ES2609655T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con tristetraprolina (TTP) mediante inhibición de transcrito antisentido natural para TTP - Google Patents

Tratamiento de enfermedades relacionadas con tristetraprolina (TTP) mediante inhibición de transcrito antisentido natural para TTP Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido que se dirige a un transcrito antisentido natural de tristetraprolina (TTP) para uso como un compuesto terapéutico, donde el oligonucleótido modula la expresión de tristetraprolina (TTP) y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se expone en una de las SEQ ID NO: 3-5.

Description

DESCRIPCION
Tratamiento de enfermedades relacionadas con tristetraprolina (TTP) mediante inhibicion de transcrito antisentido natural para TTP.
CAMPO DE LA INVENCION
La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos No. 61/175.812 presentada el 6 de mayo de 2009.
10
Aspectos de la divulgacion comprenden oligonucleotidos que modulan la expresion y/o la funcion de TTP y moleculas asociadas.
ANTECEDENTES
15
La hibridacion de ADN-ARN y ARN-ARN es importante para muchos aspectos de la funcion del acido nucleico que incluyen replicacion, transcripcion y traduccion de ADN. La hibridacion tambien es fundamental para diversas tecnologfas que tanto detectan un acido nucleico particular como alteran su expresion. Los nucleotidos antisentido, por ejemplo, alteran la expresion genica hibridandose con el ARN diana, interfiriendo asf con el splicing, 20 transcripcion, traduccion y replicacion de ARN. El ADN antisentido tiene la caracterfstica anadida de que los hfbridos de ADN-ARN sirven de sustrato para la digestion por ribonucleasa H, una actividad que esta presente en la mayorfa de los tipos celulares. Las moleculas antisentido pueden administrarse a celulas, como es el caso de los oligodesoxinucleotidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endogenos como moleculas de ARN. La FDA aprobo recientemente un farmaco antisentido, VITRAVENE™ (para el tratamiento de retinitis por citomegalovirus), 25 que refleja que el antisentido tiene utilidad terapeutica.
RESUMEN
La invencion se define por las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente divulgacion que constituyen 30 la invencion se definen por las reivindicaciones.
Este resumen se proporciona para presentar un resumen de la divulgacion para indicar brevemente la naturaleza y sustancia de la divulgacion. Se presenta con la comprension de que no se usara para interpretar o limitar el alcance o significado de las reivindicaciones.
35
En un aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos de inhibicion de la accion de un transcrito antisentido natural usando oligonucleotido(s) antisentido dirigido(s) a cualquier region del transcrito antisentido natural produciendo la regulacion positiva del gen sentido correspondiente. Tambien se contempla en el presente documento que la inhibicion del transcrito antisentido natural puede lograrse por siRNA, ribozimas y moleculas 40 pequenas, que se considera que estan dentro del alcance de la presente divulgacion.
Un aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido de TTP en celulas o tejidos de un paciente in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud donde dicho oligonucleotido tiene al menos el 50% de 45 identidad de secuencia con un complemento inverso de un polinucleotido que comprende de 5 a 30 nucleotidos consecutivos dentro de los nucleotidos 1 a 970 de la SEQ ID NO: 3, 1 a 1117 de la SEQ ID NO: 4 y 1 a 297 de la SEQ ID NO: 5 (figura 3) modulando de este modo la funcion y/o expresion del polinucleotido de tTp en celulas o tejidos de un paciente in vivo o in vitro.
50 En otro aspecto preferido, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos de TTP, por ejemplo, nucleotidos expuestos en la SEQ ID NO: 3 a 5, y cualesquiera variantes, alelos, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a estos. Ejemplos de oligonucleotidos antisentido se exponen como las SEQ ID NO: 6 a 10 (figura 4).
55 Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion funcion y/o expresion de un polinucleotido de TTP en celulas o tejidos de un paciente in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con un complemento inverso del antisentido del polinucleotido de TTP; modulando de este modo la funcion y/o expresion del polinucleotido de TTP en celulas o tejidos de un paciente in vivo o in vitro.
Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulacion de la funcion y/o expresion de un polinucleotido de TTP
en celulas o tejidos de un paciente in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con un
oligonucleotido antisentido de 5 a 30 nucleotidos de longitud donde dicho oligonucleotido tiene al menos un 50% de 5 identidad de secuencia con un oligonucleotido antisentido para un polinucleotido antisentido de TTP; modulando de este modo la funcion y/o expresion del polinucleotido de TTP en celulas o tejidos de un paciente in vivo o in vitro.
En un aspecto preferido, una composicion comprende uno o mas oligonucleotidos antisentido que se unen a polinucleotidos de TTP sentido y/o antisentido.
10
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden uno o mas nucleotidos modificados o sustituidos.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden uno o mas enlaces modificados.
15 En otro aspecto mas, los nucleotidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden fosforotioato, metilfosfonato, acidos nucleicos peptfdicos, 2'-O-metilo, fluoro- o carbono, metileno u otras moleculas de acido nucleico bloqueado (LNA). Preferentemente, los nucleotidos modificados son moleculas de acido nucleico bloqueado, que incluyen a-L-LNA.
20 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos se administran a un paciente por via subcutanea, por via intramuscular, por via intravenosa o por via intraperitoneal.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos se administran en una composicion farmaceutica. Un regimen de tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; sin embargo, este 25 tratamiento puede modificarse para incluir multiples dosis durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse con uno o mas otros tipos de terapias.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos estan encapsulados en un liposoma o unidos a una molecula portadora (por ejemplo, colesterol, peptido TAT).
30
Otros aspectos se describen mas adelante.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
35 Figure 1:
La figura 1 es un grafico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces + la desviacion estandar en ARNm de TTP despues del tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparacion con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de TTP en celulas HepG2 se incrementan significativamente 48 h despues del 40 tratamiento con dos de los siARN disenados para TTP antisentido Hs.702367 (CUR-0370 y CUR-0372), dos siARN disenados para TTP antisentido AL513578 (CuR-0368 y CUR-0336) y un siARN disenado para BG012178 (CUR- 0364). Las barras indicadas como CUR-0364, CUR-0366 y CUR-0368, CUR-0370 y CUR-0372 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NO: 6 a 10 respectivamente.
45 La figura 2 muestra
SEQ ID NO: 1: protefna con dedos de zinc 36 de Homo sapiens, tipo C3H, homologo (raton) (ZFP36), ARNm (No. de acceso al NCBI: NM_003407).
SEQ ID NO: 2: Secuencia genomica de TTP (los exones se muestran en letras mayusculas, los intrones en pequeno).
50
La figura 3 muestra
SEQ ID NO: 3: Secuencia antisentido de TTP natural (Hs.702367)
SEQ ID NO: 4: Secuencia antisentido de TTP natural (AL513578)
SEQ ID NO: 5: Secuencia antisentido de TTP natural (BG012178)
55
La figura 4 muestra los oligonucleotidos antisentido, SEQ ID NO: 6 a 10. 'r' indica ARN.
La figura 5 muestra los oligonucleotidos sentido, SEQ ID NO: 11 a 15. Los oligonucleotidos sentido SEQ ID NO: 11 a 15 son los complementos inversos de los oligonucleotidos antisentido SEQ ID NO: 6 a 10 respectivamente. 'r' indica
ARN.
DESCRIPCION DETALLADA
5 Varios aspectos de la divulgacion se describen a continuacion con referenda a aplicaciones de ejemplos para ilustracion. Debe entenderse que los numerosos detalles, relaciones y procedimientos espedficos se exponen para proporcionar un entendimiento completo de la divulgacion. Un experto en la materia relevante, sin embargo, reconocera facilmente que la divulgacion puede ponerse en practica sin uno o mas de los detalles espedficos o con otros procedimientos. La presente divulgacion no esta limitada por la ordenacion de actos o acontecimientos, dado 10 que algunos actos pueden producirse en ordenes diferentes y/o concurrentemente con otros actos o acontecimientos. Ademas, no todos los actos o acontecimientos ilustrados se requieren para implementar una metodologfa de acuerdo con la presente divulgacion.
Todos los genes, nombres de genes y productos genicos descritos en el presente documento pretenden 15 corresponderse con homologos de cualquier especie para las que son aplicables las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento. Por lo tanto, los terminos incluyen, aunque no se limitan a, genes y productos genicos de seres humanos y ratones. Se entiende que, cuando se describe un gen o producto genico de una especie particular, la presente divulgacion pretende ser a modo de ejemplo solamente, y no debe interpretarse como una limitacion, a menos que el contexto en el que aparece lo indique claramente. De este modo, 20 por ejemplo, los genes descritos en el presente documento, que en algunos casos se refieren a secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos de mairnfero, pretenden englobar genes homologos y/u ortologos y productos genicos de otros animales que incluyen, aunque no se limitan a, otros mamfferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En un aspecto preferido, los genes o secuencias de acidos nucleicos son humanos.
25 Definiciones
La terminologfa usada en el presente documento es con el fin de describir aspectos particulares solo y no pretende ser limitante de la divulgacion. Tal como se usan en el presente documento, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" pretenden incluir las formas plurales tambien, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Ademas, 30 siempre que las expresiones "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con", o variantes de las mismas, se usen en la descripcion detallada y/o las reivindicaciones, dichas expresiones pretenden ser incluyentes de un modo similar a la expresion "que comprende".
El termino "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se ha 35 determinado por un experto en la materia, lo que dependera en parte de como se mide o determina el valor, es decir, de las limitaciones del sistema de medicion. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o mas de 1 desviacion estandar, por la practica en la materia. Como alternativa, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20%, p refe rente me nte hasta el 10%, mas preferentemente hasta el 5%, y aun mas p refe rente me nte hasta el 1% de un valor dado. Como alternativa, particularmente con respecto a sistemas o 40 procesos biologicos, el termino puede significar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces, y mas preferentemente dentro de 2 veces, de un valor. Si se describen valores particulares en la solicitud y reivindicaciones, a menos que se establezca de otro modo, debe asumirse que el termino "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.
45 Tal como se usa en el presente documento, el termino "ARNm" significa uno o mas transcritos de ARNm actualmente conocidos de un gen elegido como diana, y cualquier transcrito adicional que pueda ser dilucidado.
Por "oligonucleotidos antisentido" o "compuesto antisentido" se entiende una molecula de ARN o de ADN que se une a otro ARN o ADN (ARN, ADN diana). Por ejemplo, si es un oligonucleotido de ARN, se une a otra diana de ARN por 50 medio de interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ARN diana (Eguchi y col., (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Un oligonucleotido antisentido puede regular positivamente o regular negativamente la expresion y/o funcion de un polinucleotido particular. La definicion pretende incluir cualquier molecula de ARN o ADN extraha que es util desde un punto de vista terapeutico, diagnostico, u otro punto de vista. Dichas moleculas incluyen, por ejemplo, moleculas de ARN o ADN antisentido, ARN de interferencia (iARN), microARN, moleculas de ARN sehuelo, 55 siRNA, ARN enzimatico, ARN de edicion terapeutica y ARN agonista y antagonista, compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia de grna externa (EGS), agentes de splicing alternativos, cebadores, sondas, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.
En el contexto de esta divulgacion, el termino "oligonucleotido" se refiere a un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN) o mimeticos de los mismos. El termino "oligonucleotido" tambien incluye oligomeros lineales o circulares de monomeros o enlaces naturales y/o modificados, que incluyen 5 desoxirribonucleosidos, ribonucleosidos, formas sustituidas y alfa-anomeras de los mismos, acidos nucleicos peptfdicos (PNA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), fosforotioato, metilfosfonato y similares. Los oligonucleotidos son capaces de unirse especfficamente a un polinucleotido diana a modo de un patron regular de interacciones monomero a monomero, tales como tipo Watson-Crick de apareamiento de bases, tipos Hoogsteen o Hoogsteen inversa de apareamiento de bases, o similares.
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El oligonucleotido puede ser "quimerico", es decir, estar compuesto por diferentes regiones. En el contexto de esta divulgacion, los compuestos "quimericos" son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones qufmicas, por ejemplo, region (regiones) de ADN, region (regiones) de ARN, region (regiones) de PNA, etc. Cada region qufmica esta constituida por al menos una unidad de monomero, es decir, un nucleotido en el caso de un compuesto de 15 oligonucleotidos. Estos oligonucleotidos normalmente comprenden al menos una region donde el oligonucleotido se modifica con el fin de presentar una o mas propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleotido incluyen, aunque no se limitan a, por ejemplo, resistencia incrementada a la degradacion por nucleasas, captacion celular incrementada y/o afinidad de union incrementada por el acido nucleico diana. Las diferentes regiones del oligonucleotido pueden, por lo tanto, tener diferentes propiedades. Los oligonucleotidos quimericos de la presente 20 divulgacion pueden formarse como estructuras mixtas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o analogos de oligonucleotidos, tal como se ha descrito anteriormente.
El oligonucleotido puede estar compuesto por regiones que pueden enlazarse en "registro", es decir, cuando los monomeros se enlazan consecutivamente, como en ADN nativo, o se enlazan mediante espaciadores. Los 25 espaciadores pretenden constituir un "puente" covalente entre las regiones y tienen, en casos preferidos, una longitud que no supera aproximadamente 100 atomos de carbono. Los espaciadores pueden llevar diferentes funcionalidades, por ejemplo, tener carga positiva o negativa, llevar propiedades de union a acido nucleico especiales (intercaladores, ligantes de surcos, toxinas, fluoroforos, etc.), ser lipofilos, inducir estructuras secundarias especiales como, por ejemplo, peptidos que contienen alanina que inducen helices alfa.
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Tal como se usan en el presente documento "TTP" y "Tristetraprolina" incluyen todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificantes y no codificantes, cadenas de polinucleotidos sentido y antisentido, etc.
35 Tal como se usa en el presente documento, las palabras Tristetraprolina, Tristetraprolin, TTP, “homologo de protefna con dedos de zinc 36”, “Protefna con dedos de zinc 36”, Zfp-36, ZFP36 y G0S24, GOS24, TIS11, Protefna nuclear inducible por factor de crecimiento NUP475 y protefna reguladora de la conmutacion GO/GI 24, NUP475, y RNF162A se usan de forma intercambiable en la presente solicitud.
40 Tal como se usa en el presente documento, la expresion "oligonucleotido especffico para" u "oligonucleotido que se dirige a" se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana. La estabilidad de los complejos y duplex puede determinarse por calculos teoricos y/o ensayos in vitro. Ensayos a modo de ejemplo para determinar la estabilidad de complejos y duplex de hibridacion se 45 describen en los ejemplos mas adelante.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "acido nucleico diana" engloba ADN, ARN (que comprende preARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y tambien ADNc derivado de dicho ARN, secuencias codificantes, no codificantes, polinucleotidos sentido o antisentido. La hibridacion especffica de un compuesto 50 oligomerico con su acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico. Esta modulacion de la funcion de un acido nucleico diana por compuestos que hibridan especfficamente con el, se denomina generalmente "antisentido". Las funciones de ADN en las que se interferira incluyen, por ejemplo, la replicacion y la transcripcion. Las funciones de ARN en las que se interferira incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalizacion del ARN al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna desde ARN, splicing del ARN 55 para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse por el ARN. El efecto global de dicha interferencia con la funcion del acido nucleico diana es la modulacion de la expresion de un producto codificado u oligonucleotidos.
La interferencia de ARN "iARN" esta mediada por moleculas de ARN bicatenario (dsARN) que tienen homologfa
especffica de secuencia para sus secuencias de acidos nucleicos "diana" (Caplen, N. J., y col. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 98: 9742-9747). En ciertos aspectos de la presente divulgacion, los mediadores son duplex de ARN "interferente pequeno" (siRNA) de 5-25 nucleotidos. Los siRNA se derivan del procesamiento de dsARN por una enzima ARNasa conocida como Dicer (Bernstein, E., y col. (2001) Nature 409: 363-366). Los productos de 5 duplex de siRNA son reclutados en un complejo de ARNip de multi-protefna llamado RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). Sin desear cenirse a ninguna teorfa particular, se cree entonces que un RlSc es guiado a un acido nucleico diana (adecuadamente ARNm), en el que el duplex de siRNA interactua en una forma especffica de secuencia para mediar en la escision en un modo catalftico (Bernstein, E., y col. (2001) Nature 409: 363-366; Boutla, A., y col. (2001) Curr. Biol. 11: 1776-1780). Los ARN interferentes pequenos que pueden usarse de 10 acuerdo con la presente divulgacion pueden sintetizarse y usarse de acuerdo con procedimientos que son muy conocidos en la tecnica y que seran familiares para el experto en la materia. Los ARN interferentes pequenos para su uso en los procedimientos de la presente divulgacion comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleotidos (nt). En los ejemplos de aspectos no limitantes, los siRNA pueden comprender aproximadamente de 5 a aproximadamente 40 nt, aproximadamente de 5 a aproximadamente 30 nt, 15 aproximadamente de 10 a aproximadamente 30 nt, aproximadamente de 15 a aproximadamente 25 nt, o aproximadamente 20-25 nucleotidos.
La seleccion de oligonucleotidos apropiados se facilita usando programas informaticos que alinean automaticamente secuencias de acidos nucleicos e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se usan para 20 comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un intervalo de especies permite la seleccion de secuencias de acidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no se han secuenciado, se realizan Southern blots para permitir una determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a 25 grados de astringencia variables, como es muy conocido en la tecnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que presentan un alto grado de complementariedad con secuencias de acidos nucleicos diana en un sujeto que va a controlarse y un menor grado de complementariedad con secuencias de acidos nucleicos correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de genes para su 30 uso en la presente divulgacion.
Por "ARN enzimatico" se entiende una molecula de ARN con actividad enzimatica (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Los acidos nucleicos enzimaticos (ribozimas) actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce mediante la parte de union diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en 35 estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, el acido nucleico enzimatico reconoce primero y luego se une a ARN diana mediante apareamiento de bases, y una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana.
