JPH08509720A

JPH08509720A - 白血球接着阻害

Info

Publication number: JPH08509720A
Application number: JP6524287A
Authority: JP
Inventors: ラスキー、ローレンス・エイ; バウムホイター、スザンネ; ローゼン、スティーブン・ディー; シンガー、マーク・エス
Original assignee: University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California
Priority date: 1993-05-03
Filing date: 1994-04-06
Publication date: 1996-10-15
Also published as: DE69428041D1; DE69428041T2; ATE204478T1; AU6627494A; EP0697880A1; US20080241143A1; WO1994025047A1; EP0697880B1; ZA942956B; IL109452A0; US20040141966A1; CA2159330A1; US20120328632A1; CA2159330C; AU678469B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、新たに同定されたＬ−セレクチンリガンドであるＣＤ３４を投与することにより、Ｌ−セレクチンによって媒介される細胞間接着の阻害に関する。とりわけ本発明は、単離し、精製されたＣＤ３４ポリペプチドまたは天然のＣＤ３４を結合することができる抗体の有効量を投与することにより、内皮細胞への白血球接着を阻害する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】白血球接着阻害発明の背景〈Ｉ〉発明の分野本発明は、新たに同定されたＬ−セレクチンリガンドであるＣＤ３４を投与することにより、Ｌ−セレクチンによって媒介される細胞間接着の阻害に関する。とりわけ本発明は、単離し、精製されたＣＤ３４ポリペプチドまたは天然のＣＤ３４を結合することができる抗体の有効量を投与することにより、内皮細胞への白血球接着を阻害する方法に関する。〈II〉背景および関連技術の説明急性または慢性炎症部位への白血球の移動には、これらの細胞と内皮との間での接着性相互作用が関与する。この特異的接着は、炎症性傷害より開始されるカスケードでの初期事象であることから、生体の防御調節に最も重要なことである。炎症性反応の間、白血球と内皮との間での相互作用に関与する細胞接着分子の種類は、現在のところ以下の４つ：１.セレクチン；２.セレクチンに対する（炭水化物および糖タンパク質）リガンド；３.インテグリン；４.インテグリンリガンドであり、これらは免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成員である。セレクチンは、レクチン、egf様および補体結合様ドメインの包含により構造上統合された細胞接着分子であり［ベビラッカ（Bevilacqua）,Ｍ.Ｐ.ら、サイエンス（Science）２４３、１１６０−１１６５（１９８９）；ジョンソン（Joh nson）ら、セル（Cell）５６、１０３３−１４４（１９８９）；ラスキー（Lask y）,Ｌ.Ａ.、セル５６、１０４５−１０５５（１９８９）；シーゲルマン（Sie gelman）,Ｍ.ら、サイエンス２４３、１１６５−１１７２（１９８９）；スツールマン（Stoolman）,Ｌ.Ｍ.、セル５６、９０７−９１０（１９８９）］、またそれらのレクチンドメインと細胞表面炭水化物リガンドとの間での相互作用を介して細胞結合を媒介するそれらの能力により機能上統合された細胞接着分子である［ブランドレイ（Brandley）,Ｂ.ら、セル６３、８６１−８６３（１９９０）；スプリンガー（Springer）,Ｔ.およびラスキー,Ｌ.Ａ.、ネイチャー（Nature）３４９、１９６−１９７（１９９１）；ベビラッカ,Ｍ.Ｐ.およびネルソン（Nelso n）,Ｒ．Ｍ.、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Cli n.Invest. ）９１、３７９−３８７（１９９３）］。細胞接着分子のセレクチンファミリーにおいて現在までに同定された３つの構成員は、以下のものである：Ｌ−セレクチン（a.k.a.末梢リンパ節ホーミングレセプター（pnＨＲ）、ＬＥＣ−ＣＡＭ−１、ＬＡＭ−１、gp９０^MEL、gp１００^M ^EL 、gp１１０^MEL、ＭＥＬ−１４抗原、Ｌeu-８抗原、ＴＱ−１抗原、ＤＲＥＧ抗原）、Ｅ−セレクチン（ＬＥＣ−ＣＡＭ−２、ＬＥＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ−１）およびＰ−セレクチン（ＬＥＣ−ＣＡＭ−３、ＬＥＣＡＭ−３、ＧＭＰ−１４０、ＰＡＤＧＥＭ）。Ｌ−セレクチンは、リンパ球、好中球、単球および好酸球といったような白血球の表面上に発現して、末梢リンパ組織へのリンパ球伝達（trafficking）に関与したり［ガラティン（Gallatin）ら、ネイチャー３０３、３０−３４（１９８３）］、また好中球により媒介される炎症性反応に関与する［ワトソン（Watson ）,Ｓ．Ｒ.、ネイチャー３４９、１６４−１６７（１９９１）］。Ｌ−セレクチンのアミノ酸配列およびコードする核酸配列は、例えば、１９９２年３月２４日に発行された米国特許第５,０９８，８３３号で開示されている。レクチンドメインを含んでなるＬ−セレクチンは、内皮細胞上の炭水化物を含むリガンドを認識することにより、その接着機能を発揮する。Ｌ−セレクチン− IgGキメラ分子を用いて、イマイ（Imai）,Ｙ.ら［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell Biol.）１１３、１２１３−１２２１（１９９１）］は、［³⁵ Ｓ］硫酸塩−標識化腸間膜リンパ節から約５０kＤの硫酸化糖タンパク質（Ｓg p５０）を沈殿させて、Ｓgp５０がＬ−セレクチンに対するＨＥＶリガンドであることを提唱した［イマイら、グリコバイオロジー（Glycobiology）２、３７３ −３８１（１９９２）；イマイら、ネイチャー３６１、５５５−５５７（１９９３）；および１９９２年１１月１２日に公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９２／１９７６１号もまた参照］。硫酸塩導入の面から見て比較的小さな約９０kＤのバンドもまた大抵の分析で観察されて、Ｓgp９０と名付けられた。リンパ組織のうち、末梢リンパ節（ＰＮ）および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）だけが５０および９０kＤのバンドを示したが、パイエル板（ＰＰ）、脾臓および胸腺は、どちらに関しても陰性であることが利用したアッセイで分かった。腎臓、肝臓、大脳および小脳といったような非リンパ器官は、Ｓgp５０およびＳgp９０のどちらに関しても全く陰性であることが分かった。Ｓgp９０は、Ｓgp５０と多くの特徴を共有して、硫酸化、フコシル化糖タンパク質であることを示し、その沈殿反応は、カルシウム依存性であり、Ｌ−セレクチン特異的ＭＥＬ−１４モノクローナル抗体により阻害可能であり、特異的多糖類により阻害可能であって、シアリン酸の存在に左右された。Ｓgp５０と同様に、Ｓgp９０はモノクローナル抗体ＭＥＣＡ−７９により沈殿することが報告され［ストリーター（Streeter）ら，ネイチャー（ロンド（Lond.））３３１、４１−４６（１９８８）；ストリーターら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１０７、１８５３−１８６２（１９８８）］、またこの成分は、他の幾つかのタンパク質のうち、リンパ節のウエスタンブロット分析でＭＥＣＡ−７９により認識される主要な９０kＤの成分と同一であるかもしれないという仮説が立てられた［ブッチャー（Butcher）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Am.J.Pathol.）１３６、３−１２（１９９０）］。内皮細胞とゆるく結合するＳgp５０リガンドとは対照的に、Ｓgp９０は内皮細胞表面にしっかりと結合することが分かった［イマイら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー上記；ラスキーら、セル６９、９２７−９３８（１９９２）；およびブルシュタイン（Brustein）ら、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）１７６、１４１５−１４１９（１９９２）］。この糖タンパク質をコードするcＤＮＡのクローニングおよび発現を可能とするアミノ酸配列分析に十分な量の、より多くのＳgp５０リガンドを精製するために、Ｌ−セレクチン−ＩgＧキメラ分子を物理的分別法および植物レクチンクロマトグラフィーと組み合わせて使用した［ラスキー,Ｌ.Ａ.ら、セル６９、９２７− ９３８（１９９２）；および１９９２年１１月１２日に公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９２／１９７３５号］。ＣＤ３４（またＨＰＣＡ−１とも呼ばれる）は、ヒト造血始原細胞および様々な組織の小さな血管内皮上に発現するという未知機能の１１５kＤaの膜貫通糖タンパク質（特性では（in character）シアロムチン）として既知である。その生化学的構造および部分的アミノ酸配列は、ワット（Watt）ら［ロイケミア（Leuk emia ）１、４１７（１９８７）；およびスザーランド（Sutherland）ら、ロイケミア２、７９３（１９８８）］により記載された。その遺伝子は染色体１qにマップされ［モルガード（Molgaard）ら、ロイケミア３、７７３（１９８９）］、またＣＤ３４をコードするcＤＮＡのクローニングは、サイモンズ（Simmons）ら［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）１４８、２６７−２７１（１９９２）］およびブラウン（Brown）ら［インターナショナル・イムノロジー（I nt.Immunol .）３、１７５−１８４（１９９１）］により報告された。発明の要約本発明は、Ｌ−セレクチンに対する９０kＤの糖タンパク質リガンド（Ｓgp９０）の精製および特性決定の成功に一部基づく。具体的に計画された多段階精製法によるマウス末梢リンパ節からのＳgp９０の単離、およびＮ末端並びに内部トリプシンペプチド両方のアミノ酸配列決定（sequencing）により、この糖タンパク質のポリペプチド骨格がマウスＣＤ３４のものと実質的には同一であることが明らかとなった。組換え型のマウスＣＤ３４に対して働くポリクローナル抗血清を用いて、本発明者らは、この糖タンパク質が、毛細管および末梢リンパ節高内皮細静脈（ＰＬＮＨＥＶ）の内皮に先端分布を有し、Ｌ−セレクチンに対する接着リガンドとしての役割と一致することを実証した。この抗血清はさらに、Ｌ− セレクチン沈殿反応によりリンパ節から単離されるＳgp９０を認識することが分かった。これらの結果は共に、ＣＤ３４の内皮糖型がＬ−セレクチンに対する接着リガンドとして作用することを示唆する。Ｌ−セレクチンに対するリガンドは発現しないと以前考えられていたリンパ外（extra-lymphoid）内皮細胞での後者の糖タンパク質の広い分布から考えて、第二Ｌ−セレクチンリガンドのＣＤ３４としての同定は全く予期されなかった。一態様において、本発明は、Ｌ−セレクチンにより媒介される細胞間接着に関連する病理学的状態を抑制する方法であって、ａ）単離し、精製されたＣＤ３４ポリペプチド；またはｂ）天然のＣＤ３４を結合することができる抗体の治療的有効量を必要とする患者へ投与することからなる方法に関する。特定の態様において、一次および二次リンパ器官の高内皮細静脈（ＨＥＶ）へのリンパ球接着、または血管内皮への好中球もしくは単球接着を阻害するために、ＣＤ３４ポリペプチドまたは抗−ＣＤ３４抗体を使用する。ＣＤ３４の投与は、セレクチン、さらにセレクチンリガンド、セレクチンまたはＣＤ３４以外のセレクチンリガンドを結合することができる抗体、インテグリン、インテグリンリガンド、インテグリンまたはインテグリンリガンドを結合することができる抗体、他の細胞接着分子またはそれらのリガンド、Ｌ−セレクチンにより媒介される白血球接着の非タンパク質（例えば、炭水化物）拮抗物質、抗炎症剤、抗酸化剤等を含め（これらに限定するものではない）、さらなる治療剤の有効量の投与と組み合わせることができる。本明細書中の方法の全態様において、患者は、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトである。別の態様において、本発明は、ＣＤ３４を結合することができる抗体と医薬的に活性な薬剤とを化学的に、または物理的に関連させることにより、該薬剤を内皮細胞へ標的化する方法に関する。またさらに別の態様において、本発明は、ＣＤ３４ポリペプチドもしくは抗− ＣＤ３４抗体、また所望により、さらに医薬的に活性な薬剤、好ましくは抗炎症剤、抗酸化剤、または内皮細胞へのさらなる白血球接着阻害剤を含んでなる医薬組成物に関する。さらなる態様において、本発明は、ＣＤ３４配列または天然のＣＤ３４を結合することができる抗体配列、およびさらなる医薬的に活性な部分を含んでなる双特異性分子に関する。特定の態様において、双特異性分子は、天然のＣＤ３４を結合することができる第一抗体配列、および白血球接着に関連する別の分子を結合することができる第二抗体配列を含んでなり得る。またさらなる態様において、本発明は、天然のＣＤ３４を結合することができる抗体へ共有結合する医薬的に活性な部分を含んでなる分子に関する。またさらに別の態様において、本発明は、ＣＤ３４ポリペプチドのポリペプチド骨格へ結合することにより、ＣＤ３４を発現する内皮細胞へのＬ−セレクチン −ＣＤ３４相互作用の炭水化物拮抗物質を提供する方法に関する。本発明のこれらの態様および他の態様は、当業者に明白であろう。図面の簡単な説明〈第１図〉Ｓgp９０Ｌ−セレクチンリガンドの精製およびアミノ酸分析。（Ａ）Ｓgp９０は、Ｓgp５０とは独立してＬ−セレクチンに対するリガンド活性を有する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの再沈殿反応では、ＥＤＴＡの不存在（−）または存在（＋）下、Ｌ−セレクチン−ＩgＧプロテインＡセファロース（ＬＥＣ− ＩgＧ）またはＣＤ４−ＩgＧプロテインＡセファロース（ＣＤ４−ＩgＧ）を用いて、Ｓgp９０を精製した。「supt.」は上澄み中の非結合物質を示し、「bound 」は再沈殿物質を示す。Ｍ_r標準を左側に示す。（Ｂ）単離されたＳgp９０Ｌ−セレクチンリガンドのＮ末端配列をマウスＣＤ３４の提唱された¹²Ｎ末端と比較した。