JPH08509692A

JPH08509692A - Ｅ型肝炎ウイルスペプチド抗原および抗体

Info

Publication number: JPH08509692A
Application number: JP5512710A
Authority: JP
Inventors: レイズ・グレゴリー・アール; ブラッドリー・ダニエル・ダブリュー; タム・アルバート・ダブリュー; カール・ミッチェル
Original assignee: ジェネラブス・テクノロジーズ・インコーポレイテッド; ザ・デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サーヴィスィズ; ザ・デパートメント・オブ・ザ・ネイヴィー
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-15
Publication date: 1996-10-15
Also published as: US5885768A; EP0628053A1; WO1993014116A1; CA2125700A1; KR940703851A

Abstract

(57)【要約】Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のＯＲＦ１、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３領域に由来する免疫原性ペプチド、当該ペプチド抗原を含む診断試薬、当該抗原を含むワクチン組成物、および抗原との免疫反応性である抗体が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】Ｅ型肝炎ウイルスペプチド抗原および抗体この出願は、１９８８年６月１７日に出願された米国特許出願番号第２０８，９９７号の一部継続出願である１９８９年４月１１に出願された米国特許出願番号第３３６，６７２号の一部継続出願である１９８９年６月１６日に出願された米国特許出願番号第３６７，４８６号の一部継続出願である１９８９年１０月１３日に出願された米国特許出願番号第４２０，９２１号の一部継続出願である１９９０年４月５日に出願された米国特許出願番号第０７／５０５，８８８号および１９９２年１月１７日に出願された米国特許出願番号第０７／８２２，３３５号の一部継続出願であり、それら全ては引用によってこの明細書に組み入れられる。１．発明の技術分野組成物およびワクチン方法に関する。２．引用例 Arankalle，V.A．ら，The Lancet，550（March 12，1988） Bradley，D.W．ら，J Gen．Virol.，69:1（1988） Bradley，D.W．ら，Proc．Nat．Acad．Sci.，USA，84:6277（1987） Dieckmann，C.L．ら，J．Biol．Chem．260:1513（1985） Engleman，E.G.，ら編，Human Hydridomas and Monoclonal Antibodies，Plen um Press，（1985） Geysen，H.M．ら，J．Immunol Methods，102:259（1987） Gravelle，C.R．ら，J．Infect．Diseases，131-167（1975） Hyams，K.C．ら，Lancet，印刷中 Kane，M.A．ら，JAMA，252:3140（1984） Khuroo，M.S.，Am．J. 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agent，ＥＴ−ＮＡＮＢ，本明細書中Ｅ型肝炎ウイルスまたはＨＥＶとも呼称する）は、アジア、アフリカ、ヨーロッパ、メキシコ、およびインド亜大陸における様々な伝染性および散発性の症例の肝炎の報告されている原因である。当該ウイルスは親密な物理的接触によっても広がり得るにもかかわらず、感染は、通常、糞便で汚染された水によって引き起こされる。当該ウイルスは、慢性の感染を引き起こさないようである。ＨＥＶに関するウイルス性病因論は、ボランティアに、プールした糞便分離菌を感染させることによって説明されている；免疫電子顕微鏡法（ＩＥＭ）研究は、感染した個体からの大便中に直径２７〜３４ｎｍのウイルス粒子を示した。このウイルス粒子は、地理的に異なる地域からの感染した個体からの血清中の抗体と反応して、単一のウイルス性因子またはクラスが、世界的に見られるＨＥＶ肝炎の大多数の原因となっていることを示唆した。抗体反応は、腸管外伝達ＮＡＮＢウイルス（Ｃ型肝炎ウイルスまたはＨＣＶとしても知られている）に感染した個体からの血清においては見られず、これら２つのＮＡＮＢタイプの間で異なる特異性を示した。血清学的な相違に加えて、これら２つのタイプのＮＡＮＢ感染は、明瞭な臨床上の相違を示す。ＨＥＶは、特徴として、急性感染であり、しばしば発熱および関節痛と、また、肝生検標本中の門脈炎症および付随する胆汁停止と関連している（Arankalle）。症状は通常６週間内に消散する。ＨＣＶは接触によって慢性の感染を症例の約５０％に引き起こす。発熱および関節痛はめったに見られず、炎症は、主として実質に分布している（Khuroo，1980）。ＨＥＶの一生は、一般に、健康な個体においては無事ではなく、感染した個体の大多数は、ＨＣＶで見られる慢性の後遺症なく回復する。しかしながら、この病気の１つの特有の疫学的特徴は、妊婦において観察される著しく高い死亡率である；これは、多数の研究において１０〜２０％のオーダーであると報告されている。この知見は、多数の疫学的研究において見られたが、今のところ説明されていない。これはウイルスの病原性を反映していようとなかろうと、ウイルスおよび免疫抑制された（妊娠している）宿主の相互作用の死の結果、または、敏感な栄養失調の個体群の衰弱した胎児期の健康の影響は、依然はっきりしている。２つのウイルス性因子は、主な宿主感受性に基づいても区別され得るばかりでなく、ＨＥＶはカニクイザルに伝播され得るが、ＨＣＶは伝播され得ない。ＨＣＶは、ＨＥＶよりも容易にチンパンジーに伝播される（Bradley，1987）。より早期に出願された特許出願において、ＨＥＶクローン、および全ＨＥＶゲノム配列が開示された。ＨＥＶクローンから、ＨＥＶゲノムコドン領域に由来する組換えペプチドが作られた。４．発明の要約本発明は、一面において、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３８によって同定されたペプチド配列の１つを有する免疫原性Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ペプチドを包含する。具体的な実施態様は、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３４によって同定された配列を有するペプチド抗原、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５−３７によって同定された配列を有する抗原、およびＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８によって同定された配列を有するペプチド抗原を包含する。本発明は、別の面において、固体支持体、およびそれに誘導体化された、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３８によって同定されたペプチド配列の１つを有するＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ペプチド抗原からなる診断試薬を包含する。具体的な実施態様は、ペプチド抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３４によって同定された配列を有する、抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５−３７によって同定された配列を有する、およびペプチド抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８によって同定された配列を有する試薬を包含する。Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に対して個体を免疫する際に使用するためのワクチン組成物も本発明の一部を構成する。当該ワクチンは、薬学的に容認されるキャリヤー、およびＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３８によって同定されたペプチド配列の１つを有するＨＥＶペプチド抗原を包含する。具体的な実施態様は、ペプチド抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３４によって同定された配列を有する、抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５−３７によって同定された配列を有する、およびペプチドがＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８によって同定された配列を有する組成物を包含する。本発明はさらに、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−２８によって同定されたペプチド配列の１つを有するＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ペプチド抗原に免疫特異的である抗体を包含する。具体的な実施態様は、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３４によって同定された配列を有するペプチド抗原と；ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５−３７によって同定された配列を有する抗原と、およびＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８によって同定された配列を有する抗原と免疫反応性である抗体を包含する。本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明が添付の図面に関連して読まれる時により完全に明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、ＨＥＶゲノム、ゲノム中の翻訳可能領域の配列、およびペプチド４０６．３−２、ＧＳ３およびｔｒｐＥ−Ｃ２についてのおおよそのコドン領域を示している；図２Ａおよび２Ｂは、前もってｔｒｐＥ−Ｃ２ＨＥＶ抗原（２Ａ）またはミョウバン対照（２Ｂ）で免疫した動物のビルマ株ＨＥＶ大便試料をカニクイザルに感染させた後に観察された血液ＡＬＴレベルを示している；図３Ａおよび３Ｂは、前もってｔｒｐＥ−Ｃ２ＨＥＶ抗原（３Ａ）またはミョウバン対照（３Ｂ）で免疫した動物のメキシコ株ＨＥＶ大便試料をカニクイザルに感染させた後に観察された血液ＡＬＴレベルを示している；図４は、非感染ヒト一次肝細胞（レーン４）および３時間から１１日まで時間をふやしてＨＥＶに感染させた一次肝細胞（レーン５〜１１）からのＰＣＲ増幅ＲＮＡのサザンブロットを示している；図５は、感染ウイルスを正常のプレ免疫ウザギ血清（レーン１〜３）またはＨＥＶ抗原ＨＥＶ４０６．３−２（Ｂ）（レーン２）およびＨＥＶ４０６．