JPH08509461A

JPH08509461A - ポリペプチドを固定化するための支持体及び方法

Info

Publication number: JPH08509461A
Application number: JP6516207A
Authority: JP
Inventors: ボイド，ヴィクトリア，リー; ユアン，パウ−ミアゥ
Original assignee: パーキン―エルマーコーポレーション
Priority date: 1993-01-11
Filing date: 1994-01-05
Publication date: 1996-10-08
Also published as: EP0677058A4; EP0677058A1; US5602207A; AU6083794A; US5717075A; WO1994015948A1

Abstract

(57)【要約】ポリペプチドの固定化と配列分析のための固体支持休と方法。ひとつの局面では、本発明はポリペプチドを固体支持体に固定化する方法にある。本方法では、表面結合カルボン酸基を有する固体支持体がイソオキサゾリウム塩と反応し活性化支持体を形成する。活性化支持体を洗浄して残りのイソオキサゾリウム塩と塩基を除いた後、支持体を乾燥させる。乾燥した支持体を次に支持体にポリペプチドを共有結合するために有効な条件下にポリペプチドと接触させる。固定化したポリペプチドはＮ−およびＣ−末端配列決定法により都合良く配列決定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】ポリペプチドを固定化するための支持体及び方法発明の技術分野本発明はポリペプチドを固定化するための固体支持体および方法、そして特に、ポリペプチド配列決定に使用するための固体支持体および方法に関するものである。参照文献アエバーソルドアールエイチら（1988）Biochem．27(18):6860-6867。アレンジイ（1981）Sequencing of Proteins and Peptides：Elsevier Scie nce Publishers、オランダアムステルダム。ブリジェンジェイ（1975）FEBS Lett．35:97-102。コウルジェイエムら（1991）Anal Biochem．194:110-120。ディアスエイジェイら（1987）Macromolecules 20:2074-2075。フィンドレイジェイビイシイとゲイソウエムジェイ著（1989）Prot ein Sequencing：A Practical Approach IRL Press、イギリスオツクスフオード。ラウルセンアールエイとマッハレイトダブリュ（1980）In：Methods of Biochemical Analysis 26:201-284。リーケイダブリュら（1987）Macromolecules 20:1437-1439。マツダイラピイ（1987）J．Biol．Chem．262:10035。ウッドワードアールビイとオロフソンアールエイ J．Am．Chem．Soc.83 :1007（1961）83:1007-1009；Tetrahedron Suppl．No.7（1966）pp．415-440 。発明の背景固相ペプチド配列決定において、ポリペプチドは固体支持体上に固定化し、ポリペプチドのＣ−またはＮ−末端からのアミノ酸残基を放出しそして同定するために一連の化学反応が連続的に行われる（コウル）。Ｎ−末端配列決定のための最も広く使用される方法は、エドマン分解として知られている工程で、ポリペプチドのＮ−末端アミノ基にフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を反応させることを含む（エドマン）。ＰＩＴＣと末端アミノ基の反応はフェニルチオウレア基を付加し、環化し、分裂し、Ｎ−末端アミノ酸の遊離アニリノチオゾラノン（ＡＴＺ）と短鎖ペプチドを生成する。Ｎ−末端アミノ酸のＡＴＺ誘導体は分離され、対応するフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）に転化し、そして高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で同定される。次に配列決定は次の位のＮ−末端残基を遊離アミノ酸ＰＴＨに連続的に転化し、そして各連続的に分離されたアミノ酸を同定して行われる。この方法は一般的に約２０〜４０までのアミノ酸残基の配列決定に信頼性があり、容易に自動化装置で行われる。現時点で、大抵のＣ−末端配列決定はＣ−末端チオヒダントイン（ＴＨ）またはチオヒダントイン類似誘導体の生成を含む。一つのアプローチとして、ポリペプチドのＣ−末端カルボキシル基はイソチオシアネート（ＩＴＣ）塩または酸の存在下に無水酢酸を用いて活性化され、Ｃ−末端ＩＴＣ中間体を経由してＣ−末端チオヒダントインを生成する（スターク）。このＣ−末端チオヒダントインはポリペプチドから分裂することができ、短鎖のペプチドとＣ−末端アミノ酸残基のチオヒダントイン誘導体を生成する。この誘導体は分離して、例えばＨＰＬＣで同定することができる。２つの一般的なアプローチが配列決定のための固体支持体上にポリペプチドを固定化するために用いられた。１つのアプローチでは、ポリペプチドは支持体上の反応性基を経て支持体に共有付加によって固定化される。Ｎ−末端配列決定のため、Ｃ−末端カルボン酸基は、カルボニルジイミダゾールまたはカルボニルジイミドのような活性化試薬と反応させ、続いて支持体結合アミノ基と結合させることができる（ラウルセン）。内部残基の側鎖基を経ての共有付加もまた可能である（フィンドレイおよびゲイソウ、1989）。Ｎ−末端配列決定のために、ＤＩＴＣ−活性化ガラスが一般に使用され、そこでは支持体結合イソチオシアネート基はポリペプチドアミノ基（すなわち、リシルε−アミノ基）と反応しポリペプチドと安定なチオウレア結合を形成する（ブリドゲン）。またポリペプチドのα−アミノ基は支持体と反応できるが、そのような結合（α−アミノ基との）はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて解裂できる（アレン、1981）。活性化支持体を用いた共有付加は支持体上の本質的に耐久性のポリペプチドの固定化の利点を与え、これにより試料の流失を最小にする。しかし活性化支持体は水によって不活性化されやすい傾向がある。従って、ポリペプチド試料は支持体上に固定化する前に特別の無水溶媒（例えばアセトニトリル）に溶解しなければならない。更に、活性基が経時的に劣化するで、しばしば固定化の効率は一定しない。第２のアプローチでは、ポリペブチドは非共有結合的に固定化される。気体一液体固相配列決定法では、例えば、試料は一般的にはポリペプチドとのイオン的および水素結合的相互作用によってメンブラン型の支持体の中に引っ張り込まれる。他のタイプの支持体も使用できるが、ガラス繊維支持体はこの応用では実用的であることを立証された。例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離された蛋白質はポリビニルデンジフロライド（ＰＶＤＦ）メンブラン上に直接に電気ブロットでき、目的の蛋白質を含むメンブランの一部を自動配列決定装置に直接充填できる（マツダイラ、1987）。非共有結合のための支持体は活性基の安定性の問題を回避するが、このような支持体は一般に小さなポリペプチドの保持に失敗する。固定化の効率と耐久性はしばしば、ポリペプチドの保持を高めるために支持体の表面にマトリックスを形成するポリブレン（ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ）のようなポリカチオン型キャリヤを支持体に加えて改良することができる。