JPH10504455A - ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓｐＧを含有するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ライム病の予防および診断に有用なビー・ブルグドルフェリ由来の新しい抗原ＯｓｐＧに関する。該抗原のクローニング、配列および発現を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓｐＧを含有するワクチン 本発明は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）由来の新規 抗原ならびにその誘導体、それらの製造、ヒトおよび動物の医薬ならびに診断に おけるそれらの使用、そしてそれらを含有する医薬組成物に関する。 詳細には、本発明は、新規多型性のビー・ブルグドルフェリのリポ蛋白Ｏｓｐ Ｇのクローニング発現に関する。この蛋白はかつて１ｐ７７として知られていた 。この蛋白の推定アミノ酸配列は、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、ＯｓｐＤ、 ＯｓｐＥ、ＯｓｐＦおよびＰ２７のごとき他の既知ボレリア抗原とは有意な相同 性を示さない。これらの外表面蛋白は、ＯｓｐＧとは４１％ないし６５％の類似 性を有す（表１）。 ライム病（Lyme disease）は、最も通常の、ベクターにより生じる温和な性質 の感染症である。病因論上の病原体であるスピロヘータのボレリア・ブルグドル フェリは、ヒトにおいて多症状疾患を引き起こし、それは皮膚、神経系、関節お よび心臓に影響しうる（８、４４）。異なる生物学的起源および地理的地域から 単離されたビー・ブルグドルフェリ（B.burgdorferi）株は異種混交であり（２ 、１９、３８、４５、５０）、疾病発現のパターンは該スピロヘータ株の抗原的 相違により影響されると考えられる。免疫学的または分子的な判断基準によりビ ー・ブルグドルフェリを分類するいくつかの試みが最近報告されているが、ビー ・ブルグドルフェリの分類学はやはり論争および活発な研究の的である。 現在に至るまで、外表面蛋白Ａ（ＯｓｐＡ）、ＯｓｐＢ、ｐＣおよびｐ１００ のごとき種々のビー・ブルグドルフェリ抗原が血清学的診断に用いられ、あるい はワクチン開発のための推定上の候補として用いられている（１３、１４、３６ 、３８、４０、４１）。しかしながら、種特異的診断標準物質の製造およびいず れの亜種に対しても防御を行うポリペプチドワクチンの開発のためには、それら は明らかに異種混交であるので、あいまいでない判断基準はまだない。 本発明者らは、ＯｓｐＧと命名されたビー・ブルグドルフェリ由来のさらなる リポ蛋白を見い出した。この分子は、約２２ｋＤａの分子量、等電点ＰＩ＝５． ２を有することにより特徴づけられ、１９６個のアミノ酸を含む。 ＯｓｐＧのアミノ末端部分に約２０個のアミノ酸の１つの大型の疎水性ドメイン を有するとして、その成熟蛋白がさらに特徴づけられている。このＮ−末端ペプ チドは、典型的な原核細胞のリポ蛋白前駆体に見られるリーダーシグナルペプチ ドに対応する。その疎水性コアのカルボキシ末端に、ビー・ブルグドルフェリの シグナルペプチダーゼによっておそらく認識される開裂部位が存在する。Ｏｓｐ Ｇ中の可能性のある開裂部位は位置１９のセリンと位置２０のシステインとの間 に見い出されている。ＯｓｐＧの開裂部位周辺の配列はＬ−Ｉ−Ｉ−Ｓ−Ｃであ る。 ＯｓｐＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＰ２７に関する遺伝子とは異なり、Ｏｓ ｐＧ遺伝子は本質的にはビー・ブルグドルフェリＺＳ７中の５５ｋｂのプラスミ ド上に存在する。ＯｓｐＧプローブと４５ｋｂプラスミドとの弱い交差反応性が 記録された。ＯｓｐＧは実質的に図１に示されるアミノ酸配列を有する。それは 、感染の間においてのみ発現されることによりさらに特徴づけられ、インビトロ で培養されたビー・ブルグドルフェリにおいては検出されない。 したがって、本発明は、２次元ＳＤＳゲル電気泳動により測定した場合、２０ 〜２２ｋＤａの間の分子量および４.９ないし５.４の間の等電点を有することを 特徴とするビー・ブルグドルフェリ由来の単離蛋白を提供する。 本発明者らは、図１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同 性を有する蛋白またはその免疫学的もしくは抗原的に同等なフラグメントまたは 誘導体を提供する。 蛋白ならびに対応ＤＮＡおよびＲＮＡ配列は、ワクチンおよび診断の分野にお いて有用性が見い出されている。 好ましくは、本発明は、図１に示す蛋白に対して少なくとも８５％の相同性、 より好ましくは９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有 する蛋白を提供する。 本発明蛋白は融合蛋白であってもよく、その場合、融合蛋白はそのアミノ酸配 列の一部またはそのフラグメントを有することにより特徴づけられる。好ましく は、その部分は、図１の蛋白配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８５％ 、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の相同性を有する。 好ましくは、該蛋白はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した 場合、少なくとも７０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは少なくとも９ ０％の純度である。 本発明蛋白はリポ蛋白であってもよく、あるいは何ら結合脂質を有していない 蛋白として製造されてもよい。組み換え法により製造される場合、該リポ蛋白は シグナル配列を伴って発現されるであろう。Ｎ−末端の１９個のアミノ酸を除去 するためのシグナル配列の開裂は、脂質が結合していない分子の生成を引き起こ すであろう。 