４−２（Ｍ）（レーン４）に対するウザギ抗血清とプレインキュベーションする、ＨＥＶ感染ヒト一次肝細胞からのＰＣＲ増幅ＲＮＡのサザンブロットを示している；図６は、正常のヒト血清（レーン１）および多数の異なるＨＥＶ陽性免疫ヒト血清（レーン２〜１２）の中の１つとプレインキュベーションしたＨＥＶ感染ヒト一次肝細胞からのＰＣＲ増幅ＲＮＡのサザンブロットを示している；図７は、ＨＥＶのビルマ（上のライン）およびメキシコ（下のライン）株についてのＨＥＶＯＲＦ２およびＯＲＦ３のヌクレオチド配列を示している；図８は、ＨＥＶのビルマ（上のライン）およびメキシコ（下のライン）株についてのＯＲＦ３ペプチドのアミノ酸配列を示している；図９は、ＨＥＶのビルマ（上のライン）およびメキシコ（下のライン）株についてのＯＲＦ２タンパク質のアミノ酸配列を示している；図１０Ａ−１０Ｃは、ＯＲＦ１（１０Ａ）、ＯＲＦ２（１０Ｂ）およびＯＲＦ（１０Ｃ）によってコード化された反応性エピトープのグラフ式表現である；図１１は、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３８によって同定されたＨＥＶのペプチド配列を示している；そして図１２Ａ〜１２Ｃは、ＨＥＶＯＲＦ１（１２Ａ）、ＯＲＦ２（１２Ｂ）およびＯＲＦ３（１２Ｃ）によってコード化されたタンパク質のハイドロパシープロフィールであり、縦座標上の正の値は疎水性を示し、負の値は親水性を示す。発明の詳細な説明Ｉ．定義以下に定義された術語は本明細書中次の意味を有する：１．「腸管内伝達非Ａ／非Ｂ型肝炎ウイルス性因子」、「Ｅ型肝炎ウイルス」または「ＨＥＶ」は、（ｉ）水系感染性肝炎を引き起こす、（ｉｉ）カニクイザルにおいて伝播性である、（ｉｉｉ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＤ型肝炎ウイルスとは血清学的に異なる、そして（ｉｖ）ＡＴＣＣ寄託番号６７７１７によって同定された大腸菌株ＢＢ４中にあるプラスミドｐＴＺＫＦ１（ＥＴ１．１）中の１．３３ｋｂｃＤＮＡに相同性であるゲノム領域を含むウイルス、ウイルスタイプまたはウイルスクラスを意味する。２．２つの核酸断片は、それらがManiatisら，前掲引用書中，第３２０〜３２３頁に記載されているハイブリッド形成条件下に互いにハイブリッド形成可能である場合に「相同性」である。しかしながら、次の洗浄条件：２×ＳＣＣ，０．１％ＳＤＳ、室温２回，３０分ごと；次いで２×ＳＣＣ，０．１％ＳＤＳ，５０ ℃１回，３０分；次いで２×ＳＣＣ，室温２回，１０分ごとを使うと、せいぜい約２５〜３０％の塩基対誤対合を含む相同性配列が同定され得る。さらに好ましくは、相同性核酸鎖は１５〜２５％の塩基対対誤対合、より好ましくは５〜１５％の塩基対誤対合を含む。これらの相同性の度合いは、当該技術に周知であるように、遺伝子ライブラリー（または別の遺伝物質源）からのクローンの同定のためのより厳しい洗浄条件を用いることによって選択され得る。３．２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列（２つのヌクレオチド配列の間の相同性についての代わりの定義において）は、それらが、突然変異ギャップマトリックスおよび６またはそれ以上のギャップペナルティーでプログラムＡＬＩＧＮを用いて＞５（標準デビエイション単位で）の一列スコアを有しているならば、相同（この術語がこの明細書において好ましく使用される時）であると見なされる。Dayhoff，M.O.，Atlas of Protein Sequence and Structure（ 1972）第５巻，National Biomedical Research Foundation，pp．101-110，およびこの巻のSupplement 2，pp.1-10を参照のこと。この２つの配列（またはその一部、好ましくは長さが少なくとも３０のアミノ酸）は、それらのアミノ酸が、上述のＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に一列に並べられた時に５０％同一より大きいかまたは５０％同一に等しいならば、より好ましく相同である。４．ＤＮＡ断片は、それがウイルス性因子ゲノムの領域と同一または実質的に同一の塩基対配列を有するならば、ＨＥＶウイルス性因子に「由来」する。５．タンパク質またはペプチドは、それがＥＴ−ＮＡＮＢウイルス性因子に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ断片の翻訳可能領域によってコード化されているならば、ＨＥＶウイルス性因子に「由来」する。６．アミノ酸配列中約７０％より高く相同である２つまたはそれ以上の既知のペプチド配列中、第三のアミノ酸配列は、第三の配列中の各アミノ酸が、既知の配列中のアミノ酸の少なくとも１つと同一であるならば、「既知の配列と内部で一致している」であろう。ＩＩ．ＨＥＶ抗原ワクチンこのセクションには、筋肉内に（i.m.）注射された時に、ＨＥＶ感染を防ぐのに有効なＨＥＶ抗原ワクチンを製造し、使用する方法を記載する。Ａ．ＨＥＶゲノム配列ＨＥＶゲノムクローン、および様々なＨＥＶ株についての完全なＨＥＶゲノムに対応する配列が、公開された方法（Tam，Yarboug）に従って、そして上で引用した特許出願に記載されたように得られた。手短に言えば、既知のＨＥＶ感染を有するカニクイザルの胆汁から単離したＲＮＡを、ｃＤＮＡ断片としてクローニングして断片ライブラリーを形成し、そしてこのライブラリーを感染または非感染胆汁源からの放射能標識化ｃＤＮＡｓに対する差次交雑によってスクリーニングした。同定されたクローン中のＨＥＶ断片のクローン化領域の塩基対配列を、標準配列決定方法によって決定した。図１に関連して、ＨＥＶは、正の向きの極性（po sitive-sense polarity）の約７．５キロベース（ｋｂ）の一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。３つの翻訳可能領域（ＯＲＦｓ）は、ＲＮＡに向けられたＲＮＡポリメラーゼおよびヘリカーゼのドメインを有するポリペプチドをコード化するＯＲＦ１、ウイルスの推定上のカプシドタンパク質をコード化するＯＲＦ２、およびＯＲＦ３としてＨＥＶに割り当てられている。ＨＥＶのゲノム組織は、３’末端に構造遺伝子と共に５’末端にその非構造遺伝子を割り当てている。大きさが約２．０ｋｂおよび３．７ｋｂの２つのサブゲノムのポリアデニル化された転写物（transcripts）は、感染した肝臓中で検出されて、それらの３’末端で全長７．５ｋｂのゲノムの転写物で、共に終わっている。ＨＥＶのゲノム組織と発現作戦は、それが、ＲＮＡウイルスの新しい類のための原型ヒト病原体あるいはおそらくCaliciviridae科中の分離属であろうことを示唆する。図７中に示されているゲノムおよびペプチド配列は、ＨＥＶのビルマ（Ｂ）株（上のライン）およびメキシコ（Ｍ）株（下のライン）のＯＲＦ−２およびＯＲＦ−３に対応している。中央ライン中に示されている塩基は、保存されたヌクレオチドを表している。比較のために使用されたナンバリングシステムは、ビルマ配列に基づいている。ビルマ配列はＳＥＱＩＤＮｏ．１を有し；メキシコ配列はＳＥＱＩＤＮｏ．２を有している。ＯＲＦ２に対応している領域は、それぞれビルマおよびメキシコ株についてのＳＥＱＩＤＮｏｓ．３および４を有している。４０６．３−２に対応している領域は、それぞれビルマおよびメキシコ株についてのＳＥＱＩＤＮｏｓ．５および６を有している。ＳＧ３に対応している領域は、それぞれビルマおよびメキシコ株についてのＳＥＱＩＤＮｏｓ．７および８を有している。Ｃ２に対応している領域は、それぞれビルマおよびメキシコ株についてのＳＥＱＩＤＮｏｓ．９および１０を有している。４０６．４−２に対応している領域は、それぞれビルマおよびメキシコ株についてのＳＥＱＩＤＮｏｓ．１１および１２を有している。Ｂ．組換えペプチド抗原ＨＥＶのビルマおよびメキシコ株の第三および第二の翻訳可能領域に対応しているアミノ酸配列は、それぞれ図８および９に示されている。示された配列リストは次の通りである。ＳＥＱＩＤＮｏｓ．１３および１４は、それぞれペプチド４０６．３−２（Ｂ）および４０６．３−２（Ｍ）についてのアミノ酸配列に対応している。各ペプチドは、ＯＲＦ２配列において示されているように（図９）、ＯＲＦ２によってコード化されているカプシドタンパク質のＣ末端領域中の４２アミノ酸ペプチドである。ＳＥＱＩＤＮｏｓ．１５および１６は、それぞれペプチドＳＧ３（Ｂ）およびＳＧ３（Ｍ）についてのアミノ酸配列に対応している。各ペプチドは、ＨＥＶカプシドの３２４のカルボキシルアミノ酸を含んでいる。ＳＥＱＩＤＮｏｓ．１７および１８は、それぞれペプチドＣ２（Ｂ）およびＣ２（Ｍ）についてのアミノ酸配列に対応している。それぞれ、ＨＥＶタンパク質の４６１のカルボキシルアミノ酸を含んでいる。ＳＥＱＩＤＮｏｓ．１９および２０は、それぞれビルマおおびメキシコ株ＯＲＦ２によってコード化されている推定上の全カプシドタンパク質についてのアミノ酸配列に対応している。ＳＥＱＩＤＮｏｓ．２１および２２は、それぞれ４０６．２−２（Ｂ）および４０６．４−２（Ｍ）についてのアミノ酸配列に対応している。これらはＯＲＦ３によってコード化されている３３のアミノ酸配列である。同様に、ＨＥＶ抗原の種々の株からの上で特定された配列に内部で一致している配列が予想される。これらは、配列ＩＤＮｏ．１３；配列ＩＤＮｏ．１４、および配列ＩＤＮｏｓ．１３および１４の間の内部で一致している変体（variatio ns）；配列ＩＤＮｏ．１５；配列ＩＤＮｏ．１６、および配列Ｎｏｓ．１５および１６の間の内部で一致している変体；配列ＩＤＮｏ．１７；配列ＩＤＮｏ．１８、および配列Ｎｏｓ．１７および１８の間の内部で一致している変体；配列ＩＤＮｏ．１９；配列ＩＤＮｏ．２０、および配列Ｎｏｓ．１９および２０の間の内部で一致している変体を含んでいる。例えば、ＨＥＶ４０６．３−２抗原は、ビルマ（Ｂ）およびメキシコ（Ｍ）株について以下に示された配列相同性を有している。配列の比較のためのシングルドットは、認識された高い確率または「中性」アミノ酸置換を示している。空白は、非中性置換を示している。これら２つの配列と内部で一致している配列は、配列： AN(Q/P)P(G/D)H(L/S)APLG(E/V)(I/T)RPSAPPLP(P/H)V(A/V)DLPQ(P/L)G(L/P)RR 〔但し、Ｘ／Ｙはアミノ酸Ｘまたはアミノ酸Ｙのいずれかを意味している。〕の中の１つを有するであろう。長さが１２４アミノ酸であるビルマおよびメキシコ株についてのＯＲＦ３アミノ酸配列は、１２４のアミノ酸中８７．１％の同一性を有している。６５９のアミノ酸の重複した部分を有するＯＲＦ２アミノ酸配列は、６５９のアミノ酸中９３．０％の同一性を有している。４０６．３−２（Ｍ）を作るために、例３に、およびＴａｍ文献に記載されているように、例３に記載されているλｇｔ１１４０６．３−２を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼベクターｐＧＥＸ中にサブクローン化して３−２（Ｍ）抗原を発現させた。４０６．３−２（Ｂ）抗原は、ｐＢＥＴ１プラスミド（Ｔａｍ）のＰＣＲ増幅による上記のものからビルマＳＥＱＩＤＮｏ．５のＰＣＲ増幅によって作られ得る。このプラスミドはビルマ株ＨＥＶ配列についてのＯＲＦ２およびＯＲＦ３を含む２．３ｋｂの挿入断片を含んでいる。プラスミドは、ＮｃｏＩ部位を含む５ ’プライマーおよびＢａｍＨＩ部位を含む３’プライマー（Sakai）を用いる、ＰＣＲ増幅によって増幅される。増幅された断片は、例３に記載されるように、ｐＧＥＸベクターのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位中に挿入されて、大腸菌発現系中で発現される。ＳＧ３（Ｂ）ペプチドを、ＨＥＶ（Ｂ）のＯＲＦ２およびＯＲＦ３全領域を含むｇｔ１０ファージＢＥＴ１クローンプラスミドを用いて、５’ＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩおよび３’ＢａｍＨＩリンカーを使ってＳＥＱＩＤＮｏ．