ES2199978T3 - Composiciones de blanqueo que comprenden enzimas proteasa. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA COMPOSICIONES BLANQUEADORAS QUE CONTIENEN UNA ENZIMA PROTEASA QUE ES UNA VARIANTE DE LA CARBONIL HIDROLASA CON UNA SECUENCIA AMINOACIDA QUE NO SE ENCUENTRA EN LA NATURALEZA, QUE SE DERIVA REEMPLAZANDO UNA PLURALIDAD DE RESIDUOS AMINOACIDOS DEL PRECURSOR DE LA CARBONIL HIDROLASA CON DISTINTOS AMINOACIDOS, EN LA QUE DICHA PLURALIDAD DE RESIDUOS AMINOACIDOS REEMPLAZADOS EN LA ENZIMA PRECURSORA CORRESPONDEN A LAS POSICIONES +76 EN COMBINACION CON UNO O MAS DE LOS SIGUIENTES RESIDUOS: +99, +101,+103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265, Y/O +274, EN LA QUE LAS POSICIONES NUMERADAS CORRESPONDEN A SUBTILISINA PRODUCIDA NATURALMENTE A PARTIR DEL BACILO AMILOLIQUEFACIENS O A RESIDUOS AMINOACIDOS EQUIVALENTES EN OTRAS CARBONIL HIDROLASAS O SUBTILISINAS (COMO LA SUBTILISINA DEL BACILO LENTUS) Y A UN AGENTE BLANQUEADOR.

Description

Composiciones de blanqueo que comprenden enzimas proteasa.

Campo de invención

La presente invención se refiere a composiciones de blanqueo, especialmente detergentes de lavandería y a métodos que emplean una o más enzimas proteasa que son variantes de la carbonil-hidrolasa y un sistema de blanqueo con uno o más agentes blanqueadores, especialmente activadores de blanqueo.

Fundamentos de la invención

Desde hace tiempo se han usado convencionalmente, diversos tipos de enzimas en detergentes de lavandería para favorecer la eliminación de ciertas manchas de los tejidos. Estas manchas se asocian típicamente con suciedades de lípidos y proteínas. Se ha demostrado que las enzimas, sin embargo, son menos eficaces contra otros tipos de suciedades y manchas.

También se ha sabido desde hace tiempo que los agentes de blanqueo de peroxígeno son eficaces para eliminar manchas y/o suciedades de tejidos, pero que tales agentes de blanqueo dependen de la temperatura. A una temperatura de las lejías de lavandería de 60ºC, los agentes de blanqueo de peroxígeno sólo son parcialmente eficaces. A medida que se disminuye la temperatura de las lejías de lavandería por debajo de 60ºC, los agentes de blanqueo de peroxígeno se hacen relativamente ineficaces. Como consecuencia, ha habido una cantidad sustancial de investigación industrial para desarrollar sistemas de blanqueo eficaces.

Por la presente invención, se ha descubierto que la combinación de enzimas proteasa novedosas, que son variantes de la carbonil-hidrolasa, y agentes blanqueadores, especialmente activadores de blanqueo, proporcionan eliminación eficaz de manchas y/o beneficios de limpieza de suciedad. Es por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar composiciones de blanqueo, especialmente composiciones de detergente de lavandería, que tengan beneficios de eliminación de manchas y/o de limpieza de suciedad y/o beneficios de limpieza de tejidos y/o propiedades de blanqueo mejorados.

Estos y otros objetos de la presente invención serán obvios a partir de la descripción detallada de ahora en adelante.

Fundamentos de la técnica

La patente de EE.UU. 4.634.551, Burns et al., expedida el 6 de enero de 1.987, describe compuestos blanqueadores de amidoperoxiácidos y sus precursores que se emplean en la presente invención. Véase también, la patente de EE.UU. 4.852.989, Burns et al., expedida el 1 de agosto de 1.989. La patente de EE.UU. 5.069.809, Lagerwaard et al., expedida el 3 de diciembre de 1.991, describe la combinación de activadores de blanqueo NOBS con LIPOLASE, enzimas lipasa. Véase la patente EP. 341.947, Lagerwaard et al., publicada el 15 de noviembre de 1.989 para una discusión de los problemas de compatibilidad de las enzimas lipasa con ciertos sistemas de blanqueo. La patente de EE.UU. 4.545.784, Sanderson, expedida el 8 de octubre de 1.985, describe la absorción de activadores sobre perborato de sodio monohidratado.

Sumario de la invención

La invención en la presente memoria proporciona composiciones de blanqueo que comprenden:

(a) una cantidad eficaz de enzima proteasa, que es una variante seleccionada de la subtilisina de Bacillus lentus, o mezclas de la misma; y

(b) un agente blanqueador que bien es un peroxiácido orgánico o es una combinación de un activador de blanqueo y un compuesto de peroxígeno capaz de producir peróxido de hidrógeno, que puede reaccionar con el activador para formar un peroxiácido orgánico in situ en una solución de blanqueo formada a partir de la composición; y

(c) uno o más materiales de composiciones de limpieza compatible(s) con la enzima proteasa y el agente blan-
queador.

La invención también incluye un método para limpiar tejidos que comprende poner en contacto, preferiblemente con agitación, dichos tejidos con una lejía acuosa que contiene dichas composiciones de blanqueo. El método se puede llevar a cabo a temperaturas por debajo de aproximadamente 60ºC pero, por supuesto, es completamente eficaz a temperaturas de lavandería hasta la ebullición. La lejía de lavandería acuosa comprende preferiblemente al menos aproximadamente 300 ppm de ingredientes de detergentes convencionales, así como al menos aproximadamente 25 ppm de activador de blanqueo y al menos aproximadamente 25 ppm de compuesto de blanqueo. Preferiblemente, dicha lejía acuosa comprende de aproximadamente 900 ppm a aproximadamente 20.000 ppm de los ingredientes de detergentes convencionales, de aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 25.000 ppm de compuesto de blanqueo y de aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 2.500 ppm de dicho activador de blanqueo.

Los ingredientes de detergentes convencionales empleados en dicho método comprenden de aproximadamente 1% a aproximadamente 99,8%, preferiblemente de aproximadamente 5% a aproximadamente 80%, de un tensioactivo detersivo. Opcionalmente, las composiciones detersivas también pueden comprender de aproximadamente 5% a aproximadamente 80% de un reforzante de la detergencia. También se incluyen otros ingredientes detersivos opcionales para las composiciones de detergente/agente de blanqueo totalmente formuladas, proporcionadas por esta invención.

Todos los porcentajes, relaciones y proporciones son en peso, a menos que se especifique lo contrario. Todos los documentos citados se incorporan en la presente memoria por referencia.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 A-C representan la secuencia de ADN y de aminoácidos para la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este gen (Seq. ID Nº6).

La Fig. 2 representa los residuos de aminoácidos conservados entre subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens (BPN)' y Bacillus lentus (cepa natural).

Las Figuras 3A y 3B representan la secuencia de aminoácidos para cuatro subtilisinas. La línea superior representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina a partir de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (a veces referida también como subtilisina BPN)' (Seq. ID Nº. 7). La segunda línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus subtilis (Seq. ID Nº 8). La tercera línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de B. licheniformis (Seq. ID Nº 9). La cuarta línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus lentus (también referida como subtilisina 309 en la patente PCT WO 89/06276) (Seq. ID Nº 10). El símbolo * indica la ausencia de residuos de aminoácidos específicos en comparación con la subtilisina BPN'.

La Fig. 4 representa la construcción de plásmido GGA274.

La Fig. 5 representa la construcción de GGT274 que es un intermedio para ciertos plásmidos de expresión usados en esta solicitud.

Las Fig. 6A y 6B representan la secuencia de ADN y aminoácidos de la subtilisina de Bacillus lentus (Seq. ID Nº 11). La proteína de subtilisina madura está codificada por los codones que empiezan en el codón GCG (334-336) que corresponde a Ala.

Las Fig. 7A y 7B representan la secuencia de ADN y de aminoácidos de una realización preferida de la invención (N76D/S103A/V104I) (Seq. ID Nº 12). El ADN en esta figura se ha modificado por los métodos descritos para
codificar aspartato en la posición 76, alanina en la posición 103 e isoleucina en la posición 104. La proteína de la variante de la subtilisina madura está codificada por los codones que empiezan en el codón GCG (334-336) que corresponde a Ala.

La Fig. 8 representa la construcción del vector pBCDAICAT.

La Fig. 9 representa la construcción del vector pUCCATFNA.

Descripción detallada de la invención

Las composiciones de blanqueo empleadas en la presente invención proporcionan limpieza eficaz y eficiente de tejidos que, de ese modo, eliminan manchas y/o suciedades de los tejidos. Los sistemas de blanqueo junto con la enzima proteasa son particularmente eficaces en la eliminación de la mayoría de los tipos de suciedades de los tejidos, incluyendo suciedades de proteínas y lípidos, suciedades oscuras y cargas de suciedad pesadas, especialmente de suciedades de nucleófilos y del cuerpo.

Las enzimas proteasa, agentes de blanqueo (incluyendo peroxiácidos y sistemas de blanqueo) y materiales de composiciones de limpieza útiles en la presente memoria, incluyendo los niveles preferidos, se describen con detalle de ahora en adelante.

(1) Agente de blanqueo

Las composiciones de blanqueo en la presente memoria contienen un agente de blanqueo, que preferiblemente comprende de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20% en peso de la composición. El agente de blanqueo es bien un peroxiácido orgánico, preferiblemente sólido, sustancialmente insoluble, o un sistema de blanqueo que comprende un activador de blanqueo y un compuesto de blanqueo de peroxígeno capaz de producir peróxido de hidrogeno o una combinación de los mismos. El perácido que está en la composición o que se forma por la combinación de activador y compuesto de peroxígeno, tiene preferiblemente un correspondiente ácido carboxílico que tiene un valor de Equilibrio Hidrófilo-Lipófilo ("H.L.B.") que oscila de aproximadamente 3 a aproximadamente 6,5. Por lo tanto, un método que se puede usar para caracterizar los peroxiácidos preferidos (a partir de activadores o como oxiácidos preformados) que son útiles en la presente invención es la "Escala H.L.B." tal como la descrita en Davies, J.T., Proc. 2nd Internat. Congr. Surface Activity 1, 426, Butterworths, Londres (1.957), incorporado en la presente memoria por referencia. Tal Escala H.L.B. (Equilibrio Hidrófilo-Lipófilo) se ha usado en el estudio de agentes activos de superficie (tensioactivos) como medio para referirse a la distribución de un agente activo de superficie entre una fase hidrófila (como agua) y una lipófila (como aceite). De este modo, se pueden usar los valores H.L.B. como una indicación del carácter lipófilo (hidrófobo) de las especies de blanqueo activas en el lavado (es decir, la habilidad del peroxiácido para el reparto de la lejía de lavado y producto de concentración en la interfase suciedad/tejido).

Se exponen de ahora en adelante, en la Tabla A, los valores H.L.B. que se han calculado para peroxiácidos seleccionados (como los correspondientes ácidos carboxílicos). La ecuación usada para calcular los valores H.L.B. se puede exponer como:

H.L.B.= Suma (Números de Grupos Hidrófilos) - Suma (Números de Grupos Hidrófobos)+ 7.

Los valores para los Números de Grupos Hidrófilos son [-C(O)OH - N(H)C(O)- = 2,1] y los valores para los Números de Grupos Hidrófobos son [carbono alifático/aromático = 0,475 y átomos de carbono alifáticos entre grupos polares son ½ del valor de un carbono alifático en una cadena hidrocarbonada = (0,475)/2]. Como referencia, un valor de H.L.B. >7 indica que el material es preferiblemente soluble en agua y un valor de H.L.B. <7 indica aumento de actividad superficial e hidrofobicidad.

TABLA A Valores H.L.B. proporcionados por diversos peroxiácidos

Activador/Peroxiácido	Abreviatura	Peroxiácido	H.L.B
Performado			correspondiente
			ácido carboxílico
Tetraacetiletilendiamina	TAED	CH_{3}C(O)OOH	8,6
Ácido Diperoxidodecanodioico	DPDDA	HOO(O)C)CH_{2})_{10}-	6,5
		C(O)OOH
Nonilamida de Ácido	NAPSA	CH_{3}(CH_{2})_{8}N(H)-	6,4
Peroxisuccínico		C(O(CHO_{2})_{2}C(O)-OOH
Benzoiloxibencenosulfonato	BOBS	C_{6}H_{5}C(O)OOH	6,3
Nonilamida de Ácido	NAPAA	CH_{3}(CH_{2})_{8}N(H)-	6,0
Peroxiadípico		C(O)(CH_{2})_{4}C(O)-OOH
Nonanoiloxibencenosulfanato	NOBS	CH_{3}(CH_{2})_{7}C(O)-OOH	5,3
Decanoiloxibencenosulfato	DOBS	CH_{3}(CH_{2})_{8}C(O)-OOH	4,8
Ácido Perláurico	PLA	CH_{3}(CH_{2})_{10}C(O)-OOH	3,9

Como se indicó anteriormente, un intervalo preferido de valores H.L.B. (del correspondiente ácido carboxílico) para los peroxiácidos de la presente invención (bien añadidos directamente o generados in situ) oscila de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 6,5. Un intervalo más preferido de valores H.L.B. (como ácido carboxílico) para los peroxiácidos útiles en la presente invención (bien añadidos directamente o generados in situ) oscilan de aproximadamente 4,0 a 6,5. El intervalo más preferido de valores H.L.B. (como ácido carboxílico) para los peroxiácidos de la presente invención (bien añadidos directamente o generados in situ) oscila de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0.

(a)Peroxiácido

La presente invención incluye composiciones de detergente que comprenden una cantidad eficaz de la enzima proteasa y un sistema de blanqueo que comprende al menos aproximadamente 0,1%, preferiblemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 50%, en peso, de un peroxiácido orgánico sustancialmente insoluble. El peroxiácido útil en la presente memoria preferiblemente comprende de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20, más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, lo más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 7% en peso de la composición.

Se seleccionan peroxiácidos orgánicos preferidos del grupo que consta de: ácido 4-nonilamino-4-oxoperoxibutírico; ácido 6-(nonilamino)-6-oxoperoxicaproico; ácido 1,12-diperoxidodecanodioico; ácido heptilsulfonilperpropiónico; ácido decilsulfonilperpropiónico y ácido heptil-, octil-, nonil-, decilsulfonilperbutírico y mezclas de los mismos.

De los peroxiácidos orgánicos, se prefieren los amidoperoxiácidos (ácidos peroxicarboxílicos amidosustituidos). Se describen amidoperoxiácidos adecuados para uso en la presente memoria, en las patentes de EE.UU. 4.634.551 y 4.686.063, Burns et al., ambas, expedidas el 6 de enero de 1.987 y el 11 de agosto de 1.987, respectivamente, ambas incorporadas en la presente memoria por referencia. Los amidoperoxiácidos adecuados son de la fórmula:

R^{1}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---

\delm{N}{\delm{\para}{R _{5} }}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---OOH,

\hskip1cm

R^{1}---

\delm{N}{\delm{\para}{R _{5} }}

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- OOH

en la que R_{1} es un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono (preferiblemente R^{1} es un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 átomos de carbono), R^{2} es un grupo alquileno, arileno o alcarileno que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono (preferiblemente R^{2} es un grupo alquileno que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono) y R^{5} es H o un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono (preferiblemente R^{5} es H). Más preferiblemente, R^{1} es un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 átomos de carbono, y R^{2} es un grupo alquileno que contiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono.

También son adecuados para uso en la presente memoria: peroxifumaratos, que se describen en la patente de EE.UU. 4.852.989, Burns et al., expedida el 1 de agosto de 1.989, incorporada en la presente memoria por referencia, y sulfonaperoxiácidos (ácidos sulfonaperoxicarboxílicos) que se describen en las patentes de EE.UU. 4.758.369, 4.824.591 y 5.004.558, Dryoff et al., todas, expedidas el 19 de julio de 1.988, el 25 de abril de 1.989 y el 2 de abril de 1.991, respectivamente, todas incorporadas en la presente memoria por referencia.

El Ejemplo I de la patente de EE.UU. 4.686.063 contiene una descripción de la síntesis de NAPSA, a partir de la columna 8, línea 40 a la columna 9, línea 5, y NAPAA, a partir de la columna 9, línea 15 a la columna 9, línea 65. Al final de la síntesis del amidoperoxiácido, la reacción se enfría rápidamente con agua, se filtra, se lava con agua para retirar algo de ácido sulfúrico en exceso (u otro ácido fuerte con que se preparara el peroxiácido) y se filtra de nuevo.

La torta húmeda de amidoperoxiácido así obtenida se puede poner en contacto con una solución tampón de fosfato a un pH entre aproximadamente 3,5 y 6, preferiblemente entre aproximadamente 4 y 5, de acuerdo con la patente de EE.UU. 4.909.953, Sadlowski et al., expedida el 20 de marzo de 1.990, que se incorpora en la presente memoria por referencia.

