JPH08509371A

JPH08509371A - ライム病の予防及び治療のためのＯｓｐＣ抗原ワクチンの免疫原性製剤及びかかる抗原の調製のための組換え方法

Info

Publication number: JPH08509371A
Application number: JP6523899A
Authority: JP
Inventors: ライヴィー，イアン; クロウ，ブライアン; ドルネル，フリードリッヒ
Original assignee: イムノ・アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1993-04-29
Filing date: 1994-04-29
Publication date: 1996-10-08
Also published as: NO954318D0; ES2114687T3; FI955150A0; WO1994025596A2; CZ289212B6; NO954318L; EP0701612A1; DE69408135D1; SK279968B6; HRP940279A2; CZ283995A3; FI955150A7; DE69408135T2; EP0701612B1; FI955150L; PL311301A1; WO1994025596A3; SK134195A3; HUT72923A; PL178775B1

Abstract

(57)【要約】 B．burgdorferiの異なる菌株からのＯｐＣタンパク質をグループ化することによる、血清学的、遺伝子型、そして疫学的情報を考慮に入れた、ボレリアワクチン製剤に対するアプローチ。結果として得られたワクチンが最少の数の抗原で最大の交差防御を提供するように、かかるグループの代表的試料を構成するようにＯｓｐＣ抗原が選択される。

Description

【発明の詳細な説明】ライム病の予防及び治療のためのＯｓｐＣ抗原ワクチンの免疫原性製剤及びかかる抗原の調製のための組換え方法本発明は、哺乳動物におけるライム病の予防及び治療、特にライム病の発症を遅延させるか又は予防するため異なる血清学的形態のＯｓｐＣを含む免疫原性製剤に関する。本発明は同様に、新しい抗原の調製のための組換え方法をも含んでいる。発明の背景ライム病又はライムボレリオーシスとは、ライム病ボレリア属によりひき起こされるダニ媒介スピロヘータ感染に付随するさまざまな臨床的症状を記述するのに用いられる用語である。ライム病の一般的な症状発現としては、皮膚〔遊足性紅斑（ＥＭ）又は慢性萎縮性先端皮膚炎（ＡＣＡ）］、神経系（神経ボレリオーシス）及び関節（関節炎）に影響を及ぼす障害が含まれるが、その他の器官及び組織も感染及び罹病しうる。ライム病は世界中に分布しており、米国及びヨーロッパの両方において最も優勢なダニ媒介疾病である。ヨーロッパにおいて一般にライム病と結びつけられる臨床的症状の範囲は、米国におけるものよりも広く、ヨーロッパでは皮膚及び神経系の障害が一般的であるものの米国では稀であり、一方ヨーロッパに比べて米国では関節炎がより一般的である。北米における臨床的症状は、ヨーロッパで見られるものの部分集合であると思われる。ライム病は、一般的には抗生物質で治療される。しかしながら治療は、往々にして複雑な臨床像及び広く利用可能な信頼できる診断試験の欠如のため、遅れる可能性がある。病気が慢性状態にまで進んでしまうと、抗生物質での治療はさらにむずかしく、かつ常に成功するとは限らない。その上、永久的損傷が誘発される見通しは、長期にわたる感染の間に増大する確率が高い。従って、ライム病を予防するためのワクチンが望ましい。ライム病ボレリア属からの２つの抗原についてはすでに記述されており、ライム病の動物モデルで確認されるように、これら微生物による感染／疾病に対して防御することができる。従って、これらの抗原すなわちＯｓｐＡ及びＯｓｐＣ（又は「ｐＣ」）は、ライム病に対し防御するべく設計されたあらゆるワクチンの中に含み入れるのに適当な候補である。Simon et al.，欧州特許第４１８，８２７号；Fikrig et al.，Science 250：553-56（1990）；Preac-Mursic et al.，I nfection（感染）20：342-49（1992）を参照されたい。ＯｓｐＡ及びＯｓｐＣは、多くの特性を共有している。両方共、細胞表面に露呈されたリポタンパク質である（Howe et al.，Science 227：645-46（1985）；Bergstrom et al.，Mol．M icrobiol．3：479-486（1989））；両方共プラスミドでコードされている（Barb our et al.，Science 237：409-11（1987）；Marconi et al.，J．Bacteriol．1 75：926-32（1993））；これらのタンパク質のための遺伝子は大部分の菌株の中に存在する（Barbour et al.，J．Infect．Dis．152：478-84（1985）；Marconi et al.，J．Bacterio1．175：926-32（1993）；そして、両方共、血清学的に全く異なる数多くの形態で存在する（Wi1ske et al.，（1989））。これらの抗原について血清学的に全く異なる数多くの形態が存在することは、全てとはいわないまでも大部分の形態のライム病に対し防御するためのＯｓｐＡ及びＯｓｐＣワクチンの開発にとって１つの障害物となっている。例えば、Fikr ig et al.，J．Immun．148：2256-60（1992）によると、Ｎ４０菌株の組換え型ＯｓｐＡのようなＯｓｐＡの１つの血清学的形態を用いた免疫化は、例えば菌株２５０１５のような異なるＯｓｐＡを発現する菌株での抗原投与に対し防御する必要がない、ということが立証されてきている。従って、幅広い防御を与えることが必要とされる血清学的に全く異なる形態の抗原の最適な混合物を決定できるように、異なる抗原変異体（すなわちＯｓｐＡ及び／又はＯｓｐＣ）を分類しまとめるための型決定スキーマを開発することが必要である。型決定手段として、制限された数のモノクローナル抗体を用いる、ＯｓｐＡについての血清型決定システムが開発され、この方法を用いて７つのＯｓｐＡ血清型が記述されてきた。Wilske et al.，Ann．N.Y．Acad．sci．539：126-43（198 8）。５５の異なるヨーロッパ及び北米産菌株からのＯｓｐＡ遺伝子の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析が、６つの全く異なる遺伝子群を同定した。Wallich et al.，感染と免疫60：4856-66（1992）。北米分離株からのＯｓｐＡタンパク質は、１４のＯｓｐＡのうちの１２がＯｓｐＡＩ型に、そして２つがＯｓｐＡIII 型に属することから、合理的に均質であると思われる。これとは対照的に、ヨーロッパ分離株からのＯｓｐＡは、はるかに不均質であり、ＯｓｐＡＩ型（１８）、II型（１７）、IV（４）及びＶ型（１）の代表を含んでいる。B．burgdorferiの個々の菌株からの１２のＯｓｐＡタンパク質についての配列データに基づく系統樹の構築は、ＲＦＬＰ分析の発見事実を裏づけているが、６つの遺伝子群のうちの２つの分離株からの配列情報がなおも欠如している。現在のところ、ＯｓｐＣについてはいかなる型決定システムも存在しない。ワクチンの中に含み入れるための適切な抗原を選定するときのもう１つの考慮事項は、それらがその疾病にとって疫学的に重要である菌株から誘導されているか否かということである。１９７０年代半ばに、病原細菌が、或る意味では、疾病をひき起こす上で選択的利点を有するきわめて関連性の高い細菌の制限された数のクローンから生じる、ということが仮定された。このクローン仮説はその後確認されている。Achtman et al.，J．Infect．Dis．165：53-68（1992）。従って、天然に発見されるライム病ボレリア属の数多くの菌株の中で、哺乳動物特にヒトの病気をひき起こすのにきわめて適合した「クローン」が、制限された数だけ存在する確率は非常に高いのである。哺乳動物ひいてはヒトの体内で疾病に対し防御するためのワクチンを開発する上で、研究努力を集中させうるように疾病関連クローンを同定することが最高の重要性を帯びている。従って、ライム病ボレリア属という種の個体群構造を解明し、疾病関連クローンを同定することが必要である。今日まで、（Ａ）ゲノミックＤＮＡ又は特異的遺伝子のＲＦＬＰ分析（LeFebv re et al．J．Clin．Micriobiol．27：636-39（1989）；Marconi & Garon，J．B acteriol 174：241-44（1992）；Postic et al.，Res．Micriobiol．141：465-7 5（1990）； Stahlhammar-Carlemalm et al.，Zbl．Bak 274：28-39（1990）；Adam et al.， Infect．Immun．549：2579-85（1991）；Wa11ich et al.，Infect．Immun．60： 4856-66（1992））、（Ｂ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（LeFebvre et al.，J．Clin．Micriobiol．27：636-39（1989）；Postic et al.，Res．Mic riobiol．141：465-75（1990））、（Ｃ）オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーシヨン（Marconi et al.，J．Clin．Micriobiol 30：628-32（ 1992）又は配列決定（Adam et al.，Infect．Immun．59：2579-85（1991）；Mar coni & Garon，J．Bacteriol．174：241-44（1992））による１６ＳｒＲＮＡの分析、（Ｄ）任意にプライミングされたポリメラーゼ連鎖反応によるフィンガープリント法（Welsh et al.，Int．J．System．Bacteriol．42：370-77（1992））、（Ｅ）多重遺伝子座酵素電気泳動法（Boerlin et al.，Infect．Immun．60 ：1677-83（1992））及び（Ｆ）分離株の血清型決定（Peter & Bretz，Zb．Bakt k．277：28-33（1992））を含め、ライム病ボレリア属の個体群構造を解決するために数多くの方法が使用されてきた。これらの異なる方法により、得られた結果の間には広範な一致が存在する。一般に、ライム病ボレリア属分離株は少なくとも３つの主要なグループに分割できると思われる。事実、研究者の中には、これらのグループのメンバー間の遺伝子距離がそれらを３つの種、つまり、B．burgdorferi sensu stricto（菌株Ｂ３１型）、B．garinii sp．nov．（菌株２００４７型）及びB．afzelii又は「ＶＳ４６１ボレリアグループ」と呼称される種、に区別するに値するほど充分なものである、と考えている人もいる。Baranton et al.，Int． J．Syst．Bacteriol．42：378-383，1992；Marconi & Garon，前出、を参照されたい。ワクチンの開発にとって、これらの異なるグループの存在の意義は、これから先充分に解明されるべきことである。Wallich et al.，Infection & Immunity（感染と免疫）60：4856-66（1992）から、１つの分離株が属している遺伝子群と生成されるＯｓｐＡの型の間に、強い関連性が存在するということが明らかである：すなわち、Ｂ３１菌株を含むグループ（遺伝子群ＡＡＡ又はB．burgdorferi sensu stricto）はＩ型ＯｓｐＡを生成し（分析された３０の菌株の全て）、菌株２００４７を含むグループからの分離株（遺伝子群ＢＢＢ又はB．garinii sp ．nov．）は、通常II型（１７／１９）のＯｓｐＡを生成するが、Ｖ型（１／１９）及びVI型（３／３９）も指摘された、菌株ＢＯ２３を含むクローンからの分離株（遺伝子群ＢＢＡ又はグループＶＳ４６１）は、IV型のＯｓｐＡ（４／４）を生成し、残りの２つの分離株（遺伝子群Ｂ、Ｂ／Ａ、Ａ）は、III型のＯｓｐＡを生成する。北米からのライム病分離株は、卓越して、菌株Ｂ３１により代表される１つのグループ（遺伝子群ＡＡＡ又はB．burgdorferi sensu stricto）に属しており、従ってＩ型のＯｓｐＡを生成する。このことはすなわち、Ｉ型ＯｓｐＡを含むワクチンが、現在のところ北米における、ライム病をひき起こす大部分の分離株に対して防御するのに充分なものでありうる、ということを示唆している。ヨーロッパでは、３つの主要なクローン全てが発見されており、それに対応して、存在するＯｓｐＡの型（タイプ）における多様性の増大がみられることから（遺伝子型Ｉ、II、IV、Ｖ．VI）、臨床像はより複雑なものである。その上、ＯｓｐＡは、ヨーロッパからのライム病分離株を用いて行われた２つの研究の中で、防御しないことが発見されており、これらの研究は同様に、防御抗原としてのＯｓｐＣの有用性を立証していた。米国特許出願第０７／９０３，５８０号；Preac-Mursic et al.，Infection 20：342-49（1992）を参照されたい。これまで、特定の型のＯｓｐＣが特定のグループのライム病分離株（すなわち B．burgdorferi sensu stricto，B．garinii sp．nov．又はグループＶＳ４６１）に制約されて、ＯｓｐＣがクローン的に受け継がれたか否かは知られていなかった。ＯｓｐＣはプラスミドでコードされているため（Marconi et al.，J．Bac teriol．175：926-32（1993））、異なる種のライム病分離株との間で、ＯｓｐＣ遺伝子のプラスミド媒介されたトランスファが存在したことは考え得ることであった。もしこれがあてはまるならば、存在することがわかっているものの定義づけされたことのない異なる型のＯｓｐＣは、必ずしもクローン的に受け継がれないだろう。発明の要約本発明の目的は、世界中の起源の広範な菌株の表現型決定（ＯｓｐＣ「血液型亜型」決定）、及びＲＦＬＰ型決定分析、及び配列分析、により、解明された明確なＯｓｐＣファミリーに基づいてＯｓｐＣ製剤を選択することにより、哺乳動物におけるライム病に対して、全ての菌株に関して幅広い防御効果（交差防御）レベルを有する有効なＯｓｐＣワクチンを提供することにある。さらに、ＯｓｐＣ遺伝子はクローン的に受け継がれるものであることが発見されてきた。従って、現在、ライム病ボレリア属菌株のクローナル個体群構造を解明するために、使用することのできる以下に記述する「共通膜抗原型決定」（ＣＭＡＴ）スキーマからの疫学的情報を考慮して、ＯｓｐＣ型決定スキーマの結果を解釈することが可能である。同じように、現在、（ａ）特定な地理的地域内で優勢である菌株に対し防御するためのワクチンを設計できるようにするため、或いは（ｂ）B．burgdorferiの疫学的に重要な疾病関連クローン又はクローナルクラスターに対して特異的かつ優先的に防御するため、最も適切なＯｓｐＣワクチン製剤を選択することも可能である。これらの目的及びその他の目的を達成する上で、本発明の１つの態様に従うと、（ａ）（ｉ）図１１の現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーの各々から、実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ ii）防御抗体の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物において、前記量が、ライムボレリオーシスに罹患しうる哺乳動物でライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物が提供される。もう１つの実施態様に従うと、上述の免疫原性組成物は、図１１の現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーのライム病ボレリア属の１つ以上、好ましくは２つ以上の抗原、又は上記（ii）に規定されているようなこの抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、及び（ｂ）として上記に規定されているような生理学的に受容可能な賦形剤を含んでいる。本発明のもう１つの態様に従うと、（ａ）（ｉ）ヒト疾病関連（ＨＤＡ）クローン及びクローナルクラスターによって発現された図１９のＯｓｐＣファミリーの各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御抗体の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造をもつ、ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物において、前記量が、ライムボレリオーシスに罹患しうる哺乳動物でライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物が提供される。