JPH08509121A

JPH08509121A - 形質転換生物

Info

Publication number: JPH08509121A
Application number: JP6522704A
Authority: JP
Inventors: ヴィランド，パー; クレクツコウスキ，レスゼック; オルセン，オッド−アーネ; ポウルセン，ピーター; オッケルズ，フィン; マルクッセン，ジャン
Original assignee: ダニスコエイ／エス
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1994-04-07
Publication date: 1996-10-01
Also published as: GB2291878B; AU6539294A; WO1994024292A3; WO1994024292A2; US5977437A; EP0693128A1; US6379968B1; CA2160159A1; GB2291878A; GB9307408D0; NZ265061A; GB9520520D0; AU693787B2

Abstract

(57)【要約】形質転換生物は、デンプン収量の増加を有することが記載されている。好ましい実施態様は、組換えＤＮＡ構築物を含有する植物または植物細胞に関する。この組換えＤＮＡ構築物は、それにより植物または植物細胞によるデンプン生産の速度および／またはデンプン収量を増強するために、植物プロモーター配列もしくは植物または植物細胞による遺伝子の発現を可能にする配列に対して作動上の関係で、外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ酵素（ＡＧＰ）またはＡＧＰ酵素の酵素活性を保持するそのサブユニットをコードするＤＮＡ配列を含有し、該ＤＮＡ配列が、オオムギHordeum vulgare内胚乳ＡＧＰまたはその活性化サブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異体をコードする遺伝子配列であり、その遺伝子配列がその非臨界的な対立遺伝子変異を包含することに特徴がある。

Description

【発明の詳細な説明】形質転換生物本発明は形質転換生物に関する。特に、本発明は、デンプン合成能が増大された形質転換デンプン生産生物および高収量でデンプンを生産し得る形質転換デンプン生産生物に関する。さらに特定すると、本発明は外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（glucose pyro phosphorylase）（ＡＧＰ）をコードするヌクレオチド配列を含む形質転換生物に関する。好ましい実施態様では、本発明は植物のデンプン生産中枢、すなわち葉緑体およびアミロプラストで外因性ＡＧＰを発現させ得る形質転換植物または植物細胞に関する。本発明はまた、デンプン生産増大を示す植物または植物細胞の形質転換で使用するための組換えＤＮＡ構築物ならびに組換えＤＮＡ構築物で形質転換した植物および植物細胞に関する。ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（E.C.2.7.7.27）（ＡＧＰ）は、植物、藻類、菌類、および細菌のような生物、特に植物でのデンプンおよびグリコーゲンの生合成に包含される主な酵素の１種である。ＡＧＰは以下の反応を触媒する：産物のＡＤＰ-グルコースは植物でのデンプンの生合成におけるグルコースの主な供与体である。さらに、その反応は、植物のような生物でのデンプンの合成において速度限定要因であり、この反応の速度が今度はＡＧＰ濃度に決定的に依存していることが示されている。このために、ＡＧＰは集約的な研究の主題であり、そして植物ＡＧＰについての最近の研究の概評については、Kleczkowskiら：Z ．Naturforsch．46c，605-612（1991）が参照されるべきである。 Kleczkowskiら（同書に）および他に報告されているとおり、ＡＧＰは植物界の至る所に広く分布し、そしてE．coliのようないくつかのデンプン生産細菌に見出される。植物ＡＧＰは、同じ大きさの４つのユニットからなるように見える細菌のＡＧＰとは対照的に、２つの小サブユニット（50〜55kDa）および２つの大サブユニット（51〜60kDa）からなる四量体（210〜240kDa）として存在する。ＡＧＰはまた、ラン藻および藻類でも生産されることが示されており、そこでは、その四量体構造が、通常の細菌で見出されるホモ四量体構造よりむしろ植物中の四量体構造（すなわち、２つの大きなおよび２つの小さなサブユニット）と同様である。主に食料品としてだけでなく重要な工業化学製品としてのデンプンの商業的な重要性のため、ＡＧＰそのものおよび植物ＡＧＰ濃度を増加し、そしてそのために、植物でデンプンの生合成を増加し、およびデンプン収量を増加する手段として、植物および植物細胞のトランスフェクションのためにＡＧＰをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構築物は、いくつかの最近公開された特許出願の主題を構成する。例えば、EP-A-0368506では、コムギの葉およびコムギの内胚乳からＡＧＰを抽出する方法が開示されている。コムギの葉およびコムギの内胚乳のＡＧＰをコードするｃＤＮＡ配列、ならびにデンプン合成能が増大された植物を提供するために、続いて植物に挿入されるこれらの配列を含有する種々のプラスミドもまた開示されているが、この後者の工程は詳細に記載されておらず、そしてこれらの構築物を含有する形質転換植物を提供する例でもない。 WO91/19806は、植物プロモーターを配列に含むＤＮＡ構築物を植物ゲノムに取り込むことにより達成された高められたレベルのデンプンおよびデンプン生合成を有する形質転換植物細胞および植物、色素体遷移ペプチドおよび細菌（E．col i ）ＡＧＰからなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、ならびに植物細胞で転写終了および相当するＤＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化テールの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を開示している。E．coliＡＧＰをコードするＤＮＡ配列を得、同様に推定アミノ酸配列を得る。E．coliＡＧＰ遺伝子で形質転換された形質転換ジャガイモおよびトマトは、デンプン収量の増加を生じることが示される。E．coli以外のその他の細菌供給源および藻類もまた、ＡＧＰ遺伝子の供給源として使用され得、デンプン収量の増加を提供するために植物および植物細胞の形質転換に用いられることが示される。しかし、これらの他の供給源からＡＧＰ酵素をコードするヌクレオチド配列の単離またはこのような形質転換系でのそれらの発現についての記述はない。同様の開示は、WO92/11382に含まれ、それは同様に、植物、特にジャガイモ植物を、この植物でのデンプン生合成およびデンプン収量の増加を目的とし、細菌ＡＧＰをコードする細菌（E．coli）ＤＮＡで形質転換することを開示する。わずかに異なる目的が、EP-A-0455316に記載されている。その目的は、植物ベース食料品の糖およびタンパク質濃度を、デンプン形成を犠牲にして増加させることである。これは、ＡＧＰをコードするＤＮＡ配列を植物ゲノムに組み込むことにより達成されるが、形質転換ベクターにおいて逆方向である。逆向きの配列の転写は、アンチセンスｍＲＮＡを生じ、それは、植物細胞でのＡＧＰの生産を阻害し、ＡＧＰ活性の減少およびデンプン生産の減少を導く。研究された全ての植物ＡＧＰは、３-ホスホグリセリン酸（3-phosphoglycerat e；ＰＧＡ）で強く活性化されそして無機リン酸（Ｐ_i）で阻害されることがこれまでに報告されている。また、葉緑体およびアミロプラスト（そこで生合成デンプン生産が主に行われている）中のＰＧＡ／Ｐ_iが、デンプン合成でカギとなる調節の役割を果たすと考えられている。例えば、葉緑体ＰＧＡ／Ｐ_i比は、日中、すなわち光合成を行っている間、最も高い活性であり、その期間は葉緑体でのデンプン生産のピーク期間と一致することが知られている。非光合成組織でのＡＧＰ形成の調節はそれほど理解されていないが、ＰＧＡおよびＰ_iそれぞれの活性化および阻害役割、すなわち、ＰＧＡ／Ｐ_i比は重要な部分を果たすと未だに考えられている。本発明は、デンプン生産生物においてＡＧＰaseレベルおよび／またはデンプンレベルをどのようにして増加するかということを課題とする。本発明の第１の局面により、外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）酵素またはＡＧＰ酵素の酵素活性を保持するそのサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含有する形質転換デンプン生産生物であって、ここで、上記ヌクレオチド配列が上記生物内で発現され得；上記酵素またはそのサブユニットの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルの無機リン酸からも実質的に独立する点で特徴づけられ；そして上記酵素またはそのサブユニットの活性がフルクトース−１，６−ビスＰ（fructose-1,6-bisP）により刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されない点でさらに特徴づけられる、形質転換デンプン生産生物が提供される。本発明の第２の局面により、外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）酵素またはＡＧＰ酵素の酵素活性を保持するそのサブユニットを含む形質転換デンプン生産生物であって、ここで、上記酵素またはそのサブユニットの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルの無機リン酸からも実質的に独立し、そして上記酵素またはそのサブユニットの活性がフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されない、形質転換デンプン生産生物が提供される。本発明の第３の局面により、増強されたデンプン含有量を含有するジャガイモ塊茎が提供される。本発明の第４の局面により、生物、特に植物または植物細胞においてデンプン生産の速度および／または収量を増加させる方法が提供され、この方法は、本発明の形質転換生物を形成するために本発明によるヌクレオチド配列を生物に導入する工程および上記ヌクレオチド配列を発現させる工程を包含する。