JPH08509129A

JPH08509129A - 化学的プロセスと酵素的プロセスのための逆連鎖オリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH08509129A
Application number: JP6523534A
Authority: JP
Inventors: ジェイコーシン、ピーター; ディーコンラッド、ケネス; ビーランパル、ジャン; エムクック、ロナルド
Original assignee: ベックマンインスツルメンツインコーポレーテッド
Priority date: 1993-04-19
Filing date: 1994-04-19
Publication date: 1996-10-01
Also published as: WO1994024312A3; WO1994024312A2; CA2160799A1; AU6707794A; EP0700449A1; US5462854A

Abstract

(57)【要約】ここには、特に、酵素プロセスで有用な逆連鎖オリゴヌクレオチド（『ＩＬＯ』）が開示されている。特に好ましいＩＬＯは、どちらか一方または最も好ましくは両方の末端からの酵素延長を受け入れる。特に好ましい実施態様では、ＩＬＯのそれぞれの末端は、酵素的に機能的な３’基を有している。したがって、適当な条件下で例えばｄＮＴＰ、酵素、サンプルＤＮＡおよび前記サンプルＤＮＡの第１の領域に相補的な第１の領域と前記ＤＮＡの第２の異なる領域に相補的な第２の領域とを含むＩＬＯの存在下で、前記サンプルＤＮＡの指数増幅が実施される。

Description

【発明の詳細な説明】化学的プロセスと酵素的プロセスのための逆連鎖オリゴヌクレオチド発明の分野本発明は、非天然のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよび／または非天然のオリゴリボヌクレオチドの合成とそれらの利用、たとえばそのような非天然のオリゴデオキシリボヌクレオチドの指数増幅（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）による特定のデオキシリボ核酸（『ＤＮＡ』）およびリボ核酸（『ＲＮＡ』）配列の存在の測定での利用に関する。発明の背景この文書を通じて述べる参考文献は、この文書の提出日以前であるが、ここに記載した情報のためにのみ挙げたものであり、参考文献が、先行するものであるということ、または本発明者が、先行する発明または先に提出された出願に基づく優先権によりそのような記載に対して日時が前のものとして権利が与えられないということを明示的にもあるいは暗示的にも認めると解釈すべきものではない。Ｉ．序論デオキシリボ核酸（『ＤＮＡ』）またはリボ核酸（『ＲＮＡ』）巨大分子あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ巨大分子内の関心のもたれる領域の分析は、さまざまな分野で用途がある。これらには、たとえば、犯罪捜査（この場合、犯罪現場のサンプルからのＤＮＡを、告訴された個人からのＤＮＡと比較する）、考古学（この場合、昔の植物、動物、類人種および人のＤＮＡが分析される）、父方の血筋の分析（この場合、子からのＤＮＡと予想される親のＤＮＡが比較分析される）、遺伝子分析（この場合、特定の病気の状態を示す遺伝子変異の可能性の徴候について個人のＤＮＡを分析する）、環境の分析（この場合、特定のバクテリア成分のＤＮＡの存在と量とに基づいて水のバクテリア汚染の測定ができる）および科学的研究がある。これらの例示的分野では、そのような分析は、十分な量のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの入手なくしてはほとんど不可能であり、もう一度述べると、ＤＮＡまたはＲＮＡサンプルを適切にかつ能率的に分析するのには、調査者が十分な量の物質を入手できなくてはならないことがほとんど絶対的な要件である。残念なことには、本来の形態すなわち天然の形態で得られるＤＮＡおよび／またはＲＮＡの量は、その十分な分析を可能とするのには余りにも少な過ぎるのがほとんど一般的である。特にこの理由から、そのような分析を行うためには、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡの給源から得られるＤＮＡまたはＤＮＡの量を十分に増すことがしばしば非常に重要である。通常、そのようなＤＮＡまたはＲＮＡの量を十分に増すことは、『増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）』または『増幅する（ａｍｐｌｉｆｙ）』と呼ばれる。核酸配列を増幅する能力は、比較的最近（１９８５）のものであるが、この能力の衝撃は、驚異的なものである。関心のもたれる核酸配列を増幅する能力なくしては、前記の無制限的な例示分野の全部とは言わないまでもほとんどが実施され得ない。核酸増幅が拡大した領域として、さまざまな増幅技術にかかる必要条件が変化した。したがって、核酸配列の分析の技術についての非常に実際的でかつ進行中の必要性が存在している。ＩＩ．核酸巨大分子：構造、機能、突然変異（ａ）核酸分子の成分デオキシリボ核酸およびリボ核酸は、長い糸状の巨大分子であり、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドの鎖を含んでなり、ＲＮＡは、リボヌクレオチドの鎖を含んでなる。『ヌクレオチド』は、ヌクレオシドと１つまたはそれ以上のホスフェート基からなり、『ヌクレオシド』は、ペントース糖に結合した含窒素塩基からなる。典型的には、ホスフェート基は、ペントース糖の第５炭素（『５’』ヒドロキシル基（『ＯＨ』）に結合しているが、第３炭素ヒドロキシ基（『３’ −ＯＨ』）に結合していてもよい。ＤＮＡの分子内では、ペントース糖が、『デオキシリボース』であり、一方、ＲＮＡの分子内では、ペントース糖が、『リボース』である。ＤＮＡの含窒素塩基は、アデニン（『Ａ』）、シトシン（『Ｃ』）、グアニン（『Ｇ』）およびチミン（『Ｔ』）である。これらの塩基は、ウラシル（『Ｕ』）がチミンに取って代わることを別として、ＲＮＡについて同じである。したがって、『デオキシヌクレオシド』とまとめて呼ばれるＤＮＡの主なヌクレオシドは、次のようである：デオキシアデノシン（『ｄＡ』）；デオキシシチジン（『ｄＣ』）、デオキシグアノシン（ｄＧ』）およびチミジン（『Ｔ』）。対応するリボヌクレオシドは、『Ａ』；『Ｃ』；『Ｇ』および『Ｕ』と名づけられる。（慣用的に、デオキシチミジンは、典型的に『Ｔ』と名づけられるが、一貫性を保たせる目的で、チミジンは、本開示を通して『ｄＴ』と名づけられる。）含窒素塩基の特定の配列が遺伝情報、すなわち生命の『青写真』をコード化する。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の主な繰り返し構造が、次のヌクレオシドとして描かれ得る（数字は、５つの炭素原子の位置を示す）：ＤＮＡＲＮＡＢ＝アデニン、チミンＢ₁＝アデニン、ウラシルグアニン、シトシングアニン、シトシン（ｂ）構造形成ＤＮＡおよびＲＮＡ巨大分子の含窒素塩基の配列には、遺伝子情報を含んでいるのに対して、糖およびホスフェート基は、構造的な役割を行い、巨大分子の背骨をなす。性質上ほとんど排他的に、生物学的に誘導されたＤＮＡは、第２の隣接するヌクレオチドの３’位置への第１のヌクレレオオチドの５’位置の連鎖を介して合成され、２つの糖の間の連鎖は、ホスホジエステル結合を介している。すなわち、生物学的ＤＮＡは、５’−３’の方向で合成される。固体相の、合成的に作られたＤＮＡについては、出発ヌクレオシドは、その３’ヒドロキシ基により固体支持体に典型的に結合され、５’ヒドロキシ基が典型的にはジメトキシトリチル（『ＤＭＴ』）により保護され、保護基が（典型的には、温和な酸により）除去された後、次のヌクレオチドが、その３’−ＯＨ基を介して支持体に結合するヌクレオチドに加えられる。二本鎖のＤＮＡは、（比較的）弱い水素結合により一緒に保たれたヌクレオチド鎖の２つの『相補的』鎖からなり、これらの水素結合は、たとえば、ＤＮＡの加熱、ＤＮＡを包囲している流体の塩濃度の変化、酵素的操作および化学的操作により切ることができ、このプロセスは、『変性』と呼ばれる。温度を降下させることにより、塩濃度を再調整することにより、または酵素あるいは化学物質を除去／中和することにより、ＤＮＡの２つの鎖は、このほぼ／同一の初期の状態で改質（『アニール』）する傾向を有する。各ＤＮＡ分子の塩基は、互いに選択的に結合する：Ａは常にＴと結合し、Ｃは常にＧと結合する。したがって、第１の鎖の配列５’−ＡＴＣＧ−３’は、相補的配列３’−ＴＡＧＣ−５’（あるいは、慣用的に、５’−３’−の方向で、５’−ＣＧＡＴ−３’）に直接対向するように存在する。これは、『相補的塩基の対合』と呼ばれ、相補的塩基の対合のプロセスは、『ハイブリッド形成』と呼ばれる。ＤＮＡ巨大分子の形成で重要であり得る少なくとも３つの酵素がある：ポリメラーゼ（これは巨大分子の『延長』を仲介し得る）；およびリガーゼとキナーゼ（これらは、巨大分子の『補修』を仲介し得る）。デオキシヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の形成は、酵素『ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ』によりもたらされる。ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡの巨大分子を合成（すなわち、ＤＮＡ巨大分子の『延長』）するのには、次の成分が必要である：（１）『鋳型』と呼ばれる一本鎖ＤＮＡ分子；（２）遊離３’−ヒドロキシル基を有するＤＮＡの（典型的な）短い一本鎖（これは、鋳型の特定の部位にハイブリッド化している）でこの鎖は、『プライマー』と呼ばれる；（３）遊離のデオキシリボヌクレオチド三燐酸塩（『ｄＮＴＰ』）、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰである。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを単一の方向ですなわちプライマーの３’端から延長できるだけである。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーの３’−ヒドロキシル基と、鋳型の次の塩基と相補的である『入来（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）』ｄＮＴＰとの間のホスホジエステル結合の形成をもたらし得るような必要な相補的塩基の対合があり得る領域で鋳型にハイブリッド化する。よって、鋳型の配列が、５’−ＡＴＣＧ−３’であり、プライマーが３’−ＧＣ−５’であるなら、プライマーの３’−末端に加わるべき次のヌクレオチドは、プライマーのＧヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基とｄＡＴＰとの間のＤＮＡポリメラーゼにより仲介されるホスホジエステル結合の形成を介する塩基Ａ（鋳型上のＴに相補的）である。このプロセスは、鋳型の一領域の完全な補体または全体が発生されるまで（典型的に）継続する。ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、プライマー鎖を延長するように原理的には機能し、酵素のキナーゼおよびリガーゼは、ユニタリー一本鎖にハイブリッド化した２つの隣接ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の形成により一本鎖の切断を原理的に補修するように機能する。よって、ユニタリー一本鎖の配列が、５’− ＡＴＧＣ−３’であり、切断が、Ｃとそれにハイブリッド化した相補的鎖のＡとの間（５’−ＴＡｘＣＧ−５’、ここで『ｘ』は切断を示す）に起こっているなら、キナーゼ酵素は、Ａの５’−端の燐酸基の付加により補助し、リガーゼ酵素は、ＡとＣとの間のホスホジエステル結合の形成により切断を『補修』し得る。有利には、（典型的には）リガーゼは、特に、鎖上のヌクレオチドの１つがユニタリー鎖上のヌクレオチドに相補的でないならそのようなホスホジエステル結合の形成を仲介し得なく、すなわち、ユニタリー鎖の配列が５’−ＡＴＣＧ−３’であり、２つの他の鎖が配列３’−ＴＡ−５’と３’ −ＴＣ−５’（ＴＣ鎖のＴは、ＡＴＣＧ鎖上のＣに相補的でない）を有するなら、リガーゼは、ＴＡとＴＣとの間のホスホジエステル結合の形成を仲介しないであろう。（ｃ）機能的な役割注目されるようにＤＮＡは、生命についての『青写真』と呼ばれる。ＤＮＡの役割は、生きている生命体の発達、維持および存在に必要なタンパク質の構築ブロックであるアミノ酸を特にコード化することである。３種のＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ；トランスファーＲＮＡ、ｔＲＮＡ；リボソームＲＮＡ、ｒＲＮＡ）は、指定されたアミノ酸にＤＮＡ中でコード化された遺伝子情報の『翻訳』と関連づけられている。２０の天然にコード化されたアミノ酸のそれぞれは、３つのヌクレオチドのさまざまなグループ分けによりコード化され、このグループ分けは、『コドン』と呼ばれる。したがって、遺伝子情報は、通常次のように伝達される：ＤＮＡ→ＲＮＡ→アミノ酸／タンパク質。ＤＮＡ分子のすべての領域がＲＮＡによりタンパク質に翻訳されるわけではない；翻訳されるこれらの領域は、『遺伝子』と呼ばれる。したがって、遺伝子の発現は、単数の遺伝子または複数の遺伝子から生じる終局的タンパク質を特定することにより遺伝的な特徴の翻訳を制御するように働く。（ｄ）遺伝子コードの突然変異ＤＮＡ巨大分子は、互いに化学的に極めて類似している。ＡとＧとは、化学的組成が極めて似ていてＣ、ＴおよびＵは、同様に似ている。よって、特定の配列では、Ｇに取って代わるＡまたはＴに取って代わるＣの置換（例えば、トランジション）が起こり得る；同様にＣまたたＴに取って代わるＡまたはＧ（または逆）のトランスバージョンが起こり得る。そのような置換が、それによりコード化されたアミノ酸が同じままでいるようにコドン内で起こると、置換は、『サイレント』置換と呼ぶことができる、すなわち、ヌクレオチドは、異なるがコード化されたアミノ酸は同じである。しかしながら、ほかの置換は、コドンによりコード化されたアミノ酸を改変し得る；ヌクレオチド改変が、化学的に同様なアミノ酸をもたらす時、これは、『保存（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）』改変と呼ばれ、一方、改変によりもたらされる化学的に異なるアミノ酸は、『非保存』改変と呼ばれる。アミノ酸の非保存改変は、初めのタンパク質分子とまったく異なる分子をもたらし得る。そのアミノ酸を改変させたタンパク質は、『突然変異体』、『突然変異』または『変異型』と呼ばれ得る。突然変異は自然に起こり得、そのような突然変異を受けた生命体に肯定的、否定的あるいは中性的な結果をもたらし得る。同様に、改変された（たとえば、ＤＮＡ配列の挿入または削除による）部分を有する遺伝子は突然変異である；したがって、当然、そのような突然変異した遺伝子により発現されるタンパク質は、生命体に肯定的、否定的あるいは中性的な結果をもたらし得る。ＩＩＩ．天然のオリゴヌクレオチドの合成的製造ＤＮＡおよびＲＮＡの合成鎖は、『合成オリゴヌクレオチド』または『オリゴヌクレオチド』と典型的に呼ばれる。これらの物質は、合成的に製造されるが、意図的に改変しないなら、これらは、生きている動物により作られるＤＮＡおよびＲＮＡと区別できない。よって、よりはっきりした用語は、『天然のオリゴヌクレオチド』である。オリゴヌクレオチドの合成に対して広く用いられている化学的手順は、『ホスホルアミダイト法』と呼ばれる。例えば、ここに参考としてあげる、米国特許第４，４１５，７３２号；ＭｃＢｒｉｄｅＬおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓのＭ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒａｎＬｅｔｔｅｒｓ２４：２４５−２４８（１９８３）；およびＳｉｎｈａ，Ｎ．らのＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：４５３９−４５５７（１９８４）を参照されたい。ホスホルアミダイト法に基づいた商業的に人手できる天然のオリゴヌクレオチドの合成装置には、たとえば、ｔｈｅＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＯＬＩＧＯ１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ８７５０^TM；およびｔｈｅＡＢＩ３８０^TM、３９２^TMおよび３９４^TMＤＮＡ合成装置がある。化学的に合成された天然のオリゴヌクレオチドの重要性は、天然のオリゴヌクレオチドが向けられ得る広範囲な種類の用途に主に依存する。たとえば、天然のオリゴヌクレオチドの有意的な用途は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応などのＤＮＡおよびＲＮＡ増幅技術についてのプライマーの使用および生じる増幅生成物の検出のためのプローブとしてである。ＩＶ．増幅技術核酸の増幅のための現在いくつかの入手できる技術がある。周知の増幅技術は、『ポリメラーゼ連鎖反応』または『ＰＣＲ』と呼ばれる。Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．らの『生体外のＤＮＡの特異的酵素増幅：ポリメラーゼ連鎖反応（ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡＩｎＶｉｔｒｏ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）』ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉａｏｎＱｕａｎｔ．Ｂｉｏ．５１：２６３−２７３（１９８６）。ＰＣＲプロトコールでは、鋳型二本鎖ＤＮＡが変性され、一本鎖ＡおよびＢ、『ＳＳ−Ａ』および『ＳＳ −Ｂ』となる。２つのプライマー、ＳＳ−Ａの一部に相補的な配列を有するものとＳＳ−Ｂと相補的な配列を有するものが、それぞれの相補的鎖に選択的にハイブリッド化する。ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰの存在下で、それぞれのプライマーは、延長されて、初めのＳＳ−ＡとＳＳ−Ｂへの補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を形成する。