JPH10114680A - 制癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 より優れた制癌剤を提供することを目的とす
る。 【解決手段】 抗血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因
子抗体及びシクロホスファミド又はビンクリスチンを有
効成分とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、癌細胞の増殖を抑
える副作用の少ない制癌剤に関するものであり、医療、
製薬技術に属するものである。

【０００２】

【従来の技術】本発明者等は、先に、癌細胞に血管の新
生、遊走を誘起する因子を見出し、その機能を阻害し、
腫瘍の増殖を抑えることによって、従来の腫瘍そのもの
をターゲットとした癌の治療方法とは異なる、新規かつ
有効な癌の治療方法が提供できるのでないかと考え検討
を行い、血管の新生を誘起する、あるいは血管の構成細
胞である血管内皮細胞の増殖を促進させる因子のうちで
血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子が腫瘍細胞その
ものに対してではなく血管内皮細胞に特異的に作用し、
生体内では血管の新生を促すことを見出し、この血管内
皮細胞増殖因子／血管透過性因子の作用を抑制すること
によって腫瘍の増殖を抑えることが出来ることを見いだ
し、血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子の機能阻害
剤からなる腫瘍抑制剤についての提案を行った（特開平
６−１１６１６３号）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、先の提
案を行うと共に、血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因
子の機能阻害剤からなる腫瘍抑制剤は腫瘍の治療にあた
り腫瘍細胞そのものを標的とすることなく、腫瘍血管の
新生を抑制することによって間接的に腫瘍の増殖を阻害
するという新しい作用機作に関するものであるから、当
該腫瘍抑制剤は腫瘍の増殖を抑制すると共に、作用点が
腫瘍に延びてゆく血管であるため、従来の腫瘍細胞その
ものをターゲットとする抗癌剤と全く異なり、様々な薬
剤との併用が有効に行え、癌の化学療法がより効果的に
行えるということを示唆した。本発明者らは、これらの
ことを明確にするため、種々の既存の抗癌剤と前記機能
阻害剤との併用について研究を行ったのである。

【０００４】

【課題を解決する手段】本発明者らは各種の既存抗癌剤
について検討し、特定の抗癌剤との併用において、格別
に優れた効果が奏されることを見出し、本発明を完成し
たのである。すなわち、本発明は抗血管内皮細胞増殖因
子／血管透過性因子抗体及びシクロホスファミド又はビ
ンクリスチンを有効成分とすることを特徴とする制癌剤
に関するものである。

【０００５】

【実施の形態】血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子
(vascular endothelial growth factor/vascular perme
ability factor, VEGF/VPF)は、直接的に血管内皮細胞
に作用し、血管新生すなわち毛細血管内皮細胞の増殖、
移動および組織への浸潤という現象は胎児の生長、創傷
治癒、癌細胞の増殖などの生理的または病理的現象にお
いて重要な役割を果たしているものである。

【０００６】血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子
（以下ＶＰＦという）に関しては、マウス、ラット、モ
ルモット、ウシ及びヒトの正常又は腫瘍細胞株で分泌さ
れており、また組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存
在することが明らかにされている[(Ferrara,N., et.al.
Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ヒトＶＰＦ遺伝子
についてはその cＤＮＡがすでに単離されて塩基配列が
決定され、アミノ酸配列も推定されている。この遺伝子
からアミノ酸残基数の異なる４種類の蛋白（アミノ酸残
基数が１２１個、１６５個、１８９個、２０６個の４種
類）が作られ、それらの中で１２１個のアミノ酸残基数
のもの（ＶＰＦ₁₂₁)と１６５個のアミノ酸残基数のもの
（ＶＰＦ₁₆₅)が成熟蛋白であると言われている[(Ferrar
a N., et. al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ＶＰ
Ｆ₁₂₁はＶＰＦ_{1 65}のカルボキシル末端側の４４個のアミ
ノ酸が欠損したものであるが、ＶＰＦ_{12 1}とＶＰＦ₁₆₅の
間に、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうか
については明らかにされてはいない。