本発明の第５の局面により、生物、特に植物または植物細胞においてデンプン生産の速度および／または収量を増加させる方法が提供され、この方法は、本発明のＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）酵素またはそのサブユニットを生物に導入する工程または生物で形成させる工程を包含する。本発明の第６の局面により、以下のいずれか一つが提供される：配列番号２として本明細書中で同定されたｃＤＮＡ配列であって、この配列の非臨界的な（no n-critical）対立遺伝子変異を包含する；配列番号４に示されるようなアミノ酸配列であって、この配列の１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を包含する；配列番号５として本明細書中で同定されたｃＤＮＡ配列であって、この配列の非臨界的な対立遺伝子変異を包含する；配列番号６に示されるようなアミノ酸配列であって、この配列の１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を包含する。本発明の第７の局面により、以下のプラスミドのいずれか一つが提供される：プラスミドpPPS1；プラスミドpPPL1；プラスミドpPPL1M；プラスミドpPPS4；プラスミドpPPL4；プラスミドpPPL5；プラスミドpBKL4；プラスミドpVictorIV GN 。本発明の第８の局面により、生物、特に植物または植物細胞でデンプン生産の速度および／または収量を増加する方法が提供され、この方法は、生物に、外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ酵素（ＡＧＰ）またはそのサブユニットをコードする外因性ＤＮＡ配列、およびこの配列によりコードされたＡＧＰの上記生物による発現を可能にする１またはそれ以上のプロモーター配列を含有する組換えＤＮＡ構築物を導入し、それにより上記生物のＡＧＰ含有量を増加させ、その結果上記生物によるデンプン生産速度および／またはデンプン収量を増加させる工程を包含し、上記ＤＮＡ配列が、オオムギ（Hordeum vulgare）内胚乳ＡＧＰまたはそのサブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型をコードする遺伝子配列であることで特徴づけられ、ここで、上記構築物は上記生物で発現され得る；上記酵素またはそのサブユニットの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルの無機リン酸からも実質的に独立することで特徴づけられる；そして上記酵素またはそのサブユニットの活性がフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されないことでさらに特徴づけられる。本発明の第９の局面により、生物、特に植物または植物細胞の形質転換のためのベクターが、このような生物のＡＧＰ含有量を増加させ、その結果このような生物によるデンプン生産の速度を増加させるために提供され、このようなベクターは、外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ酵素（ＡＧＰ）をコードするＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ構築物を含み、このようなベクターはまた、そのベクターにより形質転換された生物においてこの外因性ＡＧＰの発現を可能にするのに必要なプロモーターおよびその他の配列を組み込み、上記ＤＮＡ配列が、オオムギ（Hordeum vulgare）内胚乳ＡＧＰまたはそのサブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型をコードする遺伝子配列であることに特徴づけられ、ここで、上記構築物が上記生物で発現され得る；上記酵素またはそのサブユニットの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるレベルのインビボ無機リン酸からも実質的に独立することで特徴づけられる；そして上記酵素またはそのサブユニットの活性がフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されないことでさらに特徴づけられる。本発明の第10の局面により、外因性タンパク質を植物および植物細胞のアミロプラストに標的する方法が提供され、上記方法は植物および植物細胞に、デンプン分枝酵素遷移ペプチドをコードするＤＮＡ配列および外因性タンパク質をコードする外因性ＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ構築物を導入する工程を包含する；ここで、上記構築物は上記植物または植物細胞で発現され得る；好ましくは、ここで、上記デンプン分枝酵素をコードするＤＮＡ配列が配列番号５として同定される配列を含み、そして／または上記植物または植物細胞で上記構築物により発現される上記デンプン分枝酵素が、配列番号６として同定されるアミノ酸配列を含む。本発明の第11の局面により、ＡＧＰ酵素またはそのサブユニットが提供され、インビボでのその活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルのＰ_iからも実質的に独立し、そしてその活性がフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されない。本発明の第12の局面により、本発明による生物から作られるまたは生物を含む食料品が提供される；好ましくは、上記食料品が油で揚げた食料品である；さらに好ましくは、上記食料品がジャガイモである。本発明に関する用語「形質転換生物」は、発現可能な外因性ヌクレオチド配列またはこのような発現可能な外因性ヌクレオチド配列の発現産物を含有する生物を意味する。好ましくは、発現可能な外因性ヌクレオチド配列は生物のゲノムに取り込まれる。本発明に関する用語「生物」は、植物、藻類、菌類、および細菌類、ならびにそれらの細胞のようないかなるデンプン生産生物をも包含する。好ましくは、この用語は、植物またはその細胞、さらに好ましくは、ジャガイモおよび特にジャガイモの塊茎を意味する。本発明に関する用語「ヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡを包含する。好ましくは、ＤＮＡ、さらに好ましくはｃＤＮＡを意味する。本発明に関する用語「対立遺伝子」および「変異型」は、配列からのまたは配列への１またはそれ以上の核酸／アミノ酸の置換（substitution）、変異、改変、置換（replacement）、欠失、または付加を意味し、その結果生じた配列は必要な酵素活性を発現または呈示する。それらはまた、実質的に相同な配列を意味し、ここで必要な酵素活性の発現または呈示のために少なくとも必須の核酸／核酸残基／アミノ酸に関して相同性がある。列挙した配列と好ましくは少なくとも 80％の相同性があり、より好ましくは少なくとも90％の相同性があり、そしてさらにより好ましくは少なくとも95％の相同性がある。ハイブリド配列もまた包含される。これらは、少なくとも２つの異なった供給源から調製され得る。例えば、変異体は、変異型をインビボでの３−ホスホグリセリン酸のレベルに関して独立させる１つの供給源からの配列および変異型をインビボでのＰ_i のレベルに関して独立させる他の１つの供給源からの配列を含み得る。本発明に関する用語「サブユニット」は、必要な酵素活性を示す酵素の活性成分を意味する。例えば、オオムギ（Hordeum vulgare）から得られるＡＧＰ酵素の場合では、それは、２つの大サブユニットおよび２つの小サブユニットを含有するヘテロ四量体であり、この用語は、いずれか１つのそれらのサブユニットおよびそれらの組合せおよびその短縮型の変異型を包含する。本発明に関する用語「酵素活性を保持する」は、酵素変異体またはそのサブユニットの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルの無機リン酸からも実質的に独立することを意味するが、天然の酵素と必ずしも同程度でない。本発明に関する用語「実質的に独立する」は、酵素がＰＧＡおよび／または無機リン酸のレベルに対して、好ましくは少なくともＰＧＡに対して感受性の低下を有することを意味する。例として、ＰＧＡの非存在下では、天然の酵素またはそのサブユニットのＡＧＰase活性のレベルは、少なくとも0. 002ユニット/mgタンパク質の程度であり、好ましくは、少なくとも0.01ユニット /mgタンパク質である。これはBintjeジャガイモ塊茎抽出物中で測定される。代表的には、好ましいオオムギＡＧＰ酵素の場合、本発明者らは、Bintjeジャガイモ塊茎抽出物中で測定した場合、大サブユニットのＡＧＰaseレベルは、小サブユニットのレベルよりも大きく、そして代表的には0.02ユニット/mgタンパク質より大きい程度であり、そして0.05ユニット/mgタンパク質の程度であり得ることを見出した。これは、ＰＧＡの非存在下でＡＧＰase活性を有さないまたはほとんど有さない公知の酵素と対照的である。好ましくは、ＡＧＰ酵素の酵素活性が、少なくとも、いかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸とも実質的に独立している。さらに好ましくは、ＡＧＰ酵素の酵素活性はフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されず、そしてそれはＡＭＰにより阻害されない。好ましくは、ＡＧＰ酵素はヘテロ多量体であり、好ましくはヘテロ四量体、さらに好ましくは２つの大サブユニットおよび２つの小サブユニットを含有するヘテロ多量体である。好ましくは、ＡＧＰ酵素はHordeumから単離され、好ましくはこの酵素がオオムギ（Hordeum vulgare）内胚乳ＡＧＰまたはそのサブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型である。好ましくは、このヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。好ましくは、このＤＮＡ配列は、オオムギ内胚乳ＡＧＰの大サブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰの大サブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型をコードする。好ましくは、このＤＮＡ配列は、本明細書中で配列番号１として同定された配列であり、その配列の非臨界的な対立遺伝子変異を包含する。