１、２、６および１０の位置にある「Ｘ」は、恐らくこれらのトレオニン／セリン残基のＯ−グリコシル化によるものであろう、Ｓgp９０リガンドのＮ末端配列におけるギャップを示す。単離されたＳ gp９０のトリプシン消化（digest）の毛細管ＨＰＬＣプロフィール、およびマウスＣＤ３４の内部トリプシンペプチドの配列と比較したトリプシンペプチド９の配列もまた示す。〈第３図〉マウスＰＬＮ起源の硫酸塩−標識化糖タンパク質の免疫沈殿反応分析。（１）抗−ＧlyＣＡＭ１抗血清を用いる硫酸塩−標識化ＰＬＮ溶解産物（lysa te）の免疫沈殿反応。（２）抗−mＣＤ３４抗血清を用いる硫酸塩−標識化ＰＬＮ溶解産物の免疫沈殿反応。（３）Ｌ−セレクチン−ＩgＧキメラを用いる硫酸塩−標識化ＰＬＮ溶解産物の免疫沈殿反応。ＥＤＴＡインキュベーションによりＬ−セレクチン付着硫酸塩 −標識化リガンドを解離させて、カルシウムの存在下にＬ−セレクチン−ＩgＧを用いて再沈殿させた。（４）抗−mＣＤ３４抗血清を用いるＬ−セレクチン付着ＥＤＴＡ解離性硫酸塩−標識化タンパク質の免疫沈殿反応。（５）抗−ＧlyＣＡＭ１抗血清を用いるＬ−セレクチン付着ＥＤＴＡ解離性硫酸塩−標識化タンパク質の免疫沈殿反応。Ｍr標準を右側に示す。〈第４図〉Ｌ−セレクチンに対するＳgp５０（ＧlｙＣＡＭ１）およびＳgp９０（ＣＤ３４）内皮リガンドの仮説的な構造比較。先に提唱されたＧlyＣＡＭ１の構造を左側に示して、高度に広がった（highly extended）２つのムチン様ドメイン（交差−ハッチングした線）、潜在的（pote ntial）Ｃ末端の両親媒性ヘリックス、またらせん状ドメインと相互作用する仮定膜貫通タンパク質を説明する。右側には、高度に広がった、Ｎ末端に位置するもっと長いムチン様ドメイン（交差−ハッチングした線）、システインに富むドメイン（陰をつけた楕円面）、膜貫通ドメイン（ヘリックス）および広がった細胞質ドメインを含め、mＣＤ３４の仮説的な構造が説明されている。〈第５図〉様々な組織におけるmＣＤ３４ＲＮＡの発現パターン。〈第６図〉（Ａ）２９３細胞へ安定にトランスフェクトした、マウスＣＤ３４cＤＮＡ（上）およびmＣＤ３４ヒトＩgＧキメラ（下）の図解表現。（Ｂ）還元（reducing）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による、親和性で精製されたＣＤ３４／ＩgＧ融合タンパク質の分析；右側にkＤaで示す分子量マーカーと共に、クマシーブルー染色ゲルを示す。〈第７図〉（Ａ）全長の（full length）マウスＣＤ３４cＤＮＡを用いてトランスフェクトしたＮＲＫ細胞、および（Ｂ）高レベルのmＲＮＡを発現することを示したＮＩＨ３Ｔ３細胞上でのＣＤ３４表面発現の蛍光自動細胞分離分析装置分析。示したプロフィールは、第二抗体のみを用いて染色した細胞（フィルなし）、前駆免疫血清を用いて染色した細胞（灰色フィル）、および抗−ＣＤ３４抗血清を用いて染色した細胞（黒色フィル）である。〈第８図〉抗−ＣＤ３４抗体を用いる、ＣＤ３４の血管分布の免疫組織化学分析。切片を調製し、材料および方法で詳述する通り染色した。（Ａ）脳、（Ｂ）腎臓、（Ｃ）胸腺、および（Ｄ）骨髄。上のパネルは１０×原倍率で示したヘマトキシリン／エオシン染色切片であり、下のパネルは抗−ＣＤ３４を用いて染色し（１０×）、また右側隅の挿入写真は４０×原倍率で細部を示す。〈第９図〉炎症組織における血管ＣＤ３４発現の調節。（Ａ）正常および炎症リンパ節切片、（Ｂ）正常皮膚またはＤＴＨ反応誘発後の動物起源の皮膚、（Ｃ）２０週齢の雄または雌のＮＯＤマウス起源の膵島を材料および方法で記載する通り染色した。雌のＮＯＤ膵臓においてＣＤ３４を発現するＨＥＶ様構造を矢印で示す。〈第１０図〉膵島の炎症性浸潤におけるＨＥＶ様構造へ結合するＬ−セレクチン／ＩgＧ。ＧlyＣＡＭ１およびＣＤ３４を用いての共局在化（colocalization）。（Ａ）イムノゴールド（immunogold）−標識化Ｌ−セレクチン／ＩgＧ、（Ｂ）ＥＧＴＡの存在下、イムノゴールド−標識化Ｌ−セレクチン／ＩgＧ、（Ｃ）抗−ＧlyＣＡＭ１、および（Ｄ）抗ＣＤ３４を用いて、新鮮な凍結組織の連続切片を材料および方法で詳述するように染色した。ＨＥＶ様構造は、はっきりと染色される（矢印を参照）。Ｌ−セレクチン／ＩgＧの結合を必要とする新鮮な凍結組織切片を使用する場合、抗−ＣＤ３４抗体だけが弱く反応する。〈第１１図〉正常末梢リンパ節対求心路遮断された末梢リンパ節におけるＣＤ３４発現。（Ａ）正常だが、求心路遮断されていないリンパ節におけるＧlyＣＡＭ１の検出（下のパネルにおける矢印および細部）。（Ｂ）求心路遮断されたリンパ節におけるＣＤ３４の不変化発現（下のパネルにおける矢印および細部）。発明の詳細な説明〈Ｉ〉定義「ＣＤ３４ポリペプチド」という用語は、自然界に発生するか、または化学合成もしくは組換えＤＮＡ技術により製造される、天然のＣＤ３４分子およびそれらの誘導体（ただし、それらはＬ−セレクチンを結合する定性的な能力を保有する）を示すために使用する。普通、本明細書中で定義するようなＣＤ３４ポリペプチドは、Ｎ末端に位置するムチン様ドメイン、続けてシステインに富むドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するであろうし、それにもかかわらず、もっと少数のドメインを含み得る、または幾つかの繰り返されたドメインを有し得る（ただし、Ｌ−セレクチンを結合する能力を保有する）。「天然のＣＤ３４」および「野生型のＣＤ３４」という用語は区別なく使用されて、ヒトを含め、全ての動物種において自然界に存在する（「天然のＣＤ３４配列」）ＣＤ３４分子を示し、自然原料から精製されるか、化学的に合成されるか、または組換えにより製造される。各々の個体のアミノ酸配列における１つまたはそれ以上のアミノ酸の相違により示される、天然の対立遺伝子変異が存在し、個体間で発生し得ることが理解されるであろう。これらの対立遺伝子変異は、特に天然のＣＤ３４の範囲内である。「単離し、精製されたＣＤ３４ポリペプチド」という用語は、以上定義したようなＣＤ３４ポリペプチドを示すために使用し、これは実質的には他のタンパク質を有さず、ＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲル上に単一のレーン（singlela ne）を与えて、単離された形である。「単離し、精製された天然のＣＤ３４」は、普通、その天然の環境において関係する他のポリペプチドを実質的には伴わない。抗体（Ａbs）および免疫グロブリン（Ｉgs）は、同じ構造上の特性を有する糖タンパク質である。抗体が特異的抗原への結合特異性を示す一方、免疫グロブリンには、抗体および抗原特異性に欠ける他の抗体様分子の両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低レベルで、またミエローマにより高レベルで製造される。天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０,０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つ同一の軽（Ｌ）鎖および２つ同一の重（Ｈ）鎖からなる。各々の軽鎖が１つの共有ジスルフィド結合により重鎖へと結合する一方、ジスルフィド結合の数は、様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各々の重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋をも有する。各々の重鎖は、一端に可変部ドメイン（Ｖ_H）を、続けて多くの定常部ドメインを有する。各々の軽鎖は、一端に可変部ドメイン（Ｖ_L）を、またそのもう一端に定常部ドメインを有する；軽鎖の定常部ドメインは重鎖の第１定常部ドメインと並んでおり、軽鎖の可変部ドメインは重鎖の可変部ドメインと並んでいる。個々のアミノ酸残基は、軽鎖可変部ドメインと重鎖可変部ドメインとの間で界面を形成すると考えられている［クロチア（Clothia）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）１８６、６５１− ６６３（１９８５）；ノボトニー（Novotny）およびハーバー（Haber）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Proc.N atl.Acad.Sci. ）米国８２、４５９２−４５９６（１９８５）］。可変性は、抗体の可変部領域を通じて均等に分布していない。軽鎖および重鎖可変部領域の両方において相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変部領域と呼ばれる３つの部分に集中する。可変部ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。天然の重鎖および軽鎖の可変部ドメインは各々、３つのＣＤＲによりつながり、主としてβ−シート型立体配置をとる４つのＦＲ領域を含んでなり、ＣＤＲはβ−シート型構造を結合し、ある場合にはβ −シート型構造の一部を形成するループ結合を形成する。各々の鎖におけるＣＤＲはＦＲ領域により近密にまとまっており、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する［カバット（Kabat）,Ｅ.Ａ.ら、シークエンシーズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Pro teins of Immunological Interest ）、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス（National Institute of Health）、ベセズダ、メリーランド州（１９８７）を参照］。定常部ドメインは、抗体が抗原へ結合するのに直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。抗体のパパイン消化は、Ｆabフラグメントと呼ばれ、各々１つの抗原結合部位を有する２つ同一の抗原結合性フラグメント、および名称がその容易に結晶化する能力を示す、残りの「Ｆc」フラグメントを産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有して、まだ抗原を架橋（cross-linking）することができるＦ（ab’）₂フラグメントを産する。「Ｆv」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、しっかりと非共有結合した１つの重鎖および１つの軽鎖の可変部ドメインの二量体からなる。各々の可変部ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、Ｖ_H−Ｖ_L二量体の表面上に抗原結合部位を限定するのは、この立体配置においてである。一まとめになって、６つのＣＤＲが抗体へ抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変部ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含んでなるＦvの半分）でさえも、完全な結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。Ｆabフラグメントはまた、軽鎖の定常部ドメインおよび重鎖の第１定常部ドメイン（Ｃ_H１）も含む。抗体ピンジ領域起源の１つまたはそれ以上のシステインを含め、重鎖Ｃ_H１ドメインのカルボキシ末端の位置にある少数の残基の追加により、Ｆab’フラグメントはＦabフラグメントとは異なる。Ｆab’−ＳＨは、定常部ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦab’に対する本明細書中での表記である。Ｆ（ab’）₂抗体フラグメントは、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦab’フラグメント対として産生された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた既知である。全ての脊椎動物種起源の抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常部ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダ（λ）と呼ばれる明らかに異なった２つの種類のうちの１つに属し得る。それらの重鎖の定常部領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは様々なクラスに属し得る。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩgＡ、ＩgＤ、Ｉ gＥ、ＩgＧおよびＩgＭがあって、これらの幾つかはさらにサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩgＧ−１、ＩgＧ−２、ＩgＧ−３およびＩgＧ−４）へ分類することができる。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常部領域は各々、α、デルタ、イプシロン、γおよびμと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。「抗体」という用語は、本明細書中、最も広義に使用され、具体的には、天然のＣＤ３４分子と免疫学的に反応する１つのモノクローナル抗体、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント、さらにはそのような特性を有するポリエピトープ（polyepitopic）特異性のある抗体組成物を包含する。本明細書中で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的には均一な抗体の集団から得られる（以上定義したような）抗体を示す。、すなわち、少量存在し得る、可能な自然に発生する変異を除いては、集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、１つの抗原部位に対して働く。さらに、様々な決定基（エピトープ）に対して働く様々な抗体が一般的に含まれる従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定基に対して働く。それらの特異性に加えて、該モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンにより汚染されないという点が有利である。「ヒト化」型の非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小配列を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または（Ｆv、Ｆab 、Ｆab’、Ｆ（ab’）₂もしくは抗体の他の抗原結合サブ配列（subsequences）といったような）それらのフラグメントである。