Por "ARN senuelo" se entiende una molecula de ARN que imita el dominio de union natural para un ligando. El ARN 40 senuelo compite, por lo tanto, con la diana de union natural para la union de un ligando especffico. Por ejemplo, se ha demostrado que la sobreexpresion del ARN de respuesta de activacion en trans del VIH (TAR) puede actuar de "senuelo" y se une eficazmente a la protefna tat del VIH, previniendo asf que se una a secuencias de TAR codificadas en el ARN del VIH (Sullenger y col. (1990) Cell, 63, 601- 608). Esto se entiende que es un ejemplo especffico. Los expertos en la materia reconoceran que esto es solo un ejemplo, y facilmente pueden generarse 45 otros aspectos usando tecnicas generalmente conocidas en la tecnica.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "monomeros" normalmente indica monomeros enlazados por enlaces fosfodiester o analogos de los mismos para formar oligonucleotidos que varfan en tamano de algunas unidades monomericas, por ejemplo, de aproximadamente 3-4, a aproximadamente varios cientos de unidades 50 monomericas. Los analogos de enlaces fosfodiester incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, fosforoselenoato, fosforamidato y similares, tal como se describe mas completamente mas adelante.
El termino "nucleotido" cubre nucleotidos de origen natural, ademas de nucleotidos no de origen natural. Debe ser evidente para el experto en la materia que los diversos nucleotidos que se ha considerado previamente "no de 55 origen natural" se han encontrado posteriormente en la naturaleza. Asf, "nucleotidos" incluye no solo las moleculas que contienen heterociclos de purina y pirimidina conocidas, sino tambien analogos y tautomeros heterocfclicos de las mismas. Ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleotidos son moleculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo-N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7-deazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-alquinil(C3-C6)-citosina, 5-fluorouracilo, 5-
bromouracilo, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y los nucleotidos "que no existen de forma natural" descritos en Benner y col., patente de Estados Unidos N° 5.432.272. El termino "nucleotido" pretende cubrir todos y cada uno de estos ejemplos, ademas de analogos y tautomeros de los mismos. Nucleotidos especialmente interesantes son aquellos que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que 5 se consideran como los nucleotidos de origen natural en relacion con la aplicacion terapeutica y diagnostica en seres humanos. Los nucleotidos incluyen los azucares naturales 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, por ejemplo, como se describe en Kornberg y Baker, DNA Replication, 2a Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), asf como sus analogos.
"Analogos", en referencia a nucleotidos, incluye nucleotidos sinteticos que tienen restos de bases modificados y/o 10 restos de azucar modificados (vease, por ejemplo, descrito generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429-4443, Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19: 17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489: 117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25: 4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10: 297-310); [3.2.0]bicicloarabinonucleosidos enlazados en 2'-O, 3'-C 15 (vease, por ejemplo, N.K Christiensen., y col., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463; Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem. 7(7): 641-9; Cho EJ, y col. (2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264). Dichos analogos incluyen nucleotidos sinteticos disenados para potenciar propiedades de union, por ejemplo, la estabilidad del duplex o triplex, especificidad, o similares.
20 Tal como se usa en el presente documento, "hibridacion" significa el apareamiento de cadenas sustancialmente complementarias de compuestos oligomericos. Un mecanismo de apareamiento implica la formacion de puentes de hidrogeno, que pueden ser enlaces de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre bases de nucleosidos o de nucleotidos (nucleotidos) complementarias de las cadenas de compuestos oligomericos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleotidos complementarios que se aparean mediante la formacion de enlaces 25 de hidrogeno. La hibridacion puede producirse en circunstancias variables.
Un compuesto antisentido es "especificamente hibridable" cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para producir una modulacion de la funcion y/o actividad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especifica del compuesto antisentido a 30 secuencias de acidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la union especifica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de hibridacion astringentes" o "condiciones 35 astringentes" se refiere a condiciones en las que un compuesto de la divulgacion hibridara con su secuencia diana, pero con un numero mfnimo de otras secuencias. Las condiciones astringentes son dependientes de la secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias y en el contexto de esta divulgacion, las "condiciones astringentes" en las que hibridan los compuestos oligomericos con una secuencia diana se determinan por la naturaleza y composicion de los compuestos oligomericos y los ensayos en los que estan siendo investigados. En general, las 40 condiciones de hibridacion astringentes comprenden bajas concentraciones (<0,15 M) de sales con cationes inorganicos tales como Na++ o K++ (es decir, baja fuerza ionica), temperatura superior a 20°C - 25°C por debajo de la Tm del complejo de compuesto oligomerico:secuencia diana, y la presencia de desnaturalizantes tales como formamida, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, o el detergente dodecilsulfato sodico (SDS). Por ejemplo, la velocidad de hibridacion disminuye un 1,1% por cada 1% de formamida. Un ejemplo de una condicion de hibridacion de alta 45 astringencia es 0,1X tampon cloruro sodico-citrato sodico (SSC)/0,1% (peso/volumen) de SDS a 60°C durante 30 minutos.
"Complementario", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de apareamiento preciso entre dos nucleotidos en una o dos cadenas oligomericas. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posicion de 50 un compuesto antisentido es capaz de formar enlace de hidrogeno con una nucleobase en una cierta posicion de un acido nucleico diana, siendo dicho acido nucleico diana un ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido, entonces la posicion de enlace del hidrogeno entre el oligonucleotido y el acido nucleico diana se considera que es una posicion complementaria. El compuesto oligomerico y el ADN, ARN, o molecula de oligonucleotido adicional son complementarios entre si cuando un numero suficiente de posiciones complementarias en cada molecula estan 55 ocupadas por nucleotidos que pueden formar enlaces de hidrogeno entre si. De este modo, "especificamente hibridable" y "complementario" son terminos que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o complementariedad durante un numero suficiente de nucleotidos de forma que se produzca la union estable especifica entre el compuesto oligomerico y un acido nucleico diana.
Se entiende en la tecnica que la secuencia de un compuesto oligomerico no necesita ser 100% complementaria a la de su acido nucleico diana para ser especfficamente hibridable. Ademas, un oligonucleotido puede hibridarse sobre uno o mas segmentos de forma que segmentos intermedios o adyacentes no participen en el acontecimiento de hibridacion (por ejemplo, una estructura de bucle, desapareamiento o estructura de horquilla). Los compuestos 5 oligomericos de la presente divulgacion comprenden al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 75%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 85%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 99%, de complementariedad de secuencia con una region diana dentro de la secuencia de acidos nucleicos diana a la que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de los 20 nucleotidos del compuesto antisentido son 10 complementarios a una region diana y, por lo tanto, hibridarfan especfficamente, representarfa el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleotidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleotidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre si o a nucleotidos complementarios. Por lo tanto, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleotidos de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleotidos no complementarios que estan flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el 15 acido nucleico diana tendrfa el 77,8% de complementariedad global con el acido nucleico diana y de este modo estarfa dentro del alcance de la presente divulgacion. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una region de un acido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de busqueda de alineamientos locales basicos) y programas PowerBLAST conocidos en la tecnica (Altschul y col., (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410; Zhang y Madden, (1997) Genome Res., 7, 649-656). El porcentaje 20 de homologfa, identidad de secuencias o complementariedad pueden determinarse por, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando parametros por defecto, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).
25 Tal como se usa en el presente documento, la expresion "punto de fusion termico (Tm)" se refiere a la temperatura, bajo fuerza ionica, pH y concentracion de acido nucleico definidas, a la que el 50% de los oligonucleotidos complementarios a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Normalmente, condiciones astringentes seran aquellas en las que la concentracion de sales es la concentracion de ion Na (u otras sales) de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para 30 oligonucleotidos cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleotidos). Tambien pueden lograrse condiciones astringentes con la adicion de agentes desestabilizantes tales como formamida.
Tal como se usa en el presente documento, "modulacion" significa un incremento (estimulacion) o una disminucion (inhibicion) de la expresion de un gen.
35
El termino "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleotidos, puede englobar una secuencia de polinucleotidos relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definicion tambien puede incluir, por ejemplo, variantes "alelicas", de "splicing", de "especie" o "polimorficas". Una variante de splicing puede tener identidad significativa con una molecula de referencia, pero generalmente tendra un mayor o menor numero de 40 polinucleotidos debido al splicing alterno de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipeptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias de polinucleotidos que varfan de una especie a otra. Son de particular utilidad en la divulgacion variantes de productos genicos de tipo silvestre (wild type). Las variantes pueden resultar de al menos una mutacion en la secuencia de acidos nucleicos y pueden producir ARNm alterados o polipeptidos cuya estructura 45 o funcion puede o puede no alterarse. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alelicas. Cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleotidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse solo, o en combinacion con los otros, una o mas veces en una secuencia dada.
50 Los polipeptidos resultantes generalmente tendran identidad significativa de aminoacidos los unos con respecto a los otros. Una variante polimorfica es una variacion en la secuencia de polinucleotidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimorficas tambien pueden englobar "polimorfismos de un solo nucleotido" (SNP), o mutaciones de una sola base en las que la secuencia de polinucleotidos varfa en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una cierta poblacion con una propension por una patologfa, 55 es decir susceptibilidad frente a resistencia.
Los polinucleotidos derivados incluyen acidos nucleicos sometidos a modificacion qufmica, por ejemplo, sustitucion de hidrogeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, por ejemplo, oligonucleotidos derivados, pueden comprender partes no de origen natural, tales como restos de azucar alterados o enlaces inter-azucar. A modo de
ejemplo, entre estos estan fosforotioato y otras especies que contienen azufre que se conocen en la tecnica. Los acidos nucleicos derivados tambien pueden contener etiquetas, que incluyen radionucleotidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogenos, sustratos, cofactores, inhibidores, partfculas magneticas y similares.
5
Un polipeptido o peptido "derivado" es uno que se modifica, por ejemplo, por glucosilacion, pegilacion, fosforilacion, sulfatacion, reduccion/alquilacion, acilacion, acoplamiento qufmico o tratamiento suave con formalina. Un derivado tambien puede modificarse para contener una etiqueta detectable, tanto directa como indirectamente, que incluye, aunque no se limita a, un radioisotopo, etiqueta fluorescente y enzimatica.
10
Tal como se usa en el presente documento, el termino "animal" o "paciente" pretende incluir, por ejemplo, seres humanos, ovejas, alces, venados, ciervos mulos, visones, mamfferos, monos, caballos, ganado vacuno, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollo, reptiles, peces, insectos y aracnidos.
15 "Mamffero" cubre mamfferos de sangre caliente que normalmente estan bajo atencion medica (por ejemplo, seres humanos y animales domesticados). Los ejemplos incluyen felinos, caninos, equinos, bovinos y humanos, ademas de solo humanos.
"Tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de una patologfa en un mamffero, e incluye: (a) prevenir que se 20 produzca la patologfa en un mamffero, en particular, cuando dicho mamffero tiene predisposicion a la patologfa, pero todavfa no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patologfa, por ejemplo, detener el desarrollo; y/o (c) aliviar la patologfa, por ejemplo, causando la regresion de la patologfa hasta que se alcance un criterio de valoracion deseado. Tratar tambien incluye la mejora de un sfntoma de una enfermedad (por ejemplo, reducir el dolor o molestia), en el que dicha mejora puede o puede no afectar directamente la enfermedad (por ejemplo, causa, 25 transmision, expresion, etc.).
Tal como se usa en el presente documento, "cancer" se refiere a todo tipo de cancer o neoplasia o tumores malignos descubiertos en mamfferos, incluyendo, aunque sin limitarse a: leucemias, linfomas, melanomas, carcinomas y sarcomas. El propio cancer se manifiesta como un "tumor" o tejido que comprende celulas malignas del cancer. Los 30 ejemplos de tumores incluyen sarcomas y carcinomas tales como, aunque no se limitan a: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glandulas 35 sudorfparas, carcinoma de las glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de las vfas biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon microcftico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, 40 neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma. Canceres adicionales que pueden ser tratados por la composicion descrita de acuerdo con la divulgacion incluyen, aunque no se limitan a, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma multiple, neuroblastoma, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de pulmon, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmon microcfticos, tumores cerebrales primarios, cancer de estomago, cancer de colon, insulanoma 45 pancreatico maligno, tumor carcinoide maligno, cancer de vejiga urinaria, lesiones de la piel premalignas, cancer testicular, linfomas, cancer de tiroides, neuroblastoma, cancer de esofago, cancer genitourinario, hipercalcemia maligna, cancer de cuello uterino, cancer de endometrio, cancer de la corteza suprarrenal y cancer de prostata.
Una "Inflamacion" se refiere a afecciones inflamatorias sistemicas y afecciones asociadas localmente con la 50 migracion y la atraccion de monocitos, leucocitos y/o neutrofilos. Los ejemplos de inflamacion, aunque sin limitarse a, inflamacion resultante de infeccion con organismos patogenos (incluyendo bacterias gram-positivas, bacterias gram- negativas, virus, hongos, y parasitos tales como protozoos y helmintos), rechazo de trasplante (incluyendo rechazo de organos solidos tales como rinon, hfgado, corazon, pulmon o cornea, asf como rechazo de trasplantes de medula osea incluyendo enfermedad de injerto contra huesped (GVHD)), o de reacciones alergicas agudas o cronicas 55 localizada o autoinmunitarias. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen glomerulonefritis aguda; artritis reumatoide o reactiva; glomerulonefritis cronica; enfermedades inflamatorias del intestino tales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enterocolitis necrotizante; sfndromes asociados a transfusion de granulocitos; dermatosis inflamatorias tales como dermatitis de contacto, dermatitis atopica, psoriasis; lupus eritematoso sistemico (SLE), tiroiditis autoinmunitaria, esclerosis multiple, y algunas formas de diabetes, o cualquier otro estado autoinmunitario
donde el ataque por el propio sistema inmunitario del sujeto da como resultado la destruccion del tejido patologico. Las reacciones alergicas incluyen asma alergica, bronquitis cronica, hipersensibilidad aguda y retardada. Las enfermedades inflamatorias sistemicas incluyen la inflamacion asociada con traumatismo, quemaduras, reperfusion despues de episodios isquemicos (por ejemplo, eventos tromboticos en corazon, cerebro, intestino o vasos 5 perifericos, incluyendo infarto de miocardio y accidente cerebrovascular), sepsis, ARDS o sfndrome de disfuncion organica multiple. El reclutamiento de celulas inflamatorias tambien se produce en las placas ateroscleroticas. La inflamacion incluye, aunque sin limitarse a, linfoma no Hodgkin, granulomatosis de Wegener, tiroiditis de Hashimoto, carcinoma hepatocelular, atrofia del timo, pancreatitis cronica, artritis reumatoide, hiperplasia linfoide reactiva, osteoartritis, colitis ulcerosa, carcinoma papilar, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colecistitis aguda, colecistitis 10 cronica, cirrosis, sialoadenitis cronica, peritonitis, pancreatitis aguda, pancreatitis cronica, gastritis cronica, adenomiosis, endometriosis, cervicitis aguda, cervicitis cronica, hiperplasia linfoide, esclerosis multiple, hipertrofia secundaria a purpura trombocitopenica idiopatica, nefropatfa IgA primaria, lupus eritematoso sistemico, psoriasis, enfisema pulmonar, pielonefritis cronica y cistitis cronica.
15 Una 'enfermedad o trastorno cardiovascular' incluye aquellos trastornos que pueden causar isquemia o son causados por reperfusion del corazon. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitarse a, aterosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, miocarditis granulomatosa, miocarditis cronica (no granulomatosa), cardiomiopatfa hipertrofica primaria, enfermedad arterial periferica (PAD), accidente cerebrovascular, angina de pecho, infarto de miocardio, dano tisular cardiovascular provocado por paro cardiaco, dano tisular cardiovascular provocado por bypass cardfaco, 20 choque cardiogeno, y afecciones relacionadas que serfan conocidas por los expertos en la materia o que implican disfuncion de o dano tisular al corazon o la vasculatura, especialmente, aunque sin limitarse a, dano tisular relacionado con la activacion de TTP. Las enfermedades CVS incluyen, aunque sin limitarse a, aterosclerosis, miocarditis granulomatosa, infarto de miocardio, fibrosis miocardica secundaria a enfermedad valvular cardiaca, fibrosis miocardica sin infarto, cardiomiopatfa hipertrofica primaria, y miocarditis cronica (no granulomatosa).
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Composiciones y moleculas de polinucleotidos y oligonucleotidos
Dianas: En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de acido nucleico de tristetraprolina (TTP), incluyendo sin limitacion secuencias no codificantes y/o codificantes, sentido y/o antisentido asociadas con TTP.
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La tristetraprolina (TTP) (tambien conocida como homologo de protefna con dedos de zinc 36) (Zfp-36) es una protefna de union a ARN que regula la estabilidad del ARNm del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Tanto la expresion de TTP como su fosforilacion estan reguladas por la ruta de p38. La TTP tambien es una protefna reguladora con una novedosa estructura de dedos de zinc implicada en la regulacion de la respuesta a factores de 35 crecimiento y ha demostrado experimentalmente ser capaz de unirse a zinc.
En aspectos preferidos, se usan oligonucleotidos para prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados con miembros de la familia de TTP. Las enfermedades o trastornos mediados por tristetraprolina (TTP) ejemplares que pueden tratarse con celulas/tejidos regenerados a partir de celulas madre obtenidas usando los compuestos 40 antisentido comprenden: sfndrome de deficiencia de tristetraprolina, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una lesion cardiaca (por ejemplo, lesion cardiaca seleccionada de entre el grupo de sobrecarga hemodinamica, lesion por reperfusion miocardica, cardiomiopatfa hipertrofica, insuficiencia cardiaca congestiva en fase terminal y una afeccion isquemica o una consecuencia de la misma como infarto de miocardio y angina inestable etc.), artritis, una inflamacion, inflamacion articular y cutanea, SIDA, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, colitis 45 ulcerosa, cancer, obesidad, sfndrome metabolico, complicaciones metabolicas asociadas con la obesidad, una enfermedad o trastorno autoinmunitario, caquexia, hiperplasia mieloide, lesion del musculo esqueletico.
En un aspecto preferido, los oligonucleotidos son especfficos para polinucleotidos de TTP, que incluye, sin limitacion regiones no codificantes. Las dianas de TTP comprenden variantes de TTP; mutantes de TTP, incluyendo SNP; 50 secuencias no codificantes de TTP; alelos, fragmentos y similares. Preferentemente el oligonucleotido es una molecula de ARN antisentido.
De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no esta limitada a polinucleotidos de TTP en solitario sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos, regiones no codificantes 55 y similares de TTP.
En otro aspecto preferido, un oligonucleotido esta dirigido a una secuencia antisentido natural (antisentido natural a las regiones codificantes y no codificantes) de dianas de TTP, incluyendo, sin limitacion, variantes, alelos, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a estos. Preferentemente el
oligonucleotido es una molecula de ARN o ADN antisentido.
En otro aspecto preferido, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las que una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si 5 el primer nucleotido es una adenina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina, citidina u otros nucleotidos naturales o no naturales en esta posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones del compuesto antisentido. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.