好ましくは、このＤＮＡ配列は、オオムギ内胚乳ＡＧＰの小サブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰの小サブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型をコードする。好ましくは、このＤＮＡ配列は、本明細書中で配列番号２として同定された配列であり、その配列の非臨界的な対立遺伝子変異を包含する。好ましくは、両方のＤＮＡ配列が同じ生物で発現される。ＤＮＡ配列は、オオムギのような同一の最初の供給源に由来することを必要としない。しかし、それらは、同じ供給源、例えば、オオムギに由来することが好ましい。好ましくは、両方のＤＮＡ配列が同じ生物で発現される場合、各ＤＮＡ配列は異なったマーカーを付加的にコードする。例えば、オオムギＡＧＰ酵素の大または小のサブユニットは、プラスミドpBKL4 またはpVictorIV GNに基づく構築物のようなカナマイシン耐性遺伝子を含有する構築物に存在し得、そしてオオムギＡＧＰ酵素の別の小または大のサブユニットはプラスミドpVictorIV SGiN Manに基づく構築物のようなマンノースイソメラーゼ遺伝子を含有する構築物に存在し得る。好ましくは、発現されたＡＧＰ酵素またはそのサブユニットは、配列番号３に記載のアミノ酸配列、もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を含む。好ましくは、発現されたＡＧＰ酵素またはそのサブユニットは、配列番号４に記載のアミノ酸配列、もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を含む。好ましくは、発現されたＡＧＰは、配列番号３に記載のアミノ酸配列もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を有する大サブユニット、および配列番号４に記載のアミノ酸配列もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有する小サブユニットの両方を含む。好ましくは、このヌクレオチド配列は、遷移ペプチドを付加的にコードする。この遷移ペプチドは、細胞質から関連したまたは適切な色素体（例えば、葉緑体および／またはアミロプラスト）へ酵素またはそのサブユニットを輸送し得るか、または輸送を補助し得る。好ましくは、この遷移ペプチドは、Rubisco活性化酵素（Rubisco Activas e）遷移ペプチドまたはデンプン分枝酵素遷移ペプチドである。好ましくは、遷移ペプチドは、配列番号５として同定された配列を含むＤＮＡ配列によりコードされ、この配列の非臨界的な対立遺伝子変異を包含する。好ましくは、この遷移ペプチドは、配列番号６として同定された配列もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を含むアミノ酸配列を有する。好ましくは、ヌクレオチド配列がこの配列を発現させるプロモーターに作動可能に連結され、ここで、このプロモーターは、細胞、組織、または器官特異性である。好ましくは、このプロモーターは、配列番号７として同定された配列、もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なヌクレオチド置換または欠失を有するその変異型を有する。好ましくは、ＡＧＰ酵素またはそのサブユニットは、配列番号３に記載のアミノ酸配列、またはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型、および／もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列、またはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を含む。好ましくは、生物は形質転換植物である。好ましくは、形質転換植物はジャガイモ植物である。好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列は、以下のいずれか１つのプラスミドから得られ得る：プラスミドpVictorIV SGiN Man；プラスミドpPPS1；プラスミドpPPL1；プラスミドpPPL1M；プラスミドpPPS4；プラスミドpPPL4；プラスミドpPPL5；プラスミドpBKL4；プラスミドpVictorIV GN。好ましくは、酵素は、真核細胞供給源から得られ得る。本発明は、デンプン生産生物、特に植物に対し広い適応性を有する。本発明は、細菌と比較して、植物のような生物においてより良好に作用する。特に、本発明は、ＡＧＰ活性がフルクトース−１，６−ビスＰで刺激され、そしてＡＭＰにより阻害されるE．Coliと比較して、植物においてより良好に作用する。このE．Coliの経路は、植物および藻類でのデンプンの生合成の経路と異なる。本発明の１つの好ましい局面、すなわち、本発明の油で揚げたジャガイモから調製した食料品に関しては、ジャガイモのデンプン含有量が増加したことにより、揚げ加工の間の脂肪／油の収り込みが減少するようになることが注目される。これは明らかに食餌療法に利益を生じる。さらに、デンプンのレベルの増加はまた、還元炭水化物（デンプン合成で用いられる）の遊離レベルが減少していること、および生じた生産物については、加熱した脂肪／油と還元炭水化物との例示の反応により、揚げ加工時に変色するという傾向が減少していることを意味する。本発明の好ましい局面に従って、オオムギ（Hordeum vulgare）内胚乳由来のＡＧＰは、活性化因子ＰＧＡの非存在下でさえ、高い活性があり、そして多くの他の公知の植物供給源由来のＡＧＰの場合において重要な調節機能を果たすＰＧＡ／Ｐ_i比に対して比較的感受性でないことを見出した。ＰＧＡ／Ｐ_i比はまた、非植物性ＡＧＰ、例えば、藻類ＡＧＰで重要な調節機能を果たすと考えられている。オオムギ内胚乳ＡＧＰの大および小のサブユニットの部分をコードするｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列が最近確立され、そしてPlant Molecular Biolog y，19，381-389（1992）において公開された。大サブユニットについてのｃＤＮＡとともに大サブユニットをコードする完全ＤＮＡ配列がPlant Physiol．100， 1617-1618，（1992）に記述されている。本発明に従って、オオムギ内胚乳ＡＧＰの小サブユニットをコードする完全ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列が今や確立された。これらの完全ｃＤＮＡ配列は、オオムギ内胚乳ＡＧＰの大および小のサブユニットそれぞれをコードする配列番号１および２として本明細書で再現されるが、推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および４として本明細書中に記述される。従って、本発明の好ましい実施態様では、植物でのデンプン生産は、適切なプロモーター配列または植物細胞、特に葉緑体およびアミロプラストで遺伝子の発現を促進する配列の制御下で、オオムギ（Hordeum vulgare）内胚乳ＡＧＰの大サブユニット（60kDa ）または小ユニット（51kDa）のいずれかもしくは両方をコードするＤＮＡ配列を植物のゲノムの中に取り込むことで促進／増大され得る。従って、本発明の非常に好ましい局面では、デンプン生産速度および／またはデンプン含有量の増大を有する形質転換植物および植物細胞が提供され、対応している非形質転換植物または植物細胞と比較している。このような植物および植物細胞は、組換えＤＮＡ構築物で形質転換され、この組換えＤＮＡ構築物は、植物プロモーター配列もしくは植物または植物細胞で遺伝子の発現を可能にする配列に対して作動上の関係（特に下流関係）で、オオムギ（Hordeum vulgare）内胚乳ＡＧＰまたはヘテロ四量体ＡＧＰの酵素活性を保持するその活性サブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型をコードする遺伝子配列を含有する。一方、本発明に従って、広範な生物（例えば、植物および植物細胞）が、形質転換され得（特にオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを用いて）、特定の生物でのデンプン生産およびデンプン収量を増加させる。好ましい実施態様は、主要なデンプン生産植物作物、すなわち、ジャガイモ、イネ、コムギ、およびトウモロコシの形質転換に関係し、この４つの作物は、熱量に換算して、おそらく世界の食糧供給の４分の３を占める。テンサイもまた形質転換され得る。本発明のさらに特異的な局面では、非形質転換材料と比較してデンプン生産の速度の増加を有するおよび／またはデンプン収量の増加を提供する形質転換植物および植物細胞が提供される。このような植物および植物細胞は、組換えＤＮＡ構築物で形質転換され、この組換えＤＮＡ構築物は、植物プロモーター配列もしくは植物または植物細胞で遺伝子の発現を可能にする配列に対して下流関係で、本明細書に付随し、そして本明細書の一部をなす配列表中に規定の様式で記述したとおりの配列番号１および配列番号２の配列のいずれかまたは両方、もしくは列挙した配列と実質的な相同性を示しそしてヌクレオチド鎖中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なヌクレオチド置換を含むいずれかの配列の対立遺伝子変異型を含有する。その他の規定では、本発明に従って、ＡＧＰ生産レベルの増強を特に葉緑体およびアミロプラストにおいて示す形質転換植物および植物細胞が提供される。このような植物および植物細胞は、組換えＤＮＡ構築物で形質転換され、この組換えＤＮＡ構築物は、植物または植物細胞でオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニット（これらのサブユニットは、配列番号３および４に記載の誘導アミノ酸配列を有する）、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するこのような配列の変異型の発現を可能にする。本発明に従って、植物および植物細胞の形質転換のための植物形質転換ベクターもまた提供され、このような植物および植物細胞のＡＧＰ含有量を増加させ、そしてその結果形質転換された植物または植物細胞によるデンプン生産速度および／またはデンプン収量を増加させる。このようなベクターは、オオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットをコードするＤＮＡ配列と作動上の関係で連結された、植物において機能的な１またはそれ以上のプロモーター配列を含有する。