７を先ず増幅することによって作った。増幅された断片を、製造業者の指示に従って、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ベクター（Stratagene，サンディエゴ，カリフォルニア州）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。ベクターの増殖および回収後、クローン化された挿入断片を、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化することによって遊離させて、ゲル精製した。精製された断片を、ｐＧＥＸベクターのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入し、そして例３中に記載されているような大腸菌発現系中で発現させた。ＳＧ３（Ｍ）ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．７の代わりにＳＥＱＩＤＮｏ．８を使って、同様に作ることができる。Ｃ２（Ｂ）ペプチドは、例５に記載されているように作られる。手短に言えば、ｇｔ１０ファージＢＥＴ１プラスミドをＥｃｏＲＩで消化して、ＳＥＱＩＤＮｏ．１０Ｃ２配列を遊離させ、そしてこの断片をｐＡＴＨ１０ｔｒｐＥ融合ベクターに挿入し、そして組換え融合タンパク質を大腸菌宿主中で発現させた。Ｃ２（Ｍ）ペプチドは、実質的に上に記載されているように、ＥｃｏＲＩ部位を含む５’プライマーおよびＢａｍＨＩ部位を含む３’プライマーを用いて、S ＥＱＩＤＮｏ．１０のＰＣＲ増幅によって作ることができる。増幅された断片を、ｐＧＥＸベクタのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入し、そして例３に記載されているように大腸菌発現系中で発現させる。カプシドタンパク質（Ｂ）を、実質的に上に記載したように、ＮｃｏＩ部位を含む５’プライマーおよびＢａｍＨＩ部位を含む３’プライマーを用いてｇｔ１０ＢＥＴ１プラスミドから、ＳＥＱＩＤＮｏ．３のＰＣＲ増幅によって作った。増幅された断片を、ｐＧＥＸベクターのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入し、そして例３に記載されているように大腸菌発現系中で発現させた。カプシドタンパク質（Ｍ）は同様に作られる。４０６．４−２（Ｍ）ペプチドを作るために、例３に詳述されているように、例３に記載されているλｇｔ１１４０６．４−２をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼベクターｐＧＥＸ中でサブクローン化して３−２（Ｍ）抗原を発現させた。４０６．４−２（Ｂ）抗原は、ＮｏｃＩ部位を含む５’プライマーおよびＢａｍＨＩ部位を含む３’プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅による上記のものからビルマＳＥＱＩＤＮｏ．１１のＰＣＲ増幅によって、作ることができる。増幅された断片を、ｐＧＥＸベクターのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位中に挿入し、例３に記載されているような大腸菌発現系中で発現させる。選択された部分、好ましくは４０６．３−２配列を含むＨＥＶカプシドタンパク質のＣ末端部分を含む他のＨＥＶペプチドも同様に、上に概説し、また、例３および５に詳述されているように、上記ＨＥＶゲノム挿入プラスイドを用いて、所望の配列を増幅し、そして適当な発現ベクター中でクローニングして、作られ得る。組換えペプチドを作る際に使用されるコーディング配列は、ヌクレオチド配列を形成する際に、既知の方法に従って、上に記載した、また他のところ（Ｔａｍ）に詳述されているクローニングベクターから、または、オリゴヌクレオチド断片を結合するＰＣＲ切断方法を用いる合成ヌクレオチド合成から得ることができる。Ｃ．成熟カプシドタンパク質ＨＥＶペプチド抗原は、霊長類の動物の肝臓から、好ましくはヒトまたはカニクイザルの肝臓から得られる一次肝細胞中で増殖した精製されたＨＥＶウイルスからも得ることができる。培養のための霊長類の動物の一次肝細胞を調製する方法、および培養中長期間、肝臓に特異的な機能を保つのに有効な培地条件は、以下の例１においてヒト肝細胞について詳述されている。培養中の増殖３日後に、例２に詳述されているように、細胞にＨＥＢ感染カニクイザル大便プール（第４便通）のプールされた接種材料を感染させた。細胞中の増殖するＨＥＶウイルスの存在およびレベルは、間接免疫螢光法によって測定され得る。例えば一次細胞がカニクイザル細胞である場合、当該細胞を、ヒトＨＥＶ抗血清と免疫反応させ、次いでウサギ抗−ヒトＩｇＧ抗体と免疫反応させることができる。代わりに、ＨＥＶウイルスを、例２に詳述されているように、初期ＣＤＮＡ形成およびＨＥＶＣＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅によるＰＣＲ増幅を伴う選択的増幅方法によって検出しそして測定することができる。ウイルス粒子は、培地中のＨＥＶ感染ヒト肝細胞から、ウイルスを超遠心分離によって30％蔗糖クッションを通してペレット化することによって単離することができる。ペレット化されたウイルスを、所望であれば、ピークウイルスフラクションを組み合わせた１０〜４０％の蔗糖勾配を通すゾーン遠心分離によって、さらに精製することができる。可溶性培地成分からウイルス粒子を単離する別の方法も使用され得る。例えば、清澄化された培地をサイズ排除マトリックスに通して、サイズ排除によって可溶性成分を単離することができる。代わりに、清澄化された培地を、ウイルス粒子を保持できるが可溶性（非粒子）培地成分を通過できる１０〜２０ｎｍの細孔径を有する限外ろ過膜に通すことができる。本発明は、完全なＨＥＶカプシドタンパク質中でグリコシル化および別の翻訳後修飾を可能にする。ウイルス粒子からのカプシド単離は、可溶化媒体、例えば非イオン界面活性剤の溶液中でウイルス粒子を可溶化した後、標準方法、例えばイオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー、およびＨＰＬＣ精製によって行なわれ得る。タンパク質は、例えば抗ＨＥＶ抗血清から精製された抗体を使用する、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。Ｄ．ワクチン組成物の調製上に記載された組換えまたは完全なＨＥＶカプシドまたはカプシド断片ペプチド（ＨＥＶカプシド抗原）を、既知の手順に従って、ワクチン組成物中に組み入れて、注入された抗原の抗原性を高める。１つの組成物中、ＨＥＶ抗原は、キャリヤータンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンに共有結合されており、そして溶液の形でまたはアジュバントと組み合わせて注入される。代わりに、ＨＥＶ抗原が融合タンパク質の一部として作られる場合、タンパク質の非ＨＥＶ部分はキャリヤータンパク質として役に立ち得る。誘導体化されたまたは融合タンパク質は、薬学的に妥当なキャリヤー中、例えば溶液中またはアジュバント、例えば変成ミョウバン中に含まれる。代わりに、遊離ペプチドそれ自体、例えばＨＥＶＣ２ペプチドは、ミョウバン中に配合されるかまたはアジュバントなしで使用されることができる。適当なアジュバント化ワクチンは、ミョウバン１ｍｇあたり約１ｍｇのペプチド抗原の好ましい抗原濃度を有し、そして１注入あたりミョウバン８０ｍｇを越えない。 III．抗原ワクチン方法本発明は、関連した面で、非経口注入、例えば筋肉内または静脈内注入により実験材料になる人または動物に本発明のワクチン組成物を投与することにより、Ｅ型肝炎ウイルスによる個体の感染を阻害する方法に向けられている。この方法で使用するための好ましいワクチン組成物は、ＨＥＶ抗原が：配列ＩＤＮｏ．１３；配列ＩＤＮｏ．１４、および配列ＩＤＮｏｓ．１３および１４の間の内部で一致している変体；配列ＩＤＮｏ．１５；配列ＩＤＮｏ．１６、および配列Ｎｏｓ．１５および１６の間の内部で一致している変体；配列ＩＤＮｏ．１７；配列ＩＤＮｏ．１８、および配列Ｎｏｓ．１７および１８の間の内部で一致している変体；配列ＩＤＮｏ．１９；配列ＩＤＮｏ．２０、および配列Ｎｏｓ．１９および２０の間の内部で一致している変体によって同定されるペプチド中の配列を含んでいるものである。抗原ワクチン組成物は、一連の接種、例えば４週間隔与えられる２〜３回の注入の際には、筋肉内に投与されるのが好ましい。例７に詳述される方法において、カニクイザルに、変成ミョウバンアジュバント中にまたはアジュバントなしで配合されたＣ２融合タンパク質ｔｒｐＥ−Ｃ２（Ｂ）を筋肉内注入した。４匹の動物は、１ヵ月離した２回の注入でミョウバンとｔｒｐＥ−Ｃ２（Ｂ）抗原を受領した。他の２匹の動物は、同一のワクチン接種スケジュールでミョウバンだけを受領した。いずれの動物も、融合しないＣ２ＨＥＶ抗原を用いるウエスタン・ブロッティングによりまたは分離螢光抗体遮断アッセイにより判断されるように、第二回の注入の４週間後に抗ＨＥＶ血清抗体の存在を示さなかった。この段階で、４匹の実験動物の中の２匹は、非アジュバント化された、不溶性のｔｒｐＥ−Ｃ２ペプチド抗原の第三の接種を受けた。４週後、これらの動物は、ウエスタン・ブロットにより証明されるような抗ＨＥＶ抗体を示した。これらの結果は、ミョウバン共沈澱手順の間の抗原のミョウバン変性のために、ｔｒｐＥ−Ｃ２抗原が、ミョウバンの不存在下に投与された時により有効であり得ることを示唆している。最後の接種の１ヵ月後に、これらの動物に、ＨＥＶ（ビルマ株）について非常に伝染性であることを前に示した第三排便のヒト大便の静脈内注入でまたはメキシコ株ヒトＨＥＶ大便試料で誘発試験を行なった。接種後選択された間隔で、これらの動物からの血清試料を使ってＡＬＴ（アラニントランスフェラーゼ）レベルを、壊死および肝細胞退行の指標として、測定した。肝バイオプシー試料も、直接螢光抗体アッセイ（ＦＡ）によりＨＥＶ抗原の存在について測定した。図２Ａは、ｔｒｐＥ−Ｃ２の３回目の用量を受けた動物の中の１つにおける、ビルマ株ＨＥＶウイルスでの感染に続く期間のＡＬＴレベルの変化を示している。この図からわかるように、感染に続く７と１／２週間の上昇したＡＬＴレベルの証拠はなかった。肝バイオプシー試料はまた、ＨＥＶ抗原の形跡も示さなかった。図２Ｂは、ビルマ株ＨＥＶに静脈内で感染させた対照動物（ミョウバンだけの注入）のＨＥＶ（Ｂ）感染後に測定されたＡＬＴレベルを示している。高められたＡＬＴレベルは、ワクチン保護の不存在下に予期される感染レベルを示している。ＨＥＶ抗原は肝バイオプシー試料中でも検出されなかった。上述したように、類似の結果が、ｔｒｐＥ−Ｃ２ミョウバン組成物の２回の注入を受けた動物において観察されたが、３回目のミョウバンを含まない予防接種を受けた動物では観察されなかった。図３Ａは、ｔｐｒＥ−Ｃ２の３回目の用量を受けた動物の中の１匹における、メキシコ株ＨＥＶウイルスに感染後の肝臓ＡＬＴレベルの変化を示している。ここでもまた、３２日目まで上昇したＡＬＴレベルの形跡はなかった（この動物は無関係の原因で３２日目に死んだ）。肝バイオプシー試料は、ＨＥＢ抗原の最小の形跡も示した。この結果は、１つのＨＥＶ株に対して向けられている抗原ワクチンが他のＨＥＶ株に対する保護免疫性を与えることができることを証明している。図３Ｂは、ＨＥＶのメキシコ株で静脈内に感染させたコントロール動物（ミョウバンだけの注入）のＨＥＶ感染後に測定されたＡＬＴレベルを示している。高レベルの感染（ＡＬＴ活性）が観察された。上述したように、同様の結果が、ｔｒｐＥ−Ｃ２ミョウバン組成物の２回の注入を受けた動物中で観察されたが、３回目のミョウバンを含まない予防接種を受けた動物では観察されなかった。