しかしながら、１つの欠点は、このようなマトリックスは一般に、試料を充填する前にマトリックスを被覆した支持体を複数の配列決定サイクルで処理し、配列分析中のアミノ酸の同定を妨げるような汚染物質をマトリックスから除くための予備循環が必要なことである。従って、このようなマトリックスの使用は配列決定のプロトコルを遅くさせる。理想的には、ポリペプチドの共有結合固定化のための活性化支持体はポリペプチドと容易に反応する必要がある。支持体はポリペプチド試料水溶液と適合性があり、長期間にわたり結合効果を失うことなく貯蔵ができなければならない。発明の概要１つの局面で、本発明は固体支持体上にポリペプチドを固定化するための方法に向けられる。本方法において、表面に結合したカルボン酸基をもつ固体支持体がイソオキサゾリウム塩と反応し活性化支持体を形成する。活性化支持体を洗浄し、残りのイソオキサゾリウム塩および塩基を取り除いた後、支持体は空気乾燥する。次に乾燥した支持体は、支持体にポリペプチドを共有結合により結合するに効果的な状態でポリペプチドに接触させる。１つの具体例では、固体支持体は、ポリペプチド中のカチオンチャージ基と非共有結合により結合するため、表面に結合したスルホネート基を含む。また、本発明は、ポリペプチド中の１あるいはそれ以上のアミノ基と反応する表面結合エノールエステル基を持つ、上記の方法で使用されるための固体支持体を含む。この支持体は水性ポリペプチド試料と適合性があり、固体化効率の減少なく、乾燥形態（すなわち、空気乾燥後）で長期間、例えば数ヶ月間貯蔵ができる。１つの好ましい具体例では、支持体はポリビニリデンジフルオリドメンブランからなる。更に、支持体は、上述のようにポリペプチド中のカチオンチャージ基と非共有結合により結合するために、表面結合スルホネート基を含むことができる。他の局面では、本発明は、今記述したタイプの固体支持体をメンブランにポリペプチドを結合するのに有効な条件下でポリペプチドと接触させる、ポリペプチドを固定化するための方法を含む。他の局面では、本発明は、ポリペプチド中のＮ−末端およびＣ−末端残基の配列位置を同定するための方法を含む。この方法では、Ｃ−末端カルボン酸基をもつポリペプチドを、メンブランに共有結合または非共有結合によりポリペプチドを固定化するのに有効な条件下に、表面結合エノールエステル基をもつポリビニリデンジフルオリドメンブランと接触させる。ポリペプチド固定化後、メンブランは１サイクルまたはそれ以上のエドマン分解を行い、結合したポリペプチド中の１個またはそれ以上のＮ−末端残基の配列を決定する。次に、同じメンブランを１サイクルまたはそれ以上のＣ−末端配列決定を行い、ポリペプチド中の１個またはそれ以上のＣ−末端残基の配列を決定する。本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の次の詳細な説明を図面との関連で読むと一層明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、アミノプロピル−（トリエトキシラン）との反応によるガラス固体支持体の改良を示す；図２は、無水コハク酸との反応による支持体結合アミノ基のカルボン酸基への転化を示す；図３は、ウッドワード試薬Ｋ（ＷＲＫ）を用いる支持体結合カルボン酸基の活性化カルボキシレート基（エノールエステル基）への転化を示す；図４は、本発明の反応性支持体へのポリペプチドカップリングを示す；図５Ａ−５Ｅは、本発明の反応性支持体（ＰＶＤＦ−メンブラン）上に固定化されたアポミオグロビンを用いる第１から第５までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図６Ａ−６Ｄは、本発明の反応性支持体（活性化ＰＶＤＦ−メンブラン）上に固定化されたリゾチームを用いる第１から第４までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図７Ａ−７Ｄは、本発明の反応性支持体（ＰＶＤＦ−メンブラン）上に固定化された１５残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を用いる第１から第４までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図８Ａ−８Ｄは、本発明の反応性支持体（ポリスチレン樹脂）上に固定化された１２残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を用いる第１から第４までのＣ −末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図９Ａ−９Ｄは、本発明の反応性支持体（ＣＰＧビーズ）上に固定化された１２残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を用いる第１から第４までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図１０Ａ−１０Ｄは、本発明の反応性支持体（ＣＰＧビーズ）上に固定化された１１残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を用いる第１から第４までのＣ −末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示し、ここでの固定化は有機溶液中で行った；図１１Ａ−１１Ｄは、反応性支持体（ＤＳＳ誘導化ＣＰＧビーズ）上に固定化された図１０Ａ−１０Ｄからの同じペプチドを用いる第１から第４までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ここでの固定化は有機溶液中で行った；図１２Ａ−１２Ｄは、図１０Ａ−１０Ｄでのペプチドおよび反応性支持体を用いる第１から第４までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示し、ここでの固定化はｐＨ６の水溶液中で行った；図１３Ａ−１３Ｃは、図１１Ａ−１１Ｄでのペプチドおよび反応性支持体（ＤＳＳ−誘導化ＣＰＧビーズ）を用いる第１から第３までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示し、ここでの固定化はｐＨ６の水溶液中で行った；図１４Ａ−１４Ｄは、使用前に乾燥形態で３ヶ月間貯蔵されていた反応性支持体（ポリスチレン）上に固定化した１２残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を用いる第１から第４までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図１５Ａ−１５Ｄは、使用前に乾燥形態で６ヶ月間貯蔵されていた反応性支持体（ＣＰＧビーズ）上に固定化した１２残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を用いる第１から第４までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図１６Ａ−１６Ｅは、使用前に乾燥形態で３ヶ月間貯蔵されていた反応性支持体（ＰＶＤＦメンブラン）上に固定化したアポミオグロビンを用いる第１から第５までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図１７は、本発明の反応性支持体（白棒）および、非カルボキシル化、非活性ＰＶＤＦメンブラン（黒棒）に固定化された１２残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）のＮ−末端配列決定のための配列決定サイクルに対する反応収率のプロットを示す。