JPH08510331A

JPH08510331A - 多分析物均質蛍光免疫検定用の装置および方法

Info

Publication number: JPH08510331A
Application number: JP6525810A
Authority: JP
Inventors: ヘロン，ジェームズ，エヌ．; クリステンセン，ダグラス，エー．; ワン，フ−クン; コールドウェル，カリン，ディー．; ヤナトワ，ヴェラ; ホアン，シャオ−チー
Original assignee: ユニヴァーシティオブユタリサーチファンデーション
Priority date: 1993-05-18
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1996-10-29
Anticipated expiration: 2018-07-14
Also published as: ES2169079T3; DK0700514T3; EP0700514B1; JP3426602B2; DE69429262T2; DE69429262D1; WO1994027137A3; AU7311694A; ATE209782T1; WO1994027137A2; CA2162996C; AU704947B2; EP0700514A1; CA2162996A1

Abstract

(57)【要約】消失性光蛍光免疫検定の方法および装置を開示する。本装置は、一体化された半円筒形レンズ（５０２）を有する平らな導波管（１２４）を使用し、多分析物および校正の特徴を有すると共に、消失性光界強度が改良されている。バイオセンサー（１２０）および検定方法の好ましい実施態様は、単一の貯蔵部（６６０）内に隣接して配置された、異なった分析物（２１０）に対してそれぞれ特異的な捕獲分子（７２０）のパッチ（６６２）を有する。捕獲分子（７２０）は、捕獲分子（７２０）上のチオール基を光親和力架橋剤（７０６）に部位特異的に結合させ、その架橋剤が導波管表面（７００）に、または表面（７００）上の耐非特異的結合性の被覆に結合されることにより、導波管表面上のパッチ（６６２）に固定される。異なった抗体のパッチ（６６２、６６４、６６６）は、光親和力架橋剤（７０６）を結合させる方法の際に、導波管表面（７００）の部分（７１４）を、マスク（７１２）、レーザー光源等を使用して選択的に照射することにより製造される。

Description

【発明の詳細な説明】多分析物均質蛍光免疫検定用の装置および方法発明の背景技術分野：本出願は、蛍光結合検定により特定物質の試料を分析する分野に、より詳しくは、消失性光を使用するその様な検定を行なうための装置、組成物および方法に関する。先行技術：トレーサー分子の蛍光により分析物を光学的に検出する系のバイオセンサー装置は、近年、ますます注目されている。その様な装置は、診断および研究の両方の目的に有用である。特に、所望の分析物に対して特異性がある抗体または抗体断片を基材に固定し、分析物と抗体の結合が直接または間接的に（例えば標識を付けたトレーサーにより）蛍光信号を生ずる、固相蛍光免疫検定用のバイオセンサーは、重要な光学的バイオセンサーの一種になりつつある。ほんどの固相蛍光免疫検定では、十分な感度を達成するために、蛍光を測定する前に、結合していないトレーサーを除去するための“洗浄”工程が必要である。この問題は、血液、血清および尿を含む体液中で問題とする多くの分析物の場合の様に、ナノモル未満の濃度で存在する分析物の検出に特に当てはまる。しかし、洗浄工程は時間がかかり、再現性がある正確な結果を得るためには、技術者の側の注意が必要である。したがって、洗浄工程なしに、１０^-10〜１０^-13モル又はそれ以下の分析物濃度に対する感度が達成される蛍光免疫検定方式を提供することが強く望まれている。全内部反射（略してＴＩＲ）と呼ばれる光学技術が、その様な方式に近づく一つの道を与える。消失性（evanescent）光は、導波管中を伝わる光線が、導波管と周囲の、より低い屈折率を有する媒体との間の界面で完全に内部反射する場合に生じる光である。内部反射された光の電磁界の一部が周囲の媒体中に透過し、消失性光界を構成する。消失性光の強度は、導波管表面からの距離と共に指数的に低下する。蛍光免疫検定では、消失性光を使用し、固定された結合剤に直接または間接的に結合したトレーサー分子を選択的に励起することができるが、消失性光透過距離を越える溶液中にある遊離なトレーサー分子は励起されず、したがって“背景”蛍光に寄与しない。蛍光測定に消失性光界特性を使用することは、消失性光感知と呼ばれることがある。ガラスまたは類似のシリカ系材料、あるいはポリスチレンの様な光学プラスチックには、周囲媒体が水溶液である場合、消失性光による有効励起区域は一般的に導波管表面から約１０００〜２０００Å（オングストローム）である。この深度は、溶液中に遊離しているトレーサー分子の多くを励起せずに、導波管表面上の捕獲分子（抗体、レセプター分子等およびそれらの断片）の大部分を励起するのに十分である。この様にして生じる蛍光が、固定捕獲分子に結合したトレーサーの量、したがって存在する分析物の量を反映する。トレーサー蛍光は消失性光的に導波管の中にも逆透過し、その中で伝播される。導波管により消失性光を効果的に集めるための最大溶液深度は、溶液中への消失性光透過区域の深度に近似しているので、トレーサー蛍光の導波管透過部分は、導波管に結合したトレーサーから来る蛍光を選択的に測定することにも使用できる。 Carterへの米国特許第ＲＥ３３，０６４号、Flanaganらへの第５，０８１，０１２号、Keckへの第４，８８０，７５２号、Attridgeへの第５，１６６，５１５号、およびSlovacekおよびLoveへの第５，１５６，９７６号、および欧州特許出願公開第０５１７５１６号および第０５１９６２３号（両方ともSlov acek等によるもの）はすべて消失性光感知原理を使用する蛍光免疫検定用装置を開示している。免疫蛍光バイオセンサーは、１０^-12Ｍ（モル）以下の濃度で分析物分子を検出できるのが望ましい。