イムノブロット分析は、無傷のスピロヘータに前以て感染させられたマウス由 来の血清によりＯｓｐＧが認識されることを示し、そのことは、この種において 本来の蛋白は免疫原性であることを示唆する。 本発明者らは、ＯｓｐＧに関する遺伝子をさらに同定し、配列決定した。した がって、本発明は、ＯｓｐＧまたはそのフラグメントもしくは誘導体をコードし ているＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、該ＤＮＡ配列は実質的に図１に示さ れるものである。 用語「実質的に」とは、図１に示す配列に対して少なくとも７０％の同一性、 好ましくは８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、最も好 ましくは少なくとも９５％の同一性を意味する。詳細には、本発明は、実質的に 図１に示される配列を有するＤＮＡ配列、またはそのフラグメント、あるいは該 配列にハイブリダイゼーションし、ＯｓｐＧ抗原性を示す蛋白をコードしている ＤＮＡ配列を提供する。 酵素的ＤＮＡポリマー化により本発明ＤＮＡを製造することができ、一般的に は体積５０μｌまたはそれ未満として、温度１０℃〜３７℃において、必要なヌ クレオシドトリホスフェートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含 有する適当なバッファー中で、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフラグメント）の ごときＤＮＡポリメラーゼを用いて、これをインビトロで行うことができる。一 般的には５０μｌまたはそれ未満の体積として、４℃ないし周囲温度において、 ０.０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７.４）、０.０１Ｍ ＭｇＣｌ₂、０.０１Ｍジチオ スレイトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭ ＡＴＰおよび０.１ｍｇ／ｍｌウ シ・血清アルブミンのごとき適当なバッファー中で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのご ときＤＮＡリガーゼを用いて酵素的ＤＮＡフラグメント結合を行うことができる 。固相法を用い、慣用的なホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホラミ ダイト化学によってＤＮＡポリマーまたはフラグメントの化学合成を行うことが でき、例えば、固相法は、Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragmen ts-A Laboratory Manual(H.G.GassenおよびA.Lang編),Verlag Chemie,Weinheim( 1982)、または他の科学刊行物、例えば、M.J.Gait,H.W.D.Matthes,M.Singh,B.S. SproatおよびR.C.Titmas,Nucleic Acids Research,1982,10,6243；B.S.Sproatお よびW.Bannwarth,Tatrahedron Letters,1983,719；M.D.MatteucciおよびM.H.Car uthers,Journal of the American Chemical Society,1983,105,661；N.D.Sinha, J.Biernat,J.McMannusおよびH.Koester,Nucleic Acids Research,1984,12,4539 ；およびH.W.D.Matthesら,EMBO Journal,1984,3,801に記載されている。 別法として、既知方法（例えば、ｍＲＮＡを逆転写して相補的なｃＤＮＡ鎖を 得る）および市販ｃＤＮＡキットを用いて、コーディング配列をビー・ブルグド ルフェリｍＲＮＡから誘導することができる。 本発明は特別に開示された配列に限定されないが、上記蛋白またはその免疫学 的誘導体をコードしているすべての分子を包含する。 本発明蛋白をコードするｃＤＮＡに対する部位特異的突然変異法、例えば、G. Winterら,Nature,1982,299,756〜758またはZollerおよびSmith,1982,Nucl.Acids Res.,10,6487〜6500により記載された慣用的方法により行うことができ、ある いはChanおよびSmith,Nucl.Acids Res.,1984,12,2407〜2419またはG.Winterら,B iochem.Soc.Trans.,1984,12,224〜225により記載されたような欠失突然変異法に より本発明蛋白の変異体をコードするＤＮＡポリマーを製造することができ る。 １の態様において、本発明は下記工程： i）宿主細胞中において該ＯｓｐＧ蛋白またはその免疫学的誘導体をコードする ヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーを発現しうる、複製可能または統合的な 発現ベクターを調製し、 ii）該ベクターで宿主細胞を形質転換し、 iii）該ＤＮＡポリマーを発現可能にする条件下で該形質転換された宿主細胞を 培養して該蛋白を生成させ、次いで、 iv）該蛋白を回収する を含む方法を提供する。 本明細書の用語「形質転換」は、例えば、Genetic Engineering;S.M.Kingsman およびA.J.Kingsman編;Blackwell Scientific Publications;Oxford,England,19 88に記載された慣用的方法を用いて、適当なプラスミドまたはウイルスベクター での形質転換、トランスフェクションまたは感染により宿主細胞中に外来ＤＮＡ を導入することを意味する。以後、用語「形質転換された」または「形質転換体 」は、対象とする外来遺伝子を含有し発現する、得られた宿主細胞をいうのに用 いる。 該発現ベクターは新規であり、さらに本発明の一部を形成する。 