JPH08509807A - 表面増幅体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、被分析物の存在を検出することに使用する膜に関する。この膜は、密接に詰め込まれた自己整列する両親媒性分子と複数の第一及び第二のレセプター分子とを含有し、第一のレセプター分子は、被分析物の一方の部位と反応し、第二のレセプター分子は、被分析物の他の部位と反応する。この第一のレセプター分子は、膜内で側方拡散しないが、第二のレセプター分子は、膜内を自由に側方拡散する。この膜は、第一のレセプター分子：第二のレセプター分子の割合が、１０：１もしくはそれ以上であることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 表面増幅体 本発明は、被分析物の存在の検出に使用するための膜に関する。 国際特許出願ＷＯ９０／０８７８３は、支持された二重層膜にイオノホアを取 り込む側方拡散原理に基づいて、高感度でかつ高い特異性を備えたバイオセンサ ーを構成する方法を開示している。この出願に記載された発明の好ましい実施態 様は、各二重層リーフレットの各々に一つの二つのモノマーがそれ自身適切に並 んで二重層に架かるダイマーを形成するときにのみ伝導チャネルを形成すること が知られたグラミシジンをイオノホアとして含むものであった。一方の単一層（ “下方”の単一層と称される）のモノマーは、この単一層内の化学的架橋結合に より、もしくは適切な結合基を介して土台となる基質に結合されることにより、 あるいは別の方法により、側方に動かないようにされている。他の単一層（“上 方”と称される）のモノマーは、この単一層内で自由に側方拡散でき、下層のモ ノマーと並んで伝導チャネルを形成する。上層のモノマーは、結合したレセプタ ー分子を有しており、この膜の上方の液相中の被分析物に近づくことができる。 これらのレセプターは、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、少なくと も一つのＦａｂフラグメントを含む抗体断片、抗原等の、以前に記載された一般 的な種類のものでよい。また、レセプター分子のもう一方のクラス（“相補的” と称される）も、膜表面に結合されてもよい。この第二クラスのレセプター分子 は、下方の（不動の）層に接合されることによって横に動かないようにされてい る。被分析物の検出は、被分析物分子が、その相補的な部位で、可動及び不動の 両方のクラスの二つのレセプターに結合したときになされる。これにより、一方 のレセプターに接合したグラミシジンモノマーが、それ自身下層のモノマーと並 ぶことから抑制され、検出結果を与える膜の電気的伝導の低下が引き起こされる 。 このようなバイオセンサーは、決まってかなりの表面濃度の接合されたチャネ ルおよび不動のレセプター分子を有している。このように、全ての不動および可 動レセプターが、それぞれ同じ種類であることを確実にすることが必要であり、 可動チャネルが接合されたレセプター間の架橋結合を引き起こす被分析物は、決 まって効率的なゲーティングを起こさない。さらに通常の時間（約１００秒）に おけるこのような装置の検出感度は、既知の拡散速度定数、すなわち生理的条件 下で溶液から接合するためのＫ_on（約１０⁸Ｍ^-1Ｓ¹）によってセットされる。検 出部位の重要な（約５０％）フラクションが占有される（ここでは、ゲートされ るチャネル）ように、検定濃度Ｃは、次の式を満たさなければならない。 Ｃ＞１／（Ｋ_onＸ １００） （１） この一般的な要求は、上記の要求の下で、検出増幅の何らかの付加的手段なし に作動するあらゆる検出装置を限定し、約１０^-10Ｍの被分析物検出濃度限度を 定める。 本発明者らは、被分析物の存在の検出に使用する膜の感度が、可動性のレセプ ター分子に対する固定されたレセプター分子の割合を１：１の割合以上に増加さ せることによって改良されることを見いだした。 