JPH08509116A

JPH08509116A - アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子

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Publication number: JPH08509116A
Application number: JP6516656A
Authority: JP
Inventors: テプファー、ラインハルト; シュルテ、ボルフガンク; シェール、ジェフ
Original assignee: マックス − プランク − ゲゼルシャフト・ツール・フェルデルング・デル・ヴィセンシャフテン・エー・ファウ
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 1996-10-01
Also published as: CA2150678A1; WO1994017188A3; EP0680511A1; WO1994017188A2

Abstract

(57)【要約】アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、並びにこのＤＮＡ配列の対立遺伝子および誘導体が記述される。例えば穀草類植物において、非相同発現によりグラミシド系除草剤に対して耐除草剤性を得るために、あるいは相同もしくは非相同発現により植物油脂の質および量を変更するために、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子配列を使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列並びにこのＤＮＡ配列の対立遺伝子及び誘導体に関する。原核生物及び真核生物の脂肪酸代謝において、酵索アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）は重要な主要酵素である。この酵素は、下記の反応式により２段階反応でマロニルＣｏＡを作る、アセチルＣｏＡのＡＴＰに依存したカルボキシル化を触媒する（Ａ．Ｗ．アルバーツ及びＰ．Ｒ．ヴァゲロス「酵素」（ボイヤーＰＤ版）３版，６巻３７−８２頁、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９７２年［A.W．Alberts and P.R.Vagelos，The Enzyme（BoyerP D ed），Academic Press，New York，1972］。ＢＣＣＰ＋ＨＣＯ₃ ^- ビオチンカルボキシラーゼＢＣＣＰ−ＣＯＯ^-＋ＡＤＰ＋ＰｉＢＣＣＰ−ＣＯＯ^-＋アセチルＣｏＡトランスカルボキシラーゼＢＣＣＰ＋マロニルＣｏＡアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）は特に動物系及び大腸菌で生化学的に研究され、最近は様々な生物体、例えばネズミ（Ｆ．ロペスーカシラス、Ｄ．Ｈ．バイ、Ｘ．ルオ、Ｉ．Ｓ．コング、Ｍ．Ｓ．ハーモドソン及びＫ．Ｈ．キム：国立科学アカデミー会報［F.Lopez-Casillas，D.H.Bai， X．Luo，I.S.Kong，M.S.Hermodson and K.H.Kim，PNAS］85巻、5 784-5788頁(19 88年)）、ニワトリ（Ｔ．高井、Ｃ．横浜、Ｋ．和田、Ｔ．田辺：生物学会雑誌［T.Takai，C.Yo-kohama，K.Wada and T.Tanabe，J.Biol.Soc．］263号2651-265 7頁(1988年)）、酵母（Ｗ．アル−フィール、Ｓ．Ｓ．キララ及びＳ．Ｊ．ワキル；国立科学アカデミー会報［W.Al-Feel，S.S.Chirala and S.J.Wakil，PNAS］ 89巻4534-4538頁(1984年)）及び大腸菌（Ｊ．Ｈ．アリクス：ＤＮＡ［J.H.Alix ，DNA］8巻779-789頁（1989年）；Ｈ．近藤、Ｋ．白土、Ｔ．吉本、Ｔ．増田、Ａ．北園、Ｄ．都留、Ｍ．穴井．Ｍ．関口及びＴ．田辺：国立科学アカデミー会報［H.Kondo，K.Shiratuchi，T.Yoshimoto，T.Masuda，A,Kitazono，D.Tsuru，M . Anai，M.Sekiguchi and T.Tanabe：PNAS］88巻9730-9733頁(1991年)；Ｓ．Ｊ．リー及びＪ．Ｅ．クロナン・ジュニア：生化学雑誌［S.J.Li and J.E.Cronan ，Jr.，J.Biol.Chem．］267号 855-863頁(1992年)）で分子生物学的研究も行われている。細菌においては、ＡＣＣ酵素はビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）、ビオチンカルボキシ担体蛋白質（ＢＣＣＰ）及びカルボキシル転移酵素（ＣＴ）からなる３種の機能単位で構成された３つの異なるポリペプチド鎖からなっている（Ｈ．Ｇ．ウッド及びＲ．Ｅ．バーデン：生化学年鑑［H.G.Woodand R.E.Barden，Annu .Rev.Biochem．］46巻385-413頁(1977年)）。ビオチン・ドメインの領域にある大腸菌ＡＣＣ酵素のアミノ酸配列の部分が、Ｍ．Ｒ．サットン、Ｒ．Ｒ．フォール、Ａ．Ｍ．ネルヴィ、Ａ．Ｗ．アルバーツ、Ｐ．Ｒ．ヴァゲロス及びＲ．Ａ．ブラッドショー：生物化学雑誌［M.R.Sutton，R.R.Fall，A.M.Nervi，A.W.Al ｂerts，P.R.Vagelosand R.A．Bradshaw：J.Biol.Chem．］252号3934-3940頁（1 977年）によって同定された。