好ましい実施態様としては、上述の免疫原性組成物は、図１９のＯｓｐＣファミリーの１つ以上、好ましくは２つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は上記の（ii）で規定されているようなＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、そして上記の（ｂ）に規定されている生理学的に受容可能な賦形剤を含んでいる。好ましい一つの実施態様においては、本発明の範囲内に入る免疫原性組成物は、北米、ヨーロッパ又はオーストリアのような特定の地理的地域内で優勢であるライム病ボレリア菌株に対して防御するよう設計されている。好ましい実施態様としては、いずれかの抗原を単独で用いて処方されたワクチンよりも優れている、組合せ型ＯｓｐＡ／ＯｓｐＣワクチンが特許請求されている。本発明はまた、ＤＮＡ配列、発現ベクター及び形質転換された宿主細胞と共に、新しいＯｓｐＣ抗原を生成するための組換え方法をも含んでいる。本発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な記述から明らかになるだろう。ただし、本発明の好ましい実施態様を示す一方で、詳細な説明及び特定的実施例は、例示を目的として示されているにすぎない。というのも、本発明の精神及び範囲内でのさまざまな変更及び修正が、この詳細な説明から当業者にとって明らかとなるからである。図面の詳細な説明図１は、実験的調査において用いられた７７のボレリア菌株を表わしている。これらの菌株の起源国及びそれが分離された生物学的供給源（すなわちヒト、ダニ又は動物）について記述されている。ヒト分離株が得られた臨床材料及び疾病の症候群も同様に示されている（略号：ＣＳＦ＝脳脊髄液；ＡＣＡ＝慢性萎縮性先端皮膚炎；ＥＭ＝遊足性紅斑）。実験的に研究されなかった５つの付加的な菌株の特性も同様に含まれている。これは、これらの菌株に関連する公開された情報が、分析のいくつかにおいて使用されたからである。図２は、全ての菌株の寄付者の住所をリストアップしている。図３は、、モノクローナル抗体及びその共通膜抗原特異性をリストアップしている。モノクローナル抗体のアイソタイプ及び相同反応菌株も示されている。図４は、ＣＭＡＴ型決定スキーマにより解明されたＣＭＡＴの各々についての代表的菌株及び個々のスコアを示す。図５は、ＣＭＡＴ型決定データについて行われたクラスター分析の樹状図を示す。ＣＭＡＴクラスター（５０％以上の類似性をもつ全てのＣＭＡＴ）及びＣＭＡＴ亜型（２０％以上の類似性をもつ全てのＣＭＡＴ）への個々のＣＭＡＴの分類と同時に、テストされた菌株の間でのＣＭＡＴの出現頻度も示されている。図６は、さまざまな血液型亜型の標準菌株と共に、１６のＯｓｐＣ特異的モノクローナル抗体のパネルの反応パターンを示す。図７は、例４で記述されたように調製されＰＣＲ増幅されたＯｓｐＣ遺伝子が酵素Ｄｐｎ１１、Ｄｄｅ１及びＤｒａ１で消化されて得られた制限フラグメントのサイズを示す。ここに示されているデータは、列挙されている８２の菌株からの制限フラグメントデータの分析から同定された、制限フラグメント（すなわち３５のＯｓｐＣＲＦＬＰ型）の３５の独自のパターンを示している。各々のＯｓｐＣＲＦＬＰ型を代表するよう選択された標準菌株も同様に示されている。図８は、ＯｓｐＣＲＦＬＰ型１〜２４に属する菌株から選択された２４のＯｓｐＣ遺伝子の、図１とアラインさせた部分的ヌクレオチド配列を示す。図８ａは、３′末端を含む図８に従った新しいＯｓｐＣ遺伝子の完全な配列を示す。さらに、図８ａは菌株Ｈ１３及び２８６９１のＯｓｐＣ遺伝子についての配列も含んでいる。図９は、図８のヌクレオチド配列データから演鐸された、部分的アミノ酸配列のアラインを示す。配列決定された領域は、完全なＯｓｐＣタンパク質の最初の９２％に一致する。図９ａは、Ｃ末端を含む図９に従った新しいＯｓｐＣ抗原の完全なアミノ酸配列を示す。さらに、図９ａは、菌株Ｈ１３及び２８６９１のＯｓｐＣ抗原についての配列も含んでいる。図１０は、配列と配列同一性度の間の系統発生的関係を示す図９のＯｓｐＣタンパク質配列の樹状図である。この分析は、ＯｓｐＣファミリー内へのＯｓｐＣタンパク質を割り当てるために使用された。ＯｓｐＣファミリーのメンバーには、８０％以上の配列同一性を伴う関連ＯｓｐＣ配列が含まれる。同様に、ＯｓｐＣタンパク質が種特異的な方法でクラスター化し、このことはＯｓｐＣタンパク質がクローン的に受け継がれることを表わしている、ということも示している。図１１は、２０のＯｓｐＣファミリーをリストアップし、このファミリーの代表として選択された菌株を示している。図１２は、図１からの８２の菌株のＣＭＡＴ及びＯｓｐＣ型決定分析の結果を要約している。データは、特定のＯｓｐＣファミリーに属する菌株が出現する頻度を示すべく、ＯｓｐＣファミリー及びＲＦＬＰ型毎に分類されている。ＯｓｐＣファミリーに割り当てられなかった菌株は９９と呼ばれている。菌株の生物学的及び地理的起源が含まれ、ＯｓｐＣファミリーとのこれらのパラメータの比較を可能にしている。公開された記述が存在したもののテストされなかった５つの菌株に対し、ＣＭＡＴ値が割り当てられた（すなわち、B．burgdorferi、B．afzelii及びB．gariniiの菌株はそれぞれＣＭＡＴ１、３及び４に対応する）。ＯｓｐＣ血液型亜型は全ての菌株に割り当てられなかった；５つの菌株は入手できなかった（ＮＡ）。その他は、信頼できる型決定には不充分な量のＯｓｐＣしか発現しなかったことから試験されず（ＮＴ）、いくつかは試験されたがモノクローナル抗体のパネルとは反応性をもたなかった（ＮＲ）。図１３は、マッピングされたＯｓｐＣエピトープの配列と、分析された菌株の間でのその出現頻度をリストアップしている。表の下部に、モノクローナルは、研究中の７７の菌株とその反応頻度に従ったカテゴリーに分類されている。図１４は、その数で表示された数多くのＢＢＭモノクローナル抗体のエピトープの場所をマーキングする、一般化されたＯｓｐＣタンパク質の地図を示す。図１５は、アレチネズミのモデルを用いた能動免疫化実験の結果を示す。動物のグループは、抗原投与菌株Ｏｒｔｈのものと同じ（Ｈ７）か、又は異なるＯｓｐＣファミリー（ＺＳ７、ＰＫＯ及びＷ）の精製されたＯｓｐＣタンパク質変異体を用いて免疫を受けた。結果は、抗原投与菌株により発現されたものと同じファミリーの変異体で免疫化した場合強い交差防御が存在するが、抗原投与菌株のものと異なるＯｓｐＣファミリーのＯｓｐＣ変異体で免疫化した場合、ほとんど又は全く防御しない、ということを示している。図１６は、さまざまなＯｓｐＣ型の間のヒト分離株の分布とＯｓｐＣ型決定情報を要約している。チェコ共和国からのヒトライム病血清の中に存在するＯｓｐＣ抗体の特異性及び優勢性も示されている。１６のＯｓｐＣファミリーを代表する１８の異なるボレリア菌株のパネルに対して試験することによって、ＯｓｐＣ抗体特異性が定められた。図１７は、メタノールで誘発可能なＡＯＸ−１−プロモータの転写制御下でのＯｓｐＣコード配列と共に酵母発現ベクターｐＰＣ−ＰＰ４を示す。図１８は、アレチネズミモデルを用いた能動免疫化実験の結果を示している。動物はB．burgdorferi菌株Ｏｒｔｈから誘導され、及びP．pastoris ＧＳ１１５／ｐＰＣ−ＰＰ−４から組換えにより生成された精製ＯｓｐＣタンパク質で免疫化された。結果は、ボレリア属で誘導されたＯｓｐＣタンパク質ならびに酵母で誘導されたＯｓｐＣタンパク質について強い防御を示している。図１９は、ライム病ボレリアの特異的ヒト疾病関連クローン又はクローナルクラスターに対する防御のために設計されたＯｓｐＣワクチン製剤の例を示す。発明の詳細な説明以下でさらに詳しく記述する血液型亜型、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）及び配列分析によって、異なるライム病分離株にわたって高度のＯｓｐＣタンパク質の不均質性にもかかわらず、なかんづくアミノ酸配列内の類似性に基づいて、ＯｓｐＣタンパク質を制限された数のファミリーに分類することが可能である。本発明に従うと、この発見事実が意味するものは、これまで達成されなかった異なる菌株に関する高度の交差防御を提供するワクチン製剤の設計において実現される。このような交差防御を達成するためには、疾病をひき起こすと考えられる全ての菌株に対し、防御する上で一定の与えられたワクチンの成分の有効性を予想することができなくてはならない。本発明に従うと、この問題は、ワクチン内の防御抗原の不均質性が天然に見られる不均質性を最適な形で確実に反映しているようにすることによって克服される。特にＯｓｐＣタンパク質については、これは、ここで記述されている配列分析により明らかにされるＯｓｐＣファミリーの全てについての代表を含むワクチンを処方することによって達成される。このような処方の一例には、必然的に上述のＯｓｐＣファミリーの全ての代表である２０のＯｓｐＣタンパク質をワクチンの中に内含させることを必要とする。ＯｓｐＣファミリーというのは、図９、９ａ及び１０に示すように、１８ａａリーダー配列と最後の１６ａａについての情報を除外して、成熟したＯｓｐＣタンパク質の最初の９２％全体にわたって８０％以上のアミノ酸配列の同一性をもつ、ＯｓｐＣタンパク質のグループとして定義づけられる。かくして本発明は、１つの態様においては、当該発明者が初めて明確に記述した２０のＯｓｐＣファミリーの各々から、実質的に精製された１つ以上のＯｓｐＣ抗原を含む免疫原性組成物に関する。例えば２０の抗原の使用は、天然に見い出され考えられる全てのＯｓｐＣ変異体を内含する期待に対する１つの改良である（ここで記述されている３５のＯｓｐＣＲＦＬＰの型を参照）。本発明のもう１つの態様に従うと、ライム病ワクチンの処方は、ＯｓｐＣの型決定データを疫学データと組合せて利用することにより、ワクチンの防御効力を減少させないで抗原成分の数を減らすことによってさらに単純化される。以下により詳しく記述する通り、このアプローチの具体例としては、（Ａ）北米、ヨーロッパのような特定の地理的地域において又はオーストリアのような特定の国において使用するためのワクチン製剤の設計、及び（Ｂ）ヒトの疾病に関連するＣＭＡＴ分析により同定されたクローンのみに対して特異的に防御するようにターゲティングされているワクチンの設計、ができる。（Ａ）に入る１つの実施態様においては、ワクチンを北米で使用するために処方され、アメリカ産菌株について観察されるようなＯｓｐＣファミリー、すなわちファミリー２及び３のみを代表する抗原を含んでいる（図１２参照）。もう１つの実施態様に従うと、北米で使用するために処方された前記ワクチンは、ファミリー２、３、１８及び２０からの菌株を含んでいる。ライム病ボレリア属のクローンを同定するために、ＣＭＡＴ分析により個体群構造分析を行った。「ＣＭＡＴ（型）」は、その特異的モノクローナル抗体の一定の与えられたセットにより検出され、いくつかのケースでは弁別的に識別された９つの共通膜抗原の分子量変異体の組合せスコアから、結果として得られた唯一の９ケタスコアとして定義づけされる。「ＣＭＡＴクラスター」は、そのＣＭＡＴスコアにおいて少なくとも５０％の類似性をもつ関係するＣＭＡＴ（型）の１グループである。ここでは「ＣＭＡＴグループ」は、そのＣＭＡＴスコアにおいて２０％以上の類似性を有するＣＭＡＴ型の１グループを指すものとして用いられている。従って、１つのＣＭＡＴグループは、それ自体複数のＣＭＡＴ型で構成されうる複数のＣＭＡＴクラスターで構成されていてよい。「クローン」は、１つ以上の菌株を含む１つのＣＭＡＴ型として定義づけされ、又そうでない場合、クローンは同じＣＭＡＴ型を有し、従って共通の祖先菌株から発生するものとみなされる１つの菌株グループである。「クローナルクラスター」は、ＣＭＡＴクラスターレベル（すなわちそのＣＭＡＴ型が５０％以上の類似性をもつレベル）において関係づけられた１群のクローンのことである。「ヒト疾病関連クローン」は、疾病及び臨床データに基づいて、頻繁にヒトの疾病と関連することを示すことのできるクローンである。同様に、「ヒト疾病関連クローナルクラスター」は、疫学及び臨床データから、頻繁にヒトの疾病と関連することを示すことのできるクローナルクラスターである。従って、Ｂの項目に入る１つの実施態様においては（上を参照）、ＯｓｐＣワクチンが、ヒト疾病関連ＣＭＡＴクローン１．２．４．、３．２．１３及びクローナルクラスター４．２．１７、４．２．１８、４．２．２０及び４．２．２２に対して処方されている。ＯｓｐＣはチャレンジ微生物がこのＯｓｐＣの誘導元と同じライム病分離株である場合、ライム病の動物モデルの体内で防御免疫応答を惹起するのに適した免疫原であるものとして知られている。しかしながら、ライム病ボレリア菌株の間のＯｓｐＣタンパク質の血清学的不均質性のため、１つの菌株からのＯｓｐＣでの免疫化は、広範囲のライム病ボレリア属分離株での感染に対して防御できないと考えられ、交差防御研究に基づいてこの仮定を有効化する必要性が認められた（例６）。これらの研究に基づいて、ＯｓｐＣベースのワクチンが、いくつかの血清学的に全く異なる形態のＯｓｐＣを含んでいなければならないということが明白となった。このような多効果ＯｓｐＣワクチンの処方に対する１つの必須条件は、異なるＯｓｐＣ形態の中での多様性度及びこれらの異なる形態がどのように関係しているかについて知っていることである。従って、このような情報は、本発明に従うと、ライム病ボレリア属に対する新しいワクチン製剤の開発において応用される。必要とされる情報を獲得することに向けての第１段階は、異なるライム病ボレリア属菌株からのＯｓｐＣタンパク質を特徴づけるためのモノクローナル抗体をベースとする型決定システム（例１）の開発であった。最も広範なＯｓｐＣタンパク質が分析されるようにするため、ヒト（例えば、皮膚、脳脊髄液及び血液）、動物及びダニから分離された、異なる地理的地域からの多数のライム病ボレリア属菌株（すなわち、信頼できる特徴づけを可能にするのに充分なＯｓｐＣを生成するものとして図１に記述されている８２の菌株のうち６２が選択された）が研究された。この分析のもう１つの主要な様相は、単に１つのＯｓｐＣタンパク質に対してではなく、６つの異なるＯｓｐＣタンパク質に対して生成された多数のＯｓｐＣ特異的モノクローナル抗体（この例では２５個）を使用し、かくして認識されうるＯｓｐＣエピトープの多様性を増大し、異なるＯｓｐＣタンパク質を弁別する力を増大させたことにあった。この分析において収集されたデータは、明らかに異なる供給源からのＯｓｐＣタンパク質の間に高度の血清学的不均質性が存在することを示していた。１３のモノクローナル抗体のコレクションを用いて同定されたＯｓｐＣの１６の全く異なる型又は血液型亜型の反応パターンの例は、図６に示されている。さらに、１２の菌株は、モノクローナル抗体のいずれとも反応しなかったため型決定できなかった。きわめて有効ではあるけれども、血清学的手段によるＯｓｐＣの型決定はそれでも不完全なものである。というのも、これには、ＯｓｐＣが主要タンパク質として発現されること、そして広範囲の特異性をもつ１組の抗体が利用可能であること、の両方が必要とされるからである。血液型亜型分析の結果から、抗原多様性の全スペクトルは、その問題を最小限にするように選択されてきたにせよ、使用中のモノクローナル抗体では検出されていなかった、ということが明らかであった。従って、ＯｓｐＣ遺伝子の中で出現する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を分析することにより、ＯｓｐＣの不均質性がさらに研究された（例３）。８２の菌株からのデータの分析（すなわち我々の培養コレクション中の７７全ての菌株からの実験データ及び５つの公開されたＯｓｐＣ配列から演鐸された情報：図１参照）は、３５の全く異なるＲＦＬＰＯｓｐＣ型の存在を明らかにした。この方法は血液型亜型型決定から明らかであるものよりも多くの変異を検出するものの、２つの方法で得られる結果の間にはきわめて優れた一致が見られる（図１２）。所有するＯｓｐＣタンパク質又は遺伝子に従った、血液型亜型及びＲＦＬＰ型へのボレリア属菌株の分類により、本発明に従って、より詳しい特徴づけるために、個体群を全体として代表するある限られた数のＯｓｐＣ変異体を選択することが可能となった。かくして、大部分の汎存ＯｓｐＣ型の各々からの１つ以上の代表を含む２９の菌株のパネルが選択され、ＰＣＲによりＯｓｐＣ遺伝子が増幅され、ヌクレオチド及び演鐸されたアミノ酸配列が決定された（例４参照）。完全なＯｓｐＣタンパク質（システイン１９から；前に参考として含めた米国特許出願第０７／９０３，５８０号を参照のこと）から少なくとも１６のアミノ酸を削除したものが、異なるＯｓｐＣ血液型亜型／ＲＦＬＰ型からのＯｓｐＣタンパク質との間の関係を決定するのに使用された。同じＯｓｐＣ型からの密に関係したＯｓｐＣタンパク質の間の関係は、型決定システムの有効性に対するさらなるチェックとして、及び一定の与えられたＯｓｐＣ型の中にさらなる不均質性が存在したか否かを立証する目的で調査された。２４の菌株からのＯｓｐＣタンパク質についてのヌクレオチド及び演鐸されたアミノ酸配列は、それぞれ図８及び図９に示されている（すなわち、この研究からの２２の配列と菌株２５９１及びＰＢＩについての２つの公表された配列）。図１０には、ＯｓｐＣタンパク質間の系統発生的関係を示す樹状図が示されている。本発明のＯｓｐＣ抗原ベースの免疫原には、天然に出現するＯｓｐＣタンパク質の異なる血清学的形態の混合物が含まれていてよい。