宿主に適合するベクターを開裂して無傷のレプリコンを有する直鎖状ＤＮＡセ グメントを得て、次いで、連結条件下で該直鎖状セグメントを１またはそれ以上 のＤＮＡ分子と連結することにより本発明により複製可能発現ベクターを調製す ることができるが、該ＤＮＡ分子は該直鎖状セグメントと一緒になって所望生成 物、例えばＯｓｐＧ蛋白またはそのフラグメントをコードしているＤＮＡポリマ ーをコードするものである。 よって、所望により、ベクター構築の間にＤＮＡポリマーを前もって形成して もよく、あるいはベクター構築中に形成してもよい。 ベクターの選択は、一部には、宿主細胞によって決定され、それは原核細胞で あっても真核細胞であってもよい。適当なベクターは、プラスミド、バクテリオ ファージ、コスミドおよび組み換えウイルスを包含する。 ＤＮＡの制限的切断、ポリマー化および連結用の適当な酵素を用いて、例えば 、上で引用したManiatisらに記載の方法により、複製可能発現ベクターの調製を 慣用的に行うことができる。 形質転換条件下で本発明複製可能発現ベクターで宿主細胞を形質転換すること により、本発明により組み換え宿主細胞を調製する。適当な形質転換条件は慣用 的なものであり、例えば、上で引用したManiatisら、あるいは「ＤＮＡクローニ ング」第２巻、D.M.Glover編、IRL Press Ltd、１９８５年に記載されている。 形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。よって、イー・コリ（E.co li）のごとき細菌宿主を、ＣａＣｌ₂溶液（Cohen et al,Proc.Natl.Acad.Sci.,1 973,69,2110）またはＲｂＣｌ、ＭｎＣｌ₂、酢酸カリウムおよひグリセロールの 混合物を含む溶液で処理し、次いで、３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパン−スル ホン酸、ＲｂＣｌおよびグリセロールで処理することができる。ベクターＤＮＡ の細胞上への共沈により培養中の哺乳動物細胞を形質転換することができる。ま た本発明は本発明複製可能発現ベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。 ＤＮＡポリマー発現可能条件下での形質転換宿主細胞の培養を、例えば、上で 引用したManiatisら「ＤＮＡクローニング」に記載のごとく慣用的に行う。よっ て、好ましくは、細胞に栄養を与え、４５℃以下で培養する。 宿主細胞に応じた慣用的方法により生成物を回収する。よって、宿主細胞がイ ー・コリのごとき細菌細胞である場合には、それを化学的または酵素的に溶解し 、得られた溶解物または上清から蛋白生成物を単離することができる。宿主細胞 が哺乳動物細胞である場合には、一般的には、生成物を栄養培地または無細胞抽 出物から単離することができる。慣用的な蛋白単離方法は、選択的沈殿、吸着ク ロマトグラフィー、およびモノクローナル抗体アフィニティーカラムを包含する アフィニティークロマトグラフィーを包含する。 別法として、バキュロウイルスのごとき適当なベクターを用いて昆虫細胞にお いて発現を行ってもよい。本発明の特別な態様において、蛋白をレピドプテラ （Lepidoptera）細胞において発現させて免疫原性ポリペプチドを得る。レピド プテラ細胞における蛋白発現のためには、バキュロウイルス発現系の使用が好ま しい。かかる系において、典型的には、バキュロウイルスプロモーターに作動可 能に結合した蛋白コーディング配列を含む発現カセットをシャトルベクター中に 入れる。かかるベクターは、イー・コリまたはいくつかの他の適当な原核宿主に おいてシャトルベクターを増殖させるに十分量の細菌ＤＮＡを含有する。かかる シャトルベクターは、所望蛋白コーディング配列に隣接した十分量のバキュロウ イルスＤＮＡをも含み、野生型バキュロウイルス遺伝子と異種遺伝子との間の組 み換えを可能にする。次いで、組み換えベクターを野生型バキュロウイルス由来 のＤＮＡとともにレピドプテラ細胞中に同時トランスフェクションする。次いで 、相同的組み換えにより生じた組み換えバキュロウイルスを選択し、標準的方法 によりプラーク精製する。Summersら,TAES Bull（テキサス農業試験場公報）NR1 555,１９８７年５月参照。 昆虫細胞におけるＣＳ蛋白発現方法は、SmithKline RITのＵＳＳＮ２８７,９ ３４（ＷＯ／ＵＳ８９／０５５５０）に詳細に記載されている。 昆虫細胞における生産を、昆虫の幼虫を感染させることにより行うこともでき る。例えば、本発明組み換えバキュロウイルスを痕跡量の野生型バキュロウイル スとともに与え、次いで、約２日後に血液リンパから蛋白を抽出することにより 、蛋白をヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）の幼虫において生産 させることができる。例えば、Millerら,ＰＣＴ／ＷＯ８８／０２０３０参照。 本発明新規蛋白を、ＥＰ−Ｓ−０２７８９４１においてＣＳ蛋白に関して記載 されているように酵母細胞において発現させてもよい。 また本発明は、ＯｓｐＧまたはそのフラグメントもしくは誘導体を含むワクチ ン組成物に関する。 本発明ワクチンにおいて、蛋白水溶液を直接用いることができる。別法として 、前以て凍結乾燥した、あるいはしていない蛋白を、種々の既知アジュバントの いずれかと混合または吸着させることもできる。かかるアジュバントは水酸化ア ルミニウム、ムラミルジペプチドおよびＱｕｉｌ Ａのごときサポニンを包含す る が、これらに限らない。特に好ましいアジュバントはＭＰＬ（モノホスホリルリ ピドＡ）および３Ｄ−ＭＰＬ（３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ）で ある。さらなる好ましいアジュバントはＱＳ２１として知られている。Ribi Imm unochemから、あるいは英国特許第２２２０２１１号開示の方法により３Ｄ−Ｍ ＰＬを得ることができ、ＱＳ２１をCambridge Biotechから、あるいは米国特許 第５,０５７,５４０号開示の方法により得ることができる。さらなる典型的な別 法として、蛋白をリポソームのごときマイクロカプセル中に封入することができ 、あるいは水中油エマルジョンと混合することができる。もう１つの典型的な別 法において、蛋白を、死滅ボルデテラ（Bordetella）または破傷風トキソイドの ごとき免疫刺激高分子と抱合させることができる。