図１８Ａは、本発明の反応性支持体（ＰＶＤＦメンブラン）上に固定化したアポミオグロビンを用いる第１から第４までのＮ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示し；図１８Ｂは、図１８Ａに示されるＮ−末端配列決定の後、同じメンブランおよび同じ試料を用いて得られた第１から第４までのＣ−末端配列決定サイクルにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図１９は、ＷＲＫ−誘導エノールエステルの分子内転位を示す；図２０は、本発明の説明に用いられたペプチド配列を示す；発明の詳細な説明Ｉ．定義特に言及しない限り、下記の用語は次の意味をもつ： “活性化支持体”または“活性化固体支持体”とは、ポリペプチドと反応しポリペプチドと支持体間に共有結合を形成できる表面結合化学基をもつ固体支持体をいう。 “ポリペプチド”とは、ペプチド（アミド）結合により結合した多重アミノ酸残基をいう。ここで用いられるように、“ポリペプチド”は、例えばアポミオグロビンあるいはリゾチームのような蛋白質である非常に長鎖のポリペプチドと同様に、短いペプチド（すなわち、ペプチド２から２０個のアミノ酸残基）も含む。 “ペプチド”は２から約５０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドをいう。アミノ酸残基の省略形は当該分野で用いられる標準の３文字および／または１文字コードである。 II．本発明の一般的な特徴本発明は固体支持体上にポリペプチドを固定化するための方法を含む。１つの具体例として、この方法はＮ−エチル−５’−フェニルイソオキサゾリウムスルフォネート（ウッドワード試薬Ｋ；ＷＲＫ）のようなＮ−置換イソオキサゾリウム化合物を用いて、代表的には塩基の存在下に有機溶媒中で、適当な支持体上にカルボン酸基を誘導化することを含む。この誘導化反応は求核分子による攻撃に対して“活性化される”エノールエステル基に支持体結合カルボン酸基を転化する。活性化反応後、残りのイソオキサゾリウム塩および塩基は除かれて、そして支持体は長期間の貯蔵のため空気乾燥させる。本発明の重要な局面によると、本発明者は、乾燥し活性化した支持体は、支持体の固定化効率を減少させることなく長期間（例えば、数ヶ月間）貯蔵ができることを見出した。本発明の特に有利な具体例では、固体支持体はポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブランからなる。ポリペプチドの固定化は、ポリペプチドアミノ基と支持体結合のエノールエステル基との反応を促進するに有効な状態で、ポリペプチドと乾燥支持体を接触させることにより行われ、支持体にポリペプチドを共有結合することができる。このような共有結合は有機熔媒（例えば、アセトニトリル、メタノール、または、Ｎ−メチルピロリドン）の存在下、あるいは代わりに、ｐＨが約１ないし８の間の水溶液中で行われてもよい。一般に、反応時間は約３から２４時間であり、通常は３から６時間の範囲である。また、さらに一層短い反応時間も効率の良い固定化のために有効であり、例えば特に支持体がＰＶＤＦメンブランからなる場合には、分の単位になる。配列分析に先だって、非結合のポリペプチドを溶媒でメンブランを洗浄して除くこともできる。支持体上のポリペプチドの固定化は、例えば、その全体が参照文献としてここに組み込まれるボイドおよびゾンの米国特許第5,185,266号で明らかにされている方法によって、Ｃ−末端配列決定のためのペプチドフリーのＣ−末端終端を残す。 III．活性化固体支持体この章では、本発明の活性化（反応性）固体支持体を生成するために適当な固体支持体、活性化試薬および反応を記述する。Ａ．カルボキシル化固体支持体種々の固体支持体物質および形態を本発明に従ってペプチド固定化に用いることができる。適当な形態は、例えばビーズ、樹脂およびメンブランを含む。適当な支持体物質はガラス（例えば、ＣＰＧビーズ）；およびナイロン、ポリスチレン、改質ポリエチレン、テフロン（登録商標）およびテフロン中に埋め込まれたポリスチレン樹脂のようなポリマー物質を含む。本発明の活性化支持体を形成するための支持体は、支持体結合カルボン酸基、あるいは既知の反応系によりカルボン酸基に転換できる他の化学基を含む。この目的のための具体例としての支持体はバイオ−レックス７０（バイオ−ラド社、リッチモンド、カリフォルニア）、カルボン酸基濃度１０meq/ｇのカチオン交換樹脂；活性化に先だってカルボキシル基に転化できる、アミノプロピル制御ポアグラス（ＣＰＧ）およびアミノメチルポリスチレンビーズ（アプライドバイオシステムズインコーポレイテッド、フォスターシティ、カリフォルニア）；およびアンバーライトＩＲＰ６４（ロームアンドハース）、他のカルボキシレート含有カチオン交換樹脂を含む。好ましい固体支持体はカルボン酸基によって誘導されたポリビニリデンジフルオリドメンブランである（ＰＶＤＦ−ＣＯＯＨ）。このようなメンブランのひとつははポールコーポレーション（ロングアイランド、ニューヨーク）から市販されている。代わりになるものとして、カルボキシル化ＰＶＤＦメンブランは当該分野で知られている方法で調製できる。図１は、ワットマンＧＦ／Ｆガラスファイバーメンブランのようなガラス支持体を支持体結合のアミノ基を与えるために誘導する方法を説明する。ガラスファイバーメンブランは酸でエッチングし、次にアミノプロピル−トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で処理する（アエバーソルド）。アミノ基結合の程度は容易にニンヒドリン分析で定量できる。具体的なガラス支持体の誘導化のプロトコルは実施例１に挙げた。上記した支持体上、あるいは他の適当な支持体上のアミノ基は図２、実施例２および実施例３で説明されているように、無水コハク酸で一晩インキュベートしてカルボン酸基に転化できる。無水コハク酸との反応の経時過程は残存アミノ基についてのニンヒドリン分析により監視できる。支持体上のカルボン酸基の数は無水コハク酸処理後の支持体上のアミノ基の数（ニンヒドリン分析）を処理前の数から引算して判断できる。このような分析は使用者の特別なニーズに合わせた支持体上のカルボキシル基の水準に達するように反応条件を変えるために有効である。多くの他の方法を固体支持体上にカルボン酸基を結合させるために用いることができる。例えば、ポリ（クロロトリフルオロエチレン）含有支持体は水酸基を含有するように改質でき（リー）、このものは無水コハク酸との反応によりカルボン酸基に転化できる。代わりになるものとして、上記の支持体は２−（リチオメチル）−４，４−ジメチルオキサゾリンで改質でき、次にトリフルオロ酢酸／水／アセトン混合物と還流し支持体上に直接カルボン酸基を導入できる（ジアス）。Ｂ．活性化試薬本発明によれば、支持体結合のカルボン酸基は、２−エチル−５’−フェニルイソオキサゾリウムスルフォネート（ＷＲＫ）のようなＮ−置換イソオキサゾリウム化合物（ウッドワード等）と反応し、活性化カルボン酸基（エノールエステル基）を生成する。この活性基はエノールエステル部分を持ったベーターアシルオキシ−Ｎ−エチル−桂皮酸アミドの誘導体であり（参照、図３下部）、アミノ基と反応性がある。他の特別な具体例では、Ｎ−置換イソオキサゾリウム化合物はウッドワード試薬Ｌである。図３で説明したカルボン酸基の活性化は、アセトニトリルまたはＮ−メチルピロリドンのような適当な有機溶媒中で、実施例４で記述したように、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）のような適当な塩基の存在下に行われる。エノールエステル基はアミンによる求核攻撃を受けやすいので、エノールエステルの触媒による生成に用いられる塩基は比較的に非求核的でなければならないことは評価できる。従って第３級アミン、特に立体障害の第３級アミンが塩基として好ましい。図３に説明したように、カルボン酸含有支持体は塩基（好ましくは、上記のように非求核）の存在下にＷＲＫを用いて活性化することができ、その位置で反応性ケテンイミン中間体を生成する（ウッドワード）。