本発明のもう１つの実施態様においては、免疫原性組成物には、ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体が含まれている。従って、後に記述するとおり、ライム病ボレリア属細胞から得られたＯｓｐＣタンパク質に加えて、天然に出現する分子の組換え型ＯｓｐＣ変異体（「ＯｓｐＣ変異体」）及び「擬似体」−ＯｓｐＣエピトープを擬似するミモトープをもつ化合物−を利用することができる。例えばＯｓｐＣ変異体のカテゴリーには、ＯｓｐＣ分子の免疫原性部分及びＯｓｐＣ分子のあらゆる非タンパク様免疫原性部分に対応するオリゴペプチド及びポリペプチドが内含される。従って、１つの変異体には、天然のＯｓｐＣ分子に相同であり、その顕著な免疫学的特徴を保持しているポリペプチドが含まれるように意図されている。この点において、２つの配列の間の「相同性」は、第２の配列からの第１の配列の誘導を表わすものである同一性に及ばない類似性を意味している。例えば、１つのポリペプチドは、それがＯｓｐＣ特異的抗体又はＴ細胞により認識されたエピトープに対応するアミノ酸配列を含む場合に、ＯｓｐＣに対して「相同」である。このような配列はわずか数個のアミノ酸という長さをもつものであってよく、又、線形決定因子又はタンパク質の、ひだ形成の後又は共有結合修正を受けた後に、線形配列の分離された部分からのアミノ酸が空間的に並置されている場合に生じるものであってもよい。本発明の目的上抗原決定因子であるアミノ酸配列は、例えば当該技術分野において既知のものであるモノクローナルマッピング分析によって確認可能である。Regenmotel，Immunology Today（今日の免疫学）10：266-72（1989）、及びBe rzofsky et al.，ImmunologicalReviews（免疫学評論）98：9-52（1987）を参照のこと。例えば、本発明において、ＯｓｐＣ抗原は、（1）VKLSESVASLSKAA；（2）TDNDSKEAILKTNGT；（3）KELTSPVVAETPKKP；（4）FVLAVKEVETL；（5）YAISTLITEKLKAL；（6）PNLTEISKKITDSNA；（7）ASANSVKELTSPVV；（8）SPVVAETPKKP；（9）GKKIQQNNGLGA；及び（10）SPVVAESPKK；というアミノ酸配列（図１３）のうちの１つ以上のもの、又は上述のエピトープ配列の変異体又は擬似体を含む。好ましい実施態様においては、ワクチンはここに記述されているＯｓｐＣファミリーからのＯｓｐＣタンパク質のうちの１つ以上から選択された血清型特異的エピトープに対応するペプチドを含むことになる。交差防御研究（例６）は、血清型特異的エピトープにより防御免疫が誘発されることを示している。血清型特異的エピトープの一例は、ＯｓｐＣファミリー５（血液型亜型４）からのＯｓｐＣタンパク質について特異的であるモノクローナル抗体ＢＢＭ３８及びＢＢＭ３９により認識される菌株Ｏｒｔｈからの配列＃２である（上を参照）。このエピトープは、ＯｒｔｈＯｓｐＣの親水性分析から予言された推定上のエピトープ（ＤＮＤＳＫＥ）に対応する。同様にして潜在的な血清型−特異的エピトープを、その他のＯｓｐＣファミリー（例４）からのＯｓｐＣタンパク質の中でアミノ酸残基１２０−１５５（第１のシステイン残基から出発）の間に出現するものと予言することができる。このようなワクチンには、以下で記述するように、ペプチド配列の変異体又は擬似体が含まれていてよい。この種の類似性についての検定は同様に、抗体の場合には競合的阻害の研究を介して又はＴ細胞増殖によって行うことができる。これらの基準に従ってＯｓｐＣ変異体としての資格が得られるポリペプチドを、本発明に従い、従来の逆遺伝子技術によって、すなわちアミノ酸配列に基づいて遺伝子配列を設計することによって、又は従来の遺伝子スプライシング技術によって、生成することが可能である。例えば、部位特異的突然変異誘発又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発が関与する技術により、ＯｓｐＣ変異体を生成することができる。例えばCurrent protocols in molecularbiology（分子生物学における現在のプロトコール）８．０．３以降、の中の「クローニングされたＤＮＡの突然変異誘発」（Ausubel et al．eds．1989）（「Ausubel」）を参照のこと。本発明の範囲内に入るその他のＯｓｐＣ変異体は、ＯｓｐＣの一部分に対応する分子、又はＯｓｐＣの一部分を含むが、天然の分子とは一致しない分子、及び単独で提供されたとき又は代替的には担体にリンゲージされたときＯｓｐＣの免疫原性活性を表わす分子である。この種のＯｓｐＣ変異体は天然の分子の実際のフラグメントを表わすものであってもよいし、或いは又、新たに又は組換えにより合成されるポリペプチドであってもよい。ＯｓｐＣ又はＯｓｐＣ変異体の組換え型発現において使用されるように、かかる分子をコードするポリヌクレオチド分子には、好ましくはコドンの利用、翻訳の開始、及び商業的に有用な量のＯｓｐＣ又は望ましいＯｓｐＣ変異体の発現に関して選択された宿主のために最適化されている、望ましいアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が含まれる。同様に、このようなポリヌクレオチド分子を用いて、選択された宿主生体を形質転換するために選択されたベクターは、ポリペプチドをコードする配列の効率の良い維持及び転写を可能にするはずである。コードするポリヌクレオチド分子は、キメラタンパク質についてコードすることができる。すなわち、これは、宿主細胞のためのシグナルペプチドのような、非 −ＯｓｐＣ部分のためのコーディング配列に対して作動的にリンケージされたＯｓｐＣ分子の免疫学的部分をコードするヌクレオチド配列を有することができる。ＯｓｐＣ分子をコードするＤＮＡセグメントを分離するために、公表された方法に従って完全なライム病ボレリアＤＮＡを調製することができる。例えば、Ma niatis et al.，分子クローニング；実験室マニュアル（Co1d Spring Harbor La boratories，N.Y.，1982）；Baess，Acta Pathol．Microbiol．Scand．（Sect． B）82：780-84を参照されたい。このように得られたＤＮＡは、ゲノミックフラグメントの多少の差こそあれ、無作為の組合せを提供するべく、制限酵素で部分的に消化させることができる；Ｓａｕ３Ａ（Ｍｂｏｌ）のようなテトラヌクレオチド認識部位をもつ酵素が、この目的に適している。このとき、このような部分的消化からのフラグメントは、ＯｓｐＣ分子をコードするＤＮＡのものと釣り合った長さのフラグメントを提供するべく、例えばショ糖勾配遠心分離（前出のManiatis参照）又はパルスフィールドゲル電気泳動法〔Anal．Trends in Genetics（遺伝子の傾向）（１９８６年１１月）ページ２７８〜２８３を参照〕により、サイズ分画させることができる。例えばAusubelの５．０．１以降に記述されているような周知の方法に従って、選択されたフラグメントを適切なクローニングベクターの形にクローニングさせることが可能である。このように得られたＤＮＡは、例えばｐＵＣ１８クローニングベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入することができる。なかんづく、クローニングベクターにサイズ選定されたフラグメントを接合させることによって生成されたキメラプラスミド又はファージを、次にＥ．ｃｏｌｉ又はその他の宿主細胞へと形質転換させることができ、これらの細胞はその後、コードされたタンパク質の発現のためスクリーニングされる。ＯｓｐＣ遺伝子を含むクローンを同定するべくライブラリをスクリーニングするためさまざまな方法を使用することができる。これらの方法には、オリゴヌクレオチドプローブのようなＯｓｐＣに対し特異的なハイブリダイゼーションプローブでのスクリーニング、又はＯｓｐＣ特異的免疫学的試薬を用いたＯｓｐＣ抗原の発現についてのスクリーニングが含まれる。例えば、この後者のスクリーニングは、抗ＯｓｐＣモノクローナル抗体、又は精製されたＯｓｐＣで免疫化された動物から調製された特異的ポリクローナル抗体を用いて、ライブラリをイムノブロットすることによって達成される。ライブラリ内にＯｓｐＣをコードするＤＮＡを含むクローンがひとたび同定されると、このＤＮＡを分離し、ＯｓｐＣタンパク質をコードする領域を完全に特徴づけし（配列決定により）、その後、このＤＮＡを用いてＯｓｐＣ活性タンパク質の生成に適したＯｓｐＣ発現ベクターを生成することができる。前述のとおり、有効な免疫原を提供するためには、組換えにより発現されたｐＣタンパク質の構造は、このタンパク質が防御抗体の生成を誘発するように、天然の（変性されていない）ＯｓｐＣの構造に充分類似していなくてはならない。このため、変性された形での発現産物の細胞内タンパク質分解及び凝集を避けるような形で、ＯｓｐＣをコードするＤＮＡを発現することが好ましい。これらの問題を避けるための１つの方法は、好ましくは培地内へ直接宿主細胞からのｐＣの分泌を提供する宿主−べクター系の中でｐＣを組換えにより生成することである。このような系の１つは、Bacillus subtilisによって提供される。Ulmanen e t al.，J．Bacteriol．162：176-82（1985）により記述されているように、バチルスプラスミドベクターｐＵＢ１１０に対してB．amyloliguefaclensα−アミラーゼシグナル配列（Young et al.，Nucleic Acid Res．11：237-49（1983）を参照）をリンケージさせることによって、B．subtilisのための適切な分泌ベクターを構築することができる。このアプローチに従うと、外来性タンパク質のためのコード配列は、プロモーター、リボソーム結合部位及びα−アミラーゼのためのシグナル配列の下流でクローニングされる。ＯｓｐＣの転写及び翻訳は、この構成体の中でα−アミラーゼプロモータ及び翻訳機構の制御下にあり、宿主細胞からのｐＣの分泌は、α−アミラーゼシグナル配列によって提供される。本発明は、原核生物ならびに真核生物において機能的である発現ベクターを含んでいる。酵母内で使用するための類似のベクターが記述されてきており、これらのベクターを用いた酵母内のＯｓｐＣの発現分泌を達成することができた。酵母複製プラスミドの中で誘発可能なプロモータに対してＯｓｐＣコード配列をリンケージすることによって、適当な発現ベクターを構築することができる。このアプローチに従うと、外来性タンパク質のコード配列は、例えばＡＯＸ−１プロモータの下流でクローニングされ、転写及び翻訳は、メタノールを培地に付加することによって誘発され得る。（完全タンパク質のコード配列に対してシグナル配列をリンケージすることにより）外来性タンパク質の細胞内発現又は分泌のいずれかが得られる。好ましい酵母菌株はPichia pastori sである。酵母特にP．pastorisの中では、発現産物の高い収量が得られた。タンパク質分解、凝集及び変性を回避する宿主ベクター系の中でＯｓｐＣを発現するためのさらにもう１つのアプローチは、ワクチニア感染を受けやすいさまざまな哺乳動物の宿主細胞内で発現することのできるベクターとしてのワクチニアウイルスの使用である。このアプローチでは、ワクチニア感染した宿主内でＯｓｐＣタンパク質を発現するのに適した翻訳及び分泌シグナルと共に、プロモータの制御下にｐＣ遺伝子が置かれている組換え型ワクチニアウイルス由来のベクターを調製することが必要となる。本書にその内容が参考として含められている米国特許第４，６０３，１１２号に記述されているように、このプラスミドは同様に、転写制御領域に対し５′のところ及び３′末端及びポリアデニル化シグナルに対し３′のところに、野生型ワクチニアゲノム内への相同組換えに導くフランキング配列を含むことになる。この種の構成体がワクチニア感染を受けた宿主細胞内に導入された場合、フランキング配列はプラスミドベクターとワクチニアウイルスの間の直接的組換えを導き、その結果、クローニングされた構造的配列（ここではＯｓｐＣをコードする）は、ワクチニアウイルスの一部となり、このワクチニアウイルスと共に増殖し、これにより発現されることになる。好ましくは、フランキング配列間の領域は同様に選択可能な標識をも含み、かくして選択培地の存在下で組換えられたワクチニアウイルス（そしてこの状況下では、ＯｓｐＣ活性ポリペプチドをコードする配列）を含むこれら細胞のみが生きのびるようになる。この方法で生成された組換え型ワクチニア菌株は、高密度発酵成長に適したＶｅｒｏ細胞又はＣＶ１細胞のような哺乳動物の細胞を感染させるために使用することができる。発酵中にこれらの細胞内で発現されたＯｓｐＣ活性タンパク質は、発酵培地内に分泌されることになり、ここから従来の方法によって精製される。天然のＯｓｐＣ及びＯｓｐＣ変異体に加えて、本発明は、ＯｓｐＣエピトープ（「ミモトープ」）と擬似する化合物（「擬似体」）を包含している。擬似体の一例としては、抗原上のエピトープに特異的に結合する抗体で、動物を免疫化することにより生成される抗体である抗−イディオタイプ抗体がある。抗−イディオタイプ抗体は第１の抗体上の組合せ部位を認識しこれに適合する。従って、その組合せ部位の形状は、第１の抗体の組合せ部位にはめ合わされるエピトープときわめて似ている。抗−イディオタイプ抗体は、もとの抗原と擬似する形をもつ組合せ部位を有することから、これを、もとの抗原と反応する抗体を生成するためのワクチンとして使用することができる。Immunology 7：269-84（1987 ）内のFineberg & Ertl，CRC Critical Reviewsを参照されたい。適切な擬似体は、どの化合物がそれに結合するかを検出するためにＯｓｐＣ抗体でスクリーニングすることによって同定できるか、或いは又、分子モデリングによって生成可能である。ANNUAL REPORTS IN MEDICINAL CHEMISTRY（医薬化学年次報告）（Aca demic Press 1988）ｐ243以降のMorgan et al．の「ペプチドレセプタ及びペプチダーゼのための非ペプチドリガンドの発見に対するアプローチ」を参照のこと。本発明のワクチンは、ライム病に対するヒトを含む罹患しやすい哺乳動物の免疫化を意図したものである。「免疫原」という語は、体液性又は細胞を媒介した免疫（ここではボレリアでの感染）を導く特異的免疫応答を喚起する抗原を意味する。従って「免疫」とは、免疫化を受けていない患者と比べたとき、より容易に感染に耐える又は感染を克服する、又は臨床的に影響を受けることなく感染を許容する、ことのできる患者の能力のことである。本発明の免疫原はさらに、受容可能な生理学的担体で構成されていてもよい。かかる担体は、当該技術分野において周知のものであり、高分子担体を内含する。哺乳動物における適切な担体の例としては、ツベルクリンＰＰＤ、ウシ血清アルブミン、オホアルブミン又はキーホールリンペットヘモシアニンがある。担体は、好ましくは非毒性で非アレルギー性でなくてはならない。免疫原はさらに、アルミニウム化合物、水及び植物又は鉱物油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、リポソーム、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、水溶性ガラス、ポリアニオン（例えばポリＡ：Ｕ、硫酸デキストラン又はレンチナン）、非毒性リポ多糖体類似体、ムラミルジペプチド及び免疫調節物質（例えばインターロイキン１及び２）又はそれらの組合せのようなアジュバントで構成されていてよい。好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムである。ＯｓｐＣ活性ポリペプチドを発現するワクチニアのようなウイルスベクター、又はSa lmonella又はMycobacteriaなどの細菌ベクターを生きた減衰させられた状態で受けた哺乳動物の体内でも、同様に免疫原性を増強させることができる。このような免疫原を処方するための技術は、当該技術分野において周知のものである。例えば本発明の免疫原は、食塩水又はその他の生理学的溶液の中でその後再水和させるように、凍結乾燥しておくことができる。いかなる場合でも、本発明のワクチンは、ワクチンの免疫原性的に有効な成分の望ましい濃度を結果としてもたらす量の賦形剤と、免疫学的に有効な量のＯｓｐＣを混合することにより調製される。ワクチン内の免疫原性的に有効な成分の量は、対象者の年令及び体重を考慮した上で、免疫化すべき動物によって、ならびにワクチン内に存在する免疫原性成分の免疫原性によって左右されることになる。ほとんどの場合において、ワクチンの免疫原性成分は、一抗原一用量につき１〜１００マイクログラムの範囲内にあり、好ましくは一抗原一用量につき１０〜５０ミリグラムの範囲内となる。本発明のさらにもう１つの態様においては、免疫原性組成物は、例１に記述されているように、ヒト疾病関連クローン及びクローナルクラスターにより発現された図１１のＯｓｐＣファミリーの各々から実質的に精製された、１つ以上のＯｓｐＣ抗原又はそのＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体で構成されている。