大低、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）起源の残基が、望ましい特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギといったような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ起源の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦvフレームワーク残基が対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見いだされない残基を含んでなり得る。抗体性能をさらに改善して最適なものとするために、これらの修飾がなされる。本明細書中のモノクローナル抗体には、定常部ドメインを有する抗体（例えば、「ヒト化」抗体）の（超可変部を含め）可変部ドメインをスプライシングすることにより産生される融合（キメラ）および組換え抗体が含まれ、このうちの１つだけが、起源種または免疫グロブリンクラスまたはサブクラス表記、さらには抗体フラグメント（例えば、Ｆab、Ｆ（ab’）²およびＦv）に関係なく、指示されたポリペプチド、または重鎖を有する軽鎖、または他の種起源の鎖を有するある種起源の鎖、または異種タンパク質との融合に対して働く［例えば、キャビリー（Cabilly）ら、米国特許第４,８１６,５６７号；マージ（Mage）およびラモイ（Lamoyi）、モノクローナル・アンチボディ・プロダクション・テクニクス・アンド・アプリケーションズ（Monoclonal Antibody Production Techniques an d Applications ）、７９−９７頁（マーセル・デッカー社（Marcel Dekker,Inc. ）、ニューヨーク、１９８７）を参照］。「キメラ」および「ヒト化」抗体に関しては、例えば、米国特許第４,８１６, ５６７号；ＷＯ９１／０９９６８；ＥＰ４５２，５０８；およびＷＯ９１／１６９２７を参照。修飾因子「モノクローナル」は、実質的には均質な抗体の集団から得られるような抗体の特性を示し、またある特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈すべきではない。本明細書中の抗体は、ＩgＧ−１、ＩgＧ−２、ＩgＧ−３もしくはＩgＧ−４サブタイプ、ＩgＡ、ＩgＥ、ＩgＤまたはＩgＭといったような、全ての免疫グロブリンクラスまたはアイソタイプのものであり得る。免疫グロブリンエフェクター機能が望ましいならば、本明細書中の抗体は、免疫グロブリンの重鎖の定常部領域の少なくとも機能上活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを一般的に保有する。本明細書中で使用する「双特異性抗体」という成句は、少なくとも２つの結合特異性を有する（以上定義したような）抗体を示す。双特異性抗体は、通例、本質的には、ＷＯ８９／０２９２２［１９８９年４月６日公開］、ＥＰ３１４, ３１７［１９８９年５月３日公開］、および１９９２年５月２日に発行された米国特許第５,１１６,９６４号で開示されているような、ヘテロ−多量体として、また特にヘテロ−二量体、−三量体または四量体として組み立てることができる。一般に、本発明により使用する抗−ＣＤ３４抗体には、天然−配列抗体の誘導体が含まれる。天然のＣＤ３４分子または天然のＣＤ３４分子を結合することができる抗体（抗−ＣＤ３４抗体）のアミノ酸配列並びにグリコシル化変異体、および共有結合修飾を定義するために、「誘導体」という用語を使用する。「アミノ酸」という用語は、天然に存在する全てのＬ−α−アミノ酸を示す。アミノ酸は、１文字または３文字表記のいずれかにより示される：Ａsp Ｄアスパラギン酸Ｉle ＩイソロイシンＴhr ＴトレオニンＬeu ＬロイシンＳer ＳセリンＴyr ＹチロシンＧlu Ｅグルタミン酸Ｐhe ＦフェニルアラニンＰro ＰプロリンＨis ＨヒスチジンＧly ＧグリシンＬys ＫリジンＡla ＡアラニンＡrg ＲアルギニンＣys ＣシステインＴrp ＷトリプトファンＶal ＶバリンＧln ＱグルタミンＭet ＭメチオニンＡsn Ｎアスパラギン。これらのアミノ酸は、それらの側鎖の化学成分および特性により分類することができる。それらは、荷電および非荷電という２つのグループに広く分類される。アミノ酸をより正確に分類するために、これらのグループは各々サブグループに分けられる。〈Ｉ〉荷電アミノ酸酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジン〈II〉非荷電アミノ酸親水性残基：セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン「アミノ酸配列変異体」という用語は、天然のＣＤ３４または抗−ＣＤ３４抗体アミノ酸配列と比較して、置換、挿入および／または欠失を含んでなる分子を含め、天然の配列のＣＤ３４分子または抗体と比較して、それらのアミノ酸配列において幾つかの相違を有する分子を示す。その用語には、具体的には、フラグメント、すなわち、天然の配列分子のポリペプチドサブセット、およびそのようなフラグメントの置換、挿入および／または欠失変異体が含まれる。普通、アミノ酸配列変異体は、対応する天然のＣＤ３４または抗体のアミノ酸配列と、少なくとも約４０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約６０％の相同性、まださらに好ましくは７０％の相同性、一層さらに好ましくは少なくとも約８０％の相同性、また最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するであろう。相同性の度合は、これに限定されるものではないが、Ｌ−セレクチンレクチンドメインに対する適当な硫酸化およびシアリル化炭水化物構造の多価提示のための足場として作用すると考えられている、高度にＯ−グリコシル化されたＣＤ３４のムチン様ドメインを含め、Ｌ−セレクチン結合に直接関与する領域において最も高いのが好ましい。「相同性」は、配列を並べて、必要ならば、最高パーセントの相同性を得るためにギャップを導入した後、天然の分子のアミノ酸配列における残基と同一である候補（candidate）アミノ酸配列における残基のパーセンテージとして定義される。配列に関する方法およびコンピュータープログラムは当業界において周知である。置換変異体は、天然の配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されて、それに代わって同じ位置に別のアミノ酸が挿入されたものである。置換は１つ（分子中のアミノ酸１つだけが置換される）であってよく、またはそれらは複数（同じ分子中で２つもしくはそれ以上のアミノ酸が置換される）であってよい。天然のＣＤ３４リガンドの特性における実質的な変化は、電荷および／または構造が天然のアミノ酸のものとは実質的に異なる側鎖を有するアミノ酸と置換することにより得られる。この種類の置換は、ポリペプチド骨格の構造および／または置換領域における分子の電荷もしくは疎水性に影響を与えるであろうと思われる。リガンド特性における適度な変化は、電荷および／または構造が天然の分子のものと似ている側鎖を有するアミノ酸と置換することにより期待できるであろう。保存的置換と呼ばれるこの種類の置換は、ポリペプチド骨格の構造または分子の電荷もしくは疎水性のいずれかを実質的に変えるであろうとは思われない。挿入変異体は、天然のＣＤ３４配列において特定の位置にあるアミノ酸に直接隣接して１つまたはそれ以上のアミノ酸が挿入されたものである。アミノ酸に直接隣接してとは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかにつながることを意味する。普通、挿入は、１つまたは２つの保存的アミノ酸からなるであろう。電荷および／または構造が挿入部位に隣接するアミノ酸と似ているアミノ酸は、保存的であると定義される。あるいはまた、本発明には、挿入部位に隣接するアミノ酸とは実質的に異なる電荷および／または構造を有するアミノ酸の挿入が含まれる。そのような変異体は、例えば、Ｌ−セレクチンに対する結合親和性を増強する目的で製造することができる。欠失変異体は、天然のＣＤ３４アミノ酸配列において１つまたはそれ以上のアミノ酸が除去されたものである。本発明の目的として定義される欠失変異体には、１つまたはそれ以上のドメインが完全に欠失した天然のＣＤ３４分子の誘導体が含まれる。特に重要なものは、ＣＤ３４の可溶性アミノ酸配列変異体である。そのような可溶性ＣＤ３４分子は、それらの膜貫通ドメインの欠失または不活性化により、細胞膜へ結合しない。天然のＣＤ３４のものとは異なるグリコシル化プロフィールを有するＣＤ３４ポリペプチドまたは抗−ＣＤ３４抗体を示すために、「グリコシル化変異体」という用語を使用する。ポリペプチドのグリコシル化は、一般的にＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を示す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン［式中、Ｘはプロリンを除く全てのアミノ酸である］は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合に対する認識配列である。Ｏ−結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つのヒドロキシアミノ酸への、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合を示すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５− ヒドロキシセリンもまた、Ｏ−結合グリコシル化に関与し得る。本発明のＣＤ３４ポリペプチドはＯ−結合グリコシル化の優勢を特徴とするが、ヒト前駆細胞（すなわち、幹細胞）上のＣＤ３４は、Ｎ−結合およびＯ−結合炭水化物鎖を両方有することが示されている［スザーランド,Ｄ.Ｒ.ら、ロイケミア２、７９３− ８０３（１９８８）］。リンパ節ＣＤ３４は、硫酸化、フコシル化、シアリル化されており、また炭水化物に向けられたＭＥＣＡ−７９モノクローナル抗体と交差反応性であることが分かった。Ｌ−セレクチンのレクチンドメインとＣＤ３４との相互作用は炭水化物により媒介されるので、グリコシル化パターンにおける変更は全て、その受容体結合活性が対応する天然のＣＤ３４リガンドのものとは有意に異なる分子が生ずる結果になるであろうと思われる。その天然の対応物と比較したリガンド中に存在する炭水化物部分の位置および／または性質における全ての相違は、本明細書中の範囲内である（ただし、結果として得られる糖タンパク質は、Ｌ−セレクチンを結合する定性的な能力を保有するものとする）。別のグリコシル化パターンを含む様々なＣＤ３４ポリペプチドは、Ｌ−セレクチンにより媒介される身体の様々な位置での内皮細胞への接着を選択的に阻害することができる。天然のリガンドのグリコシル化パターンは、ＨＰＡＥクロマトグラフィー［ハーディ（Hardy）,Ｍ.Ｒ.ら、アナライティカル・バイオケミストリー（Anal.Bio chem. ）１７０、５４−６２（１９８８）］、グリコシル結合組成を決定するためのメチル化分析［リンドバーグ（Lindberg）,Ｂ.、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth.Enzymol. ）２８、１７８−１９５（１９７２）；ワーゲ（Waegh e）,Ｔ.Ｊ.ら、カルボハイドレート・リサーチ（Carbohydr.Res.）１２３、２８１−３０４（１９８３）］、ＮＭＲ分光法、質量分析法等を含め、既知の分析化学技術により決定することができる。共有結合誘導体は、普通、天然のＣＤ３４分子または抗体の部分ではない化学部分をさらに含むことを特徴とする。「共有結合誘導体」には、有機のタンパク質または非タンパク質誘導化剤を用いての天然のＣＤ３４分子または抗−ＣＤ３４抗体の修飾、および翻訳後修飾が含まれる。共有結合修飾は、慣例により、標的とされるリガンドのアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させることにより、または選択された組換え宿主細胞において作用する翻訳後修飾機構を利用することにより導入される。そのような修飾は、当業界における通常技術の範囲内であって、過度の実験なく行われる。ある翻訳後修飾は、発現したポリペプチドについての組換え宿主細胞の作用結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へ翻訳後に脱アミド化されることが多い。あるいはまた、これらの残基は、穏やかな酸性条件下に脱アミド化される。これらの残基の型はいずれも、本発明により使用されるＣＤ３４リガンドで存在し得る。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる［Ｔ.Ｅ.クレイグトン（Creighton）、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ（Protei ns：Structure and Molecular Properties ）、Ｗ.Ｈ.フリーマン・アンド・カンパニー（Freeman & Co.）、サンフランシスコ、７９−８６頁（１９８３）］。共有結合誘導体には、具体的に、天然のＣＤ３４もしくは抗−ＣＤ３４抗体、またはそれらのアミノ酸配列もしくはグリコシル化変異体が非タンパク質ポリマーに共有結合した融合分子が含まれる。非タンパク質ポリマーは、普通、親水性合成ポリマー、すなわち、自然界では他に見いだされないポリマーである。しかし、自然界から単離されるポリマーであるような、自然界に存在するポリマー、また組換えまたはインビトロにおける方法により製造されるポリマーが有用である。親水性ポリビニルポリマー（例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドン）が本発明の範囲内に入る。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールといったようなポリビニルアルキレンエーテルが特に有用である。ＣＤ３４または抗−ＣＤ３４抗体は、米国特許第４,６４０,８３５号；第４, ４９６,６８９号；第４,３０１,１４４号；第４,６７０,４１７号；第４,７９１ ,１９２号または第４,１７９,３３７号に詳述されている方法で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンといったような様々な非タンパク質ポリマーへ結合させることができる。