【０００７】ＶＰＦの抗体としては特に限定されず、ポ
リクローナル抗体でもモノクローナル抗体のいずれでも
良いが、本発明者らが別途作成した、特定の認識部位を
有し中和活性の強いモノクローナル抗体が本発明にとり
好ましく、それらの抗体は常法により取得することがで
きる。さらに、本発明においては、モノクローナル抗体
をキメラ抗体又はヒト化抗体に変化させたものも使用で
きる。例えば、ポリクローナル抗体はヒト前骨髄性白血
病細胞ＨＬ−６０等より単離しＶＰＦの cＤＮＡを大腸
菌の中でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合
蛋白として発現させ、得られた蛋白質を抗原として得る
ことができる。抗体は、常法に従い、該抗原によりウサ
ギを免疫し、抗体価の上昇した血清からクロマトグラフ
ィーで分画することにより得られる。また、モノクロー
ナル抗体は動物をＶＰＦで免疫し脾細胞を取り出しこれ
をミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマ細胞
を培養することにより製造することができる。このハイ
ブリドーマの製造は例えばKohlerとMilsteinの方法[Nat
ure,256:495(1975)]等により行うことができる。

【０００８】本発明の制癌剤を投与する場合投与する対
象は特に限定されない。例えば個々の癌種の予防或いは
治療することを特異目的として用いることができる。又
投与する方法は経口又は非経口でもよく経口投与には舌
下投与を包含する。非経口投与には注射例えば皮下、筋
肉、血管内注射，点滴、座剤等を含む。又、その投与量
および有効成分の割合は動物か人間かによって、又年
齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変える
ことができる。この場合本発明のＶＰＦ抗体と既存の制
癌剤の有効量と適切な希釈剤および薬学的に使用し得る
担体の組成物として投与される有効量は０.１〜１００m
g/kg体重/日であり１日１回から数回に分けて投与され
る。本発明の制癌剤を経口投与する場合はそれに適用さ
れる錠剤・顆粒剤・細粒剤・散剤・カプセル剤等は通常
それらの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤・包
含剤・賦形剤・滑沢剤・崩壊剤・湿潤剤のような添加剤
を含有する。又、経口用液体製剤としては内用水剤・懸
濁剤・乳剤・シロップ剤等いずれでの状態であってもよ
く、又、使用する際に再溶解させる乾燥生成物であって
も良い。更にその組成物は添加剤・保存剤の何れを含有
しても良い。また非経口投与の場合には安定剤・緩衝剤
・保存剤・膨張化剤等の添加剤を含有し通常単位投与量
アンプル若しくは多投与量容器又はチューブの状態で提
供される。上記の組成物は使用する際に適当な担体たと
えば発熱物質不含の滅菌された溶解剤で再溶解させる粉
体であっても良い。

【０００９】

【実施例】以下実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。但し本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない （１）ＶＰＦモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマの作製 単離したヒトＶＰＦcＤＮＡにて形質転換した酵母の培
養液よりヒトＶＰＦを精製し(ＹＶＰＦ；特開平７−３
１４９６号参照)、キーホールリンペットヘモシアニン
(ＫＬＨ)とグルタルアルデヒドを用いて複合体を作製
し、得られた蛋白を抗原として常法に従ってマウスモノ
クローナル抗体を作製した。即ち、ＫＬＨ-ＹＶＰＦで
免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞(Ｓp2/
0-Ａg14)をポリエチレングリコール存在下で細胞融合さ
せた。得られたハイブリドーマは限界希釈法によりクロ
ーニングした。ＹＶＰＦとクローン化したハイブリドー
マの培養上清の反応性を酵素免疫測定法により調べ、Ｙ
ＶＰＦと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマを選択した。又、このハイブリドーマが産生す
るモノクローナル抗体をＭＶ833と命名した。なお得ら
れたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−５６６９として寄託されている。