従って、本発明は、請求の範囲第１項〜第３項に従って、図１１に示されるような現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーの１つ以上の、好ましくは２つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は図１１の現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーの各々からの１つ以上のＯｓｐＣ抗原のいずれかから成るライム病ボレリア属のＯｓｐＣ抗原の免疫原性組成物を含んでいる。上述のＯｓｐＣ抗原に代って、組合せには、防御抗体の生成を誘発するべく充分に天然のＯｓｐＣに類似した構造をもつ、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体が含まれていてもよい。図１１は、必須エピトープの配列を示す。本発明に従うと、このようなエピトープを１つ以上含むＯｓｐＣ抗原が含まれる。その結果、本発明に従ったこれらの抗原又はポリペプチドは、図１３に示されるようなエピトープ配列を少なくとも含んでいる。このエピトープ配列は、図１３のカッコ内に示されたアミノ配列と同じ位短いものであってよい。もう１つの実施態様として、本発明は同様に、図１９のＯｓｐＣファミリーの１つ以上の、好ましくは２つ以上のＯｓｐＣ抗原、或いは図１９のＯｓｐＣファミリーの各々からの１つ以上のＯｓｐＣ抗原のいずれかを含む免疫原性組成物をも含んでいる。これらの免疫原性組成物は、請求の範囲第４項〜第６項に対応する。もう１つの実施態様においては、免疫原性組成物は、特定の地理的地域内で優勢であるライム病ボレリア属菌株に対して防御するように処方されている。かくして、１つの実施態様においては、北米で最も優勢であるライム病ボレリア菌株に対して優先的に防御するワクチンが処方されている。もう１つの実施態様においては、ヨーロッパで最も優勢であるライム病ボレリア菌株用のワクチンが処方されている。第３の実施態様においては、オーストリアで最も優勢であるライム病ボレリア属菌株用のワクチンが処方されている。これらの地理的場所の各々のためのワクチン製剤が、例７に示されている。ＯｓｐＣワクチン製剤に加えて、組合せ型ＯｓｐＡ／ＯｓｐＣワクチンも考えられている。というのも、これは、 − まず第１に、ライム病ボレリア属菌株は、常にこれらの抗原のいずれか一方を発現するとは限らない可能性はあるが、ＯｓｐＡ又はＯｓｐＣのいずれか一方を常に発現するため、 − 第２に、１方の発現がダウンレギュレーション（例えば免疫応答に応えて）された場合に、もう１方の発現が増強されるようにこれら２つの抗原の相互調節が存在するということが報告されているため、 − 第３に、少なくともＯｓｐＡでのインビトロ研究において、ワクチン逃避突然変異体が発生する可能性があることが立証されているが、これは、２つの独立した抗原の中の２重突然変異事象というものがきわめて確率の低いものであることから、第２の抗原の内含によって避けることのできる問題であるため、 − 第４に、一定の与えられた抗原に対するワクチン接種を受けた者の免疫応答が均一でなく、２つの抗原の内含が、ＯｓｐＡ又はＯｓｐＣのいずれかには低い応答性しかもたない者でも、もう一方の抗原に対する防御応答を作ることによって防御されることになる確率を高めることになるため、 − 最後に、相乗効果が存在し得ること、そしてＯｓｐＡ及びＯｓｐＣを含むワクチンを用いることより強固な免疫が得られることが期待されるため、いずれかの抗原単独で処方されたワクチンよりも優れている可能性があるからである。１つの実施態様においては、ＯｓｐＣファミリー１〜２０からの１つ以上のＯｓｐＣタンパク質が、ボレリア属菌株Ｂ３１、Ｏｒｔｈ、Ｈ４及びＫＬ１１により発現されるような１つ以上のＯｓｐＡタンパク質と組合わせられることになる。もう１つの実施態様においては、米国向けの組合せ型ＯｓｐＡ／ＯｓｐＣワクチンには、菌株Ｂ３１により発現されるように、ＯｓｐＡと共にＯｓｐＣファミリー２及び３からの１つのＯｓｐＣが含まれている。もう１つの実施態様においては、ヨーロッパにおいて使用するための組合せ型ＯｓｐＡ／ＯｓｐＣワクチンには、菌株Ｂ３１、Ｏｒｔｈ、Ｈ４及びＫＬ１１により発現されるようなＯｓｐＡと合わせて、ＯｓｐＣファミリー２、４〜７、９、１０、１２、１３及び１４、１５〜１７、１９からの１４のＯｓｐＣが含まれている。オーストリア向けの組合せ型ＯｓｐＡ／ＯｓｐＣワクチンのもう１つの実施態様には、ファミリー２、４〜７、１０、１３及び１９からのＯｓｐＣが含まれている。本発明は同様に、哺乳動物におけるライムボレリオーシスの治療又は予防のためのワクチンの製造のための、上述の免疫原性組成物に含まれているような抗原の組合せの使用も含んでいる。好ましい一実施態様として、このワクチンは人間に有効である。本発明に従ったワクチンを調製するための方法は、特異的分子の同一性及び免疫学的有効性が維持され、かつ望まれない微生物学的汚染物質が導入されないように設計されている。最終産物は、無菌状態にて分配され維持される。ライム病に対して哺乳動物を免疫化する方法には、哺乳動物に対して、前述の免疫原を有効量だけ投与する。投与には、当該技術分野において周知のあらゆる方法で行いうる。例えば、適切な投与方法には、さらされることが予想される時期よりも約６ヵ月から１年前に、ライム病ボレリア属を有するダニに対してさらされることがわかっている哺乳動物に対して、上述のワクチンを投与する。本発明に従うと、適切な免疫応答を生成すると考えられうる、又はそれが証明され得るあらゆる免疫化経路を利用することができるが、非経口投与が好ましい。適当な投与形態としては、皮下、皮内又は筋肉注射又は、経口、経鼻又は直陽投与に適した調製物が含まれる。「実質的に精製された」とは、毒性成分が全く無い均質なタンパク質であり、そのため不利な反応の可能性が低くなっていることを意味している。ここでいう「均質な」という語は、タンパク質の少なくとも８０％（ｗ／ｖ）が完全にそのままのＯｓｐＣであり、残りのほぼ全てがＯｓｐＣ分解産物で占められていることを意味する。かくして、培地成分の形での不純物及びその他のボレリア属タンパク質は、あったとしても微量でしか存在しない。均質なＯｓｐＣは、１つ以上の血清学的形態のＯｓｐＣで構成され得る。このようにして、本発明は、自己抗体を誘発し、免疫化された哺乳動物の体内での有害な自己免疫反応をひき起こす可能性のある、潜在的に免疫原性の望ましくないタンパク質を除去することを可能にしている。同じように、上述の精製方法は、ワクチン生産中のロット間の再現性をも確保する。好ましい精製方法には、以下の工程が含まれる：（ａ）ライム病ボレリア属細胞の分断及び遠心分離による「膜」及び「細胞質」成分の分画、（ｂ）可溶化されたタンパク質を含む上清を得るため、そして不溶性材料をペレットとして除去するための、非変性洗剤による膜画分の抽出と、それに続く遠心分離；及び（ｃ）吸着された抗原がＮａＣｌ勾配で溶出される、イオン交換クロマトグラフィー（ジエチルアミノエチル又は「ＤＥＡＥ」）による可溶化された抗原の分画。この精製方法には、次のものによる抗原の濃縮とさらなる精製が含まれていてもよい：（ａ）緩衝液のリン酸塩含有量を増大させることにより、吸着された抗原が溶出される、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ；及び／又は（ｂ）吸着された抗原がイミダゾールで溶出される、固定化金属−アフィニティクロマトグラフィ。当該技術分野において既知のその他の溶出方法としては、ｐＨの減少による溶出、又はキレート化金属に対する親和性をもつ塩化アンモニウム、ヒスチジン又はその他の物質の濃度を増大させることによる溶出、が含まれる。細胞破壊は、小さいガラス球を入れた細胞ミル内で懸濁状態で細胞を撹拌することによって、音波処理によって、又はフレンチプレス内で、細胞を溶解させることにより達成できる。代替的には、抗原は、細胞を洗剤にさらすことにより；細胞の環境のイオン強度を変えることにより；又は温度をわずかに移行させることにより、生体の細胞表面から直接抽出することができる。代替的には、細胞から離脱した膜水疱から成る出発材料を使用することもできる。膜画分の抽出は、好ましくは優れた可溶化力をもち、変性作用をもたず、イオン交換クロマトグラフィと相容性のある洗剤を用いて達成できる。好ましい洗剤は、Calbiochem製の両性イオン洗剤３−１４であるが、上述の特徴をもつあらゆる洗剤又は有機溶剤を使用することができる。洗剤は、通常１％（ｗ／ｖ）の濃度で使用されるが０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲内の変動の程度まで有効である。洗剤の抽出は、０〜６０℃の範囲内の温度、好ましくは３７℃で行われ、１０分〜８時間、好ましくは１時間かかるはずである。尿素のようなカオトロピック剤を、可溶化プロセスを改善する目的で洗剤に加えて使用することもできる。次に、洗剤で可溶化された抗原をＤＥＡＥクロマトグラフィにより分画させる。好ましくは、ＤＥＡＥイオン交換樹脂が使用されるが、その代りに又は互いに組合せて、その他の陰イオン又は陽イオン交換樹脂を使用することもできる。本発明に従うと、イオン交換樹脂には、荷電基がカップリングされた不溶性マトリックスが含まれる。陰イオン交換基として用いられる官能基としては、アミノエチル（ＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）及び第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基がある。陽イオン交換基は、カルボキシメチル（ＣＭ）、ホスホー又はスルホプロピル（ＳＰ）基を有していてもよい。両性イオン洗剤３−１４（１％）を含むトリス緩衝液中のカラムに試料を投入し、抗原はＮａＣｌ勾配で溶出されるが、その他の方法も同様に有効である。当該技術分野において周知の方法に従って、ヒドロキシルアパタイト上に結合させることによって、抗原を濃縮させることができる。抗原をさらに濃縮させ／精製することのできる代替的な又は相補的な方法は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィによるものである。この後者の方法は、ＯｓｐＡ及びＯｓｐＢからのより優れた分離が達成されることから、ＯｓｐＣの精製のためにはヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィよりも好ましい。上述の非変性精製プロセスのもつ利点は、タンパク質の３次元コンフォーメーションが維持され、かくして防御に関与するものを含む、天然のタンパク質上に見られる全ての抗体結合部位が保たれることになる、という点にある。タンパク質が変性された場合、結合部位は部分的又は完全に破壊され、抗体を抗原部位に誘発する抗原の能力はそれ相応に減少することになる。従ってこのように変質したタンパク質は、ワクチンに使用するには望ましいものでない。さらに、本発明は、図９ａに示されるような新しいＯｓｐＣ抗原の組換え型調製物を含む。本発明は同様に、図９ａに従ったＯｓｐＣ抗原をコードする新しいＤＮＡ配列をも含んでいる。これらのＤＮＡ配列は図８ａに示されている。同様に本発明に含まれるものは、図８ａの配列のいずれに対しても少なくとも８０％の相同性を有するようなＤＮＡ配列である。本発明は同様に、原核生物又は真核生物の宿主細胞の中の組換え型発現ベクター、特に酵母、好ましくはPichia pastorisの中で有用な発現ベクターをも含んでいる。本発明の好ましい実施態様に従うと、発現ベクターはメタノールにより誘発可能である。本発明は、（ｉ）図８ａに従った配列のいずれかによってコードされるような、又は（ii）図９ａのアミノ酸配列のいずれとでも少なくとも８０％の相同性をもつような、新しいＯｓｐＣ抗原を含む。本発明は、例示的であっていかなる形であれ、本発明の範囲を制限することを意図されていない以下の例において、より詳細に説明される。例１：Borrelia burgdorferi菌株のＣＭＡＴ型決定、並びにＣＭＡＴクラスター、ＣＭＡＴファミリー、「ヒト疾病関連」クローン及びクローナルクラスターの解明を可能にする結果のクラスター分析図２にリストアップした数多くの供給源から７７の菌株（図１参照）を得た。異なる地理的起源をもち、しかもできる限り多くの異なる疫学的及び臨床的状況からの菌株がコレクションの中に含まれるように、注意を払った。次に以下の通りに全ての菌株から、膜画分を調製した：遠心分離により（７０００×ｇ、２０分、４℃）、ライム病ボレリア属細胞を集め、５mMのＭｇＣｌ₂を含むＰＢＳの中で細胞ペレットを２度洗浄し、細胞の湿潤重量を測定した。次に、Vibrogen細胞ミル（BuhlerＶ１４型）の中で混合物を振とうすることにより、洗浄した細胞を次に溶解させた。冷却（４℃）を伴う３分間の振とうサイクルを、暗視野顕微鏡で評価されるように、細胞溶解を９９％以上完了するまで繰返した。リゼイトを次に焼結ガラスフィルター上でろ過して、ガラス球を除去し、保持された球を緩衝液で洗浄して、ろ液中の細菌抗原の収量を改善した。リゼイトを２０分間７５００×ｇ、４℃で遠心分離して、膜２又は「１ｓｐ」（低速ペレット）画分と呼ばれる粗膜画分を調製した。上清をさらに３０分間１００，０００×ｇ、４℃で遠心分離して、膜１又は「ｈｓｐ」（高速ペレット）と呼ばれるさらに精製された膜画分を調製した。両方の膜固分を１００mMのトリス−ＨＣｌ緩衝液pH＝７．４の中で２回、当初の遠心分離条件を用いて洗浄した。膜２画分は、型決定を目的として使用し、一方膜１固分は抗原精製のためとっておいた。その後、Laemmli，U.K.，Nature（London）227；680-85（1970）に記述されているとおり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各菌株の膜２画分内に存在する膜タンパク質を分析した。分子量の変動を、分析で使用された膜抗原標識の全スペクトルの分子量範囲を網羅する一組の標準タンパク質の電気泳動移動度を基準にして決定した。抗原をニトロセルロースフィルターまで移送し、例えば、当該技術分野において周知のものであるイムノブロット法により、モノクローナル抗体のパネルを用いて同定する（Ausubel，et al.，分子生物学における現行の２つのプロトコール１０、８、１以降（１９９２）。周知のハイブリドーマ技術、Kohler及びMill stein，Nature 256；495-97（1975）によりモノクローナル抗体を生成させる。本発明の好ましい実施態様においては、図１に記されている菌株が分析されている。一般に、分析中に含み入れるための膜抗原の選択は、（ａ）それを検出し、細菌菌株のＳＤＳ−ＰＡＧＥ膜抗原プロフィールの中に存在する数多くのその他の抗原から、それを区別するためのモノクローナル抗体の利用可能性により；（ｂ）分析された菌株のかなりの割合のものの中に存在している問題の抗原、すなわち共通抗原により；（ｃ）それが、同じ菌株の多数の別々に調製された膜画分の中に再現可能な形で検出され得る、すなわち問題の特定の抗原についての菌株内変動に関しては全く証拠が無いという事実により；（ｄ）多数の培養及び継代の後及び長時間（最高２年）にわたる保管の後に、抗原標識が同じ分離株の中で安定した形で発現されるという事実により；そして（ｅ）標識をコードする遺伝子が染色体外で受け継がれる、又は抗原の変動が菌株内変動を導きうる特異的抗原変動メカニズムに基づいていた、という公表された科学文献による証拠が欠如していることにより、支配される。図３は、分析に使用される９つの共通膜抗原（Ｅ９０、Ｅ６０、Ｅ５９、Ｅ４３、Ｆ１ａ、Ｅ２９、Ｅ２２抗原、Ｅ１８＋Ｅ２０組合せ抗原及びＥ１０抗原）を同定するのに用いられるモノクローナル抗体を示している。抗原は、分子量の上昇順に評点（スコア）され、１つ以上のモノクローナル抗体が存在する場合には、これらのモノクローナル抗体と抗原との反応パターンに従って、それらのわずかに異なる反応性（例えばＥ６０とＥ４３）によって評点される。図４は、９ケタの数で表わされている分析された菌株について見い出された、９つのスコアのユニークな組合せを全てリストアップしている。このとき、この９ケタの数は、その菌株の共通膜抗原型（ＣＭＡＴ）と呼称される。次に、観察された全てのＣＭＡＴの間の関係を打ち立てるため、クラスター分析を行った。これは、各抗原の遺伝子多様性を決定し、全てのユニークなＣＭＡＴのデータから計算された重みづけされていない不同性マトリックスを樹立することによって行われた。個々の共通抗原スコアが無い場合は、それが欠如したデータであるかのごとく処理された。その後、形成されたマトリックスを、ＣＳＳ（Statistica Stat-Soft）ソフトウエアを実行するＩＢＭコンパチブルパーソナルコンピュータ上で、算術平均（前出のSreath及びSokal）を用いた加重対グループ法により、リンケージを伴うクラスター分析に付した。クラスター分析の結果得られた樹状図は、図５に示されている。全般的に、樹状図は、ライム病ボレリア属個体群が実にうまく構造化されていることを示している。クラスター化段階の各々が起こる固有値をプロットすることにより、細菌をカテゴリーへと分離すべき最も適切なレベルを選択することが可能である。分割を行うのに最も理想的な位置は、連続するクラスター化段階についての固有値に主要な飛越しが存在する曲線内の地点にて出現する。図５の樹状図に示されている通り、これは、ＣＭＡＴスコアに６８％から８８％の間の差異が存在するレベルで起こる。