JPH08509606A

JPH08509606A - 細胞内感染因子に感染した個体を処置する方法および物質

Info

Publication number: JPH08509606A
Application number: JP52356894A
Authority: JP
Inventors: チュウ，ケティング
Original assignee: ロビンソン，ウィリアムエス．
Priority date: 1993-04-20
Filing date: 1994-04-20
Publication date: 1996-10-15
Also published as: KR960701988A; EP0695347B1; WO1994024267A1; EP0695347A1; EP0695347A4; AU6816194A; CA2161095A1; CN1079830C; DE69435010T2; US5962320A; US5738852A; CN1128043A; DE69435010D1

Abstract

(57)【要約】感染性細胞内病原性因子に対して、個体における少なくとも部分的な免疫を与える組換えポリヌクレオチドが提供される。組換えポリヌクレオチドは、同時刺激因子および/または標的抗原ポリペプチドをコードする。免疫を与える免疫応答は、個体において抗原提示細胞内の両ポリペプチドの発現の結果である。免疫は、標的抗原ポリペプチドを天然にコードする病原性因子に対するものである。

Description

【発明の詳細な説明】細胞内感染因子に感染した個体を処置する方法および物質発明の分野本発明は、新たな感染症を予防し、流行性感染症を治療し、そして細胞内感染因子により引き起こされる慢性感染症を処置する方法に関する。この方法は、Ｔ細胞活性化を同時刺激（costimulate）するリガンド間の相互作用を増強するための遺伝子治療の使用を包含する。さらに詳細には、本発明は、感染因子由来の抗原をコードする遺伝子と、Ｔ細胞活性化を同時刺激するリガンドとが、宿主動物の細胞内で共に発現して、慢性感染症を予防または処置する、遺伝子治療の物質および方法に関する。この方法は、抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することにより、感染因子の抗原に対する免疫応答を刺激または増強し、これにより新たな感染症に対する防御を提供し、または慢性感染症を終息させる。発明の背景多くの感染因子は、宿主生物において感染症および疾患を引き起こし得る；このような感染因子の例には、原生動物（protozoa）、真菌、細菌、ウィルス、および蠕虫（worm）さえもが包含される。これらの感染因子のうち、細胞内で作用するメカニズムを有するものは、予防および処置に対して最も重要な問題となる。このことは、細胞内感染因子の宿主が、ヒトのような哺乳動物である場合に特に事実である。哺乳動物は、感染因子の侵入に対して防御するための幾つかの異なるメカニズムを有する複雑な免疫系を有する。健常な状態では、この免疫系は、最後には感染因子を哺乳動物宿主系から排除するように機能する。ほとんどの感染症は、自己制限的である。なぜなら、哺乳動物の免疫系は、一般的に、この感染因子を排除し得るからである。しかし、免疫系が感染因子の存在に応答し得ないか、または応答しない場合に問題が生じる。この筋書では、感染症は慢性的になり得、そして何年間も持続し得、または感染したヒトまたは動物の生涯にわたってさえ持続し得る；しばしば重度の疾患に至る。伝統的で標準的なワクチンは、感染因子の抗原のような外来抗原に対して免疫系を曝し、抗原特異的免疫応答を誘導する。この免疫応答は、最も頻繁には体液性のものであって、細胞性のものではない。すなわち、この免疫応答は、抗体を産生させるが、以下に述べるＴ細胞に基づく免疫を起こさない。効果的なワクチン接種は感染を防止し、またはそのワクチンが所望される感染因子により引き起こされる感染によって生じる疾患を改変する。中和抗体を誘導する免疫応答は、特定のウィルスによる感染症を予防するのに充分である。Murphyら、（1990）。従って、これらのウィルスによる感染は、中和抗体を誘導する抗原でワクチン接種することにより予防され得る。しかし、幾つかのウィルスおよび非ウィルス性感染因子では、中和抗体は誘導され得ないか、または誘導されたとしても感染および／または疾患の進行を予防するには不十分である。２種の伝統的なワクチンのタイプは、死滅ウィルスまたは生弱毒化ウィルスである。死滅ウィルスは、ビリオン全体、またはその感染性が不活性化された他の感染因子のいずれかから構成される。これらのワクチンはまた、ビリオンまたは他の感染因子の抗原性サブユニットまたは成分部分から構成され得る。これらのワクチンは、非経口接種または粘膜への曝露により投与される。生弱毒化ワクチンは、生ウィルスまたは遺伝的に改変されたビルレンスを有する他の感染因子から構成される。ワクチン接種に用いられる場合には、これらのワクチンは、軽度の疾患を引き起こすか、または全く疾患を引き起こさない。第三のワクチンのアプローチが、研究され、そして実験的に用いられているが、未だに臨床使用には至っていない。このアプローチは、ウィルスまたは細菌のような生きている因子を、異種感染因子のワクチン抗原を発現するためのベクターとして使用するものである。抗原をコードする遺伝子またはヌクレオチド配列は、ベクターにより発現され、そしてワクチン接種に用いられる場合、宿主を抗原に対して曝露させる。抗原に対する免疫応答は、抗原が誘導された感染因子から宿主を防御すると予想される。死滅ワクチンの例には、破傷風トキソイド、インフルエンザウィルスサブユニット、狂犬病ウィルス、ポリオウィルス、およびHBVが包含される。生弱毒化ワクチンの例には、Salmonella tvphi Ty 21-aが包含され、そして生ワクチンの例には、ポリオウィルス、麻疹ウィルス、風疹ウィルス、おたふくかぜウィルス、天然痘ウィルス、および黄熱病ウィルスが包含される。異種ワクチン抗原を発現させるために用いられる生ベクターの例には、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、およびS.typhi Ty 21-a株が包含される。重篤な病状および早期死亡を伴う慢性感染症の例には、２種のヒト肝炎ウィルス、すなわちＢ型肝炎ウィルス（HBV）およびＣ型肝炎ウィルス（HCV）が包含される。これらは、慢性肝炎、肝硬変、および肝癌を引き起こす。ヒトのHBV感染は、特定の動物における密接な関連性のあるヘパドナウィルス（hepadna virus ）により引き起こされる感染症と非常に類似している。このヘパドナウィルスには、Beechey地リスに感染する地リス肝炎ウィルス（GSHV）、ウッドチャックに感染するウッドチャック肝炎ウィルス（WHV）、およびアヒルに感染するアヒルＢ型肝炎ウィルス（DHBV）が包含される。Robinson、Virology、第２版、B．Fie lds編、Raven Press、New York、pp.2137〜2169（1990）。ウィルス性感染因子により引き起こされるヒトの慢性感染症の他の例には、ヒトレトロウィルスにより引き起こされる感染症が包含される：後天性免疫不全症候群（AIDS）を引き起こすヒト免疫不全ウィルス（HIV-1およびHIV-2）；およびＴ細胞白血病およびミエロパシーを引き起こすヒトＴリンパ球向性ウィルス（HTLV-1 およびHTLV-2）が包含される。単純ヘルペスウィルス（HSV）１型および２型、エプスタイン−バー（Epstein Barr）ウィルス（EBV）、サイトメガロウィルス（CMV）、水痘−帯状疱（varicella-zoster）ウィルス（VZV）、およびヒトヘルペスウィルス６（HHV-6）を包含する、ヒトヘルペスウィルスのような多くの他の感染症は、宿主のメカニズムによっては根絶されず、むしろ慢性化し、そしてこの段階で疾患を引き起こし得る。ヒトパピローマウィルスによる慢性的感染は、頚癌を伴う。多くの他のウィルスおよび他の感染因子は、細胞内で複製し、そして宿主の防御メカニズムがそれらを排除することができない場合、慢性化し得る。これらには、病原性原生動物（例えば、Pneumocystis carinii、トリパノソーマ、リーシュマニア、マラリア、およびToxoplasma gondii）、細菌（例えば、ミコバクテリア、サルモネラ、およびリステリア）、および真菌（例えば、カンジダおよびアスペルギルス）が包含される。重要な臨床上の利益を生じる慢性ウィルス感染症の処置は、あまり成功していなかった。なぜなら、そのような処置は、感染を終息させることもウィルスを排除することもないからである。従来の処置には、小さな化学的化合物（例えば、ヌクレオシドアナログ）または生物学的に活性なタンパク質（例えば、インターフェロン）の投与が包含される。