JPH08508648A

JPH08508648A - 高等真核細胞へ外来ｄｎａを導入するためのアデノウイルス

Info

Publication number: JPH08508648A
Application number: JP6522697A
Authority: JP
Inventors: マシューコッテン; エルンシュトヴァーグナー
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング; ジェネンテックインコーポレイテッド
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1994-04-06
Publication date: 1996-09-17
Anticipated expiration: 2019-04-12
Also published as: JP3519407B2; ATE214102T1; DE59410071D1; US5693509A; EP0694071B1; DE4311651A1; PT694071E; ES2171167T3; WO1994024299A1; EP0694071A1; DK0694071T3

Abstract

(57)【要約】高等真核細胞内に外来ＤＮＡを導入ために、表面がトランスフェリンで修飾されたアデノウイルス、好ましくはトランスフェリンの糖タンパク質部分で結合しているアデノウイルスについて述べられている。外来ＤＮＡは、アデノウイルス受容体を有しない細胞内に導入され、発現される。アデノウイルスは、組み換え又は非組み換えのものであることができる。

Description

【発明の詳細な説明】高等真核細胞へ外来ＤＮＡを導入するためのアデノウイルス本発明は、高等真核細胞への核酸の導入に関する。遺伝子療法においては、特に生きた細胞に核酸を導入する有効な系が必要である。このことは、治療に有効な遺伝子生成物の合成を体内で達成するために、例えば、遺伝子の欠損がある場合に欠損のある遺伝子を置き換えるために、細胞に遺伝子を導入することを示している。細胞内への遺伝子の導入のために、例えば、起源のウイルスの有効な侵入機構を使用するウイルスベクターが用いられる。これは、細胞内で発現される遺伝子が、組み換え法によってゲノム中に組み込まれたウイルスを意味している。この方法は、試験管内及び生体内での非常に有効な遺伝子導入を得るために、組み換えレトロウイルス及びアデノウイルスのベクターの構築において使用された。遺伝子療法の中で核酸を使用する最も先進的技術では、細胞内に遺伝子を導入するレトロウイルス系を使用する（Wilson et al.，1990；Kasid et al.，1990）。それゆえ、レトロウイルス系の適用可能性を拡大するため又は、例えばウイルスの親和性を変えることなどで、定められた細胞集団に特異的にするための方法が既に開発されている。フランス特許出願第2 649 119 号と同じくRoux et al.，1889では、一方ではウイルスコートに対する抗体を含み、及び他方では標的細胞に特異的な細胞膜マーカーを含み、そしてウイルスと宿主細胞との間に結合を生じる複機能性の複合体によりレトロウイルスの親和性を変える系が述べられている。 Goud et al.，1988により提案された方法もまた複機能性の複合体の原理をもとにしている。これらの複合体は、２つのモノクローナル抗体から構成され、この抗体の一方はヒトトランスフェリン受容体に対するものであり、他方がモロニー（Moloney）レトロウイルスのgp70コートタンパク質に対するものである。これらの複合体とともに、標的細胞内に侵入することができるが、レトロウイルスは細胞内で複製はできない。国際出願WO 92/06180号に述べられているウイルスの親和性を変える方法は、標的細胞の表面受容体に結合する分子をウイルス表面に供給することであり、それにより、自然には存在しない標的細胞のための特異性をウイルスに与えることである。国際出願WO 92/06180号は、アシアログリコプロテイン受容体に結合する炭水化物分子によるレトロウイルス及びＢ型肝炎ウイルスの修飾について述べている。遺伝子療法で使用するために、最近では組み換えアデノウイルスが、組み換えレトロウイルスと次第に置き換わりつつある（Berkner，1988；Stratford-Perri caudet et al.，1990；Rosenfeld et al.，1991；Rosenfeld et al.，1992；Str atford-Perricaudet et al.，1992）。アデノウイルスベクターは、非分裂細胞に侵入し、８.５kb程度までの外来ＤＮＡ配列を吸収する有益な能力を有している。