さらに特に、配列番号１または配列番号２の配列のいずれかまたは両方、もしくは列挙した配列と実質的な相同性（少なくとも８０％）を示すが、ヌクレオチド鎖中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なヌクレオチド置換を有するいずれかの配列の対立遺伝子変異型と作動上の関係で連結された、植物において機能的な１またはそれ以上のプロモーター配列を含有する植物形質転換ベクターが提供される。プロモーターに関して、植物で機能する多数のプロモーターが公知である。プロモーターは、デンプン生産の所望される増加を生じるような充分な発現を可能にすることができるべきである。好ましくは、デンプン生産の増加がデンプン生産を必要とする植物組織で実施されるように、プロモーターを選択するべきである。例えば、植物由来のデンプン生合成遺伝子のプロモーターが有用であり得る。このようなプロモーターの公知の例は、ジャガイモ由来の顆粒結合性デンプンシンターゼ遺伝子のプロモーター（Van der Leijら、［1991 ］Mol．Gen．Genet．228:240-248）、およびイネ由来のデンプン分枝酵素遺伝子 Sbe1のプロモーター（Kawasakiら、［1993］Mol．Gen．Genet．237:1-16）を包含する。ジャガイモでの発現について、塊茎特異的クラスI patatinプロモーター（tub er specific class I patatin promoter）が好ましい（Migneryら、［1988］Gen e．62:27-44）。塊茎特異的クラスI patatinプロモーターをコードするＤＮＡ配列が本明細書の付録に配列番号７として記述されている。このpatatinプロモーターをDr．William Belknap，USDA-ARS，Alabany，Californiaから入手した。オオムギ内胚乳ＡＧＰをコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、ＤＮＡの発現のために、プロモーター配列に加えて、転写ターミネーター配列のようなその他の制御配列に連結される。転写ターミネーターは、植物性、ウイルス性、およびAgrobacterium 遺伝子を包含する種々の異なった遺伝子に由来し得る。カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーターが好ましい。ＡＧＰ活性は植物中の異なった部位で生じ得る。例えば、ジャガイモでは、ＡＧＰ活性は葉緑体（すなわち、光合成専門の色素体）またはアミロプラスト（すなわち、デンプン貯蔵専門の色素体）に主に局在する。多くのアミロプラスト局在タンパク質は、前駆物質として発現し、そしてその後に除去される適切な遷移ペプチドによりアミロプラストへ標的される。同様に、多くの葉緑体局在タンパク質は、適切な標的ペプチドにより葉緑体に標的され得る前駆物質として発現する。いかなる理論にしばられることも望まないが、オオムギ内胚乳ＡＧＰの大および小のサブユニットの両方とも、前駆ペプチドとして合成されると考えられる。遷移ペプチドを表すと理解されている付加配列が、成熟タンパク質のアミノ末端に付着することが見出されている。次いで、遷移ペプチドは、色素体への前駆タンパク質の隔離（sequestration）の際に切断される。酵素はインビボでいかなる他の翻訳後改変プロセスも受けないことが理解される。しかし、本発明のその他の実施態様では、ＡＧＰ遷移ペプチドが１またはそれ以上の付加遷移ペプチドで付加されることが所望される。遷移ペプチドは、便宜的にＡＧＰオオムギサブユニットのアミノ末端のメチオニンで直接融合され得る。さらに好ましい実施態様では、オオムギＡＧＰ遷移ペプチドは、その他のアミロプラストまたは葉緑体遷移ペプチドにより置換され得る。オオムギ内胚乳ＡＧＰｃＤＮＡを便利なクローニングベクター、例えば、プラスミドの適切な制限部位に挿入する。付加ＤＮＡ配列の取り込みのために、必要であれば、目的のＤＮＡ配列は、さらなるベクターにクローニングされ得る。適切な植物遷移ペプチドは、公知の葉緑体（Gavel & Von Heine［1990］FEBS Lett．261:455-458）またはアミロプラスト（Van der Leijら、［1991］Mol．Genet．228:240-248；Klo sgenら、［1989］Mol．Gen．Genet．217:155-161；B rissonら、The Plant Cell［1989］1:559-566）の遷移ペプチドを包含する。ジャガイモでは、好ましくはrubisco活性化酵素遷移ペプチド（Wernekeら、Pr oc．Natl．Sci．USA［1988］85:787-791）またはデンプン分枝酵素遷移ペプチドを用いる。５’の非翻訳領域の120ヌクレオチドおよびコード領域の360ヌクレオチドを示すジャガイモ由来の480bpのデンプン分枝酵素のｃＤＮＡ配列（配列番号５を参照のこと）は、これは推定75アミノ酸遷移ペプチドおよび45アミノ酸の成熟分枝酵素を含み、配列番号６として本明細書の付録に記述される。タンパク質の遷移ペプチド部分に加えて、細胞内輸送をさらに促進するために、成熟色素体標的タンパク質の部分をコードする配列を包含することが所望され得る。好ましくは、プラスミドはまた、形質転換されなかった植物細胞から形質転換植物細胞を分離するために、選択マーカーを提供される。適切な遺伝子は公知であり、そして例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、 neo npt II）、ホスフィノトリシン（phosphinotricine）／ビアラホス（bialap hos）アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、bar）およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子（例えば、uidA）またはホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（例えば、manA、pmi）を包含する。好ましい実施態様では、形質転換ベクターは、Plant Molecular Biology，19 ，381-389（1992）に記載された方法によりオオムギ内胚乳ＡＧＰの小および大のサブユニットをコードするｃＤＮＡを最初に得ることにより調製され得る。便利なクローニングベクター、例えば、プラスミドへの連結について、オオムギ内胚乳ＡＧＰのｃＤＮＡには、従来のオリゴヌクレオチド合成手順、または例えば、Applied Biosystems 381 A DNA合成機のような市販されているオリゴヌクレオチド合成機により得られるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲで各末端の制限部位が提供される。これらの制限部位は、クローニングベクター中の配列と相同であるべきである。所望されるＤＮＡ配列は、形質転換デンプン生産生物、特に形質転換植物を調製するための究極の形質転換ベクターの調製のために、さらにベクターに再クローニングされ得る。本発明の好ましい実施態様では、植物または植物細胞は細胞を形質転換するための適切な技術（Ｔ-ＤＮＡ、エレクトロポレーション、注入、ＤＮＡボンバード（bombardment）または融合の使用のような）により形質転換し得る。形質転換後、植物体が、通常の方法で形質転換された植物細胞から培養され得る。好ましくは、植物細胞の形質転換は、Agrobacterium tumefaciensまたはAgrob acterium rhizogenesをもちいてＴ-ＤＮＡで達成される。アグロバクテリアを形質転換に用いる場合、オオムギ内胚乳ｃＤＮＡは、中間ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかに最初に取り込まれることを必要とする。中間ベクターは、ヘルパープラスミドによりAgrobacterium tumefaciensに組み込まれ得る。好ましくは、バイナリーベクターが用いられ、これはアグロバクテリアに直接形質転換され得る。バイナリーベクターは、選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含み、それらは、Ｔ-ＤＮＡの右および左のボーダー領域により組み立てられている。宿主細胞として用いられるアグロバクテリアは、vir領域を有するプラスミドを含み、それはＴ-ＤＮＡが植物細胞に移行するに必要である。アグロバクテリアを用いた形質転換は、植物細胞とともにアグロバクテリアを培養することにより達成される。形質転換される植物種により、種々の異なった植物形質転換ベクターが用いられ得る。これらは、pBIN121、pAL4404、pEHA101、pBKL4、pVictorIV SGiNMan、およびpVictorIV GNを包含する。ジャガイモ種のアグロバクテリアの形質転換のため、好ましい植物形質転換ベクターは、プラスミドpBKL4、pVictorIV SGiNMan、およびpVictorIV GNである。これらのプラスミドは、後にかなり詳細に記載される。形質転換のために用いられるプラスミドの構築で用いられた好ましいプラスミドは、pPATA1およびpBluescript II KSを包含する。プラスミドpBluescriptII K Sは、Stratageneから入手可能な広範囲に使用されるクローニングベクターである。植物は、従来のブロッティングアッセイおよびＰＣＲを行うことにより形質転換を確認され得る。植物のデンプン含有量は、W.A．Gould，「Chipping Potato Handbook」，Goul d，W.A.編、The Snack Food Association，Vermont，1989年、pp18-22，表題「比重、その測定および使用」により記載されたとおり、水中の重量および空気中の重量を用いて決定した比重に基づき分析され得る。フルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されない外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）酵素またはＡＧＰ酵素の酵素活性を保持するそのサブユニットに限定することは、WO91/1 9806およびWO92/11382のＡＧＰ酵素のような先行技術のＡＧＰ酵素から本発明をさらに区別し、単にE．Coli ＡＧＰ酵素ではない外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）酵素またはＡＧＰ酵素の酵素活性を保持するそのサブユニット、もしくは以下の反応を触媒することが可能な外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）酵素またはＡＧＰ酵素の酵素活性を保持するそのサブユニットのいずれかとして発現され得る以下のサンプルは、認可された寄託機関The National Collections of Indust rial and Marine Bacteria Limited（NCIMB）、23 St．