従って、本発明は、被分析物の存在を検出することに使用される膜からなり、 この膜は、密接に詰め込まれた自己整列する両親媒性分子と、複数の第一及び第 二のレセプター分子との整列を含み、第一のレセプター分子は被分析物の一方の 部位と反応し、第二のレセプター分子は被分析物の他の部位と反応し、第一のレ セプター分子は膜内で側方拡散しないが、第二のレセプター分子は膜内を自由に 側方拡散するもので、第一のレセプター分子：第二のレセプター分子の割合が、 １０：１もしくはそれ以上とすることを特徴とする。 本発明の好ましい実施態様では、第一のレセプター分子：第二のレセプター分 子の割合が、１０：１〜１０⁵：１の範囲であり、好ましくは約１０００：１と される。 本発明のさらに好ましい実施態様では、第一及び第二のレセプター分子が、被 分析物の異なる抗原決定基（エピトープ）に結合する。 本発明の好ましい実施態様では、膜が二重層であり、一方の層の第一半膜間モ ノマーと、他方の層の第二半膜間モノマーとを含む複数のイオノホアを含有し、 第一半膜間モノマーは膜内での側方拡散が妨げられるが、第二半膜間モノマーは 膜内を自由に側方拡散し、第二のレセプター分子が第二半膜間モノマーに結合さ れ、第一及び第二のレセプター分子への被分析物の結合が、膜のコンダクタンス に変化を及ぼすものである。 第一及び第二半膜間モノマーは、当該技術分野で知られたいずれの分子でもよ いが、現在のところ、グラミシジンもしくはその誘導体が好ましい。 本発明のさらに好ましい実施態様では、膜が膜間脂質を含有する。さらに、第 一のレセプター分子が、膜間脂質に接合していることが好ましい。 また、本発明者らは、膜に接合されたルーズポリマーネットワークを用いた第 一のレセプター分子の総数を増加させる新規の方法を開発した。従って、本発明 の他の実施態様では、旋回運動の半径が約１００〜３００オングストロームの直 線状ポリマー鎖が膜の表面に接合され、第一レセプター分子が、この直線状ポリ マー鎖に接合される。 この直線状ポリマー鎖は、上層における適切に官能を有する（functionalised ）脂質を介して一または二点で膜に接合されることが好ましい。これらは、膜間 脂質であってもよい。 本発明の好ましい実施態様では、直線状ポリマー鎖の旋回運動半径が、約２０ ０オングストロームである。しかして、ポリマー鎖に接合された全ての抗体は、 膜表面の約５００オングストローム以内である。 直線状ポリマー鎖：膜の脂質の割合が、約１：１０⁴であると好ましい。これ により、膜表面におけるポリマーの“ゆるい接触の”パッキングが与えられ、従 って第一半膜間モノマーが自由に拡散できる。 ポリマー鎖は、濃縮されたポリエチレングリコールであることが好ましい。 旋回運動半径Ｓ₀は、四面体型結合の長さｌを有する一本鎖に対して以下の式 によって与えられ、上式においてｎは結合数であり、α²はポリマーに特有な定 数である。ＰＥＯ（-ＣＨ₂-ＣＨ₂-Ｏ-）_mでは、ｌはＣＨ₂-ＣＨ₂またはＣＨ₂-Ｏ 結合の長さの平均、〜１．５オングストロームであり、α²は〜２である。 ＰＥＯでは、ｎ＝３ｍ（すなわちモノマー単位の〜３倍の数字）である。 もしＳ₀が〜２００オングストロームであれば、ｎは〜２５０００（分子量〜 ４０００００）とされる。 ５００オングストローム厚の層におけるポリマーのマスフラクション（mass f raction）の平均は これは、表面上における抗体／イオンチャネル複合体の側方拡散を非常に容易 にする。 ＰＥＯのすぐに利用できる形態は、ＰＥＧ、すなわちポリエチレングリコール である。ＯＨ-ＣＨ₂-ＣＨ₂-（ＣＨ₂-ＣＨ₂-Ｏ）_m-ＣＨ₂-ＣＨ₂-ＯＨ。これは、 鎖の各末端にヒドロキシル基を備えている。