この分割は、個体群をＣＭＡＴグループと呼ぶ４つの主要なグループに分ける。連続するクラスター化についての固有値における第２の主要な飛越しは、ＣＭＡＴスコア間の４０％と５２％の差の間で起こる。この分離は、各々のＣＭＡＴグループを、個々のＣＭＡＴの２つから３つのクラスターに分ける。便宜上、ＣＭＡＴグループ化が起こるレベルとしてスコア間の８０％の差異がとられ、ＣＭＡＴクラスター化が起こるレベルとしてスコアの５０％差がとられた。前述のことから、B．burgdorferiの個体群を、各々２つから３つのＣＭＡＴクラスターから成る４つの主要なＣＭＡＴグループに分けることができるということは明白である。各々のＣＭＡＴクラスタ自体は１〜５個の個別のＣＭＡＴで構成されていた。その他の個体群構造分析の分類学的研究（Marconi & Garon，J． Bacteriol，174；241-44（1992）；Boerlin et al.，Infect，Immun．60；1677- 83（1992）Baranton et al.，Int．J．Syst．Bacteriol，42；378-383，（1992 ））の結果と、これらの結果を比較すると、ＣＭＡＴグループＩが遺伝種Borrelia bugdorferi sensu strictoに対応し、ＣＭＡＴグループ３が「グループＶ２４６１」としても知られているBorrelia afz eliiと等価であり、ＣＭＡＴグループ２及び４がB．garinii sp．nov．に対応していることがわかる。ＣＭＡＴ分析が何故B．garinii遺伝種を２つのＣＭＡＴグループに分割したかの理由は明らかでないが、例えば多遺伝子座アイソエンザイム電気泳動研究（Baerlin et al.，Infect，Immun，60；1677-83（1992））の場合よりも少ない標識が使用されたという事実によるものであるかもしれない。各ＣＭＡＴ内の特定の菌株の出現を見てみると（図５）、７つのＣＭＡＴが１つ以上の代表を有し、かくしてクローンすなわち共通の祖先をもつ菌株とみなすことができるものであるということは明らかである。実際、全ての菌株のうち６７％が３つの全く異なるＣＭＡＴクローンの中に丁度入った。例えば、ＣＭＡＴ４（クローン１：２：４）は１２の菌株を含み、ＣＭＡＴ１３（クローン３：２：１３）は２３の菌株を含み、ＣＭＡＴ１８（クローン４：２：１８）は１５の菌株を含んでいた。特に、分析されたヒト分離株の７６％（４１のうちの３１）がこれら３つの主要なクローンの間で分配されていることがわかった。その上、ＣＭＡＴ１７、１８、２０及び２２を一括して関係するクローナルクラスターの一部分とみなした場合、全てはＣＭＡＴクラスター４．２に属し、そのときヒト疾病関連は８７％にまで至る。ヒト疾病とのこの強い関連性のため、これらを、「ヒト疾病関連」（ＨＤＡ）クローン又はクローナルクラスター（上の定義を参照）とみなすことができる。さらに、これら３つの主要クローンの間で見られる分離株の型を見たところ、例えばＣＭＡＴ１３が慢性皮膚症候群ＡＣＡ（５菌株）と関連するものと思われること、そして一般にこのクローンが皮膚の症候群と結びつけられること（１９のうち１７）が明らかとなる。これとは対照的に、その他２つのＨＤＡクローンは、伝播性疾患においてより優勢であると思われる。すなわち、これらは、神経ボレリオーシス又はライム関節炎を患う患者からの血液又はＣＳＦから分離されている。ＣＭＡＴクラスター４．２（すなわちＣＭＡＴ１７、１８、２０及び２２）の場合、疫学データは、神経ボレリオーシスとの強い関連性を示唆していると思われる。１０個のヒト分離株のうち、６個はＣＳＦ材料又は神経ボレリオーシス患者から分離され、４つは、同じく神経ボレリオーシスと関連づけることのできる急性疾患と通常結びつけられる症候群であるＥＣＭをもつ患者から分離された。ヒト分離株のうちの２つが血液から分離され、３つがＣＳＦからそして１つがＥＭをもつ患者から分離されたものであることから、ＣＭＡＴ４菌株の症候群関連性はそれほど極めて明快なものではない。さまざまな菌株に関する疫学データをさらに分析すると、３つの主要なクローン又はクローナルクラスターが弁別的な地理的分布を有すること、そしてこの特徴が、今度はこれらの地域内で観察されたライム病の一次症候群の一般的差異と相関関係をもつことが明らかになる。例えば、ＣＭＡＴ４は、世界の中でも関節性症候群が支配的な地域である北米において最も支配的なＣＭＡＴである。ＣＭＡＴ１３及びＣＭＡＴ１８は、北中央ヨーロッパにおいて支配的に見られ、ここでは神経症候群及び慢性皮膚症候群が支配的である。３つの主要なクローンのうち、ＣＭＡＴ４のみが北米及びヨーロッパ（フランス、オーストリア及びロシア）の両方において発見され、この両方の大陸で広く分布している。興味深いことに、中央ヨーロッパの地域特にライム病が固有のものであるオーストリア及びスイスにおいては、３つの主要なヒト疾病関連クローンの全てが共存している。ヒト疾病が、ＣＭＡＴグループ１（Borrelia bugdorferi sensu stricto）中のわずか１つのクローン（ＣＭＡＴ４）、及びＣＭＡＴグループ３（Borrelia a fzelii）の１つのクローン（ＣＭＡＴ１８）、及びＣＭＡＴグループ４（B．gar iniisp．nov．）のクローナルクラスター（ＣＭＡＴクラスター４．２）、によって卓越してひき起こされるという認識により、我々は本発明に従って、これらに対して特異的な防御を行うＯｓｐＣワクチンや組合せ型ＯｓｐＣ／ＯｓｐＡワクチンのようなワクチンを設計する目的で、これらのクローン／クローナルクラスターに焦点をあてることが可能となる。このときこのワクチンは、これらのクローンが極めて優勢である地理的地域の中で使用することができるだろう。その上、異なるクローンに結びつけられた異なる臨床的症候群のため、我々は、これらのクローンに対するワクチンをターゲティングし、ひいては実際に特定の症候群に対して防御するためのワクチンを設計することができるのである。例２：ライム病ボレリア属のＯｓｐＣ抗原の血清学的変動を分析するためのＯｓｐＣ血液型亜型の型決定スキーマの開発。抗−ＯｓｐＣ抗体の調製２５のモノクローナル抗体のパネルを、（ａ）（１）オーストリア産菌株Ｏｒｔｈ（ＢＢＭ３４−３９）；（２）ドイツ産菌株ＰＫＯ（ＢＢＭ４２−４５）；（３）チェコスロバキア産菌株Ｅ６１（ＢＢＭ４６、４７及び４９）及び（４）ＫＬ１０（ＢＢＭ４０−４１）から誘導された４つの精製ＯｓｐＣタンパク質；（ｂ）オーストリア産菌株Ｗ（ＢＢＭ２２、２４、２５、２７、２８及び２９）から誘導された抗原のＯｓｐＣタンパク質で富化されたカクテル；及び（ｃ）チェコ菌株Ｍ５７（ＢＢＭ７５−７７）の膜２画分に対して産生させた。それぞれＢＢＭ２２、２４、２５、２７−２９及びＢＢＭ７５−７７の場合に、菌株Ｗ又はＭ５７の膜画分に対するサーフブロット分析により、又その他のものの場合には、適切な精製タンパク質に対するラインブロット分析により、さまざまなモノクローナル抗体の抗−ＯｓｐＣタンパク質の特異性を確認した。膜ＥＬＩＳＡ法ＯｓｐＣタンパク質の血清型決定は、標準的膜ＥＬＩＳＡ技術を用いて行われた。例１に記述されているように調製された全ての菌株の膜２画分を、マイクロタイタープレートの個々のウエル内に分配したpH７．４のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で０．１mg/mlになるまで希釈した。プレートを一晩３７℃で完全に乾燥した。使用に先立ち、プレートをＰＢＳ中で２度洗浄し、次に各ウエルに１％のヒトアルブミンを含むＰＢＳ中の希釈抗体溶液５０mlを付加し、プレートを３７ ℃で１時間インキュベートした。抗マウスＩｇＧアルカリ性リン酸塩接合抗体を付加する前に、プレートを４回洗浄した。プレートをさらにもう１時間３７℃でインキュベートしてから、結合した抗体の量を見積るため、基質付加に先立ち４回洗浄した。当初、どのモノクローナル抗体が血清型決定を目的として最も適切であるかを見るため、２５のモロクローナル抗体全てに対して、全ての菌株を試験した。均一の陽性及び陰性試験基準を設定するための試みがなされたが、異なる菌株内のＯｓｐＣ抗原の大幅に異なる発現レベルのためにこれが不可能であることが明らかとなった。この問題を克服するため、膜２固分をウエスタンブロット法で分析し、ニトロセルロースに移送し、Aurogoldを用いて染色した。２２〜２８kdの分子量範囲内の主要なタンパク質の不在によって判断されるように、ＯｓｐＣタンパク質を全く又は少量しか発現しなかった菌株（全部で１５菌株）を、研究からとり除いた。これにもかかわらず、一定数のケースにおいて（例えばＢＢＭ２８、２９、３７、４３及び４５を用いた場合）、陽性及び陰性の結果の間には直ちに観察できる区別はなお全く無く、従って、これらのモノクローナル抗体は、型決定の目的には不適切であるとみなされた。これらの抗体は全て共通のエピトープを認識し、従って、いずれにせよ差別的価値はほとんどない。初期分析の菌株被度データに基づくと、一定数のモノクローナル抗体が、例えばＢＢＭ２４、２５及び２７、ＢＢＭ３８及び３９及びＢＢＭ７５、７６及び７７のように類似のエピトープを認知することもわかっており、従って各グループからわずか１つのみ（それぞれＢＢＭ２４、ＢＢＭ３９及びＢＢＭ７７）が最終的血液型亜型型決定スキーマにおいて使用された。これらの菌株及びモノクローナル抗体を除去することにより、このとき、陰性菌株のバックグラウンドレベルよりも得られた光学密度値がはるかに（３倍）高いものとして陽性反応の基準を設定することが可能であった。実際上、このことは、陽性結果が０．６よりも大きい光学密度（ＯＤ）値を有していることを意味していた。全ての陽性反応は同様に、同じ膜調製物のウエスタンブロット分析によっても認識された。ウエスタンブロット分析の結果として、ＢＢＭ４８が約６０キロダルトンのタンパク質と強く交差反応し、ＥＬＩＳＡ分析において数多くの偽陽性結果を発生させることが発見された。かくして、ＢＢＭ４８も血液型亜型分析から削除された。その結果、初期の２１の利用可能な抗ＯｓｐＣ抗体のうちのわずか１３だけを用いて、血液型亜型分析は幾分か簡略化された。次に、１３のモノクローナル抗体の完全なパネルを用いた各菌株の反応パターンを対照調査し、各々のユニークなパターンを１つの「血液型亜型」として呼称した（図６参照）。究極的に分析された６２の菌株のコレクションの中で、１６のユニークな血液型亜型が観察され、かくしてこの膜タンパク質により表示された血清学的不均一性の高いレベルが実証された。個々の血液型亜型の間で観察された陽性反応の数は１〜７の範囲内にあった。各々の菌株について見い出された血液型亜型の完全なリストが図１２に示されている。これを見ればわかるように、１２の菌株（分析された菌株の１９％）は、１３のモノクローナル抗体のパネルのいずれとも反応せず（「ＮＲ」反応無しと示されている）、型決定不可能とみなされた。発現が無いか又は低レベルであったために削除された菌株（１５菌株）と合わせて考慮した場合、合計で利用可能な菌株のうちの２２％が型決定できなかった。無条件に型決定できた菌株の７８％の間の血液型亜型の出現頻度は、大幅に変動した。１０個の菌株が最も一般的な血液型亜型である２であったのに対して、血液型亜型６、８及び９の代表はただ１つしかなかった。ＯｓｐＣタンパク質のファミリー及び遺伝子型とその血液型亜型の間には強い相関関係があった。実際大部分のケースにおいて、例えばファミリー１、２、４、５、７、９、１０、１４及び１５について１対１の関係が存在すると思われた。ファミリー３、１２、１３、１７、１８及び１９は、試験されなかったか又は現在利用できるモノクローナル抗体を用いて型決定できなかったかのいずれかである。ファミリー６、８及び１１は、２つ又は３つの血液型亜型に血清学的にさらに細分できたが、このファミリーの遺伝子型も幾分かの多様性を示したということも特記しておくのが有利である。２つ以上のファミリー（ファミリー１６及び２０）の中で１つの血液型亜型（血液型亜型１６）が観察された。これは、この血液型亜型にはわずか２つの陽性反応しかなく、従って一般的モノクローナル抗体は２つのファミリーを弁別できなかったことから、起こり得たことである。例３：ＯｓｐＣ不均一性の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析。菌株ＯｒｔｈからのＯｓｐＣ遺伝子をクローニングし、前述のとおりに（米国特許第０７／９０３．５８０号）ヌクレオチド配列を決定した。菌株ＯｒｔｈからのＯｓｐＣ遺伝子の近位（コーディングストランドATG AAAAAGAATACATTAAGTGC，開始コドンに下線）及び遠位（非コーディングストランド、TAATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG，停止コドンに下線）末端を次に、我々の培養コレクション中の７７の菌株からのＯｓｐＣ遺伝子を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（例４参照）の中で使用した。米国からの１４の菌株を含め、試験された全ての菌株が予測されたサイズ（６２７〜６４２ｂｐ）のＰＣＲフラグメントを生成し、このことはすなわち、プラスミドでコード化されたＯｓｐＣ遺伝子が安定した形で維持されるだけでなく、以前に仮定されたよりもはるかに優勢であること表わしていた。インビトロで成長せしめられた培養中に、ＯｓｐＣ抗原を検出できなかったことはＯｓｐＣ遺伝子が不在であったためではなく、むしろ発現される抗原が無いか又は低レベルであったためであると思われる。異なる菌株からのＯｓｐＣ遺伝子の間の多型は、制限酵素Ｄｐｎ１１、Ｄｄｅ１及びＤｒａ１でのＰＣＲ増幅を受けたＯｓｐＣ遺伝子（上述のとおりに調製されたもの）の消化の後に得られた制限フラグメントパターンの分析によって、決定された。８２の菌株からのデータ（すなわち、我々の培養コレクション中の７７全ての菌株からのデータと５つの公表されたＯｓｐＣ配列から演鐸された情報：図１参照）の分析により、３５の全く異なるＲＦＬＲＯｓｐＣ型の存在が明らかになった。標準的な方法を用いて実験的に決定されたフラグメントの数及びサイズは、多くの例において配列決定により確認された。すなわち、ＲＦＬＰ型１〜２３の少なくとも１つの代表について、型２４は、Padula et alの配列データに基づいている。各々のＲＦＬＰ型と結びつけられたＲＦＬＰパターンは、図７に示されている。利用可能である場合、配列情報から演鐸されたフラグメントサイズは、測定値よりも優先的に示された（ＲＦＬＰ型１〜２４）。分析された各菌株についてのＲＦＬＰ−型の完全なリストは、図１２に示されている。例４：ＯｓｐＣ遺伝子の異なる対立遺伝子のＰＣＲ増幅及びヌクレオチド配列決定及び演鐸されたアミノ酸配列のクラスター分析例１及び２に記述され図１２に要約されている通り、ボレリア属菌株をＯｓｐＣ血液型亜型及びＯｓｐＣＲＦＬＰ型に分類することが可能であった。ＯｓｐＣＲＦＬＰ型１〜１７及び１９〜２３を代表する菌株が選択され、ポリメラーゼ連鎖反応によりＯｓｐＣ遺伝子を増幅させ、ヌクレオチド配列及び演鐸されたアミノ酸配列を決定した。いくつかのケースにおいて、密に関係するＯｓｐＣタンパク質の間の関係を、型決定システムの有効性についてのさらなるチェックとして、及びＯｓｐＣ型内のさらなる未検出の不均一性に関してチェックする目的で、調査した。合計２７のＯｓｐＣ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、以下に記述する通り配列決定した。ＯｓｐＣタンパク質をＯｓｐＣファミリーに分類するため、配列情報を使用した。材料と方法凍結したボレリア属保存細胞懸濁液を解凍し、２μｌ（５×１０⁶−１×１０⁸ 個/ml）を、Heraeus Biofuge A microfugeの中で最高速度で５分間遠心分離した。細胞ペレットを１０μｌの１× ＴＡＱ−緩衝液（Boehringer Mannheim）に再懸濁させ、５０μｌの鉱油（Pharm acia）を重ねて入れ、次に８分間沸とう水浴の中でインキュベートし、直ちに氷上に置いた。細胞−リゼイトに対して、９０μｌの試薬混合物〔９μｌの１０× Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、Boehringer Mannheim；２μｌの１０mMのｄＮＴＰ溶液、Boehringer Mannheim；５μｌのプライマー１（ATGAAAAAGAATACATTAAGTGC G）、１０mMのストック；５μｌのプライマー２（ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG）、１０mMのストック；０．５μｌの５，０００U/mlＴａｑボリメラーゼ、Boehri nger Mannheim；及び６８．５μｌの水］を付加した。ＬＫＢ Thermocyclerの中でＤＮＡ増幅を行った（３６秒間９５℃、６０秒間５３℃、８４秒間７０℃、３０サイクル）。トリス−アセテート緩衝液（４０mMトリスアセテート、２mMのＥＤＴＡ、pH８．０）中の１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル上で５μｌの産物を分析し、臭化エチジウムでの染色及び紫外線下での視覚化により増幅を監視した。増幅された産物をSpin Bindマイクロ遠心分離カートリッジ（ＦＭＣ）を用いて濃縮した。