Se pueden añadir otros agentes para estabilización en el almacenamiento o control exotérmico, al amidoperoxiácido antes de la incorporación en el producto final. Por ejemplo, se puede mezclar ácido bórico, un agente de control exotérmico descrito en la patente de EE.UU. 4.686.063, Burns, expedida el 11 de agosto de 1.987 e incorporada en la presente memoria, con el amidoperoxiácido (que se ha lavado en tampón de fosfato) en aproximadamente una relación perácido:ácido bórico 2:1. También se puede mezclar el amidoperoxiácido lavado en tampón de fosfato, con cantidades apropiadas de ácido dipicolínico y pirofosfato tetrasódico, un sistema de estabilización quelante. Opcionalmente se pueden incluir quelantes en el tampón de fosfato antes de ponerlo en contacto con la torta húmeda.

La torta húmeda se prepara preferiblemente de partículas con un diámetro de partícula medio de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 260 micrómetros, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 micrómetros, y lo más preferiblemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 micrómetros. Se desean cristales de NAPAA de tamaño de partícula pequeño en la presente memoria. Véase la patente de EE.UU. 5.055.218, Getty et al., expedida el 8 de octubre de 1.991, que se incorpora en la presente memoria por referencia.

La torta de masa filtrante de NAPAA, en la presente memoria, se lava preferiblemente dos veces en tampón de fosfato. Se ha encontrado que dos lavados con tampón de fosfato sucesivos prestan estabilidad óptima a NAPAA.

Se prefieren peroxiácidos orgánicos, material en forma de partículas (sólido), con un AvO teórico (oxígeno disponible) de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 12, lo mas preferiblemente entre 5 y 7.

Lo más preferido para uso en la presente memoria es NAPAA. Otro nombre para la nonilamida del ácido peroxiadí-
pico ("NAPAA", por sus siglas en inglés) es ácido 6-(nonilamino)-6-oxoperoxicaproico. La fórmula química para NAPAA es:

CH_{3}(CH_{2})_{8}

\uelm{N}{\uelm{\para}{H}}

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

(CH_{2})_{4}

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

OOH

El peso molecular de NAPAA es 287,4.

Las composiciones de detergente y las composiciones de blanqueo que contienen NAPAA proporcionan blanqueo de superficies de géneros textiles extremadamente eficaz y eficiente. Las manchas y/o suciedades se retiran de los géneros textiles. Estas composiciones son particularmente eficaces en la eliminación de suciedades oscuras de géneros textiles.

El resto amido o amidosustituido, polar, de NAPAA, da como resultado un peroxiácido que tiene una presión de vapor muy baja y, por lo tanto, posee un perfil de olor bajo así como excelente realización de blanqueo. Se cree que la polaridad del grupo amido da como resultado una reducción de la presión de vapor del peroxiácido y un aumento del punto de fusión.

Se puede usar NAPAA directamente como agente de blanqueo. Tiene una presión de vapor reducida y un buen perfil de olor en aplicaciones de lavandería.

Se puede preparar NAPAA por, por ejemplo, haciendo reaccionar primero NAAA (monononilamida del ácido adípico), ácido sulfúrico y peróxido de hidrogeno. El producto de reacción se enfría rápidamente por adición de agua helada seguido por filtración, lavado con agua destilada y filtración final por succión para recuperar la torta húmeda. El lavado se puede continuar hasta que el pH del filtrado sea neutro.

También se prefiere que el pH de NAPAA (sólidos al 10% en agua) esté entre aproximadamente 4,2 y 4,8. Sorprendentemente, este pH da como resultado más partículas térmicamente estables.

(b) Sistemas de Blanqueo - Activador de Blanqueo y Compuesto de Blanqueo de Peroxígeno (i) Activadores de Blanqueo

El activador de blanqueo para los sistemas de blanqueo útiles en la presente memoria, tiene preferiblemente la siguiente estructura:

R---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L

en la que R es un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 18 átomos de carbono, en la que la cadena alquílica lineal más larga, que se extiende desde, y que incluye el carbono carbonílico, contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 átomos de carbono y L es un grupo saliente, cuyo ácido conjugado tiene un pKa en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 13, preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 11, lo más preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 11.

L puede ser esencialmente cualquier grupo saliente adecuado. Un grupo saliente es cualquier grupo que se reemplaza a partir del activador de blanqueo, como consecuencia del ataque nucleófilo sobre el activador de blanqueo por el anión perhidróxido. Esto, la reacción de perhidrólisis, da como resultado la formación del ácido percarboxílico. Normalmente, para que un grupo sea un grupo saliente adecuado debe ejercer un efecto de atracción de electrones. Esto facilita el ataque nucleófilo por el anión perhidróxido.

El grupo L puede ser suficientemente reactivo para que la reacción tenga lugar dentro de la base de tiempo óptima (p.e., un ciclo de lavado). Sin embargo, si L es demasiado reactivo, este activador será difícil de estabilizar. Estas características normalmente corren parejas con el pKa del ácido conjugado del grupo saliente, aunque se conocen excepciones a este convenio.

Los activadores de blanqueo preferidos son los de la fórmula general:

R^{1}---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R ^{5} }}

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L

\hskip1cm

o

\hskip1cm

R^{1}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R ^{5} }}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- L

en las que R^{1} es un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 átomos de carbono, R^{2} es un alquileno que contiene de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono, R^{5} es H o alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono y L se selecciona del grupo que consta de:

1

2

3

4

---O---CH-

\uelm{C}{\uelm{\para}{Y}}

---CH---CH_{2},

\hskip3mm

---O---

\uelm{C}{\uelm{\para}{R ^{3} }}

---CHR^{4},

\hskip0,5cm

y

\hskip0,5cm

---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{3} }}

---

\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}

---

\uelm{CH}{\uelm{\para}{Y}}

---R^{4}

en los que R^{6} es un grupo alquileno, arileno o alcarileno que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, R^{3} es una cadena alquílica que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono, R^{4} es H o R^{3}, e Y es H o un grupo solubilizante. Y se selecciona preferiblemente del grupo que consta de: -SO_{3}^{-}M^{+}, -COO^{-}M^{+}, -SO_{4}^{-}M^{+}, (-N^{+}R'_{3})X^{-} y O\leftarrowN(R'_{3}), en los que R' es una cadena alquílica que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 átomos de carbono,M es un catión que proporciona solubilidad al activador de blanqueo y X es un anión que proporciona solubilidad al activador de blanqueo. Preferiblemente, M es un metal alcalino, catión amonio o amonio sustituido, siendo sodio y potasio los más preferidos, y X es un anión seleccionado del grupo formado por aniones: halogenuro, hidróxido, metilsulfato y acetato. Más preferiblemente, Y es -SO_{3}^{-}M^{+} y -COO^{-}M^{+}. Se debería observar que los activadores de blanqueo con un grupo saliente que no contenga un grupo solubilizante se debería dispersar bien en la solución de blanqueo para favorecer su disolución. Se prefiere:

5

en la que R^{3} es según se definió anteriormente e Y es -SO_{3}^{-}M^{+} o -COO^{-}M^{+} en los que M es como se definió anteriormente.

Activadores de blanqueo especialmente preferidos son aquellos en que R^{1} es una cadena alquílica lineal que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 átomos de carbono, R^{2} es una cadena de alquileno lineal que contiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono, R^{5} es H, y L se selecciona del grupo que consta de:

6

en los que R^{3} es como se definió anteriormente, Y es -SO_{3}^{-}M^{+} o -COO^{-}M^{+} y M es como se definió anteriormente.

Un activador de blanqueo preferido es:

12

en el que R es H, alquilo, arilo o alcarilo. Esto se describe en la patente de EE.UU. 4.966.723, Hodge et al., incorporada por referencia en la presente memoria.

Activadores de blanqueo preferidos son:

13

en los que R^{1} es H o un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono y R^{2} es un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono y L es como se definió anteriormente.

Activadores de blanqueo preferidos son también aquellos de la fórmula general anterior en la que L es según se definió en la fórmula general, y R^{1} es H o un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 átomos de carbono.

Incluso se prefieren más los activadores de blanqueo de la fórmula general anterior en la que L es según se definió en la fórmula general y R^{1} es un H.

Activadores de blanqueo más preferidos son aquellos de la fórmula general anterior, en la que R es una cadena alquílica lineal que contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 y preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 átomos de carbono y L se selecciona del grupo que consta de:

14

15

en las que R, R^{2}, R^{3} e Y son como se definió anteriormente.

Activadores de blanqueo particularmente preferidos son aquellos de la fórmula general anterior, en la que R es un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 12 átomos de carbono, en la que la porción lineal más larga de la cadena alquílica que se extiende desde, y que incluye el carbono carbonílico, es de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 átomos de carbono y L se selecciona del grupo que consta de:

16

en los que R^{2} es una cadena alquílica que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono e Y es -SO_{3}^{-}M^{+} o -COO^{-}M^{+}, en los que M es un metal alcalino, catión amonio o amonio sustituido.

Activadores de blanqueo especialmente preferidos son aquellos de la fórmula general anterior, en la que R es una cadena alquílica lineal que contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 y preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 átomos de carbono y L se selecciona del grupo que consta de:

17

en los que R^{2} es como se definió anteriormente e Y es -SO_{3}^{-}M^{+} o -COO^{-}M^{+}, en los que M es como se definió anteriormente.

Los activadores de blanqueo más preferidos tienen la fórmula:

18

en la que R es una cadena alquílica lineal que contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 y preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 átomos de carbono y M es sodio o potasio.

Preferiblemente, el activador de blanqueo en la presente memoria es nonanoiloxibencenosulfonato de sodio (NO
BS) o benzoiloxibencenosulfonato de sodio (BOBS).

Se prefieren particularmente además, para uso en las composiciones de blanqueo de la presente invención, los siguientes activadores de blanqueo que son particularmente seguros para uso con máquinas que tienen partes de caucho natural. Esto se cree que es el resultado de no producir especies diacilperóxido aceitosas (DAP) por la reacción de perhidrólisis de estos activadores de blanqueo procedentes de amidoácido, sino que más bien forman DAP sólido, cristalino, insoluble. Se cree que estos sólidos no forman una película de recubrimiento y que, por lo tanto, las partes de caucho natural no se exponen a DAP durante periodos de tiempo prolongados. Estos activadores de blanqueo preferidos son miembros seleccionados del grupo que consta de:

(a) un activador de blanqueo de la fórmula general:

R^{1}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\para}{O}}

- --L,

\hskip0,5cm

R^{1}---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L

o mezclas de las mismas, en las que R^{1} es un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, R^{2} es un grupo alquileno, arileno o alcarileno que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, R^{5} es H o un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono y L es un grupo saliente;

(b) activadores de blanqueo de tipo benzoxazina de la fórmula general:

20

en la que R_{1} es H, alquilo, alcarilo, arilo, arilalquilo y en la que R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} pueden ser el mismo o diferentes sustituyentes seleccionados de: H, halógeno, alquilo, alquenilo, arilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, alquilamino, COOR_{6} (en el que R_{6} es H o un grupo alquilo) y funciones carbonilo;

(c) activadores de blanqueo de N-acilcaprolactama de la fórmula:

21

en la que R^{6} es H o un grupo alquilo, arilo, alcoxiarilo oalcarilo que contiene de 1 a 12 carbonos; y

(d) mezclas de a), b) y c).

Los activadores de blanqueo preferidos del tipo a) son aquellos en los que R^{1} es un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 átomos de carbono, R^{2} contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono, y R^{5} es H o metilo. Los activadores de blanqueo particularmente preferidos son aquellos de las fórmulas generales anteriores, en las que R^{1} es un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 7 a aproximadamente 10 átomos de carbono y R^{2} contiene de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 átomos de carbono.

Los activadores de blanqueo preferidos del tipo b) son aquellos en los que R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son H y R_{1} es un grupo fenilo.

Los restos acilo preferidos de dichos activadores de blanqueo de N-acilcaprolactama del tipo c), tienen la fórmula R^{6}-CO- en la que R^{6} es H o un grupo alquilo, arilo, alcoxiarilo o alcarilo que contiene de 1 a 12 carbonos, preferiblemente de 6 a 12 átomos de carbono. En realizaciones altamente preferidas, R^{6} es un miembro seleccionado del grupo que consta de: fenilo, heptilo, octilo, nonilo, 2,4,4-trimetilpentilo, decenilo y mezclas de los mismos.

Activadores de blanqueo amidoderivados

Los activadores de blanqueo del tipo a) empleados en la presente invención, son compuestos amidosustituidos de las fórmulas generales:

R^{1}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L,

\hskip0,5cm

R^{1}---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L

o mezclas de las mismas, en las que R^{1}, R^{2} y R^{5} son como se definió anteriormente y L puede ser esencialmente cualquier grupo saliente adecuado. Los activadores de blanqueo preferidos son aquellos de la fórmula general anterior, en la que R^{1}, R^{2} y R^{5} son como se definió para el peroxiácido y L se selecciona del grupo que consta de:

23

24

26

y mezclas de los mismos, en los que R^{1} es un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, R^{3} es una cadena alquílica que contiene de 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono, R^{4} es H o R^{3} e Y es H o un grupo solubilizante.

Los grupos solubilizantes preferidos son: -SO_{3}^{-}M^{+}, -CO_{2}^{-}M^{+}, -SO_{4}^{-}M^{+}, -N^{+}(R^{3})_{4}X^{-} y O\leftarrowN(R^{3})_{3} y lo más preferiblemente -SO_{3}^{-}M^{+}y -CO_{2}^{-}M^{+} en los que R^{3} es una cadena alquílica que contiene de aproximadamente 1 aa aproximadamente 4 átomos de carbono, M es un catión que proporciona solubilidad al activador de blanqueo y X es un anión que proporciona solubilidad al activador de blanqueo. Preferiblemente, M es un metal alcalino, catión amonio o amonio sustituido, siendo los más preferidos con sodio y potasio, y X es un anión halogenuro, hidróxido, metilsulfato o acetato. Se debería señalar que los activadores de blanqueo con un grupo saliente que no contenga grupos solubilizantes se deberían dispersar bien en la solución de blanqueo para favorecer su disolución.

Los activadores de blanqueo preferidos son aquellos de la fórmula general anterior, en la que L se selecciona del grupo que consta de:

28

en los que R^{3} es como se definió anteriormente e Y es -SO_{3}^{-}M^{+} o -CO_{2}^{-}M^{+}, en los que M es como se definió anteriormente.

Otra clase importante de activadores de blanqueo, que incluye aquellos del tipo b) y tipo c), proporciona perácidos orgánicos, como se describe en la presente memoria, por apertura del anillo como consecuencia del ataque nucleófilo sobre el carbono carbonílico del anillo cíclico por el anión perhidróxido. Por ejemplo, esta reacción de apertura del anillo en los activadores de tipo c), implica atacar al carbonilo del anillo de caprolactama por peróxido de hidrógeno o su anión. Puesto que el ataque de una acilcaprolactama por peróxido de hidrógeno o su anión, tiene lugar preferiblemente en el carbonilo exocíclico, la obtención de una fracción significativa de apertura del anillo puede requerir un catalizador. Se puede encontrar otro ejemplo de activadores de blanqueo de apertura del anillo, en activadores de tipo b), tales como los descritos en la patente de EE.UU. 4.966.723, Hodge et al., expedida el 30 de octubre de 1.990.

Activadores de blanqueo de tipo benzoxazina

Tales compuestos activadores descritos por Hodge incluyen los activadores del tipo benzoxazina, que tienen la fórmula:

29

incluyendo las benzoxazinas sustituidas del tipo:

30

en las que R_{1} es H, alquilo, alcarilo, arilo, arilalquilo, y en las que R_{2}, R_{3}, R_{4}, y R_{5} pueden ser el mismo o diferentes sustituyentes seleccionados de: H, halógeno, alquilo, alquenilo, arilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, alquilamino, COOR_{6} (en el que R_{6} es H o un grupo alquilo) y funciones carbonilo.

Un activador preferido del tipo benzoxazina es:

31

Cuando se usan los activadores, se obtiene realización de blanqueo de superficies óptima con soluciones de lavado en las que el pH de tales soluciones está entre aproximadamente 8,5 y 10,5 y preferiblemente entre 9,5 y 10,5 para facilitar la reacción de perhidrólisis. Tal pH se puede obtener con sustancias comúnmente conocidas como agentes tampón, que son componentes opcionales de los sistemas de blanqueo en la presente memoria.

