JPH08509603A - 異種移植治療におけるブタＧａ１α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ブタＧａｌα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列並びに当該配列を含んだクローンが提供される。ブタＧａｌα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼはブタ細胞表面にＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープを生じさせる。このエピトープはヒト抗Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ抗体によって認識され、このヒト抗Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ抗体が異種移植されたブタの細胞、組織及び器官の超急性拒絶反応の原因となる。このような超急性拒絶を軽減する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 異種移植治療におけるブタＧａｌα（1,3） ガラクトシルトランスフェラーゼの使用 本発明は異種移植（異なる生物種間の移植）に関するものであり、特に異種移 植片拒絶反応を軽減する方法、動物個体内での異種移植組織の維持、異種移植治 療に有用なヌクレオチド配列、拒絶反応耐性を示すトランスジェニック臓器並び にその組織が異種移植に際して拒絶反応耐性を示すようなトランスジェニック動 物に関する。 人間の移植用の組織が不足している現状から、臓器源としての可能性をもつ異 種移植片について綿密に調査されるようになってきた。しかし、ヒト以外の生物 種の組織を人間に対して移植した場合、その生物種に存在する抗原に対して反応 する自然抗体が人間の血清中に存在するために超急性拒絶反応を起こしてしまう 。かかる超急性拒絶反応は移植して１０〜１５分以内に起こる。この現象は、一 般に、抗体・補体・好中球・血小板その他の炎症メディエーターの幾つか又はこ れらすべての存在に依存する。「不調和（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）」種間（自然 抗体の生ずる種同士）での血管形成臓器の移植において、自然抗体に最初に遭遇 する細胞は血管内壁の内皮細胞であり、抗体が異種抗原その他の因子に結合する ことによってこれらの細胞が活性化され、その結果超急性拒絶反応を引き起こし ている可能性が高い。 異種移植組織上で標的となり得る異種抗原の素性については余り判然としてい ない。Ｐｌａｔｔ他（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５０：８１７-８２２ ，１９９０）及びＹａｎｇ他（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２４：５９３ -５９４，１９９２）は様々な分子量の３つの糖タンパク質の組合せ（トリアド ）がブタ内皮細胞の表面に存在する主要な標的であるとしている。他の研究者ら （Ｈｏｌｇｅｒｓｓｏｎ他，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２４：６０５- ６０８，１９９２）は糖脂質が最も重要な異種抗原であるとしている。 今回、我々は、異種移植片拒絶反応、特にブタ組織についての異種移植片拒絶 反応が、ガラクトースとα（1,3）結合したガラクトース（Ｇａｌα（1,3）Ｇａ ｌエピトープ）に対する反応性抗体と関連していることを発見した。異種移植組 織の Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープに対する反応性抗体の作用を変化させると拒 絶反応に変化が生ずる。 本発明の最初の態様によれば、治療の対象たる動物における異種移植片拒絶反 応を防止する方法にして、ガラクトースとα（1,3）結合したガラクトースをも つ異種移植抗原に結合する抗体のアンタゴニストの有効量を当該動物に投与する ことを含んでなる方法が提供される。 本発明は、別の態様では、動物個体内で異種移植組織を維持する方法にして、 異種移植抗原エピトープＧａｌα（1,3）Ｇａｌに結合する抗体のアンタゴニス トの移植片拒絶有効量を当該動物に投与することを含んでなる方法に関する。 本発明のまた別の態様では、Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープと抗体の結合 を抑止する方法にして、Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープに対する抗体の結合 を阻止（ブロック）するアンタゴニストを用いて、抗体とエピトープとの相互作 用を変化させることを含んでなる方法が提供される。 好ましくは、異種移植の受容者は人間である。年齢は異種移植についての決定 因子ではないが、７５歳を超える年配者に対しては移植は普通行われない。本発 明は特に異種移植組織の人間への移植を主題とする。 異種移植する組織はブタ由来のものが好ましい。ブタ以外の哺乳動物由来の組 織についても本発明での使用が見込まれる。異種移植する組織は、例えば腎臓・ 心臓・肺又は肝臓のような器官（臓器）であるのが好ましい。異種移植組織は、 また、器官の一部・細胞集塊・腺などであってもよい。その具体例は、水晶体・ ランゲルハンス島細胞・皮膚及び角膜組織などである。Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ エピトープをもつ抗原を発現する異種移植組織であればどんなものでも本発明に 使用することができるので、異種移植組織の素性それ自体は決定的な重要性をも たない。 異種移植組織上にて発現するＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープに対して抗体 が結合すると、体液性免疫のみならず細胞性免疫による組織片拒絶反応を引き起 こして、非常に短時間のうちに（例えば、１時間も経たないうちに）組織片の拒 絶をもたらす。抗体とＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープの結合反応に拮抗する アンタゴニストは抗体の結合を阻止して、異種移植片拒絶反応を阻害する。抗体 の結 合が阻止されるため、組織片拒絶反応を引き起こす免疫応答が抑止される。 本発明のさらに別の態様によれば、Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌに対する抗体の作 用を変化させるアンタゴニストが提供される。 Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ結合に対する抗体の作用を変化させることのできるア ンタゴニストであればどんなものでも本発明に利用し得る。