別の態様において、ＣＤ３４の共有結合誘導体には、安定な血漿タンパク質への融合が含まれる。「安定な血漿タンパク質」とは、一般的に約３０〜約２０００の残基を有するタンパク質であり、これらは、それらの天然の環境において循環中に長い半減期、すなわち、約２０時間以上の半減期を示す。適当で安定な血漿タンパク質の例は、免疫グロブリン、アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質およびトランスフェリンである。ＣＤ３４ポリペプチドアミノ酸配列は、通例、安定な血漿タンパク質配列（例えば、ヒト血清アルブミン配列または免疫グロブリン定常部ドメイン配列）へＣ末端により融合する。さらに好ましい共有結合誘導体のグループであるＣＤ３４ポリペプチドまたは抗−ＣＤ３４抗体は、毒素部分へ融合する。そのような融合分子（キメラまたはコンジュゲート（conjugate）とも呼ばれる）の細胞への結合が毒素部分を細胞と近密にさせることにより、細胞死を助長する。全ての適当な毒素部分を使用することができる。しかし、例えば、リシン毒素、ジフテリア毒素、膜チャンネル形成毒素、ラジオアイソトープ毒素等といったような毒素を使用するのが好ましい。その内皮リガンドへの天然のＬ−セレクチン受容体の結合をブロックするのに有効な量を示すために、「有効量」という用語を使用する。指示された生理学的状態または症状（例えば、炎症）を予防または抑制するのに十分な量を示すために、「治療的有効量」という用語を使用する。〈II〉一般的方法以下の具体的な実施例から明らかであるように、マウスリンパ節からの天然の９０kＤのＬ−セレクチンリガンド（Ｓgp９０）（それは後に本質的には、ＣＤ３４のアミノ酸配列を有することと同定された）の精製は、困難であった。Ｓgp ９０は、Ｓgp５０よりずっと少ない量で存在して、内皮細胞表面にしっかりと結合する一方、Ｓgp５０は内皮細胞とゆるく結合する。従って、ならし培地からクロロホルム／メタノール抽出により精製することができたマウスＳgp５０リガンド（その精製された形ではマウスＧlyＣＡＭ−１と呼ばれる）とは対照的に、Ｓ gp９０の精製スキームでは、抽出のために界面活性剤を使用すること、また煮沸工程後に小麦胚凝集素上およびＬ−セレクチン−ＩgＧ親和性カラム上での親和性クロマトグラフィーが含まれることを具体的に計画しなくてはならなかった。³⁵ Ｓ−硫酸塩−標識化ＰＬＮ抽出物の添加により精製をモニターすることが可能となった。Ｌ−セレクチン−ＩgＧ親和性カラムからの最終ＥＤＴＡ解離画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、プロブロット（ProBlott ）膜へ移して、Ｓgp９０をオートラジオグラフィーにより局在化した。この精製スキームにより、アミノ酸配列分析に、またこの糖タンパク質をコードするcＤＮＡをクローニングするのに十分な量の９０kＤのＬ−セレクチンリガンドの単離が可能となった。マウスリンパ節から天然のＣＤ３４ポリペプチドを単離するための具体的な方法を以下の実施例で開示する。（ヒトを含め）他の動物種起源のＣＤ３４を同様なる方法で単離することができる。しかし、本発明の主要な業績は、９０kＤのＬ−セレクチンリガンドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を決定した結果、この糖タンパク質をその天然源から面倒な精製手順により得る必要がもうないということである。今や、哺乳類細胞および微生物を含め、適当な宿主細胞においてコードする核酸配列を発現させることにより、天然の配列のＬ−セレクチンリガンドおよびＬ−セレクチンリガンド誘導体を得ることが可能である。ＣＤ３４ポリペプチドをコードするＤＮＡを得るのに適用可能な、またアミノ酸配列およびグリコシル化変異体並びに共有結合誘導体を含め、天然のＣＤ３４および誘導体の構築に適用可能な一般的方法は当業界において既知であり、また例えば、１９９２年１１月１２日に公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９２／１９７３５号で開示されている。天然のＣＤ３４分子を結合することができる抗体は、当業界において既知のいずれの方法によっても産生することができる。以下は、そのような抗体を製造するのに利用することができる、ある一般的に用いられる技術の要約である。さらに、これらの詳細および類似技術は、例えば、キャビリーら、米国特許第４,８１６,５６７号；マージおよびラモイ、上記；サムブルック（Sambrook）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clonin g：A Laboratory Manual ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク、１９８９；およびカレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology ）、オースベル（Ausubel）ら版、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ワイレイ−インターサイエンス（Green Publishing Associates and Wiley-Interscience）、１９９１といったような一般テキストに見いだされる。例えば、本発明により使用するためのモノクローナル抗体は、ケーラーおよびミルシュタイン（Kohler & Milstein）、ネイチャー２５６：４９５（１９７５）により初めて記載されたハイブリドーマ法により製造することができ、または組換えＤＮＡ法［キャビリーら、上記］により製造することができる。ハイブリドーマ法において、マウスまたはハムスターのような他の適当な宿主動物をヒトＣＤ３４ポリペプチドで免疫処置する。ＣＤ３４は様々なリンパおよびリンパ外（extra-lymphoid）内皮細胞の表面上に自然に発現するので、皮下、腹腔内、または筋肉内経路による、そのような細胞の適当な動物への導入は、免疫処置に使用されるＣＤ３４タンパク質へ特異的に結合するであろう抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘引するであろう。あるいはまた、リンパ球をインビトロにおいて免疫処置することができる。次いで、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて、リンパ球をミエローマ細胞と融合させる［ゴッディング（Goding）,Ｊ.、モノクローナル・アンチボディーズ：プリンサプルズ・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies：Principles and Practice ）、５９−１０３頁（アカデミック・プレス（Academic Press）、１９８６）］。好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻止する１つまたはそれ以上の基質を含む適当な培養基に、このようにして製造したハイブリドーマ細胞を播種して増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）という酵素に欠けているなら、ハイブリドーマに対する培養基には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）が一般的に含まれ、これらの基質はＨＧＰＲＴに欠ける細胞の増殖を防ぐ。好ましいミエローマ細胞は、有効に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定で高い発現レベルを支持して、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性の強いものである。これらのうち、好ましいミエローマ細胞系は、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター［（Salk Institute Cell Distribution Center）、サンディエゴ、カリフォルニア、米国］から入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、およびジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション［（the American Type Culture Collecti on）、ロックビル（Rockville）、メリーランド、米国］から入手できるＳＰ− ２細胞から誘導されるようなマウスミエローマ系である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている［コズボール（Kozbor）、ジャーナル・オブ・イムノロジー１３３、３００１（１９８４）；ブロデュアー（Brodeur）ら、モノクローナル・アンチボディ・プロダクション・テクニクス・アンド・アプリケーションズ、５１−６３頁（マーセル・デッカー社、ニューヨーク、１９８７）］。ハイブリドーマ細胞が増殖する培養基を、ＣＤ３４に対して働くモノクローナル抗体の産生に関してアッセイする。好ましくは、免疫沈殿により、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）といったような、インビトロにおける結合アッセイにより、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を測定する。本発明の方法および組成物において使用するモノクローナル抗体は、試験サンプル中に存在するＣＤ３４を優先的に免疫沈殿するもの、または結合アッセイにおいてＣＤ３４受容体へ優先的に結合するものであって、インビトロもしくはインビボにおける細胞接着アッセイにおいて、Ｌ−セレクチンを持っているリンパ球がＣＤ３４を持っている内皮細胞へ接着するのをブロックすることができる。望ましい特異性、親和性および活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローン化して、標準法により増殖させることができる［ゴッディング,Ｊ.、上記］。この目的に適当な培養基には、例えば、ダルベッコの修飾されたイーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍としてインビボにおいて増殖することができる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ −セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析または親和性クロマトグラフィーといったような従来の免疫グロブリン精製法によって、培養基、腹水液または血清から適当に分離される。モノクローナル抗体の精製方法は、当業界において周知であって、例えば、「カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecul ar Biology）」、上記のユニット（Unit）１１.１１、およびそこで引用される参考資料で開示されている。ハイブリドーマの上澄み中に存在する特異的抗体の量は、固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または直接的な酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のいずれかにより定量することができる。固相ラジオイムノアッセイにおいて、連続的に希釈した抗血清をあらかじめＣＤ３４で覆っておいた微量定量ウェルに入れてインキュベートする。¹²⁵Ｉ−標識化抗−免疫グロブリン抗体を使用することにより、結合した抗体を検出する。次いで、既知濃度の特異的抗体で作成した標準曲線から、抗血清中の特異的抗体の量を決定する。未知の抗血清および標準抗体を平行してアッセイする。アイソタイプ決定に使用するＲＩＡ法、およびＥＬＩＳＡ法に関するプロトコルは、例えば、「カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、上記の第Ｖ節、およびそこで引用される参考資料から利用できる。本発明の方法において有用なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子へ特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離されて、配列決定される。上記ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として働く。一度単離したら、ＤＮＡを発現ベクター中に入れた後、免疫グロブリンタンパク質を他に産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞といったような宿主細胞中にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。〈III〉アッセイある特定の精製されたＣＤ３４ポリペプチドまたは抗−ＣＤ３４抗体が内皮細胞への白血球接着を阻害する能力は、インビトロにおける標準接着アッセイで試験することができる。特に適当なアッセイは、トルゥー（True）ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１１１、２７５７−２７６４（１９９０）により開示されているインビトロにおける基本的スタンパー−ウッドルフ（Stamper-Wood ruff）接着アッセイの修飾変法である［スタンパーおよびウッドルフ、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン１４４、８２８−８３３（１９７６）］。広い様々な研究において例外なく、このアッセイでは、インビボにおいてリンパ球がＨＥＶと相互作用する能力の確かな指標を提供している［さらなる詳細に関しては、ローゼン（Rosen）,Ｄ.Ｓ.、カレント・オピニオン・イン・セル・バイオロジー（Current Opinion in Cell Biol.）１、９１３−９１９（１９８９）を参照］。あるいはまた、またはこれに加えて、ＣＤ３４ポリペプチドまたは抗−ＣＤ３４抗体がＬ−セレクチンにより媒介される細胞間接着を阻害する能力は、１９９２年１１月１２日に公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９２／１９７６１号で開示されたアッセイにより試験することができる。抗体をスクリーニングするのに特に適当であるこの方法により、試験化合物をＬ−セレクチンおよび単離されたＬ−セレクチン結合剤（天然のＣＤ３４分子の細胞外領域を含んでなる化合物であり得る）と接触させ、Ｌ−セレクチンと単離されたＬ−セレクチン結合剤との間の結合を阻害するその能力を検出する。