これらの処置は、ウィルスの複製を阻害するが、細胞からウィルスを、またはウィルス感染細胞自身を取り除くことはなく、それらを投与している間のみ、限定的な疾患の改善がなされ得る。残念なことに、ウィルス感染症は、薬物の投与が中止されると、しばしば悪化する。一般的な抗ウィルス処置には、慢性HIV感染および関連するAIDSに対するアジドチミジン（AZT）、ジデオキシイノシン（DDI）、およびジデオキシシトジン（ DDC）、ならびにHBV感染および関連する肝疾患に対するアデニンアラビノシド（ araA）、のようなヌクレオシドアナログが包含される。インターフェロンは、同様に、慢性感染症を治療している間はHBVおよびHCVを抑制するが、治療が中止されると、ウィルスは通常、処置前のレベルに戻り、そして疾患は悪化する。細胞内感染因子による進行中の感染症を制御し、そして最終的に排除するために、哺乳動物免疫系により用いられる１つの重要なメカニズムは、特定のＴ細胞を活性化することによる活性化細胞性免疫応答である。Ｔ細胞活性化により、感染細胞表面上のウィルス性抗原（または他の細胞内感染因子抗原）に向けた細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）応答と、感染細胞の除去とが起こる。Guilhotら、J．V irol. ，66:2670-2678（1992）。これは、最終的には、感染細胞および感染細胞内の感染因子の排除を起こす。ウィルス性感染因子に対する免疫応答の一般的な考察については、Whittonら、Virology、第２版、B．Fields編、Raven Press、N ew York、pp.369-381（1990）；およびRoitt、Essential Immunology、第７版（ 1991）を参照のこと。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞レセプター（TCR）が、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）の表面上で、自己MHC（主要組織適合性複合体）分子と複合体化した抗原ペプチドとの３成分複合体を形成する場合に起こる。プロフェッショナルAP Cには、マクロファージおよび活性化Ｂ細胞が包含される。Townsendら、Cell，4 4 :959-968（1986）；Townsendら、Ann．Rev．Immunol.、7:601-624（1989）；Bj orkmanら、Nature，329:512-518（1987）；およびJardetskyら、Nature，353:32 6-329（1991）。この３成分複合体は、同時刺激シグナルが細胞間を通過するのを可能にする。Ｔ細胞活性化は、TCRによる抗原ペプチド−MHC複合体の認識だけでなく、APCの表面上にある「同時刺激因子」と、Ｔ細胞表面上の特異的分子、すなわち「同時刺激リガンド」との相互作用も必要とする。Freemenら、J．Exp ．Med. ，174:625-691（1991）。本明細書中で用いられるように、APC上の同時刺激因子には、Ｔ細胞表面上のCD28およびCTL-4タンパク質に特異的に結合するB7- 1タンパク質、ならびにＴ細胞活性化においてCTLA-4に結合するB7-2およびB7-3 タンパク質が包含されるが、これらに限定されない。Boussiotisら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA ，90:11059-11063（1993）。B7リガンドは、プロフェッショナルAPCによってのみ発現される。Freemanら、J．Exp．Med.，174:625-631（1991 ）；Razi-Wolfら（1992）；およびLarsenら、（1992）。CD28およびB7-1の相互作用は、Ｔ細胞活性化には不可欠であることが示された。 Jenkinsら、J．Immunol.，140:3324-3330（1988）；Linsleyら（1990）；Linsle yら、J．Exp．Med.，173:721-730（1991）；Gimmiら、Proc．Natl．Acad．Sci． USA ，88:6575-6579（1991）；Jenkinsら、J．Immunol.，147:2461-2466（1991）；およびHardingら（1992）。 APC上で見出される同時刺激性分子の１つは、Ｔ細胞表面分化抗原CD28のリガンドであるB7タンパク質である。プロフェッショナルAPCにより典型的に影響されるB7発現は、影響を受けていない（naive）Ｔ細胞の活性化に極めて重要であることが見出された。Larsenら、J．Exp．Med.，176:1215-1220（1992）。他の研究は、Ｔ細胞の機能活性の増加と、B7発現の増加との間に直接的な関係があることを示した。Razi-Wolfら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4210-4214（199 2）。Ｔ細胞は、それらが同時刺激リガンド（これに対しては、CD28がレセプターである）を欠いた細胞上で抗原ペプチドと出会うと、アネルギーとなる。Hard ingら、Nature，356:607-609（1992）。 MHCクラスＩ分子に結合する特異的ウィルス性抗原ペプチド断片が、それらがM HC制限CTLの標的として作用する細胞表面に存在する場合、ウィルス性抗原は感染細胞中で分解され得る。Whittonら、（1990）。しかし、ウィルス感染した宿主におけるほとんどの感染細胞は、同時刺激性タンパク質を発現するプロフェッショナルAPCではない。さらに、B7-1、B7-2、B7-3のような同時刺激性分子を欠いた感染細胞は、有効な細胞性免疫応答を誘導し得ない。このようなメカニズムが不適切であり、かつこれらの因子を排除しない場合、感染は持続し、そして慢性化し得る。 CTL応答のような幾つかの免疫学的メカニズムは、細胞内感染因子により引き起こされた進行中の感染を解消するのに関与するが、それらの免疫学的メカニズムはまた、新たな感染を予防する役割をなし得る。一方、中和抗体のような他の免疫学的メカニズムは、明らかに、進行中の感染症を解消するためよりも特定のウィルス感染症を予防するためにより重要であるようである。中和抗体の場合には、表面抗原に対して向けられた抗体は、ウィルスの凝集を促進して最終的に血流からウィルスを除去することにより、ウィルスの感染性を中和化するように作用し得る。ウィルス中和抗体により典型的にブロックされるウィルス感染もまた、同一の中和抗体を誘導する抗原で免疫化することにより予防され得る。しかし、他の細胞内感染因子に対しては、中和抗体は誘導され得ないか、または誘導されても防御には不十分である。それにもかかわらず、適切な免疫化因子を導入することにより、防御作用は与えられ得る。このような場合には、細胞性免疫メカニズムは、免疫化因子が感染に対して防御を行う能力を促進するようである。免疫応答により防御が行われるためには、免疫化因子は強力で持続的なCTL応答を誘導しなければならない。Murphyら、Virology、第２版、B．Fieldsら編、Raven Press、New York、pp.469-502（1990）。従って、強力なCTL応答を誘導することにより、ウィルスのような細胞内感染因子に対する免疫応答を増強する方法が必要とされてきた。本発明は、この必要性を満たしている。発明の要旨本発明は、ウィルス、原生動物、真菌、または細菌のような細胞内感染因子に対する、個体の免疫応答を増強する物質および方法を提供する。このような因子には、Ｔ細胞活性化のための同時刺激因子（以後、「同時刺激因子」）および感染因子由来の「標的抗原」をコードするベクターが包含される。このベクターは、ポリヌクレオチドとしてのものか、またはウィルスアッセンブリー内にパッケージされたもののいずれかであり、処置されるべき個体に直接投与されるか、あるいは、細胞内に挿入されて、次いでこの細胞が処置されるべき個体に投与されるかのいずれかである。同時刺激因子をコードする遺伝情報および標的抗原の投与は、特に、標的抗原が由来する感染因子に感染した細胞に向けられたCTLの生成を誘導することにより、免疫応答を増強する。従って、本発明の１つの実施態様は、転写調節領域に作動可能に連結した同時刺激因子をコードする領域を含み、さらに転写調節領域に作動可能に連結した標的抗原ポリペプチドをコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドである。個体内での同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドの発現は、天然に標的抗原ポリペプチドをコードする細胞内感染因子に対して、個体における少なくとも部分的な免疫を与える。この組換えポリヌクレオチドは、以下に記載するように、ウィルスベクターまたは他のベクターを含み得る。