ここでいう「変化」 とは、抗体の結合を阻止すること或いはＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープに対 する抗体の親和反応性を減少させることを意味する。種々の機構が、こうしたエ ピトープに対する抗体の結合の阻止又は抗体の親和性の減少と結び付き得る。そ うした機構には、抗体反応性部位との結合又は会合並びに抗体反応性部位のコン ホメーション変化などが含まれ、例えば、活性部位に関与する残基又は活性部位 に隣接する残基又は活性部位から遠位にある残基との結合によって、活性部位の コンホメーションが変わり、その結果Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープと結合 できなくなったり或いはエピトープに対する結合の親和性が低下する場合が挙げ られる。例えば、当業者に周知の技術（Ｃｏｌｉｇａｎ他編，ＣｕｒｒｅｎｔＰ ｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏlｏｇｙ ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ ｓ（ニューヨーク），１９９２；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ著，Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ニューヨーク），１９８８；並びにＬｉｄｄｅ ｌｌ及びＣｒｙｅｒ著，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＧｕｉｄｅＴｏ Ｍｏｎｏｃｌ ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（英国ウェ ストサセックス州チチェスター），１９９１などを参照）によれば、自然抗体又 はそのフラグメントに対して作製した抗イディオタイプ抗体を用いることによっ て、抗体反応部位のこうしたコンホメーション変化を引き起こすことができる。 同じく当業者に周知の事項であるが、かかる抗イディオタイプ抗体の臨床的有用 性を高めるために、例えばＦａｂ′フラグメントの調製のような酵素的手法或い はキメラ抗体・人体適応抗体又は単鎖抗体の調製のような組換え技術を用いて、 抗イディオタイプ抗体を修飾することもできる。 本発明は特定のアンタゴニストには限定されず、Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌエピ トープに対する特異的抗体の相互作用を変化させるアンタゴニストで非毒性のも のであればどんなものでも本発明に使用し得る。好適なアンタゴニストの具体例 には、D-ガラクトース、メリビオース、スタキオース、メチル-α-D-ガラクトピ ラノシド、D-ガラクトサミン及びこれらの誘導体が含まれる。「誘導体」という 用語には、例えば、アルキル・アルコキシ・アルキルコキシ・アラルキルアミン ・ヒドロキシ・ニトロ・ヘテロ環・硫酸及び／又はシクロアルキル置換基を単独 又はそれらの組合せとして含むもので、アンタゴニスト活性をもつ誘導体が包含 される。アンタゴニスト活性の有無は本明細書中に記載された方法によって評価 することができる。上記の炭水化物又は誘導体の１種類以上が構成成分として含 まれる高分子炭水化物も本発明に利用し得る。 Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープとの反応性をもつ抗体の相互作用を変化さ せるのに有効なアンタゴニストの量は数多くの要因に左右される。かかる要因に は、治療すべき動物の種類、移植される組織の生物種、移植受容者の体力（年齢 ・体重・性別及び健康状態）などが含まれる。人間の移植受容者に例えばブタな どの組織を移植する場合、アンタゴニストの投与量は一般に顧問医師の判断に委 ねられるであろう。一例として、人間が被術者である場合のアンタゴニストの移 植片拒絶有効量は、単位投与量にして０.０１ｍｇから１０００ｇｍのオーダー であり、好ましくは、単位投与量にして、１０ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好まし くは５０ｍｇ〜３００ｍｇ、さらに一段と好ましくは５０ｍｇ〜２００ｍｇであ る。 拒絶反応を防止して異種移植片を維持するためのアンタゴニストの投与スケジ ュールは上述の通り様々な要因に左右される。毎日、毎週或いは毎月といった具 合に様々な投与体制が考えられる。 アンタゴニストの投与方式及びその投与量は本発明においては決定的な重要性 をもたない。アンタゴニストは、非経口投与（静脈内、筋肉内又は臓器内注射） 、経口投与、経皮投与、或いは膣腔又は肛門経由で投与してもよいし、或いは当 業者に周知のその他の投与法で投与してもよい。アンタゴニストは固形でも液状 でもよく、通常は医薬的又は獣医学的に許容される賦形剤及び／又は担体を含ん でいる。本発明において用いることのできる投与形態の具体例は上述の通り当業 者には周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ；この文献は文献の援用によって本明細書の内容の一部をなす ）などに記載されている。 本発明のさらに別の態様では、α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼを コードするヌクレオチド配列並びにその変異体が提供される。当該ヌクレオチド 配列としてはブタのα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするも のが好ましい。 ヌクレオチド配列はＤＮＡでもＲＮＡでもそれらの混合物であってもよい。当 業者に周知の通り、ヌクレオチド配列又は単離核酸は、プラスミドやウイルスベ クターなどの、複製用ＤＮＡ・ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡベクターに挿入するこ とができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク），Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ，１９８９）。 α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は 、プロモーター、エンハンサー、及び発現・転写・翻訳に必要なその他の調節配 列を含んでいてもよい。かかる配列を含むベクターは、追加遺伝子及び／又は選 択マーカー（さらには細胞内でのベクターの増殖及び維持に必要な因子）の挿入 のための制限酵素部位を含んでいてもよい。 α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の 変異体が特に好ましい。その理由は、かかる変異体を当業者に周知の相同的組換 え技術（Ｃａｐｅｃｃｈｉ Ｍ.Ｒ.，“Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８-１２９２，１９８９；Ｍｅｒｌｉｎｏ Ｇ.