ｎ〜２５０００であって、膜定着も しくは抗体結合のための官能的接合点が〜１０である鎖は、抗体／脂質接合用の 側鎖（例えばヒドラジド）も含む適切な二官能（例えばジカルボン酸）分子を備 えたより短い鎖状のＰＥＧ（ｎ〜２５００）を濃縮することにより形成される。 抗体及び膜接合脂質（例えばアルデヒドに対するヒドラジドの結合）には、通 常の接合化学が用いられることが予想される。このポリマーは、（生理食塩水中 に〜１％の溶液となるように添加されて）まず最初に膜表面に接合され、未反応 の過剰分は除去される。次いで、適切に活性化された抗体を添加し、反応させる 。 この接合方法は、短い結合を介して膜間脂質に表面で直接的にタンパク質を定 着させるための以前に提案された方法を越えた、いくつかの潜在的な利点を有し ている。 １）抗体が、架橋結合反応に順応する非常に優れた局所自由度を備えている。 これは、ＥＬＩＳＡ検定法で得られた状態に近づけるべきである。もし内部層結 合グラミシジン密度が、〜１：１０⁴より高くなければ、チャネルの被分析物誘 発架橋結合と抗体結合ポリマーとにおけるそれぞれの統計的なゲーティングオフ （gating off）が適当である。可動性上層脂質に対するポリマー鎖の一点接合を 用いても、ポリマー“球体”の弱いオーバーラッピング量（マス）は、数百オン グストロームもしくはより長い規模で横の動きに対抗する。 ２）実質的により高い表面密度の“不動の”抗体が可能である。 ３）表面のゆるい“生体適合性”ポリマーネットが、膜に結合する非特異的タ ンパク質をおそらく減少させる。 本発明のさらに好ましい実施態様では、膜と電極との間に空間が存在するよう に、膜が結合分子を介して電極に接合される。好ましい結合分子は、ＰＣＴ／Ａ Ｕ９２／００１３２およびＰＣＴ／ＡＵ９３／００５０９に開示されたものがあ る。これらの各出願の開示内容を、参照としてここに取り込む。 第一半膜間モノマーは、多数の既知の技術を用いて、膜における側方拡散から 妨げられてもよいが、現在のところ第一半膜間モノマーは結合基を介して電極に 接合されることが好ましい。 本発明のさらに好ましい実施態様では、蛍光消光剤が第一レセプター分子に接 合され、蛍光種が第二レセプター分子に接合される。 このような変形例では、膜に蛍光種の励起波長を照射する。被分析物を添加す ると、この被分析物がレセプターに結合する。結合した第一レセプターの割合が より大きいために、被分析物がより確実に第一レセプター分子に結合する。次い で、膜を通した可動レセプターの拡散は、第一レセプター分子に結合した被分析 物に当接する。次いで第二レセプター分子が被分析物に結合し、蛍光基は消光さ れ、放射された蛍光が弱まる。この手段を使用して、被分析物の存在が、蛍光の 低下によって検出できる。 ここで使用したように、“レセプター分子”という用語は、その最も広い状況 で用いられる。このレセプター分子は、所望の被分析物に結合し得るあらゆる化 学的実体でもよい。レセプター分子は、他の分子を認識することのできるあらゆ る化合物もしくは組成物である。天然のレセプターは、抗体、酵素、レクチン、 染料等を含む。例えば、抗原に対するレセプターは抗体であるが、抗体に対する レセプターは、抗−抗体あるいは、より好ましくは、その特定の抗体によって認 識される抗原のいずれかである。 第一及び第二レセプター分子は、同一または異なってもよく、好ましくは、ポ リクローナルまたはモノクローナル抗体、少なくとも一つのＦａｂフラグメント を含む前記抗体フラグメント、抗原、レクチン、ハプテンおよび染料からなる群 から選択される。レセプター分子が、抗体またはそのフラグメントであることが 最も好ましい。 本発明の膜が、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００５０９記載の多数の脂質及びリンカー 化合物を好都合に取り込むことは、当業者にとって明らかなことである。このよ うな変形は本発明の範囲内であると考えられ、この互いに未決定の出願の開示内 容を参照としてここに取り込む。 