大腸菌ＢＣＣＰ及びＢＣの遺伝子（Ｊ．Ｈ．アリクス、前掲書）、並びにＣＴの遺伝子（Ｓ．Ｊ．リー及びＪ．Ｅ．クロナン、前掲書）が最近報告された。核酸配列から導き出されるこの蛋白質の分子量は、ＢＣＣＰで１７ｋＤ、ＢＣで４９ｋＤ、ＣＴについてはαサブユニットで３５ｋＤ、βサブユニットで３３ｋＤである。動物、酵母及び植物では、上記の３つの機能単位又はドメインがポリペプチドに組込まれている（Ｄ．Ｇ．ハーディー及びＰ．コーエン：ＦＥＢＳレターズ［ D.G.Hardie and P.Cohen，FEBS Letters］91号1-7頁（1978年）、Ｍ．ミシマ、Ｒ．ロッゲンカンプ及びＥ．シュヴァイツァー：ヨーロッパ生化学雑誌［M.MiSh ima，R.Roggenkamp und E.Schweizer：Eur.J.Biochem.］111号 79-87頁（1980 年）、Ｂ．エギンビューラー、Ｒ．ロイヤル及びＪ．エーベル：生化学生物物理学論叢［B.Egin-Buehler，R.Loyal und J.Ebel，Arch．Bio-chem．Biophys.］20 3号90-100頁（1979年、Ａ．Ｒ．スラバス及びＡ．ヘリヤー：植物科学［A.R.Sla bas and A.Hell-yer，Plant Sci.］39巻177-182頁（1985年）、ヘリヤーら、Ｊ．Ｌ．ハーウッド：植物生理学年鑑［Hellyer et al,J.T.Harwood，Ann.Rev.Pla nt.Physiol.］39巻101-138頁(1988年)）。多機能サブユニットの分子量は２００ｋＤを超える。ネズミのＡＣＣは２６５ｋＤの分子量（ロペス−カシラスら、前掲書）、酵母のＡＣＣは２５１ｋＤの分子量を有し（アル−フィールら、前掲書）、植物のＡＣＣの分子量は２１０ないし２４０ｋＤの範囲にある（ヘリヤーら、前掲書）。表１は既知のＡＣＣ酵素の相同性の概要を示す。表１はニワトリ、ネズミ、酵母及び大腸菌のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼについて同一アミノ酸のバーセント値又は相同度を示す。ＡＣＣ酵素は、異なる生物体でも比較的高度の親近性を示すことがはっきり分かる。ネズミとニワトリとの間と、ネズミと酵母との間とでは、進化間隔に大きな差異があるにもかかわらず、なお約６６％の相同性が全アミノ酸配列にわたって成立する。個々の領域を取り出してみると、約８０％ないし１００％の相同性が幾つかの部分に認められる（アル−フィールら、前掲書）。注目しなければならないのは、ドメインの順序ＢＣ−ＢＣＣＰ−ＣＴに関して、真核生物のＡＣＣの構造形態が等しいことである。このことは、真核生物の進化の過程において、原核生物の個々の遺伝子の早期の融合があったことを示している。ＡＣＣの高い保存度が、ネズミ、ニワトリ及び酵母の間の抗体の高い交差反応性によって実験的に証明された（アル−フィールら、前掲書）。種々の生物体のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの調節はまだほとんど不明である。植物では、これまで２つの異なる実験系、即ち葉緑体及び形成中のアブラナ種子で酵素活性が研究された。形成中のアブラナ種子ではＡＣＣの活性が脂質蓄積の前に誘発されるが、十分な脂質蓄積に到達すると急速に減少する（Ｅ．ターンハム及びＤ．Ｈ．ノースコート：生化学雑誌［E.Turnham and D.H.Northcot e，Biochem.J．］212号223-229頁(1983年)）。このことは最終生成物による調節が行われることを意味する。また、ＡＣＣは変換率を制限する酵素として、新規な脂肪酸生合成の総量を調節するようである（Ｐ．Ｄ．シムコクス、Ｗ．ガーランド、Ｖ．デリカ、Ｄ．Ｔ．カンヴィン及びＤ．Ｔ．デニス：カナダ植物学雑誌［P.D.Simcox，W.Garland，V.De Lica，D.T.Canvin and D.T.Dennis，Can.J.Bot ．］57巻1008-1014頁（1979年）；ターンハム及びノースコート、前掲書）。この実験的所見によって、植物のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、種子の適切なＡＣＣ過剰生産のもとでの収量の増加又は脂肪酸パターンの変化を期待して脂肪酸代謝を操作するための興味深いテーマとされている。双子葉栽培植物の作物の雑草、例えばイネ科植物の駆除のために使用される種々の除草剤の機能に関する研究によって明らかになった事実によると、ある種の除草剤はＡＣＣを抑制することによってイネ科植物の物質代謝に干渉する。ＡＣＣとの相互作用により除草効果を発揮する３種の異なる種類の物質が、これまでに記述された。即ち、アリルオキシフェノキシプロピオン酸誘導体（例えばディクロフォプ、フェノクサプロプ、フルアジフォブ及びハロキシフォプ［Diclofop，Fenoxaprop，Fluazifop，Haloxyfop］）（Ｋ．コベクその他：自然研究雑誌［K.Kobek et al，Z.Naturforschung］43 巻c、47-54頁(1988年)）、シクロヘキサン−１，３−ジオン誘導体（例えばシクロキシジム、クレソジム及びセトキシジム［Cycloxydim，Clethodim，Setoxydim ）（Ｍ．フォッケ及びＨ．Ｋ．リヒテンターラー：自然研究雑誌［M.Focke und H.K.Lichtenthaler，Z.Naturforschung］42巻c、1361-1363頁(1987年)）又はＰＰ６００（３−イソプロピル−６−（Ｎ−［２，２−ジメチルプロピル］アセトアミド−１，３，５−トリアジン−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）ジオン）（Ｋ．