上記予防接種方法の詳細は例５に示されている。ＩＶ．ワクチン組成物本発明は、もう１つの面で、培養中のＨＥＶ感染可能な一次肝細胞中のＨＥＶ感染を遮断する能力によって証明される、ＨＥＶ感染を中和するのに有効な抗体ワクチン組成物を包含している。２つの典型的な一次細胞は、ヒトおよびカニクイザル細胞である。当該組成物中の抗体は、好ましくは、配列：配列ＩＤＮｏ．１３；配列ＩＤＮｏ．１４、および配列ＩＤＮｏｓ．１３および１４の間の内部で一致している変体の中の１つを含むペプチドと免疫反応性である。以下に示されているように、４０６．３−２抗原（Ｍ）に対して作られた抗体が、ヒト一次肝細胞におけるＨＥＶ感染を遮断するのに有効である。ＳＥＱＩＤＮｏ．１３または１４のカルボキシ末端を含むより大きなカプシドペプチドまたはタンパク質と免疫反応性である抗体もまた好ましい。これらは、具体的には配列ＩＤＮｏ．１５；配列ＩＤＮｏ．１６；および配列ＩＤＮｏｓ．１５および１６の間の内部で一致している変体を含み得る。下記からわかるように、ヒト一次肝細胞のＨＥＶ感染を妨げるのに有効なヒト血清は、これらの配列によって定められたＳＧ３ペプチドと免疫反応性である。配列ＩＤＮｏ．１９；配列ＩＤＮｏ．２０；および配列ＩＤＮｏｓ．１９および２０の間の内部で一致している変体によって定められるような、完全なカプシドタンパク質と免疫反応性である抗体と同様に、配列ＩＤＮｏ．１７；配列ＩＤＮｏ．１８；および配列ＩＤＮｏｓ．１７および１８の間の内部で一致している変体によって定められたｔｐｒＥ−Ｃ２ペプチドと免疫反応性である抗体もまた好ましい。抗体は、例えば、上で特定されたＨＥＶ抗原の１つを用いた適当な動物、例えばウサギまたはヤギの免疫処置によって作られた抗血清からのポリクローナル抗体として得られ得る。代わりに、ポリクローナル抗体は、ヒトまたは他の霊長類の動物の抗血清から得られ得る。抗血清からの抗ＨＥＶポリクローナル抗体は、部分的に精製された血清ＩｇＧフラクションを得るために使用されるような標準方法に従って精製または部分的に精製され得る（例えば、Antibodies: A labora tory Manual， 1988，Cold Springs Harbor Labを参照）。代わりに抗ＨＥＶ抗体は、上記カプシド抗原の１つで誘導体化された固体支持体を用いて、親和性クロマトグラフィーにより精製された形で得られ得る。もう１つの実施態様において、抗体は、ハイブリドーマ細胞系によって分泌されたモノクローナル抗体である。ハイブリドーマ細胞系を作るために、免疫された動物、好ましくはマウスまたはヒトからの肝細胞を、確立された方法（例えば、Engleman，Zola）に従って、適当な不死化融合パートナーで不死化する。代わりに、ヒトモノクローナル抗体は、培養したリンパ球から得られる軽いおよび重いヒト抗−ＨＥＶＩｇＧ遺伝子を適当な発現ベクター中に挿入し、そして使用に適当な宿主を共感染させる、組換え方法によって製造され得る。ヒトリンパ球からの軽いおよび重い遺伝子を得そしてクローニングする方法および共感染された宿主細胞中のクローン化遺伝子を発現する方法は知られている（Larrick ）。抗−ＨＥＢ抗体を、典型的には筋肉内、皮下または静脈内経路による、注入のための適当な溶液中に配合して、ワクチン組成物を作る。Ｂ．抗−４０６．３−２抗体の中和活性上述したように作られた抗体の中和能力を証明するために、４０６．３−２（Ｂ）抗原に対する抗体を、培養中のヒト一次細胞中のＨＥＶ感染を遮断する能力について試験した。一次肝細胞を、公開された方法に従って、そして例１に詳述されているように、作りそして培養した。独特な培養条件は、例１に記載されているように、最初の培養後７ヵ月までの、肝臓特異的タンパク質、例えば血清アルブミンを作りそして分泌する細胞の連続した能力によって証明されるような、分化した肝細胞機能の喪失のない培養中の長期細胞増殖を考慮に入れる。培養された細胞に、正常のヒト血清またはカニクイザル大便調製物のいずれかを接種した。細胞中のＨＥＶ感染を証明するために、ｃＤＮＡ’ｓを形成する逆転写酵素と、ＨＥＶ特異的ｃＤＮＡを増幅するポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）との組み合わせを用いて、細胞をＨＥＶＲＮＡの存在下の感染後１〜１１日目に調べた。増幅した断片は、５５１塩基対長さを有することが予期される。図４は、増幅したＨＥＶ配列を検出するためのＨＥＶＯＲＦ２放射能標識化プローブを用いた、増幅した材料のサザンブロットを示している。結果は図４に示されている。レーン１〜３はコントロールである。レーン４は、正常の（非感染）血清を接種した細胞からの全増幅材料である。レーン５〜１１は、それぞれカニクイザル（cyno）大便試料での感染の３時間後、１日後、３日後、５日後、７日後、９日後、および１１日後の増幅材料を示している。この結果は、ＨＥＶが初期感染後１日以内にヒト一次肝細胞中で増殖したことを示している（レーン６）。感染後５日までのＨＥＶ複製レベルでの時間依存増加が存在し（レーン７および８）、それはその後減少するようであった（レーン９〜11 ）。未感染一次細胞から単離された全細胞ＲＮＡ中のＨＥＶの証拠はなかった。抗原ペプチド４０６．３−２（Ｂ）および４０６．４−２（Ｍ）および４０６．４−２（Ｂ）に対するウサギ抗血清を作った。上に記載した通り、４０６．３ −２ペプチドはＨＥＶカプシドタンパク質のカルボキシ末端領域からのものであり、そして４０６．４−２ペプチドは、ＨＥＶＯＲＦ３によってコード化されたペプチドからのものである。予備免疫ウサギ血清またはＨＥＶ抗原の１つに対するウサギ抗血清を、１：２０の希釈度で、カニクイザル大便接種材料に添加し、そして抗体をウイルス調製物と共にインキュベーションした。抗体処理した大便試料を次いで、ヒト一次肝細胞を感染させるために使用した。１４日後、当該細胞を、４４８塩基対増幅断片を生じることが予期されるプライマーを使用することを除いて、上記のＲＴ／ＰＣＲ／サザンブロット方法によるＨＥＶ感染について調べた。結果を図５に示す。この図中のレーン１および３は、ヒト予備免疫血清と前もってインキュベーションしたカニクイザル大便試料に感染させた細胞からの増幅したＲＮＡを示している。図中の４４８塩基対バンドはＨＥＶ感染を示している。第二レーンは、抗−４０６．３−２（Ｂ）ウサギ抗血清にさらされた細胞に対応しており、ＨＥＶ感染の実質的に完全な不存在を示している。レーン４は、抗 −４０６．４−２（Ｍ）ウサギ抗血清にさらした細胞からの増幅した材料を示している。抗体は、ＨＥＶ感染に対する保護効果をほとんどまたは全く示さなかった。Ｃ．ＨＥＶ抗血清を中和する抗体を中和する別の源は、本発明によれば、４０６．３−２抗原およびＳＧ３づけられるヒトＨＥＶ抗血清である。ヒトＨＥＶ抗血清を中和する抗体の特徴を調べるために、ヒト抗血清のパネルを、実質的に上述したように、培養した肝細胞のＨＥＶ感染を遮断する能力について試験した。１０のＨＥＶ陽性ヒト抗血清が以下の表１に示され、それらはインド、パキスタンおよびメキシコのＨＥＶ感染した患者からのものである。抗血清は菌株タイプについては試験しなかった。手短に言うと、培養した細胞を、正常のプールされた血清またはＨＥＶ抗血清で処理した試料（ビルマ株）で処理したＨＥＶ陽性カニクイザル大便にさらし、そしてＰＣＲ増幅およびＨＥＶ放射能標識化プローブを用いたサザンブロッティングにより、ＨＥＶ特異的核酸配列の存在について試験した。サザンブロットは図６に示されている。１２の血清試料のレーン数は、以下の表１の括弧内に示されている。図６からわかるようにそして表１に示されているように、ＨＥＶを中和するのに有効な抗血清は、インド１０（レーン２）、インド１８（レーン３）、インド２１０（レーン５）、インド２６５（レーン８）、パキスタン１４３（レーン９）およびパキスタン３３６（レーン１０）であった。しかしながら、他のヒト血清はＨＥＶ感染を中和する能力に関してほとんど（レーン１１，メキシコ３８７Ｃ）または全く（レーン４，インド２９；レーン６，インド２４２；レーン７，インド２５９；レーン１２，メキシコ３８７Ｃ［ＩｇＧ］）効果を示さなかった。ネガティブコントロールとして、正常のヒト血清プールは、ＨＥＶに対する中和活性を全く示さなかった（レーン１）。ヒト抗血清のいくつかを、上記４０６．３−２（Ｍ）、４０６．４−２（Ｍ）および４０６．４−２（Ｂ）抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＭ免疫活性について試験した。ＩｇＭ抗体との反応は、初期段階の感染を示す傾向があるが、ＩｇＧとの免疫反応性は、初期または後期の感染段階の両方を示す。反応はＥＬＩＳＡ試験において測定された。結果を表２Ａおよび２Ｂにおいて示す。表中「＋」記号は陽性反応を示し；表中の数字は示された特異的組換えタンパク質に対するＩｇＧの希釈力価を示している。表からのデータは、中和できるこれらのヒト抗血清が、ＨＥＶ３−２（Ｍ）エピトープに対する抗体についてＩｇＧＥＬＩＳＡによって陽性であったことを示している。インド２９は、ＨＥＶ３−２（Ｍ）に対するＩｇＧ（ｓ）について陽性ではなく、そしてＨＥＶ感染を中和しなかった（レーン４）。インド２４２およびインド２５９はＨＥＶ４０６．３−２（Ｍ）対するＩｇＧ（ｓ）について陽性であったが、それらは、ＨＥＶ４０６．３−２（Ｍ）に対するＩｇＭについて。それ故、これらの個々の試料中、引き出されたＨＥＶ３−２（Ｍ）に対するＩｇＧ（ｓ）のレベルは、一次ヒト肝細胞のＨＥＶ感染を中和するのに十分であり得る。ＨＥＶ感染したヒトの血清の中和活性とＨＥＶ３−２エピトープに対する免疫反応性との関連性をさらに研究するために、これらのヒト血清試料に関してウエスタンブロッティング分析を行なった。結果を表３に示す。この表からわかるように、ＨＥＶ感染について中和していることが前に示されたインド１８、インド２６５、そして特にインド２１０は、ウエスタンブロッティング分析においてＨＥＶ４０６．３−２（Ｍ）に対して免疫反応性であり、そしてそれらの免疫反応性はそれらの中和活性に関連した。ＨＥＶ４０６．３−２（Ｍ）に対するこれらの血清の特異的免疫反応性についての確認として、ウエスタン分析を、ＨＥＶビルマ株のＯＲＦ−２の３２９のカルボキシ末端アミノ酸を含む融合タンパク質ＳＧ３（Ｂ）に対して行なった。ＨＥＶ４０６．３−２（Ｍ）およびＳＧ３［またはＨＥＶ４０６．３−２（Ｂ）］に対するこれらの血清の免疫反応性は完全にマッチした。従って、中和抗体の適当な源を提供するヒトＨＥＶ抗血清は、ウエスタンブロットにおける、すなわち抗原がさらされた入手しやすい立体配置にある場合の免疫反応性によって共に示されるような、（ａ）４０６．３−２抗原との免疫反応性、および（ｂ）ＳＧ３抗原によって特徴づけられるものである。さらに一般に、本発明の好ましいワクチン組成物は、４０６．３−２抗原性ペプチドおよびＳＧ３抗原性ペプチドに対する免疫特異的な抗体を含んでいる。このワクチン組成物は、非経口注入のための適当なキャリヤー中に免疫特異的抗体を含んでいる。抗体ワクチン組成物は、本発明の別の面によれば、ヒトのＨＥＶ感染を予防または治療するために使用される。Ｖ．ＨＥＶエピトープ抗原このセクションは、ＨＥＶ（ビルマ株）ゲノムのＯＲＦ１、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３翻訳可能領域によってコード化されているＨＥＶ領域に由来するＨＥＶペプチド抗原を開示する。ゲノムの３つの翻訳可能領域は、重複ペプチド配列を決定するために使用された。これらの配列を有するペプチドは、例６Ａに記載されているように構成されていた。３つのＯＲＦ’ｓからの重複抗原を、プールしたＨＥＶ抗血清で免疫スクリーニングした（例６Ｂ）。