Activadores de Blanqueo de N-acilcaprolactama

Los activadores de blanqueo de N-acilcaprolactama del tipo c) empleados en la presente invención tienen la fórmula:

32

en la que R^{6} es H o un grupo alquilo, arilo, alcoxiarilo o alcarilo que contiene de 1 a 12 carbonos. Los activadores de caprolactama en los que el resto R^{6} contiene al menos aproximadamente 6, preferiblemente de 6 a aproximadamente 12, átomos de carbono proporcionan blanqueo hidrófobo que permite la limpieza de suciedadde nucleófilos y del cuerpo, como se indicó anteriormente. Los activadores de caprolactama en los que R^{6} comprende de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono, proporcionan especies de blanqueo hidrófilas que son particularmente eficaces para el blanqueo de manchas de bebidas. Se pueden usar mezclas de caprolactamas hidrófobas e hidrófilas,típicamente en relaciones en peso de 1:5 a 5:1, preferiblemente 1:1, en la presente memoria,para beneficios de eliminación de manchas mixtas.

Las N-acilcaprolactamas altamente preferidas se seleccionan del grupo que consiste en: benzoilcaprolactama, octanoilcaprolactama, nonanoilcaprolactama, 3,5,5-trimetilhexanoilcaprolactama, decanoilcaprolactama, undecenoilcaprolactama y mezclas de los mismos. Los métodos para preparar N-acilcaprolactamas se conocen bien en la técnica.

Al contrario de las explicaciones de la patente de EE.UU. 4.545.784, el activador de blanqueo no se absorbe preferiblemente sobre el compuesto de blanqueo de peroxígeno. Hacer eso en presencia de otros ingredientes detersivos orgánicos podía causar problemas de seguridad.

Los activadores de blanqueo del tipo a), b) o c) comprenderán al menos aproximadamente 0,1%, preferiblemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 50%, más preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 30%, lo más preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 25%, en peso de sistema de blanqueo o composición de detergente.

También se pueden usar los activadores de blanqueo de amidoderivados y de caprolactama preferidos en la presente memoria, junto con activadores hidrófilos, inocuos para el caucho,inocuos para las enzimas, tales como TAED, típicamente en relaciones en peso de activadores de amidoderivados o de caprolactama:TAED en el intervalo de 1:5 a 5:1,preferiblemente aproximadamente 1:1.

El mecanismo de blanqueo normalmente, y el mecanismo de blanqueo de superficies enparticular, no se comprenden completamente. Sin embargo, normalmente se cree que el activador de blanqueo experimenta ataque nucleófilo por un anión perhidróxido, que se genera a partir de peróxido de hidrógeno desprendido por el agente de blanqueo de peroxígeno, para formar un ácido peroxicarboxílico. Comúnmente se hace referencia a esta reacción como perhidrólisis.

Cuando se usan los activadores, se obtiene realización de blanqueo de superficies óptima,con soluciones de lavado en las que el pH de tal solución está entre aproximadamente 8,5 y 10,5 y preferiblemente entre 9,5 y 10,5 para facilitar la reacción de perhidrólisis. Tal pH se puede obtener con sustancias comúnmente conocidas como agentes tampón, que son componentes opcionales de los sistemas de blanqueo en la presente memoria.

(ii) Compuesto de blanqueo de peroxígeno

Los sistemas de blanqueo de peroxígeno útiles en la presente memoria son aquellos capaces de producir peróxido de hidrógeno en una lejía acuosa. Estos compuestos se conocen bien en la técnica e incluyen peróxido de hidrógeno y los peróxidos de metal alcalino, compuestos de blanqueo de peróxido orgánicos tales como peróxido de urea y compuestos de blanqueo de persales inorgánicas, tales como los perboratos, percarbonatos, perfosfatos de metal alcalino y similares. También se pueden usar mezclas de dos o más de tales compuestos de blanqueo, si se desea.

Los compuestos de blanqueo de peroxígeno preferidos incluyen: perborato de sodio, comercialmente disponible en la forma de mono-, tri-, y tetrahidrato, peroxihidrato de pirofosfato de sodio, peroxihidrato de urea, percarbonato de sodio y peróxido de sodio. Se prefieren particularmente: perborato de sodio tetrahidratado, perborato de sodio monohidratado y percarbonato de sodio. El percarbonato es especialmente preferido debido a que es muy estable durante el almacenamiento y aun todavía se disuelve muy rápidamente en la lejía de blanqueo. Se cree que dicha disolución rápida da como resultado la formación de niveles más altos de ácido percarboxílico y, por lo tanto, se exalta la realización de blanqueo de superficies.

El percarbonato altamente preferido puede estar en forma no recubierta o recubierta. El tamaño medio de partícula de percarbonato no recubierto oscila de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.200 micrómetros, lo más preferiblemente de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 micrómetros. Si se usa percarbonato recubierto, los materiales de recubrimiento preferidos incluyen mezclas de carbonato y sulfato, silicato, borosilicato o ácidos carboxílicos grasos.

El compuesto de blanqueo de peroxígeno comprenderá al menos aproximadamente 0,1%, preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 75%, más preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 40%, lo más preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 25%, en peso de sistema de blanqueo o composición de detergente.

La relación en peso de activador de blanqueo a compuesto de blanqueo de peroxígeno en el sistema de blanqueo oscila típicamente de aproximadamente 2:1 a 1:5. Las relaciones preferidas oscilan de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:3.

La relación molar de peróxido de hidrogeno producida por el compuesto de blanqueo de peroxígeno al activador de blanqueo es mayor que aproximadamente 1,0 más preferiblemente mayor que aproximadamente 1,5, y lo más preferiblemente de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10. Preferiblemente, las composiciones de blanqueo en la presente memoria comprenden de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20, lo más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10% en peso del compuesto de blanqueo de peroxígeno.

Los sistemas de activador de blanqueo/compuesto de blanqueo en la presente memoria, son útiles de por sí como agentes de blanqueo. Sin embargo, tales sistemas de blanqueo son especialmente útiles en composiciones que pueden comprender diversos adjuntos detersivos tales como tensioactivos, reforzantes de la detergencia y similares.

(2) Enzimas proteasa

La invención incluye enzimas proteasa que son variantes de la carbonil-hidrolasa que no se encuentran en la naturaleza, que tienen una actividad proteolítica, estabilidad, especificidad de substrato, perfil de pH y/o característica de realización diferentes en comparación con la carbonil-hidrolasa precursora a partir de la que procede la secuencia de aminoácidos de la variante.

Las enzimas proteasa de la invención son variantes de la subtilisina de Bacillus lentus:

N76D/S99D; N76D/S101R; N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/I107V; N76D/N123S; N76D/S99D/S101R; N76
D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I
/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S
101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I
107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V
104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/
V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/
V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N y N76D/S103A/V104I/M222A y mezclas de los mismos.

Estos números de posición de aminoácidos se refieren a los asignados a la secuencia de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura presentada en la Fig. 1. Sin embargo,la subtilisina precursora para las enzimas proteasa usadas en la invención, es subtilisina de Bacillus lentus y las sustituciones, delecciones o inserciones se hacen en los residuos de aminoácidos equivalentes en B. Lentus que corresponden a los enumerados anteriormente.

Un residuo (aminoácido) de una carbonil-hidrolasa precursora es equivalente a un residuo de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens si es bien homólogo (es decir, que corresponde en posición en estructura bien primaria o terciaria) o análogo a un residuo o porción específica de ese residuo en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (es decir,que tiene la misma o similar capacidad funcional para combinarse, reaccionar o interactuar químicamente).

Para establecer homología a la estructura primaria, se compara directamente la secuencia de aminoácidos de una carbonil-hidrolasa precursora, con la secuencia primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y particularmente con una serie de residuos que se sabe que son invariantes en subtilisinas cuya secuencia se conoce. La Fig. 2 en la presente memoria muestra los residuos conservados como entre subtilisina de amyloliquefaciens y subtilisina de B. Lentus. Después de alinear los residuos conservados,permitiendo las inserciones y delecciones necesarias para mantener la alineación (es decir,evitando la eliminación de residuos conservados a través de delección e inserción arbitrarias), se definen los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. La alineación de residuos conservados preferiblemente se debería conservar al 100% de tales residuos. Sin embargo,también es adecuada la alineación mayor del 75% o tan pequeña como 50% de los residuosconservados, para definir residuos equivalentes. Se debería mantener la conservación de la triada catalítica, Asp32/His64/Ser221.

Por ejemplo, en la Fig.3 se alinea la secuencia de aminoácidos de la subtilisina a partir de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) y Bacillus lentus, para proporcionar la máxima cantidad de homología entre secuencias de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que hay un número de residuos conservados contenidos en cada secuencia. Estos residuos conservados (como entre BPN' y B. lentus) se identifican en la Fig. 2.

Estos residuos conservados, por lo tanto, se pueden usar para definir los ccorrespondienteresiduos de aminoácidos equivalentes de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en otras carbonil-hidrolasas tales como la subtilisina de Bacillus lentus (Publicación de patente PCT Nº WO 89/06279 publicada el 13 de julio de 1.989), la enzima precursora de la subtilisina preferida en la presente memoria, o la subtilisina referida como PB92 (patente EP 0 328 299), que es altamente homóloga a la subtilisina de Bacillus lentus preferida. Las secuencias de aminoácidos de varias de estassubtilisinas se alinean en las Fig. 3A y 3B con la secuencia de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para producir la máxima homología de residuos conservados. Como se puede ver, hay una serie de delecciones en la secuencia de Bacillus lentus en comparación con la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Por lo tanto, por ejemplo, el aminoácido equivalente para Val165 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en las otras subtilisinas es isoleucina para B. lentus y B. licheniformis.

Por lo tanto, por ejemplo, el aminoácido en la posición +76 es asparagina (N) en las subtilisinas tanto de B. amyloliquefaciens como de B. lentus. En la variante de la subtilisina preferida útil en la invención, sin embargo, el aminoácido equivalente a +76 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se sustituye con aspartato (D). Se proporciona una comparación de todos los residuos de aminoácidos identificados en la presente memoria, para sustitución frente
a la sustitución preferida para cada una de tales posiciones, en la Tabla II por propósitos ilustrativos.

TABLA II

	+76	+99	+101	+103	+104	+107	+123
B. amyloliquefaciens (cepa natural)	N	D	S	Q	Y	I	N
B.lentus (cepa natural)	N	S	S	S	V	I	N
La Sustitución Más Preferida	D	D	R	A	I/Y	V	S

También se pueden definir residuos equivalentes determinando la homología al nivel de estructura terciaria para una carbonil-hidrolasa precursora cuya estructura terciaria se ha determinado por cristalografía de rayos X. Se definen residuos equivalentes como aquellos para los que los coordinados atómicos de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de aminoácidos particular de la carbonil-hidrolasa precursora y la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N en N, CA en CA, C en C y O en O) están dentro de 0,13nm y preferiblemente 0,1 nm después de la alineación. La alineación se consigue una vez que se ha orientado y colocado el mejor modelo para dar el solapamiento máximo de los coordinados atómicos de átomos de proteínas que no sean hidrógeno de la carbonil-hidrolasa, en cuestión, a la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. El mejor modelo es el modelo cristalográfico que da el factor R más bajo para datos de difracción experimentales a la resolución más alta disponible.

Factor

\hskip1mm

R = \frac{\Sigma_{h} [Fo(h)]-[Fc(h)]}{\Sigma_{h} [Fo(h)]}

Se definen residuos equivalentes que son funcionalmente análogos a un residuo específico de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, como los aminoácidos de las carbonil-hidrolasas precursoras que pueden adoptar una conformación tal que bien alteren, modifiquen o contribuyan a la estructura de la proteína, unión de substratos o catálisis de una forma definida y atribuida a un residuo específico de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Además, son los residuos de la carbonil-hidrolasa precursora (para la que se ha obtenido una estructura terciaria por cristalografía de rayos-X) que ocupa una posición análoga hasta el punto de que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo dado, puede que no satisfagan los criterios de equivalencia sobre la base de ocupar una posición homóloga, los coordinados atómicos de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo se encuentran con 0,13 nm de los correspondientes átomos de la cadena lateral de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Los coordinados de la estructura tridimensional de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se exponen en la Publicación EPO Nº 0 215 446 (equivalente a la solicitud de patente de EE.UU. SN 08/212.291, cuya descripción se incorpora en la presente memoria por referencia) y se puede usar como se explicó en líneas generales anteriormente para determinar residuos equivalentes en el nivel de estructura terciaria.

Algunos de los residuos identificados por sustitución, inserción o delección son residuos conservados mientras otros no lo son. En el caso de residuos que no se conservan, la sustitución de uno o más aminoácidos está limitada a sustituciones que producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a una encontrada por naturaleza. En el caso de residuos conservados, tales sustituciones no deberían dar como resultado una secuencia que se encuentre en la naturaleza. Las variantes de la carbonil-hidrolasa útiles en la presente invención incluyen las formas maduras de las variantes de la carbonil-hidrolasa, así como las pro- y prepro-formas de tales variantes de la hidrolasa. Las prepro-formas son la construcción preferida puesto que esto facilita la expresión,secreción y maduración de las variantes de la carbonil-hidrolasa.

"Prosecuencia" se refiere a una secuencia de aminoácidos ligada a la porción N-terminal de la forma madura de una carbonil-hidrolasa que cuando se elimina da como resultado la aparición de la forma "madura" de la carbonil-hidrolasa. Muchas enzimas proteolíticas se encuentran en la naturaleza como proenzimas producto de la traducción y, en ausencia de procedimientos postraduccionales, se expresan de este modo. En los Ejemplos, se usa la supuesta prosecuencia a partir de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536).

Una "secuencia señal" o "presecuencia" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos ligada a la porción N-terminal de una carbonil-hidrolasa o a la porción N-terminal de una prohidrolasa que puede participar en la secreción de formas maduras o pro-formas de la hidrolasa. Esta definición de secuencia señal es una funcional, queriendo decir incluir todas las secuencias de aminoácidos codificadas por la porción N-terminal del gen de la subtilisina u otras carbonil-hidrolasas que se puedan secretar, que participan en la realización de la secreción de la subtilisina u otras carbonil-hidrolasas en condiciones naturales. Las enzimas proteasa útiles para la presente invención utilizan tales secuencias para efectuar la secreción de las variantes de la carbonil-hidrolasa como se describe en la presente memoria. Una secuencia señal preferida usada en los Ejemplos comprende los primeros siete residuos de aminoácidos de la secuencia señal a partir de la subtilisina de Bacillus subtilis fusionados al resto de la secuencia señal de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536).

Una forma "prepro" de una variante de la carbonil-hidrolasa consta de la forma madura de la hidrolasa que tiene una prosecuencia operablemente unida al amino terminal de la hidrolasa y una secuencia "pre" o "señal" operablemente unida al amino terminal de la prosecuencia.

"Vector de expresión" se refiere a una construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN que está operablemente unida a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de dicho ADN en un huésped adecuado. Tales secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal transcripción, una secuencia que codifica puntos de unión de ribosomas mRNA adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula del fago o simplemente una inserción genómica potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector se puede replicar y funcionar independientemente del genoma huésped, o puede, en algunos casos, integrarse en el genoma mismo. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan a veces indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector actualmente. Sin embargo, en la presente memoria se incluyen tales otras formas de vectores de expresión que sirven funciones equivalentes y que son, o llegan a ser,conocidas en la técnica.

Las "células huésped" usadas en la presente invención normalmente son huéspedes procarióticos o eucarióticos que preferiblemente se han manipulado por los métodos descritos en la patente de EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) para hacerlos incapaces de secretar endoproteasa enzimáticamente activa. Una célula huésped preferida para expresar subtilisina es la cepa de Bacillus BG2036 que es deficiente en proteasa neutra y proteasa alcalina (subtilisina) enzimáticamente activas. La construcción de la cepa BG2036 se describe con detalle en la patente de EE.UU. 5.264.366. Otras células huésped para expresar subtilisina incluyen Bacillus subtilis I168 (también se describe en la patente de EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) y la patente de EE.UU. 5.264.366, cuya descripción se incorpora en la presente memoria como referencia), así como cualquier cepa de Bacillus adecuada tal como B. licheniformis, B. lentus, etc.

Las células huésped se transforman o transfectan con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante. Tales células huésped transformadas son capaces bien de replicar vectores codificando las variantes de la carbonil-hidrolasa o de expresar la variante de la carbonil-hidrolasa deseada. En el caso de vectores que codifican la pre- o prepro-forma de la variante de la carbonil-hidrolasa, tales variantes, cuando se expresan, se secretan típicamente a partir de la célula huésped en el medio de la célula huésped.

"Unida operablemente" cuando se describe la relación entre dos regiones de ADN, simplemente quiere decir que están funcionalmente relacionadas unas con otras. Por ejemplo, una presecuencia se une operablemente a un péptido si funciona como una secuencia señal, participando en la secreción de la forma madura de la proteína lo más probablemente implicando segmentación de la secuencia señal. Un promotor está operablemente unido a una secuencia codificadora si controla la transcripción de la secuencia; un punto de unión de ribosomas se une operablemente a una secuencia codificadora si se coloca de forma que se permita la traducción.

