JPH08509288A - ウシソマトトロピンの未変性力価アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ウシソマトトロピンの力価を測定するための方法について記載している。ウシソマトトロピン試料中の生物学的に活性なウシソマトトロピン蛋白の濃度を、固相として平均粒子直径が約５μｍ〜約１５μｍの親水性多孔性ポリマーゲルを用い、また移動相としてウシソマトトロピン試料を変性させないｐＨ約８〜約１２の緩衝水溶液を用いるサイズエクスクルージョンＨＰＬＣによって測定する。ウシソマトトロピン試料の力価は、そのようにして測定した生物学的に活性なウシソマトトロピン蛋白の濃度に基づいて決定される。本方法は、ｂＳＴ試料の力価の、好都合で正確かつ精密な測定法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウシソマトトロピンの未変性力価アッセイ 背景 本発明は、通常、ウシソマトトロピン（ｂＳＴ）に関する。より具体的には、 本発明はｂＳＴ力価アッセイを提供するのに適した方法で、ｂＳＴから生物学的 に活性なｂＳＴ蛋白分画を調製するための未変性法に関する。 近年、組み換えＤＮＡ技術によって、大規模なｂＳＴの製造が促されてきてい る。組み換え大腸菌などの組み換え微生物は、そのサイトプラズマ中にｂＳＴの 不溶性顆粒を産生する。屈折体または封入体として知られるこれらの顆粒は、凝 集した変性ｂＳＴを含有している。屈折体は回収され、通常、塩酸グアナジン、 ドデシル硫酸ナトリウムまたは尿素などの変性剤で処理される。変性剤は不適切 に折り畳まれたｂＳの折り畳みを解き、可溶化する。その後、ｂＳＴ分子は復元 され、適切に折り畳まれた生物学的に活性なｂＳＴモノマー蛋白を形成する。 しかしながら、これらの変性および復元工程の効率が悪いために、不適切に折 り畳まれた凝集物のいくらかは、生物学的に不活性なｂＳＴ凝集物をも形成する 。したがって、得られたｂＳＴバルク材料は、生物学的に活性なｂＳＴモノマー 蛋白と生物学的に不活性なｂＳＴ凝集物の両方を含んでいる。したがって、品質 管理においてｂＳＴの力価を測定する方法を確立することが重要である。 ｂＳＴの力価は、ラットの体重増加法によって以前に評価がなされている。本 質的に、ラットにｂＳＴ試料を投与してその体重増加をモニターし、このデータ からｂＳＴの力価を示す値が得られる。しかしながら、本アッセイは、日常的な 分析においてｂＳＴを正確に定量するためには使用できない。またｂＳＴの力価 は、ラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ）によっても測定される。しかしながら 、ＲＲＡは時間がかかる。また、ＲＲＡは不正確でもあり、したがって、通常は 数回の試験が行われ、その結果を平均してｂＳＴ力価値が得られる。 逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰＨＰＬＣ）は蛋白の測定に用いられてき た。しかしながら、用いられているほとんどのＲＰＨＰＬＣ法は、移動相に酸性 媒質と有機溶媒を使用するするため、ｂＳＴが変性し、ｂＳＴの力価を測定する ための候補としては適当ではない。 ドデシル硫酸ナトリウムまたは塩酸クアナジンを含む移動相を用いるサイズエ クスクルージョン（サイズ排除）高速液体クロマトグラフィ（「サイズエクスク ルージョンＨＰＬＣ」）は、以前にｂＳＴの測定に用いられきた。しかしながら 、このような方法は、移動相によってｂＳＴが変性するため、生物力価アッセイ ではない。 したがって、ｂＳＴの生物力価を測定するために、好都合で、正確であり、厳 密な不変性アッセイが求められている。 本発明の要約 本発明の望ましい態様の１つとして、ウシソマトトロピン試料の力価を測定す るための方法を提供する。本発明は、固相として平均粒子直径が約５μｍ〜約１ ５μｍの親水性多孔性ポリマーゲルを、また移動相としてｐＨ約８〜約１２の緩 衝水溶液を用いる、ウシソマトトロピン試料を変性させない、サイズエクスクル ージョンＨＰＬＣによって、ウシソマトトロピン試料中の生物学的に活性なウシ ソマトトロピン蛋白の濃度を測定することからなる。ウシソマトトロピン試料の 力価は、試料中の測定された生物学的に活性なウシソマトトロピン蛋白の濃度に 基づいて決定される。 