Machar Drive，Aberdeen ，Scotland，United Kingdom，AB2 1RYに1994年３月29日にブタペスト条約に従って寄託された：プラスミドpPPS1を含むE．Coli（NCIMB 40618）；プラスミドpPPL1を含むE．Coli（NCIMB 40619）；プラスミドpPPS4を含むE．Coli（NCIMB 40620）；プラスミドpPPL4を含むE．Coli（NCIMB 40621）；およびプラスミドpPPL5を含むE．Coli（NCIMB 40622）。以下のサンプルは、認可された寄託機関The National Collections of Indust rial and Marine Bacteria Limited（NCIMB）、23 St．Machar Drive，Aberdeen ，Scotland，United Kingdom，AB2 1RYに1994年３月31日にブタペスト条約に従って寄託された：プラスミドpBKL4を含むE．Coli（NCIMB 40623）；プラスミドpVictor IV GNを含むE．Coli（NCIMB 40624）；およびプラスミドpVictor IV SGiN Manを含むE．Coli（NCIMB 40625）。本発明による植物形質転換ベクターの詳細な構築、およびデンプン生合成の速度および／またはデンプン収量の増加を有する本発明による形質転換植物を生産するためにこれらのベクターを用いる植物および植物細胞の形質転換を、さらに詳細に記載する。このことについて、本発明は実施例によってのみ記載される。以下の実施例では、以下の添付の図面について言及されている：図１はプラスミドpPATA1についての制限地図を示す；図２は植物形質転換ベクターpBKL4についての制限地図を示す；図３はプラスミドpPPS1についての制限地図を示す；図４はプラスミドpPPL1についての制限地図を示す；図５はプラスミドpATP1についての制限地図を示す；図６は植物形質転換ベクターpVictor IV GNについての制限地図を示す；図７は植物形質転換ベクターpVictor IV SGin Manについての制限地図を示す；図８はrubisco活性化酵素−AGP小サブユニット融合酵素のＮ末端アミノ酸配列、 rubisco活性化酵素−AGP大サブユニット融合酵素のＮ末端アミノ酸配列、およびデンプン分枝酵素−AGP大サブユニット融合酵素のＮ末端のアミノ酸配列を示す；図９はプラスミドpPPS4についての制限地図を示す；図１０はプラスミドpBETP5についての制限地図を示す；図１１はプラスミドpPPL4についての制限地図を示す；図１２はプラスミドpPPL5についての制限地図を示す；図１３はプラスミドpPPL1Mについての制限地図を示す；図１４はオオムギＡＧＰの大サブユニットについてのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図１５はオオムギＡＧＰの小サブユニットについてのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す；図１６はデンプン分枝酵素についてのｃＤＮＡ（５’末端から最初の480ヌクレオチド）およびアミノ酸配列（アミノ末端から最初の120アミノ酸）を示す；および図１７は好ましいジャガイモプロモーターについてのゲノムＤＮＡ配列を示す。以下の実施例では、以下のアミノ酸コードを用いる：Ａ． patatinクラスＩプロモーターから発現されるＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子を含有する植物形質転換ベクターの構築実施例１プラスミドpPPS1 プラスミドpPPS1は、以下の構築物を含有するpBKL4誘導体である： patatinプロモーター−小サブユニットＡＧＰｃＤＮＡ−35Sターミネーター。ＡＧＰカセットをpBKL4のKpnI部位に挿入した。この挿入によりpBKL4 Ｔ-ＤＮＡに導入された付加要素を以下に記載する。 patatinプロモーター：patatinプロモーターは、ジャガイモ由来の塊茎特異的プロモーターである（Migneryら、1988，Gene 62:27-44）−配列番号７を参照のこと。小サブユニットＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（bepsF2）：これはオオムギ内胚乳由来の小サブユニットＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをコードする1.8kbのｃＤＮＡ断片である−配列番号２を参照のこと。 35Sターミネーター：CaMV 35Sターミネーター（Odellら、1985，Nature 313:8 10-812）はbepsF2断片に融合される。さらに詳細には、オオムギ内胚乳ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの小サブユニット（beps）をコードする1.8kbのBamHIｃＤＮＡ断片を、プラスミドpPAT A1のBamHI部位にクローニングした（図１）。プラスミドpPATA1は、プラスミドpUC19の誘導体であり、そして塊茎特異的patatinクラスＩプロモーター配列番号７、ポリリンカークローニング領域、および35Sターミネーターを有する。得られたプラスミドから、p atatinプロモーター、beps ｃＤＮＡ、および35Sターミネーターを含む3.1kbのK pnI断片を単離し、そして植物形質転換ベクターpBKL4（図２）のKpnI部位に挿入し、プラスミドpPPS1（図３）を得た。プラスミドpBKL4は植物のAgrobacterium tumefaciens媒介形質転換についてのプラスミドpBIN19の誘導体であり、そして35Sプロモーターから転写されそしてノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターで終了されるβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）をともなうＴ-ＤＮＡ領域、ポリリンカークローニング領域、および35Sプロモーターから転写されそしてオクトピン合成酵素遺伝子ターミネーターで終了されるネオホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有する。実施例２プラスミドpPPL1 プラスミドpPPL1は、以下の構築物を含有するpBKL4誘導体である： patatinプロモーター−大サブユニットＡＤＰ−グルコースホスホリラーゼｃＤＮＡ−35Sターミネーター。ＡＤＰ−グルコースホスホリラーゼカセットをpBKL4のEco RI部位に挿入した。この挿入によりpBKL4 Ｔ-ＤＮＡに導入された付加要素を以下に記載する。 patatinプロモーター：patatinプロモーターは、ジャガイモ由来の塊茎特異的プロモーターである（Migneryら、1988，Gene 62:27-44）−配列番号７を参照のこと。大サブユニットＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（bep110）：これはオオムギ内胚乳由来の大サブユニットＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをコードする1.9kbのｃＤＮＡ断片である（Villandら、1992，Plant Physiol 100:16 17-1618）−配列番号１を参照のこと。 35Sターミネーター：CaMV 35Sターミネーター（Odellら、1985，Nature 313:8 10-812）はbep110断片に融合される。さらに詳細には、オオムギ内胚乳ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの大サブユニット（bepl）をコードする1.9kbのEcoRI-HindIIIｃＤＮＡ断片を単離し、制限末端はクレノウＤＮＡポリメラーゼで満たされ、そして平滑末端化したＤＮＡ断片をプラスミドpPATA1のSmaI部位にクローニングした。生じたプラスミドから、patatinプロモーター、bepl ｃＤＮＡ、および35Sターミネーターを含む3.2 kbのEcoRI断片を単離し、そして植物形質転換ベクターpBKL4のEcoRI部位に挿入し、プラスミドpPPL1（図４）を得た。実施例３プラスミドpPPL1M プラスミドpPPL1M（図１３を参照）は、以下のＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼカセット： patatinプロモーター−大サブユニットＡＤＰ−グルコースホスホリラーゼ−35S ターミネーターをpVictorIV SGiN ManのEcoRI部位に挿入したことを除いてpPPL1と同様である。実施例４プラスミドVictorIV SGN pVictorIV SGN（図６）は、Agrobacteriumに媒介される植物形質転換のためのベクターであり、カナマイシン耐性（NPTII）およびβ−グルクロニダーゼ（GUS ）をコードする遺伝子を隣接するノパリンタイプのpTiT37プラスミド（Yadavら、1982，Proc Natl Acad Sci 79:6322-6326）由来のTiの右および左のボーダー配列を含有する。 E．coliでの複製および維持のために、プラスミドはE．coliプラスミドpUC19 由来の複製起点（pUC19ori）を含有し（Yanish-Perronら、1985 Gene 33:103-11 9）、そしてAgrobacterium tumefaciensでの複製および維持のために、プラスミドはさらにPseudomonasプラスミドpVS1由来の複製起点（pVSlori）を含有する（ Itohら、1984，Plasmid 11:206-220，ItohおよびHaas 1985，Gene 36:27-36）。 E．coliおよびAgrobacterium t umefaciensでの選択のために、プラスミドは酵素3’（9）-O-ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンTn7由来のスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子（spec.strep）を含有する（Flingら、1985，Nuc leic Acids Res 19:7095-7106）。spec/strep耐性遺伝子は細菌での効果的な発現のためにtacプロモーターに融合される。