さらに、アデノウイルス粒子は、ほとんど安定性を失うことなく十分に精製することができ、10¹¹PFUs／mlより大きい力価で製造される。アデノウイルスAd２及びAd５に由来する組み換えベクターの使用上の制限は、血液細胞中に侵入する能力が制限されることにある。しかしながら、血液細胞は容易に利用できるので、遺伝子療法における利用のためには好ましい標的であり、患者に再導入されることができ、さらに、血液細胞を獲得又は培養する方法が十分に確立されている。血液細胞中のアデノウイルスの能力が低い理由は、これら細胞上のアデノウイルスのための受容体数が明らかに少ないことにある（Horv ath and Weber 1988；Silver and Anderson，1988）。これら細胞へのウイルスの結合が２から５の要因により減少させられるときに、その結合したウイルスの受容体依存性エンドサイトーシス（internalisation）はさらに少ない。最初に受容体数が少ないことは、利用できる受容体の受容体依存性エンドサイトーシスが大きく減少することを伴うことがわかる。最近では、多くの研究において、エンドソーム含有物を放出するアデノウイルスの能力を考慮して、受容体依存性エンドサイトーシスによってＤＮＡ複合体とともに遺伝子導入用の非組み換えアデノウイルスを使用することが提案されている。アデノウイルスの使用は、細胞内に取り込まれたリソソーム中のＤＮＡ複合体の分解を回避することにより、遺伝子導入効率を増加させる（Curiel et al. ，1991；Curiel et al.，1992a；Zatloukal et al.，1992；Cotten et al.，199 2；Wagner et al.，1992；Curiel et al.，1992b；Yoshimura et al.，1993；WO 93/07283）。中でも、ポリリシンと結合することによりアデノウイルスを改良することが提案されている。アデノウイルス−ポリリシン−複合体は、ＤＮＡとともにトランスフェリン−ポリリシンの複合体と複合されることができ、それにより、トランスフェリン−ポリリシン／アデノウイルス−ポリリシン／ＤＮＡ三成分複合体を得ている（Wagner et al.，1992）。この研究の中で、トランスフェリン−ポリリシン−複合体を伴う感染において、遊離アデノウイルスの存在下では、K562細胞は導入レポーター遺伝子の極めて低い発現率を示すことが見出された。ところが、ポリリシン結合アデノウイルスでは、三成分複合体を形成するためにトランスフェリン−ポリリシンと共にレポーターＤＮＡと複合し、極めて良好な結果が得られている。この現象は、恐らく、アデノウイルス受容体数が少ない血液細胞におけるＤＮＡ複合体の受容体依存性エンドサイトーシスが、血液細胞が多数有しているトランスフェリン受容体を通じて起きていることに帰することができる。アデノウイルスは、アデノウイルス受容体を持たない又は有効な受容体依存性エンドサイトーシスを十分有さない細胞内に侵入することはできず、又は、生体内での使用が重要であるので、例えば抗体などによってウイルスの結合部位がブロックされることにより妨げられる。本発明の目的は、細胞の遺伝子発現のための能力及び／又はそのエンドソームの特性を保持しつつ、通常では侵入することができない細胞中に有効に侵入するための能力をアデノウイルスに与えることである。それゆえ本発明は、高等真核細胞中に外来ＤＮＡを導入するためのウイルス、即ち、細胞に結合するように標的細胞表面受容体のリガンドでウイルス表面が修飾され、及び細胞内で外来ＤＮＡが発現されるように取り込まれるウイルスに関する。該ウイルスはアデノウイルスであり、リガンドがトランスフェリンであるということを特徴としている。驚くべきことに、非修飾アデノウイルスの吸収に敏感でない血液細胞において、トランスフェリン修飾アデノウイルスにより、外来ＤＮＡが取り込まれ、有効に発現できることが見出されている。細胞がウイルスにより感染されるとき、多くの複合過程が、異なるウイルスに異なる方法で行われている。例えば、ウイルスが受容体へ結合する際に受ける形状の変化が、取り込み及び複製の過程に実質的に必須であるかもしれないが、ウイルスの生産的な侵入は受容体へのウイルスの結合に関連した様々な事柄を含んでいるので、ウイルスが修飾を受けるときに感染に必要な上記の事柄の間の関連性が維持されているかどうか予想することはできない。ウイルス受容体での非修飾ウイルス（A）の侵入と比較した、トランスフェリン受容体（B）でのトランスフェリン修飾アデノウイルスの侵入を、図１に図形的に示した。アデノウイルス受容体を持たない又は十分に持たないがトランスフェリン受容体を持つ細胞内への、トランスフェリン−ポリリシン／ＤＮＡ複合体の吸収を改善するために、途中で、本発明のトランスフェリン修飾アデノウイルスを使用することができる。