よって、１つのそのような『サイクル』の終わりで、それぞれの鎖の『コピー』の数が、次のサイクルの間に２つだけ増加し、したがって、２つのＳＳ−Ａと２つのＳＳ−Ｂが存在し、それぞれが上記のように『コピー』され得る。このプロセスは、『指数』増幅と呼ばれ、これは、本質的に、各サイクルでコピーの数が二倍となることを意味する。すなわち、約２０サイクルの後理論的には、百万を越えるコピーが生じる（２²⁰ ）。ＰＣＲにはいくつかの実際的問題が存在する。２つの鋳型に沿う第１の外来配列は、プライマーとハイブリッド化し得る；これはそのような非特異的ハイブリッド形成により共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をもたらす。増幅のレベルが増加すると、そのような共増幅の厳格さも増す。第２に、それぞれの初めの鋳型について何百万というコピーを容易につくるＰＣＲの能力のため、ほかのサンプルへの先立つ反応の最終生成物の偶発的な導入が、誤った肯定的結果につながる。第３に、ＰＣＲは、基本的にそれ自体、一本鎖塩基変化の検出を許容しない、すなわち、プロトコールは、基本的にそれ自体、正常な配列と突然変異配列との間の区別を許容しない。ＰＣＲに変わるものとしていわゆる『リガーゼ連鎖反応』すなわち『ＬＣＲ』がある。Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．『熱安定性リガーゼを用いる遺伝子病の検出とＤＮＡ増幅（ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＩｉｇａｓｅ）』、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９−１９３（１９９１）。この技術は、２つが初めの二本鎖鋳型のそれぞれの一本鎖に対応するようにした４つのプライマーの使用に基づいて特定の標的を指数的に増幅する。それぞれのプライマー対が、隣接するようにして鋳型のそれぞれ一本鎖にハイブリッド化し、リガーゼが、隣接ハイブリッド形成の領域でそれぞれのプライマーに共有結合する。ＰＣＲのように、得られる生成物は、次のサイクルで（初めの鋳型と共に）鋳型として働き、よって、各サイクルで指数増幅がもたらされる。有益には、ＬＣＲは、突然変異、特に単一ヌクレオチド突然変異を検出するために使用され得る−−各プライマーが既知の突然変異が起こり得る位置に隣接するようにプライマーが例えば遺伝子の突然変異してない形式（ｎｏｎ−ｍｕｔａｔｅｄｖｅｒｓｉｏｎ）の補体とされるとし、鋳型がそのような突然変異を含むと、リガーゼは、そこにハイブリッド化させた２つのプライマーを共有結合させ得ない。ＬＣＲに関連する問題は、当然、手順が、標的の存在の必要なくしてプライマーの非特定的『平滑末端ライゲンーション』をもたらし得る４つのプライマーを必要とすることである。すなわち、プライマーの過剰なモル濃度の使用（ほとんど典型的である）により標的配列よりもそれらのそれぞれのプライマー補体に対しプライマーの優先するハイブリッド形成がある。これらの二本鎖平滑末端フラグメントは、標的ＤＮＡ配列の不在下でもつながれ得る。このことは、高いバックグランド信号あるいは誤った肯定的結果につながり得る。ＬＣＲに関連していわゆる『オリゴヌクレオチドライゲーション検定』すなわち『ＯＬＡ』がある。Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．らのＳｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）。ＯＬＡプロトコールは、隣接するようにして標的の一本鎖にハイブリッド化し得る２つのプライマーの使用に依存する。ＬＣＲのようにＯＬＡは、点突然変異の検出に特に適している。しかしながら、ＬＣＲとは異なりＯＬＡは、指数増幅をもたらすのではなく『直線的（ｌｉｎｅａｒ）』増幅をもたらす、すなわち、各サイクルの終わりで、単一の最終生成物（共有結合したプライマー）だけが生じる。よって、ＯＬＡと関連する問題は、指数増幅の欠如である。ＰＣＲとＯＬＡとを組み合わせることが、検出方法として報告されている。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．らの『ＥＬＩＳＡに基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定を用いる自動化ＤＮＡ診断法（ＡｕｔｏｍａｔｅｄＤＮＡｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓｕｓｉｎｇａｎＥＬＩＳＡ−ｂａｓｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙ）』、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８９２３−８９２７（１９９０）。報告されているように、標的ＤＮＡは、ＯＬＡを用いる増幅された標的の検出を後続させるＰＣＲを使用して指数的に増幅された。そのような組み合わせにまつわる問題は、ＰＣＲに関連する問題を受け継いでいる上に、当然、複合段階、別々の段階および処理段階が必要とされることである。ＲＮＡに基づく増幅技術が述べられてきた。Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．らの『レトロウイルス複製をモデルとした多酵素反応による核酸の等温下の生体外の増幅（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，ｉｎｖｉｔｒｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｂｙａｍｕｌｔｉ−ｅｎｚｙｍｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｄｅｌｄｅｄａｆｔｅｒｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）』、ＰＮＡＳ８７：１８７４（１９９０）。『３ＳＲ^TM 増幅』と呼ばれるこのプロトコールは、反応の基質がＲＮＡであるので遺伝子発現を検出するために使用され得る。有益には、ＰＣＲと異なり３ＳＲは、熱サイクルを必要としない；ＰＣＲの場合のように、３ＳＲ反応は、増幅されるべき領域に『隣接する（ｆｌａｎｋ）』２つのプライマーを利用する。これらのプライマーの１つは、Ｔ７ポリメラーゼの共通プロモーター配列を含まねばならない。３つの異なる酵素が、３ＳＲ反応に必要とされる；Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ；ＡＭＶ逆転写酵素；およびＲＮアーゼＨ。等温下の増幅の利益は、３ＳＲで可能であり、多重プライマー（ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｉｍｅｒｓ）および酵素についての必要条件は、問題のある適用に対して可能性を増す。上記のことは、網羅的というよりも代表的であると解釈されるべきである。しかしながら上記のことから認識される得るように、増幅プロトコールと関連する利益もその利用での欠点に寄与する。１つの点が強調され得る：いくらかの制限にもかかわらず、特に診断学の分野では、ＰＲＣ増幅プロトコールは、主に、プロトコールと関連した力の組み合わせのためとプロセスの簡単さのため広範囲の利用を享受してきた。理想的には、ＰＣＲのように敏感でたとえばＬＣＲのように特定的であるが、行うのが容易な増幅プロトコールが、本分野の状態を高め、有意的に向上させるものである。発明の要約本発明は、これらの必要に向けられている。本発明に従えば、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの混合物に含まれる少なくとも１種の特定の核酸を増幅する方法がここに開示されている。ポリヌクレオチドは、例えばＲＮＡまたはＤＮＡの一本鎖の場合のように一本鎖標的またはＤＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの場合のように二本鎖標的であってよい。そのような増幅スキームは、逆連鎖オリゴヌクレオチドすなわち『ＩＬＯ』とここで呼ぶ合成の非天然のオリゴヌクレオチドの利用に基づいている。標的増幅技術で用いるここで開示したＩＬＯは、５’末端と３’末端に対立する少なくとも２つの３’末端または少なくとも２つの５’末端を有する核酸分子である。以下に詳述するように、ＤＮＡの相補的鎖の異なる切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）に相補的な核酸配列を含んでなるＩＬＯは、ＩＬＯ延長がどちらかの（または両方の）末端から進行し得るように利用できる。本発明のこれらの詳細また他の詳細は、本発明の開示がさらに続くことからさらに明瞭となろう。図面の簡単な説明以下の図面は説明上のものであり限定を目的としたものではない。図１は、３’−ＩＬＯ分子を用いた二本鎖標的の酵素増幅の図式的表示であり、図２は、二本鎖標的に沿う突然変異の検出のための３’−ＩＬＯ分子および５ ’−ＩＬＯ分子の酵素延長の図式的表示であり、図２Ａは、３’−ＩＬＯおよび５’−ＩＬＯがそれぞれ干渉部分を含む図２のプロトコールの別の実施態様であり、図３は、３’−ＩＬＯ分子と５’−ＩＬＯ分子を用いるギャップ領域を含む二本鎖標的配列の酵素延長と増幅の図式表示であり、図４は、不溶化した３’−ＩＬＯを用いる二本鎖標的配列の固体相『延長』の図式的表示であり、図５は、発現ベクターに挿入され得る二本鎖の『天然の』ＤＮＡをつくるように制限酵素により切断を受けることのできる２つの部位を含む環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンの作成の図式表示であり、図６は、環状形状へのＩＬＯアンプリコンの変換と反応混合物の精製の図式表示であり、図７は、逆ホスホルアミダイトについての好ましい合成ルートの図式表示であり、図８は、標識配列の３’−ＩＬＯ酵素増幅および同じ標識配列のＰＣＲ増幅のスラブゲル分析の結果の写真再現であり、図９は、特に、さまざまな長さの標的のＩＬＯ増幅の結果の写真再現であり、図１０は、特に、さまざまな長さの標的のＩＬＯ増幅の結果の写真再現であり、図１１は、制限酵素による環状二本鎖ＩＬＯアンプリコン、二本鎖ＰＣＲアンプリコンおよび二本鎖ＩＬＯアンプリコンの切断の図式表示であり、図１２ａおよび１２ｂは、特に、制限酵素により環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンを切断する効果の結果の写真再現であり、図１３は、特に、ＩＬＯアンプリコンをヤエナリエクソヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇｂｅａｎｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）にかけた写真再現であり、図１４は、特に、『自己プライミング（ｓｅｌｆｐｒｉｍｉｎｇ）』条件に置いたＩＬＯアンプリコンの結果の写真再現であり、図１５は、５’−エクソヌクレアーゼにかけたＰＣＲアンプリコン、ＩＬＯアンプリコンおよび環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンの結果の写真再現であり、そして図１６は、特に、ヒトゲノムＤＮＡと混合した同じ標的配列の減少濃度のＩＬＯ増幅の結果の写真再現である。好ましい実施態様の詳細な説明本開示の次の部分は、開示した発明の特に好ましい実施態様に関する。定義した説明を与えたある種の用語が用いられ、以下の定義を当てはめるが、これらの用語は、当業者により用いられであろう定義と異なり得る定義を有する。ＩＬＯとの関連で用いれれる時の『化学的プロセス』は、少なくとも１つの化学的部分がＩＬＯに加えられるプロセスを意味し、典型的には該部分はヌクレオチドである。反応は、共有結合的（ｃｏｖａｌｅｎｔ）であってもあるいは非共有結合的であってもよい。『環状二本鎖ＩＬＯアンプリコン』は、ＩＬＯアンプリコンが自己ハイブリッド形成をし得る十分な長さの配列であるか、ＩＬＯアンプリコンが自己ハイブリッド化し、自己ハイブリッド形成の地域からＩＬＯアンプリコンの延長領域に沿った延長が後続して初めのＩＬＯアンプリコンの相補的配列をつくる逆連鎖オリゴヌクレオチド酵素増幅プロセスの生成物を意味する。環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンは、実際には、ある種の二本鎖特性を持った一本鎖部分である。『伸長』は、標的ポリヌクレオチドにハイブリッド化した逆連鎖オリゴヌクレオチドの延長を意味する。常にではないが、典型的には、伸長は、たとえば、酵素プロセスまたは化学プロセスにより、または末端トランスファーゼあるいはキナーゼにより仲介されるようにデオキシヌクレオチド三燐酸塩またはリボヌクレオチド三燐酸塩の合体（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を介するＩＬＯの伸長を意味する。ＩＬＯと関連して用いた時の『酵素プロセス』は、ＩＬＯに加えられた少なくとも１つの部分を含む少なくとも１つの反応を少なくとも１つの酵素が触媒するプロセスを意味し、ここで部分は、典型的には、ヌクレオチドである。酵素プロセスは、限定するのもではないが、ポリメラーゼ酵素および／またはリガーゼ酵素、キナーゼ化（ｋｉｎａｓｉｎｇ）反応のような反応あるいは末端トランスファーゼ酵素または制限酵素を含む反応を用いる増幅技術を含む。『充填反応（ｆｉｌｌ−ｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）』は、第１の逆連鎖オリゴヌクレオチドのもう１つの逆連鎖オリゴヌクレオチドまでのギャップ領域を介する伸長を意味し、ここで両方の逆連鎖オリゴヌクレオチドは、標的配列の同じ鎖にハイブリッド化されている。『完全に延長されたＩＬＯアンプリコン』は、ＩＬＯの末端のすべてが延長されたＩＬＯアンプリコンを意味する。『完全に延長されたＩＬＯアンプリコン』は、初めのＩＬＯと同じ配列に加え、初めのＩＬＯのヌクレオチドの数より少なくとも５０％多いそれぞれの末端から延長するヌクレオチドを含む、すなわち、初めのＩＬＯが、逆連鎖のどちらかの側で１０の塩基からなるなら、完全に延長されたＩＬＯアンプリコンは、初めのＩＬＯの伸長により、逆連鎖のどちらかの側で少なくとも１５のヌクレオチドを有する。『ギャップ』は、標的配列の同じ鎖にハイブリッド化されている２つの逆連鎖オリゴヌクレオチド部分の間の領域を意味する。ギャップは、１−約１０，０００のヌクレオチドの長さであってよい。『ギャップ標的配列』は、部分的にまたは完全に未定義の核酸配列の領域を含む標的配列を意味し、好ましくは、標的のギャップ部分は、そのいずれかの側に定義された配列の領域があり逆連鎖オリゴヌクレオチド部分が、それにハイブリッド化し得て、部分的にまたは完全に未定義の核酸配列の領域に沿う逆連鎖オリゴヌクレオチドの間にギャップをつくる。『逆連鎖』は、換言すると５’Ａ３’−５’Ｇ３’−３’Ｔ−５’Ａ３’（下線をした領域は、３’−３’逆連鎖である）であるヌクレオチドの配列でのインターヌクレオチド連鎖の正常配向（ｎｏｒｍａｌｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で少なくとも１つの変化を意味する。『逆連鎖オリゴヌクレオチド』および『ＩＬＯ』は、分子の配向の３’−５’ 方向が、分子の長さに沿って少なくとも１回変化する非天然オリゴヌクレオチド分子を意味する。ＩＬＯは、少なくとも２つの端すなわち末端を含み、それぞれの末端は、酵素プロセスまたは化学プロセスを受け入れる同じ第１または第２ヒドロキシル基を有する。よって、『３’−ＩＬＯ』は、分子のそれぞれの末端が３’保護されたまたは未保護のヒドロキシル基であるＩＬＯであり、『５’−ＩＬＯ』は、分子のそれぞれの末端が、５’保護されたまたは未保護のヒドロキシル基であるＩＬＯである。最も好ましくは、ＩＬＯは、両方とも従来のアミダイトおよび逆アミダイトを用いてつくられＩＬＯの領域で少なくとも１つの５’− ５’および／または３’−３’逆連鎖がつくられる。逆連鎖のいずれかの側の塩基の数が等しいか異なっていることができる。逆連鎖は、一方のヌクレオチドから直接もう一方へとなっている必要はなく、一方のヌクレオチドをもう一方のヌクレオチドに結合する化学部分を含んでいてもよい。ＩＬＯは、標識を含み得る。『逆連鎖オリゴヌクレオチドアンプリコン』および『ＩＬＯ−アンプリコン』は、ＩＬＯの少なくとも１つの末端からのＩＬＯの延長生成物を指す。『逆連鎖オリゴヌクレオチド生成物』および『ＩＬＯ生成物』は、ＩＬＯを含む核酸増幅反応の最終結果を意味する。『標識（ｌａｂｅｌ）』は、ＩＬＯが検出または捕獲されるように逆連鎖オリゴヌクレオチド部分に接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）されている部分を意味する。最も好ましくは、標識は、ＩＬＯの内部５’−５’または３’−３’連鎖に位置している。『直接検出できる』標識は、直接または例えば基質（酵素の場合）のような物質とのその相互作用、光源と検出装置（蛍光化合物の場合）または光電子倍増管（放射性化合物または化学発光化合物の場合）を通じて検出できる信号発生標識である。『近接標識（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙＩａｂｅｌ）』は、近接標識が一緒にされた時互いに相互作用して検出可能な信号を生じる少なくとも２つの標識のうちの１つである。典型的には、第１の近接標識は、対応する第２の近接標識と組み合わせて用いられる。『間接的に検出可能な』標識は、もともとそれ自身で信号を与えないが間接的に検出可能な標識がつけられたＩＬＯを確認するように用いられ得る物質である。例えば、ビオチンは、間接的に検出可能な標識であり得て、これにより標識したまたは不溶化したアビジンがそれと関連して使用され、第１の例では、標識したアビジンは、複合体が直接検出され得るようにビオチンを含む部分に結合し得る；第２の例では、ビオチニル化した部分は、不溶化されたアビジンにより不溶化され、分離を可能とし、よってその検出を可能とする。最も好ましくは、標識は、ＩＬＯの連鎖領域に直接または間接的に接合される。『ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）』は、少なくとも１つのほかのＩＬＯ部分またはオリゴヌクレオチド部分への１つの逆連鎖オリゴヌクレオチド部分の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を意味する。