本発明の好ましい具体例にお いて、本発明抗原は他のボレリア（Borrelia）抗原、詳細にはＯｓｐＡを含有し ているであろう。 本発明蛋白を、ＢＣＧ、リステリア（Listeria）またはサルモネラ（Salmonel la）のごとき生きたベクターにより発現させ、かかるベクターを用いた生ワクチ ンとして処方してもよい。 ワクチン調合物は、一般的にはNew Trends and Development in Vaccines,Vol ler et al.(eds.),University Park Press,Baltimore,Maryland,1978に記載され ている。リポソーム中への封入はFullertonの米国特許第４,２３５,８７７号に より記載されている。高分子への蛋白の抱合は、例えば、Likhiteの米国特許第 ４,３７２,９４５号およびArmorらの米国特許第４,４７４,７５７号により開示 されている。 Ｑｕｉｌ Ａの使用はDalsgaard et al.,Acta Vet Scand,18:349(1977)により 開示されている。 １回分のワクチンに存在する本発明蛋白の量を、典型的なワクチンにおける有 意な副作用を伴わずに免疫防御応答を誘導する量として選択する。どのような特 異的免疫原を用いるのか、およびワクチンがアジュバントと一緒にされているか 否かによって、かかる量は変更されるであろう。一般的には、１回分は１〜１０ ００μｇの蛋白、好ましくは１〜２００μｇの蛋白を含むであろうと考えら れる。対象中の抗体力価および他の応答の観察を包含する標準的研究によって個 々のワクチンに関する最適量を確認することができる。最初のワクチン接種後、 さらなる投与を対象に行ってその免疫応答を増強させてもよい。 また本発明はＯｓｐＧに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体に関す る。かかる抗体はライム病の診断および予防にも有用であることがわかる。 本発明の別の具体例において、本発明は、ＯｓｐＧ抗原を含む診断キットを提 供する。 Ｉ．材料および方法 Ｉ．１ ボレリア株 この研究に用いたビー・ブルグドルフェリ株はかつて記載されていたものであ る（４５）。ボレリアを改変Barbour-Stoenner-Kelly II（ＢＳＫ II）培地(２ )中、３３℃で増殖させた。１００００ｘｇ、４℃、２０分の遠心分離によりス ピロヘータを集め、ＰＢＳで２回洗浄し、暗視野顕微鏡により計数した。 ビー・ブルグドルフェリ発現ライブラリーの調製およびスクリーニング リゾチーム／ＳＤＳ法によりビー・ブルグドルフェリ株ＺＳ７からゲノムＤＮ Ａを調製し、超音波処理によりＤＮＡフラグメントを得た。アダプタークローニ ング法（７、３１）を用いて、平滑末端化したＤＮＡをｐＵＥＸ１ベクター中に 挿入した。連結したＤＮＡをイー・コリ ＭＣ１０６１中に形質転換し、次いで 、１０⁴個（およびそれ以下）のビー・ブルグドルフェリ（ＺＳ７）生物を接種 されたＤＢＡ／２マウスから取った免疫血清を用いて発現スクリーニングを行っ た。 １．２ サザンブロットハイブリダイゼーション 以前記載されたように（３２）、全ゲノムＤＮＡをボレリア生物から抽出した 。製造者（Boehringer,Mannheim）の推奨に従って、１００Ｕの制限ヌクレアー ゼ（ＨｉｎｄIII）で約５μｇのＤＮＡを消化した。試料を０.７％アガロースゲ ル を用いる電気泳動に供した。ＤＮＡフラグメントをHybond^TM-Nナイロン膜（Amer sham）に移し、次いで、ＵＶ架橋し、ハイブリダイゼーションを行った。簡単に 説明すると、０.５Ｍ ＮａＨＰＯ₄／７％ ＮａＤｏｄＳＯ₄、ｐＨ７.２中、６ ５℃で一晩、³²Ｐ標識プローブのハイブリダイゼーションを行った。４０ｎＭ ＮａＨＰＯ₄／１％ＮａＤｏｄＳＯ₄、ｐＨ７.２中、室温で３０分洗浄後、乾燥 した膜について増強スクリーンを用いるKodak XAR-5フィルム上で、−８０℃に て１２時間オートラジオグラムを行った。ハイブリダイゼーションプローブとし て、ＬＡ７コーディング領域を含む５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを用いた。 対象とする遺伝子フラグメントを低融点アガロースゲルから回収し、エタノール 処理により沈殿させ、次いで、記載されたようにランダムプライム反応により放 射性標識した。 Ｉ．５ ゲル電気泳動 Laemmli（２１）による１次元ＳＤＳ／ＰＡＧＥスラブゲルによる電気泳動の ために、４０μｌの各溶解物（約１０⁸個の生物と同等）を１０μｌの５ｘ試料 バッファーと混合した。 O'Farrel（２９）により記載されたようにして、第１次元においてＩＥＦ（Ph armacia/LKBアンフォライト：１.４５％ ｐＨ３.５〜１０、０.１％ ｐＨ２. ５〜４.０、０.２％ ｐＨ４〜６、０.２％ ｐＨ９〜１１）を用いて２次元ポ リアクリルアミドゲル電気泳動を行った。１次元ゲル電気泳動の場合と同量の溶 解物を適用した。ゲルを銀染色するかまたはウェスタンブロッティング（１５） 用に処理した。 Barbourら（２０）の方法に従って、プロテイナーゼＫ（Boehringer-Mannheim ,ドイツ）を用いる表面蛋白分解を行った。次いで、蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥに より分離し、イムノブロッティングにより個々の抗原を同定した。 Ｉ．６ ウェスタンブロッティング ２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、製造者の推奨に従って、セミドライ燥電気ブロッ ティングチャンバ（BIO-RAD,ミュンヘン，ドイツ）を用い、定電流（６０ｍＡ） で１時間、Hybond Cニトロセルロースシート（Amersham）上に蛋白を電気ブロッ ティングした。ブロッキングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、５％脱脂乾燥乳）中で一晩インキュベーション後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％乾燥乳、０.