本発明の別の実施態様は、転写調節領域に作動可能に連結した同時刺激因子をコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドと、転写調節領域に作動可能に連結した標的抗原ポリペプチドをコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドとで形質転換された宿主細胞である。個体内での同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドの発現は、天然に標的抗原ポリペプチドをコードする細胞内感染因子に対して、少なくとも部分的な免疫を与える。本発明のさらに別の実施態様は、転写調節領域に作動可能に連結した同時刺激因子をコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドと、転写調節領域に作動可能に連結した標的抗原ポリペプチドとをコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドとを使用する方法である。この方法は、この組換えポリヌクレオチドを治療上有効な量で個体に投与する工程；および標的抗原を天然にコードする細胞内病原体により、感染に対する応答に伴う身体的症状の軽減化を測定する工程を包含する。本発明のさらに別の実施態様は、このポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換する工程を包含する、上記組換えポリヌクレオチドを使用する方法である。この方法により調製された宿主細胞およびそれらの子孫もまた、請求の範囲とされる。図面の簡単な説明図１は、２種のウィルスベクターの線図である。発明の詳細な説明同時刺激因子の重要な役割は、ウィルス抗原のような所望の標的抗原を発現する細胞を、Ｔ細胞活性化を促進するために、有効なAPCにすることである。同時刺激因子（またはその機能性部分）を標的抗原と同時に発現する系を作製することにより、得られる応答は、感染宿主細胞の除去および新たな感染に対する非感染宿主細胞のより強い防御を導く。本発明は、同時刺激因子および標的抗原の機能性部分をコードする個々の遺伝情報中に導入する免疫治療が、感染哺乳動物宿主の免疫応答を活性化するおよび／または促進するために用いられ得ることを教示する。この促進は、標的抗原が由来する細胞内感染病原体により起こる感染に対する細胞応答、および感染病原体の新たな感染を防ぐために非感染細胞において誘導された防御免疫応答を包含する。本明細書で用いた以下の用語は、次のように定義される。用語「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマーを意味し、そして産物の特定の長さを意味しない；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを意味しないかまたは除外する。定義内に包含されて、例えば、アミノ酸の１つまたはそれ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを包含する）を包含するポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、ならびに天然に存在するおよび天然に存在しない両方の、当該分野で公知の他の改変物である。本明細書中で用いられるように、「形質転換」は、挿入に用いた方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ因子交配またはエレクトロポレーションにかかわらなく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を意味する。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持され得、またはあるいは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。本明細書中で用いられるように、「処置（treatment）」は、予防および／または治療を意味する。処置の有効性は、細胞内病原体により起こる病気に通常関連する１つまたはそれ以上の徴候の緩和により測定され得る。「細胞内病原体」は、感受性個体で病状を起こし得る病原体を意味し、そこでは病原体の複製サイクルの一部分または全てが感染個体の細胞内で起こる。細胞内病原体は、例えば、原生動物、真菌、細菌、およびウィルスを包含する。「ヘルパー細胞」または「Ｔ_H細胞」は、Ｔ細胞の機能性サブクラスを意味し、それは、細胞障害性Ｔ細胞の生成を補助し得、そして抗体応答の産生においてＢ細胞と協同する。ヘルパー細胞は、通常、クラスII MHC分子に関連する抗原を認識する。「抗原特異的Ｔ細胞クローン」は、単一の細胞の子孫を包含する；このタイプのクローンの細胞は、同じ表現型であり、そして全て同じ抗原に対して標的とされる。抗原特異的Ｔ細胞クローンを調製する方法は、当該分野で公知である。用語「組換え発現ベクター」は、形質転換、エレクトロポレーション、形質導入またはウィルス感染により標的細胞中に導入され得る形態にあるDNAまたはRNA の複製可能単位を意味し、そしてそれは、異種の構造コーディング配列、例えば、サイトカインの発現をコードする。異種構造コーディング配列は、遺伝子発現で調節の役割を有するエレメントの制御下で、mRNAに転写されそしてタンパク質に翻訳される。このようなベクターはまた、好ましくは適切な転写および翻訳制御配列（コーディング配列に作動可能に連結した開始配列を含む）を含み得る。本明細書中で用いられるように、「組換え」は、特定のDNA配列が、天然系に見い出される相同配列と区別可能な構造コーディング配列を有する構築物を生じるクローニング工程、制限酵素処理工程、および連結反応工程の種々の組合せの産物であることを意味する。一般に、構造コーディング配列、例えば、サイトカインをコードするDNA配列は、cDNA断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ得、組換え転写単位で発現され得る合成遺伝子を提供する。このような配列は、好ましくは、代表的には、真核生物遺伝子に存在する、内部の非翻訳配列またはイントロンにより分断されないオープンリーディングフレームの形態で提供される。適切な配列を含むゲノムDNAがまた用いられ得る。非翻訳DNAの配列が、オープンリーディングフレームの5’側または3’側に存在し得、ここで、このような配列はコーディング領域の操作または発現を妨げない。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」、および微生物または単一細胞の存在物として培養された高等真核生物細胞株を示す他のこのような用語は、組換えベクターまたは他の転移ポリヌクレオチドの受容体（recipient）として用いられ得るまたは用いた細胞を意味し、そしてトランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。単一の細胞の子孫は、自然変異、偶発変異、故意の変異のために、形態もしくはゲノムまたは全DNA補足物において元の親と完全に同一である必要はないことが理解される。 CTLが抗原を有する細胞を選択的に認識および溶解し得る場合、CTLは抗原を発現する細胞に「細胞溶解的に特異性」である。CTLが、このような細胞を選択的に認識し得るその能力に関してではなく、抗原を有する細胞を溶解し得る場合、 CTLは抗原を発現する細胞「に対して細胞溶解的に反応性」である。「抗原特異的な発現」は、Ｔ細胞がその同起源（cognate）抗原を認識する場合に起こる発現を意味する。「同起源抗原」は、MHC分子に関連する場合、抗原のペプチド部分が、リガンドを認識するリンパ球に結合するリガンドを形成し、そして細胞のエフェクター機能および/または増殖に対するシグナルの誘発を起こす抗原を意味する。「標的抗原」は、細胞で発現する場合、抗原を発現する細胞で、CTL応答に向けて誘導し得るその抗原を意味する。「アグレトープ（agretope）」は、抗原または抗原性断片をMHC分子に結合可能にする、抗原または抗原性断片の部分である。「活性化リンパ球」は、同起源抗原ペプチドの結合の結果としてのリンパ球である：MHC分子は結合したリガンドのないリンパ球に対して高められたレベルでポリペプチド刺激因子（例えば、サイトカインを包含する）を生産している。「転写調節領域」は、転写に必要な全てのエレメントを包含し、そして調節および細胞特異的転写に必要なエレメントを包含し得る。従って、転写調節領域は、少なくともプロモーター配列を包含し、そしてまた、エンハンサーのようなその他の調節配列、および転写因子結合部位を包含し得る。