右および左のボーダー間のＴ-ＤＮＡセグメントは以下の遺伝子を有し、それはAgrobacterium tumefaciens媒介形質転換を経てジャガイモ植物へ運ばれた遺伝子のみである。 β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）：右のボーダーに隣接したこのセグメントは、CaMV 35Sプロモーター（35S）および35Sターミネーター（35St）（Odellら、1 985，Nature 313:810-812）に融合したE．coli由来ののβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）（Jeffersonら、1986，Proc Natl Acad Sci 83:8447-8451）である。複クローニング部位（ＭＣＳ）：種々の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有するポリリンカーを35Sターミネーターの後に挿入する。カナマイシン耐性（NPTII）：ＭＣＳに隣接したセグメントは、CaMV 35Sプロモーター（Odellら、1985，Nature 313:810-812）およびオクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター（Caplanら、1983，Science 222:815-821）に融合したトランスポゾンTn5由来のカナマイシン（ネオマイシン）ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（NPTII）（Beckら、1982 Gene 19:327-336）である。実施例５プラスミドpVictorIV SGiN Man pVictorIV SGiN Man（図７）は、ＧＵＳ遺伝子が、細菌での発現を妨げるためにイントロンを含有する他のＧＵＳ遺伝子（ＧＵＳイントロン）により置換されていること以外はpVictor IV SGN（Bilag XI）と同じである。さらに、カナマイシン（ネオマイシン）ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（NP TII）はE．coli由来のマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ遺伝子、manA で置換されている。 β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳイントロン）：右のボーダーに隣接したこのセグメントは、細菌での発現を妨害するイントロンが付き、そしてCaMV 35Sプロモーター（35S）および35Sターミネーター（35St）（Odellら、1985，Nature 313: 810-812）に融合したE．coli由来のβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）（Je ffersonら、1986，Proc Natl Acad Sci 83:8447-8451）である。マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ：このセグメントは、増強35Sプロモーター（E35S）（Kayら、1987，Science 236:1299-1302）および35Sターミネーター（35St）（Odellら、1985，Nature 313:810-812）に融合したE．coli由来のマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ遺伝子（MilesおよびGuest 198 4，Gene 32:41-48）である。ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子は、炭素源としてＤ−マンノースを含有する培地上で形質転換シュートを選択するために選択マーカーとして用いられる。Ｂ．ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼサブユニットへの遷移ペプチドの付着実施例６プラスミドpPPS4 pPPS4（図９）は、pVictorIV誘導体であって、ここでは、以下の構築物を含有する３kbのKpnI断片： patatinプロモーター−ホウレンソウrubisco活性化酵素遷移ペプチド−オオムギ内胚乳由来の小サブユニットＡＧＰ−35SターミネーターがKpnI部位に挿入される。さらに詳細には、オオムギ内胚乳ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ小サブユニット（beps）ｃＤＮＡのコーディング領域を、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：これは、５’末端にBamHIおよびNcoI、ならびに３’末端にBamHI部位を有するＰＣＲ断片を提供する。アミノ末端にＡＧＰ小サブユニットおよび２つの付加アミノ酸（ＧおよびＳ）の完全コーディング領域を含有する1.4kbのBamHI断片を、pB luescript II KSのBamHI部位にクローニングし、プラスミドpBBS Fを得た。1.4kbのBamHI断片をpBBSFから単離し、そしてプラスミドpATP1のBamHI 部位にクローニングした（図５）。プラスミドpATP1は、patatinプロモーター、 58アミノ酸のrubisco活性化酵素遷移ペプチドＤＮＡおよび35アミノ酸の成熟酵素、小サブユニットＡＧＰ読み取り枠のインフレーム融合を促進するBamHI部位、および35Sターミネーターを有する。patatinプロモーター、活性化酵素遷移ペプチド、ＡＧＰコーディング領域、および35Sターミネーターを含む３kbのKpnI 断片を、得られたプラスミドから単離し、そして植物形質転換ベクターpVictorI V GN（図６）のKpnI部位にクローニングし、プラスミドpPPS4（図９）を得た。 rubisco活性化酵素-ＡＧＰ小サブユニット融合酵素のアミノ末端アミノ酸配列。 rubisco活性化酵素の配列はアミノ酸残基１で始まりそして93番目のロイシン残基で終了するが、ＡＧＰ小サブユニット配列は96番目のメチオニンで開始する。rubisco活性化酵素遷移ペプチドは、Ｎ末端のアミノ酸として59番目のアラニンを残して58番目のアラニン残基で切断される。上記の配列を配列番号８として後記する。実施例７プラスミドpPPL4 プラスミドpPPL4は、pVictorIV SGiN Manの誘導体であって、ここでは以下の構築物、 patatinプロモーター−ホウレンソウrubisco活性化酵素遷移ペプチド−オオムギ内胚乳由来の大サブユニットＡＧＰ−35Sターミネーターを含有する3.2kbのEcoRI断片がEcoRI部位に挿入される。さらに詳細には、オオムギ内胚乳ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ大サブユニット（bepl）ｃＤＮＡのコーディング領域を、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：これは、５’末端にBamHIおよびNdeI、ならびに３’末端にBamHI部位を有するＰＣＲ断片を提供する。アミノ末端にＡＧＰ大サブユニットおよび２つの付加アミノ酸（ＩおよびＨ）の完全コーディング領域を含有する1.6kbのBamHI断片を、pB luescript II KSのBamHI部位にクローニングし、プラスミドpBBLFを得た。 1.6kbのBamHI断片をpBBLFから単離し、そしてプラスミドpATP2のBamHI部位にクローニングした。プラスミドpATP2は、 patatinプロモーター、58アミノ酸のrubisco活性化酵素遷移ペプチドＤＮＡおよび35アミノ酸の成熟酵素、大サブユニットＡＧＰ読み取り枠のインフレーム融合を促進するBamHI部位、および35Sターミネーターを有する。patatinプロモーター、活性化酵素遷移ペプチド、ＡＧＰコーディング領域、および35Sターミネーターを含有する３kbのEcoRI断片を、得られたプラスミドから単離し、そして植物形質転換ベクターpVictorIV SGiN Man（図７）のEcoRI部位にクローニングし、プラスミドpPPL4（図１１）を形成した。 rubisco活性化酵素-ＡＧＰ大サブユニット融合酵素のアミノ末端アミノ酸配列。 rubisco活性化酵素の配列はアミノ酸残基１で始まりそして93番目のロイシン残基で終了するが、ＡＧＰ大サブユニット配列は97番目のメチオニンで開始する。rubisco活性化酵素遷移ペプチドは、Ｎ末端のアミノ酸として59番目のアラニンを残して58番目のアラニン残基で切断される。上記の配列を配列番号９として後記する。実施例８プラスミドpPPL5 pPPL5は、pVictorIV GIN MANの誘導体であって、ここでは以下の構築物 patatinプロモーター−ジャガイモデンプン分枝酵素アミロプラスト遷移ペプチド−オオムギ内胚乳由来の大サブユニットＡＧＰ−35Sターミネーターを含有する3.4kbのEcoRI断片がEcoRI部位に挿入される。オオムギ内胚乳ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ大サブユニットのコーディング領域を、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：これは、BamHI末端を有する1.62kbのＰＣＲ断片を提供する。アミノ末端にＡＧＰ大サブユニットおよび１つの付加アミノ酸（Ｐ）の完全コーディング領域を含有するBamHI断片を、pBETP5のBamHI部位に挿入した（図１１）。このように、ＡＧＰ大サブユニットを、75アミノ酸のジャガイモデンプン分枝酵素遷移ペプチドおよび26アミノ酸の成熟分枝酵素に融合した。融合酵素は、patatinプロモーターから発現し、そして35Sターミネーターで終了する。patatinプロモーター、デンプン分枝酵素遷移ペプチド-ＡＧＰ大サブユニット融合酵素、および35Sターミネーターを含有する得られたプラスミド（pPBL1）由来の3.4KbのEcoRI断片を植物形質転換ベクターpVictorIV SGiN ManのEcoRI部位に挿入し、プラスミドpPPL5（図１２）を形成した。デンプン分枝酵素−ＡＧＰ大サブユニット融合酵素のアミノ末端アミノ酸配列。デンプン分枝酵素の配列はアミノ酸残基１で始まりそして103番目で終了するが、ＡＧＰ大サブユニット配列は104番目のメチオニンで開始する。デンプン分枝酵素遷移ペプチドは、アミノ末端のアミノ酸としてバリン残基（76番目）を残してアラニン残基（75番目）で切断される。上記の配列を配列番号１０として後記する。Ｃ．