10 En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de 15 aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100%.
20 Un compuesto antisentido es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para producir una perdida de actividad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union inespecffica del compuesto antisentido a secuencias de acidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la union especffica. Dichas condiciones incluyen, es decir, condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y condiciones en las que se realizan 25 los ensayos en el caso de ensayos in vitro.
Un compuesto antisentido, ya sea ADN, ARN, quimerico, sustituido, etc., es especfficamente hibridable cuando la union del compuesto a la molecula de ADN o de ARN diana interfiere en la funcion normal del ADN o ARN diana para producir una perdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union 30 inespecffica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la union especffica, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.
En otro aspecto preferido, la eleccion como diana de TTP incluyendo sin limitacion, secuencias antisentido que se 35 identifican y se expanden, usando por ejemplo, PCR, hibridacion etc., una o mas de las secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 3 a 5, y similares, modulan la expresion o funcion de TTP. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada positivamente en comparacion con un control. En otro aspecto preferido, la expresion o funcion esta regulada negativamente en comparacion con un control.
40 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden secuencias de acidos nucleicos expuestas como SEQ ID NO: 6 a 10 que incluyen secuencias antisentido que se identifican y se expanden, usando por ejemplo, PCR, hibridacion etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto preferido, los nucleotidos 45 comprenden un derivado de fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en sf conocida y no es necesario describirla aquf.
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La especificidad y sensibilidad de antisentido tambien es empleada por los expertos en la materia para usos terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas en animales y el ser humano. Los oligonucleotidos antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los 55 oligonucleotidos pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.
En aspectos de la presente divulgacion, los compuestos antisentido oligomericos, particularmente oligonucleotidos, se unen a moleculas de acidos nucleicos diana y modulan la expresion y/o funcion de moleculas codificadas por un
gen diana. Las funciones de ADN con las que interferiran comprenden, por ejemplo, replicacion y transcripcion. Las funciones de ARN con las que interferiran comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalizacion del ARN al sitio de traduccion de protefna, traduccion de protefna desde ARN, splicing del ARN para dar una o mas especies de ARNm, y actividad catalftica que puede acoplarse en o facilitarse por el ARN. Las 5 funciones pueden regularse positivamente o inhibirse dependiendo de las funciones deseadas.
Los compuestos antisentido incluyen compuestos antisentido oligomericos, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), agentes de splicing alterno, cebadores, sondas, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana. Por lo tanto, estos 10 compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.
El direccionamiento de un compuesto antisentido a una molecula de acido nucleico particular, en el contexto de esta divulgacion, puede ser un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de un acido 15 nucleico diana cuya funcion va a modularse. Este acido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresion esta asociada a un trastorno o patologfa particular, o una molecula de acido nucleico de un agente infeccioso. En la presente divulgacion, el acido nucleico diana codifica tristetraprolina (TTP).
20 El proceso de direccionamiento normalmente tambien incluye la determinacion de al menos una region diana, segmento, o sitio dentro del acido nucleico diana para que la interaccion antisentido se produzca de forma que resulte el efecto deseado, por ejemplo, la modulacion de la expresion. Dentro del contexto de la presente divulgacion, el termino "region" se define como una parte del acido nucleico diana que tiene al menos una estructura, funcion o caracterfstica identificable. Dentro de las regiones de acidos nucleicos diana estan segmentos. Los 25 "segmentos" se definen como partes mas pequenas o sub-partes de regiones dentro de un acido nucleico diana. "Sitios", tal como se usa en la presente divulgacion, se define como posiciones dentro de un acido nucleico diana.
En un aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a las secuencias antisentido naturales de tristetraprolina (TTP) y modulan la expresion y/o funcion de tristetraprolina (TTP) (SEQ ID NO: 1). Los ejemplos de 30 secuencias antisentido incluyen las sEq ID NO: 3 a 10.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a uno o mas segmentos de polinucleotidos de tristetraprolina (TTP) y modulan la expresion y/o funcion de tristetraprolina (TTP). Los segmentos comprenden al menos cinco nucleotidos consecutivos de los polinucleotidos sentido o antisentido de tristetraprolina (TTP).
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En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido son especfficos para secuencias antisentido naturales de tristetraprolina (TTP) donde la union de los oligonucleotidos a las secuencias antisentido naturales de tristetraprolina (TTP) modula la expresion y/o la funcion de tristetraprolina (TTP).
40 En otro aspecto preferido, los compuestos de oligonucleotido comprenden secuencias expuestas como SEQ ID NO: 6 a 10, secuencias antisentido que se identifican y expanden usando, por ejemplo, PCR, hibridacion etc. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotfdicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto preferido, los nucleotidos comprenden un derivado de 45 fosforo. El derivado de fosforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azucar o de analogo de azucar en los oligonucleotidos modificados de la presente divulgacion puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparacion de los analogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporacion en nucleotidos, nucleotidos modificados y oligonucleotidos, tambien es en si conocida y no es necesario describirla aquf.
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Ya que, tal como se conoce en la tecnica, el codon de iniciacion de la traduccion normalmente es 5'-AUG (en moleculas de ARNm transcrito; 5'-ATG en la molecula de ADN correspondiente), el codon de iniciacion de la traduccion tambien se denomina el "codon AUG", el "codon de iniciacion" o el "codon de iniciacion AUG". Una minorfa de genes tiene un codon de iniciacion de la traduccion que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'55 CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. De este modo, las expresiones "codon de iniciacion de la traduccion" y "codon de iniciacion" pueden englobar muchas secuencias de codon, aun cuando el aminoacido iniciador en cada caso normalmente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). Los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o mas codones de iniciacion alternativos, uno cualquiera de los cuales puede utilizarse preferencialmente para la iniciacion de la traduccion en un tipo particular de celula o tejido, o
en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la divulgacion, "codon de iniciacion" y "codon de iniciacion de la traduccion" se refieren al codon o codones que se usan in vivo para iniciar la traduccion de un ARNm transcrito de un gen que codifica la tristetraprolina (TTP), independientemente de la(s) secuencia(s) de dichos codones. Un codon de terminacion de la traduccion (o "codon de terminacion") de un gen puede tener una de tres 5 secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'- TGA, respectivamente).
Las expresiones "region de codon de iniciacion" y "region de codon de iniciacion de la traduccion" se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en 10 cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de iniciacion de la traduccion. Analogamente, las expresiones "region de codon de terminacion" y "region de codon de terminacion de la traduccion" se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleotidos contiguos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de terminacion de la traduccion. Por consiguiente, la "region de codon de iniciacion" (o "region de codon de iniciacion de la traduccion") y la "region de codon de terminacion" (o "region de 15 codon de terminacion de la traduccion") son todas las regiones que pueden ser eficazmente dirigidas como diana con los compuestos antisentido de la presente divulgacion.
El marco de lectura abierto (ORF) o "region codificante", que se conoce en la tecnica para referirse a la region entre el codon de iniciacion de la traduccion y el codon de terminacion de la traduccion, tambien es una region que puede 20 ser eficazmente elegida como diana. Dentro del contexto de la presente divulgacion, una region elegida como diana es la region intragenica que engloba el codon de iniciacion o de terminacion de la traduccion del marco de lectura abierto (ORF) de un gen.
Otra region diana incluye la region no traducida 5' (5'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un 25 ARNm en la direccion 5' desde el codon de iniciacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, nucleotidos entre el sitio caperuza 5' (5' cap) y el codon de iniciacion de la traduccion de un ARNm (o nucleotidos correspondientes en el gen). Otra region diana mas incluye la region no traducida 3' (3'UTR), conocida en la tecnica para referirse a la parte de un ARNm en la direccion 3' desde el codon de terminacion de la traduccion, y que incluye, por lo tanto, nucleotidos entre el codon de terminacion de la traduccion y el extremo 3' de un ARNm (o nucleotidos 30 correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo mas 5' del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'. La region caperuza 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura caperuza 5', ademas de los primeros 50 nucleotidos adyacentes al sitio caperuza. Otra region diana para esta divulgacion es la region caperuza 5'.
35 Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o mas regiones, conocidas como "intrones", que se escinden de un transcrito antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y, por tanto, traducidas) se conocen como "exones" y se someten a splicing juntas para formar una secuencia de ARNm continua. En un aspecto, la eleccion como diana de sitios de splicing, es decir, empalmes intron-exon o empalmes exon-intron, es particularmente util en situaciones en las que el splicing aberrante participa en la 40 enfermedad, o en las que una produccion en exceso de un producto de splicing particular participa en la enfermedad. Un empalme de fusion aberrante debido a la transposicion o delecion es otro aspecto de un sitio diana. Los ARNm transcritos producidos mediante el proceso de splicing de dos (o mas) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como "transcritos de fusion". Los intrones pueden ser eficazmente elegidos como diana usando compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.
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En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a regiones codificantes y/o no codificantes de un polinucleotido diana y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos antisentido naturales y modulan 50 la expresion y/o funcion de la molecula diana.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido se unen a polinucleotidos sentido y modulan la expresion y/o funcion de la molecula diana.
55 Pueden producirse transcritos de ARN alternativos a partir de la misma region genomica de ADN. Estos transcritos alternativos son generalmente conocidos como "variantes". Mas especfficamente, "variantes de pre-ARNm" son transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico que se diferencian de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genomico en su posicion de inicio o de parada y contienen tanto secuencia intronica como exonica.
Tras la escision de una o mas regiones de exon o intron, o partes de las mismas durante el splicing, las variantes de pre-ARNm producen "variantes de ARNm" mas pequenas. Por consiguiente, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm unica siempre debe producir una variante de ARNm unica como resultado del splicing. Estas variantes de ARNm tambien se conocen como "variantes de splicing alternativas". 5 Si no se produce splicing de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es identica a la variante de ARNm.
Las variantes pueden producirse mediante el uso de senales alternativas para la transcripcion de inicio o de parada. Los Pre-ARNm y ARNm pueden poseer mas de un codon de iniciacion o codon de terminacion. Las variantes que se 10 originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de iniciacion alternativos se conocen como "variantes de inicio alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellos transcritos que usan un codon de terminacion alternativo se conocen como "variantes de parada alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo especffico de variante de parada alternativa es la "variante de poliA", en la que los multiples transcritos producidos resultan de la seleccion alternativa de una de las "senales de parada de poliA" por la maquinaria de transcripcion, produciendo de este modo 15 transcritos que terminan en sitios de poliA unicos. Dentro del contexto de la divulgacion, los tipos de variantes descritos en el presente documento tambien son aspectos de acidos nucleicos diana.
Las ubicaciones en el acido nucleico diana con las que los compuestos antisentido hibridan se definen como al menos una parte de 5 nucleotidos de longitud de una region diana a la que se dirige un compuesto antisentido 20 activo.
Aunque las secuencias especfficas de ciertos segmentos diana a modo de ejemplo se exponen en el presente documento, un experto en la materia reconocera que estas sirven para ilustrar y describir aspectos particulares dentro del alcance de la presente divulgacion. Segmentos diana adicionales son facilmente identificables por un 25 experto en la materia en vista de esta divulgacion.
Se considera que segmentos diana de 5-100 nucleotidos de longitud que comprenden un tramo de al menos cinco (5) nucleotidos consecutivos seleccionados de dentro de los segmentos diana preferidos tambien son adecuados para el direccionamiento.
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Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena arriba del extremo 5' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 100 nucleotidos). Segmentos diana similarmente preferidos se representan por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleotidos consecutivos desde el extremo 3' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleotidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena abajo del extremo 3' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos). Un experto en la materia armado con los segmentos 40 diana ilustrados en el presente documento sera capaz, sin excesiva experimentacion, de identificar segmentos diana preferidos adicionales.
Una vez se han identificado una o mas regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos antisentido que son suficientemente complementarios a la diana, es decir, hibridan suficientemente bien y con suficiente 45 especificidad, para dar el efecto deseado.
En aspectos de la divulgacion, los oligonucleotidos se unen a una cadena antisentido de una diana particular. Los oligonucleotidos tienen al menos 5 nucleotidos de longitud y pueden sintetizarse de manera que cada oligonucleotido se dirija a secuencias solapantes de forma que los oligonucleotidos se sinteticen para cubrir toda la longitud del 50 polinucleotido diana. Las dianas tambien incluyen regiones codificantes, ademas de no codificantes.
En un aspecto, se prefiere dirigirse a acidos nucleicos especfficos por oligonucleotidos antisentido. El direccionamiento de un compuesto antisentido a un acido nucleico particular es un proceso multietapa. El proceso normalmente empieza con la identificacion de una secuencia de acidos nucleicos cuya funcion va a modularse. Esta 55 puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresion esta asociada a un trastorno o patologfa particular, o un polinucleotido no codificante tal como, por ejemplo, ARN no codificante (ARNnc).
Los ARN pueden clasificarse en (1) ARN mensajeros (ARNm), que se traducen en protefnas, y (2) ARN no
codificantes de protefna (ARNnc). Los ARNnc comprenden microARN, transcritos antisentido y otras unidades transcripcionales (TU) que contienen una alta densidad de codones de terminacion y que carecen de cualquier amplio "marco de lectura abierto". Muchos ARNnc parecen empezar a partir de sitios de iniciacion en regiones no traducidas 3' (3'UTRs) de loci codificante de protefna. Los ARNnc son frecuentemente raros y al menos la mitad de 5 los ARNnc que se han secuenciado por el consorcio FANTOM no parecen estar poliadenilados. La mayorfa de los investigadores se han basado, por motivos obvios, en ARNm poliadenilados que se procesan y se exportan al citoplasma. Recientemente, se demostro que el conjunto de ARN nucleares no poliadenilados puede ser muy grande, y que muchos de dichos transcritos surgen de las llamadas regiones intergenicas (Cheng, J. y col. (2005) Science 308 (5725), 1149-1154; Kapranov, P. y col. (2005). Genome Res 15 (7), 987-997). El mecanismo por el que 10 los ARNnc pueden regular la expresion genica es por apareamiento de bases con transcritos diana. Los ARN que funcionan por apareamiento de bases pueden agruparse en (1) ARN codificados en cis que estan codificados en la misma ubicacion genetica, pero en la cadena opuesta a los ARN en los que actuan y, por lo tanto, muestran complementariedad perfecta con su diana, y (2) ARN codificados en trans que estan codificados en una ubicacion cromosomica distinta de los ARN en los que actuan y generalmente no presentan potencial de apareamiento de 15 bases perfecto con sus dianas.
Sin desear cenirse a ninguna teorfa, la perturbacion de un polinucleotido antisentido por los oligonucleotidos antisentido descritos en el presente documento puede alterar la expresion de los ARN mensajeros sentido correspondientes. Sin embargo, esta regulacion puede tanto ser discordante (la inactivacion antisentido produce 20 elevacion de ARN mensajero) como concordante (la inactivacion antisentido produce reduccion concomitante de ARN mensajero). En estos casos, los oligonucleotidos antisentido pueden ser dirigidos a partes solapantes o no solapantes del transcrito antisentido que producen su inactivacion o secuestro. El antisentido codificante, ademas de no codificante, puede ser dirigido de una manera identica y que cualquier categorfa es capaz de regular los transcritos sentido correspondientes - tanto de una manera concordante como discordante. Las estrategias que se 25 emplean en identificar nuevos oligonucleotidos para su uso contra una diana pueden basarse en la inactivacion de transcritos de ARN antisentido por oligonucleotidos antisentido o cualquier otro medio de modulacion de la diana deseada.
Estrategia 1: En el caso de regulacion discordante, la inactivacion del transcrito antisentido eleva la expresion del 30 gen convencional (sentido). Si el ultimo debe codificar un farmaco diana conocido o supuesto, entonces la inactivacion de su homologo antisentido podrfa imitar posiblemente la accion de un agonista receptor o una enzima estimulante.
Estrategia 2: En el caso de regulacion concordante, podrfan inactivarse de forma concomitante tanto los transcritos 35 antisentido como sentido y asf lograr una reduccion sinergica de la expresion genica (sentido) convencional. Si, por ejemplo, un oligonucleotido antisentido se usa para lograr la inactivacion, entonces esta estrategia puede usarse para aplicar un oligonucleotido antisentido dirigido al transcrito sentido y otro oligonucleotido antisentido al transcrito antisentido correspondiente, o un unico oligonucleotido antisentido energeticamente simetrico que se dirige simultaneamente a transcritos sentido y antisentido solapantes.
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De acuerdo con la presente divulgacion, los compuestos antisentido incluyen oligonucleotidos antisentido, ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (iARN) de ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, ARN, similares a 45 ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden incluir construcciones tales como, por 50 ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter 55 monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden incluir nucleotidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molecula tipo horquilla auto-complementaria que se dobla
sobre si misma para formar un duplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulacion especffica de la expresion genica por expresion estable de horquillas de dsARN en lfneas celulares transgenicas, sin embargo, en algunos casos, la expresion o funcion genica esta regulada positivamente. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena que adopta la forma de una molecula 5 de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre si misma para formar un duplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.
Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas 10 enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como "similares a ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'- desoxiazucares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-hidroxilazucares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las helices de acido 15 nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos casos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B.
20 En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos deseados o compuestos antisentido comprenden al menos uno de: ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleotidos antisentido quimericos, oligonucleotidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (iARN), ARN interferente pequeno (siRNA); un microARN interferente (miARN); un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica inducida por ARN pequeno (aARN); ARN activantes pequenos (ARNap), o combinaciones de los mismos.
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Los dsARN tambien pueden activar la expresion genica, un mecanismo que se ha llamado "activacion genica inducida por ARN pequeno" o aARN. Los promotores genicos que se dirigen a dsARN inducen la potente activacion transcripcional de genes asociados. El aARN se demostro en celulas humanas usando dsARN sinteticos, llamados "ARN activantes pequenos" (ARNap). No se sabe actualmente si el aARN esta conservado en otros organismos.
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Se ha descubierto que el ARN bicatenario pequeno (dsARN), tal como ARN interferente pequeno (siRNA) y microARN (miARN), es el desencadenante de un mecanismo evolutivamente conservado conocido como interferencia de ARN (iARN). La iARN conduce invariablemente al silenciamiento genico mediante la remodelacion de cromatina para suprimir de este modo la transcripcion, degradacion de ARNm complementario, o bloqueo de la 35 traduccion de protefnas. Sin embargo, en los casos descritos en detalle en la seccion de ejemplos a continuacion, se muestra que los oligonucleotidos aumentan la expresion y/o funcion de los polinucleotidos de la tristetraprolina (TTP) y productos codificados por los mismos. Los dsARN tambien pueden actuar de ARN activantes pequenos (ARNap). Sin desear cenirse a ninguna teorfa, direccionando secuencias a promotores genicos, los ARNap induciran la expresion de genes diana en un fenomeno denominado activacion transcripcional inducida por dsARN (aARN).