Ａ．ウォーカー、Ｓ．Ｍ．リドリー及びＪ．Ｌ．ルイス・ハーウッド：植物化学［K. A.Walker，S.M.Ridley and J.L.Lewis Harwood，Phytochem.］29巻3743-3747頁( 1990年)）の誘導体は、感受性植物のＡＣＣを抑制する。阻害作用の細部がいかにして行われるのか、なぜ双子葉植物のＡＣＣは抑制されないか、は現在のところなお不明である。欧州特許第Ａ０４６９８１０号には、植物性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニットである分子量５０ｋＤのビオチン含有ポリペプチドが記載されている。ところが、図８の２２９ｂｐの大きさのクローンＣＣ８には、公知のＡＣＣアミノ酸配列の１つとの明確な相同性を持つアミノ酸リーディングフレームがないことがとりわけ確認された。このことから必然的に、欧州特許第Ａ０４６９８１０号で使用された抗体は、ＡＣＣ又は少なくともＡＣＣのサブュニットに対して特異的でないと結論することができる。本発明の課題は、植物系の相同もしくは非相同発現により植物油脂の質と量を変えることができ、また、非相同発現により様々な除草剤に対する耐性を例えば栽培植物に付与又は導入することができるＤＮＡ配列を、利用に供することである。この課題は請求の範囲第１項によるＤＮＡ配列によって解決される。本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、並びにこのＤＮＡ配列の対立遺伝子及び誘導体に関する。また本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列またはこのＤＮＡ配列の対立遺伝子もしくは誘導体を含むゲノムクローンに関する。また本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列が遺伝子工学的に導入された植物、植物部分及び植物製品の製造方法に関する。また最後に、本発明は耐除草剤性の付与もしくは導入または植物油脂の質および量を変化させるための、このＤＮＡ配列の使用に関する。図は本発明の説明のためのものである。図１は、ビオチン依存性酵素及び近縁酵素のＢＣドメインのアミノ酸配列の配列比較、図２は、変性オリゴヌクレオチド３４５５及び３４６４のＤＮＡ又はアミノ酸配列の図、図３ａは、特異的なハイブリッド形成プローブとしての２６０ｂｐのＰＣＲ断片のＤＮＡ配列及びそれから誘導された１文字コードのアミノ酸配列、図３ｂは、ネズミのＡＣＣのアミノ酸配列（上の列）と図３ａのアミノ酸配列（下の列）の比較、図４は、ゲノムクローンＢｎＡＣＣ３、ＢｎＡＣＣ８、ＢｎＡＣＣ１０及びＢｎＡＣＣ１に挿入したＤＮＡ配列の制限地図、図５は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列、図６は、図５のＤＮＡ配列の機能領域及びＤＮＡ配列由来の１文字コードのアミノ酸配列、図７は、図６のＤＮＡ配列の機能領域の概略図、図８は、ゲノムクローンＢｎＡＣＣ８のＡＣＣ遺伝子の一部を有する種々のゲノム植物ＤＮＡのサザンブロット・ハイブリッド形成（クロスハイブリッド形成）を示す。本発明に基づくＤＮＡ配列の対立遺伝子変異型及び誘導体がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするとすれば、これらの改変ＤＮＡ配列も本発明の範囲内に含まれることは言うまでもない。この対立遺伝子変異型及び誘導体としては、本発明ＤＮＡ配列の例えば欠失、置換、挿入、逆位又は付加が挙げられる。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの遺伝子はすべての植物に存在し、従って種々の方法で植物から分離することができる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブ又は特異的抗体により、ゲノム植物ＤＮＡライブラリから遺伝子が分離され、或いはｃＤＮＡライブラリからそのｃＤＮＡが分離される。アケラ（kela）品種のアブラナ（カブラ；Brassica na-pus）が特に適した植物材料であることが判明した。本発明においてはＡＣＣ遺伝子を含むゲノムクローンの分離のための出発材料として、ファージに組込んだアケラ品種のアブラナ（カブラ；Brassica napus）のゲノムの遺伝子ライブラリを使用した。ＰＣＲ（Polymerase Chain React-ion ポリメラーゼ連鎖反応）で作成したハイブリッド形成プローブによって、この遺伝子ライブラリのＡＣＣ遺伝子を探索した。こうしてＢｎＡＣＣ８の名称のゲノムクローンが分離された。これは１３．７ｋｂのＸｂａＩ断片にアブラナＡＣＣの完全な構造遺伝子（蛋白質コーディング領域（エキソン及びイントロン））を含む。このゲノムクローンは番号ＤＳＭ７３８４で寄託されている。また夫々約２０ｋｂ、１５ｋｂ又は１５ｋｂのＤＮＡ断片に同じくアブラナＡＣＣの構造遺伝子又はその一部を含むゲノムクローンＢｎＡＣＣ３、ＢｎＡＣＣ１０及びＢｎＡＣＣｌが分離された。１３．７ｋｂのＤＮＡ断片を適当なベクターでＸｂａＩ／ＳｍａＩ断片の形でサブクローン化し、配列を決定した。ＤＮＡ配列から誘導されたアミノ酸配列とＦ．ロペス−カシラス（前掲書）の図２のネズミのＡＣＣアミノ酸配列をコンピュータ解析により比較した。アミノ酸配列の相同性に基づき、１３．７ｋｂのＤＮＡ断片はアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を含むことが確認された。