Ｌ−セレクチンは、免疫グロブリン配列、好ましくは免疫グロブリン定常部ドメインを含んでなる融合タンパク質（キメラ）（例えば、免疫接着剤とも呼ばれるＬ−セレクチン−免疫グロブリンキメラ）として存在することができ、および／または固体表面上に固定することができる。Ｌ−セレクチンとＬ−セレクチン結合剤との間の結合は、例えば、フローサイトメトリーにより検出することができる。インビボにおける適当なアッセイは、例えば、ガラティン,Ｗ.Ｍ.、ネイチャー３０４、３０−３４（１９８３）により記載されているような、リンパ球のリンパ節へのインビボにおけるホーミングをブロックすることに基づくものであり得る。さらに、ＣＤ３４ポリペプチドまたは抗−ＣＤ３４抗体が炎症のようなＬ−セレクチンにより媒介される病理学的状態を抑制する能力は、既知の動物疾患モデルにおいて試験することができる。例えば、ＣＤ３４ポリペプチドまたは抗−ＣＤ３４抗体が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を抑える能力は、既知のＩＢＤ動物疾患モデルにおいて試験することができる。ＩＢＤ動物モデルの第１グループには、幾つかのＩＢＤ型を思わせるような疾患を自発的に発生させる動物が含まれる。自発的動物モデルには、Ｃ３Ｈ／ＨeＪマウス、ジャパニーズ・ウォルツィング・マイス（Japanese waltzing mice）、Ｃ.ディフィシル（C.difficile）により引き起こされるブタの赤痢並びにウマの大腸炎、およびコットン・トップ・タマリン（cotton top tamarin）が含まれる。これらの動物が患う疾患は、最近、５つの種類に細分類され、これらのうち２つはＵＣに似ている。これらのモデルのうち、これら動物の大部分が幾つかの腸障害型を有する場合にはタマリンが好ましく、またＵＣを有する患者を行う場合には、それらの多くはまた腸癌をも発生させる。別の研究法において、急性または慢性炎症を起こすために、エタノール、酢酸、ホルマリン、免疫複合体、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）、細菌産生物またはカラゲナンといったような様々な剌激物を使用する。この種類のモデルは、ウォリス（Wallace）,Ｊ.および同僚ら［モリス（Morris）ら、ガストロエンテロロジー（Gastroenterology）９６、７９５（１９８９）］により開発されている。第３の研究法によれば、トランスジェニック動物をＩＢＤモデルに使用する。強直性脊椎炎を示す大抵のヒト患者はまた、ＨＬＡ−Ｂ２７に対する遺伝子をも持っている。そのような患者は、ＩＢＤを発生させる危険がより大きいことが観察されている。脊椎関節障害をモデルすることを試みたＨＬＡ−Ｂ２７トランスジェニックラットはまた、関節疾患に加え、同一ではないが、ＣＤと多くの類似点がある慢性腸炎症の症状をも示した。従って、ＨＬ−Ｂ２７トランスジェニックラットは、ＩＢＤモデルに使用することができる。通常、本発明の目的に適当なＣＤ３４ポリペプチドおよび抗−ＣＤ３４抗体に関するスクリーニングには、インビトロおよびインビボにおける様々なアッセイの組み合わせが含まれる。〈IV〉治療への利用本発明の方法は、自己免疫および炎症性反応を含め、Ｌ−セレクチンにより媒介される細胞接着に関連する病理学的状態の（予防を含め）治療に関する。免疫系の注目すべき特徴は、そのＢおよびＴ細胞がほとんど全ての異質分子を認識する能力である。免疫反応は、広く分布して身体の抗原侵入口を守る多くの末梢リンパ器官で開始される。ほとんどの間質性間隙から排液する（drain）器官はリンパ節であり、牌臓は血液をモニターし、またパイエル板のような消化管関連リンパ集合体は消化管から漏れる抗原に対して保護する。あるリンパ器官からリンパ球を有する次の器官へのリンパ球の連続的流れは、あるいはまた血液およびリンパ管を通じての移動は正常な免疫反応に不可欠であるが、リンパ球もまた、乾癖、慢性関節リウマチおよび他の自己免疫疾患において発生する病理学的組織障害のような病理学的反応の伝達物質となり得る。好中球および単球により媒介される炎症には、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）のような白血球により媒介される急性肺傷害、多器官不全症、心筋および肝臓のような他の組織の再灌流傷害、急性糸球体腎炎、再発性関節炎、様々な皮膚病、急性化膿性髄膜炎のような中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性障害、熱性傷害、潰瘍性大腸炎並びにクローン病が含まれる炎症性腸疾患、血液透析、白血球除去血輸血、およびサイトカインにより誘発される毒性を含め、多くのヒト臨床表示に関与することが知られている。本発明により治療可能な他の障害には、外傷性ショック、敗血症性ショック、凍傷傷害またはショック、および喘息が含まれる。さらに、腫瘍転移は、特に血液源性癌の場合、循環している癌細胞の接着を阻害することにより抑制または予防することができる。例には、結腸癌腫および黒色腫が含まれる。治療する患者の天然のＣＤ３４を結合することができるＣＤ３４ポリペプチドおよび抗体は、（リンパ球、好中球および単球を含め）白血球と内皮との間の接着相互作用をブロックすることができることから、白血球ホーミングに関連する病理学的反応を阻害することができる。例えば、炎症領域に隣接する内皮への好中球の接着を阻害するために、そのような薬剤を使用することができる。ＣＤ３４ポリペプチドは、好中球の表面上に発現するＬ−セレクチンへの競合的結合により、血液から炎症部位への好中球の溢出をブロックする。抗−ＣＤ３４抗体は、内皮細胞上の天然のＣＤ３４に対する特異的結合により、炎症部位への好中球伝達（traffic）を阻害する。本発明のＣＤ３４ポリペプチドおよび抗−ＣＤ３４抗体は、抗炎症剤、抗酸化剤、またさらなる内皮細胞への白血球接着阻害剤といったような他の医薬的に活性な薬剤と共に都合よく投与することができる。そのようなさらなる阻害剤は、インテグリン、インテグリンリガンド、他のセレクチン（例えば、Ｅ−セレクチン）、他のセレクチンリガンド（例えば、ＧlyＣＡＭ−１）、および炭水化物Ｌ −セレクチンリガンドを含め、他の白血球細胞接着分子並びにそれらのリガンド、およびこれらの接着分子またはそれらタンパク質リガンドに対する抗体の可溶性型であり得る。例えば、インテグリンＣＤ１１a／１８（ＬＦＡ−１）およびＣＤ１１b／１８（Ｍac−１）は、高内皮細静脈（ＨＥＶ）との好中球相互作用に、また急性炎症の非リンパ部位への好中球局在化に不可欠であることが知られている。従って、本明細書中のＣＤ３４ポリペプチドおよび抗−ＣＤ３４抗体は、ＣＤ１１／１８とそれらの内皮リガンド（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ −３）との相互作用を拮抗することができる化合物と共に投与することができる。そのような拮抗物質は、例えば、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ１１／１８ヘテロ二量体、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３、それらのフラグメント、およびＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ１１／１８ヘテロニ量体または対応するＩＣＡＭ内皮リガンドを選択的に結合することができる抗体の可溶性誘導体であり得る。多様な（通常、２つの）特異性を有する分子を得るために、様々な白血球接着阻害剤を共有結合させることができる。そのような部分を含んでなる双特異性分子を含め、本発明の精製されたＣＤ３４ポリペプチドおよび抗−ＣＤ３４抗体は、医薬組成物として投与することができ、通常、当業界で既知の方法により用量形態に製剤化することができる［例えば、レミングトン（Remington）のファーマシューティカル・サイエンシーズ（P harmaceutical Sciences）、マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publi shing Company）、イーストン、ペンシルベニア、第１９版、１９８５を参照］。非経口投与には、一般的に、拮抗物質を医薬的に許容し得る適当なビヒクル、また所望により医薬的に許容し得る他の添加剤と混合して、注射可能な溶液剤、懸濁液剤または乳剤の形態に製剤化する。代表的なビヒクルには、生理的食塩水、デキストロース溶液、リンゲル溶液等が含まれるが、非水性ビヒクルもまた使用することができる。ある指針では、例えば、レミングトンのファーマシューティカル・サイエンシーズ、上記で開示されている通り、例えば、本発明の活性化合物を適当な高分子物質の粒子中に導入することにより、またはそれらをマイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルション等に封入することにより製剤化することのできる、放出制御型製剤が好ましいかもしれない［ドラッグ・デリバリーに関する本発明の方法の簡単なレビューには、例えば、ランガー（Langer）、サイエンス２４９、１５２７−１５３３（１９９０）を参照］。本発明のＣＤ３４ポリペプチドまたは抗−ＣＤ３４抗体は、指示された生理的状態または症状（例えば、炎症）を予防または抑制するのに十分な量でレシピエントに投与する。従って、炎症の発病前または開始後に投与を行うことができる。投与は、静脈内、筋肉内、皮下、経小腸および非経口投与を含め、従来の経路である。有効量は、勿論、患者の年齢、体重、普段の健康状態、病歴等といったような因子によって変えることができ、またその決定は十分に医者の技量の範囲内である。該有効量は、通例、約１pg／kg（体重）〜約１０mg／kg（体重）、さらに好ましくは０.００１〜１mg／kg（体重）の範囲内である。ある特定の態様において、従来の抗炎症薬物または他の薬剤を特異的な組織傷害部位へ標的化するために、本発明の抗−ＣＤ３４抗体を使用することができる。医薬的に活性な薬剤をリンパまたはリンパ外（例えば、血管内皮細胞）へ標的化するために抗−ＣＤ３４抗体を使用することにより、そのような薬剤は傷害部位でより高い局所濃度を得ることができる。このことにより、それらの全体用量を低下させることによって、従来の抗炎症剤の副作用の軽減が可能となる。標的化は、抗−ＣＤ３４抗体が医薬的に活性な部分へ共有結合することにより、または例えば、抗−ＣＤ３４抗体を液状膜に混和した薬物（例えば、抗炎症剤）を充填したリポソームを製造することにより達成できる。さらに、本発明の詳細を限定することない以下の実施例により説明する。〈Ｖ〉実施例実施例１：第二のＬ−セレクチンリガンドの同定材料および方法Ｓgp９０Ｌ−セレクチンリガンドの精製およびアミノ酸配列分析単離されたＳgp９０がＬ−セレクチンに対するリガンド活性を有することを実証するために、Ｌ−セレクチンに対する³⁵Ｓ−硫酸塩−標識化リガンドを先に記載した通り製造して［イマイら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１１３、１２１３−１２２１（１９９１）；イマイら、グリコバイオロジー２、３７３−３８１（１９９２）；およびイマイら、ネイチャー３６１、５５５−５５７（１９９３）］、トリス−緩衝化生理的食塩水中の０.５％トリトンＸ−１００中の５mＭＥＤＴＡを用いて、（ゲル１mlにつきキメラタンパク質１０mgの割合で置換した）Ｌ−セレクチン−ＩgＧ親和性カラムから溶離した。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元して（reducing）、Ｓgp５０およびＳgp９０の位置をオートラジオグラフィーにより決定した。Ｓgp９０バンドを切除し、再び水和させて、１９５mＭグリシン、２５mＭトリス、０.０１％ＳＤＳ、１０％グリセロール中に電気溶離させ（５mＡ、１２時間）、セントリコン（Centricon）３０上でＰＢＳ中の５０mＭオクチルグルコシドに交換した。その結果得られた溶液（３００μl）を３等分して、５mＭＥＤＴＡ、またはＣＤ４−ＩgＧ制御マトリックスの不存在下もしくは存在下、Ｌ−セレクチン−ＩgＧ（ＬＥＣ−ＩgＧ）２５μ lを用いて再沈殿させた。還元条件下、上澄みおよび結合物質の両方を１０％ＳＤＳ−ＲＡＧＥにより分析した後、オートラジオグラフィーにより分析した。アミノ酸配列決定のためのＳgp９０を精製するために、１,９６５匹のマウス起源の腸間膜リンパ節をプールし、ＰＢＳ中の２％トリトンＸ−１００を用いて抽出した。ホモジナイズした抽出物を遠心分離により透明とし、４０,０００cpmの³⁵硫酸塩−標識化ＰＬＮ抽出物を用いて、先に記載した通りスパイクした（spiked）［ラスキーら、セル６９、９２７−９３８（１９９２）］。この混合物を１２分間沸騰させて、沈殿したタンパク質を遠心分離により除去した。上澄みを小麦胚芽凝集素カラムへ結合させて、結合したタンパク質を０.２ＭＮ− アセチルグルコサミン、０.１％トリトン中に溶離させた。溶離した物質をＬ− セレクチン−ＩgＧ親和性カラム４０mgに通して、結合した画分をＥＤＴＡで解離させた。この親和性工程を繰り返して、最終ＥＤＴＡ解離画分をセントリコン上で濃縮し、ＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲルの単一のレーン上で泳動させた。タンパク質を電気泳動によりプロブロット膜へ移して、先に記載した通りオートラジオグラフィーにかけた［ラスキーら、上記］。オンラインＰＴＨ分析装置を備えたアプライド・バイオシステム・シークエンサー（Applied Biosyste ms sequencer）４７０Ａモデルを用いて、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した。ネルソン分析用７６０インターフェース（Nelson Analytical ７６０ interfaces）を用いるジャスティス・イノベーション・ソフトウェア（Justice Innovation s oftware）を用いて、ピークをインテグレートした。プロブロット膜のトリプシン消化後に内部ペプチド配列を得た［ウォング（Wong）ら、テクニクス・イン・プロテイン・ケミストリー（Techniques in Protein Chemistry）IV、Ｒ.Ｈ.アンゲレッティ（Angeletti）編、印刷中］。マトリックスの９０kＤの領域をメタノール１μlで湿らせた。０.５Ｍトリス−ＨＣl（pＨ８.５）、１０％アセトニトリル、５mＭＥＤＴＡおよび７mＭジチオトレイトール１００μlを用い、ブロット（blot）を４５℃で１時間還元した。その溶液を冷却して、０.５ＭＮaＯＨ中の２００mＭヨード酢酸１０μlを加えた。アルキル化反応を暗所で２０分間続けた。次いで、振盪機上、そのブロットを０.５Ｍ酢酸中の０.２５％ＰＶＰ− ４０２００μlと共に室温で２０分間インキュベートした。そのブロットを水で濯いだ後、２０％アセトニトリルで濯ぐことにより、残りのＰＶＰ−４０を除去した。