Ｔ.，“Ｔｒａｎｓ ｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， ＦＡＳＥＢ Ｊ．５：２９９６-３００１，１９９１；Ｃｏｓｇｒｏｖｅ他，“Ｍ ｉｃｅ Ｌａｃｋｉｎｇ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩＭｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ｃｅｌ ｌ ６６：１０５１-１０６６，１９９１；Ｚｉｊｌｓｔｒａ他，“Ｇｅｒｍ-ｌ ｉｎｅ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ Ｂ２-ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃ ｅｄ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｍｂｒ ｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５，１９８９ ）に利用すれば、野生型α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を不 活性化することができるからである。 変異型α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列には、 野生型α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼに対して生成変異体が機能的 ガラクトシルトランスフェラーゼをコードしなくなるようにヌクレオチドの欠失 ・挿入・置換・付加処理を行ったものが含まれる。こうした変異型ヌクレオチド 配列を相同的組換え技術に利用することができる。こうした相同的組換え技術に おいては、変異型配列が、１〜約５００個の細胞からなる幹細胞・卵又は新受精 細胞中の野生型ゲノム配列と組換えを起こす。相同的組換えに利用されるヌクレ オチド配列は単離されたヌクレオチド配列であってもよいし、ベクターに組込ま れた形であってもよい。組換えは無秩序に起こる事象であって、組換えに際して 機能的遺伝子の破壊が起こる。 野生型遺伝子の機能を破壊するための相同的組換え及びその他の技術で生み出 したトランスジェニック動物も、それから得られる器官と同様に、本発明の範囲 に含まれる。一例として、非機能的なα（1,3）ガラクトシルトランスフェラー ゼゲノム配列を有するトランスジェニック動物を生み出すための相同的組換え技 術を利用してトランスジェニックブタを作り出すことができる。こうしたトラン スジェニック動物から得られる組織を人間の患者への異種移植に利用すれば、Ｇ ａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープとそれに対して反応性をもつ循環中のヒト抗体 との免疫反応をなくすことができる。このような移植片は移植受容者によって十 分に受け入れられると考えられる。移植組織にはＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピト ープ関連抗原以外にも免疫反応を誘発する抗原が含まれている可能性があるが、 かかる移植組織に対する免疫反応の主原因を取り除けば、普通の拒絶反応治療（ シスロスポリンのような免疫抑制剤による治療）と併用することによって異種移 植片は比較的十分に受け入れられるようになるはずである。 以下、本発明を非限定的な図面及び実施例を参照して説明する。図面の簡単な説明 図１：図１Ａは、プールしておいたヒト血清の、吸収処理の前後における力価 である。力価は、ＲＢＣ（斜線を付した棒）に対する血球凝集反応並びにＰＢＬ （中抜きの棒）及び脾細胞（黒塗りの棒）に対するロゼット形成アッセイで得た 。吸収試験の結果は、ＲＢＣ・脾細胞・ＰＢＬで吸収処理すると他の細胞との反 応性が除かれることから（図１Ａ及び図２）、これらの組織すべてに同一の異種 抗原が存在していることを示している（図１及び図２）。ＥＣを用いて血清プー ルを吸収処理すると、ＥＣ反応性抗体がすべて除かれる（図２Ａ）と同時に、す べてのＰＢＬ反応性抗体が完全に除かれ、かつＲＢＣ血球凝集性抗体がほとんど すべて除かれる（力価が１/１２８〜１/2に落ちる）（図１Ａ）。ＲＢＣで吸収 処理するとＥＣ反応性抗体の７５％が除かれ（図２Ｂ）、脾細胞で吸収処理する とＥＣ反応性抗体が完全に除かれる（図２Ｃ）ことが、フローサイトメトリー（ 流動細胞計測法）で判明した。このようにブタの赤血球、ＰＢＬ、脾細胞及び内 皮細胞には共通のエピトープが存在している。ＥＣで吸収処理した血清は、ＰＢ Ｌ及び脾細胞に対しては試験しなかった。図１Ｂについては、図３参照。 図２：吸収処理の前後における、プールしておいたヒト血清とブタＥＣの試験 。各グラフにおいて、吸収処理した血清（点線）又は未吸収血清（実線）を用い てＥＣを試験した。血清の吸収処理は、ＥＣ（グラフＡ）、ＲＢＣ（グラフＢ） 及び脾細胞（グラフＣ）を用いて行った。ヒト抗体の結合は、ヒツジ抗ヒトＩｇ Ｍで検出し、フローサイトメトリーで分析した。 図３：処理済ヒト血清及び未処理ヒト血清の血球凝集力価。未処理ヒト血清（ Ａ）；プロテインＡ非結合免疫グロブリン（Ｂ）；プロテインＡ溶離免疫グロブ リン（Ｃ）；2-メルカプトエタノールで処理した血清（Ｄ）。図１Ｂは、同じデ ータを示すとともに、高分子量免疫グロブリン画分を用いて得られた追加データ も示してある。図１Ｂ：未処理ヒト血清（Ａ）：プロテインＡ非結合免疫グロブ リン（Ｂ）；高分子量免疫グロブリン画分（Ｃ）；プロテインＡ溶離免疫グロブ リン（Ｄ）；2-メルカプトエタノールで処理した血清（Ｅ）。 図４：正常ヒト血清の血球凝集反応の炭水化物による阻止。ヒト血清の力価を 各種の３００ｍＭ炭水化物溶液の存在下で測定した。 図５：正常ヒト血清の血球凝集力価を５０％阻止する炭水化物濃度。図４で血 球凝集を阻止した炭水化物だけをこの実験に使用し、グルコース及びメチル-β- ガラクトピラノシドを陰性対照として用いた。 図６：メリビオースカラムによる吸収処理の前後におけるヒト血清の、ブタＲ ＢＣに対する血球凝集力価。同じ体積のメリビオースセファロース（黒塗りの棒 ）又はセファロース（中抜きの棒）でヒト血清を吸収させ、その吸収処理の回数 を図の横軸に示す。 図７：クローンｐＰＧＴ-４のｃＤＮＡインサートをプローブとして用いたブ タゲノムＤＮＡのサザーンブロッティングの結果。配列表の簡単な説明 配列番号：１ ブタＧａｌα（1,3）トランスフェラーゼの部分塩基配列及 び部分予想アミノ酸配列。 配列番号：２ ブタＧａｌα（1,3）トランスフェラーゼの全塩基配列及び 全予想アミノ酸配列。 配列番号：３ ＰＣＲプライマーαＧＴ-１の塩基配列。 配列番号：４ ＰＣＲプライマーαＧＴ-２の塩基配列。 