また、ＢｎＡＣＣ３の約２０ｋｂのＤＮＡ配列の、約２ｋｂのＤＮＡ断片の配列を決定した。図４にゲノムクローンＢｎＡＣＣ３、ＢｎＡＣＣ８、ＢｎＡＣＣ１０及びＢｎＡＣＣ１に挿入されたＤＮＡ断片の制限地図を示す。１種類の遺伝子に属するオーバーラップしたクローンＢｎＡＣＣ３及びＢｎＡＣＣ８を除き、２つの別のクラスのゲノムクローンの１つの代表（ＢｎＡＣＣ１０及びＢｎＡＣＣ１）だけを夫々図示した。黒く標識した範囲は、使用したプローブとハイブリッドを形成するＤＮＡ領域を示す。ＤＮＡ断片はクローニングベクター、ラムダ・フィクス^TM II（Lambda FIX ^TMII）の切断部位により限定される。この切断部位を「Ｙ」の符号で示す。即ち一方の側のＸｂａＩ、ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ及びＳａＩＩ又は他方の側のＳａｌＩＩ、ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ及びＸｂａＩである。ＢｎＡＣＣ８の１３．７ｋｂのＤＮＡ断片及びＢｎＡＣＣの約２ｋｂのＤＮＡ断片の配列決定領域を白い帯で標識した。慣用の方法を適用して、ＢｎＡＣＣ８の１３．７ｋｂのＤＮＡ断片の配列を決定した。また、ＢｎＡＣＣ３の約２０ｋｂのＤＮＡ断片の第２のＳａＩＩ切断部位から３’側方向に約２ｋｂを、クローンＢｎＡＣＣ８と重なるまで配列を決定した。２つのクローンは５’側領域で重なる。配列比較によって長さ１３．７５３ｋｂのＤＮＡ配列が明らかになる。ＢｎＡＣＣ８由来の１３．７ｋｂのＤＮＡ断片の１１．９ｋｂと、ＢｎＡＣＣ３由来の約２０ｋｂのＤＮＡ断片の１９０４ｂｐからなる、１３．７５３ｋｂの完全なＤＮＡ配列を図５に再現する。ＤＮＡ配列は、５’側末端に第２のＳａＩＩ切断部位から始まるＢｎＡＣＣ３配列を包含し、３’側末端では６７８ｂｐだけＥｃｏＲＩ切断部位を超えて伸張する。ＢｎＡＣＣ８の１３．７ｋｂのＤＮＡ断片の１１．９ｋｂのＤＮＡ配列は、図５の位置１９０５で始まる。１３．７５３ｋｂのＤＮＡ断片にはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ構造遺伝子とプロモーターが含まれており、構造遺広子はＢｎＡＣＣ８の１３．７ｋｂのＤＮＡ断片の１１．９ｋｂに既に存在する。この点については、図５のＤＮＡ配列の機能領域を示す図６を参照されたい。調節要素例えばＣＡＡＴボックス（位置２２８３−２２８６）、ＴＡＴＡボックス（位置２４１６−２４１９）及びポリアデニル化信号（位置１３２８４−１３２８９）にアンダーラインを付した。位置１９０５から最初の約６００ｂｐ（ＢｎＡＣＣ８の１１．９ｋｂ）は既にプロモーターの一部をなす。先行する１９０４ｂｐは全プロモーターを含み、ＢｎＡＣＣ３に由来する。ＡＣＣのＡＴＧ開始コドンは位置２５０６に、それに属するＴＧＡ停止コドンは位置１３２５３にある。エキソン／イントロン境界を黒地で示した。配列中の黒地のエキソン領域に当該のアミノ酸配列を示した。ＰＣＲ［ポリメラーゼ連鎖反応］によりエキソン／イントロン境界が決定されていない場合は、他の生物体（ネズミ）のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Ｆ．ロペス−カシラス、前掲書）との相似に基づいてこの境界を確定した。遺伝子の最初のエキソンは、開始コドンの「ＡＴＧ」において、オープンリーディングフレームで始まる。従って５’側非翻訳領域は黒地で示さない。最後のエキソンの標識は対応する停止コドンで終るから、３’側非翻訳領域も標識しない。図７にクローンＢｎＡＣＣ８のＡＣＣ配列の機能領域を再現する。エキソンを黒地で示した。ＡＴＧは開始コドンを、ＭＫＭは保存されたビオチン結合部位を、ＴＧＡは停止コドンを意味する。また３つのドメイン、即ちＢＣ＝ビオチンカルボキシラーゼ、ＢＣＣＰ＝ビオチンカルボキシ担体蛋白質、ＣＴ＝カルボキシル転移酵素が、配列に対して明確に割り当てられる。３つのドメインは他の生物体のＡＣＣとの相同性に基づぎ確定された。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、カブラ（Brassica napus）、エンバク（Avena sativa）、オオムギ（Hordeum vulgare）、イネ（Oryza sativa）、ナツコムギ（Triticum aestivum）及びトウモロコシ（Zeamays）のゲノムＤＮＡとのクロスハイブリッド形成によって、本発明に基づくＡＣＣ配列の一部は他の植物のＡＣＣ遺伝子の単離に適していることが確認された。図８では、ＤＮＡプローブとして、クローンＢｎＡＣＣ８のＳｍａＩ／ＳａｃＩ断片（図４を参照）を使用した。種々の植物のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、サザンブロッティングを行った。プローブの交差反応性が単子葉及び双子葉植物で観察される。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする本発明のＤＮＡ配列とこのＤＮＡ配列の対立遺伝子及び誘導体とを、脂肪酸代謝の調節のために、（アンチセンス又は過剰発現の形で）遺伝子工学的方法により植物に導入することができる。図６の本発明ＤＮＡ配列の例えば位置１９０５ないし３１８７、３１８８ないし８１０８及び１１０３９ないし１２８４６の配列を含むアンチセンス構造を、植物のＡＣＣの活性を抑制するために利用することができる。特に、種子の適当な調節要素（プロモーター）でＡＣＣ遺伝子断片を制御することによりこれを行うことができる。