JPH08510231A

JPH08510231A - 有機リン化合物を検出するための方法、薬剤及びキット

Info

Publication number: JPH08510231A
Application number: JP6525185A
Authority: JP
Inventors: マシユーズ，ウエンデイ・アリソン; バンクス，ジヨン・ニコラス; チヤウドリイ，モハメド・カシム
Original assignee: Minister of Agriculture Fisheries and Food UK
Current assignee: Minister of Agriculture Fisheries and Food UK
Priority date: 1993-05-18
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1996-10-29
Also published as: AU6656694A; DE69409643D1; US5830770A; US6133049A; ATE165165T1; GB9310238D0; DE69409643T2; EP0699305A1; DK0699305T3; GR3026668T3; EP0699305B1; GB2293384B; WO1994027149A1; GB9522508D0; GB2293384A; ES2114686T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、有機リン酸エステル類、特に汎用の有機リン酸エステル殺虫剤類に特異的な新規な一般抗体に関する。さらに、これらの抗体を産生させるための化合物及び方法、該抗体を含むテストキット並びに該抗体の使用法も提供する。特に、低分子量（即ち、ＭＷ1000以下）の有機リン殺虫剤である、メタクリフォス、ピリンフォスメチル、エトリンフォス、フェニトロチオン、クロルピリフォスメチル、ジクロルボス及びマラチオンを標的とする抗体を提供する。本発明の好ましい結合体は、式（II）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｚ−［Ｙ］−タンパク質〔式中、Ｒは上記に定義の通りであり、ＺはＯ、Ｓ又は−ＮＨ−であり、Ｙはスペーサー基であり、「タンパク質」は、抗体及び抗血清を産生させるためのハプテン−タンパク質結合体に使用するのに適当なタンパク質を示す〕を有する化合物である。典型的且つ好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミン、ニワトリ卵由来のオボアルブミン、ＫＬＨ及びそれらの混合物である。

Description

【発明の詳細な説明】有機リン化合物を検出するための方法、薬剤及びキット本発明は、有機リン酸エステル類、特に汎用の有機リン酸エステル殺虫剤類に対して特異的な一般（generic）抗体に関する。さらに本発明は、ハプテン化合物及び該抗体の産生における該化合物の使用法、一般抗体を含むテストキット及び該抗体の使用法を提供する。種々の生物学的に重要な化合物の検出には多くのイムノアッセイが利用可能である。そのような化合物には、重要な有機リン酸エステル（ＯＰ）系殺虫剤が含まれる（WO91/00294号明細書を参照されたい）。これらのイムノアッセイは比較的高感度であるが、個々のＯＰ分子に向けられたものであり、従って、ＯＰの存在について効果的にスクリーニングするには数種の別個のアッセイを必要とする。食糧品、例えば、穀物の保護に一般的に用いられているこれらの有機リン殺虫剤類には、メタクリフォス（methacrifos）、ピリンフォスメチル（pirimphos m ethyl）、フェニトロチオン、エトリンフォス（etrimfos）、プロペタンフォス（propetamphos）、クロピリフォスメチル（chlopyrifos methyl）及びジクロルボス（dichlorvos）などの化合物が含まれ、これらの潜在的に毒性の化合物の存在についてスクリーニングするには通常７種の別個の薬剤の使用を必要とする。これらの化合物は、ＯＰ基自体の特性を含めていくつかの共通な化学特性を有しているが、他の一般的に用いられている殺虫剤は異なるＯＰ基を有することを特徴としている。例えばマラチオンの場合、上記に引用した化合物の（ＣＨ₃Ｏ）₂Ｐ（Ｓ）−Ｏ−基に当たるものとして（ＣＨ₃Ｏ）₂Ｐ（Ｓ）−Ｓ−基が存在する。本出願人は、２種以上のこれら特定の殺虫性有機リン化合物に対して特異的に結合するような抗体を産生させる新規方法、さらに単一の抗体試薬を用いて、選択された基のメンバーの存在についてスクリーニングし得るような抗体の使用法及び該抗体を含むキットを提供する。