「作動可能な連結」は、そのように記載された構成成分が、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を意味する。例えば、プロモーターが、その転写または発現に影響する場合、プロモーターは、コーディング配列に作動可能に連結される。用語「組換え」ポリヌクレオチドまたは核酸は、天然に存在せず、またはそうでなければ２つの分離した配列のセグメントの人工的な組合せにより作製されるものを意味する。この人工的な組合せは、化学合成方法、または核酸の単離セグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子工学技術のいずれかによりしばしば達成される。それは、通常、コドンを、同一または保存アミノ酸をコードする重複コドンで置換するために行われるが、代表的には、配列認識部位を導入または除去する。あるいは、所望の機能の組合せを生成するために、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合するために実行される。「調節配列」は、遺伝子の発現（遺伝子の転写、およびメッセンジャーRNAの翻訳、スプライシング、安定性などを包含する）に影響する遺伝子座の（例えば、50kb以内の）コーディング領域に通常関連する配列を意味する。調節配列は、特に、プロモーター、エンハンサー、スプライス部位およびポリアデニル化部位を包含する。核酸の「センス鎖」は、同起源mRNAの配列に対して配列相同性を有する配列を包含する。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」の配列に相補的である配列を包含する。本明細書中で用いられるように、「個体」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを意味し、そして家畜、運動用動物、およびヒトを含む霊長類に限定されないが、これらを包含する。「免疫化」は、治療剤または予防剤の投与により個体を免疫状態にすることを意味する。「免疫」は、標的抗原が由来する病原体による感染に対する応答に関連する１つまたはそれ以上の身体の徴候の軽減化および／または予防を意味する。組成物またはワクチンに対する「免疫応答」は、宿主における、標的抗原をコードする細胞内感染病原体に対して細胞性および／または抗体介在性免疫応答の発達である。通常、このような応答は、CTLおよび／またはＢ細胞および／または標的抗原を発現するAPCに特異的に作用する種々のクラスのＴ細胞を個々に生産することを包含する。組成物の「治療上有効な量」は、標的抗原を天然にコードする細胞内感染病原体に対する免疫応答を誘導するおよび／または免疫を付与するに十分な投与量である。本発明の実施は、特に他に指示がなければ、当該分野の公知技術である分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技法を使用し得る。このような技法は文献で十分に説明されている。例えば、以下を参照のこと、Sambrook， Fritsch，およびManiatis，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，第2版（ 1989）、OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS（M.J．Gait編、1984），ANIMAL CELL CULT URE（R.I．Freshney編、1987），一連のMETHODS IN ENZYMOLOGY（Academic Pres s，Inc.）；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS（J.M．MillerおよびM .P．Calos編、1987）、HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY，（D.M．WeirおよびC.C．Blackwell編）；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，（F.M．A usubel，R．Bren t，R.E．Kingston，D.D．Moore，J.G．Siedman，J.A．Smith，およびK．Struhl 編、1987）；およびCURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY（J.E．Coligan，A.M．Kr uisbeek，D.H．Margulies，E.M．ShevachおよびW．Strober編、1991）。上記および下記の両方で本明細書に記載の全ての特許、特許出願、および刊行物は、参考として本明細書に援用されている。本発明によれば、標的抗原を発現しそしてＴ細胞応答、好ましくはCTL応答を刺激し得るAPCは、１つまたはそれ以上の組換えポリヌクレオチドの挿入によりインビボまたはインビトロのいずれかで作製され、この組換えポリヌクレオチドは、少なくとも１つの同時刺激因子および少なくとも１つの標的抗原ポリペプチドをコードする配列を、同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドが、受容体宿主細胞内で発現されるように含む。組換えポリヌクレオチドから発現した同時刺激因子は、同時刺激因子を発現する細胞のその同時刺激リガンドへの結合を可能にするに十分なタンパク質の少なくとも部分を包含し得る。このような結合を測定する方法は、当該分野で公知である。例えば、試験されるべき細胞を⁵¹Crで標識しそして次いでCD28⁺およびCD2 8^-CHO細胞のいずれかとインキュベートし、そしてCHO細胞への標識細胞の接着を⁵¹ Cr放出により測定する手順を記載するLinsleyらを参照のこと。Proc．Natl．A cad．Sci．USA ，87:5031-5035（1990）。同時刺激因子の細胞外ドメインおよびトランスメンブランドメインは、通常ポリペプチドに包含され、そして好ましい実施態様では、完全な同時刺激因子がコードされる。同時刺激因子をコードするポリヌクレオチドの配列および機能性ドメインは公知であり、そして例えば、Linsleyら、（1990）（ヒト）およびFreemanら、J ．Immunol. ，143:2714-2722（1989）（マウス）に記載されている。組換えポリヌクレオチドから発現した標的抗原ポリペプチドは、病原性細胞内微生物内で天然にコードされ、それに対して促進または増加した免疫応答が望まれる標的抗原の全部または断片であり、そしてその微生物由来の１つまたはそれ以上のアグレトープからなる。標的抗原は、好ましくはウィルス由来であり、そして特に、慢性感染を生じるウィルス、例えば、ヘパドナスウィルス（HBVを含む）、レンチウィルス（HIVを含む）、ヘルペスウィルス（HSV-1、HSV-2、EBV、 CMV、VZV、およびHHV-6を含む）、およびフラビウィルス／ペスチウィルス（HCV を含む）由来である。また、慢性ウィルス感染を起こすウィルスには、ヒトレトロウィルス、例えば、Ｔ細胞白血病およびミエロパシーを起こすヒトＴリンパ球性ウィルス（HTLV-1およびHTLV-2）が包含される。慢性感染を起こす他の生物は、例えば、病原性原生動物（例えば、Pneumocystis carinii、トリパノソーム、マラリアおよびToxoplasma gondii）、細菌（例えば、ミコバクテリア、サルモネラおよびリステリア）および真菌（例えば、カンジダ属およびコウジカビ属）を包含する。多くのこれらのウィルス（異なった種、株、および単離株を含む）のヌクレオチド配列は、当該分野で公知である。概説は以下を参照：Robi nson（1990）（ヘパドナウィルス科）；Levy，Microbiological Reviews，57:18 3-289（1993）（HIV）；およびChooら、Seminars in Liver Disease，12:279-28 8（1992）（HCV）。特に適切な標的抗原は、感染の間、Ｔ細胞応答、および特に CTL応答を誘導する抗原である。これらは、例えば、HBV由来のコア抗原、Ｅ抗原、および表面抗原（HBsAg）を包含し得る。HBsAgに対するポリヌクレオチド配列は、種々の表面抗原サブタイプ由来のpre-S1、pre-S2およびＳ領域を含有し、当該分野で公知である。例えば、以下を参照のこと、Okamotoら、J.Gen．Virol.，67 :1383-1389（1986）；Genbank受託番号DOO329およびDOO330。HIV糖タンパク質 gp160および他の抗原性HIV領域をコードするポリヌクレオチド配列が当該分野で公知である。Lautenbergerら、Nature，313:277-284（1985）；Starcichら、Cel l ，45:637-648（1986）；Wileyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83:5038-5042 （1986）；およびModrowら、J.Virol.