配列番号：１及び配列番号：２に関して、本発明はこれらに示す特定の配列に 限定されるものではなく、上述の変異体に加え、ブタα（1,3）ガラクトシルト ランスフェラーゼ遺伝子の天然に産する対立型変異体、さらにこれらの配列に示 したアミノ酸配列を変えないような核酸変異（例えば、縮重コドンの３番目のヌ クレオチドの変更）も含まれる。 実施例１ 材料と方法 細胞 ブタの細胞と組織は屠殺場で屠殺直後の動物から入手した。全血を ８００×ｇで遠心して、赤血球（ＲＢＣ）を得てリン酸塩類緩衝溶液（ＰＢＳ） で３回洗浄し、ブタ末梢血中リンパ球（ＰＢＬ）はＩＳＯＰＡＱＵＥＦＩＣＯＬ Ｌを用いた密度勾配遠心法で単離した（Ｖａｕｇｈａｎ他，Ｔｒａｎｓｐｌａｎ ｔａｔｉｏｎ ３６：４４６-４５０，１９８３）。ブタ脾細 胞は脾臓全体から得たもので、組織を篩に通すことでバラバラに細切して単細胞 懸濁液とした。内皮細胞（ＥＣ）の培養は、無菌ブタ大動脈をコラゲナーゼ・タ イプ４（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．社製，米 国ニュージャージー州）で処理した後、単離した細胞をゼラチン被覆平板上ダル ベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａ ｕｓｔｒａｌａｓｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ.社製，オーストラリア国ニューサウスウ ェールズ州セブンヒルズ）中３７℃で増殖させることにより、確立した。これら のＥＣ培養細胞が内皮細胞由来のものであることは、ウサギ抗ヒトフォンビルブ ランド因子抗体（Ｄａｋｏ Ａ/Ｓ社製，コペンハーゲン）及び間接免疫蛍光法で 確認した。用いたＣＯＳ細胞は完全補足ＤＭＥＭ培地中で維持した。 抗体 ヒト血清は一群の健常献血者から得たもので、使用前に加熱不活化 してプールしておいたものである。ｍＡｂ ＨｕＬｙ-ｍ３（ＣＤ４８）を陰性対 照として用いた（上掲のＶａｕｇｈａｎ他の報文）。ＩｇＭの破壊には、ヒト血 清を同じ体積の５〜２００ｍＭの2-メルカプトエタノールと３７℃で１時間イン キュベートした。 吸収 プールしておいた血清を同体積の洗浄充填細胞に３７℃で１５分間 、４℃で１５分間吸収させ、得られた血清について同じ操作を３回繰り返した。 メリビオース-アガロース（Ｓｉｇｍａ社製，米国ミズーリ州セントルイス）及 びセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製 ，スウェーデン国ウプサラ）を用いた吸収の場合は、同体積の充填ビーズと血清 を３７℃で１６時間インキュベートして、遠心でビーズを除去し、この吸収操作 を数回繰り返した。 血清学的アッセイ ａ）血球凝集反応：９６穴プレートに入ったヒト血清 ５０μｌに０．１％ブタＲＢＣを５０μｌ加え、３７℃で３０分間、室温で３０ 分間及び氷浴上で６０分間インキュベートしてから、血球凝集の有無について巨 視的及び顕微鏡学的に判定した。ｂ）ロゼット形成：塩化第二クロムでヒツジ抗 ヒトＩｇＧをヒツジＲＢＣにカップリングして、ロゼット形成アッセイ（Ｐａｒ ｉｓｈ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０：１７３-１８３，１９７ ８）に用いた。ｃ）サイトフルオログラフィ分析はＦＡＣＳｃａｎ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製，米国カリフォルニア州サンホセ）で 行った（Ｖａｕｇｈａｎ他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３３：１１３-１１ ７，１９９１）。ｄ）間接免疫蛍光分析は、フルオレセイン標識ヒツジ抗ヒトＩ ｇＭ又はＩｇＧ（Ｓｉｌｅｎｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ社 製，オーストラリア国ヴィクトリア州ホーソーン）を用いて、６穴組織培養平板 上の細胞単層で行った（上掲のＶａｕｇｈａｎの報文）。 糖阻害 次の２通りの糖阻害アッセイを行った。ａ）９６穴プレートに入 ったヒト血清２倍稀釈系列５０μｌに５０μｌの糖を加え、４６℃で一晩インキ ュベートし、次いで０.１％ブタＲＢＣを５０μｌ加えて血球凝集アッセイを行 った。ｂ）血球凝集力価が５０％となる稀釈率よりも低い稀釈率でＰＢＳ中に稀 釈したヒト血清を糖２倍稀釈系列（３００ｍＭから開始）に加えて、４６℃で一 晩インキュベートし、しかる後に０.１％ブタＲＢＣを５０μｌ加えて血球凝集 アッセイを行った。 ネズミＧａｌα（1,3）トランスフェラーゼｃＤＮＡ構築体 マウスα（1 ,3）ガラクトシルトランスフェラーゼの公知の配列（Ｌａｒｓｅｎ他，Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０-１４２９７，１９８９）及びポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用して、マウスα（1,3）ガラクトシルトランス フェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを生産した。簡単に述べると、成熟α ＧＴの最初の６個のアミノ酸をコードしたセンスオリゴヌクレオチドであってＨ ｉｎｄIII制限酵素部位を含んでいるαＧＴ-１（５′-ＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣ Ｔ ＴＡＴＧＡＴＣＡＣ ＴＡＴＧＣＴＴＣＡＡＧ-３′）と、成熟αＧＴの最後の５ 個のアミノ酸とインフェーズ終結コドンをコードしたアンチセンスオリゴヌクレ オチドであってＰｓｔＩ制限酵素部位を含んでいるαＧＴ-２（５′-ＧＡＡＴＴ ＣＣＴＧＣ ＡＧＴＣＡＧＡＣＡＴ ＴＡＴＴＣＴＡＡＣ-３′）の２種類のオリ ゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド対を使用して、Ｃ５７ＢＬ /６脾細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｓａｎｄｒｉｎ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ９４：１６３６-１６４１，１９９２）から１１８５ｂｐフラグメントを増幅し た。この１１８５ｂｐフラグメントを低ゲル化点アガロースゲルで精製し、Ｈｉ ｎｄIII及びＰｓｔＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）制限エンドヌクレアーゼで消 化して、 Ｔ４リガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてＨｉｎｄIII／ｐｓｔＩ消化 ＣＤＭ８ベクター（Ｓｅｅｄ，Ｂ.，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０-８４２，１ ９８７）に指向的にクローニングした。この連結産物でＭＣ１０６１/ｐ３を形 質転換して、生成コロニーから以降の研究用ＤＮＡを調製した。以降の研究のた めに、１１８５ｂｐフラグメントを有する１種類のプラスミド（ｐａＧＴ-３） を選択した。