２％ツイン２０中 のマウスおよびヒト抗血清の１：１００（ｖ／ｖ）希釈物、あるいはマウスｍＡ ｂｓ（ＬＡ７）培養上清とともにイムノブロットを室温で２時間インキュベーシ ョンした。ニトロセルロースフィルターを希釈バッファーで５回洗浄し、アルカ リホスファターゼ抱合ヤギ・抗−ウサギ抗血清（Dianova,ハンブルグ，ドイツ、 １：４００ ｖ／ｖ）とともにさらに１時間インキュベーションした。ブロット を上記バッファーで４回洗浄し、ＴＢＳで２回洗浄し、次いで、基質として５− ブロモ−４−クロロ−３−インドールホスフェート（ＢＣＩＰ,Sigma；１６５μ ｇ／ｍｌ）およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ,Sigma：３３０μｇ／ｍ ｌ）を補足した２０ｍｌのＤＥＡバッファー（０.１Ｍ ジエタノールアミン（S igma）、０.０２％ ＮａＮ₃、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ９.０）を添加すること により免疫反応性バンドを可視化した。膜を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ ０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄することにより反応を停止した。 Ｉ．７ ＤＮＡ配列 ｐＵＥＸ１プラスミド（Amersham）中にクローン化されたビー・ブルグドルフ ェリのゲノムＤＮＡフラグメントを、製造者の推奨に従って、T⁷Sequencing kit （Pharmacia）を用いることにより配列決定した。 Ｉ．８ アミノ酸配列分析 ＨＵＳＡＲソフトウェアを用いることにより蛋白配列の並置比較および系統樹 構築を行った。 Ｉ．９ 抗体蛍光法 ビー・ブルグドルフェリ生物をＰＢＳ中で２回洗浄し、付着スライド（Superi or,Bad Mergentheim,FRG）上に移し（スピロヘータ１ｘ１０⁵個／反応フィール ド）、無水エタノールで固定し（２分、−２０℃）、次いで、風乾した。固定さ れたスピロヘータを希釈された個々のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）とともに インキュベーションし、スピロヘータをフルオレセインイソチオシアネートとと もに加湿チャンバ中で３０分インキュベーションした。ＰＢＳ中で３回洗浄後、 蛍光顕微鏡を用いて調製物を試験し、４００ＡＳＡ白黒フィルム（HP5;Illford, 英国）を用いて写真に取った。 Ｉ．１０ 抗体蛍光法 ビー・ブルグドルフェリ生物をＰＢＳ中で２回洗浄し、付着スライド（Superi or,Bad Mergentheim,FRG）上に移し（スピロヘータ１ｘ１０⁵個／反応フィール ド）、無水エタノールで固定し（２分、−２０℃）、次いで、風乾した。固定さ れたスピロヘータをＰＢＳ中で希釈された個々のｍＡｂｓとともに加湿チャンバ 中で３０分インキュベーションした。ＰＢＳ中で３回洗浄後、フルオレセインイ ソチオシアネート標識ヤギ・抗−マウス免疫グロブリン抗血清（Medac,ハンブル グ，ドイツ）とともにスピロヘータを暗加湿チャンバ中で３０分インキュベーシ ョンした。ＰＢＳで３回洗浄後、蛍光顕微鏡を用いて調製物を試験し、４００Ａ ＳＡ白黒フィルム（HP5;Illford,英国）を用いて写真に取った。 ＥＬＩＳＡ 以前記載されたようにして（１５）ビー・ブルグドルフェリＢ３１抗原を用い る固相ＥＬＩＳＡ系においてビー・ブルグドルフェリ特異的抗体を測定した。 ２．１ ｏｓｐＧ遺伝子の一部分についてのＰＣＲ増幅 疎水性リーダーペプチドをコードしている配列を欠くｏｓｐＧ遺伝子を、オリ ゴヌクレオチドプライマー （ヌクレオチド６１から７９に対応）および （ヌクレオチド５６０から５９０に対応）を用いてＰＣＲ増幅した。プラスミド ｐＺＳ７ ＤＮＡを、DNA Thermal Cycler（Bio-Med60）における３０サイクル のＰＣＲに供した。９４℃で６０秒変性を行い、４８℃で９０秒アニーリングを 行い、次いで、７２℃で９０秒伸長を行った。増幅フラグメントをグルタチオン Ｓトランスフェラーゼ遺伝子とフレーム中で結合し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ Ｉでの消化後ｐＧＥＸ−２Ｔベクター中に挿入し、ＤＨ５α宿主細胞の形質転換 に使用した。 ２．２ 組み換えＯｓｐＧの発現および精製 イー・コリＤＨ５αにおけるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ＯｓｐＧ 融合蛋白の発現、アフィニティー精製、および融合蛋白のエンドペプチダーゼス ロンビン開裂を、製造者（Pharmacia）の推奨に従って行った。 ２．３ ［³Ｈ］パルミテート標識およびトリトンＸ−１００相分配 切断（ｐＯｓｐＧ）バージョンのｏｓｐＧ遺伝子の全長（ｐＺＳ７７）を有す るプラスミドで形質転換したイー・コリ生物を［９,１０−（ｎ）−³Ｈ］パルミ チン酸（比活性約５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Amersham）存在下で増殖させ、以前記載 されたようにして（４６）放射性標識したリポ蛋白をトリトンＸ−１１４相分配 により抽出した。 ２．４ 免疫血清の生成および血清学 前以て１０⁸個（Ｃ.Ｂ−１７；ＩＳ抗−１０⁸）または１０³個（ＤＢＡ／２； ＩＳ抗−１０³）のＺＳ７株の生きたビー・ブルグドルフェリスピロヘータを尾 に接種され、あるいはアジュバント（ＡＢＭ２；Sebac,アイデンバッハ,ドイツ ）中の５〜１０μｇの脂質結合した（lip）ＬｉｐＯｓｐＡ（ＢＡＬＢ／ｃ；Ｉ Ｓ抗−ｌｉｐＯｓｐＡ）もしくは組み換え（rec）ｒｅｃＯｓｐＧ（ＢＡＬＢ／ ｃ；ＩＳ抗−ｒｅｃＯｓｐＧ）を皮下注射することによりプライムされ、次いで 、１０日後および２０日後に追加免疫されたたマウスから免疫血清を得た。以前 記載されたようにして（３９）、全スピロヘータ溶解物（ボレリア・ブルグドル フェリ（Ｂ.ｂ.）