【００１０】（２）ＶＰＦモノクローナル抗体の調製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム(Ｍ
ＡbＴrapＧII、ファルマシア社製）を用いてモノクロー
ナル抗体を精製した。又、抗体のクラスを抗マウス免疫
グロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定
法により調べた結果、ＭＶ833抗体のクラスはＩgＧ1で
あった。又、下記の方法で測定したＶＰＦ121及びＶＰ
Ｆ165に対する解離定数は以下の通りであり本発明のモ
ノクローナル抗体はＶＰＦに対して強い親和性を有する
ことがわかる。 ○ ５.７ ×１０^-11Ｍ±０.３５×１０^-11Ｍ（ＶＰＦ
121) ○ １.１０×１０^-10Ｍ±０.１１×１０^-10Ｍ（ＶＰＦ
165) 解離定数の測定方法 モノクローナル抗体を０.１Ｍ塩化ナトリウムを含む２
５mＭ炭酸緩衝液(pＨ=９.０)で２μg/mlに調製し取り外
し可能な有穴プレートに１００μlずつ添加し４℃で一
晩放置する。次に穴から溶液を除き１％ＢＳＡ-ＰＢＳ
を３０μlずつ添加し３７℃で４時間放置する。１％Ｂ
ＳＡ-ＰＢＳを取り除いた後０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで調
製したＶＰＦと¹²⁵Ｉ標識ＶＰＦ(¹²⁵Ｉ標識ＶＰＦ121は
ＹＶＰＦをクロラミンＴ法により標識、¹²⁵Ｉ標識ＶＰ
Ｆ165はアマシャム社より購入)反応混液を穴あたり２０
０μl添加して一晩放置する。この反応混液中のＶＰＦ
濃度はＶＰＦ121が０〜１ng/穴，ＶＰＦ165が０〜１０n
g/穴、¹²⁵Ｉ標識ＶＰＦが１×１０４cpm/穴(¹²⁵Ｉ標識
ＶＰＦ121 ; ６６.７pg/穴、¹²⁵Ｉ標識ＶＰＦ165 ；１
１６pg/穴)とする。穴から反応混液を取り除き０.１％
ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄した後、穴を１個ずつ切り離
して分析用チューブに入れガンマーカウンターにてカウ
ントしその結果から作成した散布図から解離定数を求め
る。又、下記の方法で測定した本発明のモノクローナル
抗体の等電点は pＩ＝５.２〜５.５であった。現時点で
報告のある他のＩgＧ1タイプの抗ＶＰＦモノクローナル
抗体の等電点は我々の報告しているＭＶ101が pＩ＝７.
０〜７.５でありジェネンテック社のＡ４.６.１が pＩ
＝４.２〜５.２[Kim,K.J. et.al. GrowthFactors,7:53
(1992)]であり本発明の物質はいずれの物質とも異なる
物質である。 等電点の測定方法 モノクローナル抗体の等電点電気泳動は市販の等電点電
気泳動用アガロースゲル(和科盛社)を使用し同社の等電
点電気泳動層にて泳動した。泳動は等電力出力可能なパ
ワーサプライ(バイオラド社)により３Ｗで３０分間泳動
した。泳動後ゲルは銀染色キット(バイオラド社)にて蛋
白染色した。モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動
した等電点マーカー蛋白の泳動度より抗体の等電点を求
めた。