プラスミドＤＮＡを調製して、正しいＤＮＡ配列であることを確認 するためにその配列を決定し、ＤＥＡＥ/デキストランを利用したＣＯＳ細胞ト ランスフェクション実験（Ｖａｕｇｈａｎ他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３ ３：１１３-１１７，１９９１；Ｓａｎｄｒｉｎ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９ ４：１６３６-１６４１，１９９２；Ｓｅｅｄ，Ｂ.，Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４ ０-８４２，１９８７）に使用した。 実施例２ ヒト抗ブタ抗体による各種細胞に存在するエピトープの検出 ヒト血清中にブタ細胞に対する抗体が含まれていて、それが主にＩｇＭクラス からなっていることを確認するために、ヒト血清のプール（１０人のドナーから 得た）を調製し、ブタ赤血球（血球凝集テストによる）、ブタリンパ球（ロゼッ ト形成テスト及びフローサイトメトリーによる）、ブタ脾細胞（ロゼット形成テ ストによる）及びブタ内皮細胞（フローサイトメトリーによる）と反応する抗体 が含まれていることを見出だした（図１及び図２）。吸収試験の結果は、ＲＢＣ ・脾細胞又はＰＢＬで吸収処理すると他の細胞との反応性が除かれることから（ 図１Ａ及び図２）、これらの組織すべてに同一の異種抗原が存在していることを 示していた（図１及び図２）。ＥＣを用いて血清プールを吸収処理すると、ＥＣ 反応性抗体がすべて除かれる（図２ａ）と同時に、すべてのＰＢＬ反応性抗体が 完全に除かれ、かつＲＢＣ血球凝集性抗体がほとんどすべて除かれる（力価が１ /１２８〜１/２に落ちる）（図１Ａ）。ＲＢＣで吸収処理するとＥＣ反応性抗体 の７５％が除かれ（図２Ｂ）、脾細胞で吸収処理するとＥＣ反応性抗体が完全に 除かれる（図２Ｃ）ことが、フローサイトメトリーで判明した。このようにブタ の赤血球、ＰＢＬ、脾細胞及び内皮細胞には共通のエピトープが存在している。 プロテインＡ-セファロースカラム（ＩｇＭは結合しない）に血清を通しても 血清の力価が変化せず（図３）、プロテインＡ-セファロースカラムから溶離し たＩｇＧ抗体がほんのわずかしかＲＢＣと反応しないことから分かる通り、血清 プール中の活性のほとんどはＩｇＧではなくてＩｇＭによるものであった。さら に、ＩｇＭは破壊するがＩｇＧを損なうことのない2-メルカプトエタノールで血 清を処理すると、抗体活性が完全に失われた（図３）。血清をセファクリルゲル クロマトグラフィーで分画すると、高分子量画分（ＩｇＭ）はＲＢＣと反応性を 有していたが、低分子量画分（ＩｇＧ）は反応性を有していなかった（データは 示さず）。このように、様々なブタ細胞が同じようなエピトープを有しており、 すべてがＩｇＭ抗体と反応し、我々のアッセイではブタ細胞に対するヒト血清中 にはＩｇＧ活性は少ししか見出だせなかった。 実施例３ 主に末端ガラクトース残基に対するヒト抗ブタ抗体の反応 様々な炭水化物による血球凝集反応の阻止能力を調べた（図４）。力価の減少 で阻止能力を測定すると、テストした糖のうち、５００ｍＭのガラクトース、メ チル-α-D-ガラクトピラノシド、メリビオース及びスタキオースで阻止が観察さ れ（これらすべてについて血清プールの力価が７５％低下した）（図４）、３０ ０ｍＭのD-ガラクトサミンで力価が５０％低下したのが観察された（図４）。こ れら以外のテストした単糖類（図４の中の説明に記載）では、いずれも、血球凝 集力価には何の影響もなかった（図４）。メリビオースもスタキオースも末端ガ ラクトース残基を有していることから、上記の結果はガラクトースがエピトープ の一部であることを示している。興味深いことに、α（メチル-α-D-ガラクトピ ラノシド、メリビオース及びスタキオース）型の立体配置とβ（メチル-β-D-ガ ラクトピラノシド）型の立体配置のガラクトースでは血清阻止能力に差がある（ β型立体配置のものは血清を阻止する能力がない）。 凝集を阻止する糖に対する抗体の相対的な結合活性を、凝集力価を５０％阻止 する糖の濃度から、評価した。こうした阻止は、D-ガラクトース及びメリビオー スでは１.５ｍＭ未満で達成され、スタキオース及びメチル-α-D-ガラクトピラ ノシドでは４.７ｍＭで達成され、D-ガラクトサミンでは１８.７ｍＭで達成され た（図５）。対照的に、D-グルコース及びメチル-β-D-ガラクトピラノシドでは ３００ｍＭ濃度でも何の影響もみられなかった。このように、D-ガラクトースは 低濃度（＜１.１５ｍＭ）でも異種抗体の強い阻害剤であるので、D-ガラクトー スがエピトープの重要な部分である。また、メチル-α-D-ガラクトピラノシドが 低濃度（＜１.１５ｍＭ）で凝集を阻止する能力をもち、それとは対照的にメチ ル-β-D-ガラクトピラノシド（３００ｍＭ）が阻止能力をもっていなかったこと は、ガラクトース残基（これが末端糖残基である可能性が高い）が次の残基とβ 結合ではなくてα結合で結合していることを示している。α結合した末端ガラク トース残基を有するメリビオース（Ｇａｌα（1,6）Ｇｌｃ）及びスタキオース （Ｇａｌα（1,6）Ｇａｌα（1,6）Ｇｌｃβ（1,2）Ｆｒｕ）で得られた結果は 、この結論に一致する。ガラクトサミン（ガラクトースにアミン側鎖の付加した もの）で観察された血球凝集阻止（１８.７ｍＭにおいて力価の５０％が阻止） は、エピトープに関与する２番目の炭水化物によるためか或いはこの糖に対する 異種抗体の親和性が低いことによるためであると考えられる。 ガラクトースとの反応をさらに詳しく調べるために、血清プールを同じ体積の メリビオースセファロース又はセファロース（対照）で４回吸収処理し、メリビ オースセファロースで１回吸収処理すると抗体の力価が１/３２〜１/４まで下が り、２回連続して吸収処理するとそのさらに１/２まで低下した（図６）。セフ ァロースビーズを用いても何の効果もみられなかった（図６）ことから分かる通 り、このような吸収はメリビオースに特異的であった。このように、異種抗原と 反応性をもつ抗体の大多数（＝９４％）はα結合したガラクトースと反応する。 実施例４ α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼでトランスフェクションしたＣＯＳ 細胞とヒト抗ブタ抗体との反応 α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼ（末端の次のガラクトースにα（1 ,3）結合した末端ガラクトース残基を転移する酵素）をコードするｃＤＮＡは、 マウス（Ｌａｒｓｅｎ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０-１４ ２９７，１９８９）及びウシ（Ｊｏｚｉａｓｓｅ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０-１４２９７，１９８９）の両方で既にクローニ ングされている。