Se pueden obtener los genes que codifican la carbonil-hidrolasa precursora que se encuentra en la naturaleza, de acuerdo con los métodos generales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos normalmente comprenden sintetizar sondas marcadas que tienen supuestas secuencias codificando regiones de la hidrolasa de interés, preparar bibliotecas genómicas a partir de organismos que expresan la hidrolasa e investigar las bibliotecas para el gen de interés por hibridación de las sondas. Después se mapean y se forman secuencias de los clones hibridados positivamente. El gen de B. lentus usado en los Ejemplos se clona como se describe en el Ejemplo 1 de la patente de EE.UU. 5.185.258, cuya descripción se incorpora en la presente memoria. El gen de BPN' usado en los Ejemplos, se clona como se describe en el Ejemplo 1 en RE 34.606, cuya descripción se incorpora en la presente memoria.

Después se usa la carbonil-hidrolasa clonada para transformar una célula huésped para expresar la hidrolasa. El gen de la hidrolasa se liga después a un plásmido de número de copias alto. Este plásmido se replica en huéspedes en el sentido de que contiene los elementos bien conocidos necesarios para la replicación de plásmidos: un promotor operablemente unido al gen en cuestión (que se puede suministrar como el propio promotor homólogo del gen si se reconoce, es decir, se transcribe, por el huésped), una terminación de la transcripción y región de poliadenilación (necesario para la estabilidad del MRNA transcrito por el huésped a partir del gen de la hidrolasa en ciertas células huésped eucarióticas) que es exógena o se suministra por la región terminadora endógena del gen de la hidrolasa y, deseablemente, un gen de selección tal como un gen resistente a los antibióticos, que permite mantenimiento biológico continuo de células huésped infectadas de plásmidos por crecimiento en medio que contiene antibiótico. Los plásmidos de número de copias alto también contienen un origen de replicación para el huésped, permitiendo de ese modo grandes números de plásmidos que se tienen que generar en el citoplasma sin limitaciones cromosómicas. Sin embargo, está dentro del alcance de la presente memoria integrar múltiples copias del gen de la hidrolasa en el genoma huésped. Esto se facilita por organismos procarióticos y eucarióticos que son particularmente susceptibles a la recombinación homóloga.

Los genes usados en los presentes ejemplos es un gen de B. lentus natural. Alternativamente, se puede producir un gen sintético que codifique una carbonil-hidrolasa (subtilisina) precursora que se encuentre en la naturaleza o mutante. En tal aproximación, se determina la secuencia de ADN y/o aminoácidos de la hidrolasa (subtilisina) precursora. Se sintetizan después de eso fragmentos de ADN monocatenario sintéticos superpuestos, que en la hibridación y ligadura producen un ADN sintético que codifica la hidrolasa precursora. Un ejemplo de construcción de genes sintéticos se expone en el Ejemplo 3 de la patente de EE.UU. 5.204.015, cuya descripción se incorpora en la presente memoria por referencia.

Una vez que se ha clonado el gen de la carbonil-hidrolasa precursora que se encuentra en la naturaleza o sintético, se emprende una serie de modificaciones para exaltar el uso del gen más allá de la síntesis de la carbonil-hidrolasa precursora que se encuentra en la naturaleza. Tales modificaciones incluyen la producción de carbonil-hidrolasas recombinantes como se describe en la patente de EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) y la publicación EPO Nº 0.251.446 y la producción de variantes de la carbonil-hidrolasa descritas en la presente memoria.

Se puede usar el siguiente método de mutagénesis de casete para facilitar la construcción e identificación de las variantes de la carbonil-hidrolasa útiles en la presente invención, aunque se pueden usar otros métodos incluyendo mutagénesis dirigida. En primer lugar, se obtiene el gen que se encuentra en la naturaleza, que codifica la hidrolasa y se ordena secuencialmente en todo o en parte. Después la secuencia se escanea para un punto en el que se desea hacer una mutación (delección, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la enzima codificada. Se evalúan las secuencias que flanquean este punto por la presencia de sitios de restricción por sustitución de un segmento corto del gen con un conjunto de oligonucleótidos que cuando se expresa codificará diversos mutantes. Tales sitios de restricción son sitios preferiblemente únicos dentro del gen de la hidrolasa de forma que se facilite la sustitución del segmento génico. Sin embargo, se puede usar cualquier sitio de restricción oportuno que no sea demasiado superfluo en el gen de la hidrolasa, siempre que se puedan volver a reunir los fragmentos génicos generados por maduración de restricción en la secuencia conveniente. Si no están presentes sitios de restricción en posiciones dentro de una distancia oportuna a partir del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), tales sitios se generan sustituyendo nucleótidos en el gen de tal modo que ni se cambia la base de lectura ni los aminoácidos codificados en la construcción final. La mutación del gen para cambiar su secuencia para conformarlo a la secuencia deseada se lleva a cabo por extensión de matriz M13 de acuerdo con métodos normalmente conocidos. La tarea de localizar regiones de flanqueo adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitios de restricción convenientes se hace rutina por la superfluidad del código genético, un mapa enzimático de restricción del gen y el gran número de enzimas de restricción diferentes. Obsérvese que si está disponible un sitio de restricción de flanqueo oportuno, el método anterior requiere que se use sólo junto con la región de flanqueo que no contiene un sitio.

Una vez que se clona el ADN que se encuentra en la naturaleza o el ADN sintético, los sitios de restricción que flanquean las posiciones que se tienen que mutar, se maduran con las enzimas de restricción de origen similar y se liga una serie de casetes de oligonucleótidos complementariamente terminales de extremo al gen. La mutagénesis se simplifica por este método debido a que todos los oligonucleótidos se pueden sintetizar de forma que tengan los mismos sitios de restricción y no se requieren conectadores sintéticos para crear los sitios de restricción.

Como se usa en la presente memoria, la actividad proteolítica se define como la relación de hidrólisis de enlaces peptídicos por miligramo de enzima activa. Existen muchos procedimientos bien conocidos para medir la actividad proteolítica (K.M. Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed., 1.988). Además de, o como alternativa para modificar la actividad proteolítica, las enzimas variantes de la presente invención pueden tener otras propiedades modificadas tales como K_{m}, K_{cat}, relación K_{cat}/_{Km} y/o especificidad de substrato modificada y/o perfil de actividad de pH modificado. Estas enzimas se pueden adaptar para el substrato particular que se prevé que esté presente, por ejemplo, para procedimientos hidrolíticos tales como usos de lavandería.

Un objetivo puede ser asegurar una carbonil-hidrolasa variante que tenga actividad proteolítica modificada en comparación con la carbonil-hidrolasa precursora, puesto que aumentar tal actividad (numéricamente mayor) permite el uso de la enzima para que actúe más eficazmente sobre un substrato objeto de estudio. También son de interés enzimas variantes que tienen estabilidad térmica modificada y/o especificidad de substrato modificada en comparación con el precursor. En algunos casos, se puede desear menor actividad proteolítica. A la inversa, en algunos casos se puede desear aumentar la actividad proteolítica de la enzima variante frente a su precursor. Adicionalmente, se pueden desear aumentos o disminuciones (modificación) de la estabilidad de la variante, estabilidad bien alcalina o térmica. Los aumentos o disminuciones en K_{cat}, K_{m} o K_{cat}/K_{m} son específicos para el substrato usado para determinar estos parámetros cinéticos.

También, se ha determinado que los residuos equivalentes a +76 junto con una serie de otras modificaciones en la subtilisina, son importantes en la modulación de la estabilidad y/o actividad proteolítica total de la enzima. Por lo tanto, como se expone en los Ejemplos, se puede sustituir la Asparagina (N) en la subtilisina de Bacillus lentus en las posiciones equivalentes +76, con Aspartato (D) en las enzimas proteasa preferidas junto con la modificación de uno o más de los residuos de aminoácidos siguientes: +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 y/o +274 para producir estabilidad exaltada y/o actividad exaltada de la enzima mutante que resulta.

Las enzimas proteasa más preferidas útiles en esta invención se exponen en los Ejemplos. Estos incluyen las siguientes combinaciones específicas de residuos sustituidos: N76D/S99D; N76D/V104I; N76D/S99D/V104I; N76D/S
103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/S101R/S103A/V104I.

\newpage

Ejemplo de fabricación de proteasa

Construcción para la Expresión de Gen GG36 en B. subtilis

La clonación y la construcción para la expresión del gen de la subtilisina de B. lentus se lleva a cabo esencialmente al igual que se describió en la patente de EE.UU. 5.185.258. El plásmido GGA274 (descrito en la Fig. 4 en la presente memoria) se modifica además de la siguiente forma, como se muestra en la Fig. 5. El sitio Pstl que se introduce durante la construcción del plásmido GGA274 se retira por la mutagénesis dirigida a los oligonucleótidos descrita a continuación, con un oligonucleótido que tiene la siguiente secuencia: 5' GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3' (Seq. ID Nº 1). El residuo "A" subrayado elimina la secuencia de reconocimiento de la enzima Pstl de restricción y cambia el correspondiente residuo de aminoácidos de alanina a treonina en la posición 274. La treonina en la posición 274 es el residuo de cepa natural que se encuentra originalmente en las secuencias génicas de la subtilisina de B. lentus clonadas. El segmento de ADN que codifica la subtilisina se toma por excisión del plásmido GGA274 o sus derivados (GGT274 mostrado en la Fig. 5) por maduración de EcoRI y BamHI. El fragmento de ADN se subclona de nuevo a vectores a base de Bacteriófago M-13, tal como MP19, para la mutagénesis. Después de la mutagénesis, se lleva a cabo la maduración de EcoRI y Hindlll, seguida por la clonación, para devolver el gen de la subtilisina mutado a un plásmido de expresión como GGA274 para la expresión y la recuperación de proteínas de la subtilisina mutadas.

Mutagénesis dirigida a oligonucleótidos

La Mutagénesis dirigida a oligonucleótidos se lleva a cabo como se describe en Zoiler, M. et al., (1.983), Methods Enzymol., 100:468-500. Como ejemplo, se usa un oligonucleótido sintético de la secuencia 5' GCTGCTCTAGACAAT
TCG 3' (Seq. ID Nº 2) para cambiar el residuo de aminoácidos en la posición 76 de asparagina (N) a ácido aspártico (D), o N76D. Los residuos "G" y "C" subrayados indican cambios de la secuencia génica de cepa natural. El CA mantiene la leucina en la posición +75 y cambia la secuencia de aminoácidos para introducir un sitio de reconocimiento de Xbal de la enzima de restricción de Xbal (TCTAGA), al tiempo que el cambio en GAC cambia asparagina en +76 a aspartato.

Para la mutagénesis en las posiciones 99, 101, 103 y 104, se pueden usar diferentes oligonucleótidos dependiendo de la combinación de mutaciones deseada. Por ejemplo, se usa un oligonucleótido de la secuencia 5' GTATTAGGGGC
GGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3' (Seq. ID Nº 3) para hacer simultáneamente los siguientes cambios: S99D; S101R; S103A y V104I en una única molécula de subtilisina. Similarmente, se utilizan los oligonucleótidos de la secuencia 5' TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3' (Seq. ID Nº 4) y 5' CACGTTGCTAGCTTG
AGTTTAG 3' (Seq. ID. Nº 5) para generar |107V y N123S, respectivamente. De nuevo, los residuos subrayados indican cambios a partir de secuencias de cepa natural que producen cambios deseados bien en secuencias de aminoácidos o secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción.

Actividad proteolítica de variantes de la subtilisina

Siguiendo los métodos de Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos anteriores, se preparan las variantes enumeradas en la Tabla III. La actividad proteolítica de cada una de estas variantes de la subtilisina se muestra en la Tabla III. Los parámetros cinéticos K_{cat}, K_{M} y K_{cat}/K_{M} se miden por hidrólisis del substrato de péptidos sintético succinil- L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida usando el método descrito en P. Bonneau et al., (1.991) J. Am. Chem. Soc., Vol. 113, Nº 3, pág. 1.030. En pocas palabras, se añade una pequeña alíquota de solución stock de variante de la subtilisina, a una cubeta de 1 cm que contiene substrato disuelto en tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 8,6, y termostatizado a 25ºC. El desarrollo de la reacción se sigue espectrofotométricamente controlando la absorbancia del producto de reacción p-nitroanilina a 410 nm. Se obtienen parámetros cinéticos usando un algoritmo de regresión no lineal para ajustar la velocidad de la reacción y la concentración de producto para cada reacción a la ecuación de Michaelis-Menten.

TABLA III Parámetros cinéticos K_{cat}, K_{M} y K_{cat}/K_{M} medidos para subtilisina y variantes de Bacillus lentus

Proteasa	Variantes de Enzima	K_{cat}(s^{-1})	K_{M}(M)	K_{cat}/K_{M} (s^{-1}M^{-1})
-	Subtilisina de B.lentus	170	0,00078	2,18x10^{5}
-	N76D	219	0,0008	2,74x10^{5}
1	N76D/S99D	88	0,00061	1,44x10^{5}
2	N76D/S101	371	0,0013	2,85x10^{5}
3	N76D/S103	400	0,0014	2,86x10^{5}
4	N76D/V104I	459	0,0011	4,17x10^{5}
5	N76D/I107V	219	0,0011	1,99x10^{5}
6	N76D/N123S	115	0,0018	6,40x10^{4}
7	N76D/S99D/S101R	146	0,00038	3,84x10^{5}
8	N76D/S99D/S103A	157	0,0012	1,31x10^{5}

TABLA III (continuación)

Proteasa	Variantes de Enzima	K_{cat}(s^{-1})	K_{M}(M)	K_{cat}/K_{M} (s^{-1}M^{-1}
9	N76D/S99D/V104I	247	0,00097	2,55x10^{5}
10	N76D/S101R/S103A	405	0,00069	5,90x10^{5}
11	N76D/S101R/V104I	540	0,00049	1,10x10^{6}
12	N76D/S103A/V104I	832	0,0016	520x10^{5}
13	N76D/V104I/I107V	497	0,00045	1,10x10^{6}
14	N76D/V104Y/I107V	330	0,00017	1,90x10^{6}
15	N76D/V104I/N123S	251	0,0026	9,65x10^{4}
16	N76D/I107V/N123S	147	0,0035	4,20x10^{4}
17	N76D/S99D/S101R/S103A	242	0,00074	3,27x10^{5}
18	N76D/S99D/S101R/V104I	403	0,00072	5,60x10^{5}
19	N76D/S99D/S103R/V104I	420	0,0016	2,62x10^{5}
20	N76D/S101R/S103A/V104I	731	0,00065	1,12x10^{6}
21	N76S/V103A/V104I/N123S	321	0,0026	1,23x10^{5}
22	N76D/V104I/I107V/N123S	231	0,003	7,70x10^{4}
23	N76D/S99D/S101R/S103A/V104I	624	0,00098	6,37x10^{5}
24	N76D/S99D/S101R/S103A/V104I	194	0,0046	4,51x10^{4}
25	N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S	311	0,0023	1,35x10^{5}

Los resultados enumerados en la Tabla III indican que todas las variantes de la subtilisina ensayadas retienen actividad proteolítica. Además, el análisis detallado de los datos revela que la actividad proteolítica se modifica significativamente por la subtilisina de Bacillus lentus por las diversas combinaciones de sustituciones en residuos de aminoácidos equivalentes a las posiciones: 76, 99, 101, 103, 104, 107 y 123 en Bacillus amyloliquefaciens.

Estabilidad térmica de variantes de la subtilisina

Una comparación de la estabilidad térmica observada para la subtilisina de Bacillus lentus y las variantes de la presente invención preparadas por el procedimiento de Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos anterior, se muestra en la Tabla IV. Se tomaron alíquotas de enzima purificada, 15 ug/ml en glicina 0,1 M, Tween-80 al 0,01% a pH 10,0, con o sin CaCl_{2} 50 mM, en tubos pequeños y se incubaron a 10ºC durante 5 minutos, 10ºC a 60ºC durante 1 minuto y 60ºC durante 20 minutos. Los tubos se pusieron después sobre hielo durante 10 minutos. Se ensayó la actividad enzimática en alíquotas a partir de los tubos por adición a cubetas de 1 cm que contenían 1,2 mM del substrato de péptidos sintético succinil-L-ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida disueltas en disolución tampón de tris-HCl 0,1 M, pH 8,6, termostatizado a 25ºC. La velocidad de reacción lineal inicial se siguió espectrofotométricamente por control de la absorbancia del producto de reacción p-nitroanilina a 410 nm como función del tiempo. Los datos se presentan como porcentaje de actividad previa al calentamiento. Los resultados enumerados en la Tabla IV indican que una gran mayoría de las variantes presenta estabilidad térmica comparable a la subtilisina de Bacillus lentus (24 de cada 26) en las condiciones de ensayo con CaCl_{2} 50 mM añadido. En las condiciones de ensayo sin CaCl_{2} 50 mM añadido, una gran mayoría de las variantes (19 de cada 26) es significativamente más estable que la subtilisina de Bacillus lentus. Además, las variantes N76D/S99D, N76D/V104I, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V104I, N76D/V104I/I107V, N76D/V104Y/I107V y N76D/S101R/S103A/V104I son significativamente más estables que la única variante N76D de substitución en las condiciones de ensayo sin CaCl_{2} 50 mM añadido.