Ｉｇ）またはｒｅｃＯｓｐＡ（ＯｓｐＡ Ｉｇ）またはｒｅｃ ＯｓｐＧ（ＯｓｐＧ Ｉｇ）のいずれかに対するスピロヘータ特異的免疫グロブ リン（Ｉｇ）量に関してすべての血清をＥＬＩＳＡにより分析した。 ２．５ 防御実験 ＳＣＩＤマウスを未処理のままとするか、または正常マウス血清（ＮＭＳ）も しくは貯留された免疫血清（ＩＳ）のいずれかで再構築した。個々のＩＳととも に移されたスピロヘータ特異的ＩＧ量（ビー・ブルグドルフェリ全細胞溶解物に 関するＥＬＩＳＡ）は以下のとおり：ＩＳ抗−１０⁸,４.４μｇ Ｉｇ／マウス； ＩＳ抗−１０³,４.５μｇ／マウス；ＩＳ抗−ｌｉｐＯｓｐＡ,５μｇ／マウス； ＩＳ抗−ｒｅｃＯｓｐＧ,７２ｎｇ／マウス。ｒｅｃＯｓｐＧについて試験した 場合、特異的Ｉｇ量は、ＩＳ抗−１０³と比較すると、ＩＳ抗−ｒｅｃＯｓｐＧ 中で約１０〜２０倍多かった。ＩＳを腹腔内注射し、１時間後、レシピエントを １０⁵個のスピロヘータ（ビー・ブルグドルフェリＺＳ７）で攻撃した。盲検条 件下での臨床的な関節炎の発生について、そして以前記載されたようにして（３ ７、４０）耳の生検をＢＳＫ培地で培養することによりスピロヘータの存在につ いて、マウスを調べた。 ２．６ 病理学 脛足根関節における臨床的な関節炎の発生を、以前記載されたようにして（３ ７、４０）盲検条件下でモニターした。用いた評点は以下のとおり：＋＋,重症 ；＋,あまり重症でない；(＋),中程度；＋／−,軽度の腫れ；（＋／−）, 最小限の腫れで赤みを帯びている；−,関節炎の臨床的徴候なし。 結果 ＯｓｐＧのクローニングおよび組み換え構築物の分析 前以て１０³個のスピロヘータ（ＩＳ抗−１０³）に感染したマウス由来の免疫 血清を用いてビー・ブルグドルフェリＺＳ７ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーをス クリーニングした。以前、このＩＳはＯｓｐＡおよびＯｓｐＢに対する抗体を欠 くが、引き続いて起こる感染に対してＳＣＩＤマウスに防御をもたらすことが示 されていた（３５）。さらにそのうえ、このＩＳは、２次元ゲル電気泳動により 分離されたＺＳ７株の全細胞溶解物からのイムノブロットにより試験した場合、 相対分子量１９〜２０ｋＤａの４つの個々の蛋白および約４０ｋＤａの２つの蛋 白を認識した。約２０個のクローンは１のクローンであると同定され、ｐＺＳ７ ７と命名され、特に反応性が高かった。組み換えプラスミドｐＺＳ７７を制限分 析に供し、サブクローン化し、配列決定した。ＯｓｐＧの推定アミノ酸配列とと もにＯｓｐＧのヌクレオチド配列を図１に示す。コンセンサスリボゾーム結合部 位（ＧＧＡＧ）は、ｏｓｐＧ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの１０ｂｐ上流に存在す る。この翻訳開始配列のさらに上流には、位置−７０ないし−６４に−１０領域 （ＴＡＴＡＴＴ）、および位置−１０５ないし−１００に−３５領域（ＴＴＧＴ ＴＡ）がある。配列ＡＴＡＴＴＴおよびＴＴＡＣＡＴＴＴを伴う２つの短い逆の 反復がこの上流領域の位置−１１８ないし−４９に含まれている。ｏｓｐＧ遺伝 子の位置＋１のＡＴＧスタートコドンの後には５８８個のヌクレオチドの読み枠 が続いており、それは分子量２２,０４９と計算される１９６個のアミノ酸の蛋 白に対応する。可能なｒｈｏ−非依存的ターミネーターが位置６２０と６５６と の間に同定された。ｏｓｐＧ遺伝子のＡＴＧスタートコドンの上流のＤＮＡ配列 を、最近報告されたｏｓｐＥ−ｏｓｐＦオペロンのプロモーター領域と並置比較 すると、ＧＡＰアルゴリズムにより決定されるように９４％の同一性が明らかと なる。ｏｓｐＧプロモーターは２つの非常に保存された８量体ＤＮＡモチーフＡ ＴＧＴＡＴＴＴ（位置−１８７ないし−１８０）およ びＡＡＴＴＡＣＡＴ（位置−１２０ないし−１１３）を含み、それらはＭＡＴα ２と命名された負のレギュレーター分子に対する蛋白結合部位に結合し、酵母の 分裂の間の遺伝子発現を調節することが以前に示されていることに注意（５、２ ５）。これらのＤＮＡモチーフは、２つのサッカロマイセス・セレビシエ（Sacc haromyces cerevisiae）遺伝子ＭＦα２およびＢＡＲ１の上でそれぞれ同定され ており、免疫グロブリン８量体モチーフＡＴＴＴＧＣＡＴに類似のモチーフの不 完全な逆の反復を含む。最も興味深いことには、さらなる免疫グロブリン（Ｉｇ ）８量体様配列ＡＴＴＴＧＣＡＡ（位置−１５４ないし−１４７）が両方のエス ・セレビシエ様モチーフの間に存在し、たった１個のトランジション置換により Ｉｇ−８量体モチーフと異なっている。 ＯｓｐＧのアミノ酸配列分析 ＯｓｐＧのヒドロパシーのプロフィールは、該蛋白が非常に親水的であり、ア ミノ末端部分に約２０個のアミノ酸の１つの疎水的ドメインを有することを示唆 する。このＮ−末端領域は、典型的な原核細胞のリポ蛋白に存在するリーダーシ グナルペプチド（５１、５２）に類似していることが明らかである。シグナル配 列のＣＯＯＨ−末端において、推定上のシグナルペプチダーゼII認識モチーフＬ ｅｕ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｃｙｓ（図３ａ）が存在する。ＯｓｐＧ中の可能な開裂部位 は位置１９のセリンと位置２０のシステインとの間に存在する。計算された等電 点はｐＩ ５.２である。ＯｓｐＧのアミノ酸配列とすべての既知ビー・ブルグド ルフェリ外表面蛋白ＯｓｐＡ〜ＯｓｐＦの配列との比較により、ＯｓｐＦとの最 高の相同性が明らかである（６５％）。さらにそのうえ、ＯｓｐＧの塩基性Ｎ− 末端ペプチドモチーフＭ−Ｎ−Ｋ−Ｋ−ＭはＯｓｐＥおよびＯｓｐＦのものと同 じである。 ＯｓｐＧのマッピング いくつかのビー・ブルグドルフェリ株のプラスミドおよび染色体ＤＮＡを、パ ルス−フィールドゲル電気泳動により分離し、ｏｓｐＡおよびｏｓｐＧ特異的プ ローブとハイブリダイゼーションさせた。我々は、ドイツのビー・ブルグドルフ ェリ単離体ＺＳ７に関して、ｏｓｐＡ含有プラスミドのサイズを５３ｋｂと推定 した。ＡＣＡ−１株のｏｓｐＡ含有プラスミドは、ゲルに負荷したＤＮＡ量が少 ないことによりほとんど見ることができなかったが、露出を延長した後に見られ た（データ示さず）。