そのデータを利用して、我々はＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピト ープの役割を調べるためのトランスフェクション実験を他の単離に用いた。マウ ストランスフェラーゼをＰＣＲ技術を用いてｃＤＮＡライブラリーから単離して 、そのＰＣＲ産物をＣＤＭ８ベクターに指向的にクローニングしてＣＯＳ細胞中 での発現実験を行った。このｃＤＮＡインサートは、報告されているヌクレオチ ド配列（Ｌａｒｓｅｎ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０-１４ ２９７，１９８９）と同一であった。旧世界ザル由来のＣＯＳ細胞を選んだのは 、この細胞がヒト血清ともＩＢ-４レクチン（このレクチンはＧａｌα（1,3）Ｇ ａｌエピトープに対して特異的である）とも反応しないからである（表１）。α （1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼでＣＯＳ細胞をトランスフェクション した後、ＩＢ-４レクチンとの結合によって、その細胞表面にＧａｌα（1,3）Ｇ ａｌエピトープが検出されたが（表１）、この細胞は血清プールとも強い反応性 を有していた。ヒト血清をブタＲＢＣで吸収処理すると、Ｇａｌα（1,3）Ｇａ ｌ⁺ＣＯＳ細胞に対する反応性が除去された（表１）。血清をプロテインＡ-セフ ァロースカラムに通しても、ＦＩＴＣ抱合ヒツジ抗ヒトＩｇＭを第２抗体として 用いたときの血清のＧａｌα（1,3）Ｇａｌ⁺ＣＯＳ細胞に対する反応性には何の 影響も現れなかった（この結果は反応性細胞の数、染色強度及び血清の力価が同 じことに反映されている（表１））。この結果とは対照的に、上記カラムから溶 離させた抗体はＧａｌα（1,3）Ｇａｌ⁺ＣＯＳ細胞とはほんの少ししか反応せず 、そうした反応もＦＩＴＣ抱合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ又はＦＩＴＣ抱合ヒツジ抗ヒ トＩｇを第２抗体として用いたときにだけ観察され、ＦＩＴＣ抱合ヒツジ抗ヒト ＩｇＭを用いたときには観察されなかった（表１）。このように、ヒト血清は、 Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ⁺ＣＯＳ細胞で発現したＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピトー プに対するＩｇＭ抗体を有している。ＣＤ４８⁺ＣＯＳ細胞が血清ともＩＢ-４レ クチンとも反応しないこと（表１）から分かる通り、こうした血清とＧａｌα（ 1,3）Ｇａｌ⁺ＣＯＳ細胞の反応は特異的なものであり、トランスフェクション操 作によるものではない。さらに、ブタのＲＢＣ（血球凝集法で検出）及びＥＣ（ ＦＡＣＳ分析で検出）に対する反応性がＧａｌα（1,3）Ｇａｌ⁺ＣＯＳ細胞での 吸収処理で除去されるのに対して、未トランスフェクションＣＯＳ細胞での吸収 処理では除去されない。このように、ヒト血清プールにはＧａｌα（1,3）Ｇａ ｌエピトープに対する反応性をもつＩｇＭ抗体が含まれている。 ヒト血清中に含まれるＧａｌα（1,3）Ｇａｌ反応性抗体のレベルは、ブタ異 種移植片に対して患者が超急性拒絶を起こす傾向を求めるのに利用することがで きる。さらに、このような抗体レベルは、このような異種移植の前に患者に投与 すべき抗体アンタゴニストの量の決定に利用することもできる。 こうした抗体のレベルは、上述のトランスフェクションＣＯＳ細胞及び未トラ ンスフェクションＣＯＳ細胞をＧａｌα（1,3）Ｇａｌ⁺及びＧａｌα（1,3）Ｇ ａｌ^-吸収剤として用いて、次いでブタのＲＢＣ及び／又はＥＣに対する吸収処 理血清の反応性を測定することによって、効果的に決定することができる。血清 抗体のレベルが高いほど、Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ⁺吸収剤に吸収させた血清の反 応性とＧａｌα（1,3）Ｇａｌ^-吸収剤に吸収させた血清の反応性との差が大きく なる。他の生物種由来の細胞（例えばヒトの細胞）もこうしたアッセイに使用す ることができる。また、ネズミのトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を 用いる代りに、ブタのトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列（実施例５参 照）を用いることもできる。ネズミとブタのトランスフェラーゼではそれらの作 用に差異（例えば、酵素のガラクトース基質の巨大分子環境に対する感受性の違 い）がみられる可能性があり、ブタの異種移植に関して問題となるのはブタの巨 大分子環境下でのＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープに対する抗体のレベルであ るので、こうしたブタのトランスフェラーゼが好ましい。 上述の事項に加え、上記のトランスフェクションしたＧａｌα（1,3）Ｇａｌ^- 細胞は、ヒト血清から抗Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ抗体を除去するための吸収剤と して用いることもでき、例えば、こうした細胞を固体担体に結合して、その固定 化細胞に血清を通せばよい。 実施例５ ブタα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼのクローニング ネズミのα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡクローンをハ イブリダイゼーションプローブとして利用して、λＧＴ１１ブタ脾ｃＤＮＡライ ブ ラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，カリフォルニア州 パロアルト）からＳａｍｂｒｏｏｋ他の文献（上掲）に記載された常法に従いブ タα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼをクローニングした。このクロー ンｐＰＧＴ-４はＡＧＡＬに寄託されており、その受託番号はＮ９４/９０３０で ある。配列番号：１は、クローンｐＰＧＴ-４の配列解析によって決定したブタ Ｇａｌα（1,3）トランスフェラーゼの部分塩基配列及び部分予想アミノ酸配列 である。この配列は５′末端側が不完全である。 ｐＰＧＴ-４クローンのｃＤＮＡインサートをハイブリダイゼーションプロー ブとして利用して、λＧＴ１０中の５′ＳＴＲＥＣＨブタ肝ｃＤＮＡライブラリ ーからＳａｍｂｒｏｏｋ他の文献（上掲）に記載された常法に従いブタα（1,3 ）ガラクトシルトランスフェラーゼの５′末端をクローニングした。上記インサ ートは、λオリゴヌクレオチド及びブタの配列に合わせて作製したオリゴヌクレ オチドを用いたＰＣＲ技術で得た。このＰＣＲ産物をＳｍａＩ切断ｐＢＬＵＥＳ ＣＲＩＰＴＫＳ⁺にクローニングした。このクローンｐＰＧＴ-２はＡＧＡＬに寄 託されており、その受託番号はＮ９４／９０２９である。 