反応性ケテンイミンは支持体結合カルボン酸基と容易に反応して、図４に示すように、エノールエステル基を生成する。この反応は、実施例４に詳述したように、ＷＲＫおよび塩基を含有する溶液中にカルボキシル化支持体を浸漬して行うことができる。例として、支持体結合カルボン酸基を含有するガラスファイバーメンブランは新たに調製したケテンイミン溶液を入れた浅い皿の中で緩やかに約４〜６時間渦巻き攪拌することができる。次にこのメンブランをアセトニトリルで洗浄し、未反応ケテンイミンを除き、そして活性化支持体を空気乾燥させる。この方法で調製された活性支持体の多くは発明者らにより、長期間にわたり安定性があり、そしてペプチド固定化のために用いるのに先立つ数ヶ月間を室温で貯蔵できることが見出された。Ｃ．ペプチド固定化本発明の活性化支持体への共有結合のため、ポリペプチドを緩衝水溶液または有機溶媒中に溶解し、支持体上にポリペプチドが固定化するに充分な時間、活性化支持体と接触させる。本発明の重要な局面によれば、本発明者等は乾燥した活性化支持体は広いｐＨ域にわたり水性条件下で充填した試料と適合性があることを見出した；すなわち、支持体へのポリペプチドの共有結合は、支持体結合エノールエステル基が水によりあまり加水分解（すなわち、非活性）することなく、水性条件下に行うことができる。本発明の支持体で行われた研究において、いくつかのカルボキシル基を含有するかまたはカルボキシル基を含有するように誘導された固体支持体をＷＲＫを用いて活性化させ、そして活性化された支持体のタンパク質を固定化する能力について試験した。更に、ＷＲＫ−活性化支持体を用いたペプチド固定化は、下記の他のペプチド固定化方法と比較した。Ｃ．１ポリペプチド固定化本発明の活性固体支持体上のポリペプチド（タンパク質およびペプチド）の固定化のために、ポリペプチドはもし必要ならイオン−ぺア試薬（例えばトリフルオロ酢酸）と共に有機溶媒中に溶解してもよい。あるいは、これに代えてポリぺプチドをｐＨ約１〜８の緩衝水溶液に溶解してもよい。支持体上のポリペプチド固体化の高割合を達成するのに、活性化支持体をポリペプチド溶液に浸漬し、室温で数時間インキュベートしてもよい。速い固定化のために、ポリペプチド溶液を支持体上にスポットし、次に乾燥させてもよい（例えば、実施例１５Ａ）。支持体が回転濾過装置中でメンブランの形態をとる場合、固定化は遠心分離により効果が表れ、そこでは溶液が支持体から遠心分離により引き出されるので、ポリペプチドが支持体の側に保持される。例えば、メンブランを遠心分離管の口から吊り下げることができる挿入物として形成できる（実施例１５Ｂ）。試料ポリペプチド溶液は挿入物中にあり、そして遠心分離管／挿入物集合体はメンブランを通してすべての溶液を通過させるに充分な時間遠心分離機にかけられ、メンブラン上にポリペプチドを固定化させる。ポリペプチドが活性化支持体上に固定化された後、支持体は普通には配列分析に先だって結合しなかったポリペプチドを除くため数回洗浄する。注意することは、高温または強い塩基条件は支持体の不活性化を最小にするために避けるべきである。図５Ａ−５Ｅおよび６Ａ−６ＤはアポミオグロビンおよびリゾチームのＣ−末端配列分析からのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。これらのタンパク質は実施例５および６に記載した手順によりＷＲＫ−活性化ＰＶＤＦメンブラン上にｐＨ７で固定化された。図５Ａ−５Ｅを参照すると、アポミオグロビン試料は第５残基まで容易に配列決定される。同様に、図６Ａ−６Ｄはリゾチームの最初の４個のＣ−末端残基が容易に配列決定されることを示している。注意することはリゾチームに関して、第３配列決定サイクルにおいてピークが観察されない（図６Ｃ）のはおそらく、第３残基のシステインがリゾチームポリペプチド鎖中に他のシステイン残基とのジスルフィド結合を残し、従って遊離チオヒダントイン誘導体として放出できないためであろう。図７Ａ−７Ｄおよび９Ａ−９Ｄは小さいペプチドのＣ−末端配列決定（実施例１４）からのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。水に殆ど溶解しないペプチドに対して、固定化はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはアセトニトリルのような有機溶媒中で行われる。しかしながら、水溶性ペプチドに関して、高い固定化収率を同様に水性溶媒中で得ることができる。一般に、ペプチドの濃度はポリペプチド固定化を促進するのに１ないし６ｍｇ／ｍｌがよいが、さらに低い濃度を使用してもよい。例えば、図１７は１２残基ペプチドのちょうど１０ｐｍｏｌ（メンブラン上にスボット）のＮ−末端配列決定分析を示す。図７Ａ−７ＤはＷＲＫ−活性化ＰＶＤＦ−メンブラン上に固定化された１５残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＣ−末端配列分析を示す（実施例７）。図から見ることができるように、アルキル化チオヒダントインのピークの強いシグナルが４つの全ての配列決定サイクルに観察された。図８Ａ−８Ｄは、実施例３および４に記述した一般的な手順で生成したＷＲＫ −活性化ポリスチレン樹脂上に固定化された１２残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＣ−末端配列分析を示す。この例では、無水コハク酸改質に先だって存在する支持体結合アミノ基の量が、ニンヒドリン分析によって決められ、樹脂１ｇ当たり約２６μｍｏｌと測定された。無水コハク酸で誘導化後、遊離アミノ酸基は検出されず、アミノ基が量的にカルボン酸基に転化されたことを示唆している。図８Ａ−８Ｄから分かるように、強いアルキル化チオヒダントインのピークが４つの全ての配列決定サイクルに観察された。図９Ａ−９Ｄは図８Ａ−８Ｄで使用した同じ１２残基ペブチドのＣ−末端配列分析を示すが、ＷＲＫ−活性化ＣＰＧビーズ（実施例３および４で記したように調製した）上に固定化したものである。再度、強い配列決定ピークが、図に示される最初の４配列決定サイクルを通じて観察された。Ｃ．２ＤＳＳ−活性化支持体との比較本発明の支持体で行った実験で、ＷＲＫ−活性化支持体を用いた固定化収率を他のペプチド固定化方法により得られた収率と比較した。１つの研究では、実施例３および４で記述したように調製したＷＲＫ−活性化ＣＰＧビーズの固定化収率をジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）で活性化したＣＰＧビーズによって与えられた収率と比較した。ＤＳＳは、ポリペプチドアミノ基をアミン誘導化支持体によってカップリングするのに用いられた２官能性架橋試薬（ピアーズ、ロックフォード、ＩＬから入手可能）である。この研究で用いられたＤＳＳ−誘導化ビーズの調製は実施例８に記述した。２つの活性化支持体は先に記した手順により各々の支持体上に合成１１残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：３，“１１−ｍｅｒ”）を固定化して調べた。実験の一つの組では、ポリペプチド固定化は有機溶媒、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中で行った。実験の第２組では、固定化を０．１Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐＨ６で行った。比較の固定化収率は各配列決定サイクルの終端で解離するアミノ酸アルキル化チオヒダントイン誘導体に対するＨＰＬＣピークの振幅を調べて決定した。図１０Ａ−１０Ｄおよび１１Ａ−１１Ｄは、ＷＲＫ−活性化ＣＰＧビーズに結合したペプチド（図１０Ａ−１０Ｄ）およびＤＳＳ−活性化ＣＰＧ−ビーズに結合したペプチド（図１１Ａ−１１Ｄ）についての最初の４回のＣ−末端配列決定サイクルからのＨＰＬＣクロマトグラムを示し、ここでの１１量体の固定化はＮＭＰ中で行った。