本出願人はさらに、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体としてのこれらの抗体又は該抗体を含む抗血清の産生に特異的に用い得る有機ハプテン化合物及びそれらの結合体を提供する。特に、メタクリフォス、フェニトロチオン、エトリンフォス、プロペタンフォス、ジクロルボスなどの化合物の中の２種以上、より好ましくは３種以上、最も好ましくは全て、及び場合によって、マラチオン、ジメトエート、クロルフェンビンフォス（chlorfenvinphos）、クロピリフォスメチル、テトラクロルビンフォス（tetrachlorvinphos）及びピリミフォス−メチル（pirimipho s-methyl）などの化合物の中の１種以上に特異的に結合し得る抗体を提供し、これらの結合化合物のそれぞれとの相対結合親和力は、単一力価（single strengt h）の抗体試薬を用いてこれらの化合物を結合し得る程度のものである。結合したＯＰが、100μg/mlの濃度で、抗体から、結合したハプテンのパーセンテージを、20、より好ましくは５、さらに好ましくは２のファクターの範囲内で互いに置換し得るのが好ましい。さらに、動物に投与したときにそのような抗体の産生を誘起するハプテン及びハプテン−タンパク質結合体をも提供する。複数の有機リン酸エステルの検出を可能にし得る１種の一般抗体又は抗血清を産生させるという概念は、Suedi及びHeesham Kiel：（1988）Milchwirt Forsch 40 179-202により既に一度考察されているが、これは、複数のモデル殺虫剤分子を用いて複数のタンパク質結合体を得ることを含むものであった。さらに、得られた抗体試薬は信頼性のあるスクリーニングには使用し得ないものであった。本発明の第１の態様において、部分化学構造Ｉ：（ＲＯ）₂Ｐ（Ｓ）−Ａ− （Ｉ）〔ここで、Ｒは低級アルキル、特にＣ_1-4アルキルであり、ＡはＯ又はＳである〕を含む化合物に対して特異的な結合親和性を有する抗体の産生を刺激し得るハプテン−タンパク質結合体を提供し、該抗体は、メタクリフォス、フェニトロチオン、プロペタンフォス、ジクロルボス、ジメトエート、マラチオン、クロルフェンビンフォス及びエトリンフォスなどの化合物中の２種以上、好ましくは３種以上、最も好ましくは全てと結合し、好ましくはさらにクロピリフォスメチル、テトラクロルビンフォス及びピリミフォス−メチルとも結合することを特徴とする。該結合体が部分構造（Ｉ）〔ここで、Ｒはメチルであり、好ましくはＡはＯである〕を標的とする抗体の産生を誘起し、該部分構造を有する化合物と比較したときの他の化合物との交差反応性が十分に低く、既知の抗体濃度で結合させることにより混合物中の標的化合物を容易に同定し得ることが最も好ましい。本発明の好ましいハプテン−タンパク質結合体は、式（II）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｚ−［Ｙ］−タンパク質（II）〔式中、Ｒは部分構造（Ｉ）に定義の通りであり、ＺはＯ、Ｓ又は−ＮＨ−であり、Ｙはスペーサー基であり、「タンパク質」は、抗体及び抗血清を産生させるためのハプテン−タンパク質結合体に使用するのに好適なタンパク質を示す〕を有する化合物である。典型的且つ好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミン、ニワトリ卵由来のオボアルブミン、ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）及びこれらの混合物である。タンパク質との結合はそのアミノ基の中の１つによるのが好ましい。好ましいスペーサー基は、式−（ＣＨ₂）_n−Ｂ−〔式中、ｎは炭素鎖長が４〜６個になるようなものであり、ＢはＣＯ又はＯ（ＣＯ）である〕を有するか、又はＣＯ若しくはＯ（ＣＯ）基を含むピリジン又はピリミジン環である。場合によってスペーサーは、例えばWO9100294号明細書に開示されているβ−アラニンのような化合物におけるような側鎖を有していてよいが、本発明の最も好ましい結合体は、４〜６個の直鎖状炭素鎖、例えば、１，４−ブタンジオールスペーサー〔この場合、ＺはＯであり、Ｂは−ＯＨ末端基をカルボジイミドを用いて活性化して得られる−Ｏ（ＣＯ）−である〕を有する。