ライゲーションには、リガーゼを用いるもののような酵素プロセスおよび限定するものではないが化学反応、光化学（光カップリング；参考のために挙げるたとえばＷＩＰＯ公開第ＷＯ９Ｏ／０１０６９号、公開日１９９０年２月８日）、熱化学およびレドックス反応を含む化学プロセスがある。『マルチマーＩＬＯアンプリコン（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃＩＬＯＡｍｐｌｉｃｏｎ）』および『ＭＩＡ』は、ＩＬＯおよび／または部分的に延長されたＩＬＯアンプリコンおよび／または完全に延長されたＩＬＯアンブリコンおよび／または環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンを含んでなる成分種の相補的領域の間のコンカテマーを意味する。生じるコンカテマーは、その成分種に変性され得る。『部分的に延長されたＩＬＯアンプリコン』は、ＩＬＯの末端の全部ではなく少なくとも１つが延長されているＩＬＯアンプリコンを意味する。『部分的に延長されたＩＬＯアンプリコン』は、初めのＩＬＯと同じ配列に加え、初めのＩＬＯのヌクレオチドの数よりも少なくとも５０％多い全部ではなく少なくとも１つの末端からそれぞれを延長したヌクレオチドを含んでなり、例えば、初めのＩＬＯが逆連鎖のどちらかの側の１０の塩基からなるなら、部分的に延長されたＩＬＯアンプリコンは、その１つの末端からの初めのＩＬＯの伸長のため、逆連鎖の一方の側の少なくとも１５のヌクレオチドおよび逆連鎖の他方の側の１０の塩基を有する。『逆アミダイト』および『逆ホスホルアミダイト』は、形成で用いられ得る核酸および逆連鎖オリゴヌクレオチドを意味する。最も好ましくは、逆アミダイトは、デオキシヌクレオシドの３’−ヒドロキシルでのジメチオキシトリチル（ｄｉｍｅｔｈｙｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）（『ＤＭＴ』）または同様な保護基およびデオキシヌクレオチドの５’−ヒドロキシルでの燐酸基を含んでなり、逆アミダイトの５’領域が、もう１つのヌクレオシド、ヌクレトチド、オリゴヌクレオチド、アミダイトまたは逆アミダイトの５’−ＯＨまたは３’−ＯＨへの連鎖を受けやすくなる。ＩＬＯアンプリコンおよび環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンと関連して用いた時の『実質的に』は、ＩＬＯを用いた標的配列の指数増幅から生じるＩＬＯ生成物の少なくとも５１％が環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンであることを意味する、より好ましくは、少なくとも約６０％、最も好ましくは、少なくとも約７５％である。『標的配列』は、定義された核酸配列を意味し、その存在または不在が、検出されることが望ましい。標的配列は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む給源からであり得、すなわち、標的配列の給源は、哺乳動物に限られない。好ましくは、標的配列は、遺伝病と関連する遺伝子のコード領域の一部を形成する。たとえば鎌型赤血球貧血症のような多くの遺伝子病について、遺伝子突然変異の存在は、遺伝子のコード配列の小さな変化により特徴づけられる；典型的には、問題の遺伝子病を持つ個人が、病気を持っていないものの対応する配列と１つのヌクレオチドだけの違いで異なる配列の遺伝子を有する。『正常』または『突然変異』遺伝子領域は、標的配列として働き得る。標的配列は、『ギャップ標的配列』を含み得る。『従来のアミダイト』および『従来のホスホルアミダイト』および『アミダイト』は、すべて、逆連鎖オリゴヌクレオチドの形成で用いられ得るヌクレオチドを意味する。最も好ましくは、従来のアミダイトは、デオキシヌクレオチドの５’−ヒドロキシルでのジメトキシトリチル（『ＤＭＴ』）または同様な保護基およびデオキシヌクレオチドの３’−ヒドロキシルでの燐酸基、ホスフィット基またはホスホネート基を含み、アミダイトの３’−領域がもう１つのヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アミダイトまたは逆アミダイトの５’−ＯＨまたは３’−ＯＨへの連鎖を受け得る。ポリメラーゼおよび／またはリガーゼ酵素を含む増幅技術のような最も好ましくは核酸のような化学プロセスおよび酵素プロセスに有用な３’および５’逆連鎖オリゴヌクレオチド（『ＩＬＯ』）がここに開示されている。そのような酵素プロセスと対向するＩＬＯの独特な特性のため、プロセスの効率は、有益に増強される。我々の最も好ましいＩＬＯに基づく酵素プロセスでは、我々は、単一組のＩＬＯ分子を用い各ＩＬＯを同一の配列を有してその組にあるようにして核酸巨大分子の指数増幅を達成し得る。我々は、ＩＬＯの特性のため、得られる増幅生成物（『ＩＬＯ生成物』）が特有の性質を有することを見いだした、すなわち、環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンと呼ばれる生成物に通じる自已プライミング能力；ＭＩＡ形成；および標的配列に沿う固体相延長を有することを見いだした。これらの特徴は以下に強調することにする。なんらの特定な理論に拘束されることを望むものではないが、我々の増幅プロセスは、ほかのすべての条件が同じものとしてＰＣＲ反応に比べてより最終生成物を生じると思われる；再度述べるなら、我々は、より少ないＩＬＯ（ＰＣＲプライマーに比較して）またはより得られにくい標的配列を用いて、同じ標的配列の実質的に同等な増幅を達成し得ると思われる。これは、標的の相補的切片が位置決めされるまでＩＬＯおよびＰＣＲプライマーが標的配列に沿って『ウォークする』あいだ、（単一の分子が、標的配列の２つの異なる領域に相補的な少なくとも２つの領域を含んでなるので）ＩＬＯが、２つのＰＣＲプライマーのそれぞれよりも標的にハイブリッド化する統計的により大きな機会を有するという仮定された理論に帰せられると我々は信じる。したがって、ＩＬＯプロセスは、ＰＣＲプロセスよりも強固で、効率的である。ＰＣＲプロセスの有意的な利益が、使用の固有の容易さにあるとして、固有により強固／効率的であり使用するのに容易なほかのプロセスは、当然、ほかの増幅技術に対して有意的に有利である。本開示の次の部分は、核酸巨大分子の酵素増幅と関連して用いられるＩＬＯの好ましい実施態様に関する情報を提供するが、ここに開示のＩＬＯの利用は、酵素増幅技術に限定されるものではないことが理解されるべきである；むしろ、当業者は、ＩＬＯが適用され得る化学的および酵素的な技術を容易に認識するであろう。いわゆる、アンチセンスオリゴヌクレオチドの業界は、これらの分子が遺伝子発現の調節のための可能性を有するので、特に、医薬に基づく工業に近時刺激をもたらした。３’−３’および５’−５’転化を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、遺伝子発現を抑制し調節できるとして説明されている。Ｒａｍａｌｈｕ− 鎖を有するオリゴデオキシヌクレオチドのアンチセンス効果（ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＥｆｆｅｃｔｏｆＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｗｉｔｈＩｎｖｅｒｔｅｄＩｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＬｉｎｋａｇｅ）』ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．＆Ｄｅｖ．２：２１９−１４６（１９９２）；また次を参照：Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．の『３’−３’インターヌクレオチド結合を有するオリゴデオキシヌクレオチドによるトリプル−ヘリックス形成と共同的結合（Ｔｒｉｐｌｅ−ＨｅｌｉｘＦｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＢｉｎｄｉｎｇｂｙＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｗｉｔｈａ３’−３’ＩｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＪｕｎｃｔｉｏｎ）』Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１６０３−１６０９（１９９２）およびＨｏｒｎｅ，Ｐ．Ｄ．＆Ｄｅｒｖｏｎ，Ｐ．Ｂ．の『交互鎖トリプル−ヘリックス形成による混合配列二重らせんＤＮＡの認識（ＲｅｃｏｇｎｉｔｉｉｏｎｏｆＭｉｘｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＤｕｐｌｅｘＤＮＡｂｙＡｌｔｅｒｎａｔｅ−ＳｔｒａｎｄＴｒｉｐｌｅ−ＨｅｌｉｘＦｏｒｍａｔｉｏｎ）』Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：２４３５−２４３７（１９９０）（以下、まとめて、『アンチセンス参考文献』と呼ぶ）。そのような分子の探究は、注目されるように、医薬に基づくアンチセンス操作の分野にこれまで向けられてきた；これは、これらの分子により起こされるヌクレオチド分解（ｎｕｃｌｅｏｔｙｌｉｃｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に対する増大した抵抗に明らか天然のオリゴヌクレオチドの合成で使用される従来のホスホルアミダイトは、５’ヒドロキシルでのＤＭＴ保護基を（ほとんど典型的に）含んでなり、入来ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基が５’−ヒドロキシル基に複合化し（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）得る（当然、ＤＭＴ基が除去された時である）。これは、天然のオリゴヌクレオチドの従来の５’−３’合成を考慮する。ポリメラーゼ酵素は、プライマーの３’末端からプライマーに沿って標的配列にハイブリッド化した核酸プライマーを延長する；よって、従来の天然のオリゴヌクレオチドプライマーでは、プライマーの伸長は、すなわち、３’末端から一方向でのみ起こる。この事実を考慮し、我々は、従来でない出発点からの核酸酵素に基づく増幅技術、すなわち３’−末端および／または５’−末端を含む天然でないオリゴヌクレオチドの利用をはっきり示すことを望むアプローチをとった；我々は、これらの分子を逆連鎖オリゴヌクレオチドまたは慣用的にＩＬＯと呼ぶ。ＩＬＯは、少なくとも２つの３’または少なくとも２つの５’末端を含んでなるので、それらは、単一の３’末端および単一の５’末端を含む天然のオリゴヌクレオチドとまったく異なる。したがって、ＩＬＯは、従来の天然のオリゴヌクレオチドが用いられるものとはまったく異なるプロセスでの操作を受け入れる。たとえば、それぞれ同じ配列を有するＩＬＯ分子は、関心のもたれる核酸配列の指数増幅で使用され得る。二本鎖標的配列の次の非限定的な図式表現が与えられるとする：すると、配列を有するＩＬＯ分子が、ポリメラーゼ酵素と十分なｄＮＴＰと関連して用いられ得て標的配列の指数増幅が達成される。（本開示の残りを通して、ＩＬＯに現れる時の記号『・』は逆連鎖を表す。）ＩＬＯの二重３’末端が本プロセスを実現可能とする。鎖Ａおよび上記の３’−ＩＬＯに焦点を当てると、次のハイブリッド化部分がつくられ、適当な条件下で、鎖Ａに沿うＩＬＯの酵素伸長が、実施可能とされ、次の部分的に延長されたＩＬＯアンプリコン（鎖Ａ’）がもたらされる：同様に、次の部分的に延長されたＩＬＯアンプリコン（鎖Ｂ’）が鎖Ｂから誘導される：認識されるように、鎖ＡおよびＢと共に反応生成物（鎖Ａ’およびＢ’）は、プロセスの後続する経路中の標的鋳型として働き得る：鎖ＡおよびＢも、この経路の間に得られるので、標的配列の指数増幅は、実行可能である。ＩＬＯアンプリコンは、『マルチマーＩＬＯアンプリコン』と呼ばれるコンカテマー種の形成にも貢献できる。これらの種は、塩基対合と関連する比較的に弱い水素（化学）結合により一緒に保持されていて、変性条件下で、ＭＩＡがその構成部分に分離されるようになる。標的配列に沿うＩＬＯの酵素伸長から生じるＩＬＯアンプリコンは、ＩＬＯ分子の利用に直接帰せられる独特の特徴を有する−−標的配列に沿うＩＬＯの延長を考慮する適当な条件下で、延長されたＩＬＯアンプリコンの１つの末端は、ＩＬＯアンプリコンの延長されてない末端と相補的である。したがって、ＩＬＯアンプリコンは、自己プライミングし得る、すなわち、ＩＬＯアンプリコンの末端がハイブリッド化すると、ＩＬＯアンプリコンに沿う『内部』延長が果たされる。この特徴は、我々が『環状二本鎖ＩＬＯアンプリコン』と呼ぶ標的配列増幅の間のＩＬＯ生成物の副集団（ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の形成を考慮する。我々は、この生成物が例えば標的配列の長さに依存して形成されることを確認した。例えば、鎖Ａ’に関心を寄せると、その末端は、相互に相補的であり、末端と末端との間に適当な距離を置き、自己ハイブリッド形成が起こり得る（表示の都合上、相補的部分だけを示す）が注目される：認識され得るように、この生成物は、示した方向で延長生成物のＡＴＣＧ部分の３’末端で自己プライミングを受けやすい（これも認識され得るように、５’− ５’逆連鎖のため、３’−末端からのＴＡＧＣの伸長は、可能でないであろう）。よって、『環状二本鎖ＩＬＯアンプリコン』がつくられ得る。ＩＬＯアンプリコンは、同じＩＬＯアンプリコンの両方の３’末端が、伸長反応に参加できるように鋳型として働き得る。たとえば、鎖Ａ’に再び関心を寄せると、鎖Ｂがそれにハイブリッド化でき：鎖Ａ’が鎖Ｂの５’末端に向け伸長され得て完全に延長されたＩＬＯアンプリコン（鎖Ａ’’’）を生じることが認識され得よう：我々は、ＩＬＯアンプリコンの形成、環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンの形成またはその両方の形成が、標的配列の長さに関連づけられ得ることを実験的に確認した。一般的案（限定ではない）として、標的の長さが『短ければ短いほど』、得られる生成物の大部分が環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンとなり得る傾向が『より大きく』、標的配列が増加するにつれ、ほぼ同等量の環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンとＩＬＯアンプリコンの両方の形成が起こり得ることを我々は見いだした。酵素プロセスで用いられるＩＬＯの長さは、標的配列と研究者の必要性とに主に依存する。例えば、特定の遺伝子または遺伝子セグメントが標的とされているなら、その配列の知識は、相補的にまたは実質的に相補的に、あるいは必要に応じ絶対的相補性をもって選択的にハイブリッド化できるＩＬＯの生成を考慮する。そのようなハイブリッド形成は、生じる標的鎖（ＩＬＯハイブリッド形成およびＩＬＯの配列）の融点をインパクトする（ｉｍｐａｃｔ）。精通した技術者は、ハイブリッド形成の度合いと融点に影響するこれらの因子を認め得る能力をもっていると容易に思われる。ＩＬＯが、異なる標的配列にハイブリッド化する領域を含んでいるので、ＩＬＯの長さは、大きな度合いの柔軟性を受け入れる。例えば、逆連鎖のどちらか一方の側に同じ数の塩基を有さないＩＬＯを利用することが受け入れ可能である；しかしながら、我々は、連鎖のどちらか一方の側の塩基の長さが実質的に同じである（すなわち±１０％）ことを優先する。この優先性は、すべての条件が『等しい』とき、『より長い』オリゴヌクレオチドが『より短い』オリゴヌクレオチドよりも『迅速に』標的配列にハイブリッド化するであろうという認識に基づく；よって、連鎖のどちらか一方の側の塩基の長さが実質的に同じＩＬＯを用いることにより、反応動力学が実質的に制御され得る。したがって、我々は、連鎖のいずれか一方の側のＩＬＯの領域の長さの比が約１：１−約１：３、より好ましくは、約１：１−約１：２、最も好ましくは、１：１であることを好む。ＩＬＯの長さは、約８−約１００の塩基の長さ、好ましくは約１５−約８０の塩基の長さ、最も好ましくは約２０−約７０の塩基の長さである；この場合も、ＩＬＯの長さの半分が標的配列の１つの領域にハイブリッド化し、ＩＬＯのもう半分が標的配列の異なる領域にハリブリッド化することを我々は好む。しかしながら、ＩＬＯの長さの選択およびそれぞれのＩＬＯの内部ハイブリッド形成領域は、特に、反応の厳格な条件に基づいて当業者により最適化を受け入れる設計の選択の問題であるということが理解されるべきである。便宜上、我々の例のいくつかでは、我々は、逆インターヌクレオチド連鎖のどちらかの側の領域の１：１の長さ比で、５０塩基の長さを有するＩＬＯを用いた。標的配列が、未知であるか、部分的にだけ既知である場合、標的領域の『側面にある』配列の一部分または標的領域そのものの一部分についての十分な情報が、標的の両側のこれらの部分または標的自体のこれらの部分に相補的である領域を有するＩＬＯをつくりだすのに必要である。標的配列が未知であるか、部分的にだけ既知である場合、ＩＬＯの長さは、標的上の配列の既知の領域へのそのハイブリッド形成を最適化するのに有益に増され得る；このことは、正確な標的配列ハイブリッド形成を確実にするのを補助する。この場合も、当業者は、そのような状況での適当なＩＬＯを最適化するのが容易であると信じられる。ＩＬＯは、逆アミダイトがＩＬＯの一部分に必要であることを別として、標準的な技術と機器とを使用してつくることができる。例えば、商業的に得られるＤＮＡ合成装置と関連してホスホルアミダイト化学を用いて、ＩＬＯの第１の部分がつくられ得る。この部分は、『Ｓ』が固体支持体である従来のＳ−３’−５’ −オリゴヌクレオチドを含んでなる。その後、反応カラムを取りはずし、逆ホスホルアミダイトを含む異なる機器に入れることができ；この機器を用いて、反応チャンバに加えられた第１の逆アミダイトが逆インターヌクレオチド連鎖をつくるであろうから、残りの逆アミダイトの添加を後続させると完全なＩＬＯがつくられ得る。認識されるように、ＩＬＯの第１の部分は、固体支持体に結合した部分がＳ−５’−３’（従来のホスホルアミダイトが後続する）であろうから逆ホスホルアミダイトを使用できる。よって、３’ＩＬＯおよび５’ＩＬＯ分子をつくることができる。