本発明の別の望ましい態様として、ウシソマトトロピンから生物学的に活性な ウシソマトトロピン分画を分離する方法を提供する。本方法は、固相として平均 粒子直径が約５μｍ〜約１５μｍの親水性多孔性ポリマーゲルを、また移動相と してｐＨ約８〜約１２の緩衝水溶液を用いる、ウシソマトトロピン試料を変性さ せない、サイズエクスクルージョンＨＰＬＣによって、ウシソマトトロピン試料 中の生物学的に活性なウシソマトトロピン蛋白を分離することからなる。 本発明の別の望ましい態様として、バルク組み換えウシソマトトロピン中の得 られた生物学的に不活性なウシソマトトロピンの非共有結合性の可溶性凝集物か ら生物学的に活性なウシソマトトロピン蛋白を分離するための方法を提供する。 本方法は、生物学的に不活性なウシソマトトロピンの非共有結合性の可溶性凝集 物から生物学的に活性なウシソマトトロピン蛋白を分離するために、バルク組み 換えウシソマトトロピンを、固相として平均粒子直径が約５μｍ〜約１５μｍの 親水性多孔性ポリマーゲルを、また移動相としてｐＨ約８〜約１２の緩衝水溶液 を用いる、ウシソマトトロピン試料を変性させない、サイズエクスクルージョン ＨＰＬＣにかける工程からなる。 本発明は、生物学的に不活性型のｂＳＴからの生物学的に活性なｂＳＴ蛋白の 分離を有利に行うための方法を提供する。 本方法は、ｂＳＴ試料の力価を測定するために都合の良い、正確で厳密なアッ セイ法を提供するために好適である。さらに、最初に非共有結合性の可溶性凝集 物の分離と広範な特徴づけが発明的方法を用いて成し遂げられた。本発明のさら なる目的、特徴および利点は本明細書から明らかとなるであろう。 図の説明 図１Ａは、下記の実施例に記載した方法を用いる、生物学的に活性なｂＳＴの 対照用標準のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣクロマトグラムである。 図１Ｂ〜１Ｅは、下記の実施例に記載の方法を用いる、バルク組み換えｂＳＴ 材料のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣクロマトグラムである。 図２Ａは、下記の実施例に記載の方法を用いる、生物学的に活性なｂＳＴ蛋白 分画のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣにおける保持時間に対する重炭酸緩衝 液濃度の影響を示すグラフである。 図２Ｂは、下記の実施例に記載の条件下における、生物学的に活性なｂＳＴ蛋 白分画のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣにおけるピーク面積応答に対する重 炭酸緩衝液濃度の影響を示すグラフである。 図３Ａは、下記の実施例に記載の方法を用いる、生物学的に活性なｂＳＴ蛋白 分画のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣにおける溶出時間に対する移動相のｐ Ｈの変化の影響を示すグラフである。 図３Ｂは、下記の実施例に記載の方法を用いる、生物学的に活性なｂＳＴ蛋白 分画のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣにおけるピーク面積応答に対する移動 相のｐＨの変化の影響を示すグラフである。 図４は、下記の実施例に記載の条件下における、いくつかの異なるロットのバ ルク組み換えｂＳＴに対する生物学的に活性なｂＳＴ蛋白のラジオレセプターア ッセイによる力価データ（ＩＵ／ｍｇ）とサイズエクスクルージョンＨＰＬＣを 用いて測定した濃度との相関を示すグラフである。 図５は、下記の実施例に記載の条件下における、標準蛋白と生物学的に活性な ｂＳＴ蛋白（「Ｂ／Ａ ｂＳＴ」）およびｂＳＴ可溶性凝集物（「Ａｇｇ．」） のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣにおけるログＭＷ対溶出時間較正曲線であ る。 図６は、下記の実施例に記載の条件下における、標準蛋白と生物学的に活性な ｂＳＴ蛋白（「Ｂ／Ａ ｂＳＴ」）およびｂＳＴ可溶性凝集物（「Ａｇｇ．」） を含む分画のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣにおけるピーク面積応答に対す る重炭酸アンモニウム濃度の影響を示すグラフである。 