図から見られるように、ＷＲＫ−活性化ビーズはＤＳＳ−活性化ビーズよりも大きなチオヒダントインピークを与えた。これはＷＲＫ−活性化ＣＰＧビーズがＤＳＳ−活性化ビーズよりも１１量体をより多量に結合している（すなわち、より大きい固定化収率）を示している。図１２Ａ−１２Ｄおよび１３Ａ−１３Ｃは、ＷＲＫ−活性化ＣＰＧビーズ（図１２Ａ−１２Ｄ）およびＤＳＳ−活性化ＣＰＧ−ビーズ（図１３Ａ−１３Ｃ）に関するＣ−末端配列決定結果を示し、ここでの１１量体の固定化はｐＨ６での燐酸塩緩衝溶液中で行った。図から見られるように、ＷＲＫ−活性化ビーズは１１量体を有機溶媒中で固定化した時に観察（図１０Ａ−１０Ｄ）されるものとほぼ同じ大きさのヒダントインピークを与えた。反対に、１１量体を燐酸塩緩衝溶液中で固定化したＤＳＳ−活性化ビーズを使用したのものでは殆ど配列決定物質が観察されなかった。この最後の結果は支持体上のスクシンイミド基のかなりの部分が１１量体と反応できる前に水によって不活性になったことを示唆している。より一般には、これらの結果は試料の固定化が達せられる広い範囲の条件からみると本発明の活性化（エノールエステル）支持体の順応性を証明している。ＤＳＳ活性化支持体は有機溶媒の存在で試料の固定化を可能にするが、水性条件下では不完全に行われる。反対に、エノールエステル支持体では有機溶媒条件および水性条件下で試料充填が可能である。この順応性によりほとんどのポリペプチド試料は特別な溶媒に移しかえる必要なく固定化される。例えば、ポリペプチドを緩衝水溶液中に供給すると、溶液は支持体と直接接触し固定化を行うことができる。更に、エノールエステル支持体は試料の溶解度の問題を回避する。すなわち、支持体は各種の溶解特性を持つポリペプチドを適応させ、必要な広い範囲の溶媒条件に適合性がある。短いペプチドのＮ−末端配列決定についての本発明の活性化支持体の有用性は実施例１３Ａの研究により証明される。この研究では、１２残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）をＷＲＫ−活性化ＰＶＤＦメンブラン上にスポットし、そしてカルボキシル化も他の誘導化もしない標準のＰＶＤＦメンブラン上にもスポットした。乾燥後、両メンブランは自動配列決定装置に配置し、Ｎ−末端エドマン分解にかけた（実施例１７）。図１７から見られるように、ＷＲＫ−活性化メンブランはペプチドに終りから２番目の残基を配列決定するようにする（中空棒）。対照的に、非活性メンブランは最初の６または７残基のみに見出せる不十分なピークを与えた。Ｃ．３結合モード本発明の他の重要な局面によると、特に活性化がＷＲＫを用いて行われた場合に、活性化支持体への共有結合が失敗したポリペプチドはなお非共有相互作用により、支持体上に固定化され得ることが見出された。このような非共有固定化はＷＲＫ試薬から誘導された支持体結合スルホネート基と、ポリペプチド中の正電荷基（アンモニウム、グアニジニュウムおよび／またはイミダゾリウム基からの）との間の好ましい電荷−電荷相互作用に基づくと仮定される。図３から分かるように、ＷＲＫにより生成されたエノールエステルはフェニルリングに結合したスルホネート基を含む。従って、エノールエステルがそのままで残っている間（すなわち、ポリペプチド、塩基または水と反応しない）に、スルホネート基が支持体のエノールエステル部位に結合する。更に、もし、図１９に図式的に示したように、図３に示したエノールエステルが分子内アシル転位を行うとすると、永久的に結合したスルホネート基が支持体上に形成できる。実施例１１で詳述した、一研究では、アポミオグロビンを酸性（０．１％ＴＦＡ、ｐＨ２）あるいは僅かに塩基性（０．１ＭNaHCO₃、ｐＨ８）の条件下にＷＲＫ−活性化ＰＶＤＦメンブラン上に固定化し、次に２５％ＴＦＡ水溶液（“酸性溶液”）または５０％ジイソプロピルエチルアミンのメタノール溶液（“強塩基溶液”）のいずれかですすいだ。引続き追加の洗浄工程を行い、メンブランはメンブラン上になお固定化されているポリペプチドの水準を決定するためにアミノ酸分析を行った（回収％）。表２Ａに関して（実施例１１）、固定化をｐＨ８で行い、すすぎ溶液を用いたのに拘らず、回収％（固定化収率）は両者共に５０％であった。対照的に、ｐＨ２で行った固定化はすすぎ工程のｐＨにより顕著に異なる回収値を与えた。メンブランを酸性溶液ですすいだ時、収率は非常に高かった（７０％）。しかしながら、すすぎを強塩基ＤＩＥＡ溶液で行うと、回収％は約５％に落ちた。同様な回収形態が、ポリペプチドとしてスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を用いたときに観察された（表２Ｂ）。試料充填をｐＨ２で行い、そしてすすぎ工程をｐＨ８（回収５．５％）で行った場合を除いた全ての場合、試料回収は約５０％であった。これらの結果は、アポミオグロビンをｐＨ８（０．１ＭNaHCO₃）で充填する場合、回収％がすすぎ溶液にかかわらず同じであるので、ポリペプチドの固定化は最初は共有結合によることを示している。試料がｐＨ２（０．１％ＴＦＡ中）で充填された時、ポリペプチドの固定化は、ポリペプチドが支持体からＤＩＥＡすすぎ溶液を用いて洗浄できるという事実により証明されるように、最初にメンブランに非共有結合する。おそらく、この強い塩基性のすすぎ溶液は、支持体上のスルホネート基と相互作用するポリペプチド上の正チャージ基の脱プロトン化により好ましい電荷−電荷相互作用（塩ブリッジ）を中断することができるからであろう。実施例１２に記述した研究では、支持体と結合したままの非共有的結合の試料の能力を異なる変性の条件下に試験した。変性の条件は２％トリトンＸ−１００（登録商標）、１Ｍ尿素、１ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１０％Ｂｒｉｊ−３５（登録商標）を含む。水は対照として含まれる。表３（実施例１２）に示すように、結合したアポミオグロビンの回収％は、１％ＳＤＳを除き全てのすすぎ条件で約８０％であった。尿素、トリトンＸ−１００（登録商標）、およびＢｒｉｊ−３５（登録商標）が荷電しないのに反し、ＳＤＳは、ＳＤＳがアニオン洗剤である他の変性剤とは異なっている。この結果は実施例１１の結果と矛盾がなく、負に荷電した洗剤は、何とか塩ブリッジを中断することで、非共有固定化を中断することができるが、中性の変性剤ではできない。より重要なのは、実施例１２からの結果が、活性化支持体が試料を溶解するために加えた変性剤の存在にもかかわらずポリペプチドに非共有結合できることを証明していることである。Ｃ．４．結合したＮ−末端およびＣ−末端配列決定他の局面では、本発明の活性化支持体は同じポリペプチド試料中のＮ−およびＣ−末端アミノ酸基の両方の配列決定に用いることができる。この能力はポリペプチド試料の同定および／または特性化を以前よりもずっと容易にし、その理由は容易に認められるように、ペプチドの両方の末端からの配列決定情報を持ち、配列決定情報がポリペプチドの１端だけからのみ得られる場合よりも、他のポリペプチド類からずっと容易に該ポリペプチド試料を識別できることである。さらに、ポリペプチドが既にその配列決定がされたものである場合、ポリペプチドの両末端での僅かの残基の配列決定分析により試料の同一性を迅速に確認することができる。本方法の応用を実施例１３Ｂに示す。実施例に詳述したように、アポミオグロビンは０．１％ＴＦＡ水溶液中でＷＲＫ−活性化ＰＶＤＦメンブラン上に固定化した。空気乾燥後、メンブランは自動配列決定装置中に入れ、５サイクルのＮ− 末端エドマン分解を行ったた。最初の４個のＮ−末端残基のＨＰＬＣクロマトグラムを図１８Ａに示す。第５番目の配列決定サイクルの後、次に同じメンブランを４サイクルのＣ−末端配列分析にかけた。