途中で使用されるとき、修飾されたアデノウイルスは、トランスフェリン−ポリリシン／ＤＮＡ複合体と共に感染される細胞に対して利用され、ＤＮＡ複合体と共に細胞内へ吸収され、そしてエンドソームの性質によって、エンドソームからのＤＮＡ複合体の放出を行うために利用される（Curiel et al .，1991）。修飾されたアデノウイルスは、三成分の組成又は組み合わされた複合体として（Zatloukal et al.，1992）、これら複合体の能力を増加するために使用されることもできる。この目的のために本発明のトランスフェリン修飾ウイルスは、例えばビオチン−ストレプタビジンのブリッジによって、ポリリシン／ＤＮＡ複合体と組み合わされる。その際、ポリリシンはまた任意にトランスフェリンと複合される。トランスフェリンがアデノウイルスと結合した結果、トランスフェリン受容体を持つ細胞において、この場合のウイルスは、エンドソームの機能に加えて、組み合わされた複合体を取り込む因子としての機能を有している。本発明のアデノウイルス複合体は、アデノウイルスが遺伝子導入での増加をもたらすために使用される、いかなる利用においても使用することができる（Curiel et al.，1991; Curiel et al.，1992a；Zatloukal et al.，1992；Cot ten et al.，1992；Wagner et al.，1992；Curiel et al.，1992b；Yoshimura e t al.，1993）。本発明のある実施態様では、アデノウイルスは組み換えアデノウイルス、即ち、組み換え法によりゲノム中に組み込まれた外来配列を含むアデノウイルスである。第一の興味深い配列は、例えば欠陥のある遺伝子を置き換えたＤＮＡのような、標的細胞における発現が所望の生物学的効果をもたらすものである。この実施態様において、本発明は、遺伝子療法のために組み換えアデノウイルスの他への上手い使用が制限されている親和性を克服し、より広く利用できる系をつくるのに有利である。本発明のウイルス複合体のためには、アデノウイルスの構成成分に関して何ら制限はない。表面上にトランスフェリンと結合することができる基を有するいずれのアデノウイルスも適している。例えば、Berkner，1988；Stratford-Perrica udet et al.，1990；Rosenfeld et al.，1991；Rosenfeld et al.，1992；Strat ford-Perricaudet et al.，1992で述べられているアデノウイルスである。このウイルスは、ヒト細胞内にＤＮＡを導入するために、特に遺伝子療法のための、ベクターとして提供されたものであり、生体内又は生体外において標的細胞内にＤＮＡを選択的に導入するために修飾することもできる。ヒトにおける使用に関しては、特に、ヒトトランスフェリンはトランスフェリンの構成成分として使用される。トランスフェリンは受容体依存性エンドサイトーシスにより極めて有効に細胞内に吸収される鉄輸送タンパクである。その結果、例えば、様々な複合体の形態で細胞内に毒素、低分子物質又は遺伝子を輸送するような多くの利用ために輸送ビヒクルとして既に使用されている。トランスフェリン受容体によってトランスフェリンの受容体依存性エンドサイトーシスの間に起こる過程は、中でも、トランスフェリン受容体が高い代謝回転で再循環されるということにより、他のリガンド／受容体の対合とは異なっている。外来ＤＮＡに関しては、本発明によって、いかなる種類にも制限されない。そのＤＮＡは、任意の遺伝子又は、例えば、ＲＮＡを阻害するためにコードされている因子を含むプラスミド構造であってもよい。遺伝子療法において有効である配列は、当該技術分野において周知である。一般に療法に有望であると考えられている配列の実施例としては、中でも、Anderson，1992により公表された概略に見出すことができる。さらに、本発明は、アデノウイルス受容体を全く又は殆ど持たない、又はアデノウイルス受容体が全体又は部分的にブロックされているヒト細胞内に外来ＤＮＡを導入する方法に関するものであり、その際に、該細胞が生体外又は生体内において適した製剤中で本発明のウイルスとともに処理される導入方法に関する。特に、該細胞は、血液細胞である。本発明の修飾されたウイルスを投与する製剤で必要とされることは、個々の利用により定められる。即ち、当該技術分野において技能を有するいずれの者も、製剤に使用される多くのキャリアー及び添加剤を見出すために、関連する薬剤の使用説明（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，1980）を学習することがきる。