急性ＨＥＶでの患者からのプールした血清は、（ｉ）血清とペプチドとの相互作用から生じる光学密度が、同一ペプチドとプールした対照血清との相互作用よりも少なくとも３倍高く、そして（ｉｉ）当該ペプチドが同一判定基準に合う少なくとも１つの他のペプチドに隣接している場合にだけ、特定のペプチドと「反応性である」と称された。隣接ペプチドは４つのアミノ酸によって重複したので、２つの隣接したペプチドに対して向けられた著しい反応性は、両方のペプチドに共通のエピトープの存在を強く示唆している。図１１Ａ〜１１Ｃは、複製合成の中の１つの反応性ペプチドについて得られた４０５ｎｍでの光学密度を示している。抗体との反応性は、ペプチド配列ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３４によって同定される１２の目立たない領域（図１０Ａ）中に含まれているエピトープに、ＯＲＦ２によってコード化された、推定びＯＲＦ３によってコード化された推定上のタンパク質の１つの目立たない領域３つのＯＲＦｓのそれぞれによってコード化されたタンパク質のハイドロパシープロフィール（Ｋｙｔｅ）は、ＯＲＦ１〜ＯＲＦ３について、それぞれ図１２Ａ〜１２Ｃに示されている。図１１に示された１６の領域（ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３８）のそれぞれの分析は、少なくとも１つの親水性遺伝子座を含んでいること示している。Ａ．免疫原性ＨＥＶペプチド本発明は、一面において、図１１中で同定された配列ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯＳ２３〜３８の中の１つを有するＨＥＶペプチド抗原を包含している。ＯＲＦ１に由来するペプチド抗原は、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯＳ２３〜３４を伴う配列によって同定される。ＯＲＦ２に由来するペプチド抗原は、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯＳ．３５〜３７を伴う配列によって同定される。ＯＲＦ３に由来するペプチド抗原は、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯ．３８を伴う配列によって同定される。これらのペプチドは、融合タンパク質中で組換えで形成されるであろうように、慣用の固相合成方法または組換え方法によって作ることができ、他のペプチドまたはタンパク質接合体または部分を含み得る。Ｂ．診断試薬ＨＥＶの測定についての１つの一般的診断試験は、本発明によれば、ＨＥＶ感染についてヒト血清をスクリーニングするための酵素イムノアッセイである。このアッセイフォーマットにおいて、配列がＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３８によって同定されているペプチドを含む、表面結合したＨＥＶペプチド抗原を有する固相試薬を、試薬上のペプチドへの抗体結合を許す条件下に、分析的血清と反応させる。結合していない血清成分を除去するために試薬を洗浄した後、当該試薬を、酵素標識化した抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上の結合した抗ＨＥＶ抗体の量に比例して、酵素を試薬に結合する。試薬を再度洗浄して、結合していない抗体を除去し、そして試薬と会合した酵素の量を測定する。１つの典型的な方法は、アルカリ性ホスファターゼで標識化した抗ヒト抗体を使用する。酵素標識化した抗体、および酵素の検出に必要とされる試薬はまた、本明細書中、固体支持体上のペプチド抗原に結合したヒト抗体の存在を検出するためのリポーター手段とも呼称される。上記アッセイ中の固体表面試薬は、固体支持体材料、例えば高分子ビーズ、浸漬スティック、またはフィルター材料にタンパク質材料を付着するための既知の技術によって作られる。これらの付着方法は一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着または、一般に遊離アミン基を介して固体支持体上の化学的反応性基、例えば活性化されたカルボキシル、ヒドロキシルまたはアルデヒド基へのタンパク質の共有付着を含む。Ｃ．ペプチドワクチン組成物上記配列ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯＳ．２３−３８の中の１つによって同定されるＨＥＶペプチド抗原を含む、そして好ましくはペプチドが結合する免疫原性ペプチドキャリヤーも含むワクチン組成物も同様に本発明に包含される。ペプチドについての特に有用な免疫原性キャリヤーは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風毒素、ポリ-1-（Lys:Glu）、ピーナッツアグルチニン、ポリ−Ｄ−リシン、ジフテリア毒素、オボアルブミン、ダイズアグルチニン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミンなどを含む。免疫原性ペプチドは、化学誘導体化を含む種々の既知の方法によっておよび遺伝子工学技術によってキャリヤーに共役され得る。このような後者の技術は、Ge rald Quinnan，“Proceedings of a Workshop”，1984年11月13日〜14日によってより詳細に開示されている。本発明のワクチンおよび接種材料は、通常筋肉内または皮下に注射することによって、腸溶性カプセルまたは錠剤により経口で、座剤として、鼻スプレーとして、また、別の適当な投与経路によって、投与され得る。ヒトの患者のために、ポリペプチドの適当な用量は、部分的には、選択された投与経路および多数の別のファクターによって決まる。これらのファクターの中には、免疫にする哺乳動物の体重、使用される時のキャリヤー、使用される時のアジュバント、および使用されるのが望ましい接種回数が含まれる。ヒト患者についての個々の接種は、一般に、ポリペプチドが連結され得るキャリヤーを除いて、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇのポリペプチドの単位用量を含んでいる。所望であれば、一連の用量を、最適の免疫性のための一定の期間にわたって投与することができる。ワクチンの単位剤形もまた、所望であれば上記量のポリペプチドを含んで、提供され得る。いずれにしても、ワクチンまたは接種材料中に含まれる免疫原は、「有効量」で存在し、その有効量は、免疫学上の技術に周知である多数のファクター、例えば免疫する哺乳動物の体重、使用するキャリヤー部分、使用するアジュバント、捜し求められた保護期間、および所望の免疫処置プロトコールによって決まる。Ｄ．抗ＨＥＶ抗体本発明は、別の面で、培養中のＨＥＶ感染可能な一次肝細胞中のＨＥＶ感染を遮断する組成物の能力によって証明されるような、ＨＥＶ感染を中和するのに有効な抗体組成物を包含する。本明細書中で意図された抗体は、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯＳ２３−３８によって同定されたＨＥＶペプチド配列と免疫反応性であるものである。抗体は、好ましくは、一実施態様においては、ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯＳ２３〜３４の中の１つを含むペプチドと；もう１つの実施態様においては、配列ＳＥＱＩ．Ｄ．ＮＯＳ３５〜３７の中の１つを含むペプチドと；第三の実施態様においては、ペプチド配列ＳＥＱＩ．Ｄ．３８と免疫反応性である。抗体は、例えば、適当な動物、例えばウサギまたはヤギを上で特定されたＨＥＶ抗原の１つで免疫することによって作られた抗血清からのポリクローナル抗体として得られ得る。代わりに、ポリクローナル抗体は、ヒトまたは他の霊長類の動物のＨＥＶ抗血清から得られ得る。抗血清からの抗ＨＥＶポリクローナル抗体は、部分的に精製された血清ＩｇＧフラクションを得るために使用されるような標準方法に従って精製または部分的に精製され得る（例えば、Antibodies: A la boratory Manual， 1988，Cold Springs Harbor Lab）。代わりに、抗ＨＥＶ抗体は、上記カプシド抗原の１つで誘導体化された固体支持体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製形で得られ得る。他の実施態様において、抗体は、ハイブリドーマ細胞系によって分泌されたモノクローナル抗体である。ハイブリドーマ細胞系を作るために、免疫処置された動物、好ましくはマウスまたはヒトからのリンパ球を、確立された方法（例えば、Engleman，Zola）に従って、適当な不死化する融合パートナーで不死化する。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、培養したリンパ球から得られた軽いおよび重いヒト抗ＨＥＶＩｇＧ遺伝子を、適当な発現ベクターに挿入し、そして適当な宿主を共感染するために使用する組換え方法によって作られ得る。ヒトリンパ球から軽いおよび重い遺伝子を得そしてクローニングする方法、およびクローン化した遺伝子を、共感染した宿主細胞中で発現する方法は知られている（Larr ick）。抗ＨＥＶ抗体は、一般には筋肉内、皮下または静脈内経路による、注射用の適当な溶液中に配合されて、ワクチン組成物を形成する。本発明において種々の方法および組成物を説明する以下の例で、本発明を説明するが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。材料酵素：ＤＮＡｓｅＩおよびアルカリ性ホスファターゼを、Boehringer Mannhei m Biochemicals（MBM,インディアナポリス，インディアナ州）から；ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＩメチラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼＩを、Ne w England Biolabs（ＮＥＢ，ベバリー，マサチューセツ州）から；そしてＲＮａｓｅＡをSigma（セントルイス，ミズーリ州）から得た。他の試薬：ＥｃｏＲＩリンカーをＮＥＢから得；そしてニトロ青テトラゾリウム（ＮＢＴ）、リン酸Ｓ−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル（ＢＣＩＰ）、Ｓ−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘｇａｌ）およびイソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）をSigm aから得た。ｃＤＮＡ合成キットおよびランダムプライミング標識化キットは、Boehringer -Mannheim Biochemical（BMB,インディアナポリス，インディアナ州）から入手する。例１培養中のヒト一次肝細胞Ａ．肝細胞の単離肝細胞を、スタンフォード大学メディカルセンターから入手したヒトの肝臓から単離した。肝臓を、本来の場所で灌流するか実験室内で灌流のためにくさび形のものとして切開した。初期の灌流は、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および０．５ｍＭエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）−テトラ酢酸を補ったＣａ⁺⁺−、Ｍｇ⁺⁺−なしのハンクス平衡塩溶液を用いて６０ｍｌ／分で１０分間行なった。灌流をさらに２０分間、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および１００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｉ型，Sigma Chemical Co.