単一の機器が、ＩＬＯをつくるように使用できるということが理解されるべきである；好ましくは、そのような機器は、反応チャンバへの従来のホスホルアミダイトおよび逆ホスホルアミダイトの両方の添加を行う能力を有する。化学リンカーも逆連鎖に用いられ得る。例えば、ＴＯＰＳ^TM試薬（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＲｅｓｅａｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が、アミダイトへの逆アミダイトの連鎖に対して用いられ得る。逆ホスホルアミダイトをつくるために用いられる好ましい合成プロトコールは、デオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの３’ヒドロキシル基での『一時』保護基の使用を必要とし、よって、ホスフェート基またはホスフィット基が、５’−ヒドロキシル基に加えられる。注目されるアンチセンス参考文献は、そのような合成についてのプロトコールについて述べている。我々は、Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｋ．Ｋ．らの『リボヌクレオシドのヒドロキシル機能の保護でのシリル基の使用（ＴｈｅＵｓｅｏｆＳｉｌｙｌＧｒｏｕｐｓｉｎＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅＨｙｄｒｏｘｙｌＦｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）』ＴｅｔｈｒａｈｅｄｒａｎＬｅｔｔｅｒｓ．３３：２８６１−２８６３（１９７４）に記載の手順の変形を用いてシリルイミダゾールがシリル化剤として用いられることを選ぶ；Ｏｇｉｌｖｉｅは、シリル化反応は、リボヌクレオシドの５’ヒドロキシル基に特異的であると報告している。５’−ヒドロキシル基が保護されると、『−時』保護基、最も好ましくはＤＭＴが、３’−ヒドロキシル基に加えられ得る。精通した技術者は、逆ホスホルアミダイトを得る別の方法を識別する能力をもっていると考えられる。本発明の酵素プロセスの例示実施態様は、二本鎖ＤＮＡ（またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）の指数増幅に特に関するが、ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡの増幅も同様に実行可能である。特に好ましい標的配列増幅プロトコールの図式的表示が、図１、２および３に示してある。固体相の増幅プロトコールの図式表示は、図４に示してある。図１では、標的配列は、二本鎖であり、ＩＬＯが標的の鎖にハイブリッド形成するようにつくられ得ることが十分な定義である；図２では、標的配列は、３’ＩＬＯおよび５’ＩＬＯが突然変異してない配列の検出と増幅のために使用される点突然変異を含んでいてよく；図３では、『ギャップ』が、標的配列内に存在し；図４では、ＩＬＯがアビジンを介して固体支持体に結合していて、逆インターヌクレオチド連鎖が、ビオチン部分を含んでいる。開示されたＩＬＯは、また、一本鎖コンホメーション多型性（ＳｉｎｇｌｅＳｔｒａｎｄｅｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）のようなプロセスで有用であり；ＳＳＣＰ分析に用いることのできる例示システムには、ｔｈｅＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ^TM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）がある。加えて、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（１３（２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１８８（１９９２）は、開示のＩＬＯと関連して使用できる。開示の次の部分について、本発明のある種の好ましい実施態様が開示されている。しかしながら、これらの好ましい実施態様は例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである；当業者は、ほかの酵素プロセスで本開示を用いる能力を有すると考えられる。Ａ．指数的増幅に使用するシングル３’−ＩＬＯ二本鎖ＤＮＡの指数的増幅のために１組の３’−ＩＬＯ分子を使用する本発明の実施態様を図１に模式図的に示す。ハイブリダイゼーションの際に条件が適切ならばＩＬＯ部分は標的鎖に沿って延長し（図１Ｂ）、標的：延長３’−ＩＬＯの延長及び変性の終わりには次の４生成物が存在する：２種類の元々の鎖及び２種類の延長したＩＬＯアンプリコン（図１Ｃ）。そのＩＬＯアンプリコンはその後のサイクルにおいて標的塩基配列として役立つ（図１Ｄ−Ｆ）。図１ＤはＩＬＯ生成物を用いる指数的増幅経路を示す。上記のように、ＩＬＯ及び標的塩基配列の長さによって、図１Ｅ及び１Ｆに示される経路の１つまたは両方がおこり得る：図１Ｅは環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンに至るＩＬＯアンプリコンのセルフ −プライミング（self−priming）を示す；図１ＦはＩＬＯアンプリコンの延長を示す。１．核酸標的配列開示された方法を用いて少なくとも１つの標的核酸配列の指数的量を生産することができる。標的配列の少なくとも２つの領域に関する十分詳細な、例えばそこにハイブリダイズするＩＬＯの生成を可能とするような情報が必要である。核酸のいかなるソースでも標的核酸配列のソースとして利用できる；その核酸配列は精製した形でも非精製でもよく、これらの選択は主として増幅の目的と関連した研究者の要求に依存する。例えば臨床的評価のためには、標的配列を精製して完全に分離するのは実際的でない；しかしながらそのサンプルが不純であればある程、潜在的偽陽性結果を生み出す見せかけの増幅のおきる可能性が大きくなるかも知れない。或る核酸リガーゼまたはポリメラーゼ及び或る複雑さをもった核酸のサンプルでは、熟練せる当業者は抑制条件（stringency conditions）；ＩＬＯ及びＩＬＯ領域の長さ；標的配列の決められた長さ；ＩＬＯのアニーリング温度を容易に調節または決定してリガーゼ及びポリメラーゼの活性を維持し、同時に見せかけの増幅の可能性を容認し得る低レベルに維持することが十分に可能である。開示せる方法では標的として一本鎖−または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを用いることができる；その上、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（これは各々の鎖を含む）も用いられる。上記のいずれかを含む混合物を用いることもできる。試験すべき標的配列はいかなるソースからも得ることができる；例えば細菌、ウィルス、酵母及び植物または動物のような有機体から分離したＤＮＡまたはＲＮＡから：ｐＢＲ３２２及びＭ１３のようなプラスミドから、そして閉鎖状ＤＮＡまたはＲＮＡからも得られる。これらの仕事を実現する技術は熟練せる当業者の技術の範囲内である。ＤＮＡは組織培養で増殖した細胞から抽出してもよい；参照：マニアチス（Maniatis）など；“分子クローニング、実験室マニュアル（ Molecular Cloning，A Laboratory Manual）”（ニューヨーク；Cold Spring Ha rbor Laboratory；1982）（以後は“マニアチス”と記載）、280−281ページ。臨床的サンプル（例えば皮膚落屑、全血、血清、血漿、精子、涙、膣スワブなど）から誘導された標的核酸配列は当業者が利用できる種々の方法によって作られる。一般にはこれらの技術の主な目的は、核酸を十分に精製して、もし存在すれば核酸増幅を妨害するかも知れない異物を除去することである。例えば血清サンプルでは核酸の製法は概して次の段階から成る：血清を、２５ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）中２．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Boehringer Mannheim）、２．５ｍＭＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳと共に７０℃で１時間インキュベートする。これに続いて次の抽出を行う：フェノール抽出及びエーテル抽出。この次にエタノール沈殿を行う。参照：ラルザル（Larzul）など、J.Heptol．５巻、199−204ページ（1987）。記載されているようにその他のプロトコル及び技術もこのような精製のために容易に使用できる。２．３’−ＩＬＯの製法好適にはＩＬＯは上記の方法で作られる。ＩＬＯのハイブリダイゼーション領域は、標的配列（ｓ）に安定的にハイブリダイズするのに十分な長さをもっていなければならない。そのためＩＬＯの長さはヌクレオチドたった４個から数百までもの範囲に変動し得る。その上、５’−５’ヌクレオチド間連鎖の領域又は他側は等しい長さであっても異なる長さであってもよい、例えばもしＩＬＯの長さを１００塩基とするならばＩＬＯの３’−５’領域が２５塩基で、したがってＩＬＯの５’−３’領域は７５塩基となる。これらの領域の長さは実質上等しいことが好ましい。熟練せる当業者は標的へのハイブリダイゼーションが可能であるＩＬＯの長さを容易に選択することができ、この標的はそれはそれでこの標的に沿ったＩＬＯの酵素的延長を行わせる。ＩＬＯは好適には次のように作られる；ビューケイジ（Beaucage,S）らのTetr ahedron Letters 22巻：1859-1862ページ（1981）に記載されているプロトコルを用いて第一の自動機器で固体サポート：３’−５’部分が作られる。その後、ＩＬＯのこの部分を含む反応カラムを第二の機器に移す；ここで逆ホスホルアミダイト類を利用して例えばオギルヴィー（Ogilvie,K.K.）などのTetrahedron Letters 33巻：2861−2863ページ（1974 ）に記載されているプロトコールを用い、ＩＬＯの第二の部分が作られる。その後、公知の基準を用いてＩＬＯの切断及び脱防御が好適に行われる。３．鎖の分離／変性鎖の分離は適切ないかなる変性法を用いても実現できる；これらには物理的、化学的又は酵素的手段の利用が含まれる。鎖を分離する物理的方法は、核酸を完全に変性するまで加熱することを含める；熱変性は一般的には約８０℃から約１０５℃までの温度（好適には約９５℃）を約１ないし約１０分間（好適には４− ５分間）適用することから成る。鎖を分離するその他の物理的方法は二本鎖が存在する媒質のｐＨを変えることから成る；ｐＨによる変性は一般的には約ｐＨ１１ないし約ｐＨ１４のｐＨを約１秒間ないし約１０分間適用することから成る。鎖分離の酵素的方法はヘリカーゼまたは酵素ＲｅｃＡと呼ばれる酵素の利用に依存する；この酵素はヘリカーゼ活性をもち、ＡＴＰの存在下では二本鎖ＤＮＡを変性すると報告されている。核酸鎖をヘリカーゼで分離するのに適した反応条件はCold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology、XLIII巻、“ＤＮＡ複製及び組換え（ＤＮＡ Replication and Recombination）”（ニューヨーク： Cold Spring Harbor Laboratory、1978）、クーン（B.Kuhn）など、“ＤＮＡヘリカーゼ（ＤＮＡ Helicases）”、63−67ページに示される；これは引例によりここに挿入される。（好適なように）熱変性を用いる場合、ＩＬＯプロトコルに用いる酵素は熱安定性酵素であることが最も好適である。４．操作段階ＩＬＯ反応は、好適には約６．０ないし約９．０のｐＨをもつ緩衝水溶液中で行われるのが好ましい。好適には反応緩衝液はＩＬＯ反応を十分にそして特異的に循環させ得る種々の成分を含んで成る。ポリメラーゼ酵素がＴａｑポリメラーゼの場合、特に好ましい緩衝溶液は２０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸（ＴＲＩＳ−ＨＣＬ）、ｐＨ７．８、である。好適には付加的材料は反応緩衝液に添加される；これらの材料は、反応の循環が高効率で（例えば標的鋳型あたり最大量の生成物、好適には２Ｘ以上、より好適にはＸ^Y、最も好適には約Ｘ²；ここでＸは各サイクル中に使用できる標的鋳型の数であり、Ｙは１．０以上、約２以下である）、しかも高い特異性（“ポリメラーゼの忠実度”とは酵素が正しいヌクレオチドを酵素的に挿入する傾向と定義し、“リガーゼ忠実度 ”とは、リガーゼ活性をニック−クロージング活性─例えば標的配列にハイブリダイズしたときに互いに隣接する２つの相補的オリゴヌクレオチド部分の結合─ に限定するもの、と定義した場合、リガーゼ及びポリメラーゼ酵素の忠実度の正確さ）をもち；加工処理性が最大であり；酵素の触媒的安定性が維持され；反応安定性（すなわち反応成分が溶液中に保持され、非特異的活性は減少し、反応成分の反応器面への付着が最小である）が維持されるように選択される。その他の材料、例えば保存剤などを任意に反応緩衝液に添加することができる。反応緩衝液の所望の最終容量を得るために二重電離水を用いるのが最も好適である。（好適なように）熱変性を利用する場合、温度の周期的範囲内に温度がコントロールされた環境を反応器に与える熱循環器を用いるのが好適である。その一例はパーキンエルマー４８０^TM熱循環器である。ＩＬＯ部分は核酸標的配列の二本鎖１つにつき最低２つのＩＬＯ分子となるように存在するのが好適である。好適にはＩＬＯは約２．０ナノモル（ｎＭ）〜約２００マイクロモル（ｕＭ）の濃度範囲で存在し；より好適には約２００ｎＭ〜約１０ｕＭ；最も好適には約２．０ｕＭである。各反応に用いるＩＬＯの最適量も標的の濃度、酵素濃度、実施される増幅サイクル数に依存して変化する。最適濃度は熟練せる当業者によって容易に決定できる。概して条件の抑制（stringency）は温度、緩衝液及び関連パラメーターに依存する；しかし温度的パラメーターは一般にはコントロールし易く、したがって、変化したときにはＩＬＯ反応のパフォーマンスを最適化するために利用できる好適な抑制パラメーターである。記載されているように、温度によって仲介される抑制に直接関係しているのはオリゴヌクレオチド部分の長さである−−そこで当業者はＩＬＯの標的とのハイブリダイゼーションによってＩＬＯを確実に酵素的延長するという目的にしたがって、抑制条件を容易に最適化することができる。ＩＬＯ延長手段、好適にはデオキシリボヌクレオチド三燐酸（すなわちｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）及び／またはリボヌクレオシド三燐酸（すなわちＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ）と組み合わせたポリメラーゼ酵素は、好適にはＩＬＯを標的配列と混合する前か混合中、または混合後に反応器中に存在する。ポリメラーゼ酵素は熱安定性ポリメラーゼ酵素であるのが最も好適である。最も好適な付加的段階は、すでに標的配列、ｄＮＴＰｓ及びＩＬＯ部分を含む反応器にポリメラーゼを混ぜるという段階である。特に好ましいプロトコルでは、ハイブリダイゼーション及び酵素活性が実質上阻止されるような温度をもった反応器中ですべての試薬を混合する。これは、約４℃に維持した反応器に反応成分を加えることによって容易に実現できる；この温度ではすべてとは言わないまでも大部分の酵素活性は実質上阻害される。最も好適な反応成分付加順序は次のようである：反応緩衝液；標的配列；ｄＮＴＰｓ；ＩＬＯ；熱安定性ポリメラーゼ酵素。“加熱開始（hot start）”後に熱安定性ポリメラーゼ酵素を加えるのが最も好適である、すなわちポリメラーゼ酵素を反応器に加える前に最初の“変性サイクル”を行う。既述のように、増幅プロセスの開始が望まれるまではこれらの成分を約４℃に維持するのが最も好適である。反応成分は手で、または種々の反応成分を反応器（ｓ）に自動的に添加できるロボット式自動ラボラトリーワークステーションによって反応器に加えられる。特に好適なロボット式自動ラボラトリーワークステーションはＢＩＯＭＥＫ^R１０００［ベックマンインスツルメント（Beckman Instruments,Inc.フラトン、ＣＡ）］である。反応成分を混合した後、反応器が最も好適なように４℃に維持されていたならば、その反応器を“加熱開始”にする、すなわち温度を約５分間約９５℃に高め、ポリメラーゼ酵素の添加によるＩＬＯ反応が開始する前に、標的配列を完全に変性する。好適にはその次ぎに増幅サイクルを行う。１サイクルはＩＬＯ部分の標的配列へのアニーリングと、その変性を必要とする。もし変性が温度によって仲介されるならば（最も好適であるように）、それらサイクルは反応器の温度調節によって調節される。熱に不安定な酵素を用いる場合は、鎖の変性に必要な温度に達したときには、その酵素の酵素的活性はほぼ破壊されている；したがって各サイクル後に新鮮な酵素を加えなければならない。主としてこの理由で熱安定性酵素の方が好んで用いられる。各サイクル中に用いられる温度は主としてＩＬＯ部分のアニーリング温度に依存する；熟練せる当業者は各サイクルに用いられる時間及び温度を容易に最適化することができる。長さ約６ないし約１０塩基のＩＬＯ部分では、そのアニーリング温度は約４０℃である；この温度では熱感受性（すなわち熱不安定の）酵素でも活性である。しかしながら部分の長さが増加するにつれてアニーリング温度は上昇し、熱安定性酵素を使用するか、または各サイクル後の熱感受性酵素の添加が必要となる。その他の変性手段、例えば物理的方法、酵素的方法、ｐＨ調節または化学的手段を用いる場合は、その手段は反応成分と相容れなければならないことは熟練せる当業者にとって当然である。ＩＬＯプロセスを行うために必要な諸成分でこのような手段を最適化することは熟練せる当業者の技術の範囲内であると考えられる。サイクル数は主として研究者の必要に依存する。使用できる標的コピーの数が少ない場合（すなわち約１０００以下）、サイクル数は１０ないし４０の範囲であり、より好適には２０ないし４０、最も好適には約４０である；使用できる標的コピーの数が多い場合（すなわち１０００以上）サイクル数は上記と同じであってもよいが、より少ないサイクルでも検出可能の結果を得ることができる。４０以上のサイクルも用いることができる。サイクル数に関する１つの準制限因子は使用するＩＬＯ分子、ｄＮＴＰｓ及び酵素の量である。サイクル数が増えるとこれらの成分は場合によっては枯渇し、それ以上のサイクルを行っても付加的増幅には至らないことがある。