実質的に必要とされることは、本発明のウイルス−トランスフェリン複合体の輸送機能に影響を与えず、又は細胞内で発現されるタンパク質の生体内利用可能性（bioavailability）を損なわない製剤である。ウイルスはペプチドを結合するそれ自身知られた方法でトランスフェリンと結合することができるが、好ましくはアデノウイルスは、トランスフェリンの炭水化物側鎖を経てトランスフェリンと結合する。この結合の形式は、DE-A1 41 150 38においてトランスフェリン−ポリリシン複合体が述べられており、これによりその開示内容が明確に述べられている。驚くべきことに、この結合形式は、他の方法では輸送ビヒクルアデノウイルスを受入れられない又は十分には受け入れられない細胞内に外来ＤＮＡを導入するための、トランスフェリンによるアデノウイルスの修飾に非常に適していることが見出されている。トランスフェリンの炭水化物側鎖に結合するためのウイルスの能力に必要なことは、ウイルス表面にアミノ基が存在することである。この考えに拘束されるものではないが、トランスフェリンの炭水化物側鎖がトランスフェリンとウイルスとの間に自然のスペーサーを形成することが有利であるのが適当である。このことは、一方では、トランスフェリンと結合及び取り込む能力を維持するのに適当であり、他方ではアデノウイルスのエンドソームの能力を維持するのに適当であり、また、組み合わされる複合物の成分としての本発明の複合体の使用において重要である。本発明の主題でもある、本発明のアデノウイルス−トランスフェリン複合体の好ましい製造方法は、緩やかな条件下においてトランスフェリンを、炭水化物の一部にアルデヒド基を含む形態に酸化し、還元条件下でアデノウイルスと酸化されたトランスフェリンを結合することである。好ましくは、過ヨウ素酸塩又は特に過ヨウ素酸ナトリウムは、トランスフェリンの炭水化物鎖末端のシアル酸をアルデヒドの形態に酸化する酸化段階の酸化剤として使用される。アデノウイルスとトランスフェリンがアルデヒド形態で結合する際の還元条件をつくるのに好適な物質は、緩やかな条件下で選択的にシッフ塩基を還元する還元剤である。本発明の方法においては、シアノホウ水素化ナトリウム又は三級ブチルアミノボランが、還元剤として好ましい。好ましくは該方法は、低温、好ましくは０℃から周囲温度で実施される。各反応段階の機構は、当該技術分野において技能を有する平均的な者に良く知られている。それゆえ、その範囲にある者は各必要とされる過程の各段階のための条件に適合できる。ある実例においては、取り込みの性能とエンドソームの特性との間の最適な均衡を得るために、本発明の範囲内で実施される実験において、より少ないトランスフェリン分子をウイルス粒子に供給することが望まれることもある。種々の量のトランスフェリンが結合した修飾されたアデノウイルス粒子は、試薬に対するアデノウイルスの比を実験的に変えることにより得ることができる。図面の概要図１：細胞へのウイルス侵入の図解説明。Ａ：非修飾アデノウイルス。Ｂ：トランスフェリン修飾されたアデノウイルス。図２：ニトロセルロース膜ブロット上のアデノウイルスに結合したトランスフェリンの定量。図３：組み換えアデノウイルスでの感染後、K562細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現。Ａ：非修飾アデノウイルス。Ｂ：トランスフェリン修飾アデノウイルス。Ｃ：対照（非感染細胞）。図４：K562細胞への遺伝子導入の発光法による定量的比較。本発明を、次の実施例により説明する。実施例ａ）アデノウイルスの調製 5×10⁶個の293細胞（ATCC No.1573；Graham et al.，1977）を、10％のFCS及び１％のグルタミンを加え、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）を添加した60mlのDMEM培地の入った175cm²のフラスコ中で、37℃及び５％のCO₂の下、３日間、コンフレントの約80〜100％である約2×10⁷個になるまで培養した。次いで培地を取り除き、細胞をアデノウイルスAd.RSVβgal（「RSVプロモーター／エンハンサーの調節下で、E.coliのガラクトシダーゼ遺伝子を運搬する,E1-,E 3-非感染アデノウイルスタイプ５」，Stratford-Perricaudet et al.，1992）（ 2％のFCSを含む5mlの培地中に約2×10⁹個の粒子）で感染させた。37℃下で２日間インキュベートした後、細胞を増加させ、底からほぼ完全に細胞を引き離した。