それによって、アセチルＣｏＡの滞留を生じることができる。なぜなら、この中間体はもはや脂肪酸代謝に入り込むことができないので、例えば植物細胞の代謝に影響するからである。１．アンチセンス構造によって細胞の脂肪酸生成を制止するならば、適当な調節要素により「自殺遺伝子」を作ることができる。植物病の克服において、こうして過敏反応を解消させることができる。２．その遺伝子産物がアセチルＣｏＡを使用する補助遺伝子を付加することにより、アセチルＣｏＡの滞留を阻止することができる。例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の合成の遺伝子（バイオリアーら；サイエンス［Piorier et al ，Science］1992年256号520-523頁）を、植物の特定の種類の組織／器官／細胞、とりわけ貯蔵組織、例えば種子（内胚乳、子葉）、根、種々の種類の塊茎に特異的に発現することができる。同時に植物の同じ部分でＡＣＣアンチセンス構造を発現させれば、未消費のアセチルＣｏＡをＰＨＢの合成のために使用することができる。ｃＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片を合成するために、本発明のＤＮＡ配列からオリゴヌクレオチドが導かれる。完全なｃＤＮＡを分離するために、このｃＤＮＡ又はその断片を単独で又はゲノムクローンの一部と組み合わせて利用することができる。このｃＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片をアンチセンス発現のために使用することもできる。こうして個々のｃＤＮＡ断片又は全ｃＤＮＡを、例えば微生物のＡＣＣ突然変異体の遺伝的相補性付与のために使用することができる。その場合に微生物（大腸菌の突然変異体ｆａｂＥ；ジルバートその他：細菌学雑誌［Silbert et al，J .Bakteriol．］1976年126巻1351-1354頁；ハーダーその他：国立科学アカデミー会報［Harder et al，PNAS］1972年69巻 3105-3109頁及び酵母の変異体；シュヴァイツァーその他［Schweizer et al］1980年頃）は、非許容条件のもとで植物のＡＣＣによって機能的に補われ、植物の酵素に直接依存する。こうして、ＡＣＣ抑制物質の開発と最適化のための植物酵素及びテスト系を選択する可能性が生まれる。またそれによって、除草剤として使用するための良好な作用物質と共にＡＣＣ酵素の耐性形態を、遺伝子（又は遺伝子の領域）の突然変異誘発により開発又は選択することができる。また多量の蛋白質又は蛋白質の一部を得るために、ｃＤＡＮを利用することができる。この製造された蛋白質は、反応機構及び調節の研究のため、または酵素又は酵素の一部の三次元構造を解明するために使用することができる。最後に挙げた点は、例えば蛋白質構造への阻害剤の適合を可能にするので、特に「蛋白質モデリング」（protein modelling）にとって重要である。ＡＣＣ遺伝子配列と、この配列の対立遺伝子及び誘導体は特に組換えベクターを用いて、とりわけ適当なプロモーターと共に植物に導入される。すべての種類の植物をこの目的のために形質転換することができる。このことに関連して、作物植物、園芸植物及び鑑賞植物が挙げられる。作物植物の中でカブラ（Brassica napus）、ダイコン（Brass1ca rapa）、ココヤシ、アブラヤシ、ヒマワリ及びアマが特に好適である。ＡＣＣをコードする本発明のＤＮＡ配列は、特定の除草剤に対する作物植物、中でも特に穀草類の耐除草剤性を得るために使用することができる。とりわけよく形質転換される植物としてトウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ及びライムギが挙げられる。ＡＣＣ−ＤＮＡ配列、並びにこの配列の対立遺伝子及び誘導体の遺伝子工学的導入は、慣用の形質転換技術によって実施することができる。このような技術には、直接的遺伝子導入、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子銃、ウイルスベクター、リポソームの媒介による導入、適当な組換えＴｉプラスミド又はＲｉプラスミドの導入及び植物ウイルスによる形質転換等の方法が包含される。単子葉植物、例えばオオムギ、コムギ又はトウモロコシの細胞培養においては、適当な除草剤で選択することによって形質転換の検証を行うことができる。また、ハイブリッド形成プローブとしてアブラナＡＣＣ−ＤＮＡの例えばイントロン配列を用いて、サザンブロッティングにより検証することができる。このようにして、本発明は上記の方法の１つにより製造し又は形質転換した植物、植物部分及び植物製品にも関する。下記の例は本発明を例示するためのものである。例例１：アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）のためのハイブリッド形成プローブの作成（ａ）縮重オリゴヌクレオチドの製造種々のビオチン含有蛋白質の配列比較に基づいて、ＡＣＣ配列の保存部分の合成オリゴヌクレオチドが導き出された。この点については、ビオチン依存性酵素及び近縁酵素のＢＣドメインのアミノ酸配列の配列比較を示す図１を参照されたい。この図はコンドーその他、前掲書［Kondo et al，supra］の刊行物の図３に由来する。左段の略称は次の意味を有する。ＥＡＣＣ＝大腸菌のＡＣＣｃＡＣＣ＝ニワトリのＡＣＣｒＰＣＣα＝ネズミのプロビオニルＣｏＡカルボキシラーゼのαサブユニット γＰＣ＝酵母のピルビン酸カルボキシラーゼＥＣＰＳＮ＝カルバモイルリン酸合成酵素のＮ末端の半量体同じアミノ酸を枠で囲み、厳密に保存された残基を点で標識した。