TABLA IV Estabilidad térmica medida para la subtilisina y variantes de Bacillus lentus a pH 10, 60ºC, \pm CaCl_{2} 50 mM añadido

	% Actividad inicial que queda
Enzima	-CaCl_{2}	+CaCl_{2}
Subtilisina de B. Lentus	2	96
N76D	34	97
N76D/S99D	49	98
N76D/S101R	0	82
N76D/S103A	26	92
N76D/V104I	58	98
N76DI107V	32	96
N76D/N123S	0	97

TABLA IV (continuación)

	% Actividad inicial que queda
Enzima	-CaCl_{2}	+CaCl_{2}
N76D/S99D/S101R	30	100
N76D/S99D/S103A	36	100
N76D/S99D/V104I	48	97
N76D/S101R/S103A	26	100
N76D/S101R/V104I	38	100
N76D/S103A/V104I	58	100
N76D/V104I/I107V	60	97
N76D/V104Y/I107V	48	74
N76D/V104I/N123S	0	98
N76D/I107V/N123S	16	100
N76D/S99D/S101R/S103A	38	100
N76D/S99D/S101R/V104I	33	100
N76D/S99D/S103A/V104I	38	98
N76D/S101R/S103A/V104I	40	99
N76D/S103A/V104I/N123S	1	98
N76D/V104I/I107V/N123S	3	99
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I	36	99
N76D/S99D/S103A/V104I/N123S	2	95
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S	0	100

Mutagénesis dirigida a oligonucleótidos con cadena de ADN molde monocatenario a partir de fagémido A. Construcción de variantes de B. Lentus

El protocolo de la mutagénesis es esencialmente el mismo que se describió anteriormente en Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos. La cadena de ADN molde monocatenario se genera por el método fagémido. Para construir el vector fagémido para generar la cadena de ADN molde monocatenario primero construimos el vector pBCDAICAT. El organigrama de la construcción de vectores se explica en líneas generales en la Figura 8. Primero, el fragmento C1al a C1al que codifica el gen CAT a partir de plásmido pC194 (Horinouchi, S., y Weisblum, B., J. Bacteriol., 150:8-15, 1.982) se clona en el sitio Accl de la región poliligadora de pUC19 (New England BioLabs, Beverly, MA) para preparar plásmido pUCCHL y se clona el fragmento EcoRI-Dral 0,6 KB a partir del extremo 5' del GG36DAI, que codifica ADN, en los sitios EcoRI y EcoRV del plásmido pBSKS (Stratagene, Inc., San Diego, CA) para preparar pBC2SK5. El único sitio EcoRI del plásmido pBC2SK5 se elimina por digestión de EcoRI, seguido por la adición catalizada por ADN polimerasa T4 y religadura para generar el plásmido pBC2SK-5R que no tiene el sitio EcoRI. El fragmento EcoRI-Dral que se clona en pBCSK-5R se aisla como fragmento Pstl-Hindlll y se clona en el sitio Pstl-Hidlll del pUCCHL (parte del poliligador de pUC19) para generar plásmido pUCCHL5R. La secuencia codificada del gen GG36DAI se escinde como fragmento EcoRI-BamHI y se clona en los sitios EcoRI-BamHI de pUCCHL5R para preparar pUCCAT. El fragmento EcoRI-HindIII grande de pUCCAT se clona después en los sitios EcoRI y HindIII de BS2KS+ para generar el plásmido pBCDAICAT.

Para generar ADN monocatenario, se infecta pBCDAICAT que contiene E. Coli con fago R408 (obtenido de Stratagene, San Diego, CA) siguiendo el protocolo descrito en Russel, M., Kidd, S. and Kelley, M.R., GENE 45:333-338, 1.986. Una vez que la cadena de ADN molde monocatenaria está disponible, se llevan a cabo métodos de mutagénesis habituales como se describió anteriormente en Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos. La construcción de ciertos mutantes se detalla a continuación por propósitos ilustrativos.

Para la construcción de N76D/S103A/V104I/L217H (GG36) B. lentus se usa un fragmento de ADN EcoRI-BamHI que codifica N76D/S103A/V104I GG36 en la construcción de pUCCAT (véase la Fig. 8) para generar el plásmido pBCDAICAT. Una vez que se prepara la cadena de ADN molde monocatenario siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se usa una matriz de mutagénesis con la secuencia siguiente:

x C1al

5' TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT 3' (Seq. ID Nº 13) para preparar el L217H. Como anteriormente, los residuos subrayados indican los cambios que se hacen en el nucleótido y el x C1al indica que el sitio C1al existente se elimina después de la mutagénesis. El protocolo de mutagénesis es como se describió en Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos anteriormente. Después de la mutagénesis, en el ADN del plásmido se investiga primero la eliminación del sitio C1al y esos clones que pierden el sitio C1al se someten a análisis de secuencia de ADN para verificar la secuencia de ADN que hizo el cambio L a H en el residuo de aminoácido 217.

B. Construcción de variantes de BPN' y su expresión en B. Subtilis

La construcción de N76D/Q103A/Y104I/Y217L (BPN') de B. Amyloliquefaciens se hace de un modo similar excepto en dos etapas consecutivas. Se introduce primero N76D en Y217L BPN' para preparar N76D/Y217L BPN' y se hace una segunda mutagénesis para convertir N76D/Y217L BPN' a N76D/Q103A/Y104I/Y217L BNP'. Para generar la cadena de ADN molde monocatenario para la primera mutagénesis, se usa un fragmento de EcoRI-BamHI codificando la subtilisina Y217L BPN' (procedente del plásmido Y217L descrito en Wells, J. et al., PNAS, 84, 5.167, 1.087) para construir un plásmido pUCCATFNA (véase la Fig. 9). El plásmido pUCCATFNA que contiene Y217L BPN' se usa para construir el plásmido pBCFNACAT (Fig. 9). Se genera ADN monocatenario como se describió anteriormente. Para generar N76D/Y217L BPN', se usa una matriz de oligonucleótidos con la secuencia:

Xbal

5' C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3' (Seq. ID Nº 14) para generar el cambio N76D. Se prepara después ADN monocatenario a partir del plásmido pBCFNACAT que contiene el N76D/Y217L BPN' (el plásmido pBCFNACAT después de la mutagénesis de N76D) y mutageneizado con otro oligonucleótido con la secuencia:

x Pvull

5' GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT 3' (Seq. ID Nº 15) para obtener N76D/Q103A/Y104
I/Y217L BPN'. Todas las etapas implicadas en la clonación, la preparación de ADN monocatenario, la mutagénesis y la investigación de mutantes, se llevan a cabo como se describió anteriormente. La expresión del gen BPN' y sus variantes se consigue integrando el ADN del plásmido (pBCFNACAT que contiene los diferentes genes BPN' de las variantes) directamente en una cepa deficiente de proteasa de Bacillus subtilis como se describe en RE 34.606.

Se preparan numerosas variantes según las explicaciones de estos Ejemplos de Fabricación de Proteasas. Se generan datos cinéticos y datos de estabilidad para tales variantes. Los datos cinéticos se generan usando los métodos descritos anteriormente y se proporcionan en la Tabla V. Los datos de estabilidad se generan como se detalla en la presente memoria. Los resultados se muestran en la Tabla VI.

Procedimiento de ensayo de la estabilidad térmica

La enzima purificada se recuperó en tampón en glicina 0,1 M, pH 10,0, Tween-80 al 0,01% aplicando la enzima a una columna que constaba de Sephadex G-25 equilibrada con este tampón y eluyendo la enzima de la columna usando el mismo tampón.

A un tubo que contenía glicina 0,1 M, Tween-80 al 0,01% a pH 10,0 termostatizado a 60ºC, se añadió la enzima recuperada en tampón para dar una concentración final de enzima de 15 ug/ml.

Se retiraron alíquotas a partir de la incubación a 60ºC a diversos tiempos y se ensayó inmediatamente la actividad enzimática por adición a una cubeta de 1 cm que contenía 1,2 mM del substrato de péptidos sintético succinil-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida disuelto en solución tampón 0,1 M de tris-HCl, pH 8,6, termostatizado a 25ºC. La velocidad de reacción lineal inicial se siguió espectrofotométricamente controlando la absorbancia del producto de reacción p-nitroanilina a 410 nm como función del tiempo.

El periodo de semidescomposición, que es la extensión de tiempo requerida para 50% de inactivación enzimática, se determinó a partir de la gráfica de la velocidad de reacción de primer orden como función del tiempo de incubación a 60ºC.

Los datos se presentan en la Tabla VI como porcentaje del periodo de semidescomposición determinado para la subtilisina (GG36) de Bacillus lentus en idénticas condiciones.

TABLA V

Enzima	Kcat (s^{-1})	KM(mM)	Kcat/KM (s^{-1}M^{-1})
Subtilisina de B. Lentus	170	0,78	2,20E+05
N76D/S103G/V104I*	380	1,4	2,70E+05
N76D/S103A/V104F	730	0,33	2,20E+06
N76D/S103A/V104N	790	2,8	2,80E+05
N76D/S103A/V104S	170	0,83	2,00E+05
N76D/S103A/V104T	370	1,9	2,00E+05
N76D/S103A/V104W	880	0,31	2,80E+06
N76D/S103A/V104Y	690	0,5	1,40E+06

TABLA V (continuación)

Enzima	Kcat (s^{-1})	KM(mM)	Kcat/KM (s^{-1}M^{-1})
K27R/N76D/V104Y/N123S	500	1,2	4,20E+05
N76D/S101G/S103A/V104I*	620	1,3	4,80E+05
N76D/S103A/V104I/S105A*	550	1,3	4,20E+05
N76D/S103A/V104I/S105D*	440	1,7	2,60E+05
N76D/S103A/V104T/I107A*	120	5,7	2,10E+04
N76D/S103A/V104T/I107L*	310	3,2	9,70E+04
N76D/S103A/V104I/L126A	90	2,2	4,10E+04
N76D/S103A/V104I/L126F	180	1,9	9,50E+04
N76D/S103A/V104I/L126I	100	2,4	4,20E+04
N76D/S103A/V104I/L126V	64	3,2	2,00E+04
N76D/S103A/V104I/S128G*	560	1,7	3,30E+05
N76D/S103A/V104I/S128L*	430	3,8	1,10E+05
N76D/S103A/V104I/L135A	140	0,76	1,80E+05
N76D/S103A/V104I/L135F	390	0,69	5,70E+05
N76D/S103A/V104I/L135I	110	0,73	1,50E+05
N76D/S103A/V104I/L135V	140	0,86	1,60E+05
N76D/S103A/V104I/S156E*	170	2,6	6,50E+04
N76D/S103A/V104I/S166D*	160	3,5	4,60E+04
N76D/S103A/V104I/D197E	510	1,4	3,60E+05
N76D/S103A/V104I/N204A*	530	1,1	4,80E+05
N76D/S103A/V104I/N204G*	580	1,4	4,10E+05
N76D/S103A/V104I/N204C*	370	1,3	2,90E+05
N76D/S103A/V104I/P210I*	500	1,2	4,20E+05
N76D/S103A/V104I/L217H*	80	0,63	1,30E+05
N76D/S103A/V104I/M222A	70	3,1	2,30E+04
N76D/S103A/V104I/M222S	80	3,1	2,60E+04
N76D/S103A/V104I/T260P	660	1,5	4,40E+05
N76D/S103A/V104I/S265N	590	1,3	4,50E+05
K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S	220	1,4	1,60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E	430	1,1	3,90E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C	400	1,1	3,60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L	440	1,2	3,70E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V	440	1,2	3,70E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S	760	0,98	7,80E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P	410	1,2	3,40E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A	390	1	3,90E+05
N76D/S103A/V104I/L126F/S265N	170	2,1	8,10E+04
N76D/S103A/V104I/S156E/S166D*	40	6,3	6,40E+03
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E	410	0,98	4,20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S	540	0,66	8,20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S	770	0,79	9,80E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S	610	0,99	6,20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S	580	0,78	7,40E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P	660	1	6,60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A	590	0,89	6,60E+05
K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274A	520	1	5,20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S	460	0,65	7,10E+05
Subtilisina de B. Amyloliquefaciens (BPN')	50	0,14	3,60E+05
BPN'-N76D/Y217L*	380	0,46	8,30E+05
*Estos mutantes se prepararon según Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos con Cadena de ADN
Molde Monocatenaria Generada a partir de Fagémido, todos los demás se prepararon según
Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos, anteriormente.

TABLA VI

Enzima	Estabilidad térmica (% periodo
	de semidescomposición de enzima natural)
Subtilisina de B. lentus	100
N76D	590
N76D/S99D	840
N76D/S103A	390
N76D/V104I	660
N76D/I107V	710
N76D/N123S	70
N76D/S99D/S101R	610
N76D/S99D/S103A	590
N76D/S99D/V104I	910
N76D/S101R/S103A	930
N76D/S101R/V104I	500
N76D/S103A/V104I	460
N76D/S103G/V104I*	370
N76D/S103A/V104F	480
N76D/S103A/V104N	230
N76D/S103A/V104S	230
N76D/S103A/V104T	370
N76D/S103A/V104W	280
N76D/S103A/V104Y	400
N76D/V104I/I107V	940
N76D/V104Y/I107V	820
N76D/V104I/N123S	80
N76D/I107V/N123S	150
K27R/N76D/V104Y/N123S	100
N76D/S99D/S101R/S103A	570
N76D/S99D/S101R/V104I	1.000
N76D/S99D/S103A/V104I	680
N76D/S101G/S103A/V104I*	390
N76D/S101R/S103A/V104I	470
N76D/S103A/V104I/S105A*	360
N76D/S103A/V104I/S105D*	370
N76D/S103A/V104T/I107A*	270
N76D/S103A/V104T/I107L*	230
N76D/S103A/V104I/N123S	110
N76D/V104I/I107V/N123S	220
N76D/S103A/V104I/L126A	270
N76D/S103A/V104I/L126F	950
N76D/S103A/V104I/L126I	410
N76D/S103A/V104I/L126V	320
N76D/S103A/V104I/S128G*	640
N76D/S103A/V104I/S128L*	760
N76D/S103A/V104I/L135A	230
N76D/S103A/V104I/L135F	200
N76D/S103A/V104I/L135I	510
N76D/S103A/V104I/L135V	500
N76D/S103A/V104I/S156E*	120
N76D/S103A/V104I/S166D*	590
N76D/S103A/V104I/D197E	460
N76D/S103A/V104I/N204A*	230
N76D/S103A/V104I/N204G*	240
N76D/S103A/V104I/N204C*	500

TABLA VI (continuación)

Enzima	Estabilidad térmica (% periodo
	de semidescomposición de enzima natural)
N76D/S103A/V104I/P210I*	1.370
N76D/S103A/V104I/L217H*	60
N76D/S103A/V104I/M222A	520
N76D/S103A/V104I/M222S	490
N76D/S103A/V104I/T260P	490
N76D/S103A/V104I/S265N	360
K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S	210
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E	120
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C	110
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L	380
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V	140
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S	270
K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P	40
K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A	60
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I	590
N76D/S99D/S103A/V104I/N123S	110
N76D/S103A/V104I/L126F/S265N	810
N76D/S103A/V104I/S156E/S166D*	220
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E	90
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S	250
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S	270
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S	460
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S	1.400
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P	310
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A	180
N76DD/S99D/S101R/S103A/V104I/N123	90
K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274	230
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N21	240
Subtilisina de B. amyloliquefaciens (BPN')	100
BPN'-N76D/Y217L*	420
*Estos mutantes se prepararon según Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos con Cadena de ADN
Molde Monocatenaria Generada a partir de Fagémido, todos los demás se prepararon
según Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos, anteriormente.

(3) Materiales de composiciones de limpieza

Las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden, además del agente blanqueador y la enzima proteasa descritos, anteriormente, uno o más materiales de composiciones de limpieza compatibles con la enzima proteasa. La terminología "materiales de composiciones de limpieza", como se usa en la presente memoria, quiere decir cualquier material líquido, sólido o gaseoso seleccionado para el tipo particular de composición de limpieza deseada y la forma del producto (p.e., líquido; en gránulos; composición de atomización), cuyos materiales también son compatibles con la enzima proteasa usada en la composición. La selección específica de los materiales de las composiciones de limpieza se prepara fácilmente considerando la superficie, artículo o género que se tiene que limpiar y la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante su uso (p.e., a través del uso de detergente de lavado). La terminología "compatible", como se usa en la presente memoria, quiere decir que los materiales de las composiciones de limpieza no reducen la actividad proteolítica de la enzima proteasa en tal extensión que la proteasa no sea eficaz como se desea durante situaciones de uso normal. Los materiales de las composiciones de limpieza específicos se ejemplifican con detalle de ahora en adelante.