これまで、消失性光型バイオセンサーのほとんどの報告は、せいぜい１０^-11Ｍの濃度が検出できるだけであることを示している。さらに、“日常”の試験、例えば血液銀行試料のウィルス抗体に対する試験、におけるスピードおよび便利さに関して、使い捨てでありかつ多試料測定能力がある消失性光免疫蛍光バイオセンサーが望ましい。多試料能力により、試験試料および比較試料（例えばブランク、陽性比較、あるいは競合型検定の場合は、トレーサー分子を予め加えた試料）を同時に発光させ、測定することができる。また、同時多試料能力により、複数の試料を分析する工程が迅速化され、代表的な光源で起こることが分かっている励起光の水準変動の影響が少なくなろう。しかし、Blockらの米国特許第４，９０９，９９０号、１９９０年３月２０日公布、の装置の様な、典型的な先行技術の消失性光装置では、導波管がファイバー光学ロッドであり、その形状のために多貯蔵部（マルチウエル）バイオセンサーの構築は困難である。得られる感度に影響するもう一つのファクターは、導波管から放射される励起光の強度に関連する。トレーサー分子から放射される蛍光の強度は、一部、励起光（これは消失性光界である）の強度に依存する。したがって、消失性光強度が増加すると、蛍光が増加し、それによって検出感度が改良される。消失性光の水準は、導波管中を伝播する光線の強度に依存し、これは導波管の断面積の減少により増加させることができる。消失性光バイオセンサーにおいて抗体を光学基材に固定する従来の方法も、感度低下を引き起こす幾つかの問題を有する。その様な方法の多くは、タンパク質中のリシン残基物のε−アミノ基を利用している。この方法には、ほとんどのタンパク質は複数のリシン残基を有するために、少なくとも二つの重大な欠点がある。第一に、複数の潜在的結合部位（複数のリシン残基）の存在が、基材表面上で抗体の複数の不規則配向を引き起こす。基材と結合したリシン残基が抗体分子のＮ−末端に近い場合、抗体の（Ｎ−末端近くにある）抗原結合部位は分析物を結合するために効果的に利用されないことがある。第二に、同じ抗体分子上の複数のリシンが基材と結合する場合、その分子は構造的なひずみを受け、抗原結合部位をねじ曲げ、その結合効率を変化させる。典型的な先行技術の方法により固定された捕獲分子に関しては、一般的に分析物結合に対して、結合部位の２０％以下しか機能しない。したがって、捕獲分子が一様に配向し、分析物の結合に使用できる様に、抗体または他のタンパク質を結合するための部位に特異的な方法が望ましい。もう一つの問題は、光学基材の抗体被覆した表面に非特異的に結合する程度に関連している。これらの程度が高いために、約１０^-10Ｍ未満の濃度で分析物を検出するのが非常に困難になる場合が多い。非特異的結合は、試料を被覆基材で培養した後、結合していないトレーサー分子を除去するために洗浄工程を含むことにより、減少させることができる。しかし、上に説明した様に、洗浄工程は好ましくない。第二に、非特異的結合は、ウシ血清アルブミンの様なマスキング剤またはポリ（エチレングリコール）またはポリ（メタクリルレート）の様な親水性重合体で表面を “不動態化”しない限り、深刻な問題になることがある。その様な不動態化（これは手順にさらに別の工程を加える）を行なわないと、非特異的結合は、特異的結合の５０％以上にもなることがある。不動態化した表面でも、非特異的結合は、検出感度および再現性を下げるのに十分である場合がある。したがって、均質検定（均質とは、本出願の目的に関しては、洗浄工程を必要としない検定として定義する）で所望の感度を与える消失性光バイオセンサーが必要とされている。さらに、ピコモル濃度以下で分析物を検出するための、改良された感度を有する装置が必要とされている。また、非特異的結合が低く、一様に配向した捕獲分子を有する、免疫検定およびバイオセンサーも必要とされている。安価で、熟練していない人でも容易に使用できるバイオセンサーおよび検定方式も必要とされている。発明の概要本発明は、１種類以上の分析物をピコモル未満の濃度で検出できる、消失性光原理に基づく均質免疫蛍光検定用の装置および方法の両方を含む方式に関する。この装置では、導波管の縁部または末端に導入され、導波管の内部を伝播する光線から隣接する溶液中に透過する消失性光界により、導波管に結合した蛍光を放射するトレーサー分子が励起される。次いで、放射された蛍光が、例えば導波管の縁部または末端からではなく、消失性光透過区域から直接集められる。本装置は、第一および第二の平行な平面およびそれらの間を伸びる縁部を有する平らな導波管からなるバイオセンサーを含み、その縁部は、内部伝播されるべき光を受けるための受光区域を有する。半円筒形のレンズが受光区域に隣接して導波管に一体化されており、導波管表面の少なくとも一方が、その上に固定された複数の捕獲分子を有する。捕獲分子は、選択された分析物を特異的に結合する様に形成されており、捕獲分子は抗体、抗体断片、ハプテン、メンブランレセプター、またはどの様な、効果的な特異的結合剤でもよい。捕獲分子は、異なった分析物にそれぞれ特異的な複数の種類を含むことができ、それぞれの種類は、導波管表面上の異なった、互いに独占的な区域に位置することができる。本装置はさらに、縁部上にある受光区域を通して導波管中にシート状の光線を送る様に形成されかつ配置された光源、および消失性光区域から蛍光を直接収集するために配置された検出手段を含むが、直接収集とは、導波管中への蛍光の透過を必要としないこと、と定義する。検出手段は好ましくは、導波管表面上の異なった区域からそれぞれ生じた複数の蛍光信号を同時に、個別に集める様に形成された画像形成検出器である。画像形成検出器は、離れた平行な平面内で互いに間隔を置いて配置された複数の光検出素子、および該蛍光信号のそれぞれを各光検出素子上に集める様に配置したレンズ手段を含む。非常に好ましい実施態様では、半円筒形レンズおよび導波管が光学プラスチックで一体成形され、レンズは、光線を、導波管−液体界面における反射の臨界角度より小さい、選択された角度で導波管の面に向ける様に配置されている。