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En un aspecto adicional, los "segmentos diana preferidos" identificados en el presente documento pueden emplearse en un cribado para compuestos adicionales que modulan la expresion de polinucleotidos de tristetraprolina (TTP). "Moduladores" son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica tristetraprolina (TTP) y que comprenden al menos una parte de 5 45 nucleotidos que es complementaria a un segmento diana preferido. El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana preferido de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos sentido o antisentido naturales de tristetraprolina (TTP) con uno o mas moduladores candidatos, y seleccionar uno o mas moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos de tristetraprolina (TTP), por ejemplo, SEQ ID NO: 6 a 10. Una vez que se 50 demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, tanto disminuir como aumentar) la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica polinucleotidos de tristetraprolina (TTP), el modulador puede entonces emplearse en estudios de investigacion adicionales de la funcion de polinucleotidos de tristetraprolina (TTP), o para su uso como un agente de investigacion, diagnostico o terapeutico de acuerdo con la presente divulgacion.
55
El direccionamiento de la secuencia antisentido natural modula p refe rente me nte la funcion del gen diana. Por ejemplo, el gen TTP (por ejemplo, numero de acceso NM_003407, figura 2). En un aspecto preferido, la diana es un polinucleotido antisentido del gen TTP. En un aspecto preferido, un oligonucleotido antisentido se dirige a secuencias sentido y/o antisentido naturales de los polinucleotidos de tristetraprolina (TTP) (por ejemplo, numero de
acceso NM_003407, figura 2), variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a los mismos. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido y las dianas incluyen regiones codificantes y no codificantes de polinucleotidos antisentido y/o sentido de TTP.
5 Los segmentos diana preferidos de la presente divulgacion tambien pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos de la presente divulgacion para formar oligonucleotidos (duplexados) bicatenarios estabilizados.
Se ha demostrado en la materia que dichos restos de oligonucleotido bicatenario modulan la expresion de la diana y 10 regulan la traduccion, ademas del procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Ademas, los restos bicatenarios pueden someterse a modificaciones qufmicas (Fire y col., (1998) Nature, 391, 806-811; Timmons y Fire, (1998) Nature, 395, 854; Timmons y col., (2001) Gene, 263, 103-112; Tabara y col., (1998) Science, 282, 430-431; Montgomery y col., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 95, 15502-15507; Tuschl y col., (1999) Genes Dev., 13, 3191-3197; Elbashir y col., (2001) Nature, 411, 494-498; Elbashir y col., (2001) Genes Dev. 15, 188-200). Por 15 ejemplo, se ha demostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana por la hibridacion clasica de la cadena antisentido del duplex con la diana, produciendo de este modo la degradacion enzimatica de la diana (Tijsterman y col., (2002) Science, 295, 694-697).
En un aspecto preferido, un oligonucleotido antisentido se dirige a polinucleotidos de tristetraprolina (TTP) (por 20 ejemplo numero de acceso NM_003407), variantes, alelos, isoformas, homologos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a los mismos. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.
De acuerdo con aspectos de la divulgacion, la molecula de acido nucleico diana no se limita a tristetraprolina (TTP) sola, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homologos y similares de las moleculas de 25 tristetraprolina (TTP).
En otro aspecto preferido, un oligonucleotido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleotidos de TTP, por ejemplo, polinucleotidos expuestos como SEQ ID NO: 3 a 5, y cualquier variante, alelo, homologo, mutante, derivado, fragmento y secuencia complementaria a los mismos. Los ejemplos de oligonucleotidos antisentido se 30 exponen como SEQ ID NO: 6 a 10.
En un aspecto, los oligonucleotidos son complementarios a o se unen a secuencias de acido nucleico de tristetraprolina (TTP) antisentido, incluyendo sin limitacion secuencias sentido y/o antisentido no codificantes asociadas con polinucleotidos de tristetraprolina (TTP) y modulan la expresion y/o funcion de moleculas de 35 tristetraprolina (TTP).
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos son complementarios a o se unen a secuencias de acido nucleico de TTP natural antisentido, expuestas como SEQ ID NO: 3 a 5 y modulan la expresion y/o funcion de moleculas de TTP.
40
En un aspecto preferido, los oligonucleotidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleotidos consecutivos de las SEQ ID NO: 6 a 10 y modulan la expresion y/o funcion de moleculas de tristetraprolina (TTP).
Las dianas de polinucleotido comprenden TTP, que incluye miembros de su familia, variantes de TTP; mutantes de 45 TTP, que incluyen SNP; secuencias no codificantes de TTP; alelos de TTP; variantes de especies, fragmentos y similares. Preferentemente, el oligonucleotido es una molecula antisentido.
En otro aspecto preferido, el oligonucleotido que se dirige a polinucleotidos de tristetraprolina (TTP) comprende: ARN antisentido, ARN de interferencia (iARN), ARN interferente pequeno (siRNA); microARN interferente (miARN); 50 un ARN temporal pequeno (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activacion genica inducida por ARN pequeno (aARN); o, ARN activante pequeno (ARNap).
En otro aspecto preferido, la eleccion como diana de polinucleotidos de tristetraprolina (TTP), por ejemplo, SEQ ID NO: 3 a 5, modula la expresion o funcion de estas dianas. En un aspecto, la expresion o funcion esta regulada 55 positivamente en comparacion con un control. En otro aspecto preferido, la expresion o funcion se regula negativamente en comparacion con un control.
En otro aspecto preferido, los compuestos antisentido comprenden secuencias expuestas como SEQ ID NO: 6 a 10. Estos oligonucleotidos pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, fragmentos mas cortos o mas
largos, enlaces modificados y similares.
En otro aspecto preferido, las SEQ ID NO: 6 a 10 comprenden uno o mas nucleotidos de LNA.
La Tabla 1 muestra oligonucleotidos antisentido ejemplares utiles en los procedimientos de la divulgacion. 5
ID de la secuencia
Nombre de la secuencia Secuencia
SEQ ID NO: 6
CUR-0364 rGrArCrUrUrCrUrGrUrCrUrCrUrCrCrArGrUrCir CrCrUrGrArCrCrG
SEQ ID NO: 7
CUR-0366 rGrUrArCrUrCrUrGrUrCrUrUrUrCrGrCrArUrCr CrArUrGrGrCrArC
SEQ ID NO: 8
CUR-0368 rArArUrCrUrUrGrArCrCrUrCrArGrGrCrUrUrCr UrCrArUrUrGrGrA
SEQ ID NO: 9
CUR-0370 rGrArUrCrCrGrArCrCrCrUrGrArllrGrArArUrAr UrGrCrCrArGrCrA
SEQ ID NO: 10
CUR-0372 rArUrCrUrUrCrAiArUrCrGrCrArUrCrUrCrUrGr UrUrUrCrUrGrArG
La modulacion de un acido nucleico diana deseado puede llevarse a cabo de varias formas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, siRNA, etc. Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos (por ejemplo, ribozimas) son moleculas de acidos nucleicos capaces de catalizar una o mas de diversas reacciones, que incluyen 10 la capacidad para escindir repetidamente otras moleculas de acidos nucleicos separadas en un modo especffico de secuencia de bases de nucleotidos. Dichas moleculas de acidos nucleicos enzimaticos pueden usarse, por ejemplo, para dirigirse practicamente a cualquier transcrito de ARN (Zaug y col., 324, Nature 429 1986; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; y Jefferies y col., 17 Nucleic Acids Research 1371, 1989).
15 Debido a su especificidad de secuencia, las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos que se escinden en trans muestran promesa como agentes terapeuticos para enfermedad humana (Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen y Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Las moleculas de acidos nucleicos enzimaticos pueden disenarse para escindir dianas de ARN especfficas dentro del fondo del ARN celular. Un acontecimiento de escision de este tipo convierte el ARNm en no funcional y anula la expresion de protefnas de 20 ese ARN. De este modo puede inhibirse selectivamente la sfntesis de una protefna asociada a una patologfa.
En general, los acidos nucleicos enzimaticos con actividad de escision de ARN actuan uniendose primero a un ARN diana. Dicha union se produce mediante la parte de union de diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimatica de la molecula que actua para escindir el ARN diana. De este modo, 25 el acido nucleico enzimatico se reconoce primero y a continuacion se une a ARN diana mediante apareamiento de bases complementario, y una vez se une al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana. La escision estrategica de dicho ARN diana destruira su capacidad para dirigir la sfntesis de una protefna codificada. Despues de unirse un acido nucleico enzimatico y escindir su aRn diana, se libera de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.
30
Se han usado varios enfoques, tales como estrategias de seleccion in vitro (evolucion) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 435), para desarrollar nuevos catalizadores de acido nucleico capaces de catalizar diversas reacciones, tales como escision y ligamiento de enlaces fosfodiester y enlaces amida, (Joyce, (1989) Gene, 82, 8387; Beaudry y col., (1992) Science 257, 635-641; Joyce, (1992) Scientific American 267, 90-97; Breaker y col., 35 (1994) TIBTECH 12, 268; Bartel y col., (1993) Science 261:1411- 1418; Szostak, (1993) TIBS 17, 89-93; Kumar y col., (1995) FASEB J., 9, 1183; Breaker, (1996) Curr. Op. Biotech., 7, 442).
El desarrollo de ribozimas que son optimas para la actividad catalftica contribuirfa significativamente a cualquier estrategia que empleara ribozimas que escinden ARN con el fin de regular la expresion genica. La ribozima de 40 cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalftica (kcat) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) de cofactor de Mg2+. Se ha demostrado que una ribozima de "ligasa de ARN" artificial cataliza la reaccion de auto-modificacion correspondiente con una velocidad de aproximadamente 100 min-1. Ademas, se sabe que ciertas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos de union al sustrato hechos de ADN catalizan la escision de ARN con multiples velocidades de recuperacion 45 que se aproximan a 100 min-1. Finalmente, la sustitucion de un residuo especffico dentro del nucleo catalftico de la cabeza de martillo con ciertos analogos de nucleotido da ribozimas modificadas que muestran una mejora de hasta 10 veces en la velocidad catalftica. Estos descubrimientos demuestran que las ribozimas pueden promover transformaciones qufmicas con velocidades catalfticas que son significativamente superiores a aquellas mostradas in
vitro por la mayorfa de las ribozimas que se auto-escinden naturales. Entonces es posible que las estructuras de ciertas ribozimas que se auto-escinden puedan optimizarse para dar la maxima actividad catalftica, o que puedan prepararse motivos de ARN completamente nuevos que muestran velocidades significativamente mas rapidas para la escision de fosfodiester de ARN.
5
La escision intermolecular de un sustrato de ARN por un catalizador de ARN que se ajusta al modelo de "cabeza de martillo" se demostro por primera vez en 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). Se recupero el catalizador de ARN y se hizo reaccionar con multiples moleculas de ARN, demostrando que era verdaderamente catalftico.
10
Se han usado ARN catalfticos disenados basandose en el motivo de "cabeza de martillo" para escindir secuencias diana especfficas haciendo cambios de base apropiados en el ARN catalftico para mantener apareamiento de bases necesarios con las secuencias diana (Haseloff y Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot y Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600; Koizumi, M., y col. (1988) FEBS Lett., 228: 22815 230). Esto ha permitido el uso del ARN catalftico para escindir secuencias diana especfficas e indica que los ARN catalfticos disenados segun el modelo de "cabeza de martillo" pueden escindir posiblemente ARN de sustrato especffico in vivo. (Vease Haseloff y Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot y Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600).
20 La interferencia de ARN (iARN) se ha convertido en una poderosa herramienta para modular la expresion genica en mamfferos y celulas de mamffero. Este enfoque requiere la administracion de ARN interferente pequeno (siRNA) bien como el propio ARN o bien como ADN, usando un plasmido de expresion o virus y la secuencia codificante para ARN de horquilla pequeno que se procesa a siRNA. Este sistema permite el eficaz transporte de los pre-siRNA al citoplasma en el que son activos y permite el uso de promotores regulados y especfficos de tejido para la expresion 25 genica.
En un aspecto preferido, un oligonucleotido o compuesto antisentido comprende un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) y/o acido desoxirribonucleico (ADN), o un mimetico, quimera, analogo u homologo de los mismos. Este termino incluye oligonucleotidos compuestos de nucleotidos de origen natural, azucares y enlaces 30 internucleosfdicos covalentes (esqueleto), ademas de oligonucleotidos que tienen partes no de origen natural que funcionan similarmente. Dichos oligonucleotidos modificados o sustituidos son frecuentemente deseados con respecto a formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captacion celular potenciada, afinidad potenciada por un acido nucleico diana y elevada estabilidad en presencia de nucleasas.
35 De acuerdo con la presente divulgacion, los oligonucleotidos o "compuestos antisentido" incluyen oligonucleotidos antisentido (por ejemplo, ARN, ADN, mimetico, quimera, analogo u homologo de los mismos), ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de gufa externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (iARN) de ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, ARNap, ARNa, y otros compuestos oligomericos que hibridan con al menos una parte del acido nucleico diana y modulan su funcion. Por lo tanto, pueden ser ADN, aRn, 40 similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser mimeticos de uno o mas de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligomericos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden incluir construcciones tales como, por 45 ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una unica cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridacion y formacion de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleotido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extension del caracter 50 monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden incluir nucleotidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleotido seleccionadas, posiciones de azucar o a uno de los enlaces internucleosfdicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de acido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molecula tipo horquilla auto-complementaria que se dobla 55 sobre sf misma para formar un duplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulacion especffica de la expresion genica por expresion estable de horquillas de dsARN en lfneas celulares transgenicas (Hammond y col., (1991) Nat. Rev. Genet., 2, 110-119: Matzke y col., (2001) Curr. Opin. Genet. Dev., 11, 221-227; Sharp, (2001) Genes Dev., 15, 485-490). Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una unica cadena que adopta la forma de una molecula de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre
si misma para formar un duplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de duplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.
Una vez introducidos en un sistema, los compuestos de la divulgacion pueden provocar la accion de una o mas 5 enzimas o protefnas estructurales para efectuar la escision u otra modificacion del acido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupacion. En general, los acidos nucleicos (incluyendo oligonucleotidos) pueden describirse como "similares a ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-desoxiazucares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o mas 2'-hidroxilazucares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las helices de 10 acido nucleico pueden adoptar mas de un tipo de estructura, mas comunmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleotidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos casos (quimericos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B.
15 Los compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgacion pueden comprender una parte antisentido de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleotidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleosidos enlazados) de longitud. Esto se refiere a la longitud de la cadena antisentido o parte del compuesto antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido monocatenario de la divulgacion comprende de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos, y un compuesto antisentido bicatenario de la divulgacion (tal como un dsARN, por 20 ejemplo) comprende una cadena sentido y antisentido o parte de 5 a aproximadamente 80 nucleotidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciara que este comprenda partes antisentido de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.
25
En un aspecto, los compuestos antisentido de la divulgacion tienen partes antisentido de 10 a 50 nucleotidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciara que estos integran oligonucleotidos que tienen partes antisentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleotidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias. En 30 algunos aspectos, los oligonucleotidos tienen 15 nucleotidos de longitud.
En un aspecto, los compuestos antisentido o de oligonucleotido de la divulgacion tienen partes antisentido de 12 o 13 a 30 nucleotidos de longitud. Un experto en la materia apreciara que estos integran compuestos antisentido que tienen partes antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleotidos de 35 longitud, o cualquier intervalo entremedias.
En otro aspecto preferido, los compuestos oligomericos de la presente divulgacion tambien incluyen variantes en las que una base diferente esta presente en una o mas de las posiciones de nucleotido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleotido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en 40 esa posicion. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones de los compuestos antisentido o de dsARN. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresion de un acido nucleico diana.
En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad, entre el compuesto antisentido y 45 la target es de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad, es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad, es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homologfa, identidad de secuencia o complementariedad, es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, loa homologfa, identidad de secuencia 50 o complementariedad, es aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100%.
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos antisentido, tales como, por ejemplo, las moleculas de acidos 55 nucleicos expuestas en las SEQ ID NO: 3 a 10, comprenden una o mas sustituciones o modificaciones. En un aspecto, los nucleotidos estan sustituidos con acidos nucleicos bloqueados (LNA).
En otro aspecto preferido, los oligonucleotidos se dirigen a una o mas regiones de las moleculas de acidos nucleicos sentido y/o antisentido de secuencias codificantes y/o no codificantes asociadas a TTP y las secuencias expuestas
como SEQ ID NO: 1, 3, 4 y 5. Los oligonucleotidos tambien se dirigen a regiones solapantes de las SEQ ID NO: 1, 3, 4 y 5.
Ciertos oligonucleotidos preferidos de esta divulgacion son oligonucleotidos quimericos. "Oligonucleotidos 5 quimericos" o "quimeras", en el contexto de esta divulgacion, son oligonucleotidos que contienen dos o mas regiones qufmicamente distintas, cada una constituida por al menos un nucleotido. Estos oligonucleotidos normalmente contienen al menos una region de nucleotidos modificados que confiere una o mas propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasas incrementada, captacion en celulas incrementada, afinidad de union por la diana incrementada) y una region que es un sustrato para enzimas capaces de escindir hfbridos de ARN:ADN o 10 ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un
duplex de ARN:ADN. La activacion de ARNasa H, por lo tanto, produce la escision del ARN diana, potenciando asf
enormemente la eficiencia de la modulacion antisentido de la expresion genica. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleotidos mas cortos cuando se usan oligonucleotidos quimericos, en comparacion con desoxioligonucleotidos de fosforotioato que hibridan con la misma region diana. La 15 escision del ARN diana puede detectarse rutinariamente por electroforesis en gel y, si fuera necesario, tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos asociadas conocidas en la tecnica. En un aspecto preferido, un oligonucleotido quimerico comprende al menos una region modificada para aumentar la afinidad de union de la diana, y, normalmente, una region que actua de sustrato para ARNasa H. La afinidad de un oligonucleotido por su diana (en este caso, un acido nucleico que codifica ras) se determina rutinariamente midiendo la Tm de un par de
20 oligonucleotido/diana, que es la temperatura a la que se disocian el oligonucleotido y la diana; la disociacion se
detecta espectrofotometricamente. Cuanto mayor sea la Tm, mayor sera la afinidad del oligonucleotido por la diana.