本発明の特徴をより詳しく理解できるように、その好ましい形態を以下の実施 例を参照してここに記述する。実施例 電極： 以下の方法は、バイオセンサーの応用に使用するための電極の製作を記述した ものである。この電極は、ガラス基質と、クロムの粘着層を備えた模様付けされ た（patterned）薄い金のフィルムからなる。対向電極は、バイオセンサーのウ ェル内に外部から適用される。 １． 清潔な顕微鏡ガラススライド（Lomb Scientific cat no．7101，寸法 26x 76x1.0-1.2mm）を、以下の記載のように用いる。このスライドを扱うには、パウ ダーの無いプラスチックグローブを使用する。 ２． 箱の中で新たに調製されたＨ₂Ｏ₂（１ｖｏｌ．）とＨ₂ＳＯ₄（３ｖｏｌ． ）の溶液に１０分間浸し、全てのスライドを箱から移す。 ３． 全てのスライドを、テフロンコートされたピンセットを用いて前記溶液か ら移し、脱イオン水に浸し、さらに１０分間流動脱イオン水ですすぐ。次いで、 液体窒素貯蔵タンクから蒸発させて得られた純粋な窒素で風乾する。 ４． この清潔なスライドは、保存せずに、直ちに蒸発装置に入れる。 ５． スライドを模様付けするための適切なシャドーマスクを、圧がかけられた 上述の高純度の窒素を用いて、過剰物質を吹き飛ばすことにより洗浄した。 ６． 洗浄されたガラススライドを、シャドーマスクに設けた溝に配置し、マス クとスライドの両方を、高真空チャンバーに入れた。 ７． 真空システムは、約４５分間以上、５ｘ１０^-6Torr以下の圧までくみ出さ れる。 ８． 電熱器を用いて、ドイツのバルゼルズ（Balzers）の９９．９％クロム元 素をタングステンのコンテナーからガラス表面上に蒸発させた。フィルムの厚さ を測定し、０．１−９．３ｎｍ／ｓの速さで堆積させて、堆積層を２０ｎｍの最 終的な厚さに調節した。 ９． 同様であるが別のタングステンのコンテナーを用いて、可動性の羽根を介 してクロムのコンテナーから単離された、Johnson Mathey（Australia）Ltdの９ ９．９９％の金を、０．１ｎｍ／ｓで１００ｎＭの深さまで蒸発させる。 １０． チャンバーと電極を約１０分間冷却し、チャンバーに窒素ガスを導入し て大気圧まで上昇させる。 １１． もう一度パウダーの無いグローブを使用して、清潔なスライドを含むマ スクをチャンバーから移し、テフロンコートされたピンセットを用いてスライド をマスクから外し、貯蔵コンテナーに移すか、あるいはクロムプレート真鍮組立 体に直接移した。 １２． 貯蔵用の箱に移された電極は、減圧して、ヒートシーラーを使用し、さ らに低揮発性のプラスチックバッグ内に収納される。 １３． 電極は、作製後２４時間以内に使用するべきである。材料および方法： １． 金でコートされた上述の顕微鏡ガラススライドの全体を、エバポレーター から直接取り出し、各ウェルが金の表面と接触するシーリングを形成し、金の電 極表面上に約２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を保持するよう に組み立てられた、１６のテフロンのウェルを備えたクロムコートされた真鍮の クランプに組み込む。 ２． 生理食塩水の添加の前に、一連のエタノール性溶液をウェル、従って新し い金の表面に添加して膜を形成する。 ３． 上記工程の間、作業者の息により新しい金表面が汚染されないように、フ ェースマスクを装着する。 ４． エタノール性溶液は、二段階で添加され、一方は膜の内側もしくは“下方 の”層を形成し、二番目は、膜の外側もしくは“上方の”層を形成する。 下層： ３μｌのエタノール性溶液で、以下のものを含有する： １０ｍＭのグリセロ-モノ-フィタニル（phytanyl）-エーテル（ＧＭＰ Ｅ）（この化合物の合成は、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００５０９に解説されている） 化合物Ｉ（図１に示されている） １ｍＭのジ-テトラ-エチレン-グリコール-ジフィタニルベンジルジスル フィド（ＤＬＰ） 化合物II（図２に示されている） ．