１０％アセトニトリルを含む０.１Ｍトリス−ＨＣl（pＨ８.０）５０μl 中、プロメガ（Promega）により修飾されたトリプシン０.２μgを用いて、９０k Ｄの領域を３７℃で１７時間消化させた。上澄みを除去し、ペプチドを毛細管ＨＰＬＣにより分離して［ヘンツェル（Henzel）ら、アナライティカル・バイオケミストリー１８７、２２８−２３３（１９９０）］、そのペプチドをＣ１８０. ３２×１５０mmの毛細管カラム（ＬＣパッキング社（Packing,Inc.））で分別した。アプライド・バイオシステム１４０Ａマイクログラジエント・ポンプ・システム（Applied Biosystems １４０Ａ microgradient pump system）およびＺ− 形（Ｚ−shaped）フローセルを備えた７８３ＵＶ検出器を用いて、ＨＰＬＣを行った。そのポンプを５０μl／分の割合で操作し、また流量を６μl／分まで減らすために分割機（splitter）として使用するバルコティー（Valco tee）に接続した。溶媒Ａは０.１％水性ＴＦＡであり、またＢは０.８％ＴＦＡを含むアセトニトリルであった。０〜７０％Ｂの直線（linear）グラジエントを用い、ペプチドを５０分で溶離し、１９５nmで検出した。幾つかのペプチドを配列決定したが、はっきりと解読可能な（interpretable）配列が得られたペプチド９を除き、全て非常に弱いシグナルが得られた。抗−ＣＤ３４多クローン性抗血清を用いてのマウスＰＬＮの免疫組織化学染色先に記載した通り、組換えmＣＤ３４をＩgＧキメラとして製造した［ワトソンら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１１０、２２２１−２２２９（１９９０）］。リジン₂₈₆で終わるmＣＤ３４のcＤＮＡ［ブラウンら、エッチ・インターナショナル・イムノロジー（H.Int.Immunol.）３、１７５−１８４（１９９１）］をヒンジであるヒトＩgＧ⁵のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに結合させた。この構築物をヒト胚性腎臓（２９３）細胞へトランスフェクトして、mＣＤ３４ −ＩgＧを産生する終生（permanent）細胞系を単離した。この細胞系により調整した血清を含まない上澄みを濃縮し、mＣＤ３４−ＩgＧキメラを精製するために、プロテインＧセファロースに通した。精製されたキメラを固定化パパイン（ピアス（Pierce））で開裂して、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーにより、mＣＤ３４の細胞外ドメインを、混入しているヒトＩgＧ１Ｆcの大部分（〜８０％）から分離した。フロイント完全アジュバント中の組換えmＣＤ３４１００μgを用いる多様な部位でのウサギの免疫処置により、mＣＤ３４に特異的な抗血清を製造した。フロイント不完全アジュバント中の組換えmＣＤ３４を用いて、ウサギに追加免疫した。先に記載した通り、微量定量プレート上にコートされた精製されたmＣＤ３４−ＩgＧキメラを用いるＥＬＩＳＡアッセイで抗−m ＣＤ３４力価を測定した。ヒトＩgＧ親和性カラム上を通すことにより、その結果得られた多クローン性抗血清から残りの抗−ヒトＩgＧ抗体が減らされた。凍結されたマウスＰＬＮから５〜６ミクロンのクリオスタット切片を切断して、ベクタボンド（Vectabond）でコートされた顕微鏡スライド上に移した。切片を３０分間風乾し、冷アセトン中に固定して（１０分、４℃）、再び風乾した（３０分間）。次いで、その切片をダルベッコのリン酸塩緩衝化生理的食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）１００μlで１０分間再び水和させて、０.１％ＢＳＡおよび３００μg／m lヤギＩgＧ（ブロック用緩衝液）を含むＤ−ＰＢＳと共に４℃で２０分間インキュベーションすることにより、非特異的結合をブロックした。次いで、ブロック用緩衝液中、１００μg／ml mＣＤ３４−ＩgＧキメラの存在下または不存在下、ウサギ抗−mＣＤ３４抗血清の１：１００の希釈液で切片を染色した。４℃で１時間後、スライドを冷Ｄ−ＰＢＳ中へ短時間に２回浸すことにより、第一抗体を洗い流した。ヤギ抗−ウサギＩgＧ−ＨＲＰＯコンジュゲート（カルターク（Caltag））の１：５００の希釈液を４℃で３０分間加えた後、ペルオキシダーゼ色原体（ＡＥＣ、バイオメダ社（Biomeda Corp.））を添加する前に、その切片をＤ−ＰＢＳおよび蒸留水中で２回洗浄した。発色を室温で２０分間行った後、スライドを洗浄し、ヘマトキシリンで１分間対比染色し、風乾して目視可能とした。マウスＰＬＮ起源の硫酸塩−標識化糖タンパク質の免疫沈殿分析先に記載した通り、器官培養においてＰＬＮを³⁵Ｓ−硫酸で標識した［イマイら、１９９０、１９９１、１９９２、上記；ラスキーら、１９９２、上記］。プロテインＧ−セファロースビーズを用いて、トリトンＸ−１００抽出物を４℃ で一晩あらかじめ清浄しておいた。ビーズを除去して、上澄みを３つのアリコートに分けた。充填されたプロテインＧ−セファロースビーズ５０μl、またはＬ −セレクチン−ＩgＧで抱合されたセファロースビーズ５０μlの存在下、ウサギ抗−mＣＤ３４抗血清１０μlまたはウサギ抗−ＧlyＣＡＭ１抗血清１０μlを用いて、免疫沈殿を４℃で５時間行った［ラスキーら、上記］。抗体結合物質を４回洗浄し、ＳＤＳ−βメルカプトエタノール中で煮沸した後、４〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドグラジエントゲル上で電気泳動にかけた。ＰＢＳ、０.０２％ＮＰ４０、０.０５％トリトンＸ−１００、５mＭＥＤＴＡ中、４℃で一晩インキュベーションすることにより、Ｌ−セレクチン−ＩgＧでコートされたセファロースビーズへ結合した物質を溶離した。１０mＭＣaＣl₂を溶離された物質に加え、抗−ＧlyＣＡＭ１抗血清、抗−mＣＤ３４抗血清またはＬ−セレクチン−ＩgＧセファロースビーズのいずれかを用いて、各々のアリコートを上記の通り再び沈殿させた。我々の先の研究では、内皮細胞とゆるく結合して、ならし培地から精製することができたＳgp５０［ラスキーら、１９９２、上記；ブルシュタインら、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン１７６、１４１５−１４１９（１９９２）］とは対照的に、Ｓgp９０は、Ｓgp５０よりずっと少ない生化学的量で存在して、内皮細胞表面にしっかりと結合する［イマイら、１９９１、上記］ことを明らかにした。単離されたＳgp５０は、カルシウロ依存法でＬ−セレクチン−ＩgＧと相互作用することが以前示された。Ｓgp９０がリガンド活性を有して、単にＳgp５０と共に共沈殿するだけではないことを証明するために、我々はＳＤＳゲルからＳgp９０を電気溶離させて、Ｌ−セレクチン−ＩgGと相互作用するその能力を試験した。第１Ａ図で示す通り、カルシウムの存在下、溶離されたＳgp９０はＬ−セレクチン−ＩgＧにより定量的に沈殿したが、ＣＤ４−ＩgＧキメラは該成分とは反応しなかった。煮沸工程と小麦胚凝集素およびＬ−セレクチン−ＩgＧ上での親和性クロマトグラフィーとを組み合わせた、マウス腸間膜リンパ節の界面活性剤溶解産物からのＳgp９０の精製法が考え出された。³⁵Ｓ−硫酸塩−標識化ＰＬＮ抽出物の添加により、精製をモニターすることが可能となった。Ｌ−セレクチン−ＩgＧカラム起源の最終ＥＤＴＡ解離画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、プロブロット膜へ移して、Ｓgp９０リガンドをオートラジオグラフィーにより局在化させた。ゲルのこの領域を単離して、アミノ酸配列分析にかけた。第１Ｂ図は、配列分析の結果を示す。多くのギャップ（「Ｘ」）を含む弱い（〜５pＭ）１２残基のＮ末端配列が決定された。マウスシアロムチンＣＤ３４（m ＣＤ３４）の推論されたＮ末端とＬ−セレクチンにより精製されたＳgp９０リガンドのＮ末端配列との比較［ブラウンら、エッチ・インターナショナル・イムノロジー３、１７５−１８４（１９９１）］により、顕著な関係が明らかになった。Ｓgp９０リガンドのＮ末端は、１２のうち７つの位置でmＣＤ３４Ｎ末端にマッチする。マッチしない４つの位置は、Ｓgp９０配列においてはギャップ、また mＣＤ３４配列においてはトレオニンまたはセリンであった。ＣＤ３４上のトレオニンおよびセリン残基の多くはＯ−グリコシル化されており［サイモンズら、ジャーナル・オブ・イムノロジー１４８、２６７−２７１（１９９２）；ブラウンら、上記；スザーランドら、ロイケミア２、１９３（１９８８）］、単離されたＳgp９０リガンドのアミノ酸配列におけるこれらの位置での解読可能なシグナルの欠除は、これらの部位のＯ−グリコシル化と一致する。最終的な配列の相違は、Ｓgp９０Ｌ−セレクチンリガンドの配列においてはトレオニン、およびmＣＤ３４配列においてはセリンであり、多型性により説明することのできる保存的置換であった。２つのタンパク質の対応に関するさらなる証拠は、単離されたリガンドのトリプシンペプチドの分析から得られた（第１Ｂ図）。トリプシンフラグメントに関して予期される通り、この配列は６つ全ての位置でmＣＤ３４とマッチし、mＣＤ３４配列においてはリジンが先頭にくる。この配列分析では、Ｓg p９０がmＣＤ３４と同一であるかもしれないことを示唆した。 mＣＤ３４に対するＳgp９０の関係をさらに調査するために、mＣＤ３４に対する多クローン性抗血清を製造した。ウサギの免疫処置に使用された組換え抗原は、ヒトＩgＧ−１定常部ドメインの大部分（〜８０％）を除去するためにパパイン開裂を受け、高度に精製されたmＣＤ３４−ＩgＧキメラであった。注入された物質の純度をＮ末端配列決定により測定した。その結果得られた多クローン性抗 −mＣＤ３４抗血清は、ＦＡＣＳ分析により、全長のmＣＤ３４ cＤＮＡを用いて安定にトランスフェクトされたラットＮＲＫ細胞を特異的に染色することが分かり、また約９０kＤのタンパク質は、これらのmＣＤ３４トランスフェクト物から免疫沈殿する（データは示さない）。さらに、多クローン性抗血清は、ＣＤ３４を発現することが知られているＮＩＨ３Ｔ３細胞と、さらにはまた、致死的照射されたマウスを再構築することができるウシ肝臓および骨髄前駆／幹細胞の小さな画分と特異的に反応する［Ｃ.ジョルダン（Jordan）、Ｓ.バウムホイター（ Baumhueter）およびＷ.マチュー（Matthews）の未公開観察結果］。後者の発見は、造血前駆細胞上でのヒトＣＤ３４の局在化と一致する［ベレンソン（Berens on）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション８１、９５１（１９８８）］。抗血清は、毛細管およびマウスＰＬＮ内のＨＥＶの尖端部を染色した。この結果は、ヒトＣＤ３４の毛細管および細静脈内皮発現を実証する先のデータと一致し［ファイナ（Fina）ら、ブロッド（Blood）７５、２４１７−２４２６（１９９０）］、またこの抗原がまた、ＰＬＮの微小脈管構造、Ｌ−セレクチンにより媒介される接着相互作用に左右されることが知られているリンパ部位においても発現することを実証することにより、これらのデータを拡張する［スツールマン，Ｌ.、セル５６、９０７−９１０（１９８９）；スプリンガー,Ｔ.Ａ.、ネイチャー３４６、４２５−４３４（１９９０）；ブッチャー,Ｅ.Ｃ.、セル６７、１０３３（１９９１）；ラスキー,Ｌ.Ａ.、サイエンス２５８、９６４−９６９（１９９２）］。重要なことには、組織化学試薬として使用する場合、Ｌ−セレクチン−ＩgＧキメラもまたＰＬＮＨＥＶを染色する［ワトソンら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１１０、２２２１−２２２９（１９９０）］。 mＣＤ３４に対する抗血清がＳgp９０と反応したかどうかを直接試験するために、免疫沈殿分析を行った（第３図）。Ｌ−セレクチン−ＩgＧを用いて、Ｓgp ５０およびＳgp９０を硫酸塩−標識化リンパ節溶解産物から沈殿させて、ＥＤＴＡで溶離させた［イマイら、１９９１、１９９２、上記］。Ｓgp５０に対するペプチド抗体（すなわち、ＧlyＣＡＭ−１）［ラスキーら、上記］は、Ｓgp５０を選択的に沈殿させたがＳgp９０は沈殿させなかった。対照的に、多クローン性抗 −mＣＤ３４血清は、Ｓgp９０成分をほとんど定量的に沈殿させた一方、Ｓgp５０には影響を及ぼさなかった。第２図の免疫組織化学分析と共に、これらのデータでは、ＣＤ３４がＰＬＮにおいて硫酸化内皮関連糖タンパク質であり、またこの９０kＤの分子がＳgp９０として知られている先に記載したＬ−セレクチンリガンドと同一であることを確認する。（糖タンパク質の複合体セットのうち）ＰＬＮＨＥＶを染色する接着ブロック抗体であるＭＥＣＡ−７９モノクローナル抗体により認識される〜９０kＤの成分に対し、mＣＤ３４、従ってＳgp９０の関係がいかなるものであるかを決定することが残っている［ベルク（Berg）ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１１４、３４３−３４９（１９９１）］。前述の結果では、ムチン様第二糖タンパク質（すなわち、ＣＤ３４）がＬ−セレクチンに対する内皮関連リガンドとして作用し得ることを実証する。第４図が説明する通り、ＧlyＣＡＭ１（Ｓgp５０）およびＣＤ３４（Ｓgp９０）の仮説的な構造は多くの類似点並びに相違を示す。最も注目せずにはいられない類似点は、両方のタンパク質において高度にＯ−グリコシル化されたムチン様ドメインの重要性（prominence）である。我々は、非常に堅くて広がった（extended）構造であると予測されるそのようなムチン様ドメイン［ジェントフ（Jentoft）,Ｎ.、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシーズ（Trends Biochem.Sci.）１５、２９１−２９４（１９９０）］が、Ｌ−セレクチンレクチンドメインに対する適当な硫酸化およびシアリル化炭水化物リガンドの多価提示のための足場として作用し得ることを先に提唱した。従って、既知の内皮シアロムチンであるＣＤ３４には、構造および内皮局在化という両方に関して、白血球とは反対に、Ｌ−セレクチンに対する炭水化物提示ための足場として働く独自の資格がある。しかしまた、興味ある幾つかの点において、ＣＤ３４の構造がＧlyＣＡＭ１のものとは異なることにも注目すべきである。例えば、ＣＤ３４は、従来の膜貫通モチーフ（ motif）により細胞表面へ直接結合し、リガンド精製の間の界面活性剤抽出の必要性と一致する（第１図）一方、ＧlyＣＡＭ１は、そのようなアンカーリング（ anchoring）モチーフを含まないらしく、周辺で（peripherally）膜と結合する。さらに、Ｓgp９０はリポソーム中へ定量的に分配される一方、Ｓgp５０は水性相に残る［Ｓ.ヘマーリッヒ（Hemmerich）およびＳ.ローゼン、未公開］。