配列番号：２は、クローンｐＰＧＴ-４及びｐＰＧＴ-２の配列解析によって決 定したブタＧａｌα（1,3）トランスフェラーゼの全塩基配列及び全予想アミノ 酸配列である。このブタのトランスフェラーゼの配列はネズミ及びウシα（1,3 ）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のいずれとも高い相同性を示す。 配列番号：１及び配列番号：２の部分ｃＤＮＡ及び全ｃＤＮＡのいずれも、上 述の異種移植治療に用いることができる。例えば、当業者に周知の技術を利用し て、配列番号：１又は配列番号：２のいずれかのヌクレオチド配列の全体又は一 部を、複製ＤＮＡ・ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡベクターに挿入すれば、これを用 いてトランスジェニック細胞又は動物中でアンチセンスＲＮＡが発現するように 仕向けることによって、ブタ細胞中でのＧａｌα（1,3）トランスフェラーゼの 発現を低下させることができる。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６（１０）：９ ５８-９７６，１９８８などを参照。 さらに、次の実施例で説明する通り、配列番号：１又は配列番号：２の配列は 、ブタα（1,3）トランスフェラーゼをコードするゲノムクローンの性状分析や 単離 のためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることもできる。ゲノムヌ クレオチド配列の変異体も、上述した通りブタ細胞中で機能的遺伝子の破壊を起 こすような相同的組換え技術に用いることができる。 実施例６ α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするブタ遺伝子の性質並び にその単離 ブタ脾組織から調製したゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、 ＨｉｎｄIII、ＫｐｎＩ及びＢｓｔＥIIで消化して、０.８％アガロースゲル上で 電気泳動し、ナイロンフィルターに移して、最終洗浄を０.１×ＳＳＣ，０.１％ ＳＤＳ中６５℃で行った。図７に示す通り、ゲノムのサザーンブロッティングの 結果は単純なパターンを示しており、この遺伝子がゲノムサイズ約２５ｋｂの単 コピーとして存在していることが示唆される。 ｐＰＧＴ-４クローンのｃＤＮＡインサートをハイブリダイゼーション用のプ ローブとして利用して、ブタゲノムＤＮＡＥＭＢＬライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅ ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，カリフォルニア州パロアルト）からＳａ ｍｂｒｏｏｋ他の文献（上掲）に記載された常法に従いブタα（1,3）ガラクト シルトランスフェラーゼ遺伝子をクローニングした。このクローニングの結果、 ブタトランスフェラーゼ遺伝子の異なる領域を含んだλＰＧＴ-ｇ１とλＰＧＴ- ｇ５の２つのλファージクローンを単離した。 上述の通り、相同的組換え技術を利用して目標とする酵素のネイティブな遺伝 子を破壊するために、α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子を用 いることができる。この技術で用いられる慣用技術によれば、このような遺伝子 破壊は、この実施例で得られたようなゲノムクローンから得られるフラグメント を利用して行われる。遺伝子破壊は体細胞又は幹細胞で行うことができる（上掲 のＣａｐｅｃｃｈｉの１９８９の報文参照）。このような遺伝子操作を施した細 胞はＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープを産生しないので、こうした細胞自体又 はその子孫はヒトの体内で超急性拒絶反応を誘起する可能性が少なく、人間の患 者への異種移植に適している。 実施例７ ヒト抗Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ抗体に対する抗イディオタイプ抗体の生産 ヒト抗Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ抗体に対するポリクローナル抗イディオタイプ 抗体は、上掲のＣｏｌｉｇａｎ他の１９９２年の報文、上掲のＨａｒｌｏｗ及び Ｌａｎｅの１９８８年の報文並びに上掲のＬｉｄｄｅｌｌ及びＣｒｙｅｒの１９ ９１年の報文に記載された手順にしたがって、調製される。プールしておいたヒ ト血清からヒト抗Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ抗体を実施例３に記載した通り固定化 メリビオース（メリビオース-セファロース又はメリビオース-アガロース）に吸 収させる。抗体を、常法（高ｐＨ）低ｐＨ、高塩濃度及び／又はカオトロピック 試薬など）を用いて溶離する。適当な緩衝液中で透析した後Ｆａｂ′フラグメン トを調製する。Ｆａｂ′フラグメントを慣用のアジュバントと共に用いてウサギ 、ヤギその他の適当な動物を免疫する。 得られたポリクローナル抗血清がヒト抗体の反応性部位のコンホメーションを 変えてＧａｌα（1,3）Ｇａｌエピトープに対するその親和性を低下させる能力 を有しているか否かについて試験する。そうした親和性を低下させる血清が所望 の抗イディオタイプ抗体を構成する。 モノクローナル抗体は、同じＦａｂ′フラグメントをマウスの適当な株を免疫 するための抗原として用いることによって生産される。こうして免疫したマウス の脾細胞をマウスのミエローマ細胞と融合することによってハイブリドーマを作 る。上清を試験して、ヒト抗体の反応性部位のコンホメーションを変えてＧａｌ α（1,3）Ｇａｌエピトープに対するその親和性を低下させる能力をもつ抗体の 有無を確認する。そうした親和性を低下させる抗体が所望のモノクローナル抗イ ディオタイプ抗体を構成する。 異種反応性ＩｇＭのほとんどが一種類のトランスフェラーゼに対するものであ るという今回の知見から、相同的組換え技術を利用しての標的α（1,3）ガラク トシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊によって、当該エピトープを欠いたトラ ンスジェニックブタを生産できる見込みが増した。このような遺伝的に改変した ブタは移植に用いることができるはずである。上記遺伝子を破壊しても、通常は 当該遺伝子がなくてもブタ及びヒトの生命には何の悪影響も及ぼさないであろう 。 本発明を例示するために説明してきたが、本発明は本明細書中に記載された特 定の実施例に限定されるものではない。