適当なハプテンの例を以下に列挙する：（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ブタンジオールスペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ブタンジオールスペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（３炭素スペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（３炭素スペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（２炭素スペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（２炭素スペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＳＨ結合スペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＳＨ結合スペーサー））（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ピリジンスペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ピリジンスペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ピリミジンスペーサー）（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ピリミジンスペーサー）本発明の第２の態様において、化合物（II）の製造に用いるための式（III）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｚ−（Ｙ）−Ｂ−（Ｄ）（III）〔式中、Ｒ、Ｚ、Ｂ及びＹは上記と同義であり、ＤはＨ又は活性化基である〕のハプテン化合物を提供する。典型的な活性化基は、カルボジイミドを用いた活性化により残されるタイプのイミダゾール残基のような基であるが、Ｂが該化合物とタンパク質のアミノ基との反応を活性化し得る酸ハロゲン化物を形成するようなＣＯである場合にはハロゲン原子を用いてもよい。特に、式（IV）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（Ｙ）−Ｂ−（Ｄ）（IV）〔式中、Ｙは、側鎖を含むか又は含まない４個の炭素長のスペーサー、好ましくは−（ＣＨ₂）₄−部分構造である〕のハプテン化合物を提供する。ＢがＯ−ＣＯ−であり、Ｄがイミダゾール残基であるのが最も好ましい。ＤがＨの場合、化合物は不活性化ハプテンであり、そうでなければ、化合物は活性化形態にある。さらに本発明は、式（II）、（III）及び（IV）のハプテン及び結合体の合成法を提供し、該方法において、ジアルキルハロチオホスフェートをスペーサー基前駆体と反応させてハプテンを生成させる。次いで得られたハプテンを活性化部分構造で活性化して活性化生成物を得、常法で該生成物をタンパク質と結合させて式（II）のタンパク質結合体を得る。ジアルキルハロチオホスフェート／スペーサー基反応は、塩基、例えば、ピリジンを含む有機溶媒相中、例えば-５〜10℃の範囲、好ましくは０〜５℃の範囲の低温で行うのが便利である。アセトン溶媒を用いるのが便利である。好ましくは、反応混合物をスペーサー基と共にふり混ぜるか撹拌して溶媒／塩基混合物に溶解し、該混合物にジアルキルハロチオホスフェートをゆっくり加え、好ましくは約60℃で数時間、最も好ましくは約２時間還流させる。ハプテンの活性化は、カルボジイミド、例えば、カルボニルジイミダゾールを用い、公知の方法で行うのが便利であり、次いでこの活性化ハプテンと選択されたタンパク質とを結合する。これらの本発明結合体を用いて産生される抗体及び抗血清は、任意の慣用の動物ドナーを用い、当業界において慣用的に用いられている任意の方法により産生させ得る。さらにそのようにして産生された抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。モノクローナル抗体は当業者が熟知しているであろうハイブリドーマ技術により誘導され得る。ＯＰの式については図１及び図２を参照されたい。本発明はさらに、本発明の抗体又は抗血清と、標的有機リン酸エステルの存在の測定に適する他の成分とからなるテストキットを提供する。そのような成分は、既知量の標的ＯＰ化合物を含む較正試薬であってもよいし、又は支持体、例えば、マイクロタイターウエルプレートなどの上に固定化された抗体の形態を取ってもよく、これにより抗体のタイターの測定に適当な波長、例えば450nmでの吸光度が容易に得られ、あるいは、特定の緩衝液、ブロッキング剤又は発色剤のような他の試薬であってもよい。典型的なキットフォーマットが WO9100294号明細書に記載されている。抗体及び抗体を含む抗血清の産生並びにアッセイにおけるそれらの使用は公知の方法を用いて行なわれ、実施例に示されている。以下の非限定的実施例を参照しながら、単に例としてのみ本発明のハプテン、結合体、抗体、抗血清及び方法を説明する。実施例１：式（III）及び（IV）の一般有機リン酸エステル抗体産生結合体ハプテン中間体の合成ピリジン10mmol（0.79g）をアセトン５mlに溶解し、溶液を氷上に維持した。