図７は、下記の実施例に記載の条件下における、標準蛋白と生物学的に活性な ｂＳＴ蛋白（「Ｂ／Ａ ｂＳＴ」）およびｂＳＴ可溶性凝集物（「Ａｇｇ．」） を含む分画のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣにおけるピーク面積に対する移 動相のｐＨの影響を示すグラフである。 図８は、下記の実施例に記載の条件下における、標準蛋白と生物学的に活性な ｂＳＴ蛋白（「Ｂ／Ａ ｂＳＴ」）およびｂＳＴ可溶性凝集物（「Ａｇｇ．」） を含む分画のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣにおけるピーク面積に対する遠 心分離の影響を示すグラフである。 好ましい態様の説明 本発明の原理を理解するのを助ける目的で、ここにその好ましい態様を引用文 献で示し、特定の言葉を同じものを説明するために用いることにする。しかし、 それらは本発明の範囲を制限することを意図するものではなく、本明細書に記載 されているような本発明の原理の変更、修飾及び応用は、本発明の関連分野の当 業者に通常生じるものとして予期されるものである。 記述した通り、本発明の好ましい態様は、ウシソマトトロピンから生物学的に 活性なウシソマトトロピンと分離するための方法に関する。本明細書で用いてい るように、「ウシソマトトロピン」は天然ウシソマトトロピンの性質を有する天 然または合成物由来の物質を示す。ウシソマトトロピンはウシの適当な腺組織（ 例えば、下垂体）から抽出することができ、遺伝的に修飾された細菌などの微生 物を用いることによって、ウシソマトトロピンおよび他の類似の物質を合成する ために現在充分に実用化されている。しばしば、そのような方法は修飾されたウ シソマトトロピン、すなわち、天然の成長ホルモンと構造が異なるが、天然の成 長ホルモンの生物学的な活性を保持している物質、を産生するのに便利またはむ しろ好ましくさえある。例えば、修飾ウシソマトトロピンはそのポリペプチド鎖 の一方または両方の末端に、１つないしそれ以上の付加的アミノ酸を含有してい てもよい。付加的な修飾は、当業者に理解されるであろう。したがって、本明細 書全体を通して、用語ウシソマトトロピンを、天然のウシソマトトロピンの生物 学的性状を共有し、構造が同じかまたは異なる天然のウシソマトトロピンと合成 的に産生されたウシソマトトロピンの両者を示すために使用する。 本発明では、組み換えＤＮＡ技術によって産生したｂＳＴ（「組み換えｂＳＴ 」）を使用することが好ましい。典型的には、組み換えｂＳＴは、組み換えｂＳ Ｔを含有する封入体を分離し、変性させ、可溶化することによって得られる。次 に、ｂＳＴは復元され、生物学的に活性なｂＳＴ蛋白を形成する。変性／復元工 程中に、生物学的に不活性なｂＳＴ非共有結合性凝集物は、所望の生物学的に活 性なｂＳＴ蛋白と共に形成される。コロイドおよびいくらかの非常に高分子量の 不純物は、限外濾過によって可溶化した封入体から除去することができる。しか しながら、かなりの量の生物学的に不活性なｂＳＴ非共有結合性凝集物は、通常 、生物学的に活性なｂＳＴ蛋白と共に限外濾過膜を通過する。その結果、最終的 に得られたバルク組み換えｂＳＴは、生物学的に活性なｂＳＴ蛋白ならびに生物 学的に不活性なｂＳＴ可溶性凝集物を含んでいる。本発明の方法は、生物学的に 不活性なｂＳＴ非共有結合性可溶性凝集物から生物学的に活性なｂＳＴ蛋白を分 離するためにこのバルク組み換えｂＳＴを処理するのに用いることができる。さ らに、本分離は、バルクｂＳＴの力価を都合よく、正確かつ厳密なアッセイを行 うために用いることができる。組み換えｂＳＴの例としては、ソミドボブおよび ソムト リボブ（ｓｏｍｅｔｒｉｂｏｖｅ）として知られる２種類の化合物がある。本発 明では、これら２種類の組み換えｂＳＴを応用することが特に好ましい。 本発明の方法では、固相として親水性多孔性ポリマーゲルを用いるサイズエク スクルージョンＨＰＬＣを使用する。本発明で使用する好ましい多孔性ゲルは、 平均粒子直径が約５μｍ〜約１５μｍであり、より好ましくは約１０μｍ〜約１ ５μｍである。典型的には、ゲルの平均ポア直径は約１００〜約２００オングス トロームであり、本発明では平均ポア直径が約１５０オングストロームのゲルが 好ましい。