Los compuestos antisentido quimericos de la divulgacion pueden formarse como estructuras compuestas por dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, mimeticos de oligonucleosidos y/o por oligonucleotidos, tal como 25 se han descrito anteriormente. Dichos compuestos tambien se han denominado en la tecnica hfbridos o gapmeros. Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichas estructuras hfbridas comprenden, aunque no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N° 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922.
30 En otro aspecto preferido, la region del oligonucleotido que se modifica comprende al menos un nucleotido modificado en la posicion 2' del azucar, de la forma mas preferente un nucleotido modificado con 2'-Oalquilo, 2'-O- alquil-O-alquilo o 2'-fluor. En otros aspectos preferidos, las modificaciones de ARN incluyen modificaciones de 2'- fluor, 2'-amino y 2'-O-metilo en la ribosa de pirimidinas, residuos abasicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones se incorporan rutinariamente en oligonucleotidos y se ha demostrado que estos 35 oligonucleotidos tienen una mayor Tm (es decir, mayor afinidad de union a diana) que los 2'-desoxioligonucleotidos contra una diana dada. El efecto de dicha afinidad incrementada es potenciar enormemente la inhibicion por oligonucleotidos de iARN de la expresion genica. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN del duplex de ARN:ADN; por lo tanto, la activacion de esta enzima produce la escision del ARN diana, y de este modo puede potenciar enormemente la eficiencia de inhibicion de iARN. La escision del ARN diana puede 40 demostrarse rutinariamente por electroforesis en gel. En otro aspecto preferido, el oligonucleotido quimerico tambien se modifica para potenciar la resistencia a nucleasas. Las celulas contienen diversas exo- y endo-nucleasas que pueden degradar acidos nucleicos. Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleotidos y nucleosidos hacen que el oligonucleotido en el que se incorporan sea mas resistente a la digestion por nucleasa que el oligodesoxinucleotido nativo. La resistencia a nucleasas se mide rutinariamente incubando oligonucleotidos con 45 extractos celulares o soluciones de nucleasa aisladas y midiendo el grado de oligonucleotido intacto que queda con el tiempo, normalmente por electroforesis en gel. Los oligonucleotidos que se han modificado para potenciar su resistencia a nucleasas sobreviven intactos durante mas tiempo que los oligonucleotidos sin modificar. Se ha demostrado que diversas modificaciones de oligonucleotidos potencian o confieren resistencia a nucleasas. Los oligonucleotidos que contienen al menos una modificacion de fosforotioato son actualmente mas preferidos. En 50 algunos aspectos, las modificaciones de oligonucleotidos que potencian la afinidad de union a diana son, por lo tanto, independientemente capaces de potenciar la resistencia a nucleasas. Algunas modificaciones deseables pueden encontrarse en De Mesmaeker y col. (1995) Acc. Chem. Res., 28: 366-374.
Ejemplos especfficos de algunos oligonucleotidos preferidos concebidos por esta divulgacion incluyen aquellos que 55 comprenden esqueletos modificados, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriesteres, metilfosfonatos, enlaces entre azucares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azucares heteroatomicos o heterocfclicos de cadena corta. Los mas preferidos son oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y aquellos con esqueletos de heteroatomo, particularmente esqueletos de CH2--NH--O--CH2, CH, --N(CH3)--O--CH2 [conocido como un esqueleto de metilen(metilimino) o MMI], CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2-N(CH3)--N (CH3)--CH2 y O-- N(CH3)--CH2--
CH2, en los que el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como O--P--O--CH,). Tambien se prefieren esqueletos de amida descritos por De Mesmaeker y col. (1995) Acc. Chem. Res. 28: 366-374. Tambien se prefieren oligonucleotidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino (Summerton y Weller, patente de Estados Unidos N° 5.034.506). En otros aspectos preferidos, tal como el esqueleto de acido nucleico peptfdico (PNA), el esqueleto 5 de fosfodiester del oligonucleotido se sustituye por un esqueleto de poliamida, estando los nucleotidos unidos directamente o indirectamente a los atomos de nitrogeno azo del esqueleto de poliamida (Nielsen y col. (1991) Science 254, 1497). Los oligonucleotidos tambien pueden comprender uno o mas restos de azucar sustituidos. Oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)nNH2 o O(CH2)nCH3 en los que n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo C1 a 10 C10 inferior, alcoxialcoxi, alquilo, alcarilo o aralquilo inferior sustituido; CI; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, o N-alquilo; O--, S--, o N-alquenilo; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escision de ARN; un grupo indicador; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una 15 modificacion preferida incluye 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2 CH2 OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo)] (Martin y col., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486). Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O--CH3), 2'-propoxi(2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-fluor (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como ciclobutilos en 20 lugar del grupo pentofuranosilo.
Los oligonucleotidos tambien pueden incluir, adicionalmente o como alternativa, modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la tecnica simplemente "base"). Tal como se usa en el presente documento, nucleotidos "no modificados" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y 25 uracilo (U). Los nucleotidos modificados incluyen nucleotidos encontrados solo poco frecuentemente o transitoriamente en acidos nucleicos naturales, por ejemplo, hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me-pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (tambien denominada 5-metil-2'-desoxicitosina y frecuentemente denominada en la tecnica 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, ademas de nucleotidos sinteticos, por ejemplo, 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u 30 otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-deazaguanina, N6(6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina (Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pags. 75-77; Gebeychu, G., (1987) y col. Nucl. Acids Res. 15:4513). Puede incluirse una base "universal" conocida en la tecnica, por ejemplo, inosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-Me-C aumentan la estabilidad del duplex de acido nucleico 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., 35 Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pags. 276-278) y son las sustituciones de base actualmente preferidas.
Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar quimicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad o captacion celular del oligonucleotido. Dichos restos incluyen, 40 aunque no se limitan a, restos de lipido tales como un resto de colesterol, un resto colesterilo (Letsinger y col., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86, 6553), acido colico (Manoharan y col. (1994) Bioorg. Med. Chem. Let. 4, 1053), un tioeter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan y col. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 306; Manoharan y col. (1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3, 2765), un tiocolesterol (Oberhauser y col., (1992) Nucl. Acids Res. 20, 533), una cadena alifatica, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras y col. EMBO J. 1991, 10, 45 111; Kabanov y col. (1990) FEBS Lett. 259, 327; Svinarchuk y col. (1993) Biochimie 75, 49), un fosfolipido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero- 3-H-fosfonato (Manoharan y col. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651; Shea y col. (1990) Nucl. Acids Res. 18, 3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan y col. (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969), o acido TTPantanoacetico (Manoharan y col. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651). Los oligonucleotidos que comprenden restos lipofilos, y procedimientos 50 para preparar dichos oligonucleotidos, son conocidos en la tecnica, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5.138.045, 5.218.105 y 5.459.255.
No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleotido dado esten uniformemente modificadas, y de hecho mas de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un unico oligonucleotido o 55 incluso dentro de un unico nucleosido dentro de un oligonucleotido. La presente divulgacion tambien incluye oligonucleotidos que son oligonucleotidos quimericos, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento.
En otro aspecto, la molecula de acido nucleico de la presente divulgacion esta conjugada con otro resto que incluye,
aunque no se limita a, nucleotidos abasicos, polieter, poliamina, poliamidas, peptidos, hidratos de carbono, lipido, o compuestos de polihidrocarburo. Los expertos en la materia reconoceran que estas moleculas pueden enlazarse a uno o mas de cualquiera de los nucleotidos que comprenden la molecula de acido nucleico en varias posiciones en el azucar, base o grupo fosfato.
5
Los oligonucleotidos usados de acuerdo con esta divulgacion pueden prepararse comoda y rutinariamente mediante la tecnica muy conocida de sfntesis en fase solida. Equipo para dichas sfntesis es comercializado por varios proveedores que incluyen Applied Biosystems. Tambien puede emplearse cualquier otro medio para dicha sfntesis; la sfntesis real de los oligonucleotidos esta perfectamente dentro de las aptitudes de un experto en la materia. 10 Tambien es muy conocido usar tecnicas similares para preparar otros oligonucleotidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados. Tambien es muy conocido usar tecnicas similares y amiditos modificados disponibles en el mercado y productos de vidrio de poro controlado (CPG) tales como biotina, fluorescefna, acridina o amiditos modificados con psoraleno y/o CPG (disponible de Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleotidos marcados de forma fluorescente, biotinilados u otros oligonucleotidos modificados tales como oligonucleotidos 15 modificados con colesterol.
De acuerdo con la divulgacion, el uso de modificaciones tales como el uso de monomeros de LNA para potenciar la potencia, especificidad y duracion de la accion y ampliar las vfas de administracion de oligonucleotidos comprende qufmicas actuales tales como MOE, ANA, FANA, PS, etc. (Uhlman, y col. (2000) Current Opinions in Drug Discovery 20 & Development Vol. 3 N° 2). Esto puede lograrse sustituyendo algunos de los monomeros en los presentes oligonucleotidos por monomeros de LNA. El oligonucleotido modificado con LNA puede tener un tamano similar al compuesto parental o puede ser mas largo o preferentemente mas pequeno. Se prefiere que dichas oligonucleotidos modificados con LNA contengan menos de aproximadamente el 70%, mas preferentemente menos de aproximadamente el 60%, mas preferentemente menos de aproximadamente el 50% de monomeros de LNA y que 25 sus tamanos esten entre aproximadamente 5 y 25 nucleotidos, mas preferentemente entre aproximadamente l2 y 20 nucleotidos.
Esqueletos de oligonucleotidos modificados preferidos comprenden, aunque no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, metil y otros alquil fosfonatos que 30 comprenden 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, analogos enlazados en 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleosidos estan enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. Tambien estan incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de acido libre.
35
Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de los enlaces que contienen fosforo anteriores comprenden, aunque no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N° 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 40 5.587.361; y 5.625.050.
Esqueletos de oligonucleotido modificados preferidos que no incluyen un atomo de fosforo en ellos tienen esqueletos que se forman por enlaces internucleosfdicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosfdicos de heteroatomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o mas enlaces internucleosfdicos heteroatomicos o heterocfclicos 45 de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azucar de un nucleosido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfoxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.
50
Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de los oligonucleosidos anteriores comprenden, aunque no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N° 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596. 086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 55 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.
En otros mimeticos de oligonucleotidos preferidos, tanto el azucar como el enlace internucleosfdico, es decir, el esqueleto, de las unidades de nucleotido se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridacion con un compuesto de acido nucleico diana apropiado. Dicho compuesto oligomerico, un
oligonucleotido mimetico que se ha demostrado que tiene excelente propiedades de hibridacion, se denomina acido nucleico peptfdico (PNA). En compuestos de PNA, el esqueleto de azucar de un oligonucleotido se sustituye por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se unen directamente o indirectamente a atomos de nitrogeno azo de la parte de amida del esqueleto. Patentes de 5 Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de compuestos de PNA comprenden, aunque no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Ensenanzas adicionales de compuestos de PNA pueden encontrarse en Nielsen, y col. (1991) Science 254, 1497-1500.
En otro aspecto preferido de la divulgacion, los oligonucleotidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleosidos 10 con esqueletos de heteroatomo, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-, son conocidos como un esqueleto de metileno (metilimino) o MMI, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- y -O-N(CH3)-CH2- CH2- en las que el esqueleto de fosfodiester nativo se representa como -O-P-O-CH2- de la patente de Estados Unidos N° 5.489.677 citada anteriormente, y los esqueletos de amida de la patente de Estados Unidos N° 5.602.240 citada anteriormente. Tambien se prefieren oligonucleotidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino de la 15 patente de Estados Unidos N° 5.034.506 citada anteriormente.
Los oligonucleotidos modificados tambien pueden contener uno o mas restos de azucar sustituidos. Oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, So N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C a CO sustituido o 20 sin sustituir o alquenilo y alquinilo C2 a CO. Se prefieren particularmente O(CH2)n OmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2nON(CH2)nCH3)2 en las que n y m pueden ser de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': C a CO, (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, nH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, 25 polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escision de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un oligonucleotido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificacion preferida comprende 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, tambien conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin y col., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificacion preferida 30 comprende 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2'-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos en el presente documento mas adelante, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (tambien conocido en la tecnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.
Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluor 35 (2'-F). Tambien pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' o en oligonucleotidos enlazados 2'-5' y la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'. Los oligonucleotidos tambien pueden tener mimeticos de azucar tales como restos ciclobutilo en lugar del azucar pentofuranosilo. Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichas estructuras de azucar modificadas comprenden, aunque no se limitan a, las patentes de 40 Estados Unidos N° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.
Los oligonucleotidos tambien pueden comprender modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente 45 denominadas en la tecnica simplemente "base"). Tal como se usa en el presente documento, nucleotidos "no modificados" o "naturales" comprenden las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleotidos modificados comprenden otros nucleotidos sinteticos y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6- metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros de alquilo de adenina y 50 guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halogeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halogeno, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilquanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7- deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
55
Ademas, los nucleotidos comprenden los descritos en la patente de Estados Unidos N° 3.687.808, los descritos en The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, paginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellos descritos por Englisch y col., 'Angewandle Chemie, lnternational Edition', 1991, 30, pagina 613, y aquellos descritos por Sanghvi, Y.S., Capftulo 15, 'Antisense Research and Applications', paginas 289-302,
Crooke, S.T. y Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Ciertos de estos nucleotidos son particularmente utiles para aumentar la afinidad de union de los compuestos oligomericos de la divulgacion. Estos comprenden pirimidinas 5- sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y 0-6, que comprenden 2-aminopropiladenina, 5- propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del 5 duplex de acido nucleico en 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds, 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pags. 276-278) y son sustituciones de base actualmente preferidas, incluso mas particularmente cuando se combinan con modificaciones de 2'-O-metoxietilazucar.
Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de los nucleotidos modificados indicados 10 anteriormente, ademas de otros nucleotidos modificados, comprenden, aunque no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N° 3.687.808, asf como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.596.091; 5.614.617; 5.750.692 y 5.681.941.
15 Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar qufmicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados, que potencian la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido.
Dichos restos comprenden, aunque no se limitan a, restos de lfpido tales como un resto colesterol, (Letsinger y col., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 86, 6553-6556), acido colico, (Manoharan y col., (1994) Bioorg. Med. Chem. 20 Let., 4, 1053-1060), un tioeter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol, (Manoharan y col., (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci., 660, 306-309; Manoharan y col., (1993) Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765-2770), un tiocolesterol, (Oberhauser y col., (1992) Nucl. Acids Res., 20, 533-538), una cadena alifatica, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o de undecilo (Kabanov y col., (1990) FEBS Lett., 259, 327-330; Svinarchuk y col., (1993) Biochimie 75, 49-54), un fosfolfpido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan y col., 25 (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654; Shea y col., (1990) Nucl. Acids Res., 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol, (Mancharan y col., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969-973), o acido TTPantanoacetico (Manoharan y col., (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654), un resto palmitilo, (Mishra y col., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237), o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke y col., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277, 923-937).
30
Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichos oligonucleotidos conjugados comprenden, aunque no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105;
5.525.465
5.541.313 5.545.730 5.552.538 5.578.717 5.580.731 5.580.731 5.591.584 5.109.124 5.118.802
5.138.045
5.414.077 5.486.603 5.512.439 5.578.718 5.608.046 4.587.044 4.605.735 4.667.025 4.762.779
35 4.789.737
4.824.941 4.835.263 4.876.335 4.904.582 4.958.013 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.082.830
5.112.963
5.214.136 5.245.022 5.254.469 5.258.506 5.262.536 5.272.250 5.292.873 5.317.098 5.371.241
5.391.723
5.416.203 5.451.463 5.510.475 5.512.667 5.514.785 5.565.552 5.567.810 5.574.142 5.585.481
5.587.371
5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.
40 Descubrimiento de farmacos: los compuestos de la presente divulgacion tambien pueden aplicarse en las areas del descubrimiento de farmacos y validacion de dianas. La presente divulgacion comprende el uso de los compuestos y segmentos diana preferidos identificados en el presente documento en esfuerzos de descubrimiento de farmacos para esclarecer relaciones que existen entre polinucleotidos de tristetraprolina (TTP) y una patologfa, fenotipo o afeccion. Estos procedimientos incluyen detectar o modular los polinucleotidos de tristetraprolina (TTP) que 45 comprenden poner en contacto una muestra, tejido, celula u organismo con los compuestos de la presente divulgacion, medir el nivel de acido nucleico o de protefna de los polinucleotidos de tristetraprolina (TTP) y/o un criterio de valoracion fenotfpico o qufmico relacionado en algun momento despues del tratamiento, y opcionalmente comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con otro compuesto de la divulgacion. Estos procedimientos tambien pueden realizarse en paralelo o en combinacion con otros experimentos para determinar la 50 funcion de genes desconocidos para el proceso de validacion de dianas o para determinar la validez de un producto genico particular como diana para el tratamiento o prevencion de una enfermedad, afeccion o fenotipo particular.
Evaluacion de la regulacion positiva o inhibicion de la expresion genica:
55 La transferencia de un acido nucleico exogeno a una celula u organismo huesped puede evaluarse detectando directamente la presencia del acido nucleico en la celula u organismo. Dicha deteccion puede lograrse mediante varios procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la presencia del acido nucleico exogeno puede detectarse por Southern blot o por una tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que amplifican especfficamente secuencias de nucleotidos asociadas al acido nucleico. La expresion de los acidos
nucleicos exogenos tambien puede medirse usando procedimientos convencionales que incluyen analisis de expresion genica. Por ejemplo, el ARNm producido a partir de un acido nucleico exogeno puede detectarse y cuantificarse usando una Northern blot y PCR con transcripcion inversa (RT-PCR).