更に、保存された配列を矢印と数字で図１に明示した。この配列は縮重オリゴヌクレオチド３４５５及び３４６４の製造又は誘導のために使用された。オリゴヌクレオチドをアプライドバイオシステムズ社のＤＮＡシンセサイザー（３８０Ｂ型）で合成した。図２に再現する。２つのオリゴヌクレオチドは５’ −３’方向で表示されているから、図１と比較するときは、オリゴヌクレオチド３４６４のアミノ酸配列を逆方向に読みとらなければならない。縮重した遺伝コード及び個々の位置でのアミノ酸配列の可能な可変性に基づき、オリゴヌクレオチドに種々の塩基を、例えばＣ又はＴ若しくはＡ又はＧをオリゴヌクレオチド３４６４に組入れた。またすべてのヌクレオチドとの相互作用を開始することができ、従って非特異的塩基とみなされるＩを導入した。（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）１μｇのPolyＡ＋ＲＮＡから出発して、トリ骨髄芽細胞症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素により、３７℃の温度で３０分間、オリゴヌクレオチド３４６４をプライマーとしてｃＤＮＡ合成を行った。温度９５℃で５分間加熱して逆転写酵素を不活性化した後、同じ反応調合物で各プライマー（３４５５及び３４６４）の最終濃度５０ｐｍｏｌ及びアンプリ・タク^TM［Ampli-Taq ^TM］ポリメラーゼ（パーキン・エルマー・セタス［Perkln Elmer Cetus］）４単位でポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応は下記の条件で行った。ａ）緩衝条件：トリス−ＨＣｌ１０ｍＭ、ｐＨ値８．０；ＫＣｌ５０ｍＭ；ＭｇＣｌ₂ １．５ｍＭ；０．０１％ゼラチン及びｄＮＴＰ５ｍＭ。ｂ）反応温度：最初の変性のために温度９２℃で３分、次に夫々変性のために温度９２℃で２分、オリゴヌクレオチドのアニーリングのために温度５１℃で２分、ＤＮＡの増幅のために温度７２℃で２．５分、最後に最終合成生成物の完全な合成を得るために温度７２℃で２．５分を含む温度サイクル３０回。ｃ）増幅生成物のクローン化ＰＣＲ生成物の突出した一本鎖ＤＮＡ部分をクレノウ重合酵素で埋め（サムブルックら：分子クローニング−試験便覧、２版、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク［Sambrook et al，Moleclar Cloning-A Laboratory Manuat，2nd ed. Cold Spring Harbor Labo-ratory Press，New Yo rk］(1989年)）、続いてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した（サムブルックら、前掲書）。ＰＣＲ生成物の精製は、サムブルックらの前掲書による標準手順に従ってアガロースゲル電気泳動、ゲル溶出、フェノール／クロロホルムによる精製及び最後のイソプロパノールによる沈殿により行った。こうして精製したＤＮＡを、ＳｍａＩで切断したｐブルースクリプト^TM［ pBluescript ^TM］ベクターＤＮＡに連結し、クローン化した。ｄ）ＤＮＡ配列決定ｐブルースクリプト^TMで作成したサブクローンのＤＮＡ配列及びエキソヌクレアーゼIIIにより欠失を作ったＤＮＡ配列（例２を参照）（サムブルックら、前掲書）の決定のために、サンガーら：国立科学アカデミー会報［Sanger et al， Proc．Natl．Acad．Sei．］74巻5463-5467頁（1977年）の方法により配列決定した。配列データを「ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ」のコンピュータ・ソフトウエア（デバルーその他：核酸研究［Devereux et al，Nucl．Ac ids Res.］12巻387-395頁(1984年)）により解析した。相同性研究は、プログラム「ベストフィット（Best-fit）」を用いて行った。ｅ）ＰＣＲによる特異的ハイブリッド形成プローブの合成アブラナ（カブラ；Brassica napus）の未熟な種子（発生後約２−３週）のpo lyＡ⁺−ＲＮＡから出発して、ｃＤＮＡ第１鎖の合成の後に、ＰＣＲ反応によりＤＮＡ断片を増幅した。そのために必要なオリゴヌクレオチドは、とりわけニワトリと大腸菌のＡＣＣの相同性比較（図１）に基づいて合成した。計算上はこの（縮重した）オリゴヌクレオチドにより、８６個のアミノ酸をコードする長さ２６０ｂｐの生成物を増幅すべきである。得られた混合生成物からこの大きさの生成物を分離し、ｐブルースクリプトでクローン化し、ＤＮＡ配列決定により同定した。他の非特異的なＰＣＲ生成物のほかに、予想された２６０ｂｐの大きさを持ち、アミノ酸８６個のオープンリーディングフレームを有する生成物をクローン化することができた（図３ａ）。オリゴヌクレオチドの領域の相同性も計算に含めれば、この生成物はネズミのＡＣＣと比較して同じアミノ酸が７７．９％あり、８８．４％の相同性を有する（図３ｂ）。増幅された配列のみで、即ち誤対合も許容するオリゴヌクレオチド領域を含めずに、同一性又は相同性を計算した場合にも、ネズミとアブラナのＡＣＣの蛋白質配列の間にはなお７３．２％の同一のアミノ酸又は８５．９％の相同性の値が出てくる。これらの数字が示すところでは、クローン化したＰＣＲ生成物はアブラナＡＣＣの一部をコードし、従って特異的ハイブリッド形成プローブとして使用することができる。