導波管は、受光区域と反対側の端部を形成する、鋸歯状の部分を有することもできる。バイオセンサーの別の好ましい実施態様では、導波管表面は、非特異的結合を少なくする不動態化する結合被覆を施した光学基材である。捕獲分子は、光親和力架橋剤により結合被覆に結合することができる。捕獲分子は部位特異的な方法で被覆に結合することもできる。本発明はさらに、捕獲分子を導波管表面に固定する方法、異なる捕獲種のパッチで光学基材を製造する方法、および洗浄工程を含まずに、消失性光蛍光免疫検定を行なう方法も含む。異なった捕獲分子のパッチで導波管を製造する方法では、光−親和力架橋剤をマスキング方式と組合せて使用し、捕獲分子を導波管表面の選択された区域に選択的に結合させることを含む。非常に好ましい方法では、導波管表面を、非特異的なタンパク質結合を阻止する被覆剤で被覆し、光活性化された架橋剤が、捕獲分子を、捕獲分子上のチオール部位を介して被覆に結合する。後者の結合により、捕獲分子が部位特異的に固定されるので、捕獲分子の５０％〜７０％が、結合に容易に使用できる分析物結合部位を有する。この方法は、５％〜１０％未満で、１〜２％程度と低い非特異的結合水準も与える。図面の簡単な説明図１は、本発明の蛍光免疫検定装置の略図であり、図２は、本発明による競合免疫蛍光検定の導波管および生物化学成分の一部の側面図であり、図３Ａは、図１の装置のフローバイオセンサーの上面図であり、図３Ｂは、図３Ａの線Ｂ−Ｂに沿って切断したフローバイオセンサーの側方断面図であり、図３Ｃは、円筒形レンズに対して分離して配置し得る導波管および入射しかつ反射された光波を示し、図４Ａは、免疫検定における励起光線および蛍光の収集に関する、図３Ａ−３Ｂの２チャネルフローバイオセンサーの立面図であり、図４Ｂは、導波管区域に関する、検出装置の２つの構成要素、ＣＣＤディテクターおよび入口分光計スリットの配置を示す２チャネルバイオセンサーの略図であり、図４Ｃは、図４Ａおよび４Ｂにより配置したバイオセンサーの２つのチャネルから検出される蛍光強度のグラフであり、図５Ａは、多チャネルバイオセンサーの別の実施態様を示す立面図であり、図５Ｂは、図５Ａのバイオセンサーの側面図であり、図５Ｃは、垂直に配置し、中に試料溶液を含む、図５Ａのバイオセンサーの側面図であり、図５Ｄは、図５Ｃの線Ｄ−Ｄに沿って切断したバイオセンサーの断面図であり、図６は、多貯蔵部バイオセンサーの別の実施態様の立面図であり、図７Ａは、第一検定フォーマットにより図１の装置で行なった、抗体を検出するためのサンドイッチ蛍光免疫検定から得た蛍光強度データを示すグラフであり、図７Ｂは、別の検定フォーマットにより図１の装置で行なったサンドイッチ蛍光免疫検定から得たデータを示すグラフであり、図８は、図７Ａおよび７Ｂの検定フォーマットで観察される蛍光増加を比較するグラフであり、図９Ａ乃至Ｆは、対応する抗体を使用して分析物を検出するための、サンドイッチ蛍光免疫検定用の交互の構成から得たデータを示すグラフであり、図１０Ａ乃至Ｄは、本装置で行なった排除（displacement）蛍光免疫検定から得たデータを示すグラフであり、図１１Ａは、バイオセンサーの別の実施態様の立面図であり、図１１Ｂは、図１１Ａのバイオセンサー実施態様の断面図であり、図１１Ｃは、図１１Ａのバイオセンサー実施態様の末端図であり、図１２Ａおよび１２Ｂは、一体成形したバイオセンサーの別の実施態様の、それぞれ上面図および立面図であり、図１３は、一体化レンズの別の実施態様による成形バイオセンサーの側面図であり、図１４Ａおよび１４Ｂは、改良された画像形成光検出方式の側面図およびその方式で使用するためのフォトダイオード列の上面図であり、図１５は、異なったFab'種のパッチで導波管を製造するためのフォトマスキング配置の斜視図であり、図１６は、異なったFab'種で導波管表面をパターン化する製法の工程を模式的に示す、導波管表面の一部の側面図であり、図１７は、パターン化製法の別の実施態様を示す、導波管表面の側面図であり、図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、本発明で有用な光親和力架橋剤の化学式、および基材被覆に架橋剤を光結合させる部分的化学反応を示す。例示する実施態様の詳細な説明光源１００から発せられた光線１０２が鏡１０４、１０６、１０８により、１２０で示す光学バイオセンサーに向けられる（図１）。実施態様では、光源１００は約４８８〜５１４．５ナノメートル（略してnm）の波長で光を放射できるアルゴンレーザーである。別の実施態様では、光源１００として６００〜約７００ nmの波長で放射するレーザーダイオードを使用することができる。蛍光トレーサーの必要条件に応じて、光源１００は、選択されたトレーサーを励起するのに適当な波長で十分な量の光を放射する他のレーザーまたは高強度光源として実施することもできる。図１の実施態様はさらに、光線をバイオセンサー上に集束させる前に、光線１０２を垂直光線にするために配置された４５°の角度鏡を含む。当業者には明らかな様に、鏡１０４、１０６、１０８、１１０の数と配置は、様々な空間上の制限に合わせるために必要に応じて変えることができるが、唯一の必要条件は、十分な量の光がバイオセンサー１２０に向けられることである。バイオセンサー１２０は、光線１０２から光を受け取る様に配置された一つの末端１２４を備えた光学基材１２２を有する。光線１０２から光を末端１２４の上に集束させるために、角度鏡１１０と導波管１２２の末端１２４との間に焦点調節レンズ１２６が配置されている。焦点調節レンズ１２６は、ここではその位置を最良の焦点を得るために調整できる様に、Ｘ−Ｙ移動装置上に取りつけた状態で示してある。免疫蛍光検定装置に一般的に見られるロッド形状ファイバー光導波管と対照的に、本発明では、図２に示す様に、光学基材１２２は、幅により間隔を置いて配置された２つの平らな表面を有する一般的に平らな形状を有する。光学基材１２２は、例えば、正方形または長方形の顕微鏡用スライドグラスまたはカバーグラス等でよい。