5 La expresion de ARN del acido nucleico exogeno tambien puede detectarse midiendo una actividad enzimatica o una actividad de protefna reportera. Por ejemplo, puede medirse la actividad moduladora antisentido indirectamente como una disminucion o aumento en la expresion de acido nucleico diana como una indicacion de que el acido nucleico exogeno esta produciendo el ARN efector. Basandose en conservacion de secuencias, pueden disenarse cebadores y usarse para amplificar regiones codificantes de los genes diana. Inicialmente, la region codificante mas 10 altamente expresada de cada gen puede usarse para construir un gen de control modelo, aunque puede usarse cualquier region codificante o no codificante. Cada gen de control se ensambla insertando cada region codificante entre una region codificante reportera y su senal de poli(A). Estos plasmidos producirfan un ARNm con un gen reportero en la parte cadena arriba del gen y una posible diana de iARN en la region no codificante 3'. La eficacia de oligonucleotidos antisentido individuales se ensayarfa por modulacion del gen reportero. Genes reporteros utiles en 15 los procedimientos de la presente divulgacion incluyen acetohidroxiacido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), protefna verde fluorescente (GFP), protefna roja fluorescente (RFP), protefna amarilla fluorescente (YFP), protefna cian fluorescente (CFP), peroxidasa de rabano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS), y derivados de los mismos. Estan disponibles multiples marcadores de seleccion que confieren resistencia a 20 ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Los procedimientos de determinacion de la modulacion de un gen reportero son muy conocidos en la tecnica, e incluyen, aunque no se limitan a, procedimientos fluorimetricos (por ejemplo, espectroscopfa de fluorescencia, clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), microscopfa de fluorescencia), determinacion de la resistencia a antibioticos.
25
La expresion de protefna y de ARNm de TTP puede ensayarse usando procedimientos conocidos para los expertos en la materia y descritos en cualquier parte en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos tales como ELlSA para medir niveles de protefna. Los anticuerpos de TTP para los ELISA estan disponibles en el mercado, por ejemplo, de Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA) (Minneapolis, MN), Abeam, Cambridge, MA. 30
En aspectos, la expresion de TTP (por ejemplo, ARNm o protefna) en una muestra (por ejemplo, celulas o tejidos in vivo o in vitro) tratada usando un oligonucleotido antisentido de la divulgacion se evalua comparando con la expresion de TTP en una muestra de control. Por ejemplo, la expresion de la protefna o acido nucleico puede compararse usando procedimientos conocidos para los expertos en la materia con aquella en una muestra tratada 35 con vector simulado o sin tratar. Como alternativa, la comparacion con una muestra tratada con un oligonucleotido antisentido de control (por ejemplo, una que tiene una secuencia alterada o diferente) puede hacerse dependiendo de la informacion deseada. En otro aspecto, una diferencia en la expresion de la protefna o acido nucleico de TTP en una muestra tratada frente a sin tratar puede compararse con la diferencia en la expresion de un acido nucleico diferente (incluyendo cualquier estandar considerado apropiado por el investigador, por ejemplo, un gen de 40 mantenimiento) en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar.
Las diferencias observadas pueden expresarse segun se desee, por ejemplo, en forma de una relacion o fraccion, para su uso en una comparacion con control. En aspectos, el nivel de ARNm o protefna de TTP, en una muestra tratada con un oligonucleotido antisentido de la presente divulgacion, disminuye o aumenta de aproximadamente 45 1,25 veces a aproximadamente 10 veces o mas con respecto a una muestra sin tratar o una muestra tratada con un acido nucleico de control. En aspectos, el nivel de ARNm o protefna de TTP aumenta o disminuye al menos aproximadamente 1,25 veces, al menos aproximadamente 1,3 veces, al menos aproximadamente 1,4 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente 1,7 veces, al menos aproximadamente 1,8 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, 50 al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces o 55 mas.
Kits, reactivos de investigacidn, diagnosticos y terapeuticos
Los compuestos de la presente divulgacion pueden utilizarse para diagnostico, agentes terapeuticos y profilaxis, y
como reactivos de investigacion y componentes de kits. Ademas, los oligonucleotidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresion genica con exquisita especificidad, son usados frecuentemente por los expertos en la materia para aclarar la funcion de genes particulares o para distinguir entre funciones de diversos miembros de una via biologica.
5
Para su uso en kits y diagnosticos y en diversos sistemas biologicos, los compuestos de la presente divulgacion, tanto solos como en combinacion con otros compuestos o terapeuticos, son utiles como herramientas en analisis diferenciales y/o combinatorios para aclarar patrones de expresion de una parte o de todo el complemento de genes expresados dentro de celulas y tejidos.
10
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "sistema biologico" o "sistema" se define como cualquier organismo, celula, cultivo celular o tejido que expresa, o se ha hecho competente para expresar productos de genes de tristetraprolina (TTP). Estos incluyen, aunque no se limitan a, seres humanos, animales transgenicos, celulas, cultivos celulares, tejidos, xenoinjertos, trasplantes y combinaciones de los mismos.
15
Como un ejemplo no limitante, patrones de expresion dentro de celulas o tejidos tratados con uno o mas compuestos antisentido se comparan con celulas o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para niveles diferenciales de expresion genica, ya que estan relacionados, por ejemplo, con asociacion de enfermedad, via de senalizacion, localizacion celular, nivel de expresion, tamano, estructura o funcion 20 de los genes examinados. Estos analisis pueden realizarse en celulas estimuladas o sin estimular y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan los patrones de expresion.
E Ejemplos de procedimientos de analisis de la expresion genica conocidos en la tecnica incluyen matrices o micromatrices de ADN, (Brazma y Vilo, (2000) FEBS Lett., 480, 17-24; Celis, y col., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16), 25 SAGE (analisis en serie de la expresion genica) (Madden, y col., (2000) Drug Discov. Today, 5, 415- 425), READS (amplificacion por enzima de restriccion de ADNc digeridos) (Prashar y Weissman, (1999) Methods Enzymol., 303, 258-72), TOgA (analisis de la expresion genica total) (Suteliffe, y col., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.., 97, 1976-81), matrices de protefnas y proteomica (Celis, y col., (2000) FEbS Lett., 480, 2-16; Jungblut, y col., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciacion de marcadores de secuencia expresada (EST) (Celis, y col., 30 FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, y col., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huellas genomicas de ARN sustractivas (SuRF), (Fuchs, y col., (2000) Anal. Biochem. 286, 91-98; Larson, y col., (2000) Cytometry 41, 203-208), clonacion sustractiva, expresion diferencial (DD), (Jurecic y Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21), hibridacion genomica comparativa (Carulli, y col., (1998) J. Cell Biochem. Suppl., 31, 286-96), tecnicas de FISH (hibridacion in situ fluorescente) (Going y Gustcrson, (1999) Eur. J. Cancer, 35, 1895-904) y procedimientos de 35 espectrometrfa de masas (To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen, 3, 235-41).
Los compuestos de la divulgacion son utiles para investigacion y diagnostico, debido a que estos compuestos hibridan con acidos nucleicos que codifican tristetraprolina (TTP). Por ejemplo, los oligonucleotidos que hibridan con dicha eficiencia y en dichas condiciones que se han descrito en el presente documento como moduladores de 40 tristetraprolina (TTP) eficaces son cebadores o sondas eficaces en condiciones que favorecen la amplificacion genica o deteccion, respectivamente. Estos cebadores y sondas son utiles en procedimientos que requieren la deteccion especffica de moleculas de acidos nucleicos que codifican tristetraprolina (TTP) y en la amplificacion de dichas moleculas de acidos nucleicos para la deteccion o para su uso en estudios adicionales de tristetraprolina (TTP). La hibridacion de los oligonucleotidos antisentido, particularmente los cebadores y sondas, de la divulgacion 45 con un acido nucleico que codifica tristetraprolina (TTP) puede detectarse por medios conocidos en la tecnica. Dichos medios pueden incluir conjugacion de una enzima con el oligonucleotido, radiomarcado del oligonucleotido, o cualquier otro medio de deteccion adecuado. Tambien pueden prepararse kits que usan dichos medios de deteccion para detectar el nivel de tristetraprolina (TTP) en una muestra.
50 La especificidad y sensibilidad de antisentido tambien es empleada por los expertos en la materia para usos terapeuticos. Se han empleado oligonucleotidos antisentido como restos terapeuticos en el tratamiento de patologfas en animales, que incluyen seres humanos. Los farmacos de oligonucleotido antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clfnicos estan actualmente en marcha. De este modo, se establece que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden 55 configurarse para ser utiles en regfmenes de tratamiento para el tratamiento de celulas, tejidos y animales, especialmente seres humanos.
Para terapeuticos, un animal, prefe rente me nte un ser humano, que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresion de tristetraprolina (TTP) se trata administrando compuestos
antisentido de acuerdo con esta divulgacion. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal que necesita tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz del modulador de tristetraprolina (TTP). Los moduladores de tristetraprolina (TTP) de la presente divulgacion modulan eficazmente la actividad de tristetraprolina (TTP) o modulan la expresion de la protefna de tristetraprolina (TTP). En 5 un aspecto, la actividad o expresion de tristetraprolina (TTP) en un animal se inhibe aproximadamente el 10% en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion de tristetraprolina (TTP) en un animal se inhibe aproximadamente el 30%. Mas preferentemente, la actividad o expresion de tristetraprolina (TTP) en un animal se inhibe el 50% o mas. De este modo, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm de tristetraprolina (TTP) al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al 10 menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100% en comparacion con un control.
En un aspecto, la actividad o expresion de tristetraprolina (TTP) y/o en un animal se incrementa aproximadamente el 10% en comparacion con un control. Preferentemente, la actividad o expresion de tristetraprolina (TTP) en un animal 15 se incrementa aproximadamente el 30%. Mas preferentemente, la actividad o expresion de tristetraprolina (TTP) en un animal se incrementa el 50% o mas. De este modo, los compuestos oligomericos modulan la expresion del ARNm de tristetraprolina (TTP) al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100% en comparacion con un control.
20
Por ejemplo, la reduccion de la expresion de tristetraprolina (TTP) puede medirse en suero, sangre, tejido adiposo, hfgado o cualquier otro lfquido corporal, tejido u organo del animal. Preferentemente, las celulas contenidas dentro de dichos lfquidos, tejidos u organos que se analizan contienen una molecula de acido nucleico que codifica peptidos de tristetraprolina (TTP) y/o la propia protefna tristetraprolina (TTP).
25
Los compuestos de la divulgacion pueden utilizarse en composiciones farmaceuticas anadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o vehfculo farmaceuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos y procedimientos de la divulgacion tambien pueden ser utiles profilacticamente.
30 Conjugados
Otra modificacion de los oligonucleotidos de la divulgacion implica enlazar quicamente al oligonucleotido uno o mas restos o conjugados que potencian la actividad, distribucion celular o captacion celular del oligonucleotido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados covalentemente unidos a grupos funcionales tales como 35 grupos hidroxilo primarios o secundarios. Grupos conjugados de la divulgacion incluyen intercaladores, moleculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que potencian las propiedades
farmacodinamicas de oligomeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocineticas de oligomeros. Grupos conjugados tfpicos incluyen colesteroles, lfpidos, fosfolfpidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluorescefnas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Grupos que potencian las propiedades
40 farmacodinamicas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, potencian la resistencia a la degradacion y/o fortalecen la hibridacion especffica de secuencia con el acido nucleico diana. Grupos que potencian las propiedades farmacocineticas, en el contexto de esta divulgacion, incluyen grupos que mejoran la captacion, distribucion, metabolismo o eliminacion de los compuestos de la presente divulgacion. Grupos conjugados representativos se describen en la solicitud de patente internacional N°. PCT/US92/09196, presentada el 23 de 45 octubre de 1992, y la patente de Estados Unidos N° 6.287.860. Restos conjugados incluyen, aunque no se limitan a, restos de lfpido tales como un resto colesterol, acido colico, un tioeter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolfpido, por ejemplo, di-hexadecil- rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido TTPantanoacetico, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil- 50 oxicolesterol. Los oligonucleotidos de la divulgacion tambien pueden conjugarse con principios activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, acido 2,3,5-triyodobenzoico, acido flufenamico, acido folfnico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbiturico, una cefalosporina, un farmaco sulfa, un antidiabetico, un antibacteriano o un antibiotico.
55
Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichos oligonucleotidos conjugados incluyen, aunque no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717; 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737;
4.824.941;
4.835.263; 4.876.335 ; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963
5.214.136;
5.245.022; 5.254.469 ; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241; 5.391.723
5.416.203;
5.451.463 5.510.475 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371
5.595.726;
5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.
5
Formulaciones
Los compuestos de la divulgacion tambien pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moleculas, estructuras de molecula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moleculas 10 dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, topica u otras, para ayudar en la captacion, distribucion y/o absorcion. Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de dichas formulaciones que ayudan en la captacion, distribucion y/o absorcion incluyen, aunque no se limitan a, las patentes de Estados Unidos N° 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.165; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 15 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; y 5.595.756.
Aunque los oligonucleotidos antisentido no necesitan administrarse en el contexto de un vector con el fin de modular la expresion y/o funcion de una diana, aspectos de la divulgacion se refieren a construcciones de vector de expresion para la expresion de oligonucleotidos antisentido, que comprende promotores, secuencias de genes 20 promotores hfbridos y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva, o una actividad promotora que puede inducirse en el caso deseado.
En un aspecto, la practica de la divulgacion implica administrar al menos uno de los oligonucleotidos antisentido anteriores con un sistema de administracion de acidos nucleicos adecuado. En un aspecto, ese sistema incluye un 25 vector no viral enlazado operativamente al polinucleotido. Ejemplos de dichos vectores no virales incluyen el oligonucleotido solo (por ejemplo, una cualquiera o mas de SEQ ID NO: 6 a 10) o en combinacion con una formulacion de protefna, polisacarido o lfpido adecuada.
Sistemas de administracion de acidos nucleicos adecuados adicionales incluyen vector viral, normalmente secuencia 30 de al menos uno de un adenovirus, virus asociado a adenovirus (AAV), adenovirus dependiente de cooperador, retrovirus, o complejo de virus hemaglutinante de Japon-liposoma (HVJ). Preferentemente, el vector viral comprende un promotor de eucariota fuerte operativamente enlazado al polinucleotido, por ejemplo, un promotor del citomegalovirus (CMV).
35 Vectores preferidos adicionales incluyen vectores virales, protefnas de fusion y conjugados qufmicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney y virus basados en el VIH. Un vector viral basado en el VIH preferido comprende al menos dos vectores en los que los genes gag y pol son de un genoma del VIH y el gen env es de otro virus. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de pox tales como vectores de ortopox o avipox, vectores del virus del herpes tales como un vector del virus del herpes simple I (HSV) 40 [Geller, A.I. y col., (1995) J. Neurochem, 64: 487; Lim, F., y col., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford Inglaterra) (1995); Geller, A.I. y col., (1993) Proc Natl. Acad. Sci.: EE. UU.: 90 7603; Geller, A.I., y col., (1990) Proc Natl. Acad. Sci Ee. UU.: 87: 1149], vectores de adenovirus (LeGal LaSalle y col., Science, 259: 988 (1993); Davidson, y col., (1993) Nat. Genet. 3: 219; Yang, y col., (1995) J. Virol. 69: 2004) y vectors de virus adenoasociados (Kaplitt, M.G., y col., (1994) Nat. Genet. 8:148).
45
Los compuestos antisentido de la divulgacion engloban cualquier sal, ester o sal de dichos esteres farmaceuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administracion a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biologicamente activo o residuo del mismo.
50
La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a sales fisiologicamente y farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la divulgacion: es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicologicos no deseados al mismo. Para oligonucleotidos, ejemplos preferidos de sales farmaceuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados 55 Unidos N° 6.287.860.
La presente divulgacion tambien incluye composiciones y formulaciones farmaceuticas que incluyen los compuestos antisentido de la divulgacion. Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden administrarse en varias formas que dependen de si se desea tratamiento local o sistemico y del area que va a tratarse. La
administracion puede ser topica (incluyendo oftalmica y a membranas mucosas que incluyen administracion vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, que incluye por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal, por 5 ejemplo, intratecal o intraventricular.
Para tratar tejidos en el sistema nervioso central, la administracion puede realizarse por, por ejemplo, inyeccion o infusion en el lfquido cefalorraqufdeo. La administracion de ARN antisentido en el lfquido cefalorraqufdeo se describe, por ejemplo, en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N°. 2007/0117772, "Methods for 10 slowing familial ALS disease progression".
Cuando se pretende que el oligonucleotido antisentido de la presente divulgacion se administre a celulas en el sistema nervioso central, la administracion puede ser con uno o mas agentes capaces de promover la penetracion del oligonucleotido antisentido objeto a traves de la barrera hematoencefalica. La inyeccion puede realizarse, por 15 ejemplo, en la corteza entorrinal o hipocampo. La administracion de factores neurotroficos por administracion de un vector de adenovirus a neuronas motoras en tejido muscularse se describe en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.632.427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons". La administracion de vectores directamente al cerebro, por ejemplo, el estriado, el talamo, el hipocampo, o la sustancia negra, se conoce en la tecnica y se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 6.756.523, "Adenovirus vectors for the 20 transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain". La administracion puede ser rapida como mediante inyeccion o realizarse durante un periodo de tiempo como por infusion o administracion lenta de formulaciones de liberacion lenta.
Los oligonucleotidos antisentido objeto tambien puede enlazarse o conjugarse con agentes que proporcionan 25 propiedades farmaceuticas o farmacodinamicas deseables. Por ejemplo, el oligonucleotido antisentido puede acoplarse a cualquier sustancia, conocida en la tecnica para promover la penetracion o transporte a traves de la barrera hematoencefalica, tal como un anticuerpo para el receptor de transferrina, y administrarse mediante inyeccion intravenosa. El compuesto antisentido puede enlazarse con un vector viral, por ejemplo, que hace al compuesto antisentido mas eficaz y/o aumenta el transporte del compuesto antisentido a traves de la barrera 30 hematoencefalica. La rotura osmotica de la barrera hematoencefalica tambien puede llevarse a cabo por, por ejemplo, infusion de azucares que incluyen, aunque no se limitan a, mesoeritritol, xilitol, D(+) galactosa, D(+) lactosa, D(+) xilosa, dulcitol, mioinositol, L(-) fructosa, D(-) manitol, D(+) glucosa, D(+) arabinosa, D(-) arabinosa, celobiosa, D(+) maltosa, D+) rafinosa, L(+) ramnosa, D(+) melibiosa, D(-)ribosa, adonitol, D(+) arabitol, L(-) arabitol, D(+) fucosa, L(-) fucosa, D(-) lixosa, L(+) lixosa y L(-) lixosa, o aminoacidos que incluyen, aunque no se limitan a, 35 glutamina, lisina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, acido glutamico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina, valina y taurina. Procedimientos y materiales para potenciar la penetracion de la barrera hematoencefalica se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 4.866.042, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier", 6.294.520, "Material for passage through the blood-brain barrier", y 6.936.589, "Parenteral delivery systems".