さらに、ＣＤ３４は、システインに富む領域、さらにはまた白血球接着の間に信号で合図する役割を有し得る拡大された細胞質ドメインを含め、他のモチーフを多く含むらしい。ＧlyＣＡＭ１とＣＤ３４との間の別の重要な相違は、それらの組織分布である（第５図）。ＧlyＣＡＭ１は、ＰＬＮの高内皮細静脈において主に発現し、Ｌ− セレクチンにより媒介されるこのリンパ器官への伝達のための内皮リガンドとしてその提唱された機能と一致する［スツールマン,Ｌ、１９８９、上記］一方、血管ＣＤ３４はずっと広い組織分布を有する。例えば、ヒトＣＤ３４は、広範囲にわたる様々な毛細管および後毛細管細静脈内皮細胞において発現するらしく［ファイナら、上記］、またノーザンブロット［ブラウンら、エッチ・インターナショナル・イムノロジー３、１７５−１８４（１９９１）］およびＰＣＲ分析［Ｓ.バウムホイターの未公開観察結果］では、mＣＤ３４に関して同様なパターンを示唆する。リンパ外血管ＣＤ３４は、急性および慢性炎症反応の間に利用されるＬ−セレクチン接着リガンドとして作用し得ると考えられている。先の研究では、炎症の間、インテグリンにより媒介されるより親和性の高い接着および溢出事象に対する必須条件である、最初の低親和性ローリング（rolling）反応の間の好中球Ｌ−セレクチンに関する重要な役割を実証している。内皮細胞上でのリンパ外血管ＣＤ３４の広い分布は、ＰＬＮＨＥＶ型がＬ−セレクチンリガンドとして働く能力と共に、Ｌ−セレクチンにより媒介される好中級ローリングにおけるリンパ外ＣＤ３４に関する機能を示唆する［レイ（Ley）,Ｋ.ら、ブロッド７７、２５５３−２５５５（１９９１）；フォン・エイドリアン（von Adrian）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ米国８８、７５３８−７５４２（１９９１）］。血管ＣＤ３４の発現の明らかに構成的性質［ファイナら、上記］により、ＣＤ３４コンホメーションにおける変化、オリゴマー化、グリコシル化または内皮細胞表面への転位を含め、様々な調節経路がＣＤ３４の接着活性を決定するのかもしれない。最終的には、本発明の結果から見て、造血幹細胞上でのＣＤ３４の局在化は、本明細書中で実証されるそのレクチン依存性細胞結合活性と共に、もしかすると特徴のあるグリコシル化パターンを含む幹細胞ＣＤ３４が、多分骨髄間質レクチンとの相互作用により、初期の造血の間に接着機能を行うことを示唆する。実施例２：様々な組織におけるＣＤ３４の発現実施例１において、我々は、ＰＬＮにより誘導されるＣＤ３４がＬ−セレクチンを結合する能力を実証して、ＣＤ３４が他のＬ−セレクチンリガンドであるＧ lyＣＡＭ１よりずっと広い組織分布範囲を有することを示すデータを提供している。この実施例において、我々は、ＣＤ３４が試験される全てのマウス器官および組織における血管部位で発現するという証拠を提供し、この結果はさらに、血管ＣＤ３４がＬ−セレクチンにより媒介される好中級ローリングに関与する可能性を強調する。さらに、ＣＤ３４の血管発現は、炎症部位で維持され、白血球伝達を指揮する潜在的役割と一致することが示されるであろう。最終的には、血管ＣＤ３４が適当な炭水化物修飾を示さないならば、Ｌ−セレクチンリガンドとしては働かないらしく、またＰＬＮへの白血球伝達を支持するには不十分であることが実証されるであろう。材料および方法抗体の産生および特性決定本質的には実施例１およびバウムホイター,Ｓら、サイエンス２６２、４３６ −４３８（１９９３）で記載された通り、マウスＣＤ３４に対する多クローン性抗体を製造した。簡単に言えば、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーを利用して、組換えmＣＤ３４／ＩgＧキメラをトランスフェクトされた細胞の上澄みから精製した。次いで、製造説明により詳述した通り、その物質を固定化パパイン（ピアス）で開裂して（３７℃で３時間）、ヒトＩgＧＦc部分を除去するために、もう１つのプロテインＧカラムに通した。ウサギを接種するために、ＣＤ３４の細胞外ドメインを含む流体（flow through）１００μgをフロイント完全アジュバンドと共に使用した。固定化抗原として組換えＣＤ３４／ＩgＧを用いるＥＬＩＳＡアッセイで抗体価を測定した。ヒトＩgＧカラムに通すことにより、最初、ウサギ血清から抗ヒトＩgＧ抗体を減らして、ＣＤ３４／ＩgＧ親和性カラム上で抗−ＣＤ３４抗体を流体から精製した。結合した抗体を０.１Ｍ酢酸／０. １５ＭＮaＣl（pＨ３.０）で溶離させ、すぐに１Ｍトリス（pＨ８.８）で中和し、ＰＢＳの３つの変化物に対して透析し、１０％グリセロール／ＰＢＳ中、−７０℃で保存した。免疫組織化学実施例１またはバウムホイターら（１９９３）、上記で記載された通り、新鮮な凍結した組織切片、または過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）で固定した組織切片について免疫組織化学を行った［１５］。簡単に言えば、５〜８μmのパラフィン切片をキシレン中で１０分間脱パラフィン化し（depar affinized）、水中で濯ぎ、内因性ペルオキシダーゼを１％Ｈ₂Ｏ₂で３０分間反応停止させた。ＣＤ３４抗体を用いて染色するために、切片を０.１Ｍクエン酸緩衝液（pＨ６.０）中に浸して、最高（on high）２回、３分間マイクロ波処理した後、室温で２０分マイクロ波処理した。抗−ＧlyＣＡＭ１抗体を用いて染色するために、クエン酸塩抗原回復工程（citrate antigen retrival step）を３７℃、３分間のペプシン消化で置き換えた。あらかじめ１０％正常ヤギ血清と共に２０〜３０分間インキュベーションしておいた後、適当な抗体の希釈液と共に３０分間室温でインキュベーションすることにより、非特異的結合をブロックした。製造者の説明に詳述された通り、その切片をＰＢＳ中で濯ぎ、ビオチン化した（biotinylated）ヤギ抗ウサギＩgＧ（ベクター・ラボラトリーズ（Vector La boratories））と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で濯いで、ベクター・エリート（Vector Elite）ＡＢＣ試薬（ストレプトアビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート）と共にインキュベートした。基質（ＤＡＢ、ダコ（Dako））を５分間加えた。その切片をメイヤー（Mayer）のヘマトキシリンで対比染色し、脱水して、合成増殖（mounting）培地にのせた。凍結組織切片に役立つ修飾には、アセトン固定工程の追加および脱パラフィン化および抗原回復（クエン酸／ペプシン）工程の省略が含まれでいた。染色の評価は０〜３の段階を用いて行ったが、３が最も強い反応性を示す。Ｌ−セレクチン／ＩgＧを用いての切片の染色は、先の方法から修飾された手順を用いて行った［ワトソンら（１９９０）、上記；およびメビウス（Mebius）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー１５１（１２）、６７６９−６７７６（１９９３）］。先に記載した通り、Ｌ−セレクチン／ＩgＧをゴールド粒子に抱合させた［２４］。凍結組織である固定されたＰＬＰの５〜８μmのクリオスタット切片をベクタボンドでコートされたスライド上に置いて、乾燥し、冷アセトンで固定して乾燥した。ＰＢＳ中に１％ＢＳＡを含む２００μg／ml ＣＤ４Ｉg Ｇ１００をスライドに加えて、７０rpmに設定した回転プラットホーム（platfor m）上、４℃で１５分間インキュベートした。次いで、１０mＭＥＧＴＡの存在下もしくは不存在下、５０μg／ml Ｌ−セレクチン／ＩgＧキメラ１００μlと共に、または対照のＣＤ４／ＩgＧ単独で、切片を４℃で４５分間および７０rpmでインキュベートした。切片を穏やかに傾瀉し、ＰＢＳ中の２.５％冷グルテルアルデヒド（gluteraldehyde）で３０分間固定し、３回変えた蒸留水中で洗浄した。Ｌ−セレクチン／ＩgＧゴールド染色は、アメルシャム（Amersham）製のインテンＳＥ（IntenSE）銀エンハンスメントキットを用いて行われた。切片をすすぎ、メイヤーのヘマトキシリンで対比染色して、クリスタル／マウント（Clysta l／Mount）にのせた（バイオメディア（Biomedia））。炎症反応マウスの導入は、８０％アセトン／２０％オリーブ油（ｖ／ｖ）中の１mg／mlオキサゾロン（シグマ（Sigma））を含む溶液２５μlを両方の後足に塗ることにより感作した。排液するリンパ節を５日後に採取し、上記の通り免疫組織化学に関して処理した。中間型過敏性反応は、５日目に同じオキサゾロン溶液１０μlを感作マウスの右耳に塗ることにより誘発された。左耳は溶媒のみで処理し、対照として働いた。ＤＴＨ反応導入の３時間後に耳を採取し、免疫組織化学に関して処理した。非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスはタコニック（Taconic）、ジャーマンタウン（Germa ntown）、ニューヨークから得て、雄および雌の動物の膵臓は生後２０週で採取した。糖尿病の発生率は、２４週齢では雌のマウスで約８０％、また雄のマウスで３０％である。ＰＬＮの求心路遮断メビウスら、上記で記載されている通り、求心路遮断を行った。簡単に言えば、膝窩リンパ節を外面化して、輸入リンパ管を切断し、輸出リンパ管および血管はそのままにしておいた。求心路遮断後１週間でマウスは死亡した。１０％インディア・インク（India ink）溶液５０μlを同側のフットパッドへ注入することにより、求心路遮断の完全性を測定した。インディア・インクの吸い上げ（uptake ）により測定する場合、無傷の輸入リンパ管を有するリンパ節は捨てた。反対側性膝窩リンパ節は、未処理の対照として働いた。結果マウスＣＤ３４に対して働く特異的多クローン性抗体の産生マウスＣＤ３４に対する高力価抗体の産生は、安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞の上澄みから精製される、このタンパク質の組換え型を用いて達成された［ブラウンら、インターナショナル・イムノロジー３、１７５−１８４（１９９１）］。ヒンジであるヒトＩgＧ−１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインをマウスＣＤ３４の細胞外ドメインへ結合させて（mＣＤ３４／ＩgＧ）（第６Ａ図）［ワトソンら（１９９０）、上記］、この構築物をヒト胚性腎臓（２９３）細胞にトランスフェクトした。プロテインＧセファロースカラム上でのmＣＤ３４／Ｉg Ｇの精製では、〜９０kＤの分子量を有する抗原のmg量を単離することが可能であった（第６Ｂ図）。マウスＣＤ３４に対する抗体反応を高めるために、固定化パパインで消化させた後、プロテインＧセファロースクロマトグラフィーにかけることにより、ヒトＩgＧ−１Ｆcの大部分を除去した。このカラムからその結果得られた流体は、ウサギの免疫処置に使用される純粋な細胞外ドメインを約８０％含んでいた。固定化組換えmＣＤ３４／ＩgＧを用いて、抗−ＣＤ３４抗体を免疫親和性によりウサギ血清から精製して、多くの組織における天然のＣＤ３４の認識に関して試験した。第７図では、全長のＣＤ３４発現構築物（第２Ａ図）を用いてトランスフェクトしたラットＮＲＫ細胞上で、抗体が細胞表面のＣＤ３４を特異的に認識し、またＣＤ３４ mＲＮＡを高レベルで発現することを示したＮＩＨ３Ｔ３細胞をも認識することを説明する（第７Ｂ図）。ＣＤ３４トランスフェクト物、さらにはＮＩＨ３Ｔ３細胞の免疫沈殿分析では、前駆免疫（preimmune）血清を用いては見られない１００kＤでのバンドを示した（データは示していない）。さらに、先の免疫組織化学分析では、この多クローン性抗血清がマウスＰＬＮにおける毛細管およびＨＥＶを特異的に認識することを実証した［実施例１およびバウムホイターら（１９９３）］。最終的には、この抗血清をマウス骨髄およびウシ肝臓起源の造血幹細胞の単離に使用した［Ｃ.ジョルダン、Ｓ.バウムホイター、Ｌ.ラスキーおよびＭ.マチューの未公開データ］。ひとまとめに考えてみると、これらのデータでは、親和性により精製された抗−ＣＤ３４抗血清が生化学および組織学実験におけるマウスＣＤ３４の検出に関して非常に特異的な試薬であることを示唆する。正常なマウス組織におけるＣＤ３４の分布次いで、マウス組織におけるＣＤ３４の分布を免疫組織化学により研究した。この調査結果を表１に要約する。試験された全ての器官において、毛細管および後毛細管静脈の顕著な染色が観察され、また第８図では、脳（第８Ａ図）、腎臓（第８Ｂ図）並びに胸腺（第８Ｃ図）における血管内皮の染色、および骨髄（第８Ｄ図）における巨核芽球、また恐らく造血前駆物質である少ないパーセンテージの胚様（blast-like）細胞の染色を説明する。明らかに細胞質である巨核芽球を除き、染色は常に管腔に（lumenally）向きを合わせた（oriented）。ある組織（例えば、リンパ節および胸腺）においては、被膜（capsules）が、これらの構造物において内皮細胞を恐らく認識するであろうＣＤ３４抗体と反応性であった［表１の注釈もまた参照］。ひとまとめに考えてみると、我々のデータでは、全体的なマウスＣＤ３４の血管発現を実証する。血管の炎症部位でのＣＤ４発現我々は、炎症部位から排液するＰＬＮ中のマウス組織における、ＤＴＨ反応を受けているマウスの皮膚における、また炎症反応を受けているＮＯＤマウスの膵臓における、ＣＤ３４の発現を試験した。３つのモデル全てにおいて、我々は、ＣＤ３４発現が血管の炎症部位で維持されることを見いだした。ＨＥＶおよび抗原部位から排液するＰＬＮの毛細管でのＣＤ３４発現は、炎症していない節に匹敵した。主要な上方または下方調節は明らかではなかったが、適度な調節を免疫組織化学を用いて検出することはできなかった。正常なマウス起源の皮膚と即時型過敏症反応を受けているマウス起源の皮膚とを比較した場合、ＣＤ３４の血管染色は、両方の場合において顕著であった（第９図）。広範囲に及ぶ白血球浸潤を受けている２０週齢の雌のＮＯＤマウスの膵臓の試験では、血管のＣＤ３４に何の変化も示さず、また興味深いことには、白血球浸潤において新たに生じた幾つかの毛細管およびＨＥＶ様構造物もまた染色された（第４図）。従って、少なくともこれらの炎症モデルにおいて、ＣＤ３４発現は下方調節ではないらしかった。雌のＮＯＤ膵臓における炎症性浸潤でのＨＥＶ様血管上でＣＤ３４が発現するという発見に促されて、我々はＬ−セレクチンがこれらの血管へ結合する可能性を調査した。先のデータでは、通常、リンパ節で見いだされるＨＥＶ様血管が、ＮＯＤマウスにおける後の炎症段階の間に誘発されることを実証している［ハンニネン（Hanninen）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション９２、２５０９−２５１５（１９９３）；ヤング（Yang）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ米国９０、１０４９４−１０４９８（１９９２）］。