光学基材１２２用の材料には、この分野でよく知られている様なガラス、高鉛ガラス、石英、光学プラスチックなどがある。一般的に１５０で示す光検出手段は、バイオセンサー１２０から放射された蛍光を検出する様に配置されている。放射された光は、図２および７乃至１０に関して以下により詳細に説明する様に、試料中の選択された分析物の濃度を反映する。光検出手段１５０は、光学基材１２２を通る光線１０２の伝播方向に対して本質的に直角の方向から放射された蛍光を収集する様に配置された集光レンズ１５２を含む。集光レンズ１５２と光学基材１２２の間隔１５４は、当業者には明らかな様に、消失性光透過の区域から放射される光を最大限に収集する様に選択される。次いで、集光レンズ１５２により集められた光は、収集された蛍光の水準を反映する出力信号に応答する検出手段１５０に送られる。検出手段１５０は、この分野で公知の様に、放射された蛍光の波長領域にわたる波長領域で光を効果的に検出する、どの様な型の光検出器でもよい。しかし、同時多分析物検定用に好ましい実施態様では、検出手段１５０は、消失性光区域２４０で生じる蛍光信号のそれぞれから直接画像形成する画像形成型検出器である。図１の装置では、検出手段１５０は、図４Ｃに示す様な信号を発するＣＣＤ（電荷−結合された装置）検出器である。その様な画像形成信号収集は、各貯蔵部またはパッチを読むのに個別の光学素子を必要とする方式よりもはるかに簡単な方法で、複数の試料を同時に測定することができる。この画像形成検出方式は、導波管中への蛍光の消失性光透過によるのではなく、消失性光区域２４０（図２）から直接放射される蛍光を収集することもできる。あるいは、検出手段１５０は、光倍率器、半導体フォトダイオード、またはその様な検出器の列でよい。ＣＣＤ以外の実施態様では、列がある種の目的のために単一の検出器に対して一般的に好ましい。小型検出器の列を使用することにより、使用者は、ピーク蛍光を検出しており、収集および検出光学系の不整列のために不注意で見落としていないことを確認できる。所望により、格子分光写真機をＣＣＤまたは他の検出手段に接続し、検出光のスペクトル解析を行なう。その場合、各ピークを囲む信号関数を積分し、試料から収集された蛍光全体を決定する手段も備える。あるいは、試験室における様な構成で使用するための、検定のすべてのパラメータが標準化されている実施態様では、分光写真機の代わりに、トレーサー蛍光の領域における波長だけを透過させるフィルターを使用することもできる。図１４Ａおよび１４Ｂは、図１のＣＣＤ画像形成検出器の代わりに使用できる、画像形成検出方式の別の、現在好ましい実施態様を示す。この実施態様では、特定のパッチから来る光が対応するフォトダイオード上に集束する様に、フォトダイオード６８０の列が検出レンズ手段に対して配置されている（図１４Ａ）。この実施態様では、検出レンズ手段は、一対の対向して配置されたレンズ６８２、６８４を含む。図１４Ａ乃至１４Ｂの画像形成検出方式を有する装置は、ＣＣＤ検出器を有する装置よりも本質的に安価に製造できる。パッチ６６２、６６４、６６６は、光学の分野で一般的に理解されている様に、フォトダイオードの大きさおよび間隔、レンズの焦点距離および倍率、および導波管表面又は検出レンズおよびフォトダイオード列との間の距離に対応する様に適当な間隔を置いて配置されるべきである。好ましくは、１個以上のフィルター６８８を検出レンズに近接して、好ましくは図１４Ｂに示す様に、２個の検出レンズの間に配置する。この配置により、信号光がフォトダイオードに当たる前に、散乱励起光および他の漂遊光を効果的にフィルターにかけることができる。フィルターは、帯域型でもロング−パス型でもよく、通過させる波長領域は、励起光およびトレーサー分子の蛍光の波長に依存する。例えば、６７０nmにピーク蛍光を有するシアニン染料ＣＹ５の６３５nm におけるレーザーダイオード励起では、約６５０nmより長い波長を有する光を通すフィルターが有用である。現在好ましい実施態様では、６７０nmに中心があり、線幅４０nmの帯域フィルターを使用する。平らな基材導波管の末端上に光線１０２の焦点を合わせるには、図３Ｃ、５Ａ、および１１Ａに分かり易く示す様に、一般的な球形レンズの代わりに、半円筒形のレンズを使用するのが好ましい。この適用の目的には、“半円筒形”は、直円柱をその円筒の縦軸に平行な平面に沿って横に切ったもの、および長円形の直円柱を横に切ったものの両方を含む。したがって、レンズ形状は非球面と呼ばれる型に類似していることができる。双曲断面も適当である場合がある。しかし、レンズの湾曲表面の形状および寸法は、光線の焦点合わせに使用する区域に沿って縦方向で一様であるべきである。図２に分かり易く示す様に、光学基材１２４は、少なくとも１個の平らな表面２００および幅２０２により間隔を置いて配置された第二の表面２０１を有する平らな導波管として具体化されている。少なくとも表面２０１は試料溶液２０３と接触して配置されている。複数の捕獲分子２０４は表面２０１上に固定されている。試料溶液は、選択された分析物の複数の分析物分子２１０、および複数のトレーサー分子２２０を含む。捕獲分子は、各分析物分子２１０の上に存在する結合部分に結合する様に、選択または構築される。トレーサー分子２２０は、適当な波長の光による刺激に応答して蛍光を放射する様に選択または構築される。トレーサー分子２２０により放射される蛍光の水準は、捕獲分子に結合した分析物の量の尺度であり、したがって、溶液中の分析物分子２１０の濃度を反映している。導波管１２４の中を光が伝播し、表面２００、２０１で内部反射するときに、距離軸２３２と強度軸２３４に対してグラフ化される（実寸ではない）様に、表面２００からの距離に応じて低下する強度曲線２３０を有する消失性光界が形成される。励起区域２４０は、消失性光の強度がトレーサー分子２２０の重要なまたは検出可能な画分を励起するのに十分である溶液の区域である（実寸ではない）。区域２４０の外にあるトレーサー分子２２０は、蛍光の誘発にほとんど、またはまったく寄与しない。励起区域２４０は、一般的に約１０００〜２０００Å の間である。