別の見地において、本発明に使用される多孔性ゲルは、排除限界平均 分子量がｂＳＴ非共有結合性の可溶性凝集物より大きい（例えば、約１０⁶以上 およびより好ましくは約１０⁷以上）ことが望ましい。 本発明で使用する移動相は、ｂＳＴを変性しない、ｐＨ約８〜約１２の緩衝水 溶液である。一般に、本緩衝液は、移動相のイオン強度がｂＳＴ試料から蛋白が 塩析するのを避けるだけ充分に低く保たれている限り、いかなる有効濃度で移動 相中に含まれていていもよい。例えば重炭酸アンモニウムの水溶液として与えら れる重炭酸（ＨＣＯ₃ ^-）緩衝水溶液は、好ましい移動相を提供する。重炭酸緩衝 液は、濃度が約０．７Ｍ未満であることが好ましく、約０．１〜約０．４Ｍの範 囲であることがより好ましい。移動相のｐＨは、約９〜約１１であることがより 好ましく、約９〜約１０であることが最も好ましい。 固相は一般的なサイズエクスクルージョンＨＰＬＣセットアップの構成部分で ある一般的なＨＰＬＣカラムに充填される。例えば、サイズエクスクルージョン ＨＰＬＣセットアップは、典型的にはポンプ、緩衝水溶液用のリザーバー、紫外 線（ＵＶ）吸収検出器および分画採取手段を含む。 本発明の方法によって処理されるｂＳＴ試料は、移動相として使用されるもの と同じ緩衝水溶液で元に戻すことが望ましい。試料中のｂＳＴ濃度は、約０．０ ５〜約２ミリグラム／ミリリトル（ｍｇ／ｍＬ）であることが望ましい。試料中 のｂＳＴ濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬであることがより望まし い。 サイズエクスクルージョンＨＰＬＣカラムの圧は、本発明に従って実施される 分離に適した流速を与える。都合のよい流速を得るのに必要な圧は、当然、固相 の粒度に依存するであろう。本発明の好ましい方法において、サイズエクスクル ージョンＨＰＬＣに使用する圧および得られる流速は、好都合なアッセイを提供 するように、約３０分以内で生物学的に活性なｂＳＴ蛋白分画を完全に溶出する であろう。これに関して、典型的なカラム圧は、約５００〜約１５００ｐｓｉで あり、より典型的には約８００〜約１０００ｐｓｉである。 既述の未変性サイズエクスクルージョンＨＰＬＣ法を用いる出願人の研究の別 の面において、高分子量のｂＳＴ可溶性凝集物が分離され、広範に特徴づけられ ている。図１Ｂおよび１Ｃにおいて、約９分に始まるピーク軌跡は、高分子量の ｂＳＴ可溶性凝集物を含んでいる。サイズエクスクルージョンＨＰＬＣによって 測定した、これらｂＳＴ可溶性凝集物の分子量は、６６００００より大きかった （図５）。ｂＳＴ可溶性凝集物は、ラジオレセプターアッセイで測定したところ 、生物学的に不活性である。 また、溶液中のｂＳＴ可溶性凝集物の挙動も特徴づけられている。ｂＳＴ可溶 性凝集物は、ｐＨが約８．５より大きく約１２より小さい未変性緩衝水溶液に十 分可溶性である（図１Ｄ、１Ｅおよび７）。この範囲外のｐＨでは、本可溶性凝 集物は、未変性緩衝水溶液から析出する。また、高い塩濃度もｂＳＴ可溶性凝集 物が析出する原因となるであろう（図６）。例えば、ｂＳＴ可溶性凝集物の塩析 は約０．７Ｍを越える重炭酸濃度で観察される。さらに、１６０００×重力（「 １６０００ ｇ」）での遠心分離下では、ｂＳＴ可溶性凝集物は０．２Ｍ重炭酸 緩衝水溶液中（ｐＨ９）で３０分以上そのままである（図８）。ドデシル硫酸ナ トリウムおよび尿素などの変性剤は、ｂＳＴ可溶性凝集物をモノマーｂＳＴに変 性させるであろう。ｂＳＴ可溶性凝集物のこれらおよび他の特性は、下記の実施 例にさらに論じる。 本発明のさらなる理解を促すために、以下の具体的な実施例を示す。これらの 実施例は例示であって、本発明を制限する性質のものではないことは理解されよ う。 実施例 化学薬品および試薬 すべての試薬は分析用試薬クレードであり、さらに精製することな使用した。 水はミリポア・ミリ−Ｑ水精製システムから得た。ｂＳＴ対照用標準および組み 替えｂＳＴバルク材料（ソミドボブ）はイーライリリーアンドカンパニーから得 た。 サイズエクスクルージョンＨＰＬＣクロマトグラフィの条件 これらの実施例では、大多数が親水性基（ゲルは架橋結合したヒドロキシル化 されたポリエーテルである）を持ち、平均粒度が約１０μｍの固定多孔性ポマー ゲル［商品名ベックマン・スフェロゲルＴＳＫ３０００ＰＷカラム（６００×７ ．５ｍｍ、Ｉ．Ｄ．）］を使用した。