次に細胞を、ソルバール（Sorvall）社のGSAローターにより3000rpmで10分間遠心分離し、細胞ペレットを50mlのテストチューブ中にPBSとともに移し、ヒラウス（Heraeus）社の遠心分離機により1000rpmで10分間遠心分離した。ペレットを２から３倍の体積の10mMのHEPES／１mMのEDTA（HE）中に取り出し、液体窒素中で瞬間冷凍させて、−70℃下で保存した。細胞を破壊するために凍結と融解の反復（液体窒素／37℃の水浴）を４回行い、10分間遠心分離（ヒラウス社、4000rpm）した。次にその細胞溶解物を超遠心した（vTI-50 47,000rpm／１時間／20℃；CsCl密度勾配：HE中に1.33g／cm³のCsClを含む溶液20ml、HE中に1. 45g／cm³のCsClを含む溶液10mlを載せ、細胞溶解物10mlで覆った）。乳白光を出すウイルスのバンドを集め、２回目の超遠心を行った（vTI-50 63,000rpm／４時間／20℃；CsCl平衡勾配：HE中に1.33g／cm³のCsClを含む溶液2.5ml、2.5mlのウイルスのバンドと混合した）。各細胞培養フラスコとしては、40％（v/v）のグリセロール中に−70℃下で保存された１−３×10¹¹個のウイルス粒子が得られた。ウイルス粒子の濃度は、１mg／mlのウイルスタンパク質＝1.34×10¹²個のウイルス粒子（Lemay et al.，1980）という比率を用いて、ブラッドフォード分析法（Bradford assay）（標準としてBSA、Fraction V、BMB）によりタンパク質含有量から測定した。ｂ）トランスフェリンによるアデノウイルスの修飾１mlの30mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5）中に105 mg（1.30μmol）のトランスフェリン（ヒト，シグマ（Sigma））を含む溶液を、同じ緩衝液を用いてSephade x G-25 PD10カラム（ファルマシア（Pharmacia））により、ゲル濾過した。80mg （1.0μmol）のトランスフェリン（トランスフェリン含有量は280nmの紫外線測定及びニンヒドリン分析により測定した）を含む得られた溶液２mlを、Speedvac （サーバント（Savant））で１mlに濃縮し、０℃に冷却して、1.1mg（５μmol）の過ヨウ素酸ナトリウムを含む30mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5）50μｌで処理した。混合液は、暗黒下で氷浴中に90分間放置した。次に別のゲル濾過を行った（Sephadex G-25 PD10カラム，ファルマシア，150mMのNaCl，10mMのHEPES,pH7 .3）。その結果、66mg（0.82μmol）の酸化トランスフェリンを含む１mlの溶液が得られた（Wanger et al.，1991に述べられているように、トランスフェリンの酸化アルデヒド含有形態の含有量は、アニスアルデヒド試薬による着色により測定した）。修飾されたトランスフェリン溶液（0.6ml；0.5μmol）を、300μｌのHBS中に25μｇ（タンパク質をもとにした値）のアデノウイルスを含む溶液に素早く加えた。周囲温度で１時間後、１mg（15μmol）のシアノホウ水素化ナトリウム溶液を加えた。周囲温度で24時間後、過剰の遊離トランスフェリンを取り除くために、トランスフェリン複合アデノウイルスを精製した。その精製は、同体積のHBS（150ml NaCl，20mM HEPES，pH7.4）でウイルスを希釈し、CsClの階段勾配で物質を遠心することにより行った。vTi-65チューブ（ベックマン（Beckman））中に、1.33g／cm³のCsCl溶液３ml及び1.45g／cm³のCsCl溶液１ml（両方とも、１mM EDTA，20mM HEPES，pH7.4のCsCl溶液）とともに約1.5mlの修飾したウイルスを置いた。サンプルを、vTi-65ローター（ベックマン）により１時間、63,000 rpmで遠心した。乳白光を示すウイルスのバンドを採取し、同体積のHBSで希釈して、２回目の同一のCsCl勾配精製を行った。代わりに、第１のウイルスのバンドを1.33g／cm³のCsCl溶液、20mM HEPES，1mM EDTA，pH7.4により5.5mlに調節して、サンプルが平衡になるまで遠心した（４時間、63,000rpm、vTi-65ローター）。精製された修飾ウイルスを採取し、同体積の96％グリセロール（フルカ（Fluk a））で希釈して、使用するまで−70℃で保存した。平行したカップリングを鉄を含まないトランスフェリン、１mM、pH7.5の鉄（III）クエン酸緩衝液１μｌと混合した精製ウイルスと行った。