Se incluye una cantidad eficaz de una o más enzimas proteasa descritas anteriormente, en composiciones útiles para limpiar una variedad de superficies que necesitan eliminación de manchas proteínicas. Tales composiciones de limpieza incluyen composiciones de detergente para limpiar superficies duras, sin límites de forma (p.e., líquida y granular); composiciones de detergente para tejidos de limpieza, sin límites de forma (p.e., formulaciones granulares, líquidas y en pastillas); composiciones de lavavajillas (sin límites de forma); composiciones de limpieza oral, sin límites de forma (p.e., formulaciones de dentífricos, pasta de dientes y enjuagues bucales); y composiciones de limpieza de dentaduras, sin límite de formas (p.e., líquida, en comprimidos). Como se usa en la presente memoria, "cantidad eficaz de enzima proteasa" se refiere a la cantidad de enzima proteasa descrita anteriormente, necesaria para conseguir la actividad enzimática necesaria en la composición de limpieza específica. Tales cantidades eficaces se determinan fácilmente por un experto en la técnica y se basan en muchos factores, tales como la variante enzimática particular usada, la aplicación de la limpieza, la composición específica de la composición de limpieza y si se requiere una composición líquida o seca (p.e., granular, en pastillas) y similares.

Preferiblemente, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden de aproximadamente
0,0001% a aproximadamente 10% de una o más enzimas proteasa, más preferiblemente de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1%, más preferiblemente aún de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,1%. También preferiblemente la enzima proteasa está presente en las composiciones en una cantidad suficiente para proporcionar una relación de mg de proteasa activa por cada 100 gramos de composición a ppm de O_{2} Disponible teórico ("AvO_{2}") a partir del peroxiácido en la lejía de lavado, referido en la presente memoria como la relación Enzima a Blanqueo (relación E/B), que oscila de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 20:1. Diversos ejemplos de diversas composiciones de limpieza en las que se pueden emplear las enzimas proteasa, se discuten con más detalle a continuación. Todas las partes, porcentajes y relaciones usadas en la presente memoria son en peso a menos que se especifique lo contrario.

(i) Enzimas detersivas opcionales

Las composiciones y métodos en la presente memoria son eficaces con todas las formas de enzimas detersivas además de las enzimas proteasa especificadas. Se pueden incluir enzimas detersivas opcionales útiles en la presente invención, para una amplia variedad de propósitos de lavandería de tejidos, incluyendo la eliminación de manchas a base de proteínas, a base de carbohidratos o a base de triglicéridos, por ejemplo, y para evitar la transferencia de colorante fugaz. Las enzimas que se tienen que incorporar incluyen otras proteasas, amilasas, lipasas, celulasas y peroxidasas, así como mezclas de las mismas. También se pueden incluir otros tipos de enzimas. Pueden ser de cualquier origen adecuado tal como de origen: vegetal, animal, bacteriano, fúngico y de levaduras. Sin embargo, su elección está gobernada por diversos factores tales como: actividad - pH y/o óptima estabilidad, termoestabilidad, estabilidad frente a detergentes activos, reforzantes de la detergencia y similares. Por lo que se refiere a esto, se prefieren enzimas bacterianas o fúngicas tales como amilasas y proteasas bacterianas y celulasas fúngicas.

Normalmente se incorporan enzimas a niveles suficientes para proporcionar hasta aproximadamente 50 mg en peso, más típicamente aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 10 mg de enzima activa por gramo de composición de detergente. Indicado de otro modo, una cantidad eficaz de las enzimas opcionales empleadas en la presente invención comprenderá típicamente al menos aproximadamente 0,001%, preferiblemente de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 5%, más preferiblemente de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1%, lo más preferiblemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%, en peso de composición de detergente.

Ejemplos adecuados de proteasas opcionales son las subtilisinas que se obtienen a partir de cepas particulares de B. Subtilis y B. Licheniformis. Otra proteasa adecuada es una enzima serin-proteasa bacteriana modificada obtenida a partir de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, que tiene actividad máxima durante todo el intervalo de pH de 8-12, desarrollada y vendida por Novo Industries A/S bajo el nombre comercial registrado ESPERASE. La preparación de esta enzima y enzimas análogas se describe en la memoria descriptiva de la patente británica Nº 1.243.784 de Novo. Otras enzimas proteolíticas que están comercialmente disponibles incluyen las vendidas bajo los nombres comerciales ALCALASE y SAVINASE por Novo Industries A/S (Dinamarca) y MAXATASE por International Bio-Synthetics, Inc., (Países Bajos). Aún otras proteasas incluyen Proteasa A (véase la solicitud de patente europea 130.756, publicada el 9 de enero de 1.985) y Proteasa B (véase la solicitud de patente europea Nº de serie 87303761,8, presentada el 28 de abril de 1.987 y la solicitud de patente europea 130.756, Bott et al., publicada el 9 de enero de 1.985) y lo que se denomina en la presente memoria "Proteasa C", que es una variante triple de una serin-proteasa alcalina a partir de Bacillus en que la tirosina sustituye a valina en la posición 104, la serina sustituye asparagina en la posición 123 y la alanina sustituye treonina en la posición 274. La Proteasa C se describe en la patente europea 90915958,4, que corresponde a la patente WO 91/06637, publicada el 16 de mayo de 1.991, que se incorpora en la presente memoria por referencia. También se incluyen en la presente memoria variantes modificadas genéticamente, particularmente de Proteasa C.

Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas descritas en la memoria descriptiva de la patente británica Nº 1.296.839 (Novo), RAPIDASE, International Bio-Synthetics, Inc., y TERMAMYL, Novo Industries.

Las celulasas utilizables en la presente invención incluyen celulasa tanto bacteriana como fúngica. Preferiblemente, tendrán un pH óptimo entre 5 y 9,5. Se describen celulasas adecuadas en la patente de EE.UU. 4.435.307, Barbesgoard et al., expedida el 6 de marzo de 1.984, que describe celulasa fúngica producida a partir de Humicola insolens y cepa Humicola DSM1.800 o un hongo que produce celulasa 212 que pertenece al género Aeromonas, y celulasa extraída a partir del hematopáncreas de un molusco marino (Dolabella Auricula Solander). También se describen celulasas adecuadas en la patente GB-A-2.075.028; la patente GB-A- 2.095.275 y la patente DE-OS-2.247.832.

Las enzimas lipasa adecuadas para uso detergente incluyen las producidas por microorganismos del grupo Pseudomonas, tales como Pseudomonas stutzeri ATCC 19,154, como se describe en la patente británica 1.372.034. Véanse también lipasas en la solicitud de patente japonesa 53-20487, abierta al público para consulta e inspección pública el 24 de febrero de 1.978. Esta lipasa está disponible de Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Nagoya, Japón, bajo el nombre comercial Lipasa P "Amano" referida de ahora en adelante como "Amano-P". Otras lipasas comerciales incluyen: Amano-CES, lipasas ex Chromobacter viscosum, por ejemplo, lipolyticum NRRLB 3.673, variedad de Chromobacter viscosum, comercialmente disponible de Toyo Jozo Co., Tagata, Japón y lipasas Chromobacter viscosum adicionales de U.S. Biochemical Corp., U.S.A. y Disoynth Co., Países Bajos, y lipasas ex Pseudomonas gladioli. La enzima LIPOLASE, procedente del hongo Humicola lanuginosa y expresada en Aspergillus oryzae como huésped y comercialmente disponible de Novo (véase también la patente europea 341.947) es una lipasa preferida para uso en la presente memoria.

Se usan enzimas peroxidasa junto con fuentes de oxígeno, por ejemplo, percarbonato, perborato, persulfato, peróxido de hidrógeno, etc. Se usan para "blanqueo en solución", es decir, para evitar la transferencia de colorantes o pigmentos retirados de substratos durante operaciones de lavado a otros substratos en la solución de lavado. Se conocen enzimas peroxidasa en la técnica e incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano, ligninasa y haloperoxidasa tales como cloro- y bromo-peroxidasa. Se describen composiciones de detergente que contienen peroxidasa, por ejemplo, en la solicitud internacional PCT de patente WO 89/099813, publicada el 19 de octubre de 1.989, por O. Kirk, cedida a Novo Industries A/S.

Se describe también un amplio intervalo de materiales enzimáticos y medios para su incorporación en gránulos de detergente sintético, en la patente de EE.UU. 3.553.139, expedida el 5 de enero de 1.971 para McCarty et al. Se describen adicionalmente enzimas en la patente de EE.UU. 4.101.457, Place et al., expedida el 18 de julio de 1.978 y en la patente de EE.UU. 4.507.219, Hughes, expedida el 26 de marzo de 1.985, ambas. Se describen materiales enzimáticos útiles para formulaciones de detergente líquido y su incorporación en tales formulaciones, en la patente de EE.UU. 4.261.868, Hora et al., expedida el 14 de abril de 1.981. Se pueden estabilizar enzimas para uso en detergentes, por diversas técnicas. Se describen y se ejemplifican técnicas de estabilización de enzimas, en la patente de EE.UU. 4.261.868, expedida el 14 de abril de 1.981 a Horn, et al., la patente de EE.UU. 3.600.319, expedida el 17 de agosto de 1.971 a Gedge et al., y la publicación de la solicitud de patente europea N!91! 0199405, solicitud Nº 86200586,5, publicada el 29 de octubre de 1.986, Venegas. También se describen sistemas de estabilización de enzimas, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. 4.261.868; 3.600.319 y 3.519.570.

(ii) Estabilizadores de enzimas

Las enzimas empleadas en la presente memoria se pueden estabilizar por la presencia de fuentes solubles en agua de iones calcio en las composiciones terminadas que proporcionan iones calcio a las enzimas. Se puede proporcionar estabilidad adicional por la presencia de otros diversos estabilizadores descritos en la técnica, especialmente especies de borato: véase la patente de EE.UU. 4.537.706 de Severson, citada anteriormente. Los detergentes típicos, especialmente líquidos, comprenderán de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, y lo más preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, milimoles de iones calcio por litro de composición terminada. Esto puede variar algo, dependiendo de la cantidad de enzima presente y de su respuesta a los iones calcio. El nivel de iones calcio se debería seleccionar de forma que haya siempre algún nivel mínimo disponible para la enzima, después de permitir la complejación con reforzantes de la detergencia, ácidos grasos, etc., en la composición. Se puede usar cualquier sal de calcio soluble en agua como fuente de iones calcio, incluyendo, pero no limitándose a, cloruro de calcio, sulfato de calcio, malato de calcio, hidróxido de calcio, formiato de calcio y acetato de calcio. También está presente con frecuencia una cantidad pequeña de iones calcio, normalmente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,4 milimoles por litro, en la composición debido a calcio en la suspensión enzimática y agua de la fórmula. En composiciones de detergente sólidas, la formulación puede incluir una cantidad suficiente de una fuente de iones calcio soluble en agua, para proporcionar tales cantidades en la lejía de lavandería. En la alternativa, puede ser suficiente la dureza del agua natural.

Las composiciones en la presente memoria pueden contener también opcionalmente, pero preferiblemente, diversos estabilizantes adicionales incluyendo recubrimientos de silicato y especialmente estabilizantes de tipo borato. Típicamente, tales estabilizantes se usarán a niveles en las composiciones de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 10%, preferiblemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, más preferiblemente de aproximadamente 0,75% a aproximadamente 3% en peso de ácido bórico u otro compuesto de borato capaz de formar ácido bórico en la composición (calculado sobre la base de ácido bórico). Se prefiere ácido bórico, aunque son adecuados otros compuestos tales como: óxido bórico, bórax y otros boratos de metal alcalino (por ejemplo, orto-, meta- y piroborato de sodio y pentaborato de sodio).

También se pueden usar ácidos bóricos sustituidos (por ejemplo, ácido fenilborónico, ácido butanoborónico y ácido p-bromofenilborónico) en lugar de ácido bórico.

(iii) Tensioactivo detersivo

La cantidad de tensioactivo detersivo incluido en las composiciones de detergente completamente formuladas, permitidas por la presente invención, puede variar de aproximadamente 1% a aproximadamente 99,8% dependiendo de los tensioactivos particulares usados y los efectos deseados. Preferiblemente, los tensioactivos detersivos comprenden de aproximadamente 5% a aproximadamente 80% en peso de los ingredientes de detergente.

\newpage

El tensioactivo detersivo puede ser: no iónico, aniónico, anfolítico, zwitteriónico o catiónico. También se pueden usar mezclas de estos tensioactivos. Las composiciones de detergente preferidas comprenden tensioactivos detersivos aniónicos o mezclas de tensioactivos aniónicos con otros tensioactivos, especialmente tensioactivos no iónicos.

Los ejemplos no limitantes de tensioactivos útiles en la presente memoria incluyen los alquilbencenosulfonatos C_{11}-C_{18} convencionales y alquilsulfatos primarios, secundarios y aleatorios, los alquilalcoxisulfatos C_{10}-C_{18}, los alquilpoliglicósidos C_{10}-C_{18} y sus correspondientes poliglicósidos sulfatados, ésteres de ácidos grasos alfasulfonatados C_{12}-C_{18}, alcoxilatos de alquilo y de alquilfenoles C_{12}-C_{18} (especialmente etoxilatos y etoxi/propoxi mezclados), betaínas y sulfobetaínas C_{12}-C_{18} ("sultaínas"), óxidos de amina C_{10}-C_{18}, sarcosinatos C_{8}-C_{24} (especialmente oleoilsarcosinato) y similares. Otros tensioactivos útiles convencionales se enumeran en textos habituales.

Una clase particular de tensioactivos no iónicos adjuntos, especialmente útiles en la presente memoria, comprenden las amidas de poli(hidroxiácidos grasos) de fórmula:

(I)R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R ^{1} }}

---Z

en la que: R^{1} es H, hidrocarbilo C_{1}-C_{8}, 2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo o una mezcla de los mismos, preferiblemente alquilo C_{1}- C_{4}, más preferiblemente alquilo C_{1} o C_{2}, lo más preferiblemente alquilo C_{1}, (es decir, metilo); y R^{2} es un resto hidrocarbilo C_{5}-C_{32}, preferiblemente alquilo o alquenilo C_{7}- C_{19} de cadena lineal, más preferiblemente alquilo o alquenilo C_{9}-C_{17} de cadena lineal, lo más preferiblemente alquilo o alquenilo C_{11}-C_{19} de cadena lineal o mezclas de los mismos; y Z es un resto polihidroxihidrocarbilo que tiene una cadena de hidrocarbilo lineal con al menos 2 (en el caso de gliceraldehido) o al menos 3 hidroxilos (en el caso de otros azúcares reductores) directamente unidos a la cadena, o un derivado alcoxilado (preferiblemente etoxilado o propoxilado) de los mismos. Z preferiblemente procederá de un azúcar reductor en una reacción de aminación reductora; más preferiblemente Z es un resto glicitilo. Los azúcares reductores adecuados incluyen: glucosa, fructosa, maltosa, lactosa, galactosa, manosa y xilosa, así como gliceraldehido. Como materias primas, se pueden utilizar: jarabe de glucosa rico en dextrosa, jarabe de glucosa rico en fructosa y jarabe de glucosa rico en maltosa, así como los azúcares individuales enumerados anteriormente. Estos jarabes de glucosa pueden producir una mezcla de componentes de azúcar para Z. Se debería entender que no se desea de ningún modo excluir otras materias primas adecuadas. Z preferiblemente se seleccionará del grupo que consta de: -CH_{2}-(CHOH)_{n}-CH_{2}OH, -CH(CH_{2}OH)-(CHOH)_{n-1}-CH_{2}OH, -CH_{2}-(CHOH)_{2}(CHOR')(CHOH)-CH_{2}OH, donde n es un número entero de 1 a 5, inclusive, y R' es H o un mono- o polisacárido cíclico y derivados alcoxilados de los mismos. Lo más preferido, son glicitilos en los que n es 4, particularmente -CH_{2}-(CHOH)_{4}-CH_{2}OH.

En la fórmula (I), R^{1} puede ser, por ejemplo, N-metilo, N-etilo, N-propilo, N-isopropilo, N-butilo, N-isobutilo, N-2-hidroxietilo o N-2-hidroxipropilo. Para la más alta formación de espuma, R^{1} es preferiblemente metilo o hidroxialquilo. Si se desea más baja formación de espuma, R^{1} es preferiblemente alquilo C_{2}-C_{8}, especialmente n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, pentilo, hexilo y 2- etilhexilo.

R^{2}-CO-N puede ser, por ejemplo, cocamida, estearamida, oleamida, lauramida, miristamida, capricamida, palmitamida, amida del sebo, etc.

Otra clase de tensioactivos no iónicos particularmente útiles en la presente invención, son condensados de óxido de etileno con un resto hidrófobo para proporcionar un tensioactivo que tiene un equilibrio (HLB) hidrófilo-lipófilo medio en el intervalo de 5 a 17, preferiblemente de 6 a 14, más preferiblemente de 7 a 12. El resto hidrófobo (lipófilo) puede ser alifático o aromático por naturaleza y se puede ajustar fácilmente la longitud del grupo polioxietileno que está condensado con cualquier grupo hidrófobo particular, para producir un compuesto soluble en agua con el grado deseado de equilibrio entre elementos hidrófilos e hidrófobos.