図１８Ｂに示すように、アボミオグロビン試料の最初の４個のＣ−末端残基が容易に確認された。Ｃ．５ＷＲＫ−活性化支持体の長期安定性他の実験では、各種のＷＲＫ−活性化支持体の長期安定性を３ないし６ヶ月間乾燥形態で貯蔵した後に決定した。下記の研究では、支持体はアミノメチルポリスチレン樹脂（実施例３および４を参照；ＷＲＫ−活性化ＣＰＧビーズ（実施例３および４）；およびＷＲＫ−活性化ＰＶＤＦメンブラン（実施例４））から調製されたＷＲＫ−活性化ポリスチレン樹脂からなる。各支持体をＷＲＫ−活性化した後、支持体をアセトンですすぎ、そして空気乾燥する。次に、各乾燥した活性化支持体はシンチレーション瓶またはエッペンドルフチューブ中に密封し、室温で貯蔵した。ポリペプチド結合能力を評価するために、各支持体を、貯蔵後に残っている支持体結合エノールエステルとポリペプチドとの反応を最小にするため、高濃度のポリペプチドとインキュベートした。次に支持体を実施例１４で記述した手順にしたがって、Ｃ−末端配列決定分析に委ねた。ＷＲＫ−活性化ポリスチレン樹脂上に固定化した１２残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）の配列決定分析は図１４Ａ−１４Ｄに示した。ここでの固定化は、乾燥し活性化した支持体を３ヶ月間貯蔵した後に行われた。図１５Ａ−１５Ｄは同じ１２量体のＣ−末端配列決定分析を示す。ここでの固定化は乾燥し活性化した支持体を３ヶ月間貯蔵の後に、活性化ＣＰＧビーズ上に行った。図１６Ａ −１６Ｅは乾燥形態で６ヶ月間前もって貯蔵されたＷＲＫ−活性化ＰＶＤＦメンブラン上に固定化されたアポミオグロビンのＣ−末端配列分析を示す。図１４Ａ−１４Ｄ、１５Ａ−１５Ｄ、および１６Ａ−１６Ｄに関して、各活性化支持体は、乾燥した活性化支持体を数ヶ月間貯蔵後に、少なくとも４回のＣ− 末端配列決定サイクルによって強いアルキルチオヒダントインシグナルを与えることが分かる。さらに加えて、チオヒダントインピークの大きさは、固定化を僅か数日間貯蔵して置いた乾燥した活性化支持体を用いて行ったときに観察されるのに匹敵していた。従って、本発明は通常の状態ではポリペプチドを共有結合させるその能力を著しく減らすことなく数ヶ月間貯蔵ができ、容易に使用できる活性化固体支持体を提供する。本発明の支持体の有用性を、アミノ酸配列決定に特に焦点をあてて討論するとき、本発明の支持体はまた免疫アッセイに用いられる固体支持体にポリペプチドをカップリングさせるのに用いることができることは評価できる；例えば、この免疫アッセイでは、抗原、抗体あるいはＦ_abフラグメントを試料中の選択された抗体あるいは抗原を結合し、同定するために支持体にカップリングさせる。前記からいかに本発明の各種の目的および特徴が兼ね備えているかは評価されるであろう。本発明は乾燥した活性化支持体とポリペプチドを固定化するための有用な方法を提供する。支持体は乾燥形態で貯蔵するとき長期間の安定性を示し何も特別な貯蔵条件を必要としない。さらに、支持体は試料装填の間、水性状態に適合し、広い範囲のｐＨ域でポリペプチドの固定化を行う。特に、支持体がＰＶＤＦメンブランからなる場合、本発明は１つのメンブランを用いてポリペプチドのＮ−およびＣ−末端の両方の配列決定ができる。下記の実施例は本発明を説明するのに提示するものであり、いかなる場合も、この範囲に限定されるものではない。材料ＤＩＴＣガラスビーズはシグマケミカル社（セントルイス、ＭＯ）から入手し、ＤＩＴＣ−ＰＶＤＦメンブラン（セクエロン登録商標）はミリポア（バーリングトン、ＭＡ）から購入した。表面に結合したカルボン酸基をもつポリビニリデンジフルオリドメンブラン（“カルボキシル化ＰＶＤＦ”はまたは“ＰＶＤＦ− ＣＯＯＨ”）はポールコーポレイション（ロングアイランド、ＮＹ）から入手した。アミノプロピル制御ポアガラス（ＣＰＧ）ビーズおよびアミノメチルポリスチレンビーズはパーキン・エルマーのアプライド・バイオシステムズ・デイビイジョン（“ＡＢＩ”、ファスターシティー、ＣＡ）から入手した。ＡＢＩモデル４７６ＡシーケンサーでＮ−末端配列決定分析を行った。Ｃ−末端配列決定分析はＡＢＩモデル４７７Ａシーケンサーで行った（ボイドら、Anal Biochem.，206，344-352，1992）。アミノ酸組成分析はＡＢＩモデル４２１アミノ酸アナライザーで行った。実施例１アミノプロピルガラスファイバーフィルターペーパーの調製ワットマンＧＦ／Ｆの円盤（直径１１ｃｍ）を穏やかに揺り動かすガラス皿中で室温で１時間、純粋のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で最初に酸エッチングする。次に、エッチングされたペーパーはワットマン＃３濾紙上に置き、一晩空気乾燥した。エッチングしたガラスファイバー濾紙はプラスチック袋の中で室温で３〜５時間（アミノプロピル）トリエトキシシラン（２％水溶液）で処理した。アセトンで数回洗浄後に、まだ湿気のあるアミノプロピル−ＧＦ／Ｆをオーブン中で１００℃で４５分間硬化させた。このフィルターペーパーはニンヒドリン検査で定量できる第一アミン基をもつ。アミン含有量は普通には１６ｎモル／直径９ｍｍディスクである。実施例２アミノプロピルガラスフィルターペーパー上のアミノ基を無水コハク酸を用いてカルボキシル基に転化無水コハク酸１ｇおよびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）０．２５ｇをアセトニトリル２０ｍｌ中に溶解した。この溶液をガラス皿中でアミノプロピルガラスファイバーフィルターペーパー（実施例１）の半円上に注ぎ、そして室温で一晩反応させた。アセトニトリルで数回洗浄し、アセトンで最後のすすぎをした後、フィルターペーパーを空気乾燥させた。小片でニンヒドリン検査で試験し、アミノ基は陰性であった。実施例３アミノプロピルＣＰＧビーズのアミノ基を無水コハク酸を用いてカルボキシル基に転化アミノプロピルＣＰＧビーズ（４５μモルＮＨ₂/ｇビーズ）１００ｍｇを蓋付エッフェンドルフチューブに入れ、約１ｍｌのＤＭＡＰ／無水コハク酸溶液（実施例２）中で室温で一晩振り動かした。このビーズをアセトニトリル、アセトンで数回洗浄し、次に乾燥させた。得られたものは、ニンヒドリン検査で試験し、アミノ基は陰性であった。実施例４活性化支持体の調製反応性ケテンイミン溶液をＷＲＫ０．０６３ｇ（０．０６３モル）およびジイソプロピルエチルアミン０．５ｍｌ（ＤＩＥＡ、０．０２５モル）をＣＨ₃ＣＮ２ｍｌ中で混合して、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウムスルホネート（ウッドワード試薬Ｋ．ＷＲＫ）からアセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ）中に生成させた。この溶液は固体ＷＲＫが完全に溶解すると直ぐに使用した。カルボキシル化支持体（例えば、実施例２または３からのカルボキシル化合物ＰＶＤＦメンブランまたはカルボキシル化支持体）をこの溶液に４〜６時間浸漬し、ここでの溶液量は支持体を完全に浸漬するように調整した。次に、得られたエノールエステル支持体はＣＨ₃ＣＮで数回洗浄し、最後にアセトンで洗浄し、短く空気乾燥させた。次に、この活性化支持体を蓋付きエッペンドルフチューブまたは密閉プラスチック袋に保管した。実施例５アポミオグロビンの活性化ＰＶＤＦメンブランへの共有結合アポミオグロビン１２０ｎモルをｐＨ７の１００ｍＭ燐酸塩緩衝溶液の３ｍｌに不完全に溶かした。この溶液を活性化カルボキシルＰＶＤＦメンブラン（実施例４、２日前に調製）のシート（２８６ｍｇ）上に３時間揺れ動かした。アミノ酸分析では１５０ｐモルのタンパク質／ｍｇメンブランが結合し、３５．８％の結合効率（アポミオグロビンとの反応前のメンブランの概算アミノ基含量に基づく）を示した。Ｃ−末端配列分析の第１サイクルの収率（実施例１４）は３５％（メンブランに結合した１５０ｐモルのタンパク質から５０ｐモルの“配列決定用”物質）であった。