これに、１，４−ブタンジオール10mmol（0.90g）を加え、磁気撹拌器を用いて冷却混合物を絶えずふりまぜながら、10mmol（1.61g）のジメチルクロロチオホスフェート（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）Ｃｌをゆっくり加えた。反応物質を60℃で２時間還流し、次いで室温で一晩放置した（反応Ａ）。反応物質混合物を３×25mlのジエチルエーテルで抽出して最終生成物を精製し、これを３×10mlのＨ₂Ｏで洗浄し、次いで約２〜３mlの最終量に蒸発させた。ＴＬＣ（クロロホルム：アセトン70：30中のＲｆ＝0.1）により、（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ −（ＣＨ₂）₄−ＯＨ（分子量214）が形成されたことが示され、これをＧＣ／ＭＳにより確認した。実施例２：ハプテンの活性化実施例１で得た生成物エーテル溶液を10mmol（1.62g）のカルボニルジイミダゾールで処理し、活性化ハプテン溶液を得た。（注：Ｂがカルボキシル基の場合には、ハロゲン化チオニルを用いて公知の方法により対応する酸ハロゲン化物を得てもよい）。実施例３：タンパク質結合体の形成３種のタンパク質溶液のそれぞれに、１mlのエーテル性溶液の形態の実施例２で得た活性化ハプテン３mmolを、磁気撹拌器を用いて絶えず撹拌しながら極めてゆっくり−５分毎に１滴ずつ−加えた。該タンパク質溶液はそれぞれ、10mlのリン酸緩衝塩水（ｐＨ7.4）中30μmolのＢＳＡ若しくはオボアルブミン又は３nmolのＫＬＨを含むものであった。反応物質を２時間ゆっくり撹拌し、室温で一晩、次いで４℃で72時間放置した（反応Ｂ参照）。ブラッドフォードのクーマシーブルー法：Analytical Biochem．（1976）72: 248- 254を用いて、結合体溶液をタンパク質の濃度について分析した。Analytical Bi ochem．（1966）14: 328-336に記載のHabeebの遊離アミノ基法により結合比率を測定すると、ＯＰ：ＢＳＡが10で、ＯＰ：オボアルブミンが４であった。カラムにかける前の予備段階として不溶又は殆ど不溶の結合体の透析を蒸留水に対して行ってから、結合体をSephadex（PD10）カラムにかけて精製した。実施例４：一般結合体に対するポリクローナル抗体の産生シモーヌノワール（Simone Noir）ハーフロップ種のウサギを１匹ずつ囲いに入れ、３週間安静にしてから予備免疫感作血液試料を採取して免疫感作スケジュールを開始した。先ず、最終濃度がタンパク質約１mg/mlになるようにハプテン−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）結合体を等量のフロイントアジュバントと混合した。テストを行って結合体に対して反応性の天然抗体が不在であることを確認した後で、各ウサギに、完全アジュバント中の実施例３のＢＳＡ−般結合体１mlを４部位（１部位当たり0.25ml）に皮下注射した。次いで４、８及び12週目に不完全アジュバント中の結合体を注射した。抗体の力価が低下し始めたときに、フロイントの不完全アジュバント中の結合体１mlを４部位に注射してウサギにさらに追加免疫した。以下の表において、ウサギＲ19、20、21には、10：１のＯＰハプテン：タンパク質比の本発明の一般結合体を用いて免疫感作した。次いで抗血清のストックを作製するために、抗体検査用に免疫感作する前及び注射後４週及び14週目に辺縁耳静脈から血液を採取した。血液を４℃で一晩凝固させて抗血清を作製し、次いで遠心して透明な液体を得た。該液体から、慣用法により、イオン交換クロマトグラフィー又は固定化標的有機リン酸エステル基を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーを使用して必要な抗体を単離することができた。実施例５：式（Ｉ）の部分構造に対する抗血清の親和性を示す間接：抗体捕獲酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ＥＬＩＳＡを用い、以下のプロトコルを用いて、本発明の一般ハプテン／結合体に対するポリクローナル抗体を得るために抗血清をスクリーニングした。適切なオボアルブミンとハプテンとの結合体を0.05Mの炭酸水素ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ9.6）に希釈してチェッカー板滴定により既に測定された１μg/mlの最適タンパク質濃度を得、マイクロタイタープレート（Costar）を該溶液でコーティングした。タンパク質はブラッドフォードアッセイにより測定した。各マイクロタイタープレートウエルに100μlを加え、プレートを一晩湿室に置き、0.05％のTween 20〔ＲＴＭ〕を含む0.15Mのリン酸緩衝塩水（ｐＨ7.2）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、水分を吸取って乾燥させた。