次にＤＮＡを３０μｌのＨ₂Ｏの中で収集し、上述のとおりアガロースゲル上に精製産物を２μｌ走らせることによって回収を監視した。フルオレセインで標識づけされたプライマ5′-ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG-3′及び5′-ATTA AGGTTTTTTTGGAGTTTCTG-3′でAuto Cycle配列決定キット（Pharmacia）を用いてＬＫＢ Thermocycler上で配列決定するため（３６秒９５℃、３０秒５３℃、８０秒７０℃で２５サイクル）、増幅されたＤＮＡフラグメント（２〜７μｌ）を調製した。メーカーにより規定されている通り、自動レーザー螢光〔ＡＬＦ〕配列決定装置（Pharmacia ＬＫＢ）を用いて、６％のポリアクリルアミド配列決定ゲル上で、試料を電気泳動させた。ＡＬＦからのヌクレオチド配列データファイルを、ソフトウエアパッケージＤＮＡＳＩＳ及びＰＲＯＳＩＳ（Pharmaci a-ＬＫＢ）での演鐸されたタンパク質配列を用いて対照調査し分析した。ライム病スピロヘータの２４の異なる菌株からのＯｓｐＣタンパク質についてのアミノ酸配列（すなわちこの研究からの２２の配列と菌株２５９１及びＰＢＩについての２つの公表された配列）を、Wilbur及びLipman，PNAS USA 80；726-3 0（1983）の高速／概略方法によって整列させ、前出のSneath及びSokalのＵＰＧＭＡ方法（クラスター分析の１形態）により樹状図を構築するために、かくして生成された類似性スコアを使用した。これらの分析は、ソフトウエアパッケージ Clustal V （Higgins及びSharp，CABIOS 5；151-53（1989）；Higgins et al.， CABIOS（1991）を用いて行った。結果と論述２４の異なるＲＦＬＰ型を代表する２４の菌株からのＯｓｐＣ遺伝子及びタンパク質についての整列されたヌクレオチド配列、及び演鐸された部分的アミノ酸配列が、図８及び９に示されている。ＯｓｐＣタンパク質内の第１のシステイン残基（Ｏｒｔｈ配列内のアミノ酸１９）に先行するアミノ酸は、リーダー配列であり、完全タンパク質の中に存在しない（配列ＦＩＳＣは推定上のシグナルペプチダーゼ分割部位である）ことから、これらは配列比較に含み入れられなかった。タンパク質のカルボキシ末端端部において、最後の１６のアミノ酸は除外された。これには、（最後の７個のアミノ酸と等価である）プライマー２の結合部位に対応する領域、そして次に、最初の配列が得られるまでのさらに９つのアミノ酸の間隙が含まれている。ＯｓｐＣ遺伝子のこの末端部分は、保存度が高く、プライマー２を用いて試験された全ての菌株からのＯｓｐＣ遺伝子を増幅し、配列決定する能力によって示される通り、ＯｓｐＣタンパク質の間で観察される多様性を生み出す上でさほど重要なものではないと思われる。その上、このＯｓｐＣ領域に結合するモノクローナル抗体は、幅広い反応性をもつ（例えば図１３及び１４中のＢＢＭ２９、４２及び４５）。ＯｓｐＣ配列は、きわめて可変的であり、最も遠い関係のあるアミノ酸配列（ B．burgdorferi菌株２９７及びB．garinii菌株ＩＤ９０）は、わずか５９％のアミノ酸配列の同一性（８０％の類似性）しか示さない。しかしながら、同じＲＦＬＰ型のメンバーの間ではいかなる配列差も検出されず、このことはすなわち、この型決定方法がきわめて精確にＯｓｐＣ遺伝子間の不均一性を表示しているということを示している（すなわち、ＲＦＬＰ型１菌株ＶＳ２１５、ＶＳ２１９及びＤＫ７に対するＯｓｐＣ配列は、ＺＳ７のものと同一である；ＲＦＬＰ型２菌株ＩＰ２と２６８１６は、Ｂ３１と同一である；ＲＦＬＰ型６菌株Ｈ１５とＡＣＡ１は、同じである；ＲＦＬＰ型７菌株ＰＫＯとＤＫ２６は、ＪＳＢと同一である；ＲＦＬＰ型１０菌株Ｈ４とＷは、同じである；ＲＦＬＰ型１３菌株８７１１０４とＫＬ１１は、同一である；ＲＦＬＰ型１４菌株２００４７とＶＳ１８５は、同じである）。クラスター分析により決定された部分的ＯｓｐＣアミノ酸配列の間の関係性の度合は、図１０に樹状図として示されている。同じ種の菌株からのＯｓｐＣタンパク質は、異なる種からのＯｓｐＣタンパク質に対してよりも互いに対してより密に関係している。それでも、１つの種の中でさえ、著しい可変性は明らかである。ＯｓｐＣ配列の多様性は、系統樹のこの部分の内部に観察されるより深い分岐、そしてより多数のＯｓｐＣ変異体が、他の２つのボレリア種よりもＢ．gariniiと関連していることによって示されるように、B．garinii菌株の間で特に高いものである。ＯｓｐＣ遺伝形質のクローナル構造は、異なるライム病ボレリア属の間で、プラスミドでコードされるＯｓｐＣの水平トランスファ、又は遺伝子内組換えのいずれによっても、遺伝子材料の著しい交換が全くなかったことを示唆している。ＯｓｐＣタンパク質は、ＯｓｐＣファミリーに割当てられてきており、ここでＯｓｐＣファミリーは、完全ＯｓｐＣタンパク質の最初の９２％にわたって８０％以上のアミノ酸配列同一性をもつ、すなわち１８ａａリーダー配列と最後の１６ａａについての情報を除いた同一性をもつＯｓｐＣタンパク質の１グループとして定義づけされる。図１には１８の異なるＯｓｐＣファミリーが描かれているが、樹状図の中に内含されなかった菌株Ｈ１３及び２８６９１からのＯｓｐＣタンパク質について、不完全な配列情報からさらに２つのＯｓｐＣファミリー（１９及び２０）が同定された。ＯｓｐＣタンパク質の間の多大な多様性にもかかわらず、完全ＯｓｐＣタンパク質の最初の３分の１は保存され（図１０）、同じ種の菌株はこの領域内で約８０〜９０％の配列同一性を示している。しかしながら、異なる種からのＯｓｐＣタンパク質の間の配列の同一性は、ＯｓｐＣタンパク質のアミノ末端端部における種特異的配列モチーフの存在のため、タンパク質のこの部分においてさほど高くない。上述のように、示されていないＯｓｐＣのカルボキシ末端部分も同じく見かけ上保存度がきわめて高い。介在部分（すなわちアミノ酸残基ＫＫＩ及びＮＳの間の図９の下部の２つのブロック）は非常に可変的であり、ＯｓｐＣと関連する主要な多様性源である。血清型特異的エピトープがこの可変領域内にくることが予想される。Hopp及びWoodsの方法により個々のタンパク質配列の親水性プロフィールを分析することによって、エピトープの存在を強く予告するものである最高の親水性ピークがこの領域内にあることがわかった。より特定的に言うと、この領域内のＯｓｐＣ配列の間の高い可変性にもかかわらず、推定上のエピトープは不変的に完全タンパク質のアミノ酸残基１２０〜１５５の間にある。０ｒｔｈ菌株のＯｓｐＣ内では、１つのエピトープをも表わすことになるパラメータである、予告されたβターン及び高い柔軟性の領域である残基１３６〜１４１（ＤＮＤＳＫＥ）で、親水性ピークが出現する（ＰＣ／ＧＥＮＥを用いて行われた分析）。例５：抗−ＯｓｐＣモノクローナルのエピトープマッピング抗−ＯｓｐＣモノクローナル抗体のいくつかのエピトープを、Geysen et el. ，J．Immunol，Methods 102；259-74（1987）により記述されている、ピン技術方法、又はメーカーにより記述されているビオチニル化ペプチドＥＬＩＳＡ、又はドットブロット方法のいずれかを用いる、Cambridge Research Biochemicals Ltd.， Gradbrook Park，Northwich，Cheshire，Englandからの市販のカスタム指定エピトープ走査キットを用いて、マッピングした。試験された２０２６カスタム合成ペプチドは、図９に示されているＯｓｐＣタンパク質の一段の重複する１０mers であった。菌株Ｏｒｔｈ、ＰＫＯ、及びＢ３１のＯｓｐＣタンパク質のＣ末端端部、及び菌株Ｏｒｔｈのシグナルペプチド配列の重複ペプチドも同様に分析に含み入れられた。モノクローナル抗体と反応する連続的ペプチドの組合せ配列は、「完全ペプチド配列」として記述される。図１３は、エピトープを識別することのできたモノクローナル抗体の完全エピトープ配列をリストアップしている。カッコ〔〕内に囲まれた配列には、全ての反応するペプチドに共通のアミノ酸が含まれており、従ってこれはエピトープの重要な部分を形成する。一般化されたＯｓｐＣタンパク質内の各々の完全配列の場所は、図１４に示されている。しかしながら、例えば数多くのエピトープを識別できた１つの例においては、一次エピトープすなわち最も反応性の高いエピトープについてのものだけが与えられ（図１３）、図示されている（図１４）。１つ以上のＯｓｐＣタンパク質内の類似の領域に対応するペプチドと、モノクローナルが反応したケースにおいては、Ｏｒｔｈ菌株に関するものだけが与えられている。換言すると、モノクローナル抗体がＯｒｔｈタンパク質（例えばＢＢＭ４３）と反応しない場合、与えられる反応配列は、相同菌株（ＰＫＯ）についてのものである。図１３の下には、図の上部に示されているそれらが認識するエピトープの出現頻度に基づいて、モノクローナル抗体がカテゴリーに分類されている。これを見ればわかるように、これらのうちの半分以上は、それらが分析された菌株のうちの１０未満のものの中で出現するという点において、きわめて特異的なエピトープを認識する。モノクローナル抗体のうちの５つは、中間出現頻度のエピトープを認識し、一方残りの７つは、分析された７７の菌株のうちの２５以上の中で出現することから、共通エピトープを認識するとみなすことができる。血液型亜型分析に適していることがわかったモノクローナル抗体は、図１３の中で星印によって表わされている。興味深いことに、無条件にマッピングできた中間出現頻度のエピトープ（ＢＢＭ２２、３５及び４０）、又は共通エピトープ（ＢＢＭ２８、２９、３４、３７、４２、４３及び４５）を認識するのは、主としてモノクローナル抗体であった。実際、型特異的であると見なされ得た（ＢＢＭ３８、２９及び４４）、すなわち１０未満の菌株と反応する３つのモノクローナル抗体のみがマッピングできた。ＢＢＭ３８及び３９は両方とも同じ菌株反応パターンを有し、同じ領域（アミノ酸１５５及び１７０）に対してマッピングした。Ｏｒｔｈタンパク質のアミノ酸配列の親水性プロットに基づくと、親水性ピークと予想されたβターンはこの領域と一致しており、これらは１つのエピトープを高レベルで表わすパラメータである。ＢＢＭ４４のエピトープは、同様に著しく変動する部域であるアミノ酸７９〜９０の間にある。残念なことに、その他の型特異的モノクローナル抗体のエピトープのいずれもマッピングされ得ず、このことはすなわち、これらが分子の確認に依存していることを示唆している。しかしながら、３つの型特異的抗体は全て、タンパク質のうち最も可変的なものの間にある領域に対しマッピングすることから、それが同じくその他の型特異的エピトープ内でも関与する可能性がきわめて高い。興味深いことに、高い頻度のエピトープと反応するＢＢＭ２８は同様に、ＢＢＭ３８及び３９と同じ領域に対してマッピングする。その理由はわかっていないが、このあいまいさをもたらす結合部位で関与する実際のアミノ酸及び数におけるわずかな差異が存在するのかもしれない。共通エピトープと反応する抗体のうちの４つ（ＢＢＭ２９、４２、４３及び４５）は、タンパク質の遠位Ｃ末端端部（アミノ酸２００〜２１２）でマッピングするのに対して、その他の２つは、保存度が高いことが示されていた領域であるタンパク質のＮ末端端部近く（アミノ酸４１〜６７）で反応する。中間出現頻度をもつエピトープを認識するモノクローナル抗体は、分子の半分保存された領域（アミノ酸１０３〜１１４及びアミノ酸１７６〜１９６）の内部でマッピングした。これらの結果は同様に、ＯｓｐＣタンパク質の１６の血液型亜型変異体の各々を発現する菌株の膜２固分に対し特異的である、多価のウサギ血清がＯｒｔｈタンパク質の２０３の重複ペプチドに対してスクリーニングされたもう１つの実験においても確認された。全ての共通の交叉反応エピトープは、上述の保存された及び半分保存された領域の中に見られた。興味深いことに、ＣＭＡＴグループ１の菌株（B．burgdorferi sensu stricto）からの血清は、ＣＭＡＴグループ３（ B．afzelii）及び４（B．garinii）の菌株からの血清ほど頻繁には交叉反応しなかった。例６：アレチネズミにおける交差防御の研究異なるＯｓｐＣファミリーの間での交差防御が可能であったか否かを確かめるため、B．burgdorferi菌株ＺＳ７（ＯｓｐＣファミリー１）、B．afzelii菌株ＰＫ０（ＯｓｐＣファミリー７）及びB．garinii菌株Ｗ（ＯｓｐＣファミリー１０）からＯｓｐＣタンパク質を精製し、B．afzelii菌株Ｏｒｔｈ（ＯｓｐＣファミリー５）での抗原投与に対するライムボレリオーシスのアレチネズミモデル内の免疫原としてこれを用いた。１つのファミリーの中での防御をテストするため、菌株Ｏｒｔｈに対する免疫原として、菌株Ｈ７からのＯｓｐＣ（ＯｓｐＣファミリー５）を用いた。菌株Ｈ７からのＯｓｐＣは菌株ＯｒｔｈからのＯｓｐＣと同じ血液型亜型及びＲＦＬＰ型に属している。アレチネズミには、Titer Max♯Ｒ−１（CytRx）をアジュバントして、すなわち合成免疫調節物質（共重合体ＣＲＬ８９−４１）を伴う油中水型（スクアレン）エマルジョンとして調製された、精製ＯｓｐＣ（２０μｇのタンパク質／２００μｌ）の一回の皮下免疫化か、又は水酸化アルミニウムをアジュバントとした２回の腹腔内ＯｓｐＣ注射（１０μｇのタンパク質／５００μｌ）のいずれかが与えられた。精製抗原は、以前に参考としてその内容が内含された米国特許出願第０７／９０３５８０号の中で記述された方法によって、菌株から調製された。最初の免疫化から３．５週後に、血液試料を目から採取し、抗原投与の時点での免疫原に対する抗体の応答が確認されうるように、血漿を調製した（免疫化を受けていない対照動物も同様に処理した）。最初の免疫化から４週間後に、免疫化を受けていない対照動物のグループと同様に、菌株Ｏｒｔｈの細胞１０⁴個（２５〜１００ＩＤ₅₀）を用いて動物に腹腔内抗原投与した。抗原投与懸濁液を同様に、免疫化されていないアレチネズミにおいても滴定し、５０％の動物を感染させるのに必要とされる用量を決定した。さらに２週間後、１０⁴の用量で抗原投与を受けた動物を殺し、ＢＳＫ培地内で膀胱、心臓、腎臓及び脾臓を培養した。接腫後２〜６週目から一週毎に、暗視野顕微鏡でスピロヘータについて培養を検査した。同様に血液も採取し、結果として得られた血漿を血清転換すなわち免疫原以外の菌株Ｏｒｔｈからの抗原に対する抗原投与後の抗体の発生について、ウエスタンブロット法により分析した。どの動物が感染を受けたかを確かめるために使用された培養試験と血清学的試験の間には、優れた一致が見られた。ＩＤ（５０）の決定のためには、血清学的試験のみが使用されたが、この場合、動物は抗原投与から３週間後に放血され、感染を受けたアレチネズミにおける抗体応答が容易に検出できるほど充分強いものとなっていることを確実にする余分の時間が与えられていた。種間の交差防御の兆しは全くなかった。すなわち、抗原投与菌株Ｏｒｔｈ（B ．afzelii）に対する免疫原として、ＯｓｐＣファミリー１（B．burgdorferi）及び１０（B．garinii）からのＯｓｐＣタンパク質は有効でなかった。同様に、同じ種の異なるＯｓｐＣファミリーの間の交差防御の兆しも全くなかった。すなわち、ＯｓｐＣファミリー５からのＯｓｐＣタンパク質を発現する菌株Ｏｒｔｈでの抗原投与に対する免疫源として、ＯｓｐＣファミリー７分離株（B．afzelii 菌株ＰＫＯ）からのＯｓｐＣタンパク質は有効でなかった。これとは対照的に、菌株Ｈ７（ＯｓｐＣファミリー５）からのＯｓｐＣタンパク質での免疫化は、抗原投与菌株Ｏｒｔｈ（ＯｓｐＣファミリー５）に対して有効であった。これらのデータ（図１５）は、ＯｓｐＣファミリーの間での交差防御は考えられず、ファミリー内部での防御は可能であることを示している。ＯｓｐＣファミリーの各々からのＯｓｐＣタンパク質の１つ以上の型を含む多効果のワクチンは、大部分のライム病ボレリア属菌株に対し防御するのに充分なものでなくてはならない。例７：ヒト疾病と関連するＯｓｐＣタンパク質のさまざまなファミリーの出現頻度の地理的分布ＯｓｐＣタンパク質の高度の可変性のため、優れた防御有効範囲を与え、しかもこの最終目的達成のために過度に多くの変異体の内含が必要とされないようなワクチン製剤を設計することは、きわめて困難である。ＯｓｐＣ変異体の選択を最適化する１つの方法は、どのＯｓｐＣ変異体がヒト疾病と関連していて、高い頻度で出現するかを見極めることである。ヒト疾病と稀にしか関連しないＯｓｐＣ変異体又は稀少なＯｓｐＣ変異体は、かくして、最小限のワクチン効力損失をもつあらゆるワクチン製剤から除去されることになる。その上、ワクチンが特定の地理的地域内での使用のためのみに設計される場合、その地域のライム病ボレリア属の間で優勢でないＯｓｐＣ変異体を内含するのは不必要なことであろう。この研究に使用されるボレリア属菌株についての疫学的情報及びＯｓｐＣ型決定情報を用いると（図１２）、ＯｓｐＣワクチンに内含させるべきＯｓｐＣ変異体についての選択を行うことが可能であった。 B．burgdorferi分離株（菌株２５０１５を含むＣＭＡＴグループ１：合計２３菌株）の分析は、これらの菌株の間で最も優勢なＯｓｐＣ変異体が、ファミリー１及び２に属するものであることを示している。ファミリー１の菌株は全てヨーロッパの分離株であり、ヒト疾病をひき起す可能性があるが、５つの菌株のうちの１つのみがヒト分離株であった。このことは、これらの菌株が高レベルの毒性をもたないことを示していると考えられる。