寄託 上記のクローンｐＰＧＴ-４、ｐＰＧＴ-２、λＰＧＴ-ｇ１及びλＰＧＴ-ｇ５ は、それぞれ、受託番号Ｎ９４/９０３０、Ｎ９４/９０２９、Ｎ９４/９０２７ 、Ｎ９４/９０２８として、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｍｅｎｔ Ａｎａ ｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（略号ＡＧＡＬ；住所：１Ｓｕａｋ ｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ｎ.Ｓ.Ｗ．２０７３，Ａｕｓｔｒａｌｉａ ）に寄託されている。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認 に関するブダペスト条約（１９７７）に基づいて行われたものである。これらの 寄託は１９９４年３月１１日になされた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 9359−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/10 9/10 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マッケンジー、イアン・エフ オーストラリア、ビクトリア州 3055、ウ エスト・ブランズウィック、ブランズウィ ック・ロード 359、

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の配列を含んでなる単離核酸分子。 （ａ）配列番号：１の連続するヌクレオチドからなるセンス配列であって、当 該センス配列がブタゲノムに特有のものであると同時にブタα（1,3）ガラクト シルトランスフェラーゼ遺伝子の同定及び／又は単離のためのＰＣＲプライマー 又はハイブリダイゼーションプローブとして十分に役立つ鎖長をもつものである センス配列；又は （ｂ）上記配列（ａ）に相補的なアンチセンス配列；又は （ｃ）上記配列（ａ）と（ｂ）の両方。 ２ 請求項１記載の単離核酸分子にして、前記センス鎖が配列番号：１の少な くとも２１個の連続するヌクレオチドを含んでいることを特徴とする単離核酸分 子。 ３ 下記の配列を含んでなる単離核酸分子。 （ａ）配列番号：２の連続するヌクレオチドからなるセンス配列であって、当 該センス配列がブタゲノムに特有のものであると同時にブタα（1,3）ガラクト シルトランスフェラーゼ遺伝子の同定及び／又は単離のためのＰＣＲプライマー 又はハイブリダイゼーションプローブとして十分に役立つ鎖長をもつものである センス配列；又は （ｂ）上記配列（ａ）に相補的なアンチセンス配列；又は （ｃ）上記配列（ａ）と（ｂ）の両方。 ４ 請求項３記載の単離核酸分子にして、前記センス鎖が配列番号：１の少な くとも２１個の連続するヌクレオチドを含んでいることを特徴とする単離核酸分 子。 ５ ブタゲノムに特有のヌクレオチドの配列を含んでなるクローン化ブタゲノ ムＤＮＡ分子にして、当該ＤＮＡ分子が請求項１記載の単離核酸分子と特異的に ハイブリダイズすることを特徴とするクローン化ブタゲノムＤＮＡ分子。 ６ ブタゲノムに特有のヌクレオチドの配列を含んでなるクローン化ブタゲノ ムＤＮＡ分子にして、当該ＤＮＡ分子が請求項３記載の単離核酸分子と 特異的にハイブリダイズすることを特徴とするクローン化ブタゲノムＤＮＡ分子 。 ７ ブタゲノムに特有のヌクレオチドの配列を含んでなるクローン化ブタゲノ ムＤＮＡ分子にして、当該ＤＮＡ分子が配列番号：１に示すヌクレオチド配列を もつ核酸プローブと特異的にハイブリダイズすることを特徴とするクローン化ブ タゲノムＤＮＡ分子。 ８ ブタゲノムに特有のヌクレオチドの配列を含んでなるクローン化ブタゲノ ムＤＮＡ分子にして、当該ＤＮＡ分子が配列番号：２に示すヌクレオチド配列を もつ核酸プローブと特異的にハイブリダイズすることを特徴とするクローン化ブ タゲノムＤＮＡ分子。 ９ ヒト抗Ｇａｌα（1,3）Ｇａｌ抗体を阻止する方法にして、当該抗体の反 応性部位のコンホメーションを変化させて当該抗体のＧａｌα（1,3）Ｇａｌエ ピトープに対する親和性を低下させることを含んでなる方法。 １０ 請求項９記載の方法において、前記抗体の反応性部位のコンホメーション を抗イディオタイプ抗体を用いて変化させることを特徴とする方法。 １１ 請求項１記載の単離核酸分子のコピーを含んでなる哺乳動物細胞にして、 当該コピーがネイティブな細胞には存在しないものであることを特徴とする哺乳 動物細胞。 １２ 請求項１１記載の哺乳動物細胞において、前記コピーと当該細胞のゲノム ＤＮＡとの間の相同的組換えの結果として、当該細胞が機能的α（1,3）ガラク トシルトランスフェラーゼを産生しないことを特徴とする哺乳動物細胞。 １３ 請求項３記載の単離核酸分子のコピーを含んでなる哺乳動物細胞にして、 当該コピーがネイティブな細胞には存在しないものであることを特徴とする哺乳 動物細胞。 １４ 請求項１３記載の哺乳動物細胞において、前記コピーと当該細胞のゲノム ＤＮＡとの間の相同的組換えの結果として、当該細胞が機能的α（1,3）ガラク トシルトランスフェラーゼを産生しないことを特徴とする哺乳動物細胞。 １５ 請求項５記載のクローン化ブタゲノムＤＮＡ分子のコピーを含んでなる哺 乳動物細胞にして、当該コピーがネイティブな細胞には存在しないものであ ることを特徴とする哺乳動物細胞。 １６ 請求項１５記載の哺乳動物細胞において、前記コピーと当該細胞のゲノム ＤＮＡとの間の相同的組換えの結果として、当該細胞が機能的α（1,3）ガラク トシルトランスフェラーゼを産生しないことを特徴とする哺乳動物細胞。 １７ 請求項６記載のクローン化ブタゲノムＤＮＡ分子のコピーを含んでなる哺 乳動物細胞にして、当該コピーがネイティブな細胞には存在しないものであるこ とを特徴とする哺乳動物細胞。 １８ 請求項１７記載の哺乳動物細胞において、前記コピーと当該細胞のゲノム ＤＮＡとの間の相同的組換えの結果として、当該細胞が機能的α（1,3）ガラク トシルトランスフェラーゼを産生しないことを特徴とする哺乳動物細胞。 １９ 請求項７記載のクローン化ブタゲノムＤＮＡ分子のコピーを含んでなる哺 乳動物細胞にして、当該コピーがネイティブな細胞には存在しないものであるこ とを特徴とする哺乳動物細胞。 ２０ 請求項１９記載の哺乳動物細胞において、前記コピーと当該細胞のゲノム ＤＮＡとの間の相同的組換えの結果として、当該細胞が機能的α（1,3）ガラク トシルトランスフェラーゼを産生しないことを特徴とする哺乳動物細胞。 ２１ 請求項８記載のクローン化ブタゲノムＤＮＡ分子のコピーを含んでなる哺 乳動物細胞にして、当該コピーがネイティブな細胞には存在しないものであるこ とを特徴とする哺乳動物細胞。 ２２ 請求項２０記載の哺乳動物細胞において、前記コピーと当該細胞のゲノム ＤＮＡとの間の相同的組換えの結果として、当該細胞が機能的α（1,3）ガラク トシルトランスフェラーゼを産生しないことを特徴とする哺乳動物細胞。 ２３ 受託番号ＡＧＡＬ Ｎ９４/９０３０のクローンｐＰＧＴ-４。 ２４ 受託番号ＡＧＡＬ Ｎ９４/９０２９のクローンｐＰＧＴ-２。 ２５ 受託番号ＡＧＡＬ Ｎ９４/９０２７のクローンλＰＧＴ-ｇ１。 ２６ 受託番号ＡＧＡＬ Ｎ９４/９０２８のクローンλＰＧＴ-ｇ５。