１ウエル当たり250μlの５％脱脂乳を加え、25℃で１時間ブロッキングした。さらに２回洗浄した後、コーティングしたマイクロプレートを必要になるまで −20℃で貯蔵し、次いでＰＢＳＴで１回洗浄した。抗血清をＰＢＳＴに希釈（一般的なスクリーニング用には１／10 00、又は滴定アッセイ用には１／512,000までの二倍希釈）し、50μl量のものを３つ作ってマイクロタイターウエルに加え、湿室中、25℃で１時間インキュベートした（適切な陽性及び陰性対照は、ＰＢＳＴ、陰性ウサギ血清及び産生時の陽性血清を含んでいた）。次いでウエルをＰＢＳＴで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（DAKO）に結合したブタ抗ウサギ免疫グロブリンの１：1500希釈物 200μlを各ウエルに加えた。プレートをもう一度25℃で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。ＤＭＳＯ中6.0g/lのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）400μlを、100μlの１％Ｈ₂Ｏ₂を含む0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.5）24.5mlに加えて、ＴＭＢ酵素基質溶液を調製し、この100μlをウエルに加えた。マイクロプレートを暗所で15分間25℃でインキュベートした後、50μlの2.5MＨ₂ＳＯ₄を加えて反応を停止し、450nmでの空気に対する吸光度を読み取った。結果を実施例６の結果と共に以下に示す。実施例６：競合／阻害アッセイこのアッセイは実施例５と同じ方法に以下の変更を加えて行った。プレートをコーティングした後、種々の希釈度の抗血清を種々の濃度の被検体溶液と共に25 ℃で１〜２時間又は４℃で一晩インキュベートした。試験した抗血清の希釈度は、１／1000、１／2000、１／5000及び１／10000であり、分析物の濃度は200〜0. 001μg/mlの範囲であった。一般ハプテン−オボアルブミンのコーティングは１ μg/mlであり、後に他のコーティング強度を試験したところ、400〜12.5ng/mlの範囲であった。注：プレートをブロッキング剤若しくはＢＳＡ又はオボアルブミンを用いて１μg/mlでコーティングした間接ＥＬＩＳＡを行って全ての場合の交差反応性を検査した。脱脂乳、ウシ胎児血清（共に５％）、セシン（caesin）（ 0.3％）又はサカナの皮膚のゼラチン（0.5％）をこの場合のブロッキング剤として選択した。交差反応性の測定には競合アッセイを用いるのが好ましい。結果：４週及び16週目に回収した血清は結合体に対して反応性であることが示され、16 週目のチェッカー板滴定（表１及び表２を参照）は、３種のウサギ血清が全て高度に反応性であることを示した。結合体を用いたウエルの最適なコーティングは約１μg/mlで達成されることが立証され、抗血清の場合には高吸光度を、陰性の場合には低吸光度を得た。スペーサー部分構造又はタンパク質のみとの交差反応が生起され得ることに留意されたい。脱脂乳でコーティングし、ゼラチンでブロッキングしたプレートは、有効なＥＬＩＳＡを得るのに十分な程、該交差反応を回避し得ることが示された。表３は競合／阻害ＥＬＩＳＡの結果を示しており、該結果は、最適感度を得るためにはコーティングレベルが１μg/ml未満でなければならないこと、例えば、 200〜0.001μg/mlの被検体の検出には400〜0.012μg/mlの結合体を必要とすることを示している。実施例７：改変競合阻害アッセイ実施例５と同様な方法に以下の変更を加えてアッセイを実施した。抗血清をＰＢＳＴ中１％のＢＳＡで１：2000に希釈し、100μlを微小滴定プレート中各濃度の非結合ＯＰ（この場合は一般的な部分）100μlと共に25℃で２時間インキュベートした。ＯＰの濃度は200〜0.001μg/mlの範囲であった。種々の有機リン殺虫剤を用いた阻害ＥＬＩＳＡによるウサギ19、20及び21由来の抗血清の交差反応性を表５に示す。該表において、50％阻害が発生する濃度（ μg/ml）を、その中において50％阻害が生じた希釈剤、即ちＰＢＳＴ、又はＰＢＳＴ中のメタノール％を表す数字と共に示す。実施例７から得た結果に示されている一般結合体抗体に対する種々の有機リン酸エステルの相対親和力を、100μg/mlの有機リン酸エステルを用いて得られた結合阻害量から0.1μg/mlの有機リン酸エステル濃度における結合阻害量を減算して誘導されたものとして以下に示す。結果は、阻害剤としてスペーサーを含むハプテンを用いて得られた阻害に対する％として示されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月７日【補正内容】請求の範囲１．