１、１．０、＆１０μＭのビオチニル化（biotinylated）されたジ- アミノカプリルに結合した膜間脂質（ＭＳＬＸＸＢ） 化合物III（図３に示されている） ０．８ｍＭのメルカプト酢酸-ジスルフィド（ＭＡＡＤ） 化合物IV（図４に示されている） ０．１μＭのジテトラエチレン-グリコール-グラミシジン-ベンジルジ スルフィド（ＧａＹＹＳＳＢｎ） 化合物Ｖ（図５に示されている） を各ウェルに添加し、直ちに２０μｌのエタノールを加える。電極および溶液を 、５分間インキュベートし、蒸留したＡＲエタノールで二度洗浄し、パラフィル ムに密封して室温に保存した。この保存期間は、数分から数週間でよく、重要な ものではないと考えられる。 上層： 保存後、以下のものを含有する３μｌのエタノール性溶液を添加した： ２８ｍＭのＧＭＰＥ ０．２８μＭのビオチニル化されたビス-ジ-アミノカプリル-グラミシ ジン（Ｇａ６Ｘ） 化合物VI（図６に示されている） 次いで、電極を、５００μｌのガラスμｌシリンジから５００μｌの０．１Ｎ リン酸バッファー生理食塩水ｐＨ７．４、５ｍＭのＰＯ₄ ⁺で二度すすぎ、この工 程で形成された膜のインピーダンスを、電極上の２００μｌウェルの内部の生理 食塩水と接触させて、銀のワイヤーと比較して測定する。インピーダンスの測定： インピーダンスを、１０００Ｈｚ〜０．１Ｈｚまでの連続した周波数で、１０ −１００ｍＶの交流（a.c.）励起電位を用いて測定した。これらの測定から得ら れたインピーダンススペクトルは、以下の両方の観点で解釈される： 電極のヘルムホルツキャパシタンスを示す蓄電器と連続している両方のイオン チャネルを示す抵抗器と並列な、膜を示す蓄電器を含む等価電気回路（equivale nt electrical circuit）における抵抗要素。 金の電極と対称電極との間の膜を通した、与えられた電位と得られた電流との 間の位相角。このような流れで行われた相測定の態様は、膜が最も抵抗を有し、 伝導イオンチャネルによってそのインピーダンスにおいて支配される周波数を示 す最少位相が起こる周波数（ｆ_min）である。試験： ２３℃で、通常の金の電極を分ける１６のブロック中のｘ４ウェルのグループ 上でインピーダンスの測定を行った。組み立てられたブロックは、可動性レセプ ター（Ｇａ６ＸＢ）の固定された濃度に対して、上記の範囲のつながれたレセプ ター（ＭＳＬＸＸＢ）を備えるものであった。 添付のグラフに示した、つながれた／可動性レセプターの割合は、０−１００ ０であった。この割合は、［ＤＬＰ］／［ＭＳＬＸＸＢ］の割合から計算される ： この種の溶液の濃度を、金の表面の数の比に変換すると仮定して、 １ｍＭのＤＬＰに対して：− １０μＭ、１μＭ、０．１μＭもしくは０μＭのＭＳＬＸＸＢ、 １００、１０００、１００００および無限大の割合を与える。ある程度の量的差 異が、溶液と表面の値との間に存在するが、定性的な傾向は、図７において明白 である。 つながれたレセプターの数の比、および上層の可動性レセプターの既知の濃度 から、（ＧＭＰＥと比べて１：１０００００）、つながれた／可動性のレセプタ ーの比は、それぞれ１０００、１００、１０および０と見積もることができる。 ゲーティング前後の伝導チャネルの数の比は、つながれた／可動性レセプターの 比の関数として図７に示されている。 ゲーティングは、各ウェルに直接２μｌの０．０１ｍｇ／ｍｌストレプトアビ ジンを添加することによって行われる。添加後、位相が最少となる周波数（ｆ_{mi n} ）が観察され、ゲーティング後のｆ_minによるゲーティング前のｆ_minを分割す ることにより決定されたゲーティングの割合を完全にした。