ＡＧＰ遺伝子を含有する形質転換ジャガイモ植物の生産実施例９純粋ストック培養物 Solanum tuberosumのシュート培養物「Bintje」および「Dianella」を、２μM のチオ硫酸銀（silver thiosulphate）を含むLinsmaier，E.U.およびSkoog，F．（1965），Physiol．Plant．18:100-127による処方の培地（LS）上で25℃および 16時間明/8時間暗で維持する。培養物を約40日後に継代培養する。葉をシュートから切り離し、そして切断してそれぞれ１つの節を含有する節切片（約0.8cm）を得る。ジャガイモ組織の接種約40日齢のシュート培養物由来のシュート（高さ約5〜6cm）を切断し、節間切片（約0.8cm）を得る。切片を目的のバイナリーベクターを含有する形質転換Agr obacterium tumefaciensを含む液体LS培地に置く。Agrobacteriumは、適切な抗生物質（Agrobacterium株の耐性遺伝子に相当する）を含有するYBM培地（リン酸水素二カリウム３水和物（dipotassiumhydrogen phosphate，trihydrate）（0.6 6g/l）；硫酸マグネシウム７水和物（magnesium sulphate，heptahydrate）（0. 20g/l）；塩化ナトリウム（0.10g/l）；マンニトール（10.0g/l）；および酵母抽出物（0.40g/l）で660nmでの光学密度（OD-660）が約0.8になるまで一晩培養し、遠心分離しそしてOD-660が0.5になるまでLS培地に再懸濁する。切片を30分間Agrobacteriumの懸濁液中に放置し、そして次いで、滅菌濾紙上で切片を吸い取らせることにより過剰な細菌を除去する。共存培養シュート切片を寒天（8.0g/l）、２、４-ジクロロフェノキシ酢酸（2.0mg/l）、およびトランス-ゼアチン（0.5mg/l）を含有するLS培地で直接的に48時間細菌と共存培養する。培地およびまた外植片を滅菌濾紙で覆い、そしてペトリ皿を25℃および16時間明／８時間暗で置く。「洗浄」手順 48時間後、共培養培地上の切片を800mg/lカルベニシリン（carbenicillin）を含有する液体LS培地を含有する容器に移す。この容器を穏やかに振とうし、そしてこの手順によりAgrobacteriumの大部分を切片から洗い流しおよび/または死滅させる。選抜洗浄手順の後、切片を、LS培地、寒天（8g/l）、トランス-ゼアチン（1〜5mg/ l）、ジベレリン酸（0.1mg/l）、カルベニシリン（800mg/l）、および用いたベクター構築物に依存して硫酸カナマイシン（50〜100mg/l）またはホスフィノトリシン（1〜5mg/l）またはマンノース（5g/l）を含有するプレートに移す。切片を新鮮な培地で各３〜４週間継代培養する。３〜４週間で、シュートが切片から発達し、そして新しいシュートの形成を３〜４カ月間継続させる。再生シュートの発根再生シュートをLS培地、寒天（8g/l）およびカルベニシリン（800mg/l）からなる発根培地に移す。再生シュートの形質転換遺伝子型は、硫酸カナマイシン（2 00mg/l）を含有する上記の培地上での発根能力のテスト、NPTIIアッセイ（Radke ，S．Eら、Theor．Appl．Genet．（1988），75:685-694）の実施、またはHodal ，Lら、Pl．Sci．（1992），87:115-122に従って共導入されたβグルクロニダーゼ遺伝子についてのＧＵＳアッセイの実施、または他に記載されるようなオオムギＡＧＰのｍＲＮＡの発現またはＡＧＰ酵素活性についてのアッセイにより確証される。これらのアッセイでポジティブでない植物は、廃棄するか、またはコントロールとして用いる。土壌への移動新たに発根した植物（高さ約2〜3cm）を発根培地から土壌に移し、そして育成チャンバー（21℃、16時間光200〜400uE/m²/秒）の中に置く。植物が十分に樹立した時に、それらを温室に移し、ここで、塊茎が発達しそして植物の最上部が老化するまで育成する。収穫ジャガイモを約３カ月後に収穫した。ＡＧＰアッセイ収穫したジャガイモ植物由来の塊茎を４℃で貯蔵した。AGPaseを25mM Hepes（ pH7.4）mMメルカプトエタノールおよび１mM DTTを含有する緩衝液20ml中で10〜2 0gの薄くスライスしたジャガイモ塊茎をホモジナイズすることにより抽出した。ホモジナイズは、30ml Waringブレンダーの15秒間フルスピードを用いて０〜４℃で行った。次いで直ぐに、粗抽出物のアリコートを、卓上Eppendorf微量遠心分離を用いて１分間最大速度で遠心分離し、そして次いでAGPase活性についてアッセイした。アッセイを遠心分離後直ぐに行い、酵素が貯蔵の間に不活性化されていないことを確認した。アッセイをLKB分光光度計（Ultrospec II）を用いて、340nm（21℃）でグルコース-1-Pの形成をモニターするピロホスホロリシスディレクリョンで行った。アッセイ混合物（1ml）は、以下を含有する：100mM Mops（pH7.4）、0.6mM NAD、7 mM MgCl₂、1mM ＡＤＰ-グルコース、1mM無機リン酸、10uMグルコース-1,6−二リン酸、各２ユニットのグルコース-6-Pデヒドロゲナーゼおよびホスホグルコムターゼ。いくつかの例では、2mM3-ホスホグリセリン酸（PGA）をアッセイに添加した。アッセイを約５分間行い（PGA無し）、そして次いでＰＧＡを添加し、そしてアッセイをさらに5〜10分間モニターした。速度は通常アッセイのタイムコースの間直線状であった。１ユニットのＡＧＰase活性は、アッセイ条件下で１umo lのＮＡＤＨを生産する酵素の量に相当する。デンプン分析ジャガイモ塊茎のデンプン含有量は、Dutch-German working group「標準規格（Standardization）」により設計および提案されそして「ジャガイモおよびジャガイモ製品の評価方法（Method of assessment for potatoes and products）」に公開された方法に従って決定した。この方法は、5000gの試料サイズで用いるために開発されたが、本発明者らは、この方法を、通常20および200gの間の一つの植物からのジャガイモ塊茎で用いるために縮小した。１つの植物から得られる全てのジャガイモを洗浄し、そして電気秤で重量を測定する（ａグラム）前に布で拭いて乾かす。後に、塊茎の重量を再度測定するが、この時に天秤で２つの金属かごを用い、その内の１つは水鉢に浸けられている。ジャガイモ塊茎をバケツの水中に置き、そしてそれらの水中での重量（ｂグラム）を決定する。試料の水下重量（under-water weight）を5000ｂ／ａグラムで計算する。水下重量、乾燥物質およびデンプン含有量の間の関係を示す表から、後者の２つの外観（figures）が決定され得る。この手順はW.A．Gould、Chipping Potato Handbook，Gould，W.A.編，The Sna ck Food Association，Vermont，1989，pp18-22，表題「比重、その測定および使用」にさらに詳細に記載されている。結果ＡＧＰaseレベルおよびデンプンレベルは、本発明の構築物、特にＰＧＡの非存在下で、特に大サブユニットをコードする構築物、特に遷移ペプチドをコードする構築物を用いて増加した。この点に関して、いくつかの結果をプラスミドpPPS4およびpPPL4由来の構築物を含む形質転換ジャガイモについて表Ｉ（下）に示す。上記の結果は、プラスミドpPPS4およびpPPL4由来の構築物を含む形質転換ジャガイモでの平均デンプンレベルが天然ジャガイモで見出された平均デンプンレベルの約136％まで増加することを明らかに示す。さらに、プラスミドpPPS4およびpPPL4由来の構築物を含む形質転換ジャガイモの最上級の２つの平均デンプンレベルは、天然ジャガイモで見出された平均デンプンレベルの約155％である。これらの所見の各々は有意である。本発明のその他の改変は、本発明の範囲から逸脱せずに当業者に明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/12 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 9281−4Ｂ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オルセン，オッド−アーネノルウェー国エイエスエヌ―1430，ターンヴェイエン 16 (72)発明者ポウルセン，ピーターデンマーク国コペンハーゲンオーディーケイ―2100，３，ホステインズゲイド 52 (72)発明者オッケルズ，フィンデンマーク国ロスキルドディーケイ― 4000，コンゲマーケン 11 (72)発明者マルクッセン，ジャンデンマーク国コペンハーゲンケイディーケイ―1210，２，ナブロストレイデ 25

Claims

【特許請求の範囲】１．外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）酵素またはＡＧＰ酵素の酵素活性を保持するそのサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含有する形質転換デンプン生産生物であって、ここで、該ヌクレオチド配列が該生物内で発現され得；該酵素またはそのサブユニットの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルの無機リン酸からも実質的に独立する点で特徴づけられ；そして該酵素またはそのサブユニットの活性がフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されない点でさらに特徴づけられる、形質転換デンプン生産生物。２．前記ＡＧＰ酵素がヘテロ多量体、好ましくはヘテロ四量体、さらに好ましくは２つの大サブユニットおよび２つの小サブユニットを含有するヘテロ多量体である、請求項１に記載の生物。３．前記ＡＧＰ酵素がHordeumから単離され、好ましくは該酵素がオオムギ（Hor deum vulgare ）内胚乳ＡＧＰまたはそのサブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型である、請求項２に記載の生物。４．前記ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である、請求項３に記載の生物。５．前記ＤＮＡ配列が、前記オオムギ内胚乳ＡＧＰの前記大サブユニット、もしくは該オオムギ内胚乳ＡＧＰの該大サブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点て非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型をコードする、請求項４に記載の生物。６．