40
Los compuestos antisentido objeto pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moleculas, estructuras de molecula o mezclas de compuestos, por ejemplo, liposomas, moleculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, topica u otras, para ayudar en la captacion, distribucion y/o absorcion. Por ejemplo, pueden incluirse lfpidos cationicos en la formulacion para facilitar la captacion de oligonucleotidos. Se 45 mostro que una composicion tal que facilitaba la captacion es LIPOFECTIN (disponible de GIBCO-BRL, Bethesda, MD).
Se cree que los oligonucleotidos con al menos una modificacion de 2'-O-metoxietilo son particularmente utiles para administracion por via oral. Composiciones y formulaciones farmaceuticas para administracion topica pueden incluir 50 parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprais, lfquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehfculos farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. Tambien pueden ser utiles preservativos recubiertos, guantes y similares.
Las formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion, que pueden presentarse convenientemente en forma de 55 dosificacion unitaria, pueden prepararse de acuerdo con tecnicas convencionales muy conocidas en la industria farmaceutica. Dichas tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion los principios activos con el (los) vehfculo(s) farmaceutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion uniforme e fntimamente los principios activos con vehfculos lfquidos o vehfculos solidos finamente divididos, o ambos, y luego, si fuera necesario, moldeando el producto.
Las composiciones de la presente divulgacion pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificacion posibles tales como, aunque no se limitan a, comprimidos, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgacion tambien pueden formularse como 5 suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizantes.
Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion incluyen, aunque no se limitan a, soluciones, 10 emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones farmaceuticas y formulaciones de la presente divulgacion pueden comprender uno o mas potenciadores de la penetracion, vehfculos, excipientes u otros principios activos o inactivos.
Las emulsiones normalmente son sistemas heterogeneos de un lfquido dispersado en otro en forma de gotitas que 15 normalmente superan 0,1 pm de diametro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales, ademas de las fases dispersas, y el farmaco activo que puede estar presente como una solucion en o bien la fase acuosa, fase oleosa o bien el mismo como una fase independiente. Las microemulsiones estan incluidas como un aspecto de la presente divulgacion. Las emulsiones y sus usos son muy conocidos en la tecnica y se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
20
Formulaciones de la presente divulgacion incluyen formulaciones liposomales. Tal como se usa en la presente divulgacion, el termino "liposoma" significa una vesfcula compuesta por lfpidos anfifflicos dispuestos en una bicapa o bicapas esfericas. Los liposomas son vesfculas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipofilo y un interior acuoso que contiene la composicion que va a administrarse. Los liposomas 25 cationicos son liposomas positivamente cargados que se cree que interaccionar con moleculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o estan cargados negativamente atapan el ADN en vez de complejarse con el. Se han usado tanto liposomas cationicos como no cationicos para administrar ADN a celulas.
30 Los liposomas tambien incluyen liposomas "estericamente estabilizados", una expresion que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o mas lfpidos especializados. Cuando se incorporan en liposomas, estos lfpidos especializados producen liposomas con vidas en circulacion mejoradas con respecto a los liposomas que carecen de dichos lfpidos especializados. Ejemplos de liposomas estericamente estabilizados son aquellos en los que parte de la parte de lfpido formado de vesfcula del liposoma comprende uno o 35 mas glucolfpidos o se derivatiza con uno o mas polfmeros hidrofilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
Las formulaciones y composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion tambien pueden incluir tensioactivos. El uso de tensioactivos en medicamentos, formulaciones y en emulsiones es muy conocido en la tecnica. 40 Tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
En un aspecto, la presente divulgacion emplea diversos potenciadores de la penetracion para efectuar la administracion eficiente de acidos nucleicos, particularmente oligonucleotidos. Ademas de ayudar en la difusion de farmacos no lipofilos a traves de membranas celulares, los potenciadores de la penetracion tambien potencian la 45 permeabilidad de farmacos lipofilos. Los potenciadores de la penetracion pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorfas, es decir, tensioactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los potenciadores de la penetracion y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
50 Un experto en la materia reconocera que las formulaciones se disenan rutinariamente segun su uso previsto, es decir, su via de administracion.
Formulaciones preferidas para administracion topica incluyen aquellas en las que los oligonucleotidos de la divulgacion estan en mezcla con un agente de administracion topica tal como lfpidos, liposomas, acidos grasos, 55 esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Lfpidos y liposomas preferidos incluyen neutros (por ejemplo, dioleoil-fosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DmPc, diestearoilfosfatidilcolina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y cationicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoil-fosfatidiletanolamina DOTMA).
Para administracion topica u otra, los oligonucleotidos de la divulgacion pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas cationicos. Como alternativa, los oligonucleotidos pueden estar complejados con lfpidos, en particular con lfpidos cationicos. Acidos grasos y esteres preferidos, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen adicionalmente en la 5 patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
Las composiciones y formulaciones para administracion por via oral incluyen polvos o granulos, micropartfculas, nanopartfculas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, capsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, 10 adyuvantes de dispersion o aglutinantes. Formulaciones orales preferidas son aquellas en las que los oligonucleotidos de la divulgacion se administran conjuntamente con uno o mas potenciadores de la penetracion, tensioactivos y quelantes. Tensioactivos preferidos incluyen acidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, acidos biliares y/o sales de los mismos. Acidos biliares/sales y acidos grasos preferidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N° 6.287.860. Tambien se prefieren combinaciones de 15 potenciadores de la penetracion, por ejemplo, acidos grasos/sales en combinacion con acidos biliares/sales. Una combinacion particularmente preferida es la sal de sodio de acido laurico, acido caprico y UDCA. Potenciadores de la penetracion adicionales incluyen eter polioxietilen-9-launlico, eter polioxietilen-20-cetilico. Los oligonucleotidos de la divulgacion pueden administrarse por via oral, en forma granulada que incluye partfculas secadas por pulverizacion, o complejados para formar micro o nanopartfculas. Los agentes complejantes de oligonucleotidos y 20 sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos N° 6.287.860.
Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, aunque no se limitan a, potenciadores de la penetracion, compuestos portadores y otros vehfculos o 25 excipientes farmaceuticamente aceptables.
Ciertos aspectos de la divulgacion proporcionan composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos oligomericos y uno o mas de otros agentes quimioterapeuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Ejemplos de dichos agentes quimioterapeuticos incluyen, aunque no se limitan a, farmacos quimioterapeuticos para 30 el cancer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosido, biscloroetil-nitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrogeno, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, 35 citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo-fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5- fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposido (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gemcitabina, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la divulgacion, dichos agentes quimioterapeuticos pueden usarse individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido durante un periodo de tiempo seguido 40 de MTX y oligonucleotido), o en combinacion con uno o mas de otros de dichos agentes quimioterapeuticos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleotido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleotido). Farmacos antiinflamatorios, que incluyen, aunque no se limitan a, farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y farmacos antivirales, que incluyen, aunque no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, tambien pueden combinarse en composiciones de la divulgacion. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros farmacos no antisentido 45 tambien estan dentro del alcance de la presente divulgacion. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o secuencialmente.
En otro aspecto relacionado, las composiciones de la divulgacion pueden contener uno o mas compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos 50 antisentido adicionales dirigidos a un segundo acido nucleico diana. Por ejemplo, la primera diana puede ser una secuencia antisentido particular de tristetraprolina (TTP), y la segunda diana puede ser una region de otra secuencia de nucleotidos. Como alternativa, las composiciones de la divulgacion pueden contener dos o mas compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo acido nucleico diana de tristetraprolina (TTP). Se ilustran numerosos ejemplos de compuestos antisentido en el presente documento y otros pueden seleccionarse de entre 55 compuestos adecuados conocidos en la tecnica. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o secuencialmente.
Dosificacidn:
Se cree que la formulacion de composiciones terapeuticas y su posterior administracion (dosificacion) estan dentro de la experiencia de los expertos en la materia. La dosificacion depende de la gravedad y sensibilidad de la patologfa que va a tratarse, durando el ciclo de tratamiento de varios dfas a varios meses, o hasta que se efectue una cura o se logre una disminucion de la patologfa. Pueden calcularse programas de dosificacion optimos a partir 5 de mediciones de acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente. Los expertos pueden determinar facilmente dosificaciones optimas, metodologfas de dosificacion y tasas de repeticion. Las dosificaciones optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleotidos individuales, y generalmente pueden estimarse basandose en las CE50 que se ha descubierto que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificacion es de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una vez o mas diariamente, 10 semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 anos. Los expertos en la materia pueden estimar facilmente tasas de repeticion para la dosificacion basandose en tiempos de residencia medidos y concentraciones del farmaco en fluidos corporales o tejidos. Tras el tratamiento satisfactorio, puede desearse que el paciente reciba terapia de mantenimiento para prevenir la reaparicion de la patologfa, en el que el oligonucleotido se administra en dosis de mantenimiento, que oscilan de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal, una vez o mas 15 diariamente, a una vez cada 20 anos.
En aspectos, un paciente se trata con una dosificacion de farmaco que es al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos 20 aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Ciertas dosificaciones inyectadas de oligonucleotidos antisentido se 25 describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 7.563.884, "Antisense modulation of PTP1B expression".
Aunque diversos aspectos de la presente divulgacion se han descrito anteriormente, debe entenderse que se han presentado a modo de ejemplo solamente, y no de limitacion. Pueden realizarse numerosos cambios a los aspectos 30 descritos de acuerdo con la divulgacion en el presente documento sin alejarse del espfritu o alcance de la divulgacion, Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente divulgacion no deben estar limitados por ninguno de los aspectos descritos anteriormente.
Por su citacion de diversos referencias en este documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia 35 particular sea "tecnica anterior" a su invencion. Casos de composiciones y procedimientos inventivos se ilustran en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
40 Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la divulgacion. Se apreciara que variaciones en proporciones y alternativas en elementos de los componentes mostrados seran evidentes para los expertos en la materia y estan dentro del alcance de aspectos de la presente divulgacion.
Ejemplo 1: Diseno de oligonucleotidos antisentido especfficos para una molecula de acido nucleico 45 antisentido para una tristetraprolina (TTP) y/o una cadena sentido de un polinucleotido de tristetraprolina (TTP)
Tal como se ha indicado anteriormente, la expresion "oligonucleotido especffico para" o "dianas de oligonucleotido" se refiere a un oligonucleotido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del 50 gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un duplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana.
La seleccion de oligonucleotidos apropiados se facilita adicionalmente usando programas informaticos que alinean automaticamente secuencias de acidos nucleicos e indican regiones de identidad u homologfa. Dichos programas se 55 usan para comparar secuencias de acidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparacion de secuencias de acidos nucleicos de un intervalo de especies permite la seleccion de secuencias de acido nucleico que muestran un grado de identidad entre especies apropiado. En el caso de genes que no han sido secuenciado, se realizan Southern blots para permitir una determinacion del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando
Southern blots a grados de astringencia variables, tal como se conoce bien en la tecnica, es posible obtener una medida de identidad aproximada. Estos procedimientos permiten la seleccion de oligonucleotidos que presentan un alto grado de complementariedad con secuencias de acidos nucleicos diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de acidos nucleicos correspondientes en otras especies. Un experto 5 en la materia se dara cuenta de que hay libertad considerable en la seleccion de regiones apropiadas de genes para su uso en la presente invencion.
Un compuesto antisentido es "especfficamente hibridable" cuando la union del compuesto al acido nucleico diana interfiere en la funcion normal del acido nucleico diana para producir una modulacion de la funcion y/o actividad, y 10 hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especffica del compuesto antisentido a secuencias de acidos nucleicos no diana en condiciones en las que la union especffica se desea, es decir, en condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, y en condiciones en las que los ensayos se realizan en el caso de ensayos in vitro.
15 Las propiedades de hibridacion de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden determinarse por uno o mas ensayos in vitro, tal como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, las propiedades de los oligonucleotidos descritos en el presente documento pueden obtenerse por determinacion de la intensidad de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco usando el ensayo de la curva de fusion.
20 La intensidad de union entre el antisentido natural diana y una posible molecula de farmaco (Molecula) puede estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medicion de la intensidad de interacciones intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de la curva de fusion.
El ensayo de la curva de fusion determina la temperatura a la que se produce una rapida transicion de conformacion 25 bicatenaria a monocatenaria para el complejo de antisentido natural/molecula. Esta temperatura es ampliamente aceptada como una medida fiable de la intensidad de interaccion entre las dos moleculas.
Puede realizarse un ensayo de la curva de fusion usando una copia de ADNc de la molecula de ARN antisentido natural real o un nucleotido de ADN o ARN sintetico correspondiente al sitio de union de la molecula. Estan 30 disponibles multiples kits que contienen todos los reactivos necesarios para realizar este ensayo (por ejemplo, kit MeltDoctor de Applied Biosystems lnc.). Estos kits incluyen una solucion tampon adecuada que contiene uno de los colorantes de union a ADN bicatenario (dsADN) (tales como los colorantes aBi HRM, SYBR Green, SYTO, etc.). Las propiedades de los colorantes de dsADN son tales que casi no emiten fluorescencia en forma libre, pero son altamente fluorescentes cuando se unen a dsADN.
35
Para realizar el ensayo, el ADNc o un oligonucleotido correspondiente se mezclan con la molecula en concentraciones definidas por los protocolos del fabricante particulares. La mezcla se calienta a 95°C para disociar todos los complejos de dsADN previamente formados, luego se enfrfa lentamente a temperatura ambiente u otra temperatura menor definida por el fabricante del kit para permitir que se hibriden las moleculas de ADN. Entonces, 40 los complejos recientemente formados se calientan lentamente a 95°C con recopilacion de datos continua simultanea sobre la cantidad de fluorescencia que se produce por la reaccion. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de dsADN presentes en la reaccion. Los datos pueden recogerse usando un instrumento de PCR en tiempo real compatible con el kit (por ejemplo, sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus de ABI o el instrumento LightTyper, Roche Diagnostics, Lewes, Reino Unido).
45
Los picos de fusion se construyen representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-d(Fluorescencia)/dT) sobre el eje y) contra la temperatura (eje x) usando software apropiado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Dissociation Curve, ABI). Los datos se analizan para identificar la temperatura de la rapida transicion del complejo de dsADN a moleculas monocatenarias. Esta temperatura se llama Tm y es 50 directamente proporcional a la intensidad de la interaccion entre las dos moleculas. Normalmente, la Tm superara los 40°C.
Ejemplo 2: Modulacion de polinucleotidos de TTP
55 Tratamiento de celulas HepG2 con oligonucleotidos antisentido
Celulas HepG2 de la ATCC (n° de cat HB-8065) se cultivaron en medio de crecimiento (MEM/EBSS (Hyclone n° de cat SH30024, o Mediatech n° de cat MT-10-010-CV) + 10% (Mediatech n° de cat. MT35- 011-CV) FBS + penicilina/estreptomicina (Mediatech n° de cat MT30-002-CI)) a 37°C y el 5% de CO2. Un dfa antes del experimento,

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de tristetraprolina (TTP) para uso como un compuesto terapeutico, donde el oligonucleotido modula la expresion de tristetraprolina (TTP) y donde el
    5 transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una de las SEQ ID NO: 3-5.
  2. 2. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de tristetraprolina (TTP) para uso
    en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a tristetraprolina (TTP), donde el oligonucleotido modula la expresion de tristetraprolina (TTP) y donde el transcrito antisentido natural tiene la
    10 secuencia de acido nucleico tal como se expone en una de las sEq ID NO: 3-5.
  3. 3. Uso de un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de tristetraprolina (TTP) para la fabricacion de un medicamento para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada a tristetraprolina (TTP), donde el oligonucleotido modula la expresion de tristetraprolina (TTP) y donde el
    15 transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una de las SEQ iD NO: 3-5.
  4. 4. El oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 2 o el uso de acuerdo con la
    reivindicacion 3, donde la enfermedad o trastorno asociado a tristetraprolina (TTP) se selecciona de entre el grupo que consiste en sfndrome de deficiencia de tristetraprolina, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una lesion
    20 cardiaca (por ejemplo, lesion cardiaca seleccionada de entre el grupo de sobrecarga hemodinamica, lesion por reperfusion miocardica, cardiomiopatfa hipertrofica, insuficiencia cardiaca congestiva en fase terminal y una afeccion isquemica o una consecuencia de la misma como infarto de miocardio y angina inestable etc.), artritis, una inflamacion, inflamacion articular y cutanea, SIDA, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, cancer, obesidad, sfndrome metabolico, complicaciones metabolicas asociadas con la obesidad, una 25 enfermedad o trastorno autoinmunitario, caquexia, hiperplasia mieloide y lesion del musculo esqueletico.
  5. 5. Un procedimiento in vitro de modulacion de la expresion de tristetraprolina (TTP) en celulas o tejidos de un paciente que comprende: poner en contacto dichas celulas o tejidos con un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de tristetraprolina (TTP); modulando de este modo la expresion de tristetraprolina
    30 (TTP), donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de acido nucleico tal como se expone en una de las SEQ ID NO: 3-5.
  6. 6. Un oligonucleotido que se dirige a un transcrito antisentido natural de tristetraprolina (TTP), donde el oligonucleotido modula la expresion de tristetraprolina (TTP), donde el transcrito antisentido natural tiene la
    35 secuencia de acido nucleico tal como se expone en una de las SEQ ID NO: 3-5 y donde el oligonucleotido comprende ademas una o mas modificaciones que comprenden
    a. al menos un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, 2'-O-metoxietilo (MOE), 2'-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato,
    40 acetamidata, ester carboximetflico, y combinaciones de los mismos;
    b. al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico, un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o
    45 c. al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado 2'-O-metoxietilo, un resto de azucar modificado 2'-metoxi, un resto de azucar modificado 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, y combinaciones de los mismos.
  7. 7. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, o el uso de 50 acuerdo con la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4, o el procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 5, o
    el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 6, donde el oligonucleotido tiene entre 10 y 30 nucleotidos de longitud.
  8. 8. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7, o el uso de 55 acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 o el procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 5
    o la reivindicacion 7, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, donde el oligonucleotido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con un complemento de un transcrito antisentido natural de tristetraprolina (TTP).
  9. 9. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8 o el procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o el oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el oligonucleotido es monocatenario.
    5
  10. 10. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 7 u 8, o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8 o el procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5, 7 u 8, o el oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el oligonucleotido es un compuesto de siARN.