【００１１】（５）ＶＰＦ中のモノクローナル抗体の反
応部位の同定 （ａ）ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当するペプチ
ドの作製 ヒトＶＰＦ121のアミノ配列の連続した１２個のアミノ
酸を１つのペプチドとして全配列を網羅する６７種のペ
プチドを考案し、各ペプチドをマルチピンペプチド合成
法[Maeji,N,J, et.al. J.Immunol.method,134:23(199
0)]により合成した。まず９６穴アッセイプレート用ピ
ンブロックのピンの先端に導入された9-フルオレニルメ
トキシカルボニル(Ｆmoc)-β-アラニンからピペリジン
によりＦmoc基を除去した後、ジシクロヘキシカルボジ
イミドとヒドロキシベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-
アミノ酸を縮合させた。N,N-ジメチルホルムアミドで洗
浄後、再びジシクロヘキシカルボジイミドとヒドロキシ
ベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-アミノ酸を縮合さ
せ、この操作を繰り返すことにより目的のペプチドを合
成した。縮合反応終了後、無水酢酸でアセチル化を行
い、さらにトリフルオロ酢酸で側鎖保護基を除去した。
ピン上で合成したペプチドはピンを中性溶液中に浸すこ
とにより切り出した。合成したペプチドの定量はオルト
フタルアルデヒドを用いてアミノ基を定量することによ
り行った。合成した６７種のペプチドのアミノ酸配列を
表１に示した。数字はペプチド識別番号を示す。

【００１２】

【表１】

【００１３】（ｂ）ＭＶ833抗体と反応するペプチドの
同定 以上のようにして合成した６７種のペプチドはヒトＶＰ
Ｆ121の全領域に対応するものである。したがって６７
種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べることに
よりＭＶ833抗体がＶＰＦのどの部位に反応しているか
を明らかにすることができる。そこで酵素免疫測定法に
より６７種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べ
た。９６穴ＮＯＳプレート(コースター社製)に６７種の
２０μＭペプチド溶液を入れ室温で２時間放置した。
０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳでプレートの穴を３回洗浄した
後、２％ＢＳＡ-ＰＢＳを入れ室温で１時間放置した。
２％ＢＳＡ-ＰＢＳを除いた後、ＭＶ833(１％ＢＳＡ-Ｐ
ＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ
-ＰＢＳで６回洗浄後ペルオキシダーゼ標識したヒツジ
抗マウスＩgＧ(アマシャム社)(０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳ溶
液)を入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ-ＰＢ
Ｓで６回洗浄後８.３mg/mlオルトフェニレンジアミン２
塩酸塩および０.０１％過酸化水素を含む０.２Ｍトリス
−クエン酸緩衝液(pＨ=５.２)を入れて発色させた。反
応は２規定硫酸を加えて停止させた後、吸光度(ＯＤ４
９０／６５０)を測定した。以上の方法で測定した結果
をグラフにプロットし図１に示した。

【００１４】ＭＶ833抗体は６７種類のペプチドの中で
ペプチド識別番号３１、３２、３３、６０、６３の５つ
のペプチドに強く反応した。ペプチド識別番号３１〜３
３のペプチドにはＫＰＳＣＶＰＬＭＲという配列が共通
に含まれていることより、この領域ではＭＶ833抗体は
ＫＰＳＣＶＰＬＭＲというアミノ酸配列部分と反応して
いると考えられる。したがって、ＭＶ833抗体はＶＰＦ
のＫＰＳＣＶＰＬＭＲ配列とＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ
配列とＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ配列とに反応している
ことが予想される。抗体はタンパク質の表面に露出して
いる部分を認識すると考えられるため、この２種類のア
ミノ酸配列部分はＶＰＦの表面に露出している部分であ
ると言える。又、モノクローナル抗体は抗原決定基が単
一であると言われているが、高次構造をとっている蛋白
質などの高分子物質が抗原の場合は抗体が立体的に抗原
を認識し、蛋白質の一次構造レベルで抗体の反応性を調
べた時に二箇所以上の不連続なアミノ酸配列に反応する
ことがある。ＭＶ833抗体がＶＰＦ中の二箇所のアミノ
酸配列部分に反応したことより、本抗体は二箇所のアミ
ノ酸配列部分を立体的に同時に認識していると考えられ
る。