前記ＤＮＡ配列が本明細書中で配列番号１として同定された配列であり、その配列の非臨界的な対立遺伝子変異を包含する、請求項４または５に記載の生物。７．前記ＤＮＡ配列が前記オオムギ内胚乳ＡＧＰの前記小サブユニット、もしくは該オオムギ内胚乳ＡＧＰの該小サブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型をコードする、請求項４に記載の生物。８．前記ＤＮＡ配列が本明細書中で配列番号２として同定された配列であり、その配列の非臨界的な対立遺伝子変異を包含する、請求項４または７に記載の生物。９．請求項５または６に記載のＤＮＡ配列および請求項７または８に記載のＤＮＡ配列を含み、好ましくは各ＤＮＡ配列が異なったマーカーを付加的にコードする、請求項４に記載の生物。１０．前記発現されたＡＧＰ酵素またはそのサブユニットが、配列番号３に記載のアミノ酸配列、もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を含む、上記いずれかの請求項に記載の生物。１１．前記発現されたＡＧＰ酵素またはそのサブユニットが、配列番号４に記載のアミノ酸配列、もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を含む、請求項１から９のいずれかに記載の生物。１２．前記発現されたＡＧＰが、配列番号３に記載のアミノ酸配列もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を有する大サブユニット、および配列番号４に記載のアミノ酸配列またはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有する小サブユニットの両方を含む、請求項１に記載の生物。１３．前記ヌクレオチド配列が遷移ペプチドを付加的にコードする、上記いずれかの請求項に記載の生物。１４．前記遷移ペプチドがRubisco活性化酵素遷移ペプチドまたはデンプン分枝酵素遷移ペプチドである、請求項１３に記載の生物。１５．前記遷移ペプチドが、配列番号５として同定された配列を含むＤＮＡ配列によりコードされ、この配列の非臨界的な対立遺伝子変異を包含する、請求項１４に記載の生物。１６．前記遷移ペプチドが、配列番号６として同定された配列もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を含むアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の生物。１７．前記ヌクレオチド配列が該ヌクレオチド配列を発現するプロモーターに効果的に連結され、ここで、該プロモーターが細胞、組織、または器官特異性である、請求項４に記載の生物。１８．前記プロモーターが、配列番号７として同定された配列、もしくはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なヌクレオチド置換または欠失を有するその変異型を有する、請求項１７に記載の生物。１９．外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）酵素またはＡＧＰ酵素の酵素活性を保持するそのサブユニットを含む形質転換デンプン生産生物であって、ここで、該酵素またはそのサブユニットの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルの無機リン酸からも実質的に独立し、そして該酵素またはそのサブユニットの活性がフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されない、形質転換デンプン生産生物。２０．前記ＡＧＰ酵素またはそのサブユニットが、配列番号３に記載のアミノ酸配列、またはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸の置換または欠失を有するその変異型、および／もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列、またはこの配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を含む、請求項１９に記載の生物。２１．前記生物が形質転換植物である、上記いずれかの請求項に記載の生物。２２．前記形質転換植物がジャガイモ植物である、請求項２０に記載の生物。２３．請求項２２に記載の形質転換ジャガイモ植物から得られるとき、増強されたデンプン含有量を含有するジャガイモ塊茎。２４．生物、特に植物または植物細胞においてデンプン生産の速度および／または収量を増加させる方法であって、上記いずれかの請求項で定義されるような形質転換生物を形成するために請求項１またはそれに従属する請求項で定義されるようなヌクレオチド配列を該生物に導入する工程、および該ヌクレオチド配列を発現する工程を包含する方法。２５．生物、特に植物または植物細胞においてデンプン生産の速度および／または収量を増加させる方法であって、請求項１９またはそれに従属するいずれかの請求項で定義されるようなＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）酵素またはそのサブユニットを生物に導入する工程または生物で形成させる工程を包含する、方法。２６．配列番号２として本明細書中で同定されたｃＤＮＡ配列であって、この配列の非臨界的な対立遺伝子変異を包含するｃＤＮＡ配列。２７．配列番号４に示されるようなアミノ酸配列であって、この配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸の置換または欠失を有するその変異型を包含する、アミノ酸配列。２８．配列番号５として本明細書中で同定されたｃＤＮＡ配列であって、この配列の非臨界的な対立遺伝子変異を包含する、ｃＤＮＡ配列。２９．配列番号６に示されるようなアミノ酸配列であって、この配列中に１またはそれ以上の位置で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型を包含する、アミノ酸配列。３０．ＡＧＰ酵素またはそのサブユニットであって、該酵素またはそのサブユニットのインビボでの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルの無機リン酸からも実質的に独立し、そして該活性がフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されない、ＡＧＰ酵素またはそのサブユニット。３１．プラスミドpPPS1。３２．プラスミドpPPL1。３３．プラスミドpPPL1M。３４．プラスミドpPPS4。３５．プラスミドpPPL4。３６．プラスミドpPPL5。３７．プラスミドpBKL4。３８．プラスミドpVictorIV GN。３９．生物、特に植物または植物細胞においてデンプン生産の速度および／または収量を増加させる方法であって、該方法は、生物に、外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ酵素（ＡＧＰ）またはそのサブユニットをコードする外因性ＤＮＡ配列およびこの配列によりコードされた該生物によるＡＧＰの発現を可能にする１またはそれ以上のプロモーター配列を含有する組換えＤＮＡ構築物を導入し、それにより該生物のＡＧＰ含有量を増加させ、その結果該生物によるデンプン生産速度の増加および／またはデンプン収量の増加させる工程を包含し、該ＤＮＡ配列が、オオムギ（Hordeum vulgar e ）内胚乳ＡＧＰまたはそのサブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型をコードする遺伝子配列であることで特徴づけられ、ここで、該構築物が該生物で発現され得；該酵素またはそのサブユニットの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルの無機リン酸からも実質的に独立することで特徴づけられ；そして該酵素またはそのサブユニットの活性がフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されないことでさらに特徴づけられる、方法。４０．生物、特に植物または植物細胞の形質転換のためのベクターであって、このような生物のＡＧＰ含有量を増加させ、その結果このような生物によるデンプン生産の速度を増加させ、このようなベクターは、外因性ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ酵素（ＡＧＰ）をコードするＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ構築物を含み、このようなベクターはまた、該ベクターにより形質転換された生物においてこの外因性ＡＧＰの発現を可能にするのに必要なプロモーターおよびその他の配列を組み込み、該ＤＮＡ配列が、オオムギ（Hordeum vulgare）内胚乳ＡＧＰまたはそのサブユニット、もしくはオオムギ内胚乳ＡＧＰまたはそのいずれかのサブユニットを定義するアミノ酸配列中に１またはそれ以上の点で非臨界的なアミノ酸置換または欠失を有するその変異型をコードする遺伝子配列であることで特徴づられ、ここで、該構築物が該生物で発現され得；該酵素またはそのサブユニットの活性がいかなるレベルのインビボ３−ホスホグリセリン酸および／またはいかなるインビボレベルの無機リン酸からも実質的に独立することで特徴づけられ；そして該酵素またはそのサブユニットの活性がフルクトース−１，６−ビスＰにより刺激されないおよび／またはＡＭＰにより阻害されないことでさらに特徴づけられる、ベクター。４１．外因性タンパク質を植物および植物細胞のアミロプラストに標的する方法であって、該方法が、該植物または植物細胞に、デンプン分枝酵素遷移ペプチドをコードするＤＮＡ配列および外因性タンパク質をコードする外因性ＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ構築物を導入すること包含し；ここで、該構築物が該植物および植物細胞で発現され得る、方法。４２．前記デンプン分枝酵素をコードする前記ＤＮＡ配列が配列番号５として同定される配列を含むことで特徴づけられる、請求項４１に記載の方法。４３．前記植物および植物細胞で前記構築物により発現される前記デンプン分枝酵素が配列番号６として同定されるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。４４．請求項１またはそれに従属するいずれかの請求項に記載の生物からつくられるまたは生物を含む食料品。４５．前記食料品が油で揚げた食料品である、請求項４４に記載の食料品。４６．前記食料品がジャガイモである、請求項４４または４５に記載の食料品。