実施例６リゾチームの活性化ＰＶＤＦメンブランへの共有結合ｐＨ７の燐酸塩緩衝溶液中の鶏卵白リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）溶液を実施例５に記したように活性化カルボキシルＰＶＤＦメンブランのシート上（２８３ｍｇ）に揺れ動かした。アミノ酸分析は５０％の結合効率を示した。Ｃ−末端配列分析の結果（実施例１４）は図６Ａ−６Ｄに示した。実施例７短鎖ペプチドの活性化ＰＶＤＦメンブランへの結合１５残基のペプチド（２ｍｇ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を３ｍｌのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解した。このペプチド溶液を活性化カルボキシルＰＶＤＦメンブラン（予め活性化し、２日間乾燥したもの）のシート２８６ｍｇ上に３時間揺れ動かした。結合していないペプチドは、アセトニトリル、アセトンを用いてこの順に流去し、次にこのシートにＣ−末端配列分析を行った（実施例１４、図７Ａ−７Ｄ）。実施例８固体支持体にペプチドを結合させるためのジスクシンイミジルスベレートの使用ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ、１５ｍｇ）をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ、７２０μＬ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、４０μＬ）およびピロリジン（４０μＬ）の混合物に溶解した。この混合物が完全に溶解すると直ぐに１００ｍｇのアミノメチルポリスチレンビーズ（ＡＢＩから入手、２６μモルＮＨ₂基／ｇビーズ）に加え、反応混合物は１〜２時間、室温で振とうさせた。得られた活性化ビーズはＮＭＰで２回洗浄した。結合されるペプチド（通常は約１０μＭ）をＮＭＰ３６０μＬおよびピリジン４０μＬの混合物に溶解した。完全に溶解後、ペプチドをまだ湿った活性化ビーズに加え、室温で一晩振とうさせた。次の日ビーズをＮＭＰ、水、次にアセトニトリルで数回洗浄し、真空遠心分離で乾燥させた。この手順は一般的に約２ｎモルペプチド／ｍｇシートのペプチドの充填を与える。また、同じ手順はアミノプロピルＣＰＧビーズに首尾よく応用された。実施例９エノールエステル支持体の安定性３種の異なったＷＲＫ−活性化支持体を乾燥形態で長期間貯蔵後、ポリペプチド結合能力の保持力について試験した。研究に用いた乾燥支持体は実施例４で記した一般的な手順により生成され、空気乾燥した後、シンチレーションガラス瓶またはエッペンドルフチューブに貯蔵した。特別な貯蔵条件は用いなかった；換言すれば、活性化支持体を完全に乾燥したり、または不活性雰囲気下に、または冷凍庫中に貯蔵する作業は不用である。活性化支持体は数日間貯蔵後、および数ヶ月間貯蔵後にポリペプチド結合能力についてＣ−末端配列分析により試験した。ＷＲＫ−活性化ポリスチレン樹脂（実施例４）はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．５ｍｌ中で１２残基ペプチド（ＳＷＱＩＤＮＯ：２）３ｍｇと３時間インキュベートし次に実施例１４に記した手順によりＣ−末端配列決定した。３ヶ月間乾燥形態で貯蔵後のポリスチレン樹脂の結果は図１４Ａ−１４Ｄに示した。ＷＲＫ−活性化ＣＰＧビーズをＤＭＦ中、１２残基ペプチドと同様な仕方でインキュベートし、上記のように配列決定した。３ヶ月間乾燥形態で貯蔵後の活性化ポリスチレン樹脂についての結果を図１５Ａ−１５Ｄに示す。ＷＲＫ−活性化ＰＶＤＦ（実施例４）は実施例５で記したようにアポミオグロビン１２０ｎモルとインキュベートし、そして上記のように配列決定した。６ヶ月間乾燥形態で貯蔵後の活性化メンブランについての結果を図１６Ａ−１６Ｅに示す。実施例１０試料を活性化メンブランに結合させる際のｐＨ効果実施例４と同様に調製した６個の各々直径４ｍｍの活性化ＰＶＤＦメンブラン上に、下記に記す１つに、３ｍｇ／ｍＬアポミオグロビン（５００ｐモル、馬の骨格筋肉からのもの）を含む溶液４μＬをスポットする：水、０．１％ＴＦＡ水溶液、ｐＨ２、または０．１ＭNaHCO₃、ｐＨ５、７、８、または９。ディスクは室温で３０分間空気乾燥させた。次に各ディスクを水０．５ｍＬで２回、５％ＴＦＡ水溶液０．５ｍＬで２凹、アセトニトリル、またはメタノール０．５ｍＬで１回洗浄した。結合した試料はアミノ酸分析で定量し（材料と方法）、異なるバッファー条件の各々についてディスクの結合効果を充填した量に対する結合した試料の割合として計算した（表１）。実施例１１活性化ＰＶＤＦメンブランへの共有結合対非共有結合の試料実施例４で調製した４個の直径４ｍｍの各活性化ＰＶＤＦメンブランディスク上に、０．１％ＴＦＡ水溶液、ｐＨ２（最初のペアのディスク）中または０．１Ｍ NaHCO₃、ｐＨ８（第２のペアのディスク）中に２．５ｍｇ／ｍＬアポミオグロビン（７５０ｐモル）を含む溶液の５μＬをスポットした。ディスクは室温で約３０分間空気乾燥させた。次に、各ペアからの１個のディスクを２５％ＴＦＡ水溶液（酸性溶液）の５００μＬで２回洗浄し、引続き５％アセトニトリル水溶液５００μＬと純粋アセトニトリル５００μＬで洗浄した。各ペアからのもう一個のディスクを５０％ＤＩＥＡメタノール溶液（塩基性溶液）５００μＬで洗浄し、引続き５％アセトニトリル水溶液５００μＬと、純粋アセトニトリル５００ μＬで洗浄した。充填した試料のパーセンテージとして、各ディスクに結合した試料の水準を表２Ａに示す。また、この手順はアポミオグロビンの代わりにスーパーオキシドジスムターゼ（２００ｐモル；牛赤血球からのもの）を用いて行った。メンブラン上に保持されている試料の水準は表２Ｂに示す。実施例１２活性化メンブランの試料結合強度における洗浄効果実施例４で調製された５個の直径４ｍｍの活性化ＰＶＤＦメンブランディスクの各々に、０．１％ＴＦＡ水溶液、ｐＨ２のアポミオグロビンの１ｍｇ／ｍＬ溶液の２．５μＬをスポットした。次に各ディスクを５００μｌの下記の溶液の１つで２回洗浄した：水、２％トリトンＸ−１００、１Ｍ尿素、１％ＳＤＳ、または１０％Ｂｒｉｊ−３５。第２番目の洗浄後、支持体は５００μＬの水で２回洗浄した。充填量のパーセンテージとして各ディスクに結合した残りの試料を表３に示す。実施例１３活性化ＰＶＤＦメンブランを用いる配列分析Ａ．ペプチドのＮ−末端配列分析：活性化ＰＶＤＦメンブラン対非活性化、非カルボキシル化ＰＶＤＦメンブラン（ｉ）直径４ｍｍのＰＶＤＦメンブラン（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッドからのプロブロットメンブラン；非活性化、非カルボキシル化）および（ii）実施例４で調製された直径４ｍｍの活性化ＰＶＤＦメンブランディスクの各々の上に、０．１％ＴＦＡ水溶液中に溶解した２μｌの１２残基ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４；７μｇ／ｍＬ、全１０ｐモル）を充填した。ディスクを空気乾燥した後、ディスクを５％ＴＦＡ水溶液（５００μＬ）で、続いてアセトニトリル（５００μＬ）で洗浄した。次にディスクをＡＢＩモデル４７６Ａシーケンサーに置き、１２サイクルのエドマン分解を行った。各サイクルでの残基の同定と収率を図１７に示す。Ｂ．単一試料ディスクを用いる二元的Ｎ−およびＣ−末端配列分析実施例４と同様に調製された直径４ｍｍの活性化ＰＶＤＦメンブラン上に、０．１％ＴＦＡ水溶液中に溶解したアポミオグロビン（１ｍｇ／ｍＬ、全１２０ｐモル）２μＬを充填した。ディスクを空気乾燥した後、ディスクをＡＢＩモデル４７６Ａシーケンサーに装填し、５サイクルのエドマン分解を行った。最初の４サイクルの分析からのＨＰＬＣを図１８Ａに示した。