ｃ）アデノウイルスに結合したトランスフエリンの定量測定トランスフェリン修飾アデノウイルス、非修飾アデノウイルス及び標準トランスフェリン（それぞれHBS中にあり、ウイルス粒子又はトランスフェリン分子の使用される数は図２に見ることができる）の希釈系列はニトロセルロース膜（Sc hleicher & Schuell、口径0.lmm）に結合した。ブロットは、一晩、４℃で、HBS （10ml）中の３％（W/V）の粉末スキムミルクとプレハイブリダイズされた。各サンプルのヒトトランスフェリンと認められるトランスフェリン含有量は、周囲温度で４時間、膜をマウスの抗体にさらすことにより測定した（Chemicon MAB 0 33-19/1、HBS／ミルクで1：2000に希釈、10ml）。次に（130mlのHBS／ミルクで４回洗浄して２時間後）、¹²⁵Ｉでラベルした第２の抗体（sheep-anti-mouse-Ig 、Amersham、カタログNo.L52215、20mlのHBS／ミルク中に２μCi）に１時間さらした。膜のリン酸現像分析（phosphoimager analysis）により、非修飾アデノウイルスにおいてはシグナルはないが、修飾アデノウイルスのプローブ中にトランスフェリンの存在がみられた。標準トランスフェリンとともに修飾されたウイルスで得られたシグナルを比較することにより、ウイルス粒子と結合したトランスフェリンの量を測定することができる。３×10⁹個のウイルス粒子が、４×1 0¹²個のトランスフェリン分子のシグナルと比較し得るシグナルを与えることが見出された。これは、およそ1000個のトランスフェリン分子が、１個のアデノウイルス粒子に結合していることを示している。２つのCsCl密度勾配によりアデノウイルス粒子とトランスフェリン分子の結合は、ウイルスのキャプシドタンパク質とトランスフェリン分子との間の共有結合であることを示している。これは、 SDS-PAGEを用いたウイルスのキャプシドタンパク質の分析結果とも一致し、結合したトランスフェリンの大部分がヘキソンと結合していることを示している。ｄ）外来ＤＮＡとしてβ−ガラクトシダーゼを含有するトランスフェリン修飾組み換えアデノウイルスによるK562細胞への感染 K562細胞（ATCC No．CCL 243）は、10％のFCS、100 UNIT／mlのペニシリン、1 00μｇ／mlのストレプトマイシン及び2mMのグルタミンを添加したRPMI 1640培地（ギブコ（Gibco））中に懸濁して培養した。感染の20時間前、トランスフェリン受容体の数を増加させるために、50μMのデスフェリオキサミン（desferrioxa mine）（Cotten et al.，1990）を含む新鮮培地中に細胞を移した。感染は、同じ培地（50μMのデスフェリオキサミンを添加）中で250,000cell／mlの密度で実行した。同量（3000ウイルス粒子／細胞から300ウイルス粒子／細胞まで）の非修飾アデノウイルス（Ad.RSVβgal）又は修飾アデノウイルス（Tf-Ad.RSVβgal ）のいずれかをK562細胞に利用した。感染の48時間後、100〜200μｌの体積中の約25,000個の細胞を、丸底の96穴プレートのウェル中に移して、ベックマンGH3. 7ローターにより800rpmで10分間遠心した。上清を注意深く取り除き、0.5％のグルタルジアルデヒドを含む100μｌのHBSで置き換えた。細胞を、ピペッティングにより分散させ、次いで再び遠心を行った。次いで定着剤を取り除き、細胞を洗浄した。次に200μｌの染色溶液（10mMのリン酸緩衝液、pH7.0、150mMのNaCl、1 mMのMgCl₂、3.3mMのK₄Fe（CN）₆3H₂O、3.3mMのK₃Fe（CN）₆及び0.2％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド）を、20分から３時間、37℃でインキュベートした（Lim and Chae，1989）。細胞は、38 ℃で、５時間インキュベートした。次いで２回洗浄し、平底の96穴プレートのウェルに移して、写真撮影をした。感染の結果を図３に示す。細胞に対するウイルスの比率が最大のときに、非修飾ウイルスは約５％の効率で細胞に形質導入できることが見出されている。しかしながら、細胞に対するウイルスの比率が同じときに、トランスフェリン修飾ウイルスは細胞集団の90％以上に形質導入しており、また細胞当たり生産されるβ −ガラクトシダーゼの実際の量もより高い。非修飾及び修飾のいずれのアデノウイルスも、同じ効率レベルでHeLa細胞に侵入できることが対照試験により明らかとなった。さらに、β−ガラクトシダーゼ活性が、Jain and Magratz，1991に述べられている方法を用いて、発光法（luminometry）により分析した。