，61:570-578（1987）．融合し得るまたは融合し得ない２つまたはそれ以上の標的抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチドを包含することは、本発明の範囲内にある。この２つの標的抗原ポリペプチドは、同一の病原性細胞内微生物由来であり得、または１つ以上の微生物に対する免疫応答を増強することが所望される場合、異なる微生物由来であり得る。同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドをコードする配列は、転写調節領域に作動可能に連結される。転写調節領域は、当該分野で公知であり、例えば、以下より単離した領域を包含する：ヒトサイトメガロウィルス（HCMV）IE94プロモーター領域（Boshartら、Cell，41:521-530（1985））；ヒトIL-2遺伝子（Fujitaら、Cell，46:401-407（1986））；ヒトIFN-γ遺伝子（Ci ccaroneら、J．Imunol.，144:725-730（1990））；ヒトIL-3遺伝子（Shoemaker ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:9650-9654（1990））；ヒトIL-4遺伝子（ Araiら、J．Immunol.，142:274-282（1989））；ヒトリンホトキシン遺伝子（Ne dwinら、Nucl．Acids．Res.，13:6361-6373（1985））；ヒト顆粒球-マクロファージCSF（GM-CSF）遺伝子（Miyatakeら、EMBO J.，4:2561-2568（1985））；ヒトパーフォリン遺伝子（Lictenheldら、J．Immunol.，143:4267-4274（1989））；ヒト519遺伝子（Manningら、J．Immunol.，148:4036-4042（1992））；ヒトグランザイムB（CTLA-1）遺伝子（Haddadら、Gene，87:265-271（1990））；ヒトC TLA-4遺伝子（Harperら、J．Immunol.，147:1397-1044（1991））；ヒトCGL-2遺伝子（Heuselら、J．Biol．Chem.，266:6152-6158（1991））；ヒトグランザイムH遺伝子（Haddadら、Int．Immunol.，3:57-66（1990））；ヒトIL-2レセプター、α鎖遺伝子（Crossら、Cell，49:47-56（1987））；マウスＴ細胞活性化3（ TCA-3）遺伝子（Wilsonら、J．Immunol.，141:1563-1570（1988））；およびヒトCD69遺伝子。本発明の幾つかの実施態様では、転写調節領域はハイブリッドである。例えば、エンハンサー領域（例えば、HCMV IE転写調節領域由来および／またはSV40初期プロモーター領域由来）を転写調節領域の上流に挿入し得る。あるいは、またはさらに、多重の転写因子結合部位（例えば、NF-ATおよび／またはNFKB）が、転写調節領域の上流に挿入され得、または転写調節領域の上流領域と他の近位領域とを組み合わせた上流領域に挿入され得る。分泌シグナルがまた、適切な場合、天然タンパク質由来もしくは同一または関連の種の他の分泌ポリペプチド由来のいずれかにかかわらず含まれ得、タンパク質が細胞膜を通過および／または入り込むことを可能にし、そしてそれゆえその機能的トポロジーを達成し、または細胞から分泌される。さらに、組換えポリヌクレオチドを運ぶ細胞の選択を可能にするポジティブマーカーを組換えポリヌクレオチド中に含むことは有用である。ポジティブ選択可能マーカーは、宿主細胞内に導入される場合に、この遺伝子を運ぶ細胞のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この型の遺伝子は、当該分野では公知であり、そしてその遺伝子としては、特に、ヒグロマイシンＢに対する耐性を与えるヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ hph）、抗生物質G418に対する耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoまたはaph）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DH FR）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ADA）、および多重薬剤耐性（MDR ）遺伝子が挙げられる。同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドをコードする配列は、別々のポリヌクレオチド上に存在し得るが、好ましくは、同じポリヌクレオチド上に存在する。これらをコードする配列はまた、別の転写調節配列の制御下にあるか、あるいは同じ転写調節配列の制御下にある。転写調節領域に加えて、幾つかの実施態様では、同時刺激因子および標的抗原をコードするポリヌクレオチドは、組換え発現ベクターの形態をとる。核酸操作の技術は、例えば、Sambrookら（1989）、Ausubelら（1987）；およびAnnual Reviews of Biochemistry，61:131-156（1992）に一般的に記載されている。このような技術を適用するのに有用な試薬（制限酵素など）は、当該分野では広く知られており、多くのメーカーから市販されている。本発明の細胞を作製するために用いられる大量のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞中での複製により生産され得る。所望の断片をコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片は、組換え核酸構築物、典型的にはポリヌクレオチド構築物内に組み込まれ得る。これらの構築物は、原核細胞または真核細胞内に挿入可能であり、かつ原核細胞または真核細胞内で複製可能である。通常は、これらの構築物は、酵母または細菌のような単細胞宿主中での複製に適しているが、これらはまた、ゲノム内での組込みでもっておよび組込みなしで、培養された哺乳動物細胞系または植物細胞系または他の真核細胞系への導入に対しても意図され得る。本発明の方法により生産される核酸の精製は、例えば、Sambrookら（1989）の中に記載されている。本発明において用いられるポリヌクレオチドはまた、化学合成によって、例えば、BeaucageおよびCarruthers，Tetra.Letts.，22:1859-1862（1981）により記載されるホスホルアミダイト法あるいはMatteucciら，J．Am．Chem．Soc.，103: 3185（1981）により記載される方法によるトリエステル法によって、部分的にまたは全部として生産され得、そして市販の自動オリゴヌクレオチド合成機により行われ得る。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適切な条件下でその鎖を一緒にアニーリングすることによって、あるいはDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を適切なプライマー配列と共に加えることによってのいずれかにより、化学合成により生産された一本鎖物から得られ得る。複製のための原核生物または真核生物の宿主細胞内への導入のために調製されたポリヌクレオチド構築物は、典型的には、宿主により認識される複製系を含み、所望のポリペプチドをコードする目的の組換えポリヌクレオチド断片を包含する。このようなベクターは、標準的組換え技術によって調製され得、この標準的組換え技術は、当該分野では周知であり、例えば、Sambrookら（1989）またはAu subelら（1987）において議論されている。好ましくは、クローニング段階の間、ポリヌクレオチド構築物は、選択可能マーカー、すなわちベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む。この遺伝子の存在は、挿入物を発現するそれらの宿主細胞だけの増殖を確実にする。典型的な選択遺伝子は、（a）抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートなどに対する耐性を与える；（b）栄養素要求性欠損を補う、あるいは（c）複合培地からは利用不可能な臨界栄養素を供給する、タンパク質をコードし、例えば、BacilliのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。適切な選択可能マーカーの選択は宿主細胞に依存し、そして異なる宿主に対する適切なマーカーは当該分野では周知である。