最後のサイクルが完了した後、ディスクをシーケンサーから取り出し、そしてＡＢＩモデル４７７Ａシーケンサーに移した。次に、Ｃ−末端配列分析を実施例１４に記したように行った。結果を図１８Ｂに示す。実施例１４固定化ペプチドの配列分析上記のように固体支持体に結合したタンパク質およびペプチドを、下記のようにＣ−末端チオヒダントインに転化し、次にアプライド・バイオシステムズ・モデル４７７Ａタンパク質シーケンサーを用いてＣ−末端から配列決定した。１０％ＤＩＥＡ（ジイソプロピルアミン）のアセトニトリル溶液をモデル４７７ＡのＳ１位置に充填し、８％ジフェニルクロロホスフェートのアセトニトリル溶液をＸ１位置に配置した。次の反応工程を５５℃で行った。タンパク質またはペプチド誘導化支持体をシーケンサーに充填した後、ＤＩＥＡとジフェニルクロロホスフェート溶液の等容積量を、メンブランを完全に湿めらせるに充分な量でメンブランに供給した。５分間の休止の後、ＤＩＥＡとジフェニルクロロホスフェート溶液の供給をもう一度繰り返す。次に、メンブランをアセトニトリルで洗浄し、残りのクロロホスフェート化合物を除く。さらに、５分間の休止の後、１％アンモニウムチオシアネートのアセトニトリル溶液の等分量をメンブランに供給し、次に６０秒間トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）蒸気にメンブランをさらした。５分間休止後、１％アンモニウムチオシアネートとＴＦＡ蒸気の供給を５分間の休止をはさんで１〜５回繰り返し行った。次に残存する試薬はアセトニトリルを用いてメンブランから洗浄した。アスパルテートおよびグルタメートの側鎖のカルボキシレート基のエステル化が望ましい場合ば、エステル化工程はペプチジル−チオヒダントインの生成および上記のようなアセトニトリルでのメンブランの洗浄の後に含まれる。エステル化工程では、メンブランはメタノールで短時間（例えば、１分間）洗浄し、次にＴＦＡ蒸気で６０秒間処理される。５分間の休止後、メンブランをアセトニトリルで洗浄した。配列決定は基本的には米国特許第５，１８５，２６６号に記述されるように行った。この手順で、Ｃ−末端チオヒダントインはアルカリ化剤と反応させ、チオヒダントインを更によい脱離基にした。次にＴＭＳ−ＩＴＣまたはアンモニウムチオシアネートおよびＴＦＡ蒸気を用いて残存のペプチドからチオヒダントイン付加物を分裂させ、次のアミノ酸残基のチオヒダントインを生成する。分裂したチオヒダントイン付加物を米国特許第５，１８５，２６６号に示された方法で分離し同定した。実施例１５Ａ．メンブラン支持体上への試料のスポットＷＲＫ−活性化カルボキシル化ＰＶＤＦメンブランの直径４ｍｍディスク上に２つの２．５μＬの等分量で、ｐＨ７の燐酸塩緩衝液中のリソチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を５μＬスポットした。ディスクは空気乾燥し、次にＮ−またはＣ−末端配列分析のため自動化シーケンサーに配置した。Ｂ．回転濾過遠心分離（回転濾過）によるポリペプチドの固定化のため、遠心分離管挿入装置をプロスピン（登録商標）挿入装置（ＡＢＩ、パーツ番号：４０１，２５６）を改良し、直径４ｍｍのＷＲＫ−活性化ＰＶＤＦ（分画分子量８，０００）を含めるように組み立てた。次に、挿入物は１．５ｍＬエッペンドルフチューブに装填し、一般にはタンパク質５００ｐモルを含むポリペプチド試料溶液（５０〜１００μＬ）を加えた。次に、管／挿入物組立物をマイクロフュージに装填し、約１時間８０００ｒｐｍで遠心分離した。空気乾燥の後、支持体は配列分析に使用できる。一般的に、５０〜６０％のタンパク質試料が、アミノ酸分析での測定によりメンブラン上に固定化されていた。本発明は、特定の支持体およびポリペプチドに関して記述され説明されているが、各種の改良および変更が、本発明から逸脱することなく行えることは高く評価されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ユアン，パウ−ミアゥアメリカ合衆国カリフォルニア州 95129 サンジョーズ，ジョンソンアベニュ 1249

Claims

【特許請求の範囲】１．表面結合カルボン酸基を有する固体支持体を、塩基の存在で有機溶媒中のイソオキサゾリウム塩と反応させ、反応性支持体を形成し、反応性支持体を洗浄して残りのイソオキサゾリウム塩と塩基を除去し、洗浄した支持体を乾燥させ、そして前記乾燥後に、ポリペプチドを支持体に結合するために有効な条件下に、支持体をポリペプチドと接触させる各工程から成る、固体支持体上にポリペプチドを固定化する方法。２．前記ポリペプチドが第１級アミノ基を含み、前記条件が活性化支持体にポリペプチドを共有結合するために有効である、請求項１記載の方法。３．さらに前記支持体が表面結合スルフォネート基を含み、前記条件が活性化支持体にポリペプチドを非共有結合するために有効である、請求項１記載の方法。４．前記乾燥後、活性化支持体を少なくとも約３ヶ月間乾燥形態で貯蔵し、前記反応によって、前記乾燥なしで達成されるであろう収率と実質的に同じペプチド固定化収率を達成する、請求項１記載の方法。５．支持体がガラスファイバーメンブランから成る、請求項１記載の方法。６．支持体がポリビニリデンジフルオリドメンブランから成る、請求項１記載の方法。７．イソオキサゾリウム塩が２−エチル−５’−フェニルイソオキサゾリウムスルフォネートである、請求項１記載の方法。８．前記接触させるために、前記ポリペプチドを水溶液に溶解する、請求項１記載の方法。９．前記接触させるために、前記ポリペプチドを有機溶媒に溶解する、請求項１記載の方法。１０．表面結合エノールエステル基と表面結合スルフォネート基を有するポリビニリデンジフルオリドメンブランを、ポリペプチドをメンブランに結合するために有効な条件下にポリペプチドと接触させて成る、ポリペプチドを固定化する方法。１１．前記ポリペプチドが第１級アミノ基を含み、前記条件が活性化支持体にポリペプチドを共有結合するために有効である、請求項１０記載の方法。１２．前記条件が活性化支持体にポリペプチドを非共有結合するために有効である、請求項１０記載の方法。１３．イソオキサゾリウム塩が２−エチル−５’−フェニルイソオキサゾリウムスルフォネートである、請求項１０記載の方法。１４．前記接触させるために、前記ポリペプチドを有機溶媒に溶解する、請求項１０記載の方法。１５．前記接触が約１ないし８のｐＨで水性媒体の存在で行われる、請求項１０記載の方法。１６．前記ｐＨが約２である、請求項１５記載の方法。１７．前記ｐＨが約７である、請求項１５記載の方法。１８．表面結合エノールエステル基を有する乾燥固体支持体から成り、前記支持体がペプチド固定化効率を減少することなく少なくとも約３ヶ月間乾燥形態で貯蔵できる活性化固体支持体。１９．さらに表面結合スルフォネート基を含む、請求項１８記載の支持体。２０．支持体がポリビニリデンジフルオリドメンブランから成る、請求項１８記載の支持体。２１．活性化エノールエステル基が３−ヒドロキシ−Ｎ−エチル−シンナムアミドのエステルである、請求項１８記載の支持体。２２．Ｃ末端カルボン酸基を有するポリペプチドを、表面結合エノールエステル基を有するポリビニリデンジフルオリドメンブランと、ポリペプチドをメンブランに共有結合または非共有結合するために有効な条件下に接触させ、メンブランを１またはそれ以上のサイクルのエドマン分解にかけ、結合したポリペプチド中の１またはそれ以上のＮ末端残基の配列を決定し、最初の前記エドマン分解の工程の後、メンブランを１またはそれ以上のサイクルのＣ末端配列決定に委ねる各工程から成るポリペプチド中のＮ末端とＣ末端の残基の配列位置を同定する方法。２３．前記接触が約１ないし８のｐＨで水性媒体の存在で行われる、請求項２２記載の方法。２４．前記ｐＨが約２である、請求項２３記載の方法。２５．前記ｐＨが約７である、請求項２３記載の方法。