，セントルイス，ミズーリ州）を補ったウイリアムス媒体Ｅ（ＷＭＥ）を用いて行なった。灌流後、肝臓嚢を細かい鉗子を用いて除去し、そして肝細胞を、コラゲナーゼ溶液中で穏やかに振とうすることによって取り除いた。肝細胞懸濁液を、数層のガーゼを通してろ過しそして等容積の、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＷＭＷと混合した。肝細胞を、５０×ｇで５分間遠心分離することによって沈降させ、５％ＦＢＳを含むＷＭＥ中に再懸濁させた。肝細胞を沈降させ、そしてさらに２回この方法で再懸濁した。最終の細胞調製物をさらに数層のガーゼに通し、その後トリパンブルーを用いて生存率を調べた。細胞を、コラーゲン（Collabor ative Reseach）を予め塗布した６０ｍｍのPrimaria平板あたり２×１０⁶細胞の密度で平板培養した。培養を、３７℃で５％ＣＯ₂中で３時間インキュベーションして付着させ、そして培地を血清を含まない配合物に取替え、その後４８時間毎に取り替えた。血清を含まない配合物は、記載されているように（Lanford）、増殖ファクター、ホルモン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００μｇ／ｍｌゲンタミシンを補ったＷＭＥベースの媒体であった。Ｂ．肝臓特異的タンパク質の検出ヒト肝細胞培養を、種々の期間血清を含まない培地中に維持し、そして［³⁵Ｓ］−メチオニンで２４時間標識化した。培地を、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＥＤＴＡ、および１％ＮＰ４０を含むように調整した。種々の血漿タンパク質に特異的な抗体を、タンパク質Ａ−アガロースビーズに結合し、当該ビーズをＰＢＳで洗浄し、そして標識化した培地のアリコートを、抗体−ビーズ複合体と共に４℃で１６時間インキュベーションした。ビーズを３回、１％ＮＰ４０を含む緩衝液で洗浄し、そして免疫沈澱させたタンパク質を、２％ＳＤＳおよび２％２−メルカプトエタノールを含むゲル電気泳動試料緩衝液で溶出させた。試料を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％）およびオートラジオグラフィーによって分析した。例２一次ヒト肝細胞の試験管内ＨＥＶ感染Ａ．ヒト肝細胞のＨＥＶ感染ＨＥＶ感染カニクイザル＃７３大便プール（第四便通）を、一次ヒト肝細胞の感染のための接種材料として使用した。種々の量の接種材料を血清を含まない媒体（ＳＦＭ）１ｍｌ中で希釈して、３時間のインベーションの間に培養に適用した。次いでこの溶液に新鮮なＳＦＭ２ｍｌを補い、そして全混合物を一晩インキュベーションした。次の日、細胞単分子層をＷＭＥ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）で３回洗浄し、新鮮なＳＦＭに取り替えて、その後２日おきに取り替えた。Ｂ．免疫螢光染色アッセイ一次カニクイザル肝細胞を単離し、上記のコラーゲンを塗布したカバーグラスを備えた組織培養平板中で平板培養した。カバーグラス上の細胞に、ＨＥＶ感染カニクイザル＃７３大便プールかまたはＮＩＨ正常ヒト血清のいずれかを初期平板培養の３日後に感染させた。感染は２週間続けられた。カバーグラス上の細胞を、９０％アセトン中で室温で１分間固定した。次いでカバーグラスを空気乾燥した。カバーグラスを１時間ＰＢＳ中１％ヤギ血清中で遮断し、ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＨＥＶ組換えタンパク質１Ｌ６、４−２、および６−１−４に対するウサギ抗血清の混合物と共に室温で３時間インキュベーションした。再度カバーグラスをＰＢＳで３回洗浄しそして、ＰＢＳ−１％ヤギ血清中で希釈したフルオレセインイソチオシアナート共役（ＦＩＴＣ）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Zymed）と３０分間反応させた。カバーグラスをＰＢＳで３回洗浄し空気乾燥した後、ＦＩＴＣグリセロール溶液をのせて、螢光顕微鏡で調べた。Ｃ．逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）一次カニクイザル（cynomolgus macaque）肝細胞のＨＥＶ感染をＲＴ／ＰＣＲアッセイによって評価した。ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲのためのプライマーは、完全な長さのＨＥＶｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいていた（A．Tamら）。プライマーＨＥＶ３．２ＳＦ１（nt６５７８−６５９７）およびＨＥＶ３．２ＳＦ２（nt６６５０−６６６８）は、ウイルスゲノムのＯＲＦ２領域からのセンス極性を有しており、ＨＥＶ３．２ＳＲ１（nt７１０８−７１２７）およびＨＥＶ３．２ＳＲ２（nt７０７８−７０９７）は、当該領域中のアンチセンスプライマーである。ＨＥＶ感染細胞から全細胞ＲＮＡを、一段階グアニジニウム（guanidin iumu）方法またはSherkerらの方法によるＨＥＶ感染上清を用いて抽出した後、ＲＮＡ試料のアリコートを９５℃で５分間加熱変性し、室温で５分間そして４２ ℃で６０分間、１ｍＭの各デオキシリボヌクレオチド（Perkin-Elmer Cetus）および２．５ｕＭのＨＥＶ３．２ＳＲ１プライマーの濃度で、２０単位のＲＮａｓｉｎ（Promega）、１ｘＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer Cetur）を含む２０ｕｌ反応容積中で反応ごとに２００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）を用いて逆転写に付した。次いで反応混合物を９５℃で５分間熱処理してＭＭＬＶ逆転写酵素を変性した。１０ｐｌのｃＤＮＡ合成製品を、０．５ｕＭＨＥＶ３．２ＳＦ１プライマー、１．２５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq，Perkin-Elmer Cetus）および１ｘＰＣＲ緩衝液を含む５０ｍｌの最終容積中でＰＣＲのために使用し、５０ｍｌの鉱油で覆い、そしてPerin-Elmer熱循環器（thermocycler）中で４０サイクルのＰＣＲに付した（９５℃×１分；５２℃×２分；７２℃×３０秒）。次いで初回のＰＣＲ製品の１０μｌを、内部ＰＣＲプライマーＨＥＶ３．２ＳＦ２およびＨＥＶ３．２ＳＲ２を含む５０ｕｌの全容積中で、さらに４０サイクルの一連のＰＣＲ（９５℃×１分；５５℃×２分；７２℃×３０秒）に付した。初回および第二回のＰＣＲ製品を、アガロース電気泳動に付し、エチジウムブロミド染色し、そしてＵＶ光下で撮影した。結果を、上で説明した図４に示す。サザン転移を行なって、フィルターを、プライマー（nt６７８２−６９９７）を除いた［³²Ｐ−ｄＣＴＰ］−標識化内部プローブＨＥＶＯＲＦ２−７と交雑し、そしてオートラジオグラフィーを行なった。例３４０６．３−２および４０６．４−２抗原の調製ＴＺＫＦ１プラスミド（ＥＴ１．１），ＡＴＣＣ寄託番号６７７１７をＥｃｏＲＩで消化して１．３３ｋｂＨＥＶ挿入断片を遊離し、これをゲル電気泳動によって線状化プラスミドから精製した。精製した断片を、標準消化緩衝液（０．５ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．５；１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ；１０ｍＭＭｎＣｌ₂）中で懸濁して約１ｍｇ／ｍｌの濃度にし、ＤＮＡｓｅＩで室温で約５分間消化した。これらの反応条件は、先行した検定研究から求め、その際主に１００〜３００塩基対断片を作るのに必要なインキュベーション時間が求められた。材料をエタノール沈澱前にフェノール／クロロホルムで抽出した。消化混合物中の断片を平滑断端とし、ＥｃｏＲＩリンカーで結合した。結果として得られる断片を、ＰｈｉＸ１７４／ＨａｅＩＩＩおよびλ／ＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカーを用いて、１．２％アガロースゲル上で電気泳動（５−１０Ｖ／ｃｍ）によって分析した。１００〜３００ｂｐフラクションをＮＡ４５細片（Sc hleicher & Schuell）上へ溶出し、次いで、溶出溶液（１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭアルギニン、ｐＨ９．０）と共に、１．５ｍｌ微小管中に置き、そして６７℃で３０〜６０分間インキュベーションした。溶出したＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、次いで２容積のエタノールで沈澱させた。ペレットを２０ｍｌＴＥ（０．０１ＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．００１ＭＥＤＴＡ）中で再懸濁した。Ｂ．発現ベクター中でのクローニングラムダｇｔ１１ファージベクター（Huynh）をPromega Biotec（マディソン，ウイルコンシン州）から入手した。このクローニングベクターは、β−ガラクトシダーゼ翻訳終止コドンから上流に独特のＥｃｏＲＩクローニング部位５３塩基対を有している。コーディング配列５）から直接にまたはｃＤＮＡの増幅後に提供された、上記からのゲノム断片を、０．５〜１．０ｍｇのＥｃｏＲＩ開裂したｇｔ１１、０．３〜３ｍｌの上記標準サイズの断片、０．５ｍｌの１０Ｘ連結反応緩衝液（上記）、０．５ｍｌリガーゼ（２００単位）そして５ｍｌになるまで蒸留水を混合することによってＥｃｏＲＩ部位に導入した。混合物を、標準方法（Maniatis,第２５６〜５６８頁）に従って、一晩１４℃でインキュベーションし、次いで、試験管内でパッケージングした。パッケージングしたファージを使って、Dr．Kevin Moore，DNAX（Palo Alto，カリフォルニア州）から入手した大腸菌株ＫＭ３９２を感染させた。代わりに、 American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ＃３７１９７）から入手した大腸菌株Ｙ１０９０を使用することができた。感染した細菌を平板培養しそして得られたコロニーを、標準Ｘ-gal基質プラークアッセイ方法（Maniatis）を用いてＸ -galの存在中でβ−ガラクトシダーゼ活性−（透明プラーク）の喪失について調べた。約５０％のファージプラークが、β−ガラクトシダーゼ酵素活性の喪失を示した（組換え体）。Ｃ．ＨＥＶ組換えタンパク質についてのスクリーニングＨＥＶ回復期抗血清を、メキシコ、ボルネオ、パキスタン、ソマリアおよびビルマにおいて文書で証明されたＨＥＶの発生の際に感染した患者から得た。これらの血清を、ＥＴＮＡＮＢ肝炎を持った他の数人の患者のそれぞれからの大便検体中のＶＬＰｓと免疫反応させた。上記からのファージストックの約１０４ｐｆｕに感染した大腸菌ＫＭ３９２細胞のローンを、１５０ｍｍ平板上に作り、そして３７℃で５〜８時間逆さにしてインキュベーションした。このローンをニトロセルロースシートで覆い、発現したＨＥＶ組換えタンパク質をプラークから紙に移動させた。対応する平板およびフィルターを適合させるために、平板とフィルターに番号をつけた。フィルターをＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭトリス，ｐＨ８．