同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、幾つかの方法により個体内に導入され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、宿主細胞、例えば、樹枝状細胞、または皮膚バイオプシー由来の細胞内にエクスビボで導入され得る。組換えポリヌクレオチドを含む細胞は、個体に免疫性を与えるために用いられ得る。細胞は、通常、注入により投与され、各注入は、少なくとも10⁶から10¹⁰細胞/m²の範囲で、好ましくは少なくとも10⁷から10⁹細胞/m² の範囲で行われる。クローンは、単回注入により、あるいはある時間範囲での多回注入により、投与され得る。しかし、個々の個体では、応答性がさまざまであると予想されるので、注入される細胞のタイプおよび量、ならびに注入の回数および多回注入が行われる時間範囲は、診療する医師または獣医により決定され、そして定期検査により決定され得る。同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびアデノ関連ウィルス（AAV）ベクターの使用を含む形質導入を包含する当該分野で公知の手段によって、ならびに特に、当該分野で公知のレトロウィルス遺伝子導入の方法を用いることによって、エクスビボで所望の細胞内に導入され得る。遺伝子送達のために組換え感染ウィルス粒子を利用する種々の感染技術が開発されてきた。これは、本発明への好ましいアプローチである。このような方法で用いられてきたウィルスベクターとしては、シミアンウィルス40（SV40；Karlss onら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:158（1985））、アデノウィルス（Karl ssonら，EMBO J.，5:2377（1986））、AAV（Carter，Current Opinion in Biote chnology 1992，3:533-539）、およびレトロウィルス（Coffin，Weissら（編），RNATumor Viruses，第２版，第２巻，Cold Spring Harbor Laboratory，New Y ork，1985，pp.17-71）由来のウィルスベクターが挙げられる。従って、遺伝子の導入および発現の方法は、多数あるが、哺乳動物細胞において遺伝物質を導入および発現するように本質的に作用する。上記の技術の幾つかは、造血細胞またはリンパ系細胞に形質導入するために用いられ、カルシウムホスフェートトランスフェクション（Bermanら，（1984））、プロトプラスト融合（Deansら，（198 4））、エレクトロポレーション（Cannら，Oncogene，3:123（1988））、および組換えアデノウィルスによる感染（Karlssonら，（1986））；Reutherら，Mol．Cell．Biol. ，6:123（1986）；AAV（Carter（1985））およびレトロウィルスベクター（Over ellら，Oncogene 4:1425（1989））が挙げられる。レトロウィルスベクターは、真核細胞内への遺伝子導入のための非常に効果的な方法を提供し、この方法は、本発明のポリヌクレオチドの送達に好適な方法である。さらに、レトロウィルスの組み込みは、制御された様式で行われ、そして細胞１個当たり新しい遺伝情報の１または数コピーの安定な組み込みを生じる。レトロウィルスは、鳥類または哺乳動物の宿主細胞の染色体DNA内に組み込まれる二本鎖DNA中間体を提供するようにウィルスRNAゲノムを複製するために、ウィルスがコードするRNA依存性DNAポリメラーゼ、すなわち逆転写酵素を用いて複製するウィルスの１クラスである。ほとんどのレトロウィルスベクターは、ネズミレトロウィルス由来である。しかし、本発明による使用に適合可能なレトロウィルスは、任意の鳥類または哺乳動物の細胞源由来であり得る。これらのレトロウィルスは、好ましくは両栄養性であり、これは、これらのレトロウィルスが、ヒトを含む幾つかの種の広範な宿主の範囲の宿主細胞に感染可能であることを意味する。レトロウィルスゲノム（および本明細書中に記載されるように使用されるレトロウィルスベクター）の特性的特徴は、レトロウィルスの長末端反復（long terminal repeat）、すなわちLTRであり、これは、レトロウィルスゲノムの5’および3’末端でのわずかに変異した形態に見出される約600塩基対の非翻訳領域である。プロウィルスとしてDNA内に組み込まれる場合、レトロウィルスのLTRは、各末端での短い直接反復配列と、RNAポリメラーゼIIによる転写の開始ならびにRNA転写物の3’開裂およびポリアデニル化のためのシグナルとを含む。LTRは、ウィルス複製に必要な他のすべてのシス作用配列を含む。用語「プロウィルス」は、適切な宿主細胞中で染色体DNA中に安定に組み込まれるレトロウィルスのDNA逆転写物、またはそのクローン化コピー、またはレトロウィルスDNAの非組み込み中間形態のクローン化コピーをいう。プロウィルスの順方向転写および感染性ウィルスへのアセンブリは、適切なヘルパーウィルスの存在下で、または汚染ヘルパーウィルスの同時産生なしにキャプシド化を可能にする適切な配列を含む細胞株で起こる。Mannらは、組換えレトロウィルスのヘルパーのないストックを産生するために使用され得る「パッケージ化」細胞株（例えばΨ2）の開発を記載する。Cell，33:153（1983）。パッケージ化細胞株は、キャプシド化にシスで要求される配列を欠くが、完全な（intact）ビリオンをトランスで生成するために必要なすべての遺伝子産物を提供する、組み込まれたレトロウィルスゲノムを含む。組み込まれた変異体プロウィルスから転写されたRNAは、それ自身パッケージ化され得ないが、これら細胞は、同一細胞中に導入された組換えレトロウィルスから転写されたRNAをキャプシド化し得る。得られるウィルス粒子は、感染性であるが、複製欠損であり、それらを、キャプシド化を可能にする相補的遺伝情報を欠く細胞内に導入した後に感染性ウィルスを生成し得ない有用なベクターにする。エコトロピックウィルスエンベロープをコードするトランス作用エレメントを保有する細胞株（例えばΨ2）におけるキャプシド化は、エコトロピック（限られた宿主範囲）な子孫ウィルスを提供する。あるいは、両栄養性パッケージ化遺伝子を含む細胞株（例えば、PA317、ATCC CRL 9078）におけるアセンブリは、両栄養性子孫ウィルスを提供する。MillerおよびButtimore、Mol．Cell．Biol.，6 :2895（1986）。そのようなパッケージ化細胞株は、必要なレトロウィルスgag、 polおよびenvタンパク質をトランスで提供する。この戦略は、哺乳動物細胞に対して高度に感染性であるが、その一方、それらが標的細胞のゲノム中に組み込まれた後にさらなる複製をし得ないレトロウィルス粒子の産生を生じる。env遺伝子産物は、標的細胞の表面上のウィルスレセプターへのレトロウィルスの結合の原因となり、そしてそれゆえ、レトロウィルスの宿主範囲を決定する。PA317細胞は、両栄養性エンベロープタンパク質を有するレトロウィルス粒子を産生し、それはヒトおよび他の種起源の細胞を形質導入し得る。他のパッケージ化細胞株は、エコトロピックなエンベロープタンパク質を有する粒子を産生し、それはマウスおよびラット細胞のみを形質導入し得る。多くのレトロウィルスベクター構築物が、多くの外来遺伝子を発現するために首尾良く使用されている（例えは、Coffin（1985）参照）。挿入された配列を有するレトロウィルスベクターは、一般に機能的であり、そして一貫してレトロウィルス感染に対して阻害的である配列はほとんど同定されていない。機能的ポリアデニル化モチーフは、レトロウィルスRNA合成をブロックすることによりレトロウィルス複製を阻害し、そしてレトロウィルス粒子にパッケージ化され得る約 11kbの上限サイズの配列がある；しかし、複数の内部プロモーターの存在が初期には問題であると考えられていたが、いくつかのレトロウィルス構築物では良好に許容されることが見い出された。Coffin（1985）；およびOverellら，Mol．Ce ll．Biol. ,8:1803（1983）。多くの遺伝子産物がレトロウィルスベクターで発現されている。このことは、発現されるべき配列を、レトロウィルスLTR中に取り込まれたプロモーターの転写制御の下に置くことにより、またはLTR間に挿入された異種プロモーターの制御下にそれらを置くことのいずれかにより達成され得る。後者の戦略は、ベクター中の優性選択可能マーカー遺伝子を同時発現する方法を提供し、従って特定のベクター配列を発現する細胞の選択を可能にする。本発明の他の実施態様においては、同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、処置されるべきおよび/または免疫されるべき個体中に直接導入される。