これらの構造物ではまた、ＭＥＣＡ７９と反応することも示されており、ＭadＣＡＭ１に関して陽性である。従って、ＮＯＤ膵臓におけるＨＥＶへのＬ−セレクチン結合を実証すること、またＧlyＣＡＭ１およびＣＤ３４の発現が重複することがあり得るかどうかを調査することが興味あることらしく、このことは、これらのタンパク質のどちらか一方、または両方がＬ−セレクチンリガンドとして作用し得ることを示唆する。Ｌ−セレクチン／ＩgＧキメラを用いてのＮＯＤマウス膵臓の染色では、これらのＨＥＶ様血管のうち少なくとも１つのサブセットがカルシウム依存法でキメラを特異的に結合するらしいことを示した（第１０Ａ、Ｂ図）。連続切片では、同じ血管がＧlyＣＡＭおよびＣＤ３４に関して陽性であることを示す（第１０Ｃ、Ｄ図）。対照の雄のＮＯＤ膵臓または正常なマウスの膵臓において、Ｌ−セレクチン染色を検出することはできなかった（示していない）。標準条件下、ＧlyＣＡＭ１はＰＬＮおよびＭＬＮＨＥＶのみに存在するらしいので、これらのデータは、ＧlyＣＡＭ１およびＬ−セレクチン／ＩgＧ結合が非リンパ部位における慢性炎症により誘発され得ることを実証する。このことは、炎症をうけたＮＯＤ膵臓において誘発されたＨＥＶ様血管が表現型としてはＰＬＮＨＥＶと類似していることを示唆する。さらに、我々の結果は、単に血管ＣＤ３４が存在するだけではＬ−セレクチン／ＩgＧ結合に不十分であることを実証し、この発見は、Ｌ−セレクチンによるＣＤ３４の高い親和性認識において、硫酸化のような特異的な炭水化物修飾に対する役割と一致する。求心路遮断されたＰＬＮにおけるＬ−セレクチンリガンドの発現先のデータでは、求心性リンパ管流れの中断がインビボにおけるＰＬＮへのリンパ球の伝達を強く減少させる結果となるため、そのように処理されたＰＬＮは有意に大きさがより小さくなることを実証している［メビウスら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１１５、８５−９５（１９９１）］。これらの求心路遮断されたＰＬＮの顕微鏡分析では、通常、Ｌ−セレクチンによるリンパ球の結合を媒介するらしい高壁細静脈（ＨＥＶ）が平たい壁になることを示す。さらに、インビトロにおけるこれら平たい壁の内皮細胞へのリンパ球接着は多いに減少されるらしく、多くのＰＬＮＨＥＶ糖タンパク質上の硫酸化炭水化物エピトープを認識することが示されており［イマイら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１１３、１２１３−１２２１（１９９１）］、ＰＬＮＨＥＶへのリンパ球のＬ−セレクチン依存性結合をブロックする、モノクローナル抗体ＭＥＣＡ７９を用いての求心路遮断されたＰＬＮの染色は、強い減少を示した。最終的には、最近のデータでは、Ｌ−セレクチン／ＩgＧキメラタンパク質は、求心路遮断されたＰＬＮにおけるＨＥＶへ結合することができないことを実証している［メビウスら（１９９３）、上記］。この研究はまた、ＧlyＣＡＭ１に対するmＲＮＡ、さらには硫酸化糖タンパク自体の両方が処理されたＰＬＮでは検出不可能であることをも実証した。従って、これらの処理した器官におけるmＣＤ３４の発現を測定することは非常に興味あることであった。第１１図に見られる通り、求心路遮断は、血管ＧlyＣＡＭ１の発現を下方調節する。驚いたことに、これらの節がＭＥＣＡ７９およびＬ−セレクチン／ＩgＧ染色に関して陰性であるという事実にもかかわらず、ＣＤ３４の発現は求心路遮断されたＰＬＮにおいて変化しない。Ｌ−セレクチン結合の不存在下におけるＣＤ３４の連続発現は、親和性の高いＬ−セレクチン結合に対する適当な翻訳後の炭水化物修飾の重要性を再び強調する。適切な硫酸化炭水化物リガンドのないタンパク質骨格だけでは、ＰＬＮへのリンパ球伝達を媒介するのに不十分である。我々の結果ではまた、求心路遮断後の２つのＬ−セレクチンリガンドの様々な調節レベル、すなわち、ＧlyＣＡＭ１発現の下方調節対タンパク質発現を維持したＣＤ３４の炭水化物修飾調節があるということをも提唱する。議論本明細書で報告したmＣＤ３４の全体的な血管分布は、好中球の非リンパ部位へのＬ−セレクチン依存性接着に関する内皮リガンドとして作用するという可能性と一致する。炎症傷害の不存在下では好中球は血管を通って流れないという事実から考えて、全ての血管部位でのmＣＤ３４の構成的発現を間接的なもの（cou nterintuitive）として見なすことができる。Ｐ−セレクチンを無効とするマウスから収集された最近の情報は、この明らかな問答を説明するのに役立ち得る。これらのマウスは、腸間膜細静脈（venues）を通る好中球のローリング、および炎症刺激剤であるチオグリコレートに反応して起こる好中球の腹膜への流入の両方において不十分であることが分かった［マヤダス（Mayadas）ら、セル７４、５４１−５５４（１９９３）］。従って、これらの突然変異マウスから得られた最も明瞭な結論は、Ｐ−セレクチンが好中球のローリングおよび流入の重要な成分であるということであった。先の調査では、Ｌ−セレクチンもまた好中球のローリングおよび溢出にとって明らかに重要であることを示したので、恐らく、これらの接着分子は両方とも好中球の流入に必要であるが、どちらのタンパク質も単独では、この工程を媒介するのに十分ではないらしい。好中球炎症の重大な性質は、好中球のローリングに関与する接着分子が構成的に発現して、血管ＣＤ３４の構成的管腔（lumenal）発現およびＰ−セレクチンの顆粒発現がこの基準を満たすことを必要とする。好中球のローリングの間にＬ−およびＰ−セレクチンの両方を必要とする生理学的理由は推測することしかできない。例えば、セレクチンのうちの１つが相互作用を開始するのに働き得る一方、他のものは結合事象を強くし得ることが可能である。本発明のデータに対する別の興味深い態様は、ＣＤ３４がＰＬＮおよびＭＬＮ対非ＰＬＮまたはＭＬＮ血管において別々にグリコシル化されなくてはならないという間接的証明から得られる。先のデータでは、ＭＥＣＡ７９モノクローナル抗体が多くの内皮糖タンパク質上の炭水化物エピトープを認識し［ストリーターら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１０７、１８５３−１８６２（１９８８）；ベルクら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１１４、３４３−３４９（１９９１）］、これらのうちの１つがＣＤ３４である［イマイら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー１１３、１２１３−１２２１（１９９１）］ことを実証している。このエピトープは主としてＰＬＮおよびＭＬＮＨＥＶにおいて発現し、ＭＥＣＡ７９により認識される炭水化物が血管内皮細胞の小さなサブセットにおいてのみ発現することを実証する。さらに、ＭＥＣＡ７９抗体は、凍結切片アッセイにおいてＬ−セレクチンにより媒介されるリンパ球のＰＬＮＨＥＶへの接着をブロックし、この炭水化物がＬ−セレクチンのレクチンドメインにより認識される炭水化物リガンドの成分となり得ることを示唆する［ストリーターら、上記］。従って、ＣＤ３４がＭＥＣＡ７９抗原発現を示さない血管部位で発現するという発見は、非ＰＬＮＣＤ３４がＰＬＮＣＤ３４のものとは違う炭水化物修飾パターンを有することを示唆する。しかし、この結果が必ずしも、非ＰＬＮＣＤ３４がＬ−セレクチンへ結合することができないということを示すとは限らない。例えば、リンパ球がこれらの器官を通って伝達されるとき、ＭＥＣＡ７９により検出されるＰＬＮＣＤ３４の炭水化物修飾が、リンパ球の結合能力を高めるのに働くことが可能である一方、好中球とＭＥＣＡ７９に特異的な炭水化物に欠けている非ＰＬＮＣＤ３４との間のより低い結合活性相互作用は、この種類の白血球のローリング反応を発生させる結果となる。この後者の仮説は、これらの器官へのリンパ球伝達が有意に減少するという事実にもかかわらず、ＣＤ３４発現が求心路遮断されたＰＬＮ血管上で維持されるという、本明細書中で報告した発見により強化される。先に記載した、求心路遮断されたＰＬＮ血管上ではＭＥＣＡ７９が発現しないことはまた、様々な生理学的状態の下、血管ＣＤ３４を別々にグリコシル化することができることも示唆する。さらに、Ｌ −セレクチン／ＩgＧのみが、ＨＥＶ様の、すなわち、ＧlyＣＡＭ１、また恐らくＭＥＣＡ７９を発現する、炎症を起こしたＮＯＤ膵臓において血管へ結合するらしいという証明はまた、血管ＣＤ３４の相違あるグリコシル化によりＬ−セレクチン結合の強さを調節することができるという仮説とも一致する。要するに、本明細書中で報告したデータは、マウスにおける多様な器官および組織へのＬ−セレクチン依存性伝達における非ＰＬＮ血管ＣＤ３４の役割と一致する。Ｌ−セレクチン依存性接着をブロックするmＣＤ３４に対して働く抗体の産生により、この仮説を試験するのが可能であるように思われ得るが、mＣＤ３４により示されるＬ−セレクチンリガンドの炭水化物性質がそのような作業を困難とする。このことは、抗−炭水化物抗体は特異性に欠けることが多く、また、通常、比較的結合活性の低いものであるという事実による。従って、代わりの研究法とは、ＣＤ３４遺伝子において無効の突然変異を有するマウスの種族を産生することであり得る。そのような調査により、我々は、急性および慢性炎症の間に利用される様々な接着機構を確かに理解するであろう。明細書中の引用、また本明細書中で引用する参考資料は全て、本明細書により参考として明確に組み込まれる。前述のものは特に好ましい態様を示すが、本発明はそのように限定されるものではないことが理解されるであろう。普通、本発明の全体的概念から外れることなく、開示した態様に様々な変更をなし得ることが当業者には考えられるであろう。そのような変更は全て、本発明の範囲内であることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡＡＤＵＡＢＥ 39/395 ＡＢＹＡＤＡＣ０７Ｋ 14/47 ＡＤＵ 16/18 ＡＣＤＣ１２Ｐ 21/08 ＡＣＶ (72)発明者ラスキー、ローレンス・エイアメリカ合衆国94965カリフォルニア、ソーサリト、スター・ルート・ボックス460 番 (72)発明者バウムホイター、スザンネアメリカ合衆国94061カリフォルニア、レッドウッド・シティ、カントリー・クラブ・ドライブ3733番 (72)発明者ローゼン、スティーブン・ディーアメリカ合衆国94703カリフォルニア、サン・フランシスコ、クレイトン・ストリート828番 (72)発明者シンガー、マーク・エスアメリカ合衆国94703カリフォルニア、サン・フランシスコ、グラント・ストリート 1915番

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｌ−セレクチンにより媒介される細胞間接着に関連する病理学的状態を抑制する方法であって、ａ）単離し、精製されたＣＤ３４ポリペプチド；またはｂ）天然のＣＤ３４を結合することができる抗体の治療的有効量を必要とする患者へ投与することからなる方法。２．病理学的状態が白血球の内皮細胞への接着に関連する、請求項１に記載の方法。３．白血球がリンパ球であって、内皮細胞が末梢または腸間膜リンパ節上にある、請求項２に記載の方法。４．病理学的状態が自己免疫疾患である、請求項３に記載の方法。５．病理学的状態が慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、または慢性皮膚炎である、請求項４に記載の方法。６．白血球が好中球または単球であって、内皮細胞が細静脈内皮の細胞である、請求項２に記載の方法。７．治療される病理学的状態が急性または慢性炎症である、請求項６に記載の方法。８．病理学的状態が成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）、多器官不全症、再灌流傷害、急性糸球体腎炎、再発性関節炎、皮膚炎、急性化膿性髄膜炎、熱性傷害、潰瘍性大腸炎、クローン病、血液透析、白血球除去血輸血、出血性ショックまたはサイトカインにより誘発される毒性である、請求項６に記載の方法。９．ａ）セレクチン、ｂ）ＣＤ３４ポリペプチド以外のセレクチンリガンド、ｃ）セレクチンまたはＣＤ３４ポリペプチド以外のセレクチンリガンドを結合することができる抗体、ｄ）インテグリン、ｅ）インテグリンリガンド、ｆ）インテグリンまたはインテグリンリガンドを結合することができる抗体、およびｇ）Ｌ−セレクチン−ＣＤ３４相互作用の非タンパク質拮抗物質、よりなる群から選択される化合物の治療的有効量の投与をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。１０．該化合物がＰ−セレクチン、Ｐ−セレクチンリガンドまたはＰ−セレクチンを結合することができる抗体である、請求項９に記載の方法。１１．ステロイドまたは非ステロイド抗炎症剤の投与をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。１２．該患者が哺乳類である、請求項２に記載の方法。１３．該患者がヒトである、請求項１２に記載の方法。１４．該ＣＤ３４ポリペプチドがモノクローナル抗体ＭＥＣＡ７９により認識される炭水化物構造を有する、請求項１に記載の方法。１５．医薬的に活性な化合物を内皮細胞へ標的化する方法であって、天然のＣＤ３４を結合することができる抗体と該化合物とを化学的に、または物理的に関連させることからなる方法。１６．該医薬的に活性な化合物が抗炎症剤である、請求項１５に記載の方法。１７．該医薬的に活性な化合物が抗酸化剤である、請求項１５に記載の方法。１８．該医薬的に活性な化合物が該抗体の定常部ドメイン配列へ直接融合する、請求項１５に記載の方法。１９．ＣＤ３４を発現する内皮細胞へＬ−セレクチン−ＣＤ３４相互作用の炭水化物拮抗物質を提供する方法であって、該拮抗物質をポリペプチド骨格またはＣＤ３４ポリペプチドへ結合することからなる方法。２０．ＣＤ３４配列または天然のＣＤ３４を結合することができる抗体配列、およびさらなる医薬的に活性な部分を含んでなる双特異性分子。２１．天然のＣＤ３４を結合することができる抗体配列、および抗炎症剤または抗酸化剤の医薬的に活性な部分を含んでなる、請求項２０に記載の双特異性分子。２２．天然のＣＤ３４を結合することができる第一抗体配列、および白血球接着に関連する別の分子を結合することができる第二抗体配列を含んでなる、請求項２０に記載の双特異性分子。２３．該第二抗体配列がＣＤ３４以外の天然のセレクチンリガンドを結合することができる、請求項２２に記載の双特異性分子。２４．該第二抗体配列が天然のインテグリンリガンドを結合することができる、請求項２２に記載の双特異性分子。２５．該インテグリンリガンドがＩＣＡＭファミリーの一員である、請求項２４に記載の双特異性分子。２６．単離し、精製されたＣＤ３４ポリペプチドまたは抗−ＣＤ３４抗体を含んでなる医薬組成物。２７．さらなる医薬的に活性な化合物をさらに含んでなる、請求項２６に記載の医薬組成物。