０）１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％ツイーン20）中で２回洗浄し、ＡＬＢで遮断し（１％ゼラチンを含むＴＢＳＴ緩衝液）、再度ＴＢＳＴ中で洗浄し、そして抗血清の添加（ＡＩＢ中１：５０に希釈、１２〜１５ｍｌ／平板）後、一晩インキュベーションした。シートを２回ＴＢＳＴ中で洗浄し次いで、酵素標識化した抗ヒト抗体と接触させて、抗血清により認識される抗原を含むフィルター部位で標識化抗体を結合した。最終洗浄後、フィルターを、アルカリ性ホスファターゼ緩衝液（１００ｍＭトリス，ｐＨ９．５、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂）５ｍｌ中でＢＣＩＰ（４℃に維持された５０ｍｇ／ｍｌ貯蔵溶液）16ｍｌと混合した３３ｍｌのＮＢＴ（４℃で維持された50ｍｇ／ｍｌのストック溶液）を含む基質媒体中で現像した。抗血清によって認識されるように、抗原生産の地点で紫色が現れた。Ｄ．スクリーニング平板培養前の工程で決定された抗原生産の領域を、約１００〜２００ｐｆｕで８２ｍｍ平板上で再度平板培養した。５〜８時間のインキュベーションから始まりＮＢＴ −ＢＣＩＰ現像を介する上記工程を、ＨＥＶ抗体と反応し得る抗原を分泌するファージをプラーク精製するために繰り返した。同定されたプラークを取り出して、ファージ緩衝液（Maniatis,第４４３頁）中に溶出した。選択された２つのサブクローンは、４０６．３−２および４０６．４−２クローンであり、それらの配列は上に示されている。これらの配列を、メキシコ人の大便から得られた増幅ｃＤＮＡライブラリーから単離した。このセクション中に記載された技術を用いて、これらのクローンによって発現されたポリペプチドを、世界中の源から得られた多数の種々のヒトＨＥＶ−陽性血清に対する免疫反応性について調べた。以下の表４に示されているように、ポリペプチドと免疫反応性である８つの血清は、４０６．４−２によって発現し、そしてポリペプチドと免疫反応した６つの血清は、４０６．３−２クローンによって発現した。比較のため、当該表は、種々のヒト血清と非構造ペプチドＹ２との反応性も示す。これらの血清の中の１つだけが、このクローンによって発現したポリペプチドと反応した。免疫反応性は、ｇ１１ベクターの正常の発現生成物について見られなかった。ここでＹ２は、ＨＥＶゲノムの第一翻訳可能領域からのＨＥＶ配列１５７塩基対配列によってコード化された配列を表している。Ｅ．４０６．３−２抗原を作る上記からの４０６．３−２ｇｔ１１プラスミドを、ＥｃｏＲＩで消化し、遊離したＨＥＶ断片を、５’断片末端にＮｃｏＩ部位を、また３’断片末端にＢａｍＨＩを添加するリンカーの存在下にＰＣＲによって増幅した。増幅した材料を、製造業者の指示に従って、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化しそしてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼベクターｐＧＥＸ発現ベクターのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。ｐＧＥＸプラスミドを使用して大腸菌宿主細胞を形質転換し、そしてｐＧＥＸベクターで首尾よく形質転換された細胞を、抗ＨＥＶヒト抗血清を用いて、免疫螢光法によって同定した。Ｆ．４０６．４−２抗原を作る上記からの４０６．４−２ｇｔ１１プラスミドを、上述したように、ＥｃｏＲＩで消化し、そして遊離したＨＥＶ断片をＰＣＲによって増幅し、増幅した断片を、ｐＧＥＸ発現ベクターのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。４０６．４ −２のペプチド発現は、４０６．３−２融合ペプチドについて記載されたものと同様であった。Ｇ．抗体を作る標準方法に従って、上述したようにして作った４０６．３−２（Ｍ）および４０６．４−２（Ｍ）を使用してウサギを免疫してＨＥＶ特異的抗血清を生じさせた。例４抗−３．２（Ｍ）抗体の中和活性Ａ．試験管内感染一次ヒト肝細胞がＨＥＶ感染および複製を許容することを証明するために、細胞を正常なヒト血清（ＮＩＨ正常ヒト血清プール）またはＨＥＢ感染したカニクイザル大便調製物（cyno＃７３）のいずれかにさらした。感染後１４日、全細胞ＲＮＡｓを逆転写（ＲＴ）／ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイのために調製して、ＨＥＶでの一次ヒト肝細胞の感染性を評価した。結果は、一次ヒト肝細胞がＨＥＶ増殖を支え得ることを示した（図４）。定量的なＰＣＲを適用しないにもかかわらず、ＨＥＶ感染一次ヒト肝細胞から単離した全細胞ＲＮＡは、³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識化ＨＥＶ特異的プルーブでのハイブリダイゼーションの程度によって示唆されるウイルス複製の高いレベルを示すであろう（レーン５）。正常のヒト血清プールで処理した一次ヒト肝細胞から単離した全細胞ＲＮＡ中のＨＥＶの形跡はなかった（レーン４）。ＲＴ／ＰＣＲアッセイのためのネガティブコントロールとして、残余または交差汚染は検出されなかった（レーン１、２および３）。最初のＨＥＶ感染カニクイザル大便（cyno ＃７３）は、ＲＴ／ＰＣＲアッセイ中のポジティブコントロールとして役に立った（レーン６）。Ｂ．抗体の中和活性抗−３−２（Ｍ）、−４−２−（Ｍ）の中和活性を調べるために、各ウサギ抗血清を、一次ヒト肝細胞のＨＥＶ感染のためのウイルス接種材料と共に最終希釈度１：２０で使用した。希釈した抗体およびウイルス接種材料を、培養細胞の感染前に一緒にインキュベーションした。ウサギ抗−３−２（Ｍ）は、ＨＥＶ感染に対する活性を中和する高いレベルを示した（図５、レーン２対レーン１）。非常にわずかな中和活性が、ウサギ抗−４−２（Ｍ）において観察された（レーン４対レーン３）。この結果は、ＨＥＶ３−２（Ｍ）組換えタンパク質は、ＨＥＶ感染に対する保護抗体を引き出すことができる中和エピトープをコード化したが、ＨＥＶ４−２（Ｍ）または４−２（Ｂ）組換えタンパク質はコード化しなかったことを示唆する。メキシコクローン３−２（Ｍ）およびビルマクローン３−２（Ｂ）がアミノ酸レベルで９０．５％の相同性を共有するという事実は、３−２（Ｍ）に対して上昇した抗体が、感染する任意の細胞からのメキシコ株またはビルマ株のＨＥＶを交差中和または交差保護するはずであることを示唆した。例５ＨＥＶに対するワクチン保護Ａ．ｔｒｐＥ−Ｃ２ペプチドの調製ＨＥＶの１．８ｋｂ３’末端部分に対応する２．３ｋｂ挿入断片を含むｐＢＥＴ１プラスミドが開示されている（Tam）。このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し片を、電気泳動することによって精製し、そしてT.J．Koernerら（Department o f Microbiology，UCLA）から入手したｐＡＴＨ１０ｔｒｐＥ融合ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入挿入した。この組換えベクターを使用して大腸菌ＤＨ５αＦ’ 宿主を形質転換した。ｐＡＴＨＡＣ２からの組換えｔｙｐＥ−Ｃ２融合タンパク質を、Dieckmannらの手順の修正によって単離した。ｐＡＴＨＣ２プラスミドを含む細菌を一晩トリプトファンを含む増殖培地中で増殖した。２ｍｌの一晩培養菌を、１００ｍｌの新鮮な増殖培地中に接種し、そしてさらに３７℃で４時間増殖させた。細菌ブロスを、トリプトファンを含まない新鮮な増殖培地１リットルに添加し、３０℃で１．５時間増殖させた。１０ｍｌのインドールアクリル酸（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして増殖を３０℃でさらに５〜１０時間続けた。細菌細胞を遠心分離によって集めた。細胞ペレットを、リゾチームを含む低張性溶液中に再懸濁して細菌細胞壁を分解した。懸濁物に塩化ナトリウムおよび界面活性剤ＮＰ−４０を添加して、細胞の高張性溶菌を引き起こした。溶菌細胞溶液を音波処理した。溶液を遠心分離した。得られたタンパク質ペレットを、dounceホモジェナイザーを用いて約５ｍｌの１０ｍＭトリスｐＨ７．５中に再懸濁させた。溶液中のタンパク質の約７５％はｔｒｐＥ−Ｃ２タンパク質からなっていた。Ｂ．ワクチンの調製変成したミョウバンアジュバントを標準方法により調製した。手短に言うと、１０％ミョウバン懸濁液を、１ＮのＮａＯＨで滴定してｐＨ６．６にし、次いで４℃で一晩攪拌した。懸濁液を、低速遠心分離によって清澄にし、上清をデカントした。少量の０．９％ＮａＣｌ＋１：２０，０００ホルマリンを各ペレットに添加し、そして渦によって懸濁させた。抗原ワクチン組成物を調製するため、上からのｔｒｐＥ−Ｃ２融合タンパク質を、０．９％ＮａＣｌ溶液中に添加して所望の最終抗原濃度にした。非アジュバント化不溶性ｔｒｐＥ−Ｃ２ペプチドを、上記セクションＡにおいて上述したように製造した。Ｃ．予防接種８９０１、８９０２、８９０３、８９１０、９９０２および９９０４と称された６匹のカニクイザルを予防接種研究において使用した。これらのサルの中４匹、８９０１、および８９０２、８９０３、および８９１０を、１．０ｍｌのミョウバンアジュバント化ｔｒｐＥ−Ｃ２組成物（約５０μｇのＣ２ペプチドを含む）で静脈内注射することによって免疫した。残りの２匹の動物はアジュバントのみを受けた。１ヵ月後、６匹の動物に、第一のものと同一の第二予防接種を与えた。第二予防接種の４週間後、これらの動物からの血清を、融合していないＣ２タンパク質を用いて、ウエスタンブロッティングにより、抗ＨＥＶ抗体について試験した。この段階で、動物８９０１および８９０２はそれぞれ、アジュバント化されていない、不溶性のｔｒｐＥ−Ｃ２組成物（それぞれ約８０μｇのｔｒｐＥ −Ｃ２ペプチドの全ＩＶ用量）での第三予防接種を受けて、両方の動物は、４週後にウエスタンブロッティングにより抗ＨＥＶを示した。動物８９０１、８９０３および９００２にそれぞれ、各１ｍｌの、前に非常に感染性であることが示された１０％の第三排便カニクイザル大便（ビルマ株）で誘発試験ＩＶを行なった。動物８９０２、８９１０および９００４にそれぞれ、カニクイザルに厳しい疾患およびチンパンジーに並の疾患を引き起こすことが知られている、証明ずみの感染性のヒト大便分離菌，メキシコ株＃１４の１ｍｌで誘発試験ＩＶを行なった。結果は、上で説明した図２Ａ、２Ｂおよび３Ａおよび３Ｂに示されている。例６急性ＨＥＶ抗血清と免疫反応性のＨＥＶエピトープＡ．重複ペプチドの合成 Geyseらの方法（Geysen）をこの合成において使用した。手短に言うと、４つのアミノ酸全てに重複している１０量体をポリプロピレンピンヘッド上で合成した（Cambridge Research Biochemicals，Norwich，英国）。全てのペプチドを二重に合成した。使用したアミノ酸は、９−フルオレニルメトキシカルボニル誘導体のペンタフルオロフェニルエステルであった。ブロックをジメチルホルアミド（ＤＭＦ）（Baxter Healthcare，Burdick & Jackson Div.，Muskegon，ミシガン州）中で５分間浸漬し、次いでＤＭＦ中２０％ピペリジン中で１時間脱保護した。ブロックを次いで、ＤＭＦ中１％酢酸（Mallinckrodt）で５分間洗浄し、次いでＤＭＦ中で同様に洗浄した。メタノール中での４回の洗浄後、ブロックを１時間空気乾燥した。濃度３０ｍＭのアミノ酸の添加前に、ブロックを５分間ＤＭＦ中に置いた。アミノ酸誘導体をＤＭＦ中１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Sigma）の等モル溶液中に溶解させた。１００μｌの所望のアミノ酸を、ポリプロピレンマイクロタイタープレートの適当なウエル中に分配し、それらを次いで室温で一晩インキュベーションした。