これを行うために、K562細胞を、50μMのデスフェリオキサミンを含むRPMI／10％FCS培地中で18時間培養した。細胞を、感染前に素早く、デスフェリオキサミンを含む新鮮培地中に入れた（250,000cell／ml、96穴プレートに１ウェル当たり50,000セル）。対照及びトランスフェリン修飾アデノウイルスAd.RSVβgalを含むサンプルの希釈は、RPMI／２％熱不活性ウマ血清で準備し、図４に示した細胞当たりのウイルス粒子数を含むウイルス（50μｌ）アリコートを細胞上に置いた。37℃で４時間後に、細胞を新鮮培地（デスフェリオキサミンを含まない）で洗浄した。37℃で24 時間後に、50,000個の感染又は対照細胞を含むアリコートを、発光法測定のために遠心分離により選択し、0.25M pH7.5のトリス100μｌ中に置き、３回の凍結／融解の反復（液体窒素／37℃）によって破壊した。細胞の破片は、遠心（14,000 ×ｇ、エッペンドルフ（Eppendorf））することにより取り除き、タンパク質含有量のために標準化された上清のアリコートを化学発光性基質であるAMPGD及びエメラルド発光増感剤（Emerald Luminescence Intensifier）（Tropix）を用いて分析した。測定結果を図４に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者コッテンマシューオーストリアアー1130 ウィーンマキシングシュトラーセ 22―24―３―８ (72)発明者ヴァーグナーエルンシュトオーストリアアー2103 ランゲンツェルスドルフヴィーナーシュトラーセ 201

Claims

【特許請求の範囲】１．高等真核細胞内に外来ＤＮＡを導入するためのウイルスであって、該ウイルス表面が、標的細胞に結合するように該細胞の表面受容体のリガンドで修飾され、及び外来ＤＮＡが該細胞内で発現するように取り込まれるウイルスであり、該ウイルスがアデノウイルスであり、リガンドがトランスフェリンであることを特徴とするウイルス。２．ウイルス及びトランスフェリンがトランスフェリンの炭水化物側鎖で結合されていることを特徴とする、請求項１に記載の修飾されたアデノウイルス。３．ウイルスがタイプ２のアデノウイルスであることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の修飾されたウイルス。４．ウイルスがタイプ５のアデノウイルスであることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の修飾されたウイルス。５．ウイルスが、外来ＤＮＡとして遺伝子療法に有効なＤＮＡ配列を含む組み換えアデノウイルスであることを特徴とする、前記の請求項のいずれか１項に記載の修飾されたウイルス。６．トランスフェリンがヒトトランスフェリンであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾されたウイルス。７．トランスフェリンを温和な条件下で炭水化物基にアルデヒド基を含む形態に酸化し、及び酸化されたトランスフェリンを還元条件下でアデノウイルスと結合することを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイルス−トランスフェリン複合体の製造方法。８．トランスフェリンが過ヨウ素酸塩に酸化されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。９．結合が、トランスフェリンのために温和な条件で選択的にシッフ塩基を還元する物質の存在下、還元条件下で実施されることを特徴とする、請求項７又は請求項８に記載の方法。 10．結合がシアノホウ水素化ナトリウムの存在下で実施されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。 11．アデノウイルス受容体を持たない又は僅かしか持たない、又は全体又は一部がブロックされたアデノウイルス受容体を持つヒト細胞内に、ヒトアデノウイルスによって外来ＤＮＡを導入する方法であって、請求項５及び請求項６に定められたウイルスと細胞を接触させることを特徴とする方法。 12．アデノウイルス受容体を持たない又は僅かしか持たない、又は全体又は一部がブロックされたアデノウイルス受容体をもつヒト細胞内に、ヒトアデノウイルスによって外来ＤＮＡを導入する方法であって、請求項１〜４及び請求項６のいずれか１項に定められ、ポリリシンがウイルス及び任意にトランスフェリンとも結合し、外来ＤＮＡと結合している複合体の構成成分としてのウイルスと、ヒト細胞を接触させることを特徴とする方法。 13．細胞が血液細胞であることを特徴とする、請求項11又は請求項12に記載の方法。