式（Ｉ）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｚ−［Ｙ］−タンパク質（Ｉ）〔式中、Ｒは低級アルキルであり、ＺはＯ、Ｓ又は−ＮＨ−であり、Ｙはスペーサー基であり、「タンパク質」は、抗体及び抗血清を産生させるためのハプテン −タンパク質結合体中のタンパク質としての使用に適当なタンパク質を示す〕を有するハプテン−タンパク質結合体であって、基Ｙの構造は、前記結合体が、化学部分構造（II）：（Ｒ′Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ａ− （II）〔式中、Ｒ′は低級アルキルであり、ＡはＯ又はＳである〕を含み基Ｙを含まない２種以上の化合物に対して特異的な結合親和性を有する抗体の産生を誘起させ得るようなものであることを特徴とする結合体。２．抗体が、以下の化合物、メタクリフォス、フェニトロチオン、プロペタンフォス、ジクロルボス、ジメトエート、マラチオン、クロルフェンビンフォス、エトリンフォス、クロルピリフォス−メチル、テトラクロルビンフォス及びピリミフォス−メチルの中の２種以上に結合する請求項１に記載の結合体。３．抗体は、２種以上の化合物と、これらの化合物全てが100μg/mlの濃度で抗体から結合したハプテンと20％の範囲内で互いに置換し得るような親和力をもって結合する請求項２に記載の結合体。４．相対結合親和力が、前記パーセンテージが５％の範囲内の程度である請求項３に記載の結合体。５．結合化合物が、化合物メタクリフォス、フェニトロチオン、プロペタンフォス、ジクロルボス及びジメトエートを含む請求項１から４のいずれか一項に記載の結合体。６．結合化合物が、化合物メタクリフォス、フェニトロチオン、プロペタンフォス、ジクロルボス、ジメトエート、マラチオン、クロルフェンビンフォス及びエトリンフォス全てを含む請求項２から５のいずれか一項に記載の結合体。７．スペーサー基が、式−（ＣＨ₂）_n−Ｂ−〔式中、ｎは４〜６個の炭素鎖長を与えるものであり、Ｂは−ＣＯ−又は−Ｏ−ＣＯ−である〕を有する請求項１から６のいずれか一項に記載の結合体。８．スペーサー基が１種以上の側鎖で置換された請求項７に記載の結合体。９．スペーサーが−（ＣＨ₂）₄−Ｏ−ＣＯ−部分構造によって与えられる請求項７に記載の結合体。１０．式：（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質の中のいずれか一つを有する請求項１から６のいずれか一項に記載の結合体。１１．タンパク質が、ウシ血清アルブミン、ニワトリ卵由来のオボアルブミン及びＫＬＨから選択される請求項１から１０のいずれか一項に記載の結合体。１２．請求項１から１１のいずれか一項に記載のハプテン−タンパク質結合体の製造に用いるための式（III）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｚ−（Ｙ）−Ｂ−（Ｄ）（III）のハプテン化合物であって、該式中、Ｒ、Ｚ、Ｂ及びＹは請求項１から１１のいずれか一項に記載の通りであり、Ｄは、Ｈ、又は該化合物とタンパク質との反応を増強し得る活性化基であるハプテン化合物。１３．Ｂが−Ｏ−ＣＯ−の場合、活性化基はカルボジイミドを用いて活性化することにより残されるタイプのカルボニルイミダゾール残基であり、ＢがＣＯの場合、活性化基はハロゲン原子である請求項１２に記載のハプテン化合物。１４．式（IV）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（Ｙ）−Ｂ−（Ｄ）（IV）〔式中、Ｙは、側鎖を含むか又は含まない４個の炭素長のスペーサーである〕を有する請求項１２に記載のハプテン化合物。１５．Ｙが−（ＣＨ₂）₄−部分構造である請求項１４に記載のハプテン化合物。１６．（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−ＣＯＯＨから選択された一つの式を有することを特徴とする請求項１２から１５のいずれか一項に記載のハプテン化合物。１７．ジアルキルハロチオホスフェートをスペーサー基と反応させてハプテンを生成させる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）、（III）及び（IV）のハプテン及び結合体の合成法。１８．次いで得られたハプテンを活性化部分構造で活性化して活性化生成物を得、該生成物をタンパク質と反応させて式（Ｉ）のタンパク質結合体を得る請求項１７に記載の方法。１９．場合によって不完全又は完全アジュバントの存在下に、請求項１から１１のいずれか一項に記載のハプテン−タンパク質結合体を用いて動物を免疫感作し、抗体誘導期後に該動物から血液を採取し、該血液から血清及び／又は抗体を分離することにより得ることができる抗血清又は該抗血清から単離若しくは精製された抗体。