つながれた／可動性の種の増加した割合の利点 つながれた／可動性レセプターの割合の増加が、ストレプトアビジンとの試み の前後で伝導するチャネルの割合における増加を引き起こす。これは、より多数 のつながれたレセプターによって、より効果的なイオンチャネルの架橋結合およ び分解、並びに被分析物に対するより敏感な反応を引き起こす。 これは、伝導チャネル数における最少の信頼できる検出可能な変化（約１０％ ）が、より小さい被分析物の濃度で達成できる、つながれた／可動性レセプター の割合を増加させる装置の検出感度を意味する。 広く記載した本発明の精神もしくは範囲から離れることなく、特定の実施態様 に示したように、多数の変形例および／または修飾例が本発明に対してなされる ことは当業者に理解されるであろう。本実施態様は、あらゆる点で例証的であり 限定的でないものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ＰＭ４３０２ (32)優先日 1994年３月８日 (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コーンネル，ブルース アンドリュー オーストラリア国 2089 ニュー サウス ウェールズ ニュートラル ベイ ウィ コム ロード 58 (72)発明者 ペース，ロナルド ジョン オーストラリア国 2607 オーストラリア ン キャピタル テリトリー ファーラー ホークスベリー クレセント 138

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 密接に詰め込まれた自己整列する両親媒性分子と複数の第一及び第二のレ セプター分子とを含有し、第一のレセプター分子は被分析物の一方の部位と反応 し、第二のレセプター分子は被分析物の他の部位と反応し、第一のレセプター分 子は膜内の側方拡散から妨げられるが、第二のレセプター分子は膜内を自由に側 方拡散する、被分析物の存在を検出することに使用する膜であって、第一のレセ プター分子：第二のレセプター分子の割合が、１０：１もしくはそれ以上とする ことを特徴とする膜。 ２． 第一のレセプター分子：第二のレセプター分子の割合が、１０：１〜１０ ５：１の範囲である、請求項１記載の膜。 ３． 第一のレセプター分子：第二のレセプター分子の割合が、約１０００：１ である、請求項２記載の膜。 ４． 第一および第二のレセプター分子が、被分析物の異なるエピトープに結合 する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の膜。 ５． 膜が二重層であり、一方の層の第一半膜間モノマーと、他方の層の第二半 膜間モノマーとを含む複数のイオノホアを含有し、第一半膜間モノマーは膜内で 側方拡散しないが、第二半膜間モノマーは膜内を自由に側方拡散し、被分析物の 第一及び第二のレセプター分子への結合が膜の伝導に変化を及ぼすように、第二 のレセプター分子が第二半膜間モノマーに結合された請求項１ないし４のいずれ か１項に記載の膜。 ６． 膜が膜間脂質を含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の膜。 ７． 第一のレセプター分子が、膜間脂質に接合された請求項６に記載の膜。 ８． 旋回運動半径が約１００〜約３００オングストロームの直線状ポリマー鎖 が、膜の表面に接合され、第一のレセプター分子が直線状ポリマー鎖に接合され た請求項１ないし５のいずれか１項に記載の膜。 ９． 第一および第二の半膜間モノマーが、グラミシジンもしくはその誘導体で ある請求項４ないし８のいずれか１項に記載の膜。 １０． 膜と電極との間に空間ができるように、膜が結合分子を介して電極に接 合された請求項１ないし９のいずれか１項に記載の膜。 １１． 蛍光消光剤が第一レセプター分子に接合され、蛍光種が第二レセプター 分子に接合された請求項１ないし４のいずれか１項に記載の膜。