ｏｓｐＧプローブを用いると、約４８ｋｂの直鎖状プラス ミドに伴って主要バンドが見られ、さらにＺＳ７株の４５ｋｂのプラスミドに伴 って弱いバンドが見られた。対照的に、アメリカのＢ３１株においては、４５ｋ ｂおよび約３５ｋｂのサイズの２つのプラスミドがｏｓｐＧ遺伝子プローブとハ イブリダイゼーションした。ビー・ガリニイ（B.garinii）ＺＱ１株および２０ ０４７株、並びにビー・ジャポニカ（B.japonica）Ｈ０１４株からのゲノムＤＮ Ａを用いた場合にはハイブリダイゼーションが観察されなかったことに注意。対 照実験において、ＺＳ７由来のｏｓｐＥ−ｏｓｐＦプローブを用いて、これらの ゲノムＤＮＡを用いて異なるバンドが観察されうるかどうかを調べた。この実験 により、ＺＳ７、Ｂ３１、２００４７および２１０３８株について４５ｋｂおよ び３５ｋｂの２つのプラスミドが明らかとなった。ビー・コリアセアエ（B.cori aceae）Ｃｏ５３、ビー・ヘルムシイ（B.hermsii）およびビー・ツリカタエ（B. turicatae）のごとき他のボレリア種、およびトレポネマ・パリドゥム（Trepone ma pallidum）から単離したＤＮＡはｏｓｐＧプローブとハイブリダイゼーショ ンせず、種ビー・ブルグドルフェリに関する特異性が示された。 ｏｓｐＧ遺伝子のＲＦＬＰ エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIを用いるｏｓｐＧに関する制限フラグメント 長多型性（ＲＦＬＭ）分析により、試験した２０種のビー・ブルグドルフェリ単 離体において少なくとも７種の異なるハイブリダイゼーションパターンが明らか となった。ビー・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト（B.burgdorferi sens u stricto）単離体の大部分は１.８および３.８ｋｂの２つのハイブリダイゼー ションフラグメントにより特徴づけられ（図６、レーン１）；試験した６種のビ ー・ガリニイのうち３種はｏｓｐＧプローブとハイブリダイゼーションせず、 ビー・ガリニイ２００４７株およびＳ９０株はそれぞれ１.８ｋｂおよび１.７ｋ ｂおよび３ｋｂのフラグメントを示し（データ示さず）；種ビー・アフゼリイ（ B.afzelii）においては少なくとも３つの異なるハイブリダイゼーションパター ン：ＡＣＡ−１株については２.４ｋｂの１本のバンド（レーン３）、そしてＭ ＭＳ株については１.９および２ｋｂの２本のバンド（レーン４）、あるいはＮ Ｅ４０株については２および５ｋｂの２本のバンド（レーン５）が観察された。 イー・コリにおけるＯｓｐＧ組み換え蛋白の発現 ＰＣＲによりＯｓｐＧを増幅するために、最終組み換え生成物がリーダーペプ チドを含む２０個のアミノ酸残基（４６）を欠くようにプライマーを選択した。 増幅されたＯｓｐＧコーディング生成物を発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Pharma cia,フライブルク，ドイツ）のキャリア蛋白に関してフレーム中に挿入し、ＩＰ ＴＧで誘導後、約４４ｋＤＡのＧＳＴ−ＯｓｐＧ融合蛋白を得た。グルタチオン −アガロースビーズを用いることによりＧＳＴ−ＯｓｐＧ融合蛋白をイー・コリ 溶解物から豊富化し、部位特異的プロテアーゼを用いて、結合したＧＳＴ−Ｏｓ ｐＧ融合蛋白の引き続いての消化を行った。 ［³Ｈ］パルミテート標識 イー・コリＤＨ５αにおいてＯｓｐＧがリポ蛋白として発現されているかどう かを調べるために、細胞をプラスミドｐＺＳ７７またはｐＯｓｐＧのいずれかで 形質転換し、［³Ｈ］パルミテートで標識した（図８）。プラスミドｐＺＳ７７ は、正常なＮ−末端シグナルペプチドを伴った全長のＯｓｐＧ前駆体蛋白をコー ドしているが、ｐＯｓｐＧは、ＯｓｐＧ前駆体の最初の２１個の残基が配列Ｍｅ ｔ−Ｌｙｓで置き換えられた蛋白を示す。界面活性剤相分配による抽出およびＳ ＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後、放射性生成物をフルオログラフィーにより可視 化した。全長のｏｓｐＧ遺伝子（プラスミドｐＺＳ７７）を含むイー・コリ細胞 は、界面活性剤相中に分配する２０ｋＤａのリポ蛋白を発現したが、リポ蛋白は 切断されたｏｓｐＧ遺伝子を含むＤＨ５α細胞においては観察できなかった。 ＯｓｐＧの細胞内局在化 無傷の生物スピロヘータにおけるＯｓｐＧの細胞内局在化を調べるために、ス ピロヘータをプロテイナーゼＫで処理し、次いで、発現ライブラリーからｏｓｐ Ｇ単離するのに用いられる抗−１０³血清を用いるイムノブロッティングにより 分析した。抗−１０³免疫血清により４つの低分子蛋白が検出され、それらは蛋 白分解後に部分的に消失したが、約４０ｋＤａの範囲の分子量の２つの構造はプ ロテイナーゼ処理（１７）により影響されなかった。ｒＯｓｐＧが抗−１０³血 清によって認識されるかどうかを調べるために、ウェスタンブロッティングを行 った。抗−１０³血清とのｒＯｓｐＧとの吸着の後、吸着した抗−１０³血清によ りサイズが同じである同じ主要蛋白が認識され（図７Ａ）、インビトロ培養され たＺＳ７からの溶解物中に含まれる低分子蛋白中にはＯｓｐＧは存在することが できないか、あるいは、ＯｓｐＧの蛋白分解が起こりうることが示された。Ｏｓ ｐＧの同一性を確認し、ＯｓｐＧがインビトロ培養されたビー・ブルグドルフェ リＺＳ７において発現されうるかどうかを調べる目的では、高度免疫ネズミ・抗 −ｒＯｓｐＧ血清は、１０⁹個のインビトロ培養されたＺＳ７生物からのＯｓｐ Ｇを検出しなかった。いくつかの実験において、予期されない弱い反応性が４０ ｋＤａポリペプチドに関して観察され、それはＯｓｐＧ変種であるか、またはい くつかのエピトープをＯｓｐＧと共有しているビー・ブルグドルフェリ蛋白を示 すかのいずれかである可能性がある。インビトロ培養されたビー・ブルグドルフ ェリＺＳ７からのｏｓｐＧ遺伝子の発現を評価するために、全ＲＮＡを単離し、 ノーザンブロット分析によりｏｓｐＧ転写物の存在について分析した。インビト ロ発現およびＲＮＡ分解の対照として、ＮＣフィルターをｏｓｐＡ遺伝子プロー ブで探索した。