Los tensioactivos no iónicos especialmente preferidos de este tipo son los etoxilatos de alcoholes primarios C_{9}-C_{15} que contienen 3-8 moles de óxido de etileno por mol de alcohol, particularmente los alcoholes primarios C_{14}-C_{15} que contienen 6-8 moles de óxido de etileno por mol de alcohol, los alcoholes primarios C_{12}-C_{15} que contienen 3-5 moles de óxido de etileno por mol de alcohol y mezclas de los mismos.

(iv) Reforzantes de la detergencia detersivos

Los ingredientes de detergentes opcionales empleados en la presente invención contienen reforzantes de la detergencia detersivos inorgánicos y/u orgánicos, para favorecer el control de la dureza mineral. Si se usan, estos reforzantes de la detergencia comprenden de aproximadamente 5% a aproximadamente 80% en peso de las composiciones de detergente.

Los reforzantes de la detergencia inorgánicos incluyen, pero no se limitan a, sales de metal alcalino, amonio y alcanolamonio de polifosfatos (ejemplificados por los tripolifosfatos, pirofosfatos y metafosfatos poliméricos vítreos), fosfonatos, ácido fítico, silicatos, carbonatos (incluyendo bicarbonatos y sesquicarbonatos), sulfatos y aluminosilicatos. Sin embargo, se requieren reforzantes de la detergencia que no sean de fosfato en algunos locales.

Ejemplos de reforzantes de la detergencia de silicato son los silicatos de metal alcalino, particularmente los que tienen una relación SiO_{2}:Na_{2}O en el intervalo 1,6:1 a 3,2:1 y silicatos estratificados, tales como los silicatos de sodio estratificados descritos en la patente de EE.UU. 4.664.839, expedida el 12 de mayo de 1.987 a H.P. Rieck, disponible de Hoechst bajo la marca registrada "SKS"; SKS-6 es un reforzante de la detergencia de silicato estratificado especialmente preferido.

Los reforzantes de la detergencia de carbonato, especialmente un carbonato de calcio molido con área superficial mayor que 10 m^{2}/g, son reforzantes de la detergencia preferidos que se pueden usar en composiciones granulares. La densidad de tales detergentes reforzados de carbonato de metal alcalino pueden estar en el intervalo de 450-850 g/l con el contenido de humedad preferiblemente por debajo de 4%.

Ejemplos de reforzantes de la detergencia de carbonato son los carbonatos de metales alcalino-térreos y alcalinos como se describe en la solicitud de patente alemana Nº 2.321.001 publicada el 15 de noviembre de 1.973.

Los reforzantes de la detergencia de aluminosilicato son especialmente útiles en la presente invención. Los aluminosilicatos preferidos son reforzantes de la detergencia de zeolita que tienen la fórmula:

Na_{z}[(AlO_{2})_{z}(SiO_{2})_{y}]xH_{2}O

en la que z e y son números enteros de al menos 6, la relación molar de z e y está en el intervalo de 1,0 a aproximadamente 0,5, y x es un número entero de aproximadamente 15 a aproximadamente 264.

Los materiales de intercambio iónico de aluminosilicato útiles están comercialmente disponibles. Estos aluminosilicatos pueden ser cristalinos o amorfos en estructura y pueden ser aluminosilicatos que se encuentran en la naturaleza o derivados sintéticamente. Se describen métodos para producir materiales de intercambio iónico de aluminosilicato, en la patente de EE.UU. 3.985.669, Krummel, et al., expedida el 12 de octubre de 1.976 y la patente de EE.UU. 4.605.509, Corkill et al., expedida el 12 de agosto de 1.986. Los materiales de intercambio iónico de aluminosilicato cristalinos, sintéticos, preferidos, útiles en la presente memoria, están disponibles bajo las denominaciones Zeolita A, Zeolita P (B) (incluyendo las descritas en la patente EPO 384.070) y Zeolita X. Preferiblemente, el aluminosilicato tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 0,1-10 micrómetros de diámetro.

Reforzantes de la detergencia detersivos, orgánicos, adecuados para los propósitos de la presente invención incluyen, pero no se restringen a, una amplia variedad de compuestos de policarboxilatos, tales como policarboxilatos de éteres, incluyendo oxidisuccinato, como se describe en la patente de EE.UU. 3.128.287, Berg, expedida el 7 de abril de 1.964 y la patente de EE.UU. 3.635.830, Lamberti et al., expedida el 18 de enero de 1.972. Véanse también reforzantes de la detergencia "TMS/TDS" de la patente de EE.UU. 4.663.071, concedida a Bush et al., el 5 de mayo de 1.987. Los policarboxilatos de éter adecuados también incluyen compuestos cíclicos, particularmente compuestos alicíclicos tales como los descritos en las patentes de EE.UU. 3.923.679; 3.835.163; 4.158.635; 4.120.874 y 4.102.903.

Otros reforzantes de la detergencia detersivos útiles incluyen los hidroxipolicarboxilatos de éteres, copolímeros de anhídrido maleico con etileno o vinil metil éter; ácido 1,3,5-trihidroxibenceno-2,4,6-trisulfónico y ácido carboximetiloxisuccínico, las diversas sales de poli(ácidos acéticos) de metal alcalino, amonio y amonio sustituido tales como ácido etilendiaminotetraacético y ácido nitrilotriacético así como policarboxilatos tales como ácido melítico, ácido succínico, ácido oxidisuccínico, poli(ácido maleico), ácido benceno-1,3,5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico y sales solubles de los mismos.

Los reforzantes de la detergencia de citrato, por ejemplo, ácido cítrico y sales solubles del mismo (particularmente la sal sódica) son reforzantes de la detergencia de policarboxilato preferidos que también se pueden usar en composiciones granulares, especialmente junto con reforzantes de la detergencia de zeolita y/o de silicato estratificado.

También son adecuados en las composiciones de detergente de la presente invención, los 3,3-dicarboxi-4-oxa-1,6-hexanodioatos y los compuestos relacionados descritos en la patente de EE.UU. 4.566.984, Bush, expedida el 28 de enero de 1.986.

En situaciones donde se pueden usar los reforzantes de la detergencia a base de fósforo, y especialmente en la formulación de pastillas usadas para operaciones de lavandería a mano, se pueden usar los diversos fosfatos de metal alcalino tales como los bien conocidos tripolifosfatos de sodio, pirofosfato de sodio y ortofosfato de sodio. También se pueden usar reforzantes de la detergencia de fosfonato tales como etano-1-hidroxi-1,1-difosfonato y otros fosfonatos conocidos (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 3.159.581; 3.213.030; 3.422.021; 3.400.148 y 3.422.137).

(v) Adjuntos detersivos opcionales

Como una realización preferida, se pueden seleccionar los ingredientes de detergentes convencionales empleados en la presente memoria, a partir de componentes típicos de las composiciones de detergente tales como tensioactivos detersivos y reforzantes de la detergencia detersivos. Opcionalmente, los ingredientes de detergente pueden incluir uno o más de otros adjuntos u otros materiales detersivos para favorecer o exaltar la realización de limpieza, el tratamiento del substrato que se tiene que limpiar o para modificar la estética de la composición de detergente. Los adjuntos detersivos usuales de composiciones de detergente, incluidos los ingredientes expuestos en la patente de EE.UU. Nº 3.936.537, Baskerville et al., se incorporan en la presente memoria por referencia. Tales adjuntos que se pueden incluir en composiciones de detergente, empleados en la presente invención, en sus niveles establecidos en la técnica, convencionales, para uso (normalmente de 0% a aproximadamente 20% de los ingredientes de detergentes, preferiblemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10%), incluyen: motas de color, reforzantes de la espuma, supresores de la espuma, agentes de deslustrado y/o anticorrosión, agentes de suspensión de la suciedad, agentes de liberación de la suciedad, colorantes, cargas, abrillantadores ópticos, germicidas, fuentes de alcalinidad, hidrótropos, antioxidantes, perfumes, disolventes, agentes de solubilización, agentes de eliminación/antireprecipitación de suciedad de arcilla, agentes de dispersión poliméricos, auxiliares de procesado, componentes de ablandamiento de tejidos (por ejemplo, arcillas de esmectita), agentes inhibidores de la transferencia de colorantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona), agentes de control estático, etc.

Los sistemas de blanqueo opcionalmente, pero preferiblemente, también comprenderán un quelante que no sólo exalte la estabilidad del agente blanqueador por eliminación de iones de metales pesados que tienden a descomponer los agentes blanqueadores, sino que también favorezcan la eliminación de manchas polifenólicas tales como manchas de té y similares. Diversos quelantes, incluyendo los aminofosfonatos, disponibles como DEQUEST de Monsanto, los nitrilotriacetatos, los hidroxietiletilendiaminotriacetatos y similares, se conocen por tal uso. Los quelantes no fosforados, biodegradables, preferidos, incluyen los compuestos: etilendiaminodisuccinato ("EDDS"; véase la patente de EE.UU. 4.704.233, Hartman y Perkins), etilendiamino-N,N'-diglutamato (EDDG) y 2-hidroxipropilendiamino-N,N'-disuccinato (HPDDS). Tales quelantes se pueden usar en sus sales de metal alcalino o alcalino-térreo, típicamente a niveles de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 10% de las composiciones presentes.

Las composiciones de la presente invención son especialmente útiles como composiciones de detergentes de lavandería convencionales tales como los típicamente encontrados en detergentes granulares o pastillas de lavandería. La patente de EE.UU. 3.178.370, Okenfuss, expedida el 13 de abril de 1.965, describe pastillas de detergente de lavandería y procedimientos para prepararlas. La patente filipina 13.778, Anderson, expedida el 23 de septiembre de 1.980, describe pastillas de lavandería de detergente sintético. Los métodos para preparar pastillas de detergente de lavandería por diversos métodos de extrusión se conocen bien en la técnica.

Los ejemplos siguientes se dan para ilustrar adicionalmente la presente invención, pero no se desea que sean limitantes de la misma.

Ejemplo 1

Se preparó una composición de detergente granular que comprendía los Siguientes ingredientes.

Componente	% en peso
Alquilbencenosulfonato lineal C_{12}	22
Fosfato (como tripolifosfato de sodio)	30
Carbonato de sodio	14
Silicato de sodio	3
Proteasa 12	0,3
Percarbonato de sodio	5
Quelante etilendiaminodisuccinato (EDDS)	0,4
Sulfato de sodio	5,5
Nonanoilcaprolactama	5
Carga* y agua	Equilibrio a 100%
*Se puede seleccionar a partir de los materiales oportunos tales como CaCO_{3},
talco, arcilla,silicatos y similares.

Se prepararon mezclas soporte acuosas de componentes estables al calor y a los álcalis de las composiciones de detergente y se desecaron por atomización y se mezclaron los otros ingredientes de forma que contuvieran los ingredientes tabulados a los niveles mostrados.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 2

Se preparó una composición de detergente granular que comprendía los siguientes ingredientes.

Componente	% en Peso
Alquilsulfato aniónico	7
Tensioactivo no iónico	5
Zeolita (0,1-10 micrómetros)	10
Citrato trisódico	2
Reforzante de la detergencia de silicato SKS-6	10
Polímero de acrilato-maleato	4
Nonanoilcaprolactama	5
Percarbonato de sodio*	15
Carbonato de sodio	5
Quelante de etilendiaminodisuccinato (EDDS)	0,4
Supresor de espuma	2
Proteasa 12	0,3
Lipasa	0,3
Agente de liberación de suciedad	0,2
Minoritarios, carga** y agua	Equilibrio al 100%
*Tamaño medio de partícula de 400 a 1.200 micrómetros.
**Se puede seleccionar a partir de los materiales oportunos tales como CaCO_{3},
talco, arcilla, silicatos y similares.

Se prepararon mezclas soporte acuosas de componentes estables al calor y a los álcalis de la composición de detergente y se desecaron por atomización, y los otros ingredientes se mezclaron de forman que contuvieran los ingredientes tabulados a los niveles mostrados.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención referidas en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 3

Se preparó una composición de detergente por un procedimiento idéntico al del Ejemplo 2, con las excepciones de que el 15% de una mezcla 1:1:1 de benzoilcaprolactama, nonanoilcaprolactama y (6-nonanamidocaproil)oxibencenosulfonato se sustituyó por la nonanoilcaprolactama y la cantidad de percarbonato de sodio fue 30%.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 4

Se preparó una composición de detergente por un procedimiento idéntico al del Ejemplo 1, con las excepciones de que el 20% de una mezcla 1:1 de benzoilcaprolactama y (6-nonanamidocaproil)oxibencenosulfonato se sustituyó por la nonanoilcaprolactama, la cantidad de percarbonato de sodio fue 20% y la cantidad de fosfato fue 0%.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención, referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 5

Se preparó una composición de detergente por un procedimiento idéntico al del Ejemplo 2, con la única excepción de que se sustituyó una cantidad equivalente de un activador de tipo benzoxazina, por la nonanoilcaprolactama.

\newpage

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención, referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 6

Se preparó una composición de detergente por un procedimiento idéntico al del Ejemplo 2, con las excepciones de que el 10% de una mezcla 1:1 de un activador de tipo benzoxazina y tetraacetiletilendiamina, se sustituyó por la nonanoilcaprolactama y la cantidad de percarbonato de sodio fue 25%.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención, referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 7

Se preparó una pastilla de lavandería adecuada para tejidos ensuciados, para lavar a mano, por procedimientos de extrusión clásicos y comprendió lo siguiente:

Componente	% en Peso
Alquilbencenosulfonato lineal C_{12}	30
Fosfato (como tripolifosfato de sodio)	7
Carbonato de sodio	25
Pirofosfato de sodio	7
Monoetanolamida de coco	2
Zeolita A (0,1-10 micrómetros)	5
Carboximetilcelulosa	0,2
Poliacrilato (p.m. 1.400)	0,2
(6-nonanamidocaproil)oxibencenosulfonato	5
Percarbonato de sodio	5
Abrillantador, perfume	0,2
Proteasa 12	0,3**
Lipasa	0,3
CaSO_{4}	1
MgSO_{4}	1
Agua	4
Carga*	Equilibrio para 100%
*Se puede seleccionar a partir de los materiales oportunos tales como CaCO_{3},
talco, arcilla, silicatos y similares.
**Indica mg de enzima activa por gramo de composición.

Las pastillas de lavandería, de detergente, se elaboraron en pastillas de jabón o de detergente convencionales preparando equipo como se usa comúnmente en la técnica.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención, referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 8

Se preparó una composición de detergente por un procedimiento idéntico al del Ejemplo 7, con la única excepción de que se sustituyó una cantidad equivalente de benzoilcaprolactama, por la (6-nonanamidocaproil)oxibencenosulfonato.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención, referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

\newpage

Ejemplo 9

Se preparó una composición de detergente por un procedimiento idéntico al del Ejemplo 7, con la única excepción de que se sustituyó una cantidad equivalente de nonanoilcaprolactama por (6-nonanamidocaproil)oxibenceno-
sulfonato.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención, referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 10

Se preparó una composición de detergente granular que comprendía los siguientes ingredientes.

Componente	% en Peso
Alquilsulfato aniónico	7
Tensioactivo no iónico	5
Zeolita (0,1-10 micrómetros)	10
Citrato trisódico	2
Reforzante de la detergencia de silicato SKS-6	10
Polímero de acrilato-maleato	4
Nonanoilcaprolactama	5
Percarbonato de sodio*	15
Carbonato de sodio	5
Quelante de etilendiaminodisuccinato (EDDS)	0,4
Supresor de espuma	2
Proteasa 12	0,5
Agente de liberación de suciedad	0,2
Minoritarios, carga** y agua	Equilibrio al 100%
*Tamaño medio de partícula de 400 a 1.200 micrómetros.
**Se puede seleccionar a partir de los materiales oportunos tales como CaCO_{3},
talco, arcilla, silicatos y similares.

Se prepararon mezclas soporte acuosas de componentes estables al calor y a los álcalis de la composición de detergente y se desecaron por atomización, y se mezclaron los otros ingredientes de forma que contuvieran los ingredientes tabulados a los niveles mostrados.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 11

Se preparó una composición de detergente por un procedimiento idéntico al del Ejemplo 10, con la única excepción de que se sustituyó una cantidad equivalente de benzoilcaprolactama por la nonanoilcaprolactama.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención, referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 12

Se preparó una composición de detergente por un procedimiento idéntico al del Ejemplo 10, con las excepciones de que el 15%, en peso, de (6-nonanamidocaproil)oxibencenosulfonato se sustituyó por la nonanoilcaprolactama y la cantidad de percarbonato de sodio fue 30%.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención, referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 13

Se preparó una composición de detergente por un procedimiento idéntico al del Ejemplo 10, con las excepciones de que el 15%, en peso, de un activador de tipo benzoxazina se sustituyó por la nonanoilcaprolactama y la cantidad de percarbonato de sodio fue 30%.