【００１５】（６）抗腫瘍試験 ヌードマウス皮下にて継代したヒト線維肉腫（ＨＴ１０
８０）を２mm角に切り出し、別の１群５匹のヌードマウ
ス皮下にトロアカールを用いて移植した。移植翌日に既
存抗癌剤であるシクロホスファミドを５０mg/kg又はビ
ンクリスチン０.２mg/kg、尾静脈より単回投与し、抗体
は移植翌日から１２.５μgを４日毎に尾静脈投した。抗
癌剤単独投与群ではシクロホスファミドの場合５０mg/k
g、ビンクリスチンの場合０.４mg/kgを併用群と同様の
方法で投与した。抗体単独投与群では抗体の１２.５μg
を同様の方法で投薬した。経時的に腫瘍径を測定するこ
とで腫瘍体積を算出した。同時に体重変化の観察も行っ
た。それらの結果を図２〜５に示す。図２はＶＰＦモノ
クローナル抗体とシクロホスファミドの併用による腫瘍
体積の変化を示す図であり、図中黒三角は抗体を単独で
１２.５μg投与したもの、黒丸はシクロホスファミドを
単独で５０mg/kg投与したもの、黒四角は抗体とシクロ
ホスファミドを併用したもの、白丸はコントロールを示
し、横軸は投与後日数、縦軸は腫瘍体積(mm³)を示す。
図３はＶＰＦモノクローナル抗体とシクロホスファミド
を併用した際の体重変化を示す図であり、中の記号は図
２と同じであり、横軸は投与後日数、縦軸は体重変化
(g)を示す。図４はＶＰＦモノクローナル抗体とビンク
リスチンの併用による腫瘍体積の変化を示す図であり、
図中黒丸は抗体を単独で１２.５μg投与したもの、黒三
角はビンクリスチンを単独で０.４mg/kg投与したもの、
白四角は抗体とビンクリスチンを併用したもの、白丸は
コントロールを示し、横軸は投与後日数、縦軸は腫瘍体
積(mm³)を示す。図５はＶＰＦモノクローナル抗体とビ
ンクリスチンを併用による腫瘍体積の変化を示す図であ
り、図中黒丸は抗体を単独で１２.５μg投与したもの、
黒三角はビンクリスチンを単独で０.２mg/kg投与したも
の、白四角は抗体とビンクリスチンを併用したもの、白
丸はコントロールを示し、横軸は投与後日数、縦軸は腫
瘍体積(mm³)を示す。図から明らかな様に、シクロホス
ファミドと抗体を併用した群ではそれぞれを単独で投与
した群よりも抗腫瘍活性が強いことが示された。その
時、体重減少は観察されなかった。また、シクロホスフ
ァミドを単独で２００mg/kg投与すると、強い抗腫瘍活
性を示したが体重減少もまた観察された。ビンクリスチ
ンに関してもシクロホスファミドの場合と同様の結果が
示された。

【００１６】

【発明の効果】本発明は、先に提案したＶＰＦの機能阻
害剤からなる腫瘍抑制剤の奏する効果をさらに向上する
ものであり、優れた制癌剤を提供できるものである。

【００１７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＶＰＦ121中の一部分に相当する６７種の
ペプチドに対するＭＶ833抗体の反応性を調べた図であ
る。

【図２】ＶＰＦモノクローナル抗体とシクロホスファミ
ドの併用による腫瘍体積の変化を示す図である。

【図３】ＶＰＦモノクローナル抗体とシクロホスファミ
ドを併用した際の体重変化を示す図である。

【図４】ＶＰＦモノクローナル抗体とビンクリスチンの
併用による腫瘍体積の変化を示す図である。

【図５】ＶＰＦモノクローナル抗体とビンクリスチンの
併用による腫瘍体積の変化を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈴木 日出夫 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因
   子抗体及びシクロホスファミド又はビンクリスチンを有
   効成分とすることを特徴とする制癌剤。