２０．式（II）の固定化化合物との親和性結合を用いて抗血清から得られた請求項１９に記載の抗体。２１．アフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて親和性結合させる請求項１９に記載の抗体。２２．請求項１９から２１のいずれか一項に記載の抗血清及び／又は抗体並びに試料中の有機リン殺虫剤についてのイムノアッセイの実施に必要な１種以上の他の試薬又は成分を含むことを特徴とするイムノアッセイテストキット。２３．抗血清及び／又は抗体が特定動物中で産生され、１種以上の他の試薬が標識形態で該特定動物由来の免疫グロブリンに対して産生された抗体からなる請求項２２に記載のイムノアッセイテストキット。２４．標識形態が、前記特定動物由来の免疫グロブリンに対して産生され、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗体からなる請求項２３に記載のイムノアッセイテストキット。２５．既知量の標的ＯＰ化合物又は式IIIのハプテン化合物を含む１種以上の試薬をさらに含む請求項２３又は２４に記載のイムノアッセイテストキット。２６．固体支持体上に固定化されたタンパク質−ハプテン結合体に対する抗体を含む請求項２３から２５のいずれか一項に記載のイムノアッセイテストキット。２７．０〜50％のメタノール、ブロッキング剤及び／又は発色剤を含む緩衝液をさらに含む請求項２３から２６のいずれか一項に記載のイムノアッセイテストキット。２８．式（II）の部分構造を有する化合物の存在についてのスクリーニング法であって、該化合物と請求項１９から２１のいずれか一項に記載の抗体との結合を同定する段階を含むことを特徴とする方法。２９．１種の抗血清又は抗体試薬を用いて、メタクリフォス、フェニトロチオン、プロペタンフォス、ジクロルボス、ジメトエート、クロルフェンビンフォス、エトリンフォス、クロルピリフォス−メチル、テトラクロルビンフォス、ピリミフォス−メチル及びマラチオンの中の２種以上の存在を同定するのに適当な請求項１８から２７のいずれか一項に記載のテストキット又は方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バンクス，ジヨン・ニコラスイギリス国、バークシヤー・エス・エル・３・７・エイチ・ジエイ、スロウ、ロンドン・ロード、シー・エス・エル（番地なし) (72)発明者チヤウドリイ，モハメド・カシムイギリス国、バークシヤー・エス・エル・３・７・エイチ・ジエイ、スロウ、ロンドン・ロード、シー・エス・エル（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．化学部分構造Ｉ：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ａ− （Ｉ）〔ここで、Ｒは低級アルキルであり、ＡはＯ又はＳである〕を含む化合物に対して特異的な結合親和性を有する抗体の産生を誘起し得るハプテン−タンパク質結合体であって、抗体が、メタクリフォス、フェニトロチオン、プロペタンフォス、ジクロルボス、ジメトエート、マラチオン、クロルフェンビンフォス、エトリンフォス、クロルピリフォス−メチル、テトラクロルビンフォス及びピリミフォス−メチルなどの化合物の中の２種以上と結合することを特徴とする結合体。２．抗体は、化合物全てが100μg/mlの濃度で、抗体から、結合したハプテンを2 0％の範囲内で互いに置換し得るような親和力をもって２種以上の化合物と結合する請求項１に記載の結合体。３．相対結合親和力は、そのパーセンテージが５％の範囲内の程度である請求項２に記載の結合体。４．結合化合物が、メタクリフォス、フェニトロチオン、プロペタンフォス、ジクロルボス及びジメトエートなどの化合物を含む請求項１から３のいずれか一項に記載の結合体。５．結合化合物が、メタクリフォス、フェニトロチオン、プロペタンフォス、ジクロルボス、ジメトエート、マラチオン、クロルフェンビンフォス及びエトリンフォスなどの化合物全てを含む請求項１から４のいずれか一項に記載の結合体。６．式（II）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｚ−［Ｙ］−タンパク質（II）〔式中、Ｒは請求項１から４のいずれか一項に定義の通りであり、ＺはＯ、Ｓ又は−ＮＨ−であり、Ｙはスペーサー基であり、「タンパク質」は、抗体及び抗血清を産生させるためのハプテン−タンパク質結合体中のタンパク質としての使用に好適なタンパク質を示す〕を有する化合物であることを特徴とするハプテン−タンパク質結合体。７．タンパク質が、ウシ血清アルブミン、ニワトリ卵由来のオボアルブミン及びＫＬＨから選択される請求項６に記載の結合体。８．