こうして所望サイクル数の増加につれて、ＩＬＯ分子、ｄＮＴＰ及び酵素の相対的量を増加することが好ましい；所望のサイクル数に対してこれらを最適化することは当業者の技術の範囲内と考えられる。適切なサイクル数が行われた後、反応を打ち切る。効率的方法は酵素を不活性化することであり、最も好適には反応器温度を４℃に下げることによってこれを実現することである。しかしその他の方法、例えばＥＤＴＡ及び尿素“中止”溶液を用いることができる。その他に、当業者に公知の方法を用いて酵素を化学的に不活性化することができ、或いは例えばセファデックスカラム上で；濾過によって；遠心分離により；またはゲル電気泳動法によって、成分を分離することができる。温度を利用して反応を打ち切るのが最も好適である。あらゆる増幅プロトコルと関連した潜在的致命的問題は汚染である；この問題が特にひびくのは、増幅プロトコルが診断的目的に用いられる場合である。例えば、１つの反応器からの微々たる汚染でも誤った陽性結果を導くことがある、すなわち第一の反応器に存在し、第二の反応器には存在しない所望標的が偶然に第一反応器から第二の反応器に移るかも知れない−−こうなると所望標的は事実第二の反応器には本来存在しなかったのに、第二の反応器が所望標的の増幅を示すようになる。このような汚染の可能性を本質的に減らすための種々のアプローチが提案されている。このようなアプローチの１つは、酵素ウラシル −Ｎ−グリコシラーゼ（“ＵＮＧ”）を利用するものである。ＵＮＧはウラシルを分解するから、ウラシルを含むオリゴヌクレオチドはＵＮＧの存在下で効率的に分解する。その上ＵＮＧは熱（約８０℃）で不活性化される。こうして汚染に関する懸念を減らすためには、反応混合物中のｄＴＴＰをＵＴＰに置き換えた溶液を用いるのが好適である、すなわち増幅生成物はチミジンの代わりにウラシルを取り込む。第一の反応器で標的が増幅した後、ＵＮＧを第二反応器に加える；もしも第一反応器からきた何らかの増幅生成物が第二反応器を汚染したならば、ＵＮＧがその汚染物を効果的に分解する。その後第二反応器は約８０℃までの加熱によって“加熱開始”され、それによってＵＮＧは不活性化される。その後ｄＮＴＰ及び／または酵素を第二反応器に加えて、ＩＬＯプロトコルを開始することができる。５．ＩＬＯ標識化ＩＬＯの標識化は任意のものであり、主として研究者の要求に任せられる。標識は、処理操作が容易で効率的に検出できるものであることが好ましい。その上、ｄＮＴＰｓは標識化することができる。直接検出できる標識に関するアプローチとしては、例えば³²Ｐ、³⁵Ｓまたは¹² ⁵ Ｉなどの放射性標識をつけたｄＮＴＰの利用がある；これらの放射性標識はＩＬＯ部分に組み込まれ、またはＩＬＯ部分の酵素的延長に関して利用される。しかしながら後者のアプローチが用いられる場合、組み込まれた標識化ｄＮＴＰｓを、組み込まれなかったそれらから分離することが必要である。ＩＬＯを直接標識化するアプローチは、当業者には公知のオリゴヌクレオチドの標識方法から取り入れることができる。特に好適なアプローチは“末端標識化 ”アプローチである。それによるとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、 γ−ホスフェートをリボヌクレオシド５’−三燐酸ドナー（一般的には［γ−³² Ｐ］ＡＴＰ）から５’−ヒドロキシルに移すことによって５’−末端標識を５’ −ＩＬＯに導入する。参照：例えば、リチャードソン（Richardson,C.C．）、“ 酵素（TheEnzymes）”、XIV巻、核酸Ａ部、Boyer編、P.D.Acad．出版、299ページ、1981。別法としては、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、提供されたデオキシヌクレオチド系列をＩＬＯの３’−末端に付加する；例えば［α³²Ｐ］デオキシＮＴＰを用いればシングル（single）ヌクレオチド標識化が可能である。参照：例えば、ボラム（Bollum,F.J．）、“酵素”、Ｘ巻、Boyer編、P.D.Acad．出版、1974；ユサフ（Yousaf,S.I．）など、“遺伝子（G ene）”27巻、309ページ（1984）；ワール（Wahl,G.M．）など、PNAS USA 76巻、3683−3687ページ（1979）。標識ジ−デオキシＮＴＰｓ、例えば［α³²Ｐ］ｄｄＡＴＰなども用いることができる。その他に非放射性標識化ＩＬＯ、例えばハプテン標識化ＩＬＯなどが有効である。例えばＷＩＰＯ出版物Ｎｏ．ＷＯ91/19729“核酸プローブ及び蛋白質プローブ（Nucleic Acid Probes and Protein Probes）”、アダムス（Adams,C.W.）、出版日1991年12月26日を参照、これは引例によってここに挿入される。このようなハプテン標識に関する検出スキームにはそのハプテンに対する抗体の利用が含まれる−−その抗体が標識化される。これに類似した１アプローチはビオチン及びアビジン、またはこれらの誘導体の利用を含む。例えばビオチン−１１−ｄＵＴＰをｄＴＴＰの代わりに、またはビオチン−１４−ｄＡＴＰをｄＡＴＰの代わりに用いることができる。それから標識化アビジン、またその誘導体が検出のために用いられる。一般的にランガー（Langer,P.R.）などのPNAS USA 78巻：6633−6637ページ（1981）を参照せよ；これは引例によってここに挿入される。ビオチニル化ホスホルアミダイト類も利用できる。例えばミシウラ（Misiura,K.）など、“核酸研究（Nucl.Acids.Res．）”18巻、4345−4354ページ（1990）参照；これは引例によってここに挿入される。このようなホスホルアミダイト類は、オリゴヌクレオチド部分の合成中に、成長しつつあるオリゴヌクレオチド部分に沿った所望位置に正しくそれらを挿入することができる。その他にフルオレッセイン−１１−ｄＵＴＰ［参照：シモンズ（Simmonds,A.C ．）など、Clin.Chem.37巻：1527−1528ページ（1991）、引例によってここに挿入される］及びジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ［参照：ムーレッガー（Muhleg ger,K.）など、“ヌクレオシド及びヌクレオチド（Nucleosides & Nucleotides ）”、８巻、1161−1163ページ（1989）；引例によってここに挿入される］を標識として用いることができる。化学ルミネセンス基質も標識として有効である。例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（“ＨＲＰ”）及びアルカリ性ホスファターゼ（“ＡＰ”）─これらは両方共核酸に直接架橋結合する［参照；レンズ（Renz,M．）及びクルツ（ Kurz,C．）、核酸研究１２巻：3435−3444（1964）、引例によりここに挿入される］─は酵素標識として使用できる。ＨＲＰの基質であるルミナール及びＡＰの基質である置換ジオキセタンが化学発光基質として用いられる。ＨＲＰ標識プロトコルの例はアメルシャム（Amersham）（アーリントンハイツ、イリノイ、USA）から市販されるＣＬシステムである。一本鎖オリゴヌクレオチドの標識化方法及び標識化オリゴヌクレオチドは米国特許第4,948,882号にも記載されている。このなかに述べられている情報も開示されたＩＬＯプロトコルに利用できる。標的増幅が必ずしも連続的に行われない研究的環境においては、放射性標識の利用がより好ましいかも知れない。非研究的環境、例えば臨床的状況ではこのような標識は廃棄物の問題及び連続的放射性標識被曝に関係する関連リスクのために好ましくない。そこでこれらの状況では非放射性標識の方が好ましいかも知れない。上記の事柄は制限としてでなく例として把握されるべきである。６．増幅生成物の検出増幅生成物の検出は主として使用した標識による；ＭＩＳＡはその固有のコンカテマリゼーションのために、増幅反応器中でネフェロメトリープロトコルまたは比濁法プロトコルによって検出しやすい“スカッターセンター（scatter cent ers）”を作り出すことができる。すなわち増幅プロセス後に増幅反応を直接検出することができる。熟練せる当業者は選択した標識に対して適切な検出プロトコルを選択する能力をもっている。制限するものではなく例として、放射性標識を用いた場合には反応器からの増幅生成物並びに反応成分を検出前に何らかの種類の分離操作、好適には“スラブ”ゲル電気泳動にかけるべきである；その後Ｘ線感受性フィルムを分離媒質上に置き、それによって放射性標識による露出によって生成物増幅がおきたかどうかが明らかにされる。或いは、増幅生成物を反応成分から分離し、このような測定に適合したまたはそのために設計された機器を用いて放射能カウントを測定することができる。非放射性標識は目で見て確認したり、このような目的のために設計された機器で検出したりすることができる。例えば標識がＨＲＰのような酵素であり、基質が色素生産性物質である場合、基質の標識への導入は色の変化をおこし、そのため色が増幅生成物の証拠となる。ハプテン標識は、検出可能の標識を結合して有する抗ハプテン抗体を用いて検出することができる。間接的に検出できる標識、例えばビオチンでは、検出可能の標識を結合して有するアビジン（またはその誘導体）を用いて、または反応混合物から捕獲し、分離することによって検出することができる。増幅生成物検出のためのその他の手段としては、増幅生成物に相補的な核酸プローブの利用がある。この種の検出においてはオリゴヌクレオチド部分の標識化は不必要である。標的が存在するならば、その増幅は、標識核酸プローブを用いて検出できるような十分量の標的を生ずる。直接または間接に検出できる標識を含む単一プローブを用いることもできるし、または直接または間接に検出できる標識と捕獲部分（capture moieties）とを含む複数プローブを用いることもできる。参照；例えば米国出願番号第07/576,137号“液相核酸ハイブリダイゼーション及び標的核酸検出のための固相捕獲、及びそのキット（Solution Phase Nucleic Acid Hybridization and Solid Phase Capture For Detection of Target Nucleic Acid、and Kit Therefore）”、これは参考として、ここに挿入される。Ｂ．突然変異領域の検出及び指数的増幅に用いるシングル３’−ＩＬＯ及びシングル５’−ＩＬＯ標的配列に沿った突然変異点を増幅検出する本発明の実施態様を図２に模式図的に示す。この実施態様においては、突然変異点の塩基配列情報がわかっているため、相補的ＩＬＯ分子を作り出すことができる。図２を参照すると、矢印は推定される突然変異点の領域を指している；例えばＡＡＡＣＧＧＧＴが正しい配列を示し、したがってＡＡＡＣＡＧＧＴは突然変異点を示し、ＡＡＡＣＧＴは欠失を示す、等々。ＩＬＯ分子が正しい野生型配列にハイブリダイズするように設計されるならば、もしも突然変異がある場合は、ＩＬＯ部分の酵素的結合に導くようなハイブリダイゼーションはおこそうとしてもおきるはずがない。認められているように、ＩＬＯ部分が標的にハイブリダイズする点において結合の必要があるため、１つのＩＬＯ部分は３’−ＩＬＯ（２つの３’末端）でなければならず、もう一つのＩＬＯは５’−ＩＬＯ（２つの５’−末端）でなければならない。この結果１つのＩＬＯの３’末端ともう一つのＩＬＯの５’末端との間に結合がおきる。この理由で、反応プロトコルの開始前には各５’末端に燐酸基が含まれていることが好ましい。その上、各ＩＬＯの配列は結合点に関して標的配列のクロス−ダイアゴナル領域に一致する。例えば図２を参照すると、３’−ＩＬＯは鎖Ａ上の或る領域に相補的な配列（鎖ＡのＡＡＡＣ領域に相補的な３’−ＩＬＯのＴＴＴＧ部分）と鎖Ａ補体（３’−ＩＬＯのＧＧＧＴ部分は鎖Ａ補体のＣＣＣＡ領域に相補的である）とを含む。標的鎖は定義により相補的であるから、これらの塩基配列は標的配列の相補的部分にあらわれる配列と同一である。推定的突然変異点の領域の塩基配列を研究することは勿論必要である；これは３’−ＩＬＯ及び５’−ＩＬＯの作成を可能とする。再び図２を参照すると、３’−ＩＬＯ及び５’−ＩＬＯの各相補的領域はそれぞれの標的にハイブリダイズすることができる；適切な条件下では次に結合的できごとがおこる；それは３’−ＩＬＯを５’−ＩＬＯにつなげ、その結果次のラウンドで標的として使用できる２つの生成物が生ずる。１．核酸標的配列Ａ．１章に示される情報は発明のこの実施態様に適用できる；記載されているように、３’−ＩＬＯ及び５’−ＩＬＯを作り出すためには、突然変異に通ずるヌクレオチド変化の領域の塩基配列に関する情報が必要である。２．ＩＬＯの形成ａ）３’−ＩＬＯの形成Ａ．２章に示される情報は発明のこの実施態様に適用できる。ｂ）５’−ＩＬＯの形成本質的には５’−ＩＬＯは、３’−ＩＬＯを生成するのと同じ方法で多量に生成する。しかしながら逆ホスホルアミダイト類を使用して、固体サポート付着、すなわち固体サポート：ｒｐ５’−３’（ここで“ｒｐ”は逆ホスホルアミダイト類）を形成するのが好適である。その後反応チャンバーを第一合成装置から取り出し、従来のホスホルアミダイト類を用いる合成装置に入れ、３’−３’逆連鎖が生じるようにした。ｃ）３’−ＩＬＯ／５’−ＩＬＯハイブリダイゼーションの回避３’−ＩＬＯ及び５’−ＩＬＯは互いに相補的である；それに加えて、そして当業者には当然であるように、反応器に加えられる３’−ＩＬＯ及び５’−ＩＬＯの量は、ＩＬＯ：標的ハイブリダイゼーションを活発に行わせるために、普通は標的配列に対して過剰になっている。これはまた３’−ＩＬＯ：５’−ＩＬＯハイブリダイゼーションを促進する可能性を増やす潜在的効果も有する。そのためＩＬＯ部分は、ＩＬＯ：ＩＬＯハイブリダイゼーションを実質上阻止するように合成される。これはヌクレオチド間連鎖内に“妨害部分”、すなわちビオチン分子を入れることによって実現する。別法として逆連鎖領域内もしくはその近くのヌクレオチドを利用することもできる。例えば図２の３’−ＩＬＯ及び５’ −ＩＬＯを用いて、互いに相補的でない付加的塩基を使用することができる；図２Ａはその方法の模式図である。図２Ａでは、３’−ＩＬＯは鎖Ａの塩基に一致する２つの塩基（ＧＧ）を含む；これは勿論ＩＬＯのこの部分における相補的塩基対形成を妨害する。５’−ＩＬＯは鎖Ａ補体の塩基に一致する２つの塩基を含む（ＧＧ）；これも同じ効果を有する。よって、５’−ＩＬＯのＧＧ（下線を引いた部分）は、２つのＩＬＯ部分の中心領域内が非相補的であるが故に、３’−ＩＬＯの５’−ＩＬＯへのハイブリダイゼーションを妨害する。“妨害部分”がヌクレオチド塩基である発明のこの実施態様において、妨害塩基の数がＩＬＯの塩基数の約１０％以下であるのが好適であり、ＩＬＯの塩基数の約５％以下であるのがより好適である。例えばヌクレオチド間連鎖の両側に２５塩基をもつ全部で５０塩基から成るＩＬＯでは、ＩＬＯの１領域の塩基２５が標的領域に絶対的に相補的であり、ＩＬＯのその他の領域の約２０−２３塩基が標的領域に絶対的に相補的であり、約５ないし２塩基が記載のように非相補的であるのが好適である。３．鎖の分離／変性Ａ．３章に示される情報は本発明の実施態様に適用できる。４．操作段階Ａ．４章に示される情報は次のような変更を加えれば発明のこの実施態様に利用できる。定義により発明のこの実施態様は５’−ＩＬＯ及び３’−ＩＬＯの結合を必要とし、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓに加えてリガーゼ酵素、最も好適には熱安定性リガーゼ酵素が用いられる。サイクル操作により結合生成物を増幅することができる；これは勿論３’−ＩＬＯと５’−ＩＬＯとの結合が標的配列に関して実現可能であると仮定してのことである。５．ＩＬＯの標識化Ａ．５章に示される情報は発明のこの実施態様に適用できる。６．結合生成物の検出結合生成物（もしも存在するならば）を検出するための検出スキームは多数ある。我々はビオチン部分を例えば３’−ＩＬＯに組み込み、例えば放射性標識を５’−ＩＬＯに組み込む二段階式検出スキームを利用することにした。反応プロトコル後、反応器をアビジン−コーテッド固体サポートに導入する。これは３’−ＩＬＯのほとんどすべてと、もし存在するならば３’−ＩＬＯ：５’−ＩＬＯ結合生成物を取り出すという効果をもつ。厳密に言うと、放射性標識化５’−ＩＬＯは実質上全く存在しない。もしも分離された物質それ自体が“バックグラウンド”に起因しない検出可能の放射能をもつならば、３’−ＩＬＯと５’−ＩＬＯとの結合がおきた、という結論が引き出される。Ｃ．３’−ＩＬＯ及び５’−ＩＬＯ間のギャップ３’−ＩＬＯ及び５’−ＩＬＯを標的にハイブリダイズさせ、そのハイブリダイゼーションの結果３’−ＩＬＯと５’−ＩＬＯとの間にギャップが存在し、増幅プロセスがそれに関連づけられるように設計された本発明の実施態様が図３に模式図的に示される。１．核酸標的配列Ａ．１章に示される情報は発明のこの実施態様に適用できる。しかしながら定義により、ギャップ間の配列に関する情報は知る必要がない。例えば、ギャップの配列は未知であってよい；必要なのは、ギャップの両側の部分に関する十分な詳細がわかっており、相補的３’−ＩＬＯ及び５’−ＩＬＯを生成できることである。２．ＩＬＯの形成Ｂ．３章に示す情報は発明のこの実施態様に適用できる。３．鎖の分離／変性Ａ．３章に示す情報は発明のこの実施態様に適用できる。４．操作段階ギャップを“埋める（fill-in）”必要があるため、ポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰｓ及びリガーゼ酵素が発明のこの実施態様には必要である。こうしてＡ．４及びＢ．４章に示される情報は適用できる。ポリメラーゼ酵素及びｄＮＴＰｓを使用する必要があるため、標的鎖にハイブリダイズした３’−ＩＬＯがギャップとは反対方向に延長する可能性が存在する（“埋まらない（non−fill-in）”）。本質的にはこれは重要な問題ではない。埋まらない延長を減らし、“埋める”延長が可能であるようにサイクル時間を最適化することが実現可能である。ギャップの配列に関する情報が（ａ）ある場合、及び（ｂ）４塩基中３塩基のみから成る場合、別のアプローチが可能である。これによると３ｄＮＴＰｓを使用して埋まらない延長を制限することができる。約２００ヌクレオチド以上の長さをもつギャップでは、各サイクルの反応時間を延長することが好ましい；各サイクル反応時間が約１０分以上、すなわち約１２−１５分以上であることが好適である。このような時間延長の目的はサイクリング効率を高めることである。５．ＩＬＯ標識化Ａ．５及びＢ．５章に示される情報は発明のこの実施態様に適用できる。６．結合生成物の検出Ａ．