ファミリー２の菌株は１０メンバーをもつ単一の最も一般的な型のＯｓｐＣファミリーである。ファミリー１の菌株とは異なり、これらの菌株は、米国、ヨーロッパ及びロシアからの分離株を含めて広範に分布している。ファミリー２の菌株は明らかにヒト疾病に関連しており、５０％の分離株が臨床標本である。試験された残り８つのB．burgdorferi分離株は全て米国の分離株であり、これらは、各菌株が異なるＯｓｐＣＲＥＬＰ型を発現することから、それが発現するＯｓｐＣという点で非常に多様である。これらの菌株のうちわずか１つだけ（菌株２９７、ファミリー３）がライム病の一症例から分離された。ファミリー２及び３は、菌株２５０１５を除いて、３つの主要なヒト疾病関連クローンＣＭＡＴ型１、２、４（図５）のうちの１つに属している。 B．afzeliiの２６の菌株（すなわちグループＶＳ４６１、ＣＭＡＴグループ３）は、６つの孤立したファミリー、すなわちそれぞれ５、４、６、２、又は４のメンバーをもつＯｓｐＣファミリー４−８及びファミリー１６の中に入る。日本産の１つの分離株を除いて、全ての菌株は、ヨーロッパすなわちオーストリア（１４）；チェコ共和国（４）、デンマーク（１）、ドイツ（２）、イタリア（１）、スロヴェニア（１）、スウェーデン（１）及びスイス（１）からのものであった。ヨーロッパ産分離株の８８パーセントはヒト由来のものであり、分離株の８０％が皮膚の生検、８％が血液試料からのものであった。これらのデータは、B．afzel ii菌株とライム病の皮膚科学形態の発症の間の強い関連性を反映している。ヒト分離株はさまざまなＯｓｐＣファミリー全体を通して均等に分布していた。オーストリア産分離株は、卓越してファミリー４〜６に属していた（８６％）が、単一の代表がファミリー７及び８の中にも発見された。オーストリア産分離株がＯｓｐＣファミリー７の間で低い発生率しか示さず（すなわち１／５）、ファミリー１６では分離株が不在であったこと（０／４）は、ヨーロッパ内でさまざまな B．afzelii ＯｓｐＣファミリーの優勢度に地理的変動が見られることを示唆している。それでも、ＯｓｐＣファミリー４〜８及び１６からのB．afzelii菌株は、ヨーロッパ全体に広く分散している。これらの菌株はほぼ排他的に、もう１つの主要なヒト疾病関連クローンすなわち３、２、１３（図５）のメンバーである。３０のB．garinii菌株（すなわち異型菌株１９８５７及び１９９５２を除くＣＭＡＴグループ４及びＣＭＡＴ菌株２００４７、ＩＤ９０及びＮＢＳ１６）を９つのＯｓｐＣファミリーと、いかなるファミリー割り当ても無い２つのＲＦＬＰ型に細分割することができる。試験されたB．garinii菌株の５３パーセントがヒト分離株であり、これらの菌株は、ＯｓｐＣ型の１つ（ＲＦＬＰ３４）を除く全てを通して分布している。これらの B．garinii菌株の７５パーセント（１２／１６）が、神経ボレリオーシスの症例から分離され、残りは皮膚分離株であった。従って、B．gariniiは主として神経ボレリオーシスと結びつけられるが、病因の如何に関わらず皮膚病変（ＥＭ）の発生がライム病の全ての形態に共通の症状発現であることから、皮膚分離株の出現を予想すべきである。ＯｓｐＣファミリー１３の菌株は最も一般的に分離されたＯｓｐＣ型であり、全B．gariniiＯｓｐＣ型の２３％（７／３０）、そしてヒト分離株の２５％（４／１６）を占めていた。このＯｓｐＣファミリーの菌株は、ヨーロッパの中で一般的なものであり、６つの異なる国からの分離株を内含する。ＯｓｐＣファミリー１１も又広く分布しており、かなり頻繁に出現する（１７％又は５／３０）が、１つの分離株のみがヒト由来のものであるため、ヒト疾病との関連性はさほど明確でないが、これは試料採取上の誤差及び分析された菌株の数が少なかったことを反映しているのかもしれない。これら後者のコメントは、ＯｓｐＣファミリー１４の菌株（４菌株、ただしヒト分離株は１つのみ）についてもあてはまる。その他のＯｓｐＣファミリー（９、１０、１２、１５、１７、１９及びＲＦＬＰ型３３及び３４）からの分離株が、より低い頻度で発見された。しかしながら、オーストリア産B．garinii菌株に対するワクチンのためには、ＯｓｐＣファミリー１０及び１９を付加的に考慮しなければならない。というのも、オーストリアからの４つのB．garinii分離株の全てがこれら２つのＯｓｐＣファミリーに属していたからである。上述のようなボレリア菌株の直接分析に加えて、さまざまなＯｓｐＣ変異体の多効果性及びヒトボレリオーシスとのその関連性を間接的に見極めることも可能である。これは、ライム病患者からの血清中のＯｓｐＣ抗体の特異性を試験することによって達成できる。ＥＭ（１５）、ＡＣＡ（１５）、神経障害（１０）又は関節及び筋肉に関連する症候群（１０）を患うプラハ地域（チェコ共和国）内の患者から採取した５０の血清を、ＯｓｐＣに対する抗体について試験した。１８菌株のパネルに対してスクリーニングしたところ、１７（３４％）の血清（３ＥＭ、１０ＡＣＡ、３ライム関節炎及び１神経ボレリオーシス）が、試験された１６のＯｓｐＣファミリー（図１６）の１つ以上のものと反応することがわかった。血清のうち１２が、ただ１つのＯｓｐＣと特異的に反応した〔ファミリー５（４ｘ）、ファミリー７（３ｘ）、ファミリー６（２ｘ）、ファミリー８、１３及び１４（１ｘ）〕。３つの血清が、ファミリー４及び６の両方と反応し、一方その他２つの血清が広く交差反応し、試験されたファミリーのうち６つ及び８つと反応した。従って、ＯｓｐＣファミリー５〜７、１３、１４そしておそらくは４からのＯｓｐＣ変異株を発現するボレリア属菌株が、チェコ共和国内に存在している。この血清学的データは、隣国オーストリアについての菌株分析から得た結果と一貫性をもち、従ってこの結果を実証している。上述の結果に基づき、次の国で使用するためにワクチンが処方された：すなわち、１）米国；ＯｓｐＣファミリー２及び３からのＯｓｐＣ２）ヨーロッパ；ＯｓｐＣファミリー２、４〜７、９、１０、１２、１３、１４、１５〜１７及び１９からの１４の０ｓｐＣ変異体、３）オーストリア；ＯｓｐＣファミリー２、４〜７、１０、１３及び１９からの８つ以上のＯｓｐＣ。例８：P．pastoris内の組換え型ＯｓｐＣの発現 Pichia pastoris ＯｓｐＣ発現ベクターの構築 B．burgdorferiのＯｓｐＣコード配列をクローニングするために、組換え型P ．pastoris/E．coliシャトルベクターｐＨＩＬ−Ａ１（Phillips Petroleumから提供）を用いた。各ファミリーからの１つ以上の代表を含む菌株パネルを選択し、ポリメラーゼ連鎖反応によりＯｓｐＣ遺伝子を増幅した。米国出願０７／９０３，５８０（ＥＰ．０５２２５６０）で開示されているようなＯｓｐＣヌクレオチド配列から演鐸された菌株特異的プライマを用いることにより、第１のシステインアミノ酸（菌株ＯｒｔｈからのＯｓｐＣタンパク質配列の中のアミノ酸１９）から開始する完全ＯｓｐＣタンパク質のコード配列を増幅させた。 B．burgdorferi ＯｒｔｈＯｓｐＣ遺伝子の５′及び３′末端を作り出すため、5′-AAATGTGTAATAATTCAGGGAAAGG-3′という配列をもつアミノ末端プライマーＰＣ−Ｆ及び5′-ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG-3′という配列をもつカルボキシ末端プライマーＰＣ−Ｂを用いて、基本的に例４に記述されている通りに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。プライマーＰＣ−Ｆ内の下線を施した配列は、完全ＯｓｐＣタンパク質の翻訳開始コドンと同一であり、プライマーＰＣ −Ｂ内の下線を施した配列は翻訳停止コドンと同一である。ｐＨＩＬ−Ａ１内にB．burgdorferi菌株Ｂ３１、ＰＫＯ、ＺＳ７、ＫＬ１０及びＥ６１のＯｓｐＣコード配列を挿入するためのクローニング戦略（ＰＣＲのために使用されるベクター及びプライマー内の制限部位）が、以下の表１に要約されている。ベクターｐＨＩＬ−Ａ１をＳｆｕｌで消化させ、張り出し末端をクレノウボリメラーゼで充填して平滑末端を作り上げた。ＯｓｐＣコード配列を含む精製ＰＣＲフラグメントをベクターと一晩連結させた。この連結混合物を、コンピテント E．coli ＤＨ５αを形質転換するのに使用し、さらなるプラスミド増幅のためＬＢ−Ａｍｐ−プレート上でアンピシリン耐性コロニーを選択した。制限断片長によりミニ調製物（Maniafls et al．1982）をスクリーニングし分析し、ＯｓｐＣ遺伝子をもつプラスミドをｐＰＣ−ＰＰ４と標識づけした（図１７）。精製ｐＰＣ−ＰＰ４ＤＮＡを調製し、配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。Dohmen et al．1991（Yeast 7；691-692）により記述された方法により、P．pastoris 菌株ＧＳ１１５ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（Cregg et al．Mol．Cell．Biol． 5；3376-3385（1985））内で、精製プラスミドｐＰＣ−ＰＰ４を形質転換させ、形質転換体をＭＤプレート上で選択した。表１は、異なるライム病ボレリア菌株の完全ＯｓｐＣタンパク質のコード配列のＰＣＲ増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを示す。ｐＨＩＬ−Ａ１ベクター内のＯｓｐＣコード配列の挿入のために用いられる制限酵素も同様に示されている。 P．pastoris内の組換え型ＯｓｐＣ^-の発現ＭＤプレートからP．pastoris ＧＳ１１５／ｐＰＣ−ＰＰ４形質転換体を採取し、２−１０という光学密度（ＯＤ６００）になるまでつねに撹拌しながら３０ ℃で３mlのＭＧ培地内で成長させた。ＯｓｐＣ合成の誘発のため、１mlの培養をスピンダウンさせ、ＭＭで一回洗浄し、３mlのＭＭ又はＭＭＹ¹−培地の中で再懸濁させ、つねに撹拌しながら３０℃ で２日間インキュベートした。成長培地内でのメタノールの存在によって、ＯｓｐＣの発現を誘発させた。培養のアリコートをとり出し、ＯｓｐＣ特異的モノクローナル抗体ＢＢＭ４５を用いて、リゼイトをウエスタンブロット分析した。〔１以下の培地は全て、１リットルあたりの量として表現されている。ＭＤ：酵母窒素原基礎培地（ＹＮＢ、１３．４ｇ）、硫酸アンモニウム（５ｇ）、ビオチン（４００mg）、グルコース（２％）、ＭＧ：ＹＮＢ、硫酸アンモニウム、ビオチン、グリセロール（１０ml/l）、リン酸カリウム（１００mM）、ＭＭ：ＹＮＢ、硫酸アンモニウム、ビオチン、メタノール（５ml）、リン酸カリウム（１００mM）ＭＭＹ：ＭＭ、酵母エキス（１０ｇ）、カゼイン（２０ｇ）］組換え型ＯｓｐＣの精製遠心分離（３，０００ｇ、５分、４℃）によりP．pastoris ＧＳ１１５／ｐＰＣ−ＰＰ４細胞を集めた。洗浄した細胞をpH７．４の１５０mMのトリス／ＨＣｌ緩衝液に再懸濁させ、この懸濁液をガラ中で混合物を振とうすることにより、細胞を溶解させた。その後リゼイトを焼結ガラスフィルター上でろ過してガラス球を除去した。リゼイトを４℃で３，０００ｇにて５分間遠心分離した。上清をさらに１時間、４℃で１００，０００ｇで遠心分離した。ＯｓｐＣ抗原をさらに精製するため「高速上清」を用いた。以下で例示する通りに、ＤＥＡＥクロマトグラフ１によりＯｓｐＣ抗原を分画した。カラム：WatersからのProtein-ＰＡＫＤＥＡＥ５ＰＷ試料：４５mlの透析された抗原調製物、平衡緩衝液（Ａ）：１０mMのトリス／ＨＣｌ、pH７．５溶離用緩衝液（Ｂ）：１０mMのトリス／ＨＣｌ、１MのＮａＣｌ、pH７．５流量：４ml/分勾配：７０分間０％Ｂ、５０分間０〜１００％カラムを緩衝液Ａで平衡化し、抗原を増大する量のＮａＣｌで溶出させた。問題の抗原を含む固分を同定するため、アセトンで画分のアリュートを沈殿させ、ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はイムノブロット法によって分析した。ＯｓｐＣ抗原について富化したＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィ分離からの固分をさらに、ＥＰＯ５２２５６０に記述されているとおり固定化金属−アフィニティクロマトグラフィによって精製した。発酵槽内でのＯｓｐＣタンパク質の大規模産生連続的発酵ランの中でＯｓｐＣ産生を検査した。各々のランは、ｐＨ、溶存酸素、撹拌器速度、温度、空気流量及び酸素流量についてのモニター及び制御装置を備えた発酵槽を用いて行われた。温度は３０℃に保持した。細胞収量は、洗浄済み細胞の湿潤重量から決定した。発酵槽のランのための接種材料を、ＥＰＯ２６３３１１に開示されている通り、修正ＦＭ２１培地５００mlを含むエルレンマイヤーフラスコの中で成長させた。バッチモードで成長された発酵槽培養を、炭素及びエネルギーの唯一の供給源としてグリセロールを用いて増殖させた。１リットルあたり５００〜７００ｇの湿潤細胞重量のバイオマス濃度が達成されるまで、一定のグリセロール供給量で、連続培養を打ち立てた。基線制御試料をひとたび採取したならば、メタノール濃度を０．０５〜１．５％の間に保つよう、数日間にわたりメタノール−塩−ビオチン供給としてメタノールを培養に加えた。産生したバイオマスは毎日除去した。遠心分離によってP．pastoris細胞を収集し、緩衝液（１５０mMのトリス／ＨＣｌ、２mMのＥＤＴＡ、１mMの塩酸ベンズアミジン、０．１％のＮａＮ₃、pH ７．４）に再懸濁させた。フレンチプレスを用いることにより細胞リゼイトを得た。Bradfordの方法によりＯｓｐＣタンパク質濃度を決定した。予備的結果は、 B．burgdorferi菌株から得られた収量に比べてP．pastorisから誘導されたＯｓｐＣ抗原の約１００倍増大した収量（単位体積の培養あたり）という抗原産生を示した。 P．pastorisから誘導されたＯｓｐＣ抗原の免疫化及び抗原投与（防御）研究例５に記述されている通り、アレチネズミにおいて防御研究を行った。P．pas toris（菌種ＯｓｐＣからクローニングしたもの）又はボレリア属菌株Ｏｒｔｈからの２０マイクログラムという量のＯｓｐＣを、図１８内に示されているように、その防御効力についてテストした。P．pastorisで誘導されたＯｓｐＣを用いて免疫化した全てのアレチネズミは、相同な菌株Ｏｒｔｈでの抗原投与に対して防御されており、結果は、ボレリア誘導のＯｓｐＣ抗原で得られた防御研究に匹敵するものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９５年４月１８日【補正内容】請求の範囲１．（ａ）（ｉ）図１１の現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーの各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対し防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物。２．（ａ）（ii）図１１の現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーのライム病ボレリア属の２つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物。３．（ａ）（ｉ）１つ以上のヒト疾病関連（ＨＤＡ）クローン及びクローナルクラスターにより発現された図１９のＯｓｐＣファミリーの各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造をもつ、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物。４．（ａ）（ｉ）１つ以上のヒト疾病関連（ＨＤＡ）クローン及びクローナルクラスターによって発現された図１９のＯｓｐＣファミリーのライム病ボレリア属の２つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造をもつ、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対し防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物。５．特定の地理的地域に優勢なB．burgdorferi菌株に対する防御のために設計された、請求の範囲第１項又は第３項に記載の免疫原性組成物。６．（ａ）（ｉ）ＯｓｐＣファミリー２及び３の各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、北米で使用するための、請求の範囲第５項に記載の免疫原性組成物。７．前記材料が、更に、B．burgdorferi Ｂ３１からのＯｓｐＡ抗原を含んでいる、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。８．（ａ）（ｉ）ＯｓｐＣファミリー２、４〜７、９、１０、１２〜１７及び１９の各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、ヨーロッパで使用するための、請求の範囲第５項に記載の免疫原性組成物。９．（ａ）（ｉ）ＯｓｐＣファミリー２、４〜７、１０、１３及び１９の各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、オーストリアで使用するための、請求の範囲第７項に記載の免疫原性組成物。 