本明細書で報告する分離のための移動相は 、特に示さない限り、ＮａＯＨでｐＨ９に補正した０．２Ｍ重炭酸アンモニウム であった。すべての分離は、特に示さない限り、室温で、流速０．５ｍＬ／分で 実施した（約８００〜１０００ｐｓｉの範囲の対応する圧を生じる）。試料の注 入容量は２０μＬであった。ほとんどの分離は、９１１＋フォトダイオードアレ イ（配列）検出器及びＷＩＳＰ７２１オートサンプラーを含むウォーターズ６２ ５ＬＣシステムを用いて実施した。しかしながら、精度および直線性試験は、モ デル１２６溶媒供給システム、モデル１６６可変波長検出器およびモデル５０７ オートサンプラーからなるベックマンシステム−ゴールトＨＰＬＣシステムによ って実施した。 試料の調製 試料および標準は、移動相中で調製した。すべてのｂＳＴ試料は、特に示さな い限り、１ｍｇ／ｍＬ ｂＳＴの濃度で調製した。不完全な溶解を最小限にする ために、移動相の部分標本をｂＳＴに加え、その試料溶液を３０分間室温に放置 した。次に、試料溶液を５〜１０分間静かに振盪させた。次に、試料溶液を注入 する前に、アクロディスク０．４５μｍフィルターで濾過した。 ｂＳＴ試料のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣの結果 図１Ａは、生物学的に活性なｂＳＴ蛋白を含む単一の主要ピークのみが認めら れた、生物学的に活性な組み換えｂＳＴ蛋白の対照用標準のサイズエクスクルー ジョンＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図１Ａのクロマトグラムは、流速 を１ｍＬ／分とした以外は、既述の方法を用いて得られた。図１Ｂおよび１Ｃは 、異なるロットの組み換えｂＳＴバルク材料のサイズエクスクルージョンＨＰＬ Ｃクロマトグラムを示している。それらの間のベースラインがきわめてはっきり している２つの強いピークが観察された。クロマトグラフィによる最初の溶出ピ ーク（〜９分）は、高分子量のｂＳＴ可溶性凝集物を含有しており、第二の溶出 ピークは（〜１３分）は、生物学的に活性なｂＳＴ蛋白である。 図１Ｄおよび１Ｅは、図１Ｃのクロマトグラムの作成に使用した同じバルクの 組み換えｂＳＴからの試料のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣクロマトグラフ を示す。図１Ｄに示した単独のクロマトグラムは、ｐＨ１１．３の移動相を用い て得られた。図１Ｂと同様に、２つの強いピークが再度観察された。図１Ｅの重 ね合わせたクロマトグラムは、ｐＨが７．９〜１２．２の範囲の移動相を用いて 得られた。試験したより低いｐＨとより高いｐＨにおけるピーク面積応答の低下 は、ｂＳＴ可溶性凝集物の溶解性の低下を証明した。本発明のさらに都合のよい 方法は、ｂＳＴ可溶性凝集物がより高い溶解性を示す移動相のｐＨ（例えば、こ れらの操作において約９〜約１２のｐＨで）を用いて実施される。 図１Ｂおよび１Ｃに示したロットのさらなるサイズエクスクルージョンＨＰＬ Ｃクロマトグラムは、異なる未変性移動相（０．０５Ｍホウ酸緩衝溶液）を使用 する以外は、同じ条件下で得られた。得られたクロマトグラムは、２つの強いピ ークがあり、それらの間のベースラインがはっきりしている、図１Ｂおよび１Ｃ に示したものと同様のものであった。したがって、他の未変性緩衝水溶液は、本 発明に従ったサイズエクスクルージョンＨＰＬＣによる分離に直ちに使用してよ い。 サイズエクスクルージョンＨＰＬＣ条件の変化 サイズエクスクルージョンＨＰＬＣにおける生物学的に活性なｂＳ蛋白分画の 溶出時間に対する重炭酸アンモニウム濃度の変化の影響について検討した。一連 の実験から、生物学的に活性なｂＳＴ蛋白は重炭酸アンモニウム溶液の変化によ って典型的なサイズエクスクルージョンＨＰＬＣ曲線が得られた（図２Ａ）。溶 出時間のわずかな変化は、約０．１〜０．４Ｍの範囲の重炭酸アンモニウム濃度 において認められた。重炭酸アンモニウムの濃度が約０．４Ｍを越える範囲のと き、溶出時間はより急速に増加した。さらに、塩（重炭酸アンモニウム）濃度が 約０．７Ｍより上昇したとき、ｂＳＴのピーク面積は有意に減少した（図２Ｂ） 。したがって、本発明のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣ法は、約０．