６及びＢ．６章に示される情報は発明のこの実施態様に適用できる。特に好適な検出スキームは、オリゴヌクレオチド部分の１つ（または複数）に相補的な核酸プローブの使用を含む；このためアンプリコンを反応器から“引き出す” ことができ、それによってその塩基配列を決定することができる。発明のこの実施態様に関係する診断的応用により、１つ以上の対立遺伝子を生ずる特異的突然変異のための種々の標識プローブを用いる機会に恵まれる。すなわち遺伝子の特定領域内に存在することがわかっている種々の突然変異に対して、この領域をフランク（flank）するように３’−ＩＬＯ及び５’−ＩＬＯを設計することができる；その後標的の増幅の結果、未確定突然変異のアンプリコンが生ずる。それから既知の突然変異配列のための特異的プローブを用いて、そのアンプリコンをスクリーニングし、どのプローブがそのアンプリコンにハイブリダイズするかによって突然変異を確認することができる。熟練せる当業者は上述のような増幅標的のスクリーニングに必要な条件を最適化する能力を有する。Ｄ．標的の固相ＩＬＯ延長開示されたＩＬＯ分子は標的配列を用いる固相ＩＬＯ延長を可能とする；好都合なことに、延長した標的生成物の検出はこのアプローチによってより効率的に行われる。図４を参照すると、標的塩基配列、固体サポート、及び３’−ＩＬＯが用意される。この反応の目的は標的塩列を鋳型として用いて不溶化ＩＬＯの酵素的延長をおこすことである。便宜上、この実施態様は不溶化ストレプトアビジンと、５’−５’ヌクレオチド間連鎖に位置するビオチン部分を含む３’ＩＬＯとに焦点を置いている。この実施態様の主要目的は標的配列を介してＩＬＯを延長し、延長したＩＬＯを分析することである。認められているように、遺伝子分析の領域では遺伝子または遺伝子領域の増幅の後に、増幅生成物の例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（“ＡＳＯ”）による“プルーブ（probing）”を行うのが最も一般的である。これは増幅生成物を固体サポートに固定し、それから不溶化生成物をいくつかのＡＳＯでプルーブするか（“ドットプロット（dot blott）”法）または不溶化ＡＳＯｓを増幅生成物でスクリーニングする（“逆ドットブロット”法）ことによって達せられる。これら従来のアプローチは多数の段階を必要とし、その各段階は繁雑で間違いの可能性を増大させるのは明らかである。このような問題を避けるために我々は固相標的延長ができるＩＬＯｓを開発した、すなわち延長生成物が最初から不溶化されており、反応後、不溶化反応生成物を直接ＡＳＯｓで調べる（probe）ことができる。図４は、ビオチン部分が最も好適に逆連鎖（Inverse Linkage）に挿入されたビオチニル化３’−ＩＬＯを示す。アビジン（またはストレプトアビジン）固体サポートを用いると、３’−ＩＬＯのビオチン部分は３’−ＩＬＯの不溶化をおこし、概ね“Ｙ”または“Ｔ”形構造が形成される。この配置は好適である、なぜならばビオチニル化（またはこれに匹敵する）ＩＬＯが容易に生成し、アビジン−コーテッド固体サポートと混じることができるからである。その後、Ａ章に詳しく述べたように、標的配列を含むサンプルを不溶化３’− ＩＬＯ、ポリメラーゼ酵素及びｄＮＴＰｓと混ぜ合わせる。適切なサイクリング後、不溶化３’−ＩＬＯの３’末端は酵素的に延長する。その後、不溶化物質（すなわちＣＰＧまたは匹敵する物質）を反応器から取り出し、上記のようにＡＳＯｓで調べることができる。発明のこの実施態様のために我々が用いた好適固体サポート物質はアミノ化ポリプロピレンである；これはコーシン（Coassin,P）などの米国出願番号第07/971,100号、ヨーロッパ出版物N o. 、タイトル“表面活性有機ポリマーを用いるビオポリマー合成（Biopol ymerSynthesis Utilizing Surface Activated Organic Polymers）”に開示されている−−これは参考としてここに完全に挿入される（以後は“コーシンなど” と記載する）。Ｇ．“問題の塩基配列”を増幅すべき標的配列に組み込むためのＩＬＯ利用問題の塩基配列を標的塩基配列に組み込むことが望ましいことはよくある；例えば、制限酵素部位をアンプリコンの１つの末端または複数末端に組み込み、そのアンプリコンが同じ制限部位を含むサブクローニングベクターに容易に組み込まれるようにすると好都合である。この目的を達するためには、最も好適には、制限部位配列の相補的部分を逆連鎖近くのＩＬＯ領域に組み込んで、標的配列に相補的なＩＬＯ領域がＩＬＯ末端に位置するようにした変形ＩＬＯを作る。例えばＣｌａＩ部位（５’−ＡＴＣＧＡＴ−３’）及びＢａｍＨＩ部位（５ ’−ＧＧＡＴＣＣ−３’）をＩＬＯに組み込み、増幅した標的がこれらの部位を組み込むことが望ましい場合は、ＩＬＯは次のような塩基配列をもつのがよい：（選択した酵素によっては、スペーシング塩基（“Ｎ”）が必要である。使用するスペーシング塩基数は使用する酵素に依存する。熟練せる当業者はこの数を決めることができる。）増幅時に生成したＩＬＯ生成物はＢａｍＨＩ及びＣｌａＩ部位の両方を含むことは当然である。その後ＩＬＯ生成物をそれぞれの制限酵素で消化すると、そのＩＬＯ生成物はこれらの部位で切断され、“粘着末端”を生ずる；これは対応する“粘着末端”を有する例えばサブクローニングベクターに容易に挿入される。Ｆ．環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンを切断して“天然”ＤＮＡを生成する図５は環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンから“天然”ＤＮＡを生成する模式図を示す。このプロトコールの目的は、生成した環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンが少なくとも２つの制限酵素部位を含むように標的配列を増幅し、環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンをこれらの部位で切断して天然二本鎖ＤＮＡを生成することである。天然二本鎖ＤＮＡは例えば適切なサブクローニングベクターに挿入するために用いられる。制限酵素部位がＥ章にすでに示したようにＩＬＯに組み込まれるのが最も好適である。Ｇ．ＩＬＯアンプリコンの“精製”のための処理実施例に詳細に示すように、ＩＬＯアンプリコンはセルフプライミングしやすい、すなわちｄＮＴＰｓ及びポリメラーゼ酵素の存在下でＩＬＯアンプリコンは環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンに“変換”し得る。実施例にさらに示すように、３’−ＩＬＯｓから生成した環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンは、その配座的性質により、３’−ＩＬＯアンプリコンに比べて５’−エキソヌクレアーゼによる消化により強く抵抗する。このアプローチの模式図は図６に描かれる。ＩＬＯアンプリコンのほとんどすべてを環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンに変換した後、混合物を５’エキソヌクレアーゼにさらす；我々はこの混合物中に残っている最も多い検出可能生成物が環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンであることを明らかにした。ＩＬＯが３’−ＩＬＯである場合、好適なエキソヌクレアーゼは５’−エキソヌクレアーゼである。好適な５’エキソヌクレアーゼとしてはバクテリオファージλエキソヌクレアーゼ及びＴ７ジーン６エキソヌクレアーゼがある。例限定するものではなくかつ限定するものとして解釈されるべきではない以下の例は、本発明の特に好ましい実施態様である、単−ＩＬＯ分子を使用した核酸高分子の増幅に関するものである。Ｉ．物質、方法、装置、特定逆連鎖オリゴヌクレオチドＡ．装置１）オリゴヌクレオチドとＩＬＯの合成天然のオリゴヌクレオチドとＩＬＯの合成を、ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレイテッド（Beckman Instruments，Inc.）（カリフォルニア州、フラートン）のオリゴ（OLIGO）１０００自動化ＤＮＡ合成装置で、ホスホルアミダイトをベースとする化学プロトコールを使用して行なった。便宜上、ＩＬＯは、２つの装置を使用してつくった。即ち、最初のオリゴ１０００合成装置においては、「従来の」ホスホルアミダイトを利用してＩＬＯの第１の部分を形成し、次に、カラムを逆ホスホルアミダイトを含む第２の装置に移し、ＩＬＯの第２の部分を形成した。２）毛管ゲル電気泳動（「ＣＧＥ」）ＩＬＯの毛管電気泳動分析を、ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレイテッドのＰ／ＡＣＥ（商標）２０００高性能毛管電気泳動装置で行なった。２７ｃｍ、内径が１００μｍのカラム［アリゾナ州、フェニックスのポリマイクロ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Polymicro Technologies，Inc.）］を利用し、重合ポリアクリルアミドゲルカラムのインハウス製造を９％Ｔを使用して行なった。サンプルを界面動注入法（７．５ｋＶ、３．０秒）によりカラムに装填し、分離を３００ｖ／ｃｍで行ない、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン−ボレートをランニング緩衝剤として使用した。サンプル濃度を１．０ＯＤ／ｍｌにして、吸光度検出をＯＤ_{260nm while}で行なった。３）サーマルサイクラーパーキン・エルマ・サーマル・サイクラー４８０（Perkin Elmer Thermal Cyc ler 480）（商標）を利用した。更に、ナショナル・ラブネット・カンパニー（N ational Labnet Company）のサーマル・リアクタ・ハイブリッド・サイクラー（ Thermal Reactor Hybrid Cycler）も使用した。製造者の指示に従った。Ｂ．商業的に入手可能なプロトコール１）ポリメラーゼ鎖反応（「ＰＣＲ」）バクテリオファージラムダターゲットセグメントの７６３０を介してのヌクレオチド７１３１の増幅（amplification）をアンプリタグＤＮＡポリメラーゼを用いるパーキンエルマのセタスジーンアンプ（CetusGeneAmp）（商標）ＤＮＡ増幅試薬キット（パート番号Ｎ８０１−００５５）を使用して行なった。製造者の指示に従った。ジーンアンプキットは、増幅に関して以下のプライマを含む。（ａ）センス（配列番号１）（ｂ）アンチセンス（配列番号２）２）プライマのビオチニル化ＩＬＯの逆連鎖領域でのビオチニル化を、ビオチン−ＯＮ（Bioch in-ON）（商標）ホスホルアミダイト［カリフォルニア州、パロ・アルトのクローンテック・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Clonetech Laboratories ,Inc.）、パート番号５１９１］を使用して行なった。ビオチニル化ＩＬＯは、利用前は精製しなかった。製造者の指示に従った。Ｃ．試薬１）オリゴ１０００ＤＮＡ合成装置：ホスホルアミダイト類逆連鎖オリゴヌクレオチド用のオリゴヌクレオチドの合成を、リバース・ホスホラミジツ（Reverse Phosphoramidites）（赤外）およびベックマン・インスツルメンツ・インコーポレイテッドのバイナリーパック（BINARY-PAK）（商標）ホスホルアミダイト類（ｄＡＣＢｚ）−パート番号３３７７３７、ｄＣ（Ｂｚ）− パート番号３３７７３８、ｄＧ（ｃｂｕ）−パート番号３３７７３９、Ｔ−パート番号３３７７４６；ＤＮＡシンセシス・リアジェント・キット（DNA Synthesi s Reagent Kit）［オキシダイズ（Oxidize）−パート番号３３７７３２、デブロック（DEblock）−パート番号３３７７３３、キャップ１（Cap 1）−パート番号３３７７３４、キャップ２−パート番号３３７７３５］；アクチベート・リアジェント（Activate Reagent）（パート番号３３８２８４）；およびクリベージ・アンド・ディプロテクション・キット（Cleavage and Deprotection Kit）（パート番号３３７７４２）を使用して行なった。合成は、バイオラン（Bioran）制御のポアガラス（ポアサイズ：１０００Å）を使用して行なった。２）逆ホスホルアミダイト（「３’−ＤＭＴ保護」）３’−ＤＭＴ保護デオキシヌクレオシドを図７に記載の概略プロトコールに従ってつくった。簡単に説明すると、プロトコールは、４つのデオキシヌクレオシドの５’ＯＨ基のマスキング用の一時保護基としてｔ−ブチルジメチルシリル（「ＴＢＤＭＳ」）を利用する。保護が行なわれてから、従来のジメトキシトリチル（「ＤＭＴ」）保護基を、従来のＤＭＴ−Ｃｌ／ピリジン処理を使用して３’−ＯＨ基に加える。次に、５’−ＴＢＤＭＳの開裂を弗化物イオンを使用して行なって、所要の３’−ＤＭＴヌクレオシドを提供し、３’−ＤＭＴヌクレオシドを適宜のクロロ−シアノエトキシホスフィンで処理することにより逆アミジトの調製を行なう。反応の効率は、著しい無水状態を保持することができるかどうかに特に依存する。溶媒は、水分含量が最小であるものが最も好ましい。シリル化反応の場合には、ＤＭＦを真空蒸留することにより、ヌクレオシドと溶媒に存在する可能性のある痕跡量の水を共沸除去すべきである。同様に、ＤＭＴ反応の場合には、ピリジンを真空蒸留して、痕跡量の水分を除去するようにすべきである。（このような予防措置を行なっても、追加当量のＴＢＤＭＳ−イミダゾリドまたはＤＭＴ− Ｃｌを添加することが必要となる場合がある。図７参照。）ヌクレオシドの３’領域に結合されるＤＭＴ基の安定性が高められるので、３ ’−ＤＭＴは、５’異性体よりも溶液中で一層安定となる。標準相薄層クロマトグラフィ（「ＴＬＣ」）における３’ＤＭＴヌクレオシドの移行速度は、５’ＤＭＴヌクレオシドよりもはるかに大きい。更に、５’ＴＢＤＭＳエーテルは、３ ’ＴＢＤＭＳエーテルよりも緩慢に流れる。Ｔ逆ホスホルアミダイトを除く他の逆ホスホルアミダイトは、非晶質ガムになる傾向があり、精製のためにクロマトグラフィが必要であり、逆ホスホラミヂトは純粋になるとガラス状の固体になる。（ａ）物質と方法ＴＢＤＭ−ＳｉＣｌ、ＤＭＴ−Ｃｌおよびクロロ−シアノエチルオキシ−ジイソプロイルアミノホスフィンは、ケム・インペックス（Chem Impex）（イリノイ州、ウーデイル）またはアルドリッチ・ケミカルズ（Aldrich Chemicals）（ミズーリー州、セントルイス）から得た。ＴＢＡＦ／ＴＨＦは、アルドリッチから得た。前躯物質ヌクレオシド［ｄＡ（Ｂｚ）、ｄＣ（Ｂｚ）、ｄＧ（ｉＢＵ）およびＴ］は、ケム・インプレックスから入手した。ＴＬＣは、メタノールの塩化メチレン溶液（１％乃至５％）を使用し、アルミニウムプレートに予備コーティングしたシリカゲル［イー・メルク（E．Merck）、カタログ（Cat.）番号５５３４］で行なった。ＴＬＣ展開をＵＶ２５４ｎｍにより行ない、希過塩素酸を噴霧してＤＭＴを検出するとともに、高温空気ガンで炭化してデオキシリボ含有成分の検出を行なった。３’−ＤＭＴ−チミジン−５’−アミジトの調製を以下において説明する。他の逆ホスホルアミダイトの調製を同じプロトコールに従ったので、概略だけを説明する。プリン（ＡおよびＧ）は、ピリミジン（ＴおよびＣ）と比べて、ＴＢＤＭＳおよびＤＭＴ反応において幾分緩慢に反応するが、適正な結果をもたらした。化合物５’−ＴＢＤＭＳ−Ｔ−３’−ＯＨ（Ｃ₁₆Ｈ₂₈Ｎ₂Ｏ₅Ｓｉ、分子量：３５６．５）を次のようにしてつくった。ＴＢＤＭＳｉ−塩化物（２．０４ｇ、１３．６ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、次いで、室温で撹拌しながらイミダゾール（１．８ｇ、２７．２ミリモル）を添加し；その場でＴＢＤＭＳ−イミダゾリドを生成した。この溶液をチミジン（３．０ｇ、１２．４ミリモル）のＤＭＦ撹拌溶液に加えた。１時間後に、反応が完了した。混合物を氷上に注ぎ、生成物を白い固形物として沈澱させ、生成物をろ過し、塩化メチレンと混合し、水に対して２回分配させた。その後、物質をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させて生成物を得た。次に、生成物をエーテル：石油エーテル（１：１）に溶解し、ろ過に供し、乾燥を行なった。最終生成物は量が３．２ｇ（７２％）であり、「Ｔ−１」と称した。５’−ＴＢＤＭＳ−Ｔ−３’−ＯＤＭＴ（Ｃ₃₇Ｈ₄₆Ｎ₂Ｏ₇Ｓｉ、分子量：６５８．８）を以下のようにして調製した。Ｔ−１の２．５ｇ（７ミリモル）をピリジン（１０ｃｃ）に溶解し、ＤＭＴ−Ｃｌ（５．０６ｇ、１５ミリモル）を撹拌しながら加えた。ＴＬＣにより、反応は４時間で完了したことがわかった。メタノール（５ｃｃ）を加え、過剰のＤＭＴ−Ｃｌをクエンチ（quench）し、その後、溶媒を蒸発し、最終生成物「Ｔ−２」をオイルとして得た。（追加当量のＤＭＴ−Ｃｌは反応を完了へ「推進する」のに多くの場合必要であるとともに、過剰のＤＭＴ副生成物はＴＢＤＭＳ基の弗化物脱保護を妨害するものではなく、従って、かかる副生成物の除去は重要であるとは考えられない。）５’−ＨＯ−Ｔ−３’−ＯＤＭＴ（Ｃ₃₁Ｈ₃₂Ｎ₂Ｏ₇、分子量：５４４．５８）を次のようにしてつくった。Ｔ−２をテトラブチルアンモニウムフロライド（「ＴＢＡＦ」）の１．０ＭＴＨＦ溶液２５ｃｃで処理した。ＴＬＣにより、反応は室温において４時間で完了したことがわかった。溶媒を蒸発させ、残留物を塩化メチレンに溶解し、次いで、この物質をシリカゲルカラムに適用し、メタノールの０％乃至２％塩化メチレン溶液で溶出した。得られたガムを少量の塩化メチレンに溶解し、石油エーテルを用いて粉砕した。これにより固体生成物が得られ、これをろ過し、真空乾燥させた。生成物は重量が２．１ｇ（ＴＢＤＭＳ−Ｔ−ＯＨ基準で８２％）であり、「Ｔ−３」と称した。５’−アミジト−Ｔ−３’−ＯＤＭＴ（「逆アミジト：Ｔ」）を次のようにしてつくった。Ｔ−３の１．５ｇ（２．７２ミリモル）をＴＨＦ１０ｃｃに溶解し、次いで、室温でジイソプロピルアミン１．９ｃｃ（１０．８８ミリモル）を添加した。次に、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−シアノエトキシ−クロロホスフィン（１．２ｃｃ、５．４ミリモル）を磁気撹拌を行ないながら混合物に加えるとともに、反応を窒素中で浴処理させた。ＴＬＣ（２％メタノール／塩化メチレン）により、反応は３０分で完了したことがわかり、その後、塩をフィルタ処理し、ＴＨＦを真空下で３０℃で蒸発させた。