スペーサー基が式−（ＣＨ₂）_n−Ｂ−〔式中、ｎは４〜６個の炭素鎖長を与えるようなものであり、Ｂは−ＣＯ−又は−Ｏ−ＣＯ−である〕を有する化合物である請求項６又は７に記載の結合体。９．スペーサー基が１種以上の側鎖で置換される請求項６から８のいずれか一項に記載の結合体。１０．スペーサーが−（ＣＨ₂）₄−Ｏ−ＣＯ−部分構造によって与えられる請求項８に記載の結合体。１１．式：（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質の中のいずれか位置一つを有する化合物である請求項６から１０のいずれか一項に記載の結合体。１２．式（III）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｚ−（Ｙ）−Ｂ−（Ｄ）（III）の化合物であって、該式中、Ｒ、Ｚ、Ｂ及びＹは請求項１から９のいずれか一項に記載のものであり、ＤはＨ又は該化合物とタンパク質との反応を増強し得る活性化基である化合物。１３．Ｂが−Ｏ−ＣＯ−の場合、活性化基はカルボジイミドを用いて活性化することにより残されるタイプのカルボニルイミダゾール残基であり、ＢがＣＯの場合、活性化基はハロゲン原子である請求項１２に記載の化合物。１４．式（IV）：（ＲＯ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（Ｙ）−Ｂ−（Ｄ）（IV）〔式中、Ｙは、側鎖を含むか又は含まない４個の炭素長のスペーサーである〕を有する請求項１１に記載の化合物。１５．Ｙが−（ＣＨ₂）₄−部分構造である請求項１４に記載の化合物。１６．（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリジン−ＣＯＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−ＯＨ（ＣＨ₃Ｏ）₂−Ｐ（Ｓ）−Ｏ−ピリミジン−ＣＯＯＨから選択される式を有することを特徴とする請求項１２から１５のいずれか一項に記載の化合物。１７．ジアルキルハロチオホスフェートをスペーサー基と反応させてハプテンを生成させる、請求項２から１６のいずれか一項に記載の式（II）、（III）及び（IV）のハプテン及び結合体の合成法。１８．次いで得られたハプテンを活性化部分構造で活性化して活性化生成物を得、該生成物をタンパク質と反応させて式（II）のタンパク質結合体を得る請求項１７に記載の方法。１９．場合によって不完全又は完全アジュバントの存在下に、請求項１から１１のいずれか一項に記載のハプテン−タンパク質結合体を用いて動物を免疫感作し、抗体誘導期後に該動物から血液を採取し、該血液から血清及び／又は抗体を分離することにより得られる、抗血清又は該抗血清から単離若しくは精製された抗体。２０．式（Ｉ）の固定化化合物との親和性結合を用いて抗血清から得られた請求項１９に記載の抗体。２１．親和性結合がアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて行われる請求項１９に記載の抗体。２２．請求項１９から２１のいずれか一項に記載の抗血清及び／又は抗体、並びに試料中の有機リン殺虫剤についてのイムノアッセイの実施に必要な１種以上の他の試薬又は成分を含むことを特徴とするイムノアッセイテストキット。２３．抗血清及び／又は抗体が特定動物中で産生され、１種以上の他の試薬が標識形態で該特定動物由来の免疫グロブリンに対して産生された抗体からなる請求項２２に記載のイムノアッセイテストキット。２４．標識形態が、前記特定動物由来の免疫グロブリンに対して産生され、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗体からなる請求項２３に記載のイムノアッセイテストキット。２５．既知量の標的ＯＰ化合物又は式IIIのハプテン化合物を含む１種以上の試薬をさらに含む請求項２３又は２４に記載のイムノアッセイテストキット。２６．固体支持体上に固定化されたタンパク質−ハプテン結合体に対する抗体を含む請求項２３から２５のいずれか一項に記載のイムノアッセイテストキット。２７．０〜50％のメタノール、ブロッキング剤及び／又は発色剤を含む緩衝液をさらに含む請求項２３から２６のいずれか一項に記載のイムノアッセイテストキット。２８．式（Ｉ）の部分構造を有する化合物の存在についてスクリーニングする方法であって、該化合物と請求項１９から２１のいずれか一項に記載の抗体との結合を同定する段階を含むことを特徴とする方法。２９．１種の抗血清又は抗体試薬を用い、メタクリフォス、フェニトロチオン、プロペタンフォス、ジクロルボス、ジメトエート、クロルフェンビンフォス、エトリンフォス、クロルピリフォス−メチル、テトラクロルビンフォス、ピリミフォス−メチル及びマラチオンの中の２種以上の存在を同定するのに適当な請求項１８から２７のいずれか一項に記載のテストキット又は方法。