    10
  11. 11. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 10 o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 10 o el procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 10, o el oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el oligonucleotido comprende al menos una de las SEQ ID NO: 6-15.
    15
  12. 12. El oligonucleotido para uso de acuerdo con la reivindicacion 10, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 10, o el procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicacion 10, o el oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el compuesto de siARN comprende al menos un oligonucleotido seleccionado de entre las SEQ ID NO: 6 a 10 y una secuencia complemento inversa de dicho oligonucleotido seleccionado de entre las
    20 SEQ ID NO: 11 a 15.
  13. 13. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 12, o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 12, o el procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 12, o el oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 to 12,
    25 donde el oligonucleotido incrementa la expresion de tristetraprolina (TTP).
  14. 14. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 13, o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 13 o el procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 13, o el oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13,
    30 donde la expresion de tristetraprolina (TTP) se incrementa en al menos el 10%.
  15. 15. El oligonucleotido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 7 a 14, o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 7 a 14 o el procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7 a 14, donde el oligonucleotido comprende ademas una o mas modificaciones que
    35 comprenden
    a. al menos un enlace internucleosfdico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, 2'-O-metoxietilo (MOE), 2'-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triester de fosfato, acetamidata, ester carboximetflico, y combinaciones de los mismos;
    40
    b. al menos un nucleotido modificado seleccionado de entre: un acido nucleico peptfdico (PNA), un acido nucleico bloqueado (LNA), un acido arabino-nucleico, un analogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o
    c. al menos un resto de azucar modificado seleccionado de entre: un resto de azucar modificado 2'-O-metoxietilo, un 45 resto de azucar modificado 2'-metoxi, un resto de azucar modificado 2'-O-alquilo, un resto de azucar bicfclico, y
    combinaciones de los mismos.
  16. 16. Una composicion farmaceutica que comprende al menos un oligonucleotido que tiene las caracterfsticas de un oligonucleotido definido en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15 y un excipiente
    50 farmaceuticamente aceptable.
    FIGURA 1
    Diferencia en veces en el n° de copias de ARNm en comparacion con el control
    i
    i
    \
    imagen1
    V VAV •• VAV
    FIGURA2
    (SEQ ID NO: 1)
    >gi I 1418022611 ref |NM_003407 | Proteina con dedos de zinc 36 de Homo sapiens, tipo CH3, homologo (de raton) (ZFP36), ARNm
    agcctgacttcagcgctcccactctcggccgacacccctcatggccaaccgttacaceatggatctgactgccatct
    acgagagcctcctgtcgctgagccctgacgtgcccgtgccatccgaccatggagggactgagtccagcccaggctgg
    ggctcctcgggaccctggagcctgagcccctccgactccagcccgtctggggtcacctcccgcctgcctggccgctc
    caccagcctagtggagggccgcagctgtggctgggtgcccccaccccctggcttcgcaccgctggctccccgcctgg
    gccctgagctgtcaccctcacccacttcgcccactgcaacctccaccaccccctcgcgctacaagactgagctatgt
    cggaccttctcagagagtgggcgctgccgctacggggccaagtgccagtttgcccatggcctgggcgagctgcgcca
    ggccaatcgccaccccaaatacaagacggaactctgtcacaagttctacctccagggccgctgcccctacggctctc
    gctgccacttcatccacaaccctagcgaagacctggcggccccgggccaccctcctgtgcttcgccagagcatcagc
    ttctccggcctgccctctggccgccggacctcaccaccaccaccaggcctggccggcccttccctgtcctccagctc
    cttctcgccctccagctccccaccaccacctggggaccttccactgtcaccctctgccttctctgctgcccctggca
    cccccctggctcgaagagaccccaccccagtctgttgcccctcctgccgaagggccactcctatcagcgtctggggg
    cccttgggtggcctggttcggaccccctctgtacagtccctgggatccgaccctgatgaatatgccagcagcggcag
    cagcctggggggctctgactctcccgtcttcgaggcgggagtttttgcaccaccccagcccgtggcagccccccggc
    gactccccatcttcaatcgcatctctgtttctgagtgacaaagtgactgcccggtcagatcagctggatctcagcgg
    ggagccacgtctcttgcactgtggtctctgcatggaccccagggctgtggggacttgggggacagtaatcaagtaat
    ccccttttccagaatgcattaacccactcccctgacctcacgctggggcaggtccccaagtgtgcaagctcagtatt
    catgatggtgggggatggagtgtcttccgaggttcttgggggaaaaaaaattgtagcatatttaagggaggcaatga
    accctctcccccacctcttccctgcccaaatctgtctcctagaatcttatgtgctgtgaataataggccttcactgc
    ccctccagtttttatagacctgaggttccagtgtctcctggtaactggaacctctcctgagggggaatcctggtgct
    caaattaccctccaaaagcaagtagccaaagccgttgccaaaccccacccataaatcaatgggccctttatttatga
    cgactttatttattctaatatgattttatagtatttatatatattgggtcgtctgcttcccttgtatttttcttcct
    ttttttgtaatattgaaaacgacgatataattattataagtagactataatatatttagtaatatatattattacct
    taaaagtctatttttgtgttttgggcatttttaaataaacaatctgagtgt
    (SEQ ID NO: 2)
    CAGCCrGACTTCAGCGCTCCCACTCTCGGCCGACACCCCTCATGGCCAACCGTTACACCATGGATCTGACrGCCATC
    TACGAGGTGAGTCCCCGCCGCACGGCATCCCCGGTACCTGCATGCCTGAGTCCGAGTCCCCACCTCTCTAGCGCCGC
    AAACTCCAGCCCGGGACGCrTGCCTCCCTTCTCCAACTGGGGCTCCCTAGCGCCGCGCCCTCCAGCCTGGGGCCCCT
    GCCTCCCGCTCAGACCAGCrTGGTGATTTGGAGGTGAAAATGGAACCCGCGACACCCGGCTCTTCGCTCAAACATGG
    GTGGGGCGGCCCATGCAAGTGGAAAGTCGGAGAACTTTTCTCAGACCGAGGCTGCCrGGAGGCGGAAGTGGCCCCCA
    TACCTGGCTCACCCCTAGTCGTTGCTGAGGGCGTGGTTTTGCGCGGAGGCGTCTCTGGGGCTGAAGTCTCAGGGTGG
    GGGGArCCGACTTCrGTCTCTCCAGTCCCTGACCGTAGAGACAGAGAACCCTAAAACCGAAGCAArCCGGACTTCCA
    GGTCAACTTTGCCCGGTTTCTCCAGTTGTGAAACTGGAGATCCCGACGCGTGGGTCATATCCGGGGAGGACAAGAGA
    CCCAAAATTGGGAAACAGTGGTGCGCCCTGACTTCGGGGTCCCCCTCTTGGTCCAGCCGGGGAAGCCGGGATTCCTG
    GGTCCCTCGGGATAAGGCCTCGGTGGTGGGTAAACTCAGAACCTCCAACTCTGGGTTCCTGGCATCCGGAACCCAGG
    GGTTTCTGCGGGCGGGTGGGGCTCAGGCGGGGAGCCCACAAACCGGCCTGGCAAGCTCTAGTrCCCTGCAGCTGGGG
    TGGGGCGTCGCCCTGCATTTTCAGGTGCCTTAACCGACCCATTTCCGCAGAGCCTCCTGTCGCTGAGCCCTGACGTG
    CCCGTGCCATCCGACCATGGAGGGACTGAGTCCAGCCCAGGCTGGGGCTCCTCGGGACCCTGGAGCCTGAGCCCCTC
    CGACTCCAGCCCGTCTGGGGTCACCTCCCGCCTGCCTGGCCGCTCCACCAGCCTAGrGGAGGGCCGCAGCTGTGGCT
    GGGTGCCCCCACCCCCTGGCTTCGCACCGCTGGCTCCCCGCCTGGGCCCTGAGCTGrCACCCTCACCCACTTCGCCC
    ACTGCAACCTCCACCACCCCCTCGCGCTACAAGACTGAGCTATGTCGGACCTTCTCAGAGAGTGGGCGCTGCCGCTA
    CGGGGCCAAGTGCCAGTTTGCCCATGGCCTGGGCGAGCTGCGCCAGGCCAATCGCCACCCCAAATACAAGACGGAAC
    TCTGTCACAAGTTCrACCTCCAGGGCCGCTGCCCCTACGGCTCTCGCTGCCACTTCATCCACAACCCTAGCGAAGAC
    CTGGCGGCCCCGGGCCACCCTCCTGTGCTTCGCCAGAGCATCAGCTrCTCCGGCCTGCCCTCTGGCCGCCGGACCTC
    ACCACCACCACCAGGCCTGGCCGGCCCTTCCCTGTCCTCCAGCrCCrTCTCGCCCTCCAGCTCCCCACCACCACCTG
    GGGACCTTCCACTGrCACCCTCTGCCTTCTCTGCTGCCCCTGGCACCCCCCTGGCTCGAAGAGACCCCACCCCAGTC
    TGTTGCCCCTCCTGCCGAAGGGCCACTCCTATCAGCGTCTGGGGGCCCTTGGGTGGCCTGGTTCGGACCCCCTCTGT
    ACAGTCCCTGGGATCCGACCCTGATGAATATGCCAGCAGCGGCAGCAGCCTGGGGGGCTCTGACTCTCCCGTCTTCG
    AGGCGGGAGTTTTTGCACCACCCCAGCCCGTGGCAGCCCCCCGGCGACTCCCCATCrTCAArCGCATCTCTGTTTCT
    GAGTGACAAAGTGACTGCCCGGTCAGATCAGCTGGATCTCAGCGGGGAGCCACGTCrCTTGCACTGTGGTCTCTGCA
    TGGACCCCAGGGCTGTGGGGACTTGGGGGACAGTAATCAAGXAATCCCCTTTTCCAGAATGCATTAACCCACTCCCC
    TGACCTCACGCTGGGGCAGGTCCCCAAGTGTGCAAGCTCAGTATTCATGATGGTGGGGGATGGAGTGTCTTCCGAGG
    ttcttgggggaaaaaaaattgtagcatatttaagggaggcaatgaaccctctcccccacctcttccctgcccaaatc
    TGTCTCCTAGAATCrTATGTGCTGrGAATAATAGGCCrTCACTGCCCCTCCAGTTTrTATAGACCTGAGGTTCCAGT GTCTCCTGGTAACTGGAACCTCTCCTGAGGGGGAATCCTGGTGCTCAAArTACCCTCCAAAAGCAAGTAGCCAAAGC CGTTGCCAAACCCCACCCATAAATCAATGGGCCCTTTATTTATGACGACTTTATTTATTCTAAXATGATTTTATAGT ATTTATATATATTGGGTCGTCTGCrTCCCTTGrATTTTTCTTCCTTrTTTTGTAATATTGAAAACGACGATATAATT ATTATAAGTAGACTATAATATATTrAGTAATATATATTATTACCTTAAAAGTCTATTTTTGrGTTTTGGGCATTTTT AAATAAACAATC TGAGTG
    FIGLRA3
    Sccucncia antiscntido natural (Hs. 702367): SEQ ID NO:3
    ATAAAgATCATATTAGAATAAATAAAGTCgGTCATAAATAAAGGnCgCCATTGgTTTATGGGTGGnGnTnGGnAACG
    GgXTXGGgXACXnGCnXXXGGgGGGnAAXrnGgGCgCCAGGgXXCCCCCTCAGGgGgGGTXCCAGXgACCAGGgGnn
    AnnGGAACCTCAGGnCTATnAnAACTGGnGGGGCAGTGAAGGCCTArTATTCACAGCACATAAGATTCTAGGnGAnA
    GATTTGGGCAGGGAAGAGGTGGGGGnGAGGGTTCATTGCCTCCCTTAAATATGCTACAAtTTTTTTTTCCCCCAAGA
    ACCTCGGAAGgCACrCCATCCCCCACCATCAXGAATACXGgGCTTGCgCACTTGGGGgCCTGCnCCAGCGTGAGGTC
    AGGGGAGTGGGTTAATGCArTCTGGAAAAGGGGATTACTTGATTACrGTCCCCCAAGTCCCCACAGCCCTGGGGTCC
    ATGCAGAGACCACAGTGCAAGAGAgCGTGGCTCCCCGCTGAGAXCCAGCTGATCTGACCGGGCAGXCACTTTGTCAC
    TCAGAAACAGAGATGCGATTGAAGATGGGGAGTCGCCGGGGGGCTGCCACGGGCTGGGGTGGTGCAAAAACTCCCGC
    CTCGAAGACGGGAGAnTCAGAGCCCCCCAGGCTGCTGCCGCXGCTGGCATATTCATCAGGGrCGGATCCCAGGGACT
    GIACAGAGGGGGTCCGAACCAGGCCACCCAAGGGCCCCCAGACGCXGAXAGGAGTGGCCCXXCGGCAGGAGGGGCAA
    CAGACTgGGGGTGGGGTCTCTTCGAGCCAgGGGGGGTGCCAGGGGCAGCAGAnAAGGCAGAgGGGrGACAGTGGAAG
    GTCCCAGGTGGTGGTGGGGAGCTGGAGGGCGAGAAGGAGCTGGAGGACAnGGAAGGGCgGGCCAGGCTGGTGGTnGT
    GGTGAGGTCCGGCGGCaaaaggngggCGGnnAAnCTGATGCTCTGG
    Sccucncia antiscntido natural (AL513578): SEQ ID NO:4
    GTGGGGACGGAAACATCCCGTCCCCGACCGCACCCGCCCGAAGCTGGGTCAAGGAGCCCAGCAGGACGGGAGCGCGG
    CGCCCCCGACGCCCGGGAACTGGCTCCCCCGGTTCCCATCTGGTGACCTCACCTGGTCCCAeCCTTTCAGGTGAACG
    GCCAGGCCCGGTGACGTCACTTCCTGCCAGAAGCACCTCTCTCCCTCGCTCCGCCCTTCACCCAGACGCTCGCCAAT
    CCGTGTGTGGTTCCGAGCCGGACTTCATTTCCCCGAAGCGTCGCGGCCTGAGGAGACCCGTTGGGTCCTCAGCGTCT
    TGGCGGCAGTTGGTGGAACCGGAGCXTCGAGXCCGXCCCCGGTGCXGCCTGCGCGTTCACCTGAGTnTCGCrGGAGC
    TCTTCTCGCCCGCCCACCXCATCXCAACCCACTTXCCGCGGGGAGCGGCGCCAAGCTGGGCCTTCCTCGGAXCAGGC
    GTCCCCTGAAGTCGGCACGCCCCTCTGCGrCCCCCTTCGGTCCCGCrAGGACCCCGTCCGGGCTGCCGTCGCCTCGT
    CGCTATGGCGCCCACCATCCAGACCCAGGCCCAGCGGGAGGATGGCCACAGGCCAATTCCCACCGGACTCTGCCTGA
    GAGGTCTGGAGTGGTCTGCCGAGTCAAGTACTGCAATAGCCTCCCTGATATCCCCTTCGACCCCAAGTTCATCACCT
    ACCCCTTCGACCAGAACAGTTCTTCTAGArCCAGCXGATGAGAAACrTTTGGAAGAGGAGATTCAGGCCCCCACCAG
    CTCCAAGAGATCCCAGCAGCACGCGAAGGrGGTGCCATGGATGCGAAAGACAGAGXACATCTCCACTGAGTTCAACC.
    GTTATGGCATCTCCAATGAGAAGCCTGAGGTCAAGATTGGGGTTTCrGTGAAGAGCAGTTTACCGAGGAAGAAATAT
    ACAAAGACAGGGATAGCCAGATCACAGCCATTGAGAAGACTTTTGAGGATGCCCAGAAATCAATCTCACAGCAT’TnC
    AGCAAACCCCGAGTnAnACCGGTGGAGGnCATGCCTGTtTTCCCAGACTTTAAaatgtgnttantcatgtaccnAGG
    XGAXCTXnantaaaCCAGCCCCAAGGAaGAGXGGggagc
    Secuencia antisentido natural (BG012178): SEQ ID NO:5
    GGAATCCGGATTGCTTCGGTTTTAGGGTTCTCrGTCTCTACGGTCAGGGACTGGAGAGACAGAAGICGGArCCCCCC
    ACCCTGAGACTTCAGCCCCAGAGAGGCCTCCGCGCAAAACCACGCCCTCAGCAACGACTAGGGGTGAGCCAGGTAXG
    GGGGCCgCTTCCGCCTCCAGGCAGCCTCGnngtCTGAGAAAAcGTTCTCCnGACTTTCCACTTGCATGGGCCGCCCC
    ACCtATGTTTGAGCGAAGAGCCGGGTGTCGCGGGTTCCATTTTCACCTCCAAATCACCAAGCTGGT
    FIGURA4
    ID de la secuencia
    Nombre de la secuencia antisentido Secuencia
    SEQ ID NO:6
    CUR-0364 rGrArCrUrUrCrUrGrUrCrUrCrUrCrCrArGrUrCr CrCrUrGrArCrCrG
    SEQ ID NO:7
    CUR-0366 rGrUrArCrUrCrUrGrUrCrUrUrUrCrGrCrArUrCr CrArUrGrGrCrArC
    SEQ ID NO: 8
    CUR-0368 rArArUrCrUrUrGrArCrCrUrCrArGrGrCrUrUrCr UrCrArUrUrGrGrA
    SEQ ID NO: 9
    CUR-0370 rGrArUrCrCrGrArCrCrCrUrGrArUrGrArArUrAr UrGrCrCrArGrCrA
    SEQ ID NO:10
    CUR-0372 rArUrCrUrUrCrArArUrCrGrCrArUrCrUrCrUrGr UrUrUrCrUrGrArG
    FIGURA5
    ID de la secuencia
    Nombre de la secuencia sentido Secuencia
    SEQ ID NO:11
    CUR-0364 rGrUrCrArGrGrGrArCrUrGrGrArGrArGrArCrAr GrArArGTC
    SEQ ID NO:12
    CUR-0366 rGrCcCrArUrGrGrArUrGrCrGrArArArGrArCrAr GrArGrUAC
    SEQ ID NO:13
    CUR-0368 rCrArArUrGrArGrArArGrCrCrUrGrArGrGrUrCr ArArGrATT
    SEQ ID NO:14
    CUR-0370 rCrUrGrGrCrArUrArUrUrCrArUrCrArGrGrGrUr CrGrGrATC
    SEQ ID NO:15
    CUR-0372 TCrArGrArArArCrArGrArGrArUrGrCrGrArUrUr GrArArGAT
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