捕獲分子２０４は、抗体全体、Fab'断片の様な抗体断片、抗原分子（ハプテン）または抗原断片、および抗原性である、および／または３次元構造で抗体を結合するエピトープに類似したオリゴペプチドでよい。捕獲分子２０４は、細胞または機能質メンブラン上に通常見られる種類の、所望の分析物に特異性を有するレセプター分子、またはその部分であって、レセプターの分析物を特異的に結合する特性を有するものでよい。図２は、競合検定構成を示す（排除検定ともいう）。しかし、当業者には明らかな様に、サンドイッチ検定の様な別の検定構成も本装置で行なうことができる。捕獲分子２０４は、表面２０２上に、この分野で公知の、どの様な方法によっても固定することができる。しかし、好ましい実施態様では、捕獲分子は部位特異的に固定される。本出願で使用する様に、用語“部位特異的”とは、代表的な先行技術の方法における様な不規則な部位ではなく、むしろ捕獲分子上の特異的部位が導波管への結合に関与することを意味している。実施例Ｉ乃至IIIは、基材上の耐タンパク質性被覆により光学基材の表面に捕獲分子を部位特異的に固定する方法を詳細に説明する。先に述べた様に、消失性光の強度は導波管表面からの距離と共に急速に低下する。したがって、導波管表面から有効な励起範囲２４０（必ずしも実寸ではない）内にあるトレーサー分子だけが、消失性光により励起され、蛍光を放つ。該範囲２４０は、一般的に１０００〜２０００Åである。この範囲は、捕獲分子２０４に（直接または間接的に）結合した本質的にすべてのトレーサー分子２２０を確実に検出するのに十分であり、一方、溶液中に遊離しているトレーサー分子のほとんどは有効な励起範囲の外にある。図１の装置の実施態様では、蛍光の測定は分光計により行なう。ローダミン標識を付けた分子が関与する実施例では、光源１００は、放射波長が５１４nmのアルゴンイオンレーザー（LEXEL Model 95-2）である。蛍光検出は、モノクロメーター（SPEX Industries，Inc.，Model 1680C）および電荷結合装置（略してＣＣＤ）（Photometrics Ltd．Series 200またはCH-250）で行なった。あるいは、光源１００は、選択した蛍光染料の励起に望ましい波長で放射する、どの様な光源でもよい。また、検定手順が実証され、標準化されたら、蛍光スペクトルまたは蛍光の空間的分布を測定する必要はなかろう。検出手段は、検定の最小限の必要条件で簡素化することができる。別の実施態様では、光源１００は、Toshibaから市販の赤色波長領域６００〜７００nmで放射するレーザーダイオード（model No.TOLD 9211）である。このレーザーダイオードは、ピーク放射波長約６７０nmで約５ミリワットの出力を有する。６３０nmで放射するレーザーダイオードも市販されており、使用することができる。この領域の波長を使用する実施態様には、蛍光が赤色スペクトル領域の波長で励起されるシアニン染料の様な染料を使用する必要がある。その様な染料の例は、Biological Detection Systems，Inc.，Pittsburgh PAから市販のＣＹ５（カタログ番号A25000）である。ＣＹ５染料は、メーカーの指示および／またはＢＤＳから市販のキットを使用して所望のトレーサー分子に共役させることができる。同じメーカーから市販の第二の染料ＣＹ７も好適である。染料および共役方法は、Southwick,P.L.らの“Cyanine Dye Labelling Reagents-Carboxymeth ylindo-cyanine Succinimidyl Esters”、Cytometry11:418-430（1990）に記載されている。光源としてレーザーダイオードを使用することにより、バイオセンサーおよび導波管をプラスチックで形成することができ、それによって製造経費が著しく下がり、半円筒形レンズと導波管および貯蔵部の一体成形が容易になる。図２の実施態様では、免疫検定は、捕獲分子２０４が分析物分子２１０の代わりにトレーサー分子２２０と結合する様に、トレーサー分子２２０が構築されている競合検定である。分析物分子２１０の濃度が高いために、トレーサー分子２２０のほとんどは捕獲分子２０４から周囲の溶液中に排除され、基材１２２の励起範囲２４０の中にあるトレーサー分子の数が減少する。トレーサー分子の結合が減少するために、蛍光の量が減少する。反対に、分析物分子２１０の濃度が低い場合は、トレーサー分子２２０が捕獲分子２０４に結合し、励起範囲２４０内に保持される。図１の実施態様では、バイオセンサー１２０は、図３Ａ乃至３Ｂにより詳細に示すフロースルーセルとして示す。例えば顕微鏡のスライドまたはカバーグラスでよい、平らな導波管３０２が、ねじ３０８Ａ、３０８Ｂにより一緒に保持されている２枚の板３０４、３０６の間に挟まれている。導波管３０２と板３０６の間に、ガスケット３２０が配置されている。ガスケット３２０は２つの内側開口部を有し、それらの開口部は、ガスケット３２０を板３０６と導波管３０２の間に固定したときに、貯蔵部３２２、３２４を形成する。貯蔵部３２２、３２４の中では、導波管３０２が一方の壁を構成し、板３０６が第二の壁を構成し、ガスケットの内側縁部３２２Ａ、３２４Ａが残りの壁を構成する。貯蔵部３２２、３２４はここでは長方形で示してあるが、他の形状も使用できる。また、図３Ａに示す様な２つの貯蔵部の代わりに、ガスケットはただ１つの、または２つ以上の開口部を有し、対応する数の個別貯蔵部を形成することもできる。ガスケット３２０は、励起光の波長領域で導波管材料の屈折率よりも小さな屈折率を有する半剛性材料からなるのが好ましい。最良の結果を得るには、ガスケット材料の屈折率は、導波管の屈折率と比較して、できるだけ低くすべきであると考えられる。石英またはガラス製の導波管では、屈折率は一般的に約１．４６〜１．５２であり、高鉛ガラスに関しては、より高い。屈折率が１．３５〜１．４３の透明な（着色していない）シリコンゴム（シロキサン重合体）が現時点でガスケット３２０に好ましい材料である。ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）またはＦＥＰ（フッ素化エチレンプロピレン）の様なTEFLON型の材料は、屈折率が約１．３４〜１．３５であり、やはり適当である。しかし、TEFLON表面は非特異的にタンパク質を吸収する傾向があるので、シリコンゴムが一般的に好ましい。図３Ｂの下側板３０６は、一対の入口３３０、３３２および一対の出口３４０、３４２を有する。これらの入口および出口は、溶液がそれぞれの貯蔵部３２２、３２４を個別に流れる様に配置されている。下側板３０６はアルミニウム合金から作られるのが好ましい。図３Ｃは、導波管３０２を、バイオセンサーの残りの部分から分離して示す。レンズ１２６は、光線１０２を受け取り、導波管上に集束する。好ましくは、外周縁部３５０は、レンズ１２６からの集束光が導波管に入る、被覆していない区域３５２を除いて、反射性の材料で被覆してある（図３Ｃ）。矢印３５４は被覆縁部からの反射を示す。図３Ｃで、１個のレンズおよび１つの被覆していない区域だけを示しているが、２チャネル以上では、光が導波管中に進入できる様に、より多くの縁部３５０を被覆せずにおくこともできる（例えば図４Ａ参照）。反射被覆は、それがなければ縁部３５０を通って逃げてしまうであろう光を導波管の中に反射して戻す。それによって消失性光波の強度が増加する。好適な反射被覆材料としては、この分野で公知の様に、アルミニウム、銀等がある。あるいは、被覆の代わりに、反射体を縁部の周りに配置し、逃げようとする光を導波管中に反射して戻すこともできる。例えば試験試料の蛍光を、同じ導波管上の比較区域から来る蛍光と同時に測定したい場合、少なくとも２個の個別の貯蔵部を有する設計が、貯蔵部が１個しかない実施態様よりも著しく有利である。例えば、導波管への非特異的結合の水準を、試験試料蛍光から差し引くことができる。また、励起光の強度変動による測定変化を補正することもできる。排除検定では、“比較”区域は、試料中に分析物が存在しない、または既知量の分析物が存在する、予め装填した導波管でよい。３個以上の貯蔵部がある場合、“未知の”、つまり試験試料に加えて、分析物を含まない比較、および少なくとも１個の既知の校正用分析物試料の両方に関して蛍光を測定することができる。図４Ａは、導波管励起標準に使用できそうな、図３Ａ乃至３Ｂのフロースルーセルを示す。ここでは、光線を２つの等しい成分４００、４０２に分割し、それぞれの集光レンズ４０４、４０６を通過させ、導波管３０２中で“チャネル１” （ＣＨ．１）および“チャネル２”（ＣＨ．２）を照明する。実線の矢印４１０はＣＨ．１中で蛍光が収集される方向を示し、破線の矢印４１２はＣＨ．２中で蛍光が収集される方向を示す。集光レンズ４０４、４０６が導波管および光源に適切に整列している場合、光線成分４００、４０２が整列している方向で導波管に伸びる２つの照明された帯４３０、４３２（図４Ｂ）が見える。四角４４０は、ＣＣＤ列の検出区域の大体の輪郭を表し、四角４４２は分光写真器の入口スリットの大体の輪郭を示す。先に説明した様に、検出方式の一実施態様は、ＣＣＤ列と組合せた分光写真器を含む。図４Ｃは、ＣＨ．１中の“ブランク”つまり分析物を含まない試料およびＣＨ．２中の供試つまり“未知”の試料を同時に測定するための、その様な検出方式から予想される結果を示す。曲線４５０、４５２はそれぞれＣＨ．１およびＣＨ．２からの蛍光を示す。ブランクおよび試料の蛍光強度は、それぞれの区域４６０、４６２にわたる曲線４５０、４５２の対応する積分値により比較される。この分野で公知の様に、一般的に、分析物濃度が既知である一連の校正試料に対して校正曲線を作成し、未知試料の濃度測定に使用する。さらに図４Ａで重要なのは、導波管３０２に対するレンズ４０４、４０６の向きである。湾曲した縁部４０４Ａ、４０６Ａが導波管３０２の方を向いているのが分かるが、これは図３Ｃに示す向きから１８０°である。集光レンズはどちら向きでもよいが、フロースルーセルを備えた導波管の照明には、図４Ａの配置が現時点では好ましい。図５Ａ乃至５Ｄは、図１の装置に有用なバイオセンサーの別の実施態様を示す。一般的に５００で示すバイオセンサーは、一体的に取りつけた、または成形した集光レンズ５０２および導波管５０４を含み、レンズ５０２が光を導波管の前端部５０６上に焦点を合わせる様に配置されている。集光レンズ５０２は、光線を導波管５０４の受光末端５０６に集束する様に形成され、配置されている（図５Ａ、５Ｃ）。側壁５１１、５１２、上および底壁５１６、５１７、および取り外しできる様に密封している後壁５１８が、導波管５０４の周囲の空間を取り囲み、貯蔵部５２０、５２２を形成する。一体化された集光レンズ５０２が、図１の装置における集光レンズ１２６の代わりである。図５Ａ乃至５Ｄの実施態様では、集光レンズは、導波管ホルダー５００の一部としてポリスチレン、ポリカーボネート等の光学プラスチックで成形されている。バイオセンサー５００は、図５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄに最も分かり易く示す貯蔵部５２０、５２２を含み、その中に試料溶液を入れることができる。所望により、スロット５０４に沿って、導波管表面の分離区域を限定する縦方向リブ５３０（図５Ｄ）を設けるのが望ましい場合がある。図６は、導波管５０４上に一連の分離された貯蔵部６００、６０２、６０４、６０６が形成されている以外は、図５Ａ乃至５Ｃのバイオセンサーと類似の多貯蔵部バイオセンサーを示す。図６の実施態様は、貯蔵部６００、６０２、６０４、６０６を覆わなくてもよい様に、水平位置で使用する。レンズを含むバイオセンサーは、好適な光学プラスチックで成形することができる。必要に応じて貯蔵部壁、レンズ、およびフレーム部品を含むホルダーを予備成形することができる。続いて、シリカ表面導波管を、屈折率が適合した接着剤と共に挿入し、所定の位置に固定し、必要であれば密封し、分離したチャネルを形成する。あるいは、ホルダーは、シリカ表面導波管を所定の位置にして成形し、それによって接着剤の必要性をなくすこともできる。