１つの実施態様では、本発明のポリヌクレオチドが、処置されるべき個体に直接投与される。この方法では、ポリヌクレオチドが同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドの両方をコードすることが好ましい。さらに、ポリヌクレオチドが発現ベクターの形態であることが好ましい。ポリヌクレオチドは、適切な賦形剤と混合され、そして当該分野で公知の任意の適切な手段により個体に投与される。この手段は、例えば、非経口的（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、および皮下を含む）摂取、リポフェクション、および経皮的を含む。適切な賦形剤は当該分野で公知であり、そしてポリヌクレオチドが投与されるべき個体種、および投与様式に依存し得る。個体に投与されるべきポリヌクレオチド量は、免疫化される個体に免疫を与えるに十分な量である。この量は、処置される個体に依存して変動し得、そして処置する医者または獣医により決定され得る。投与されるべき量ならびに投与の時間（感染前または感染後）および単回または多回であるかの投与回数は、当業者に公知の規定的な方法により決定される。本発明の別の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ビリオン中にキャプシド化され、そして個体は、キャプシド化ポリヌクレオチドで処理される。使用されるビリオンは、遺伝子治療手順に適切である当該分野で公知である任意のビリオンであり得、それらのいくつかはエクスビボでの細胞中へのポリヌクレオチドの導入について上記で論議される。投与様式は使用されるビリオンに依存し、そして、例えば、非キャプシド化ポリヌクレオチドの投与について上記に掲げられた様式を含み得る。ビリオンが、適切な賦形剤中で調製され、そして個体に投与される。投与されるべき量ならびに投与の時間（感染前または感染後）および単回または複数回であるかの投与回数は、投与する医師または獣医により決定され、そして当業者に公知の規定的な方法により得られ得る。以下の実施例は、当業者である実施者に対するさらなる指針として提供され、そしていかなる方法においても本発明を制限するとして解釈されるべきではない。実施例１ B7ポリペプチドおよびGSVH c-ポリペプチドをウィルス標的抗原ポリペプチドとしてコードする発現ベクターの設計 Beechey地リスの慢性地リス肝炎ウィルス（GSVH）感染は、ヒトにおけるHBV感染のモデルシステムである（Seegerら、J.Virol．51:367-375（1984）を参照）。本実施例では、B7遺伝子発現のレトロウィルスベクター構築物およびGSVHのc- 抗原（cAg）をコードする遺伝子が記載される。ベクター構築物は、モロニーネズミ白血病ウィルス（MMLV）ベースの複製不能ベクターpMV-7（Ausubelら（1989）；および Kirschmeierら、DNA、7:219-225（1988））を利用する。pMV-7はHSVチミジンキナーゼ（TK）プロモーターの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を含むので、ベクターを含む細胞の組織培養における選択が可能になる。プレコア配列を含むGSHV c-遺伝子を、標的抗原をコードするポリヌクレオチド配列として用いる。GSVH c-遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖応答（PCR）によってウィルスゲノム（EMBC/Genbank受諾番号K02715）から単離する。Marionら、Proc .Natl．Acad．Sci．USA 、77:2941-2945（1980）およびSeeger（1984）。次いで、単離されたGSHV c-遺伝子をMMLV LTRの制御下でpMV-7ベクターに導入する。ヒトB7 cDNA（EMBL/Genbank受諾番号M27533）を、公開されているcDNA配列から設計されたプライマーを用いて、RajiヒトＢ細胞株のB7 mRNAからPCRによって増幅されたcDNAとしてクローニングする。Freeman（1989）。B7-1遺伝子をコードするcDNAをCMV即時型プロモーターによる制御下でGSVH c-遺伝子と同一のベクターに導入した。Gaballeら、J．Virol．62:3334-3340（1988）。 B7ポリペプチドおよびcAgポリペプチドをコードするpMV-7ベースのベクター構築物を、レトロウィルスパッケージ化細胞株であるpsi-2にトランスフェクトした。Millerら、Mol.Cell．Biol.、6:2895-2902（1986）。次いで、トランスフェクトされた細胞を、ネオマイシンを含有する培地で培養することによって選択する。ネオマイシン培養で増殖した細胞によって生成された両栄養性エンベロープを有する複製不能レトロウィルスが培地中で見られた。実施例２ B7ポリペプチドおよびGSVH GSHsAg-ポリペプチドをウィルス標的抗原ポリペプチドとしてコードする発現ベクターの設計プレ-S1、プレ-S2およびＳ領域を含む地リス肝炎表面抗原（GSHsAg）をコードするGSVHポリヌクレオチドをGSVH cAgをコードするGSVHポリヌクレオチドに置き換えることを除いて、構築物を実施例１と同様に調製する。上記のＳ領域をコードするポリヌクレオチド配列は、Seegerら（1984）に記載されている。実施例３ GSHVに対する非感染個体へ免疫を与えるためのB7ポリペプチドおよびGSHsAgをコードするベクターの使用 B7ポリペプチドおよびGSHsAgポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む両栄養性エンベロープ（10⁷組織培養感染単位）にパッケージされた感染性レトロウィルスベクターで構成される、治療上有効な量の組成物を、非感染で GSHVにかかりやすいBeechey地リスに非経口投与する。Seegerら（1984）。ベクターは実施例２に記載されたように構築されている。「非感染で」GSHVにかかりやすい地リスは、地リス肝炎ウィルスコア抗原に対する検出可能な血清抗体（抗 -GSHcA g）あるいは地リス肝炎ウィルス表面抗原に対する検出可能な抗体（抗-GSHsAg）を有していない。B7遺伝子およびGSHV遺伝子を含むレトロウィルスベクターを非経口投与した結果、血清抗GSHsAg応答およびGSHsAgを発現する細胞に対するCTL 応答が起こる。２つの応答、すなわち、血清応答およびCTL応答によって、GSHVによる将来の感染に対する免疫が非感染の地リスに少なくとも部分的に与えられる。実施例４慢性ウィルス感染の処置のための、B7ポリペプチドおよびGSHsAgポリペプチドをコードするベクターの使用感染の処置のために、B7ポリペプチドおよびウィルス標的抗原をコードするポリヌクレオチドを慢性的にGSHV感染した動物に投与するためには、異なる２つの方法を用い得る。B7ポリペプチドおよびGSHsAgポリペプチドをコードするベクターの感染哺乳動物への直接送達両栄養性エンベロープにパッケージされ、B7ポリペプチドおよびGSHcAgポリペプチドをコードする感染性レトロウィルスベクターを、実施例１と同様に構築する。治療上有効な量のベクターを、慢性GSHV感染した地リスに非経口投与する。レトロウィルスベクター由来のポリペプチドの発現が、GSHcAgを発現する細胞に対するCTL応答を含む、地リスによる免疫応答に与える影響をモニターする。さらに、ウィルスDNAの存在、GSHsAgの存在、および疾患と関連した病原性の影響を含む、疾患の慢性における影響をモニターする。処置された個体における身体的症状および／あるいはGSHsAgおよび／あるいはGVSH DNAの減少は、GSHVが引き起こした慢性疾患の軽減および／または終息を示している。B7ポリペプチドおよびGSH cAgをコードするベクターでエクスビボでトランスフェクトした細胞による感染哺乳動物の処置感染個体の皮膚バイオプシーから単離した線維芽細胞を培養し、B7ポリペプチドおよびGSHcAgポリペプチドをコードするレトロウィルスベクターでトランスフェクトする。ベクターを実施例１に記載されているように構築する。次いで、ネオマイシン含有培地で細胞を培養することによって、感染された（形質導入された）細胞を選択する。GSHcAgを発現する細胞を、抗HBcを用いた蛍光染色法（IFA ）および抗B7モノクローナル抗体（mAb）を用いたELISAによるB7タンパク質発現を用いることによって同定する。GSHcAGおよびB7を発現する治療上有効な量の自己細胞を、GSHV感染地リスに静脈注入する。移植された細胞におけるレトロウィルスベクター由来のポペプチドの発現が、 GSHcAgを発現する細胞に対するCTL応答を含む、地リスによる免疫応答に与える影響をモニターする。