次の日、上述したように、ブロックをＤＭＦ中で１回、そしてメタノール中で４回洗浄し、そして空気乾燥した後、脱保護を行なった。上記工程を、所望のアミノ酸数が添加されるまで繰り返した。次いでＮ−末端アミノ基を、１０％無水酢酸（Sigma）および２％ジイソプロピル−エチルアミン（Sigma）を含むＤＭＦ中でアセチル化した。室温で９０分のインキュベーションの後、当該ペプチドを、２．５％フェノール（Sigma）および２．４％１，２−エタンジチオール（Sig ma）を含むトリフルオロアデト酸（Sigma）中で４時間脱遮断した。その後、ジクロロメタン（Aldrich）中および、５％ジイソプロピルエチルアミンを含むジクロロメタン中で洗浄した。次いでブロックを空気乾燥し、蒸留水中およびメタノール（Mallinckrodt）中ですすいだ。空気乾燥後、ブロックをシリカゲル中に室温で少なくとも１７時間貯蔵した後、−２０℃で貯蔵した。合成を監視するために、アミノ酸配列ＰＬＡＱおよびＧＬＡＱを有するペプチドをコントロールピン上で同時に合成した。Ｂ．ヒト血清ウエスタンブロットアッセイ（Hyams）により診断された急性Ｅ型肝炎の１１人のスーダン人の小児科患者（年齢１４歳またはそれ未満）からの血清試料をプールし、そして上記重複ペプチドに対する反応性を調べた。急性Ｅ型肝炎の形跡のない（ウエスタンブロットアッセイによって調べた）同一の研究（Hyams）における１１人の対照患者からの血清試料もプールしそしてネガティブコントロールとして供給した。Ｃ．ＥＬＩＳＡによるヒト血清の試験ブロックを室温にした後、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２，ＧＩＢＣＯ）中の遮断試薬［５％ウシ血清アルブミン（Calbiochem）、０．０５％ツイーン２０（Sigma）および０．０５％アジ化ナトリウム（Fischer Scientific）］中で３７℃で１時間インキュベションした。このブロックを一晩適当な血清試料（遮断試薬中１：１００の希釈度）とまたはＰＢＳと共に４℃でインキュベーションした。全てのプールした血清を二重合成に対して試験した。ＰＬＡＱおよびＧＬＡＱピンを、市販のマウス血清（Cambridge Research Biochemicals）を用いて試験した。次の日、ブロックを、０．０５％ツイーン２０および０．５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）（洗浄緩衝液）中で４回洗浄しそして１時間３７ ℃で、アルカリ性ホスファターゼ標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭと共に１：１０００希釈度で洗浄緩衝液中でインキュベーションした。ＰＬＡＱおよびＧＬＡＱピンは、１：１０００希釈度で同様に標識化したヤギ抗マウスＩｇＧを受領した。ブロックを前に記載したように再度１回洗浄しそして色を、市販のホスファターゼ基質キツト（Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，メリーランド州）を用いることによって発色させた。着色反応の強さをＵＶマックス（ Molecular Devices）上で４０５ｎｍで求めた。ＰＢＳと共にインキュベーションしたペプチドのために得られた値を次いで、血清試料を用いて得られた対応する値から控除した。Ｄ．ブロックの音波処理使用後、ブロックをＰＢＳ中で５分間洗浄した後、１％ＳＤＳ（Sigma）および０．１％２−メルカプトエタノール（Sigma）を含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で４０分間４７ｋＨｚ、６０℃で音波処理した。音波処理の後、６０℃で水の中で４回洗浄し、メタノール中で１回洗浄した。次いでブロックを１時間空気乾燥した後、−２０℃で貯蔵した。本発明を個々の実施態様、方法、構成および使用に関連して説明したが、当業者にとって、種々の変更および修正は本発明からはなれずになされ得ることは明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１月７日【補正内容】請求の範囲１．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３８からなる群から選択される免疫原性Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ペプチド。２．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３４からなる群から選択される請求項１記載のペプチド。３．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５〜３７からなる群から選択される請求項１記載のペプチド。４．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８を有する請求項１記載のペプチド。５．固体支持体、およびそれに誘導体化された、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３８からなる群から選択されるＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ペプチド抗原を含む診断試薬。６．ペプチド抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３４からなる群から選択される請求項５記載の試薬。７．ペプチド抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５〜３７からなる群から選択される請求項５記載の試薬。８．ペプチド抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８を有する請求項５記載の試薬。９．薬理学的に容認できるキャリヤー中に、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３８からなる群から選択されるＨＥＶペプチド抗原を含むＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に対して個体を免疫化する際に使用するためのワクチン組成物。１０．ペプチド抗原が、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３４からなる群から選択される請求項９記載の組成物。１１．ペプチド抗原が、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５〜３７からなる群から選択される請求項９記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/10 9116−2ＪＧ０１Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹＣ１２Ｐ 21/02 ＡＢＤＧ０１Ｎ 15/00 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ (71)出願人ザ・デパートメント・オブ・ザ・ネイヴィーアメリカ合衆国、ワシントン、デー・シー・20231 (72)発明者レイズ・グレゴリー・アールアメリカ合衆国、テキサス州、77380 ザ・ウッドランズ、レッド・セイブル・ポイント、25 (72)発明者ブラッドリー・ダニエル・ダブリューアメリカ合衆国、ジョージア州、30244 ローレンスヴィル、ケリー・コート、2938 (72)発明者タム・アルバート・ダブリューアメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94122 サン・フランシスコ、テンス・アヴニュー、1871 (72)発明者カール・ミッチェルアメリカ合衆国、メリーランド州、20901 シルバー・スプリングス、オペラ・コート、309

Claims

【特許請求の範囲】１．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３８からなる群から選択される免疫原性Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ペプチド。２．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３４からなる群から選択される請求項１記載のペプチド。３．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５〜３７からなる群から選択される請求項１記載のペプチド。４．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８を有する請求項１記載のペプチド。５．固体支持体、およびそれに誘導体化された、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５〜３７からなる群から選択されるＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ペプチド抗原を含む診断試薬。６．ペプチド抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３４からなる群から選択される請求項５記載の試薬。７．ペプチド抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５〜３７からなる群から選択される請求項５記載の試薬。８．ペプチド抗原がＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８を有する請求項５記載の試薬。９．薬理学的に容認できるキャリヤー中に、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３８からなる群から選択されるＨＥＶペプチド抗原を含むＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に対して個体を免疫化する際に使用するためのワクチン組成物。１０．ペプチド抗原が、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３４からなる群から選択される請求項９記載の組成物。１１．ペプチド抗原が、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５〜３７からなる群から選択される請求項９記載の組成物。１２．ペプチド抗原が、ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８を有する請求項９記載の組成物。１３．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３８からなる群から選択されるＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ペプチド抗原に対して免疫特異的である抗体。１４．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．２３〜３４からなる群から選択されるペプチド抗原に対して免疫特異的である請求項１３記載の抗体。１５．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯＳ．３５〜３７からなる群から選択されるペプチド抗原に対して免疫特異的である請求項１３記載の抗体。１６．ＳＥＱ．Ｉ．Ｄ．ＮＯ．３８を有するペプチド抗原に対して免疫特異的である請求項１３記載の抗体。