次に、粗生成物を（無水炭酸ナトリウムで前処理した）酢酸エチルに再溶解し、次いで、無水ＭｇＳＯ₄上で有機層を乾燥し、その後、３０℃で真空蒸発を行なった。これにより、高真空下で発泡するオイルが得られた。（粗生成物を生成する別の方法は、溶媒系として酢酸エチル：石油エーテル（３：１）を使用するＳｉＯ₂カラムクロマトグラフィによるものがある。）逆アミジトＡ、ＣおよびＧを、初期の工程でチミジンの代わりにｄＡ（Ｂｚ）、ｄＣ（Ｂｚ）、およびｄＧ（ｉＢＵ）を使用した点を除いて、同じプロトコールに従ってつくった。３）アミノ化ポリプロピレン：アビジン固体支持体アミノ化ポリプロピレン糸（直径０．０２５４ｃｍ）をコアシン（Coassin）等の論文に開示のようにしてつくった。Ｄ．逆連鎖オリゴヌクレオチド（「ＩＬＯ」）第１の一連の実験においては、利用したＩＬＯは、ジーンアンプキットからのセンスおよびアンチセンスの双方のプライマのシーケンスからなるものであった。２つの比較ＩＬＯ実験を行なったが、一方の実験におけるＩＬＯシーケンスは他方において利用されているものの対となるものであった。これは、ＩＬＯ生成物のＩＬＯの配向において、場合によっては存在する可能性のある差を測定するために行なわれた。この実験におけるＩＬＯシーケンスは、次の通りであった。（１）Ａ−１８０（配列番号３）：（２）Ａ−１８１（配列番号４）：ＩＬＯおよびＰＣＲ比較プライマを、シー・トーマス・キャスキー（C．Thoma s Caskey）［ベイラー・メディカル・カレッジ（Baylor Medical College）、テキサス州ヒューストン）により広く提供されている嚢胞性繊維症遺伝子（野生型）のエクソン（Exon）１０からのアンプリコン（amplicon）の増幅に関する研究のために形成した。（１）Ａ−２４０（配列番号５）：（２）センス（配列番号６）：（３）アンチセンス（配列番号７）種々のインサートをはじめとするブルースクリプト（Bluescript）ｐＢＫＳ＋ファージミド（phagemid）（ストラタジーン（Stratagene）、カリフォルニア州ラヨラ）の分析のため、ＩＬＯおよびＰＣＲ比較プライマを、ファージミドのＴ３およびＴ７プロモータに基づいて形成した。（１）Ａ−１８９（配列番号８）（２）Ｔ３プロモータ、センス（配列番号９）（３）Ｔ７プロモータ、アンチセンス（配列番号１０）：ビオチニル化ＩＬＯはまた、固相ターゲット延長のためにつくった。（１）Ａ−２０６（配列番号１１）ＩＩ．例Ｉ：３’ＩＬＯ酵素増幅酵素増幅反応に関して、ＰＣＲ制御をジーンアンプ（商標）バクテリオファージラムダターゲットの増幅に関する製造者の指示に従って行なった。Ａ−１８０およびＡ−１８１の３’−ＩＬＯ分子を使用したこのターゲットシーケンスの酵素増幅のために、Ａ１８０の１００ピコモルを利用するとともに、Ａ−１８１を１００ピコモル利用した点を除いて、このプロトコールに同じく従い、これらをＡ−１８０およびＡ−１８１の最終濃度をそれぞれ１．０マイクロモルにするために、最終容量１００マイクロリットルの反応混合物に加えた。増幅反応後に、実質上同じアリコットを３つの反応容器のそれぞれから得て、スラブゲル電気泳動（１．５％アガロースゲル）により分析を行なった。結果を図８に示す。図８の結果が示すように、ターゲットシーケンスの指数増幅をＡ−１８０またはＡ−１８１の３’−ＩＬＯを使用して行ない、バンド強度に基づくと、結果はＰＣＲ制御により行なわれた結果に匹敵するものである。更に、ＩＬＯアンプリコンはＰＣＲ増幅生成物よりも「長く」なっており、この差はＩＬＯアンプリコンから延びる別の逆アミジト即ち従来のアミジトによるものであることがわかる［オーバーハング（overhang）］。更に、２つのＩＬＯ生成物レーンはそれぞれ、２つの異なる生成物バンドからなり、低い方の生成物バンドはＩＬＯアンプリコンからなり、一方、高い方のバンドは環状２重鎖ＩＬＯアンプリコンによるものであり、１．５％アガロースが利用されているので、これらのＩＬＯ生成物間の解析（resolution）は「広範に亘る」ものではない。しかしながら、２つの異なるバンドは、ＩＬＯ生成物レーンに確かに現われている。ＩＩＩ．例ＩＩ：ＩＬＯアンプリコンサブタイプ種々の長さのターゲットシーケンスをｐブルースクリプトファージミドに挿入し、インサートをＰＣＲプライマまたはＩＬＯを使用して増幅した。これらの結果は、図９にまとめて示されている。これらの結果および利用されたスラブゲル電気泳動条件によれば、記載されている「予期されるサイズ」はＰＣＲアンプリコンに基づくものであり、ＩＬＯ生成物はオーバーハングまたは環状形状により一層緩慢に流れる。例Ｉの結果とは異なり、例ＩＩの結果は５．０％アガロースゲルで解析されたものである。従って、ＩＬＯ生成物レーンにおいては、少なくとも３つの異なるバンドが解析され、これらの２つは、略同じサイズで解析され、１つは全く異なるサイズで解析されている。最も緩慢なバンドは、二重鎖の態様で互いにハイブリッド化したＩＬＯアンプリコンによるものであり、２つの内の「早い方」は、（２つの「オーバーハング部」を含む）二重鎖の態様でハイブリッド化された２つの部分延長されたＩＬＯアンプリコンであり、２つのうちの「遅い方」は二重鎖の態様でハイブリッド化された１つの部分延長ＩＬＯアンプリコンと１つの完全延長ＩＬＯアンプリコンでありまたは２つの完全延長ＩＬＯアンプリコンである。（ａ）ＣＦエクソン１０：９８ｂｐの予期サイズ増幅されたＣＦ遺伝子のエクソン（Exon）１０の部分は長さが９８ｂｐであった（「ＣＦアンプリコン」）。ＣＦアンプリコンは、ファージミドに次のようにしてサブクローン化された。ＣＦアンプリコンをクレナウ（Klenow）［マニアティス（Maniatis）参照］を使用してブラントエンドされ、連結されたブラントエンドＣＦアンプリコンはＳｍａＩカットファージミドに連結された（「ＣＦサブクローン」）。増幅条件は、各ＰＣＲプライマ（配列番号６および７）の１００ｐモルを利用するとともに、ＩＬＯ（配列番号５）の２００ｐモルを利用した点を除いて、ＩＬＯおよびＰＣＲ条件の双方とも同じであった。増幅は、ハイベイド（Hybaid）サーマルサークラーにおいてパーキン−エルマジーンアンプキットを使用し、１００μｌの全容量で行なった。アルカリ溶菌プラスミドミニ−プレップ１μｌ（〜５０ｎｇＤＮＡ）をテンプレートとして使用した。熱サイクル（４０サイクル）は、９５℃１５秒、６０℃２０秒、７２℃３０秒であった。各反応混合物１０ μｌを５％アクリルアミドゲルの分離レーンに装填し、次いで、エチジウムブロミドを用いて染色を行なった。図９のレーン２は、ＰＣＲアンプリコンであり、レーン３はＩＬＯアンプリコンである。レーン２と３との間に見られるサイズの差は、ＩＬＯアンプリコン生成物の実質上全てが環状形状であり、ＩＬＯアンプリコンの比較的少ないものがレーン３にあることを示している。（図９のレーン１はメリーランド州ベセスダに所在するＢＲＬから得られる１Ｋｂラダー（Iadder）サイズマーカである。）（ｂ）ファージミドからのポリリンカ：１６４ｂｐの予期サイズファージミドからのポリリンカ（polylinker）をターゲットとして利用し、得られたＰＣＲアンプリコンの予期サイズは１６４ｂｐであった。Ｔ３およびＴ７プロモータ領域を、ＰＣＲプライマ（配列番号９および１０）とＩＬＯ（配列番号８）とに利用した。条件は、熱サイクル（４０サイクル）条件が４０サイクルに関して９５℃１５秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒であった点を除いて、例ＩＩ（ａ）の記載と同様であった。図９のレーン４はＰＣＲアンプリコンであり、レーン５はＩＬＯ生成物である。例ＩＩ（ａ）の場合と同様、生成物の実質上全てが環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンであるが、ＩＬＯアンプリコンの出現もまたは明らかである。（ｃ）ポリリンカ＋エクソン１０：２６２ｂｐの予期サイズＣＦ遺伝子（９８ｂｐ）のエクソン１０を、ファージミド（１６４ｂｐ）のポリリンカ領域に上記したようにサブクローニング処理した。それにより、予期されるＰＣＲアンプリコンサイズは２６２ｂｐである。増幅条件は、例ＩＩ（ｂ）に記載の通りであった。図９のレーン６はＰＣＲアンプリコンであり、レーン７はＩＬＯ増幅反応からのものである。明らかなように、このターゲットサイズでは、２つの異なるＩＬＯ副生成物の出現が一層明確となったが、上部バンド（環状形状）は一層強い染色強度を有している。この場合にも、ＩＬＯアンプリコンは、ＩＬＯ成分と上記したハイブリッド化生成物のタイプによる１７ｂｐ「オーバーハング」の包含によりＰＣＲアンプリコンよりも「一層緩慢に」流れている。（ｄ）ポリリンカ＋エクソン１０のタンデムダブルインセット：３６０ｂｐの予期サイズこのターゲットは、予期ＰＣＲアンプリコンが３６０ｂｐとなるようにエクソン１０（９８ｂｐ＋９８ｂｐ）のタンデムダブルインセットがファージミド（１６４ｂｐ）のポリリンカに挿入された点を除いて、例ＩＩ（ｃ）と実質的に同一であった。増幅は例ＩＩ（ｃ）と同様であった。レーン８はＰＣＲアンプリコンであり、レーン９はＩＬＯ増幅反応からのものである。例ＩＩ（ｃ）の場合と同様、２つの異なるＩＬＯ生成物が形成された。（ｅ）ポリリンカ＋ドロソフィラＤＮＡのサブクローン：６２３ｂｐの予期サイズ（前もって配列された）ドロソフィラ（Drosophila）ＤＮＡの４６６ｂｐサブクローンのＰＣＲアンプリコンを、ファージミドのポリリンカ部分のハインド（ Hind）ＩＩＩ部位とエコ（Eco）ＲＶ部位との間に挿入した（このようにすることによりポリリンカの約１７ｂｐが失われ、予期ＰＣＲアンプリコンは６２３ｂｐとなる）。増幅は、例ＩＩ（ｃ）のようにして行なった。レーン１０はＰＣＲアンプリコンであり、レーン１１はＩＬＯ増幅反応からのものである。このターゲット長さでは、ＩＬＯアンプリコンと環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンは双方とも染色強度が略同等である。例ＩＩ（ｆ）−（ｈ）に関する結果を図１０に示すが、これは５％アクリルアミドゲルとは反対に、ターゲットのサイズと２％アガロースゲルの利用の必要とにより必要とされるものであった（即ち、アガロースは例ＩＩ（ｆ）−（ｈ）の一層大きいサイズのアンプリコンを解析するのに必要であった）。図１０のレーン１は１Ｋｂラダーサイズマーカであり、レーン２と３は例ＩＩ（ｅ）の同じ増幅生成物（レーン２：ＰＣＲ、レーン３：ＩＬＯ）であり、これらは比較のために提示されている。増幅条件と分析された物質の量は例ＩＩ（ｅ）に記載の通りであった。（ｆ）ポリリンカ＋ドロソフィラＤＮＡのサブクローン：８４６ｂｐの予期サイズドロソフィラＤＮＡの７２４ｂｐサブクローンのＰＣＲアンプリコンを、ファージミドのポリリンカのハインドＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位との間に挿入した（この処理において、ポリリンカの約４２ｂｐが失われる）。図１０のレーン４はＰＣＲアンプリコンであり、レーン５はＩＬＯ増幅反応からのものである。（ｇ）ポリリンカ＋ドロソフィラＤＮＡのサブクローン：１２８５ｂｐの予期サイズドロソフィラＤＮＡの１１５２ｂｐサブクローンのＰＣＲアンプリコンを、ファージミドのポリリンカのハインドＩＩＩ部位とバム（Bam）ＨＩ部位との間に挿入した（この処理において、ポリリンカの約３１ｂｐが失われる）。図１０のレーン６はＰＣＲアンプリコンであり、レーン７はＩＬＯ増幅反応からのものである。（ｈ）ポリリンカ＋ドロソフィラＤＮＡのサブクローン：１６６５ｂｐの予期サイズドロソフィラＤＮＡの１５２８ｂｐサブクローンのＰＣＲアンプリコンを、ファージミドのポリリンカのハインドＩＩＩ部位とＳｍａＩ部位との間に挿入した（この処理において、ポリリンカの約３７ｂｐが失われる）。図１０のレーン８はＰＣＲアンプリコンであり、レーン９はＩＬＯ増幅反応からのものである。例ＩＩの結果は、図９および１０から明らかなように、ＩＬＯによる酵素増幅が広範囲のターゲット長さ（１００ｂｐ乃至１．５ｋｂ）に亘って可能であることを示している。更に、幾分「小さな」ターゲット（即ち、約２５０ｂｐ以下）の場合には、ＩＬＯアンプリコンの実質上全てが環状形状をなし、その後、ターゲットのサイズが増すにつれて、ＩＬＯアンプリコンの出現が始まるが、環状二重鎖ＩＬＯが、ターゲットのサイズに拘らず、このターゲット範囲に亘って常に形成される。ＩＶ．例ＩＩＩ．環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンの有限形成本明細書全体に記載のように、本発明は、環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンの形成を前提としている。明確な証明は、環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンと推定されるものを二重鎖制限酵素に曝すことにより最も良好に示され、ＰＣＲアンプリコンは対照として作用する。ＰＣＲアンプリコンを消化する（digest）ことにより、ゲル電気泳動を介して２つの生成物を得られるはずである。環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンの消化により、単一のバンドとなるはずであり、この生成物は実際には「リニア」であるが、二重鎖特性を有するので、その切断により生成物を「解放し」または生成物の「フックを外す」ことにより、ＰＣＲアンプリコンと略同じサイズで流れる一体生成物が得られるはずである。これを、図１１に概略示する。例ＩＩ（ｂ）からのＰＣＲアンプリコン（ファージミドポリリンカ）１０μｌを５％アクリルアミドゲルに装填し、エチジウムブロミドで染色した。結果を図１２ａのレーン１に示す。ファージミドポリライナは、ＰＣＲアンプリコンをハインドＩＩＩで消化することにより、９７および６７ｂｐのフラグメントサイズとするように、ハインドＩＩＩ部位を含む。ＰＣＲアンプリコン５０μｌを脱塩し、クロマ・スピン（CHROMA SPIN）＋ＴＥ−１００カラム（クローンテック）を使用して不使用のＰＣＲプライマ分離し、製造者の指示に従った。脱塩し、分離したＰＣＲアンプリコン１０μｌをストラタジーン（Stratagene）により推奨された緩衝液３０μｌ中でハインドＩＩＩ（ストラタジーン）１０単位を用いて１時間消化させ、更に、消化混合物全体を図１２ａのゲルのレーン２に装填した。予期したように、２つのバンドが約９７と６７ｂｐにおいて現われている。例ＩＩ（ｂ）からのＩＬＯ反応混合物１０μｌを図１２ａのレーン３に装填したが、これは推定した環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンである。この反応混合物５０μｌを上記した態様でハインドＩＩＩで処理し、消化混合物全体を図１０ａのレーン４に装填した。この生成物が環状二重鎖物質である場合には、この環状生成物を切断すると生成物を「リニアにする」（"Iinearize"）ので、切断したときに約１６４ｂｐにおいて単一のバンドを示すはずである。レーン４の結果はかかるバンドを示している。（図１１ａのレーン５は１ｋｂラダーサイズマーカである。）例ＩＩ（ｅ）に記載した条件とプロトコールを繰り返し、得られたＰＣＲアンプリコン１０μｌを上記したようにハインドＩＩＩで消化し、消化物全体を図１２ｂのレーン２に装填した（図１１ｂのレーン１は１Ｋｂラダーである）。ＰＣＲアンプリコンが消化されると、２つのバンド、即ち、一方のバンドは約５００ｂｐで得られ、もう一方は約１２５ｂｐで得られるが、この図について大きい方のバンドを解析するため、ゲルを流し落したので小さい方のバンドは視認されていない。レーン２は、ハインドＩＩで消化されたＰＣＲアンプリコンの大きい方のバンドが約５００ｂｐに位置することを示している。比較のため、未処理のＰＣＲアンプリコン１０μｌをレーン３に示すが、これらは、予期した通り、約６２３ｂｐで流れている。図１２（ｂ）のレーン６は、例ＩＩ（ｅ）と同じ条件およびプロトコールに従って例ＩＩ（ｅ）のターゲットシーケンスのＩＬＯ増幅により得られたＩＬＯ生成物のアリコットである。予期した通り、２つの異なるバンド領域が出現し、低い方のバンドはオーバーハングによりＰＣＲアンプリコンよりもわずかに緩慢に流れるＩＬＯアンプリコンである。上方のバンドはＩＬＯ生成物の環状形態である。ＩＬＯ生成物の残りのものは、１．５％低融点アガロースゲルで解析した（結果は示さず）ところ、２つのバンド領域が、ゲルから個々に切断され、ＩＬＯ生成物をフェノール抽出により抽出した［マニアティス参照］。図１２Ｂのレーン４はフェノール抽出物の低い方のバンドのアリコット（ＩＬＯアリコット）であり、これらはレーン６の低い方のバンドと比較的同じ場所で解析される。ＩＬＯアンプリコンをハインドＩＩＩで消化しても同様に、消化されたＰＣＲアンプリコンに近い２つの生成物が得られるはずである。下方のバンド（フェノール抽出物）１０μｌをハインドＩＩで上記のように消化し、消化物質全体を図１２ｂのレーン５に装填した結果、解析したバンドはＩＬＯアンプリコンのオーバーハングにより、比較ＰＣＲ−消化バンドよりもわずかに大きくなっている。レーン７は、フェノール抽出物の上方のバンドのアリコット（環状二重鎖ＩＬＯアリコット）であり、これらはレーン６の上方のバンドと比較的同じ場所で解析される。上方のバンドのフェノール抽出物１０μｌをハインドＩＩＩで上記のように同様に消化し、消化物質全体を図１２ｂのレーン８に装填したところ、これらはＰＣＲアンプリコンと略同じサイズで流れた（比較を容易にするため、レーン３の物質、即ち、未消化ＰＣＲアンプリコンは、図１１ｂのレーン９で同様に流れた）。これらの結果は、ＩＬＯは本質的にリニアであり、一方、環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンは本質的に環状であることを示すものである。Ｖ．例ＩＶ．「オーバーハング」の有限形成例ＩおよびＩＩの結果は、ＰＣＲアンプリコンに対して「一層緩慢に」流れるＩＬＯアンプリコンは、ＩＬＯアンプリコンにオーバーハングを包含することによるものであるとする本発明者の見解を立証するものであるが、本発明者は、ＩＬＯアンプリコンをムングビーン（Mung bean）エキソヌクレアーゼ、単鎖特異エキソヌクレアーゼに曝すことによりこの設題を実験的に試験した。このエキソヌクレアーゼに曝したＩＬＯアンプリコンは、消化されたＩＬＯアンプリコンがスラブゲル（５％アクリルアミド）に対して対応するＰＣＲアンプリコンと同様に流れるように相補的二重鎖ＤＮＡが開始する領域へ張出しから戻って消化されるされるものと考えられる。