En este ejemplo las Proteasas 1-11 y 13-25 referidas en la Tabla III, entre otras incluyendo las proteasas adicionales útiles en la presente invención, descritas en las Tablas V y VI, se sustituyeron por Proteasa 12, con resultados sustancialmente similares. También en este ejemplo, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente invención, referidas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyó por Proteasa 12 con resultados sustancialmente similares.

Ejemplo 14 Ensayo de realización de lavado

La realización de lavado de las variantes útiles en las composiciones de la presente invención se evaluó midiendo la eliminación de manchas de pedazos de tejido de muestra (sangre/leche/negro de carbono sobre algodón) EMPA 116 (Testfabrics, Inc., Middlesex, NJ 07030).

Se colocaron seis pedazos de tejido de muestra EMPA 116, cortados a 7,62 x 11,43 cm (3x4-1/2 pulgadas) con bordes picados, en cada marmita de un sistema de lavado modelo "Terg-O-Tometer" Modelo 7243S (United States Testing Co., Inc., Hoboken, NJ) que contenía 1.000 ml de agua, 256,5 ppm (15 gpg) de dureza (Ca^{++}:Mg^{++}::3:1::p:p), 7 g de detergente y enzima como fuera apropiado. El detergente base fue detergente WFK1 de wfk-Testgewebe GmbH, Adlerstrasse 42, Postfach 13 07 62, D-47759 Krefeld, Alemania:

Componente	% de Formulación final
Zeolita A	25%
Sulfato de sodio	25%
Sosa	10%
Alquilbencenosulfonato lineal	8,8%
Etoxilato de alcoholes (7-8 EO)	4,5%
Jabón de sodio	3%
Silicato de sodio (SiO_{2}:Na_{2}O::3,3:1)	3%

Para este detergente base se hicieron las siguientes adiciones:

Componente	% de Formulación Final
Perborato de sodio monohidratado	13%
Copolímero (Sokalan CP5)	4%
TAED (Mykon ATC Green)	3%
Enzima	0,5%
Abrillantador (Tinopal AMS-GX)	0,2%

Se obtuvo perborato de sodio monohidratado de Degussa Corporation, Ridgefield-Park, NJ 07660. Se obtuvo Sokalan CP5 de BASF Corporation, Parsippany, NJ 07054. Se obtuvo Mykon ATC Green (TAED, tetraacetiletilendiamina) de Warwick International, Limited, Mostyn, Holywell, Clwyd CH8 9HE, Inglaterra. Se obtuvo Tinopal AMS GX de Ciba-Geigy Corporation, Greensboro, NC 27.419.

Se lavaron seis pedazos de tejido de muestra EMPA 116 en detergente con enzima durante 30 minutos a 60ºC y con posterioridad se enjuagaron dos veces durante 5 minutos cada vez en 1.000 ml de agua. Se añadieron enzimas a concentraciones finales de 0,05 a 1 ppm para curvas estándar, y 0,25 ppm para análisis de rutina. Se secaron y prensaron los pedazos de tejido de muestra, y se midió la reflectancia de los pedazos de tejido de muestra usando el valor L sobre la escala L a b de un cromámetro Minolta, Modelo CR-200 (Minolta Corporation, Ramsey, NJ 07446). La realización se refirió como porcentaje de la realización de proteasa (GG36) de B. lentus y se calculó dividiendo la cantidad de proteasa (GG36) de B. Lentus por la cantidad de proteasa variante que se requería para proporcionar la misma realización X 100 de eliminación de manchas. Los datos se muestran en la Tabla VII.

TABLA VII

Enzima	Realización de lavado
Subtilisina de B. Lentus	100
N76D	310
N76D/S103A	230
N76D/V104I	130
N76D/V107V	160
N76D/S99D/S101R	370
N76D/S99D/S103A	290
N76D/S101R/S103A	130
N76D/S101R/V104I	300
N76D/S103A/V104I	320
N76D/S103G/V104I	160
N76D/S103A/V104F	210
N76D/S103A/V104N	110
N76D/S103A/V104T	170
N76D/V104I/I107V	210
N76D/S99D/S101R/S103A	220
N76D/S99D/S101R/V104I	140
N76D/S101G/S103A/V104I	170
N76D/S101R/S103A/V104I	150
N76D/S103A/V104I/S105A	170
N76D/S103A/V104T/I107A	120
N76D/S103A/V104T/I107L	110
N76D/S103A/V104I/L126F	110
N76D/S103A/V104I/S128G	280
N76D/S103A/V104I/L135I	160
N76D/S103A/V104I/L135V	160
N76D/S103A/V104I/D197E	170
N76D/S103A/V104I/N204A	160
N76D/S103A/V104I/N204G	150
N76D/S103A/V104I/P210I	470
N76D/S103A/V104I/M222A	100
N76D/S103A/V104I/T260P	280
N76D/S103A/V104I/S265N	190

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Ghosh, Chanchal K.

\hskip3,3cm

Burns, Michael E.

\hskip3,3cm

DiGiulio, David N.

\hskip3,3cm

Getty, Edward E.

\hskip3,3cm

Hartshorn, Richard T.

\hskip3,3cm

Willey, Alan D.

\hskip3,3cm

Brode, Philip F., III

\hskip3,3cm

Barnett, Bobby L.

\hskip3,3cm

Rubingh, Donn N.

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones de Blanqueo que Comprenden Enzimas Proteasa

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 15

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: The Procter & Gamble Company

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 11.810 East River Road

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Cincinnati

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: OH

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: U.S.A.

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 45.253-8.707

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMULARIO LEIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERADOR: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release 1,0, versión 1,25

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 13 de octubre de 1.994

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN ABOGADO/ AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Zerby, Kim William

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.323

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO REFERENCIA/CERTIFICADO: 5041R

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

Teléfono: (513) 627-2885

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

Telefax: (513) 627-0318

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID Nº. 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAAGCTGCAA CTCGTTAAA

\hfill

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTGCTCTAG ACAATTCG

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT

\hfill

39

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº. 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG

\hfill

33

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.497 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:

34

35

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 275 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 275 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:

37

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 274 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:

38

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 269 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:

39

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.140 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.140 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TATGCCAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T

\hfill

31

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N:15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA CATENARIO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTGACGGTT CCGGCGCTAT TAGTTGGATC ATT

\hfill

33

Claims (19)

1.Una composición de blanqueo que comprende:

(a)

una cantidad eficaz de enzima proteasa, que es una variante de la carbonil-hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que procede de una carbonil-hidrolasa precursora de subtilisina, y en la que la enzima proteasa es una variante de la subtilisina de Bacillus lentus seleccionada de:

N76D/S99D; N76D/S101R; N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/I107V; N76D/N123S; N76D/S99D/S101 R; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V 104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/I107V/N123S; N76D/S99D /S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N7 6D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/ S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S 103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S 105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S 103A/V104I/L126F/S265N y N76D/S103A/V104I/M222A y mezclas de las mismas, donde la posición numerada corresponde a subtilisina que se encuentra en la naturaleza, de Bacillus amyloliquefaciens; y

(b)

un agente de blanqueo que bien es un peroxiácido orgánico o es una combinación de un activador de blanqueo y un compuesto de peroxígeno capaz de producir peróxido de hidrógeno, que puede reaccionar con el activador para formar un peroxiácido orgánico in situ en una solución de blanqueo formada a partir de la composición; y

(c)

uno o más materiales de composiciones de limpieza compatibles con la enzima proteasa y el agente de blanqueo.

2. La composición de blanqueo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos aproximadamente 5% de tensioactivo seleccionado del grupo que consta de: alquilbencenosulfonatos, alquilsulfatos primarios, alquilsulfatos secundarios, alquilalcoxisulfatos, alquilalcoxicarboxilatos, alquilpoliglicósidos y sus correspondientes poliglicósidos sulfatados, ésteres de ácidos grasos alfa-sulfonatados, alcoxilatos de alquilo y de alquilfenoles, betaínas y sulfobetaínas, óxidos de amina, N-metilglucamidas, etoxilatos de alcoholes primarios no iónicos, mezcla etoxi/propoxi de alcoholes primarios no iónicos y mezclas de los mismos.

3. Las composiciones de blanqueo de acuerdo con la reivindicación 1, en las que los materiales de la composición de limpieza comprenden al menos un suavizador de tejidos.

4. Una composición de limpieza de tejidos de acuerdo con la reivindicación 1, en la que:

(b)

el agente de blanqueo está comprendido a un nivel de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 20% y se selecciona del grupo que consta de:

(i)

un peroxiácido orgánico de la fórmula:

R^{1}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---OOH,

\hskip1cm

R^{1}---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- OOH

en la que R^{1} es un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, R^{2} es un grupo alquileno,arileno o alcarileno que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, y R^{5} es H o un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono, y

(ii)

una combinación de un activador de blanqueo y un compuesto de peroxígeno capaz de producir peróxido de hidrógeno, que puede reaccionar con el activador para formar un peroxiácido orgánico in situ en una solución de blanqueo formada a partir de la composición, en la que dicho activador de blanqueo tiene la fórmula general:

R---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L

\newpage

en la que R es un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 18 átomos de carbono, en la que la cadena alquílica lineal más larga que se extiende desde, y que incluye el carbono carbonílico, contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 átomos de carbono y L es un grupo saliente, cuyo ácido conjugado tiene un pKa en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 13; y

(c)

los materiales de la composición de limpieza comprenden al menos aproximadamente 5% de tensioactivo y al menos aproximadamente 5% de reforzante de la detergencia, en peso de la composición.

5. La composición de limpieza de tejidos de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la enzima proteasa es una variante de la subtilisina de Bacillus lentus seleccionada de: N76D/S99D; N76D/V104I; N76D/S99D/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S101R/S
103A/V104I; N76D/S101R/V104I, donde la posición numerada corresponde a subtilisina que se encuentra en la naturaleza, de Bacillus amyloliquefaciens, y mezclas de las mismas.

6. La composición de limpieza de tejidos de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la enzima proteasa es una variante de la subtilisina de Bacillus lentus seleccionada de N76D/V104I; N76D/S103A/V104I; donde la posición numerada corresponde a subtilisina que se encuentra en la naturaleza, de Bacillus amyloliquefaciens, y mezclas de las mismas.

7. Las composiciones de limpieza de tejidos de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende un agente de blanqueo que comprende al menos aproximadamente 0,1% en peso de un compuesto de blanqueo de peroxígeno capaz de producir peróxido de hidrógeno en una lejía acuosa y al menos 0,1% en peso de uno o más activadores de blanqueo, en las que dichos activadores de blanqueo son miembros seleccionados del grupo que consta de:

a)

un activador de blanqueo de la fórmula general:

R^{1}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L,

\hskip1cm

R^{1}---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L

o mezclas de las mismas, en las que R^{1} es un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, R^{2} es un grupo alquileno, arileno o alcarileno que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, R^{5} es H o un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono, y L es un grupo saliente;

b)

un activador de blanqueo de tipo benzoxazina de la fórmula:

46

en la que R^{1} es H, alquilo, alcarilo, arilo, arilalquilo y en la que R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} pueden ser el mismo o diferente sustituyente seleccionado de: H, halógeno, alquilo, alquenilo, arilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, alquilamino, -COOR_{6}, en el que R_{6} es H o un grupo alquilo y funciones carbonilo;

c)

un activador de blanqueo de N-acilcaprolactama de la fórmula:

47

en la que R_{6} es H o un grupo alquilo, arilo, alcoxiarilo o alcarilo que contiene de 1 a 12 carbonos; y

d)

mezclas de a), b) y c).

8. La composición de limpieza de tejidos de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el correspondiente ácido carboxílico del agente de blanqueo de peroxiácido orgánico, tiene un valor de Equilibrio Hidrófilo-Lipófilo dentro del intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 6,5.

9. La composición de limpieza de tejidos de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la relación de mg de enzima proteasa por cada 100 gramos de composición a ppm de O_{2} teórico disponible del peroxiácido orgánico, está dentro del intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 20:1.

10. Una composición de limpieza de tejidos que comprende:

(a)

de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 10% de enzima proteasa, que es una variante de la subtilisina N76D/S103A/V104I procedente de la subtilisina de Bacillus lentus, donde la posición numerada corresponde a subtilisina que se encuentra en la naturaleza, de Bacillus amyloliquefaciens;

(b)

de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 20% de un sistema de blanqueo que comprende al menos aproximadamente 0,1% en peso de un compuesto de blanqueo de peroxígeno capaz de producir peróxido de hidrógeno en una lejía acuosa y al menos 0,1% en peso de uno o más activadores de blanqueo, en la que dichos activadores de blanqueo son miembros seleccionados del grupo que consta de:

(i)

un activador de blanqueo de la fórmula general:

R^{1}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L,

\hskip1cm

R^{1}---

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{5} }}

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---R^{2}---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---L

o

mezclas de las mismas, en las que R^{1} es un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, R^{2} es un grupo alquileno, arileno o alcarileno que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 átomos de carbono, R^{5} es H o un grupo alquilo, arilo o alcarilo que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono, y L es un grupo saliente;

(ii)

un activador de blanqueo de tipo benzoxazina de la fórmula:

49

en la que R^{1} es H, alquilo, alcarilo, arilo, arilalquilo y en la que R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} pueden ser el mismo o diferente sustituyente seleccionado de: H, halógeno, alquilo, alquenilo, arilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, alquilamino, -COOR_{6}, en el que R_{6} es H o un grupo alquilo y funciones carbonilo;

(iii)

un activador de blanqueo de N-acilcaprolactama de la fórmula:

50

en la que R_{6} es H o un grupo alquilo, arilo, alcoxiarilo o alcarilo que contiene de 1 a 12 carbonos; y

(iv)

mezclas de i), ii) y iii).

(c)

al menos aproximadamente tensioactivo al 5%;

(d)

al menos aproximadamente reforzante de la detergencia al 5%; y

(e)

opcionalmente, uno o más materiales de la composición de limpieza compatible(s) con la enzima proteasa y el sistema de blanqueo seleccionado del grupo que consta de: disolventes, tampones, enzimas, agentes de liberación de suciedad, agentes de eliminación de suciedad de arcilla, agentes dispersantes, abrillantadores, supresores de espuma, suavizadores de tejidos, reforzantes de espuma, estabilizantes de enzimas, colorantes, perfumes y mezclas de los mismos.

11. La composición de limpieza de tejidos de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el tensioactivo se selecciona del grupo que consta de: alquilbencenosulfonatos, alquilsulfatos primarios, alquilsulfatos secundarios, alquilalcoxisulfatos, alquilalcoxicarboxilatos, alquilpoliglicósidos y sus correspondientes poliglicósidos sulfatados, ésteres de ácidos grasos alfa-sulfonatados, alcoxilatos de alquilo y de alquilfenoles, betaínas y sulfobetaínas, óxidos de amina, N-metilglucamidas, etoxilatos de alcoholes primarios no iónicos, mezcla etoxi/propoxi de alcoholes primarios no iónicos y mezclas de los mismos; y en la que además el reforzante de la detergencia se selecciona del grupo que consta de: zeolitas, policarboxilatos, silicatos estratificados, fosfatos y mezclas de los mismos.

12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicho activador de blanqueo se selecciona del grupo que consta de: benzoilcaprolactama, nonanoilcaprolactama, (6-nonanamidocaproil)oxibencenosulfonato y mezclas de los mismos.

13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el compuesto de blanqueo de peroxígeno se selecciona del grupo que consta de: perborato de sodio monohidratado, perborato de sodio tetrahidratado, peroxihidrato de pirofosfato de sodio, peroxihidrato de urea, percarbonato de sodio, peróxido de sodio y mezclas de los mismos.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que la relación molar de peróxido de hidrógeno a activador de blanqueo es mayor que aproximadamente 1,0.

15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que R^{1} es un grupo alquilo, que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 átomos de carbono, R^{2} contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono, y R^{5} es H o metilo.

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que R^{1} es un grupo alquilo, que contiene de aproximadamente 7 a aproximadamente 10 átomos de carbono y R^{2} contiene de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 átomos de carbono, y en la que L se selecciona del grupo que consta de:

51

en las que R^{3} es una cadena alquílica que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono, e Y es -SO_{3}^{-}M^{+} o -CO_{2}^{-}M^{+} en los que M es sodio o potasio.

17. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende una N-acilcaprolactama seleccionada del grupo que consta de: benzoilcaprolactama, octanoilcaprolactama, nonanoilcaprolactama, 3,5,5-trimetilhexanoilcaprolactama, decanoilcaprolactama, undecenoilcaprolactama y mezclas de las mismas.

18. Un método para limpiar tejidos, comprendiendo dicho método poner en contacto un género que necesite que se limpie, con una solución de lavado que contiene una cantidad eficaz de una composición de acuerdo con la reivindicación 1.

19. Un método para limpiar tejidos, comprendiendo dicho método poner en contacto un género que necesite que se limpie, con una solución de lavado que contiene una cantidad eficaz de una composición de acuerdo con la reivindicación 10.