位置３０４及び３８９（図３ｂ）のアミノ酸の間のネズミＡＣＣとの相同状態に基づき、クローン化したＰＣＲ断片は長さ６０００ｂｐ以上のｃＤＮＡだけを認識することが予想された。例２：ＡＣＣをコードするＤＮＡ配列を持つゲノムクローンの特性決定ラムダ・フィクス^TMIIベクター（ストラタジーン社）を用いて構築したアケラ品種のアブラナ（カブラ；Brassica napus）の遺伝子ライブラリから、例２で述べるクローン化したＰＣＲ断片によって、１０個のゲノムクローンが分離され、特性が決定された。これらのゲノムクローンは、その制限地図に基いて３つのクラスに分けられる。図４は、ゲノムクローンＢｎＡＣＣ３、ＢｎＡＣＣ８、ＢｎＡＣＣ１０及びＢｎＡＣＣ１の制限地図を示す。最も頻繁に現れるクラスに属するクローンＢｎＡＣＣ８は、１３．７ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を含む。このＤＮＡ断片は、アブラナのＡＣＣの完全な構造遺伝子を包含する。このＤＮＡ断片を、ｐブルースクリプト^TMを用いてＸｂａＩ−ＳｍａＩ断片の形でサブクローン化し、配列を決定した。また、ＢｎＡＣＣ３の約２０ｋｂのＤＮＡ断片の約３．２ｋｂのＳａｌＩ−ＳｍａｌＤＮＡ断片をサブクローン化し、その内の約２ｋｂをＳａｌＩ切断部位から３’側方向に配列決定した。９頁１６行及び請求項９で言及した微生物ＢｎＡＣＣ８は１９９３年１月８日にＤＳＭドイチェ・ザンムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクター・ハフトゥング［ドイツ微生物・細胞培養コレクション有限責任会社］（Ｄ３８１２４ブラウンシュヴァイク、マシェローダー・ヴェーク１Ｂ）［DSM Deutsche Sammlung vo n Mikroorganisumenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1B，D-38124Brau nschweig］に寄託番号ＤＳＭ７３８４で寄託された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１１月２３日【補正内容】請求の範囲１．植物アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列並びにこのＤＮＡ配列の対立遺伝子及び誘導体。２．アブラナ（カブラ；Brassica napus）から分離したことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ配列。３．１３．７ｋｂの大きさを有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの完全な構造遺伝子及びプロモーターの少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項１又は２のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。４．アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする植物ＤＮＡ配列またはこのＤＮＡ配列の対立遺伝子もしくは誘導体を含むゲノムクローン。５．前記ＤＮＡ配列をアブラナ（カブラ；Brassica na-pus）から分離したことを特徴とする請求項４に記載のゲノムクローン。６．前記ＤＮＡ配列が１３．７ｋｂの大きさを有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの完全な構造遺伝子及びプロモーターの少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項４又は５のいずれか１項に記載のゲノムクローン。７．ゲノムクローンＢｎＡＣＣ８（ＤＳＭ７３８４）。８．アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの完全な構造遺伝子もしくはその少なくとも一部、またはこのＤＮＡ配列の対立遺伝子もしくは誘導体を含むゲノムクローンＢｎＡＣＣ１、ＢｎＡＣＣ３及びＢｎＡＣＣ１０。９．前記構造遺伝子のＤＮＡ配列がアブラナ（カブラ；Brassica napus）から分離されたことを特徴とする請求項８に記載のゲノムクローン。１０．少なくとも前記ゲノムクローンＢｎＡＣＣ３が、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの構造遺伝子のプロモーターのＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項９に記載のゲノムクローン。１１．図５に記載したアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの構造遺伝子及びプロモーターを含むことを特徴とするＤＮＡ配列。１２．請求項１ないし３のいずれか１項もしくは請求項１１に記載のＤＮＡ配列又は請求項４ないし１０のいずれか１項に記載のゲノムクローンに由来するＤＮＡ配列を、遺伝子工学的に導入する、耐除草剤性を有する植物、植物部分及び植物製品の製造方法。１３．請求項１ないし３のいずれか１項もしくは請求項１１に記載のＤＮＡ配列又は請求項４ないし１０のいずれか１項に記載のゲノムクローンに由来するＤＮＡ配列を、遺伝子工学的に導入する、油脂及び脂肪酸の生産に関して質および量が変更した植物、植物部分及び植物製品の製造方法。１４．マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子銃、適当な組換えＴｉプラスミド又はＲｉプラスミドの転移、リポソームに媒介された転移又は植物ウイルスによりＤＮＡ配列を導入することを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の方法。１５．耐除草剤性を植物に付与するための、請求項１ないし３のいずれか１項もしくは請求項１１に記載のＤＮＡ配列又は請求項４ないし１０のいずれか１項に記載のゲノムクローンに由来するＤＮＡ配列の使用。１６．植物の油脂及び脂肪酸生産に関して質および量を変化させるための、請求項１ないし３のいずれか１項もしくは請求項１１に記載のＤＮＡ配列又は請求項４ないし１０のいずれか１項に記載のゲノムクローンに由来するＤＮＡ配列の使用。１７．請求項１２又は１３及び１４に記載の方法により製造した植物、植物部分及び植物製品。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者シェール、ジェフドイツ連邦共和国、デー ― 50829 ケルン、カール ― フォン ― リネ・ベーク 12

Claims

【特許請求の範囲】１．アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列並びにこのＤＮＡ配列の対立遺伝子及び誘導体。２．植物から分離したことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ配列。３．アブラナ（カブラ；Brassica napus）から分離したことを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ配列。４．１３．７ｋｂの大きさを有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの完全な構造遺伝子とプロモーターの少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。５．アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列またはこのＤＮＡ配列の対立遺伝子もしくは誘導体を含むゲノムクローン。６．前記ＤＮＡ配列が植物から分離されたことを特徴とする請求項５に記載のゲノムクローン。７．前記ＤＮＡ配列がアブラナ（カブラ；Brassica na-pus）から分離されたことを特徴とする請求項６に記載のゲノムクローン。８．ＤＮＡ配列が１３．７ｋｂの大きさを有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの完全な構造遺伝子とプロモーターの少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項５ないし７のいずれか１項に記載のゲノムクローン。９．ゲノムクローンＢｎＡＣＣ８（ＤＳＭ７３８４）。１０．アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの完全な構造遺伝子のＤＮＡ配列もしくは少なくともその一部、またはこのＤＮＡ配列の対立遺伝子もしくは誘導体を含むゲノムクローンＢｎＡＣＣ１、ＢｎＡＣＣ３及びＢｎＡＣＣ１０。１１．前記構造遺伝子のＤＮＡ配列が植物から分離されたことを特徴とする請求項１０に記載のゲノムクローン。１２．前記構造遺伝子のＤＮＡ配列がアブラナ（カブラ；Brassica napus）から分離されたことを特徴とする請求項１１に記載のゲノムクローン。１３．少なくとも前記ゲノムクローンＢｎＡＣＣ３が、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの構造遺伝子のプロモーターのＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載のゲノムクローン。１４．図５に記載したアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの構造遺伝子及びプロモーターを含むＤＮＡ配列。１５．請求項１ないし４のいずれか１項もしくは請求項１４に記載のＤＮＡ配列、又は請求項５ないし１３のいずれか１項に記載のゲノムクローンに由来するＤＮＡ配列を、遺伝子工学的方法で導入する、耐除草剤性を有する植物、植物部分及び植物製品の製造方法。１６．請求項１ないし４のいずれか１項もしくは請求項１４に記載のＤＮＡ配列又は請求項５ないし１３のいずれか１項に記載のゲノムクローンに由来するＤＮＡ配列を、遺伝子工学的方法で導入する、油脂及び脂肪酸生産に関して質および量を変化させた植物、植物部分及び植物製品の製造方法。１７．マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子銃、適当な組換えＴｉプラスミド又はＲｉプラスミドの転移、リポソームに媒介された転移又は植物ウイルスによりＤＮＡ配列を導入することを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。１８．耐除草剤性を植物に付与するための、請求項１ないし４のいずれか１項もしくは請求項１４に記載のＤＮＡ配列又は請求項５ないし１３のいずれか１つに記載のゲノムクローンに由来するＤＮＡ配列の使用。１９．植物の油脂及び脂肪酸生産に関して質および量を変化させるための、請求項１ないし４のいずれか１項もしくは請求項１４に記載のＤＮＡ配列又は請求項５ないし１３のいずれか１項に記載のゲノムクローンに由来するＤＮＡ配列の使用。２０．請求項１５又は１６及び１７の方法により製造した植物、植物部分及び植物製品。