10．前記材料が、ボレリア菌株Ｂ３１、Ｏｒｔｈ、Ｈ４及びＫＬ１１からのＯｓｐＡ抗原からの抗原を含んでいる、請求の範囲第８項又は第９項に記載の免疫原性組成物。 11．前記材料が、ライム病ボレリア属の全細胞から精製された（ｉ）又は（ ii）からの抗原を含んでいる、請求の範囲第１項又は第３項に記載の免疫原性組成物。 12．前記材料が、真核生物宿主において組換え技術により生成され、そこから精製される（ｉ）又は（ii）からの抗原を含んでいる、請求の範囲第１項又は第３項に記載の免疫原性組成物。 13．前記宿主が酵母である、請求の範囲第１２項に記載の免疫原性組成物。 14．前記宿主がP．pastorisである、請求の範囲第１３項に記載の免疫原性組成物。 15．前記抗原が、（1）VKLSESVASLSKAA；（2）TDNDSKEAILKTNGT；（3）KELTSPVVAETPKKP；（4）FVLAVKEVETL；（5）YAISTLITEKLKAL；（6）PNLTEISKKITDSNA；（7）ASANSVKELTSPVV；（8）SPVVAETPKKP；（9）GKKIQQNNGLGA；及び（10）SPVVAESPKK；から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつ１つ以上のエピトープ、又は防御免疫の生成を誘発するべく天然のエピトープに充分類似した構造をもつ、かかるエピトープの変異体又は擬似体、を含んでいる、請求の範囲第１項又は第３項に記載の免疫原性組成物。 16．エピトープ（１）〜（１０）の各々が代表する、請求の範囲第１５項に記載の免疫原性組成物。 17．さらにアジュバントを含んでいる、請求の範囲第１５項又は第１６項に記載の免疫原性組成物。 18．前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求の範囲第１７項に記載の免疫原性組成物。 19．前記防御量が、一用量あたり一抗原につき１〜１００マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第１項〜第１８項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。 20．前記防御量が、一用量あたり一抗原につき１０〜５０マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第１９項に記載の免疫原性組成物。 21．前記哺乳動物がヒトである、請求の範囲第１項〜第２０項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。 22．前記防御量が、ライムボレリオーシスを予防するか又は改善するものである、請求の範囲第１項〜第２１項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。 23．図８ａに示される、２８６９１株、２５０１５株、ＳＺ７株、２９７株、ＳＩＭＯＮ株、Ｅ６１株、ＡＣＡ１株、Ｈ９株、Ｊ１株、ＶＳ４６１株、Ｍ５７株、Ｗ株、ＶＳＤＡ株、ＮＢＳ２３ａ株、２００４７株、ＫＬ１０株、ＩＰ９０株、ＮＢＳ１ＡＢ株、ＢＩＴＳ株、ＫＬ１１株及びＨ１３株からのＯｓｐＣ遺伝子配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む組換え型ＤＮＡ配列。 24．図９ａに示される、２８６９１株、２５０１５株、ＳＺ７株、２９７株、ＳＩＭＯＮ株、Ｅ６１株、ＡＣＡ１株、Ｈ９株、Ｊ１株、ＶＳ４６１株、Ｍ５７株、Ｗ株、ＶＳＤＡ株、ＮＢＳ２３ａ株、２００４７株、ＫＬ１０株、ＩＰ９０株、ＮＢＳ１ＡＢ株、ＢＩＴＳ株、ＫＬ１１株及びＨ１３株のＯｓｐＣ抗原をコードする組換え型ＤＮＡ配列。 25．図８ａのＯｓｐＣ遺伝子配列のいずれか１つに対し少なくとも８０％の相同性を有する、請求の範囲第２３項に記載の組換え型ＤＮＡ配列。 26．図１１の現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーのいずれかのＯｓｐＣ抗原をコードする配列を含む、組換え型発現ベクター。 27．請求の範囲第２３項〜第２５項に記載の組換え型ＤＮＡ配列を含んでいる、請求の範囲第２６項に記載の組換え型発現ベクター。 28．真核生物／原核生物宿主細胞のためのシャトルベクターである、請求の範囲第２６項又は第２７項に記載の発現べクター。 29．前記のべクターが、酵母、好ましくはP．pastoris、及びＥ．ｃｏｌｉにおいて複製する、請求の範囲第２８項に記載の発現ベクター。 30．ＯｓｐＣ遺伝子の発現が、誘導可能なプロモーターの転写制御下で行われる、請求の範囲第２６項〜第２９項のいずれか１項に記載の発現ベクター。 31．ＯｓｐＣをコードする配列の発現が、メタノールによって誘発可能である、請求の範囲第３０項に記載の発現ベクター。 32．請求の範囲第２６項〜第３１項のいずれか１項に記載の発現べクターで形質転換された宿主細胞。 33．（ｉ）請求項２３〜２５の配列のいずれかによりコードされた、又は（ii ）少なくとも８０％の相同性を有する、ＯｓｐＣ抗原。 34．哺乳動物におけるライムボレリオーシスの治療又は予防のためのワクチンの製造を目的とした、請求の範囲第１項〜第３３項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物により包含されているような抗原の組合せの使用。 35．前記有効量が、一用量あたり一抗原につき１〜１００マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第３４項に記載の使用。 36．前記有効量が、一用量あたり一抗原につき１０〜５０マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第３５項に記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ０７Ｋ 14/20 8517−4ＨＣ０７Ｋ 14/20 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）（ｉ）図１１の現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーの各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対し防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物。２．（ａ）（ｉ）図１１の現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーのライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物。３．前記材料が、２つ以上の（ｉ）からのＯｓｐＣ抗原又は（ii）からの前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体を含んでいる、請求の範囲第２項に記載の免疫原性組成物。４．（ａ）（ｉ）１つ以上のヒト疾病関連（ＨＤＡ）クローン及びクローナルクラスターによって発現された図１９のＯｓｐＣファミリーの各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造をもつ、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物。５．（ａ）（ｉ）１つ以上のヒト疾病関連（ＨＤＡ）クローン及びクローナルクラスターによって発現された図１９のＯｓｐＣファミリーのライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造をもつ、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対し防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、免疫原性組成物。６．前記材料が、２つ以上の（ｉ）からのＯｓｐＣ抗原、又は（ii）からの前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体を含んでいる、請求の範囲第５項に記載の免疫原性組成物。７．特定の地理的地域に優勢なB．burgdorferi菌株に対する防御のために設計された、請求の範囲第１項又は第４項に記載の免疫原性組成物。８．（ａ）（ｉ）ＯｓｐＣファミリー２及び３の各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、北米で使用するための、請求の範囲第７項に記載の免疫原性組成物。９．前記材料が、現在認知されているＯｓｐＣファミリー２又は３の各々から１つの抗原を含んでいる、請求の範囲第７項又は第８項に記載の免疫原性組成物。 10．前記材料が、更に、B．burgdorferi Ｂ３１からのＯｓｐＡ抗原を含んでいる、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。 11．（ａ）（ｉ）ＯｓｐＣファミリー２、４〜７、９、１０、１２〜１７及び１９の各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、ヨーロッパで使用するための、請求の範囲第７項に記載の免疫原性組成物。 12．前記材料が、２つ以上の（ｉ）からのＯｓｐＣ抗原、又は（ii）からの前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ疑似体を含んでいる、請求の範囲第１１項に記載の免疫原性組成物。 13．（ａ）（ｉ）ＯｓｐＣファミリー２、４〜７、１０、１３及び１９の各々から実質的に精製されたライム病ボレリア属の１つ以上のＯｓｐＣ抗原、又は（ ii）防御免疫の生成を誘発するべく天然のＯｓｐＣに充分類似した構造を有する、前記ＯｓｐＣ抗原のＯｓｐＣ変異体又はＯｓｐＣ擬似体、を含む、ある量の材料；及び（ｂ）生理学的に受容可能な賦形剤、を含んでいる免疫原性組成物であって、前記量が、ライムボレリオーシスに罹病しうる哺乳動物においてライムボレリオーシスに対して防御性のある免疫応答を惹起するのに充分なものである、オーストリアで使用するための、請求の範囲第７項に記載の免疫原性組成物。 14．前記材料が、ボレリア菌株Ｂ３１、Ｏｒｔｈ、Ｈ４及びＫＬ１１からのＯｓｐＡ抗原からの抗原を含んでいる、請求の範囲第１１項〜第１３項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。 15．前記材料に、ライム病ボレリア属の全細胞から精製された（ｉ）又は（ii ）からの抗原を含んでいる、請求の範囲第１項又は第４項に記載の免疫原性組成物。 16．前記材料に、真核生物宿主において組換え技術により生成され、そこから精製される（ｉ）又は（ii）からの抗原を含んでいる、請求の範囲第１項又は第４項に記載の免疫原性組成物。 17．前記宿主が酵母である、請求の範囲第１６項に記載の免疫原性組成物。 18．前記宿主がP．pastorisである、請求の範囲第１７項に記載の免疫原性組成物。 19．前記抗原が、（1）VKLSESVASLSKAA；（2）TDNDSKEAILKTNGT；（3）KELTSPVVAETPKKP；（4）FVLAVKEVETL；（5）YAISTLITEKLKAL；（6）PNLTEISKKITDSNA；（7）ASANSVKELTSPVV；（8）SPVVAETPKKP；（9）GKKIQQNNGLGA；及び（10）SPVVAESPKK；から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつ１つ以上のエピトープ、又は防御免疫の生成を誘発するべく天然のエピトープに充分類似した構造をもつ、かかるエピトープの変異体又は擬似体、を含んでいる、請求の範囲第１項又は第４項に記載の免疫原性組成物。 20．エピトープ（１）〜（１０）の各々が代表する、請求の範囲第１９項に記載の免疫原性組成物。 21．さらにアジュバントを含んでいる、請求の範囲第１９項又は第２０項に記載の免疫原性組成物。 22．前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求の範囲第２１項に記載の免疫原性組成物。 23．前記防御量が、一用量あたり一抗原につき１〜１００マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第１項〜第２２項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。 24．前記防御量が、一用量あたり一抗原につき１０〜５０マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第２３項に記載の免疫原性組成物。 25．前記哺乳動物がヒトである、請求の範囲第１項〜第２４項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。 26．前記防御量が、ライムボレリオーシスを予防するか又は改善するものである、請求の範囲第１項〜第２５項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。 27．哺乳動物におけるライムボレリオーシスの治療又は予防のためのワクチンの製造を目的とした、請求の範囲第１項〜第２６項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物に包含されている抗原の組合せの使用。 28．前記哺乳動物がヒトである、請求の範囲第２７項に記載の使用。 29．前記有効量が、一用量あたり一抗原につき１〜１００マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第２７項又は第２８項に記載の使用。 30．前記有効量が、一用量あたり一抗原につき１０〜５０マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第２９項に記載の使用。 31．前記有効量が、ライムボレリオーシスを予防するか又は改善するものである、請求の範囲第２７項〜第３０項のいずれか１項に記載の使用。 32．図８ａのＯｓｐＣ遺伝子配列のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、組換え型ＤＮＡ配列。 33．図９ａに示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする組換え型ＤＮＡ配列。 34．図８ａのＯｓｐＣ遺伝子配列のいずれか１つに対し少なくとも８０％の相同性を有する、請求の範囲第３２項に記載の組換え型ＤＮＡ配列。 35．図１１の現在認知されている２０のＯｓｐＣファミリーのいずれかのＯｓｐＣ抗原をコードする配列を含む、組換え型発現ベクター。 36．請求の範囲第３２項〜第３４項に記載の組換え型ＤＮＡ配列を含んでいる、請求の範囲第３５項に記載の組換え型発現ベクター。 37．真核生物／原核生物宿主細胞のためのシャトルベクターである、請求の範囲第３５項又は第３６項に記載の発現ベクター。 38．前記ベクターが、酵母、好ましくはP．pastoris、及びＥ．ｃｏｌｉにおいて複製する、請求の範囲第３７項に記載の発現ベクター。 39．ＯｓｐＣ遺伝子の発現が、誘導可能なプロモーターの転写制御下で行われる、請求の範囲第３５項〜第３８項のいずれか１項に記載の発現ベクター。 40．ＯｓｐＣをコードする配列の発現が、メタノールによって誘発可能である、請求の範囲第３９項に記載の発現ベクター。 41．請求の範囲第３５項〜第４０項のいずれか１項に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 42．ａ．請求の範囲第３５項〜第４０項のいずれかに記載の発現ベクターを用いて真核性酵母細胞を形質転換する工程；ｂ．この酵母細胞を培養する工程；ｃ．場合によりメタノールを添加することによりＯｓｐＣ遺伝子の発現を誘導する工程；ｄ．細胞を集める工程、及びｅ．ＯｓｐＣ抗原を精製する工程、を含む、現在認知されている２０のファミリーのＯｓｐＣ抗原の組換え型生成のための方法。 43．（ｉ）図８ａに従った配列のいずれかによりコードされた、又は（ii）図９ａのアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％の相同性を有する、ＯｓｐＣ抗原。 44．請求の範囲第１項又は第４項に記載の免疫原性組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、ライムボレリオーシスに対する哺乳動物の免疫方法。 45．前記哺乳動物がヒトである、請求の範囲第４４項に記載の方法。 46．前記有効量が、一用量あたり一抗原につき１〜１００マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第４４項に記載の方法。 47．前記有効量が、一用量あたり一抗原につき１０〜５０マイクログラムの範囲内にある、請求の範囲第４６項に記載の方法。 48．前記有効量が、ライムボレリオーシスを予防又は改善するものである、請求の範囲第４４項に記載の方法。