例ＩＩ（ｅ）のＩＬＯ生成物から得られた下方のバンドは、上記したようにゲルから分離され、上記したように脱塩されたものであり、比較のために、ＰＣＲアンプリコンバンドが同様に分離され、脱塩されている。ＩＬＯアンプリコン１０μｌをムングビーンエキソヌクレアーゼ１単位と混合し、３７℃で３０分間反応に供した。その後、ＰＣＲおよびＩＬＯ分離混合物からの実質上同じアリコットと、消化されたＩＬＯ分離混合物とを上記したように電気泳動が行なわれた５％アクリルアミドスラブゲランドのレーン１、２および３に装填し、次いで、上記したように染色を行なったが、その結果を図１３に示す。図１３のゲルから明らかなように、ＩＬＯアンプリコン（レーン２）は、単鎖オーバーハングによりＰＣＲアンプリコン（レーン１）よりもわずかに緩慢に流れたが、このオーバーハングが消化されると、消化されたＩＬＯアンプリコン（レーン３）はＰＣＲアンプリコンと略同様に流れる。例ＩＩＩの結果によれば、ＩＬＯアンプリコンにオーバーハングが存在すると、ＰＣＲアンプリコンとは異なるスラブゲル横断が容易となる。ＶＩ．例Ｖ：ＩＬＯアンプリコンのセルフプライムＩＬＯアンプリコンが「セルフプライム」（"self-prime"）する能力、即ち、環状二重鎖ＩＬＯアンプリコン形態の形成のテンプレートとして作用する能力は、ＩＬＯ成分に特有の独特の特徴であり、本発明者による知得によれば、ＰＣＲアンプリコンをはじめとする他の増幅生成物はセルフプライムを行なうことができない。ＩＬＯアンプリコンのセルフプライム能力により、得られるＩＬＯ増幅生成物の実質上全てが環状二重鎖形態を有するように増幅反応を「推進する」ことができる。これにより、３’−ＩＬＯの場合には、上記したように５’−オキソヌクレアーゼを使用して生成物を生成し、あるいは、例えばサブクローニングベクタへの挿入のために、得られた環状二重鎖ＩＬＯサンプリコンを切断することができる。図１４について説明すると、レーン１は例ＩＩ（ｃ）からのＩＬＯ増幅生成物（即ち、ＣＦフラグメントサブクローン）１０μｌであり、この場合には、上部バンドは環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンであり、下部バンドはＩＬＯアンプリコンである。例ＩＩＩにおいて説明したように、反応生成物のアリコットは低融点アガロースに関して解析され、双方のバンド領域を上記したように分離して脱塩し、脱塩したＩＬＯ生成物３０μｌを例ＩＩ（ｃ）の同じ反応成分（即ち、ＩＬＯ、ターゲット、ｄＮＴＰｓ、酵素）に加えるとともに、混合物を例ＩＩ（ａ）において説明したようにして４０サイクルの熱サイクルに供した。得られた生成物３０μｌ（３倍希釈により、レーン１に装填された１０μｌと当量）をゲルのレーン２に装填したが、比較バンド強度に基づけば、一層多い生成物がレーン２の反応において形成されており、これは、ＩＬＯ生成物が追加の生成物形成のターゲットとして機能するので、予期されたものである。その後、追加のＩＬＯを混合物に加えなかった点を除いて、脱塩したＩＬＯ生成物３０μｌを例ＩＩ（ｃ）と同様に反応において利用した（即ち、反応成分は脱塩されたＩＬＯ生成物、ｄＮＴＰｓおよび酵素である）。得られた生成物３０μｌをゲルのレーン３に装填し、解析を行なった。明らかなように、レーン３の強いバンドは、レーン１の環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンと実質上同じ領域において解析されている。この反応においてはＩＬＯは利用されておらず、しかも下方のバンドは実際には「消えている」ので、ＩＬＯアンプリコンの前提とされているセルフプライム能力が形成されており、「ターゲットのない」環境（即ち、ｄＮＴＰｓ、酵素、ＩＬＯ生成物）においては、ＩＬＯアンプリコンは、環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンに変換されるようにセルフプライムすることができた。このように、増幅生成物（ＩＬＯアンプリコン）は、異なる増幅生成物を形成するテンプレートとして作用することができることがわかる。ＶＩＩ．例ＶＩ：エキソヌクレアーゼの精製例ＩＩ（ｂ）の条件とプロトコールに従い、得られたＰＣＲアンプリコン１０ μｌを図１５のゲルのレーン４（５％アクリルアミド）に装填し、ＩＬＯ生成物１０μｌをレーン３に装填した。図１５のレーン２は、ＰＣＲアンプリコン５μ ｌとＩＬＯ生成物５μｌとの混合物であり、得られたバンドは、予期した通り、レーン３および４のバンドと略同じ位置にある。ＰＣＲアンプリコン５μｌとＩＬＯ生成物５μｌとの混合物に、ジーン６エキソヌクレアーゼ（ＵＳＢ）１単位を加えたが、このエキソヌクレアーゼは５’特異的である。反応は３７℃で１時間行なわれた。混合物全体を、図１５のゲルのレーン１に装填した。明らかなように、ＰＣＲアンプリコンは、予期したようにレーン１には存在していない。レーン１の主な残りのバンドは、環状二重鎖ＩＬＯアンプリコンに対応する。この生成方法を使用することにより、ＩＬＯ生成物の環状形態をＩＬＯアンプリコンおよびＰＣＲアンプリコンと区別することができる。ＶＩＩＩ．例ＶＩＩ：ＩＬＯ反応の特異性ＩＬＯがターゲットを複合ゲノムバックグラウンドから選択することができるようにするために、以下の実験を行なった。結果を図１６に示す（レーン１は１Ｋｂラダーである）。レーン２および３は、例ＩＩ（ｂ）のＰＣＲアンプリコンおよびＩＬＯ生成物の各１０μｌを示す（条件およびプロトコールは例ＩＩ（ｂ）に記載の通りである）が、これらは比較のために提供されている。レーン４および５は、ヒトＤＮＡ（プロメガ）０．５μｇを反応混合物に加えて複合ゲノムバックグラウンドを形成した点を除いて、（上記したように繰り返される）例ＩＩ（ｂ）のＰＣＲおよびＩＬＯ生成物の各１０μｌを示す。この例の残りの部分については、テンプレート（即ち、ポリリンカの部分がターゲットシーケンスであるファージミド）の量を連続して希釈した点を除いて、全ての条件はレーン４および５の生成物を得た条件と同じであった。図１６のテンプレートの量と対応するレーンは次の通りである。例ＶＩＩＩの結果によれば、ＩＬＯは複合ＤＮＡと相互混合される広範囲のターゲットシーケンス濃度に亘ってターゲットシーケンスを特定的に選択しかつ増幅することができる。ＩＸ．例ＶＩＩＩ：固相３’ＩＬＯターゲット延長Ａ−２０６はビオチニル化３’−ＩＬＯであり、ビオチン分子はビオチニル化ｄＡＴＴホスホルアミダイトを介してインターヌクレオチド結合部に提供された。ＣＺＥ（カラム：２７ｃｍ、ポリアクリルアミドゲル、９％Ｔ）によるＡ−２０６の分析は、単一の主生成物の形成（データは示さず）を示す単一のピークを明らかにしている。蛋白質であるアビジンは、ＣＺＥ毛管カラムを通過しない。Ａ−２０６のアリコットを、溶液中で（ＦＩＴＣの標識が付された）アビジンと混合し、この混合物のアリコットを上記したＣＺＥ条件に曝した。ピークは観察されず、これは、Ａ−２０６がビオチン成分を含む（データは示さず）、即ち、Ａ−２０６：アビジン抱合体が毛管カラムを通るのをＡ−２０６のビオチン部分とアビジンとの抱合により阻上されることを示している。共有結合されたアビジンを有するアミノ化ポリプロピレンを次のようにしてつくった。無水スクシネート（０．１００６０ｇ）を５００μＭのＮａＡｃ１０ｍｌ、ｐＨ５．５５に溶解した。１０ｃｍの長さのアミノ化ポリプロピレン糸（ thread）を酢酸緩衝液に浸し、緩衝液のデカウント後、無水スクシネート２ｍｌを糸に加え、反応容器にキャップをした。容器を回転しながら、反応を室温で２４時間進めた。次に、糸を、２ｍｌの酢酸塩緩衝液で２回、２ｍｌの水で２回、２ｍｌの無水ＩＰＡイソプロピルアルコール（「ＩＰＡ」）で３回リンスした。次いで、１−エチル−３（−３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ［ピアス（Pierce）♯２２９８０］０．０５６７１ｇを１５ｍｌの無水ＩＰＡに溶かした溶液をつくり、この溶液８ｍｌを糸に加えた。この反応を、容器を回転しながら室温で２時間進めた。次に、糸を３ｍｌのＩＰＡで２回リンスした。次に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ピアス♯２４５００）０．１０１５６ｇを無水ＩＰＡ１５ｍｌに溶解して溶液をつくり、この溶液２ｍｌを糸に加えた。この反応を、容器を回転しながら、４℃で約４８時間、次いで、室温で１時間進行させた。次に、糸を氷で冷やしたＮａＡｃ（１０μＭ、ｐＨ５）でリンスし、氷の上に置いた。予め調製したアビジンストック溶液（５００μｍのＮａＨＣＯ₃の溶液、ｐＨ８．０）５００μｌ（１ｍｇ）を糸に加え、次いで、重炭酸塩緩衝液５００μｌで希釈した。この反応を、容器を回転しながら、室温で４時間行なわせ、次いで、糸を氷の上に約２０時間置いた。共有結合されたアビジンを有するアミノ化されたポリプロピレン糸を、次に、２ｍｌのＮａＨＣＯ₃で２回、２ｍｌの０．１５ＭＮａＣｌで２回、２ｍｌのＨＲＰ緩衝液で２回リンスした。便宜上、この糸を「ｐｐ−アビジン」と云う。ビオチニル化ＩＬＯのＡ−２０６の２０μｌと、ヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）の２０μｌとを、ｐｐ−アビジン５ｍｍの部分と混合し、反応を室温で一晩行ない、次いで、糸を１００μｌの水で５回洗浄した。便宜上、この糸を「ｐｐ−アビジン：Ａ−２０６」と云う。ｐｐ−アビジン：Ａ−２０６の５ｍｍの部分と、非アミノ化ポリプロピレン糸（対照）の５ｍｍの部分をそれぞれ、ＰＣＲ緩衝液［セタス（cetus kit）］１０μｌ、テンプレート（セタス）１１μｌ、水６９μｌ、マスターミックス（ｄＡＴＰ１０μｌ、ｄＣＴＰ１０μｌ、ｄＧＴＰ１０μｌ、ＴＴＰ１０μｌ、水７．５μｌ、酵素２．５μｌ）１０μｌと混合した。Ａ−２０６の酵素延長を、１分５５℃、１分７２℃および１分９４℃のサイクルを３５サイクル行なった。これらのサイクル後に、糸を、１００μｌの水で３回、１００μｌのフェノール／ＣＨＣｌ₃で２回および１００μｌのＣＨＣｌ₃で３回リンスした。「酵素延長」（"enzymatic elongation"）なる語は、定義されている「増幅」（"amplification"）それ自体が意図されていない場合に利用される。むしろ、２つの３’末端からの固定化ＩＬＯの延長が予期される。この延長が生ずる場合には、ＩＬＯにハイブリッド化するテンプレートの相補部が形成されて、対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）とのプロービング（probing）が可能となる。２つのＡＳＯシーケンスを選択したが、一方はセタステンプレートのヌクレオチド７１６１−７１７０に対して相補性があり、もう一方はテンプレートのヌクレオチド７３７２−７３８１に対して相補性があるものであった。各ＡＳＯは、Ｔ₄ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵＳＢ、カタログ番号７００３１）を使用してアデノシン５ ’−［γ−³²Ｐ］トリホスフェート［アマーシャム（Amersham）カタログ番号ＡＣ９３０３］の標識を付した。配列は下記の通りである。Ａ−２３５（ヌクレオチド７１６１−７１７０）（配列番号１２）：Ａ−２３６（ヌクレオチド７３７２−７３８１）（配列番号１３）：ＡＳＯとのハイブリッド化条件は次の通りであった。対照糸とｐｐ−アビジン：Ａ−２０６（推定酵素延長）のそれぞれを９５℃の水２００μｌにおいて２０分間加熱し、次いで、水を除去し、糸をそれぞれ６ｘＳＳＰＥ緩衝液２０μｌに入れた。次に、標識が付されたＡ−２３５の５μｌを対照の糸に加えるとともに、Ａ−２３５の５μｌをｐｐ−アビジン：Ａ−２０６に加え、反応を室温で４時間続けた。その後、各糸を１００μｌの２ｘＳＳＰＥ緩衝液で６回洗浄し、次いでＣＰＭを計数した。Ａ−２３５でプローブしたｐｐ−アビジン：Ａ−２０６の計数は２８５であった。次に、これらのＡＳＯ−結合糸をそれぞれ９５℃の水２００μｌにおいて２０分間加熱して、結合されているＡＳＯの実質上全てを除去した。次に、これらの糸を、標識を付したＡ−２３５に関して説明した条件の下で、標識を付したＡ−２３６とプローブし、上記したようにリンスし、次いで、ＣＰＭを得た。標識を付したＡ−２３６でプローブしたｐｐ−アビジン：Ａ−２０６については、計数は１，０１５であり、Ａ−２３６でプローブした対照糸は計数が１９７であった。これは、約５：１の比である。Ａ−２３５ＡＳＯでのプローブ処理はまた、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ［ダイナビーズ（Dynabeads）（登録商標）Ｍ−２８０、製造番号１１２．０５］を用いて行なわれた。支持物質の製造については製造者の指示に従った。磁気ビーズへのビオチニル化ＩＬＯ（Ａ−２０６）の取着は、上記したように行なわれた（これらは「ｍａｇ．−Ａ−２０６」と呼ばれ、対照ビーズは「ｍａｇ．」と呼ばれている）。略等量のｍａｇ．−Ａ−２０６とｍａｇ．とが利用された。ｍａｇ．−Ａ−２０６とｍａｇ．の双方に対して、ＰＣＲ緩衝液（セタスキット）１０μｌ、テンプレート１μｌ、アンプリコンテンプレート５μｌ、水７４ μｌ、マスターミックス（ｄＡＴＰ８μｌ、ｄＣＴＰ８μｌ、ＤＧＴＰ８μｌ、ＴＴＰ８μｌ、水３８μｌ、タグ（Tag）酵素２μｌ）１０μｌを加えた。熱サイクルを上記のようにして行ない、次いで、³²Ｐ−標識ＡＳＯ表示Ａ−２３５を使用して、上記したのと同じ条件で洗浄およびハイブリッド化を行なった。ＣＰＭ計数は、ｍａｇ．−Ａ−２０６が１，４６０であり、ｍａｇ．が３４２であった。これは比が４：１であることを示している。これらの結果は、ターゲットシーケンスを使用したＩＬＯの固相延長が可能であることを示しており、実際に、ターゲットは「増幅」され、例えば臨床サンプルにおけるかかるターゲットの存在は、上記したように、ＡＳＯでのプローブ処理により測定することができる。以上のように詳細に説明したが、例は説明のために提供されているものであって、限定を意味するものではない。当業者の能力範囲内にある上記した技術に関する修正と改良は、請求の範囲内に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者コンラッド、ケネスディーアメリカ合衆国 90814 カリフォルニア州ロングビーチイー５スストリート 3706 (72)発明者ランパル、ジャンビーアメリカ合衆国 92687 カリフォルニア州ヨーバリンダビアカナリアス 20470 (72)発明者クック、ロナルドエムアメリカ合衆国 94903 カリフォルニア州サンラファエルマークドライブ 40

Claims

【特許請求の範囲】１．鎖と相補的鎖とを含んでなる二本鎖核酸巨大分子の増幅方法であって：（ａ）相補的鎖から鎖を分離し；（ｂ）鎖と相補的鎖とを少なくとも１つの３’−逆連鎖オリゴヌクレオチド（ＩＬＯ）に供する段階であって、ここで、それぞれの３’−ＩＬＯの配列が同じであり、それぞれのＩＬＯが、前記鎖上の領域に相補的な第１の配列部分と、前記相補的鎖上の領域に相補的な第２の配列部分とを含んでなり、これらの領域が互いに相補的となっておらず、前記３’−ＩＬＯの第１の配列部分が前記鎖上の前記領域にハイブリッド化するかまたは前記３’−ＩＬＯの第２の配列部分が前記相補的鎖上の前記領域にハイブリッド化して、前記鎖または前記相補的鎖にハイブリッド化した３’−ＩＬＯがそれぞれ前記鎖または前記相補的鎖に沿って延長されてＩＬＯ生成物をつくる条件下で、鎖と相補的鎖とを少なくとも１つの３’−逆連鎖オリゴヌクレオチド（ＩＬＯ）に供し、；そして（ｃ）ＩＬＯ生成物を鎖と相補的鎖から分離し、段階（ｂ）を少なくとも１回繰り返し、ここで少なくとも１つのＩＬＯ生成物が第２の３’−末端に相補的な第１の３’−末端を有し、前記第１の３’−末端が前記第２の３’−末端にハイブリッド化されている各段階を含んでなる方法。２．前記３’−ＩＬＯが２つの３’−末端を含んでいる請求項１の方法。３．前記３’−ＩＬＯ末端が標識を含んでいる請求項１の方法。４．前記標識が、前記逆連鎖に位置している請求項３の方法。５．前記３’−ＩＬＯの長さが約８ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドである請求項１の方法。６．前記巨大分子がヒトゲノムＤＮＡである請求項１の方法。７．前記ＩＬＯ生成物が、ＩＬＯアンプリコン、マルチマーＩＬＯアンプリコンおよび環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンからなる群から選択される請求項１の方法。８．前記ＩＬＯアンプリコンが、部分的に延長されたＩＬＯアンプリコンと完全に延長されたＩＬＯアンプリコンとからなる群から選択される請求項７の方法。９．請求項１の方法により得られるＩＬＯ生成物。１０．ＩＬＯアンプリコン、マルチマーＩＬＯアンプリコンおよび環状二本鎖ＩＬＯアンプリコンからなる群から選択された請求項９のＩＬＯ生成物。１１．前記ＩＬＯアンプリコンが、部分的に延長されたＩＬＯアンプリコンおよび完全に延長されたＩＬＯアンプリコンからなる群から選択される請求項１０のＩＬＯ生成物。１２．鎖と相補的鎖とを含んでいる二本鎖核酸巨大分子の分析方法であって：（ａ）鎖を相補的鎖から分離し；（ｂ）鎖と相補的鎖とを不溶化した３’−ＩＬＯに供する段階であって、前記３’−ＩＬＯが、少なくとも１つの逆連鎖を含んでなり、前記３’−ＩＬＯが前記逆連鎖を介して固体支持体に不溶化されていて、それぞれの３’−ＩＬＯが、前記鎖上の領域に相補的な第１の配列部分と前記相補的鎖上の領域に相補的な第２の配列部分とを含み、これらの領域が互いに相補的になっておらず、前記３’−ＩＬＯが、前記３’−ＩＬＯがハイブリッド形成の領域に沿って延長される条件下で（ｉ）前記鎖、（ｉｉ）前記相補的鎖、（ｉｉｉ）前記鎖と前記相補的鎖からなる群のハイプリッド形成メンバーにハイブリッド化し；そして（ｃ）前記ハイブリッド形成メンバーを前記延長され不溶化された３’−ＩＬＯから分離する各段階を含んでなる方法。１３．段階（ｂ）が段階（ｃ）の後に少なくとも１回繰り返される請求項１２の方法。１４．特定の配列の存在が、前記延長され不溶化された３’−ＩＬＯ上で検出され、前記特定の配列が、前記鎖上の領域に相補的な前記第１の配列部分および前記３’−ＩＬＯの前記相補的な鎖上の領域に相補的な第２の配列部分とは異なっている請求項１２の方法。１５．前記検出が、対立遺伝子特定オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）による請求項１２の方法。１６．前記ＡＳＯが標識されている請求項１５の方法。１７．３’−ＩＬＯが少なくとも１つの逆連鎖を含み、前記３’−ＩＬＯが前記逆連鎖を介して不溶化されている不溶化された３’−ＩＬＯ。