７Ｍ未 満の移動相中の重炭酸塩濃度で実施することが望ましい。 生物学的に活性なｂＳＴ蛋白分画のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣ溶出時 間およびピーク面積応答に対する移動相のｐＨの変化の影響についても検討した 。０．２Ｍ重炭酸アンモニウム移動相のｐＨが約７．５〜約１０．５の範囲で上 昇しても、ｂＳＴの溶出時間には影響しなかったが、ピーク面積応答は、同じｐ Ｈ範囲にわたってわずかに増大した（図３Ａ、３Ｂ）。 本試験における最も都合のよいサイズエクスクルージョンＨＰＬＣの流速は、 約０．５ｍＬ／分であることがわかった。０．３ｍＬ／分の流速は使用可能であ り、同等の効率が得られるが、操作時間がほぼ２倍になる。生物学的に活性なｂ ＳＴ蛋白分画のピークは、１ｍＬ／分の流速でボイド（ｖｏｉｄ）ピークと重な った。 未変性ｂＳＴ試料 本発明の方法がｂＳＴを変性させないことを確認するために、対照用標準中の 生物学的に活性なｂＳＴ蛋白分画（図１Ａ参照）を採取し、その生物学的活性を ＲＲＡによって測定した。その結果は、採取された移動相中の生物学的に活性な ｂＳＴ蛋白分画成分がサイズエクスクルージョンＨＰＬＣによる処理前の元の溶 液と同じ生物学的活性を保持していることを示唆した。 いくつかの異なるロットの組み換えバルクｂＳＴの試験において、本発明のサ イズエクスクルージョンＨＰＬＣ法によって測定した生物学的に活性なｂＳＴ蛋 白分画濃度とＲＲＡによって測定した力価データ（Ｉ．Ｕ．／ｍｇ）との間に強 い相関のあることが証明された。サイズエクスクルージョンＨＰＬＣ法およびＲ ＲＡのデータの直線回帰プロットを図４に示す。それらのデータの相関係数は０ ．８４５であった。これらの結果は明らかに、本発明のサイズエクスクルージョ ンＨＰＬＣ法がｂＳＴバルク材料の力価値の測定に使用できること示している。 すなわち、本発明のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣ法は、力価のわかってい ないｂＳＴ試料中の生物学的に活性なｂＳＴ蛋白の濃度（例えば、ピーク面積パ ーセント）の測定に使用することができる。次に、試料中の測定された生物学的 に活性なｂＳＴ蛋白の濃度は、ｂＳＴ対照に対するＲＲＡおよびサイズエクスク ルージョンＨＰＬＣアッセイのデータを含めて、図４と同様の較正された曲線上 にプロットすることができる。ＲＲＡのデータは従来通り他の方法（例えば、よ く知られたラットの体重増加法）によって得られる生物力価データとよく相関し ている。したかって、本サイズエクスクルージョンＨＰＬＣの結果の同様の相関 を、他の既知のｂＳＴ生物力価アッセイによって得られるデータに対して得るこ とができる。 方法の直線性と精度 本発明のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣ法の直線性は、異なる濃度の移動 相中の生物学的に活性なｂＳＴ蛋白対照用標準を調製することによって測定した 。濃度範囲が０．１〜１ｍｇ／ｍＬのｂＳＴの標準溶液を、トリプリケートで、 サイズエクスクルージョンＨＰＬＣによって処理し、データの直線回帰分析を行 った。異なる３日間に３本の異なるカラムを用いて得られた直線性の再現性を表 １に示す。その相関係数は０．９９９８〜１．０００の範囲であり、平均相対標 準偏差（Ｒ．Ｓ．Ｄ．）は１．３６％であった。 本発明のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣ法の精度は、２本の異なるＨＰＬ Ｃシステム、連続番号の異なる３本のカラムおよび異なる３ロットのｂＳＴバル ク材料を同時に用いて３日間にわたって評価した。得られた結果（表２に記載） は、測定した生物学的に活性なｂＳＴ蛋白のＲ．Ｓ．Ｄ．は２．８％より小さく 、溶出時間の再現性は０．１８％Ｒ．Ｓ．Ｄ．より小さいことを示している。 ｂＳＴ回収試験は、異なる２つのバルクｂＳＴに異なる２濃度の生物学的に活 性なｂＳＴ蛋白対照用標準を添加することによって行った。今回の試験における 回収率は、１０１〜１０４％の範囲であった（表３）。 上記の結果は、本発明のサイズエクスクルージョンＨＰＬＣ法がバルクｂＳＴ 材料におけるｂＳＴの力価の正確で精密な測定法を提供すること証明している。 