現時点で好ましい別の実施態様では、導波管も光学プラスチックで形成し、レンズおよび／または貯蔵部と同時に成形する。後者の型の構造は４８８〜５１５ nmの励起波長で使用するには適していない。というのは、公知の光学プラスチックは、この（青および緑）波長領域で励起した場合に蛍光を発する傾向があるためである。この蛍光は背景蛍光として現れる。しかし、６００nm以上の波長で放射する光源を使用する装置の実施態様では、プラスチック製の導波管を使用することができる。プラスチックの単一装置としてレンズ／導波管、またはレンズ／導波管／貯蔵部を成形することにより、製造原価が著しく低減し、使い捨てバイオセンサーがより有用なものになる。図１１Ａ乃至１１Ｃは、図３Ａ乃至３Ｃに示すバイオセンサーと類似の、別の実施態様のバイオセンサーを示す。図１１Ａで、導波管１０は、固体の無色プラスチックレンズ１４中に鋸で切った溝１２（図１１Ｂ）の中に挿入したカバーグラスである。透明壁１６、１８、２０、２２は、屈折率が適合した接着剤により、レンズ１４および導波管１０の縁部の周りに密封して取りつけられ、一対の分離貯蔵部３０、３２を形成している（図１１Ｂ）。図１１Ａ乃至１１Ｃの実施態様では、レンズ１４の湾曲した前端部３４が、導波管１０の前端部から距離４０をおいて配置されている。距離４０は、レンズ１４の焦点距離に適合する様に選択される。可視光線に対して不透明な材料からなるマスク４２がレンズ１４の後端部４４を覆っている。図１１Ａ乃至１１Ｃの実施態様は、図５Ｃに示す様な垂直配置に使用できる。あるいは、バイオセンサーを導波管１０と共に本質的に水平な位置に向け、導波管１０の片側だけを使用することもできる。その様な場合、貯蔵部の開いた末端を密封できるキャップを備えなければならない。水平に向ける構成の利点は、薄い層５０の試料溶液だけを必要とすることである（図１１Ｃ）。しかし、図５Ｄにおけるリブ５３０の様なリブを導波管１０に沿って設けない限り、水平方向における図１１Ｃのバイオセンサーには、ただ１個の有効試料チャネルを有する。レンズ１４の湾曲した端部３４は本質的に半直円柱形状で示してあるが、前に図３Ａおよび５Ｃに関して説明した様に、他のレンズ形状も可能である。図１２Ａおよび１２Ｂに示す、バイオセンサーの別の非常に好ましい実施態様では、平らな導波管の、受光端部から離れた端部が、鋸歯状または歯の様な部分６５０を有する。角度６５２Ａ、６５２Ｂは、導波管−空気の界面における全内部反射に対する臨界角度より小さくなければならない（ポリスチレン／空気に対する臨界角度は約５１°である）。好ましくは、光が導波管の縦軸に沿って直接逆反射して戻る様に、角度６５２Ａ、６５２Ｂの合計が９０°になるべきであり、さらに好ましくは、６５２Ａ＝６５２Ｂ＝４５°である。この形状の利点は、端部の反射被覆なしに内部反射の水準が増加し、製造の複雑さおよび原価が低減することである。ＴＩＲの増加により、消失性光界強度が高くなり、したがって検定の感度が改良される。また、鋸歯状の端部により、導波管内の光の強度が均一になる（導波管全体を通してより一様になる）。バイオセンサーの導波管部全体は、鋸歯状端部および一体化レンズを含めて、光学品質の表面を有するべきである。実施態様では、導波管は厚さが約０．０５センチメートル（cm）であり、貯蔵部の深さが約０．０８〜０．１cmである。導波管を含むバイオセンサーは幅が約２．５cm、長さが約４．３cmである。図１２Ａおよび１２Ｂの実施態様は、それぞれ導波管の受光末端１２４から長さ方向に伸びる複数の平行な貯蔵部６６０も有する。ここで、各貯蔵部は、それぞれ異なった固定Fab'種を含む複数のパッチ６６２、６６４、６６６を含む。その様な異なった種間の、導波管中を伝播する光の方向に伸びる分離壁を取り除くことにより、検定の感度がさらに増加する。１）壁を通過する導波管の光損失が避けられ、２）消失性光透過区域の外にある未結合トレーサー分子を励起し、好ましくない背景蛍光を増加することがある励起光の散乱が避けられるので、感度は増加する。別の改良では、シート状の励起光線が、導波管の平面に対してある角度で導波管の受光端部に入る様にする。図１３は、その様な角度のついた入射光を受け入れる様に形成された、角度のつけられた一体化レンズ６７０を示す。この目的には、レーザーから発する光線は、この分野で公知の様な円筒形および／または球形のレンズを使用し、導波管の受光区域の幅に近い幅を有し、比較的小さな厚さ（好ましくは導波管の厚さの１０倍以下、好ましくは１〜４倍）を有するシート状にすべきである。光線の入射にその様な角度をつける効果は、導波管に入る光の比率を増加し、その入る光はマルチモード導波管で伝播されたより高いオーダーのモードを励起し、それによって消失性光界の強度を増加することである。平均光線入射角度は、導波管／溶液界面の臨界角度未満であるが、臨界角度の近くなる様に選択するのが望ましい。光線入射角度がこの臨界角度に近い程、消失性光強度の増加が大きくなる。しかし、光線入射角度が臨界角度に近過ぎると、入射する光の一部が導波管／溶液界面で逃げ、導波管の効率および消失性光強度が低下する。そのため、実験的に求められる最適角度がある。一般的に、臨界角度より数度小さい（約５〜約１５度小さい）光線入射角度が有用である。ポリスチレン製導波管では、臨界角度は約３３°であり、現時点で好ましい光線入射角度は２５°であり、これらの値で、消失性光の強度は、０°光線入射角度を使用する場合より、少なくとも約２のファクターの増加が達成される。角度のついた光線入射を使用するには、当業者には明らかな様に、導波管の受光端部に対して半円筒形レンズの曲率半径の中心の向きを調節する必要がある。成形された一体化バイオセンサーでは、一体化レンズ／導波管は図１３の様に形成することができる。下記の実施例は、捕獲分子を導波管表面に、部位特異的に付着されるための幾つかの方法を詳細に説明する。非特異的結合の水準を下げるための一般的な方法では、導波管を耐タンパク質性の物質で被覆し、次いでその被覆に抗体を固定する。