さらに、ウィルスDNAの存在、GSHsAgの存在、および疾患と関連した病原性の影響を含む、疾患の慢性における影響をモニターする。処置された個体における身体的症状および／またはGSHsAgおよび／またはGVSH DNAの減少は、GSHVが引き起こした慢性疾患の軽減および／または終息を示している。実施例５ B7およびHBSを発現するためのレトロウィルスベクターの構築図１は、インビボでの細胞におけるB7-1との同時発現によるＢ型肝炎表面抗原（HBS）への免疫応答の増加を示すための組換えレトロウィルスベクターを示す図である。レトロウィルスベクターpMV-7 DNAを、pMV-7のポリリンカーで挿入されたHBSコード配列を有する組換えベクター907；ならびに、HBSコード配列、脳心筋炎ウィルス（EMC）のキャップ非依存性翻訳エレメント（CITE）およびネズミB7-1のコード配列のすべてをpMV-7のポリリンカーで挿入された同一のオープンリーディングフレーム内に有する組換えベクター1016を構築するために使用した。各組換えベクターを、ネズミBalbcパッケージ化細胞株をリン酸カルシウムD NA法によってトランスフェクトするために用い、各ベクターを含有する細胞をネオマイシン含有細胞培地で培養することによって選択した。組換えベクター907 を含有するように選択されたパッケージ化細胞個体群ネオマイシンおよび組換えベクター1016に対して選択されたパッケージ化細胞個体群ネオマイシンは、Balb c 3T3細胞にネオマイシン耐性を与える能力によってアッセイされ得るウィルスを放出した。組換えウィルス907に感染したネオマイシン耐性Balbc 3T3細胞は、ELISAによってHBSを放出することが示された。組換えウィルス1016に感染したネオマイシン耐性Balbc 3T3細胞は、上記のようなHBS、およびB7-1タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたFACS分析によってB7-1 タンパク質を発現することが示された。各タイプの細胞（２×10⁷）およびトランスフェクトされていないBalbc 3T3細胞を、HBSに対する免疫応答を調査するために、腹腔内経路によって10匹のBalbcマウスの別々のグループに各々接種した。ELISAによって測定された抗HBS、インビトロでHBSに被曝された脾臓細胞の増殖、およびHBS発現Balbc 3T3細胞からのクロム51の放出による脾臓細胞の細胞障害活性を、各グループの５匹のマウスで接種２週間後および各グループの５匹のマウスで接種４週間後にアッセイする。図１において、LTRはレトロウィルスベクターの長末端反復を、TKは単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼプロモーターを、Neoはネオマイシン耐性を与える遺伝子をそれぞれ表している。本発明を明確にし理解されるようにするために、上記の発明を図面および実施例によって詳細に記載したが、ある程度の変更および改変を行い得ることは当業者には明らかである。従って、記載および実施例は、添付の請求項によって記載される本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．転写調節領域に作動可能に連結した同時刺激因子をコードする領域を含み、さらに、転写調節領域に作動可能に連結した標的抗原ポリペプチドをコードする領域を含む組換えポリヌクレオチド。２．前記同時刺激因子が、B7-1、B7-2およびB7-3からなる群から選ばれる、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。３．個体における前記同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドの発現が、該標的抗原ポリペプチドを天然にコードする細胞内感染因子に対して、該個体において少なくとも部分的な免疫を与える、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。４．前記標的抗原が、ウィルス内で天然にコードされる、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。５．前記標的抗原が、肝炎ウィルス内で天然にコードされる、請求項３に記載の組換えポリヌクレオチド。６．前記標的抗原が、レトロウィルス内で天然にコードされる、請求項３に記載の組換えポリヌクレオチド。７．前記標的抗原が、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）内で天然にコードされる、請求項３に記載の組換えポリヌクレオチド。８．前記標的抗原が、Ｃ型肝炎ウィルス（HCV）内で天然にコードされる、請求項３に記載の組換えポリヌクレオチド。９．前記標的抗原が、原生動物内で天然にコードされる、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。１０．前記標的抗原が、真菌内でコードされる、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。１１．前記標的抗原が、細菌内で天然にコードされる、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。１２．前記標的抗原が、寄生性因子内でコードされる、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。１３．請求項１に記載の組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター。１４．請求項２に記載の組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター。１５．請求項３に記載の組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター。１６．請求項１に記載の組換えポリヌクレオチドを含むウィルス性ベクター。１７．請求項２に記載の組換えポリヌクレオチドを含むウィルス性ベクター。１８．請求項３に記載の組換えポリヌクレオチドを含むウィルス性ベクター。１９．転写調節領域に作動可能に連結した同時刺激因子をコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドと、転写調節領域に作動可能に連結した標的抗原ポリペプチドをコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドとで形質転換された宿主細胞。２０．前記同時刺激因子が、B7-1、B7-2およびB7-3からなる群から選ばれる、請求項１９に記載の宿主細胞。２１．個体における前記同時刺激因子および標的抗原ポリペプチドの発現が、該標的抗原ポリペプチドを天然にコードする細胞内感染因子に対して、該個体において少なくとも部分的な免疫を与える、請求項１９に記載の宿主細胞。２２．転写調節領域に作動可能に連結した同時刺激因子をコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドと、転写調節領域に作動可能に連結した標的抗原ポリペプチドをコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドとを使用する方法であって、該組換えポリヌクレオチドを治療上有効な量で個体に投与する工程；および該標的抗原を天然にコードする細胞内病原体による感染に対する応答に関連する身体的症状の軽減化を測定する工程、を包含する、方法。２３．前記同時刺激因子が、B7-1、B7-2およびB7-3からなる群から選ばれる、請求項２２に記載の方法。２４．前記投与された組換えポリヌクレオチドが、ウィルス性ベクター内に含まれる、請求項２２に記載の方法。２５．前記投与された組換えポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドでエクスビボで形質転換された宿主細胞内に含まれる、請求項２２に記載の方法。２６．前記ポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換する工程を包含する、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチドを使用する方法。２７．前記ポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換する工程を包含する、請求項３に記載の組換えポリヌクレオチドを使用する方法。２８．請求項２６に記載の方法により調製された宿主細胞およびその子孫。２９．請求項２７に記載の方法により調製された宿主細胞およびその子孫。