ｂＳＴ可溶性凝集物の特徴づけ 既述したように、約１３分におけるピークは生物学的に活性なｂＳＴ蛋白分画 を示し、約９分のピークはｂＳＴ可溶性凝集物分画を示す（図１Ｂ−１Ｅ）。さ らなる試験において、サイズエクスクルージョンＨＰＬＣ法においてフォトダイ オードアレイ検出器によって得られたＵＶスペクトラムは、生物学的に活性なｂ ＳＴ蛋白分画とｂＳＴ可溶性凝集物分画のＵＶ像が同様であることを証明した。 ｂＳＴ可溶性凝集物のＵＶスペクトラムの変化が２５０−２７０ｎｍで認められ たが、これは凝集後の芳香族アミノ酸の環境変化によるもののようである。 ｂＳＴ可溶性凝集物の分子量は、サイズエクスクルージョンＨＰＬＣを用いる 較正曲線によって測定した。その結果を図６に示す。ｂＳＴ可溶性凝集物は、カ ラムの排除ボリュームに溶出し、その分子量（ＭＷ）は６６００００（サイログ ロブミンのＭＷ）より大きかった。さらにｂＳＴ可溶性凝集物を特徴づけるため に、バルクｂＳＴを０．４Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ９）中に溶解し、５ｍｇ ／ｍＬの溶液とした。１６０００ ｇで遠心分離後、上清を、移動相が０．４Ｍ 重炭酸アンモニウム溶液である以外は既述の標準的なサイズエクスクルージョン ＨＰＬＣの条件下で処理した。この分離によって得られた２つの成分である生物 学的に活性なｂＳＴ蛋白およびｂＳＴ可溶性凝集物は、分離した分画中に収集さ れた。それぞれ収集された分画は、再度クロマトグラフィにかけ、その溶出時間 および純度を確認した。その結果は、遠心分離後にもなお、溶液中にｂＳＴ凝集 物が残存することを証明した。 試験を実施し、ｂＳＴ可溶性凝集物が非共有結合性であることを確認した。も しｂＳＴ可溶性凝集物が非共有結合性蛋白であれば、溶液中に界面活性剤、高濃 度の尿素および塩酸グアナジンなどの変性剤が存在することによりモノマーに解 離するであろう。このことを確認するために、収集したｂＳＴ可溶性凝集物分画 と２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の１：１混合物を、ｄｕ Ｐｏｎｔ ２５０カラムおよび１％ＳＤＳ含有０．４Ｍ重炭酸塩移動相を含むシステムでク ロマトグラフィを行った。予想した通り、解離した蛋白のクロマトグラフィプロ フィールおよびＵＶスペクトラムは、同じ実験条件下で得られたＳＤＳ−モノマ ーのそれと同じであった。同様の試験において、ｂＳＴ可溶性凝集物は３Ｍ尿素 によっても解離し得ることが明らかとなった。 溶液中のｂＳＴ可溶性凝集物の挙動が、さらに検討されている。ｂＳＴ可溶性 凝集物の可溶性は、溶液中の塩濃度によって強い影響を受けた。図６に示すよう に、重炭酸塩の増加は、調製試料および移動相中の重炭酸アンモニウム濃度が変 化する他は既述の条件下で行ったサイズエクスクルージョンＨＰＬＣが示す通り 、該蛋白の塩析による可溶性凝集物の可溶性を急激に低下する。同様に、ｂＳＴ 可溶性凝集物の可溶性に対する重炭酸緩衝溶液のｐＨの影響について検討した。 ８．５未満のｐＨおよび１２．５を越えるｐＨにおいて、ｂＳＴ可溶性凝集物は ０．２Ｍ重炭酸溶液外に析出する。ｂＳＴ可溶性凝集物の可溶性は、ｐＨ８．５ から始まるｐＨの上昇につれて増大し、ｐＨ９．５で最大に達した（図７）。 本可溶性凝集物の安定性についても試験した。分離されたｂＳＴ可溶性凝集物 溶液は、４℃で２日間安定であり、室温では９時間以上安定である（単位時間当 たりのサイズエクスクルージョンＨＰＬＣピーク面積を測定することによって決 定した）。さらに、１６０００ｇで遠心分離したとき、ｂＳＴ可溶性凝集物は少 なくとも３０分間溶液中に残存している（図８）。 本発明は既述の明細書中に例示され、詳細に記載されているが、これらは例示 であって、本発明を制限する性質のものではないと考えるべきであり、好ましい 態様のみが記載されており、本発明の精神に適うすべての変化および修飾が保護 されていることが望ましいと理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．固相として平均粒子直径が約５μｍ〜約１５μｍの親水性多孔性ポリマー ゲルを、また移動相としてウシソマトトロピン試料を変性させないｐＨ約８〜約 １２の緩衝水溶液を用いる、サイズエクスクルージョンＨＰＬＣによって、ウシ ソマトトロピン試料中の生物学的に活性なウシソマトトロピン蛋白の濃度を測定 すること；および測定された生物学的に活性なウシソマトトロピン蛋白の濃度に 基づいてウシソマトトロピン試料の力価を決定すること、からなるウシソマトト ロピン試料の力価を測定するための方法。 ２．親水性多孔性ポリマーゲルの平均粒度が約１０μｍ〜約１５μｍである請 求項１に記載の方法。 ３．緩衝水溶液が重炭酸塩緩衝溶液である請求項１に記載の方法。 ４．親水性多孔性ポリマーゲルの平均粒度が約１０μｍ〜約１５μｍである請 求項３に記載の方法。 ５．該決定がウシソマトトロピン対照試料に関するサイズエクスクルージョン ＨＰＬＣによるデータとＲＲＡ力価値を関連づける較正曲線上に測定した生物学 的に活性なｂＳＴ蛋白の濃度をプロットすることを含む請求項４に記載の方法。 ６．親水性多孔性ポリマーゲルの平均粒度が約１０μｍである請求項４に記載 の方法。 ７．親水性多孔性ポリマーゲルの平均ポア直径が約１５０オングストロームで ある請求項４に記載の方法。 ８．移動相のｐＨが約９〜約１１である請求項６に記載の方法。 ９．親水性多孔性ポリマーゲルの平均ポア直径が約１５０オングストロームで ある請求項８に記載の方法。 １０．サイズエクスクルージョンＨＰＬＣが約８００〜約１０００ｐｓｉの圧 で実施される請求項６に記載の方法。 １１．移動相が約０．７Ｍ未満の濃度の重炭酸アンモニウム緩衝溶液である請 求項６に記載の方法。 １２．サイズエクスクルージョンＨＰＬＣが約８００〜約１０００ｐｓｉの圧 で実施される請求項１１に記載の方法。 １３．親水性多孔性ポリマーゲルの平均ポア直径が約１５０オングストローム である請求項１２に記載の方法。 １４．固相として平均粒度が約５μｍ〜約１５μｍの親水性多孔性ポリマーゲ ルを、また移動相としてウシソマトトロピン試料を変性させないｐＨ約８〜約１ ２の緩衝水溶液を用いる、サイズエクスクルージョンＨＰＬＣによって、ウシソ マトトロピンから生物学的に活性なウシソマトトロピン分画を分離することから なる、ウシソマトトロピンから生物学的に活性なウシソマトトロピン分画を分離 するための方法。 １５．緩衝水溶液が重炭酸塩緩衝溶液である請求項１４に記載の方法。 １６．親水性多孔性ポリマーゲルの平均粒度が約１０μｍ〜約１５μｍである 請求項１４に記載の方法。 １７．親水性多孔性ポリマーゲルの平均ポア直径が約１５０オングストローム である請求項１４に記載の方法。 １８．サイズエクスクルージョンＨＰＬＣが約８００〜約１０００ｐｓｉの圧 で実施される請求項１６に記載の方法。 １９．移動相のｐＨが約９〜約１１である請求項１６に記載の方法。 ２０．移動相が約０．７Ｍ未満の濃度の重炭酸アンモニウム緩衝溶液である請 求項１６に記載の方法。 ２１．親水性多孔性ポリマーゲルの平均ポア直径が約１５０オングストローム である請求項１８に記載の方法。 ２２．サイズエクスクルージョンＨＰＬＣが約８００〜約１０００ｐｓｉの圧 で実施される請求項２０に記載の方法。 ２３．親水性多孔性ポリマーゲルの平均ポア直径が約１５０オングストローム である請求項２２に記載の方法。 ２４．生物学的に不活性なウシソマトトロピンの非共有結合性可溶性凝集物か ら生物学的に活性なウシソマトトロピンを分離するために、固相として平均粒子 直径が約５μｍ〜約１５μｍの親水性多孔性ポリマーゲルを、また移動相として ウシソマトトロピン試料を変性させないｐＨ約８〜約１２の緩衝水溶液を用いる 、サイズエクスクルージョンＨＰＬＣにバルク組み換えウシソマトトロピンをか けることからなる、バルク組み換えウシソマトトロピン中に含まれる生物学的に 不活性なウシソマトトロピン非共有結合性可溶性凝集物から生物学的に活性なウ シソマトトロピン蛋白を分離するためにバルク組み換えウシソマトトロピンを処 理するための方法。 ２５．緩衝水溶液が重炭酸塩緩衝溶液である請求項２４に記載の方法。 ２６．親水性多孔性ポリマーゲルの平均粒度が約１０μｍ〜約１５μｍである 請求項２４に記載の方法。 ２７．サイズエクスクルージョンＨＰＬＣが約８００〜約１０００ｐｓｉの圧 で実施される請求項２６に記載の方法。 ２８．移動相のｐＨが約９〜約１１である請求項２６に記載の方法。 ２９．移動相が約０．７Ｍ未満の濃度の重炭酸アンモニウム緩衝溶液である請 求項２６に記載の方法。 ３０．親水性多孔性ポリマーゲルの平均ポア直径が約１５０オングストローム である請求項２７に記載の方法。