単一の約２ｋｂの転写物に結合したｏｓｐＡプローブとは対照的 に、ｏｓｐＧプローブはｏｓｐＧ転写物を検出しなかった。これらの結果は、イ ンビトロ培養の間におけるＯｓｐＧ発現不足は、ｍＲＮＡ安定性に対するｏｓｐ Ｇ転写レベルにあると思われる。ＯｓｐＧはインビトロ培養されたビー・ブルグ ドルフェリＺＳ７からの溶解物において検出できないが、ＯｓｐＧの発現 は哺乳動物宿主中での増殖の間においては異なっている可能性がある。ヒト・ラ イム病患者および実験的に感染させられたマウスの両方からの試料典型的な血清 試料を用いるイムノブロット分析により、ＯｓｐＧに特異性を有する抗体が存在 したことが明らかとなった。ライムボレリオシス（Lyme borreliosis）であるこ とが実証されている患者からの１３種の血清試料のうち６種が、抗−ＯｓｐＧ抗 体を含むことが示された。対照的に、健康なドナー（ｎ＝８）からのすべての血 清は、ｒＯｓｐＧを認識する抗体を含まなかった（データ示さず）。これらの知 見は、ＯｓｐＧは感染の過程においてのみ発現されることを示唆する。 抗−ＯｓｐＧ免疫血清によるＳＣＩＤマウスの部分的防御 抗−ＯｓｐＧ免疫血清の防御能を試験するために、ＳＣＩＤマウスを下記量の 貯留されたＩＳ（免疫血清）調製物由来のビー・ブルグドルフェリ特異的Ｉｇで 処理した：Ｃ.Ｂ.−１７ ＩＳ抗−１０⁸（４.４μｇＢ.ｂ．Ｉｇ／マウス）、Ｄ ＢＡ／２ ＩＳ抗−１０³（４.５μｇＢ.ｂ．Ｉｇ／マウス）、ＢＡＬＢ／ｃＩＳ 抗−ｌｉｐＯｓｐＡ（５μｇＢ.ｂ.Ｉｇ／マウス）、およびＢＡＬＢ／ｃ ＩＳ 抗−ｒｅｃＯｓｐＧ（７２μｇＢ.ｂ.Ｉｇ／マウス）。しかしながら、ＩＳ 抗 −ｒｅｃＯｓｐＧは、ＩＳ 抗−１０³と比較すると、ｒｅｃＯｓｐＧに対する抗 体を１０倍より多く含んでいた。上記ＩＳのいずれかをＳＣＩＤマウスに腹腔内 注射し、次いで、１０⁵個のビー・ブルグドルフェリ生物で攻撃した。臨床的関 節炎の発生および耳の生検におけるスピロヘータの存在をモニターした。接種さ れたが未処理のＳＣＩＤマウス、あるいは正常マウス血清（ＮＭＳ）で処理され たＳＣＩＤマウスについては、接種６日目から開始する臨床的関節炎が発生し、 脛足根関節の重い腫れが１３日目から２４日目（終了時）の間に発生した。上記 のごとくＩＳ 抗−１０⁸またはＩＳ 抗−１０³およびＩＳ 抗−ｌｉｐＯｓｐＡ で受動免疫されたＳＣＩＤマウスは、臨床的関節炎を示さないかまたは最小限の 徴候を示した。対照的に、ＩＳ 抗−ｒｅｃＯｓｐＧで受動免疫されたＳＣＩＤ マウスについては、６日目から１８日目の間の穏やかな腫れの発生により示され るように関節炎の発生はわずかに抑えられた。期間の 後半において、これらのマウスはより重い形態の関節炎を発生し、感染抑制に関 してこのＩＳは他のＩＳよりも有効でないことが示された。ＩＳ 抗−ｒｅｃＯ ｓｐＧは、ｒｅｃＯｓｐＧに対する抗体をＩＳ 抗−１０³よりも１０倍より多く 含んでいるがあまり防御的でないという事実は、ＩＳ 抗−１０³における感染抑 制に対するさらなる特異性の貢献を示唆する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヴァリッヒ，ラインハルト ドイツ連邦共和国デー−69120ハイデルベ ルク、イム・ノイエンハイマー・フェルト 280番 デパートメント・アプライド・イ ムノロジー、ジャーマン・キャンサー・リ サーチ・センター (72)発明者 ズィーモン，マルクス・エム ドイツ連邦共和国デー−79108フライブル ク、シュトゥーベヴェーク51番 マック ス・プランク・インスティトゥート・フュ ーア・イムーンビオロギー (72)発明者 クラマー，ミヒャエル・デー ドイツ連邦共和国デー−69120ハイデルベ ルク、イム・ノイエンハイマー・フェルト 305番 ウニヴェルズィテート・ハイデル ベルク、インスティトゥート・フューア・ イムノロギー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ビー・ブルグドルフェリ由来の精製ＯｓｐＧ、またはその免疫学的機能の ある誘導体。 ２．見かけの分子量２２ｋＤａ、等電点約５．２を有し、１９６個のアミノ酸 を有することを特徴とするビー・ブルグドルフェリ由来の精製ＯｓｐＧ、または その免疫学的機能のある誘導体。 ３．実質的に図１に示されるビー・ブルグドルフェリ由来の精製ＯｓｐＧ。 ４．図１に示されるアミノ酸配列に関して少なくとも８０％の相同性を有する 請求項３記載の精製ＯｓｐＧ。 ５．医薬に用いる上記請求項記載の精製ＯｓｐＧ。 ６．請求項１ないし４のいずれかに記載の精製ＯｓｐＧを含むワクチン組成物 。 ７．さらに、さらなるビー・ブルグドルフェリ抗原を含む請求項６記載のワク チン組成物。 ８．さらに、ボレリア由来のＯｓｐＡ抗原を含む請求項６記載のワクチン組成 物。 ９．さらに、ＱＳ２１または３Ｄ−ＭＰＬを含む請求項６〜８のいずれかに記 載のワクチン組成物。 １０．ライム病にかかっている、あるいはライム病に感受性のある患者の免疫 予防的または免疫治療的処置のためのワクチンの製造のための請求項１ないし４ 記載のＯｓｐＧ抗原の使用。 １１．有効量の請求項６〜９記載の組成物を投与することを含む、ライム病に かかっている、あるいはライム病に感受性のある患者の処置方法。 １２．請求項１ないし４に記載のＯｓｐＧ蛋白またはその免疫学的機能のある 誘導体をコードする単離ＤＮＡ配列。 １３．実質的に図１に示される配列を有することをさらに特徴とする請求項１ ２記載のＯｓｐＧ蛋白をコードする単離ＤＮＡ配列。 １４．請求項１２ないし１３に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。 １５．請求項１２または１３のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。 １６．請求項１４の発現ベクターで細胞を形質転換し、細胞を培養し、次いで 、生じた蛋白を単離することを含む請求項１ないし４記載の精製ＯｓｐＧの製造 方法。 １７．該ＯｓｐＧまたはその免疫学的機能のある誘導体を医薬上許容される賦 形剤と混合することを含む請求項１ないし４のＯｓｐＧを含むワクチンの製造方 法。 １８．ビー・ブルグドルフェリ由来のＯｓｐＧを含む診断キット。