この方法はさらに、捕獲分子が被覆に部位特異的に付着するために、抗体または他の捕獲分子を部位特異的に変性して固定すると共に、耐タンパク質性被覆の誘導体化も含む。記載する実施例の中で、実施例ＩおよびIIが一般的により優れた結果を与えた。現在、アビジン−ビオチン結合法（実施例II）が最も好ましい。どちらかの結合方式を使用することにより、固定化したFab'断片の少なくとも約７５％が活性であり、非特異的結合の水準は一般的に特異的結合の１〜２％以下であった。変性ＰＥＧ被覆は、５％〜約２５％の、やや高い水準の非特異的結合を与えた。実施例Ｉ導波管表面−ヒドロゲルの製造ポリメタクリロイルヒドラジド（略してＰＭａｈｙ）を含むヒドロゲル被覆を有するシリカ表面を製造した。ESCO，Inc.から市販の、ＣＯグレードで厚さ約１ mmの融溶石英スライドが導波管（光学基材）として好適であった。ＰＭａｈｙを該シリカにグラフト化するために、その表面をアルデヒド基で誘導体化した。この誘導体化は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（略してＡＰＳ）でシラン化してアミノ官能基を加え、続いてグルタルアルデヒドと反応させて遊離のアルデヒド基を形成することにより行なった。次いでＰＭａｈｙをこれらのアルデヒド基と反応させ、ヒドロゲル被覆を形成した。抗体はこのヒドロゲルに少なくとも２つの方法で結合させることができた。一つの方法では、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理することにより、Ｆｅ抗体領域における炭水化物基をアルデヒドに酸化する。しかし、この目的に有用な炭水化物部分を含む抗原結合断片はほとんどない。そこで、好ましい方法では、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロ−へキサン−１−カルボキシレート（略してＳＭＣＣ；Pierce Chemicals）で処理することにより、ヒドロゲルの懸垂ヒドラジド基をマレイミド基に変性する。これらのマレイミド基は、Fa b'断片のＣ−末端領域に一般的に見られる遊離のチオール基と反応させ、それによってFab'断片をヒドロゲルに結合させることができる。ポリ塩化メタクリロイル（略してＰＭａＣｌ）は、Jantasら、J．Polym．Sci. ，Part A：Polym．Chem．27:475-485（1989）に記載されている様に、不活性雰囲気中で、ジオキサン中で塩化メタクリロイル（略してＭａＣｌ）をラジカル重合させることにより製造した。２１．１モル％のＭａＣｌ、７８．１モル％のジオキサン、および０．８モル％のＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロ−ニトリル）を含む反応混合物を撹拌しながら６０℃で２４時間反応させた。そうして製造されたＰＭａＣｌは、反応の間中、溶液中に残っていた。次いで混合物を、反応に使用したジオキサンの２倍量で希釈し、過剰のヒドラジン水化物に徐々に加え、希釈されたＰＭａＣｌに対して２：５の体積比を達成した。後者の添加は、窒素雰囲気中、氷浴中で約３０分間行なった。次いで、得られた混合物を室温で約１時間撹拌した。生成物ＰＭａｈｙは、ジオキサンおよび残留する未反応ヒドラジン水化物を蒸発させ、続いて蒸留水で洗浄することにより精製した。次いで、洗浄した生成物を、分子量カット −オフ３，５００ダルトンを有するSpectraPor透析膜中で透析し、未反応モノマーを除去した。その様にして製造した重合体は、ゲル透過クロマトグラフィーにより測定した分子量が塩酸塩形態で約２６，０００であった。溶液中の重合体濃度は塩酸塩形態で約５％〜８％（w/v）であると評価された。この重合体は、窒素雰囲気下の水溶液中、４℃で、有害な量の自然架橋を起こさずに、少なくとも５箇月貯蔵できることが分かった。シリカチップまたはガラスまたは石英の顕微鏡スライドグラスをクロム酸で洗浄し、次いで５％ＡＰＳ／９５％脱イオン水（v/v）で、室温で約１５分間処理した。このＡＰＳ処理した表面を脱イオン水および無水エタノールですすぎ、窒素で少なくとも３回掃気した真空オーブン中、１２０℃で１時間保持した。得られたシラン化された表面を、０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中２．５％グルタルアルデヒド（PolysciencesからのＥ．Ｍ．グレード）、ｐＨ９．２に室温で２時間浸漬した。次に、線状ＰＭａｈｙを、処理したチップ上のアルデヒド基と反応させ、その鎖中に多くの未反応ヒドラジド基を含む架橋した重合体皮膜を形成した。これは、処理したチップを約５％〜８％（w/v）のＰＭａｈｙ溶液、ｐＨ５．２に室温〜約６０℃の温度で、厚さ約１００Å以下の重合体皮膜を形成するのに十分な時間浸漬することにより行なった。ヒドロゲル層の厚さは、溶液中に保持する時間および温度と共に増加した。厚さ１００Å以下のフィルムの製造に最適な条件は、５％（w/v）ＰＭａｈｙ中に室温（約２５℃）で２時間保持することであることが分かった。次に、重合体皮膜の遊離ヒドラジドをＳＭＣＣで処理することにより変性させ、重合体側鎖の末端上に反応性のマレイミド基を与えた。これは、ＰＭａｈｙ被覆した基材を、ジメチルホルムアミド中０．１９％（w/v）ＳＭＣＣの溶液中に２５℃で約１時間浸漬することにより行なった。ＳＭＣＣで誘導体化した後、ヒドロゲル被覆した表面を、５mMＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０中のFab'断片の１mg/ml溶液で処理した。この様にして製造された導波管表面は、Fab'分子を表面密度約１．４×１０^-12モル/cm² で固定することが分かった。また、この表面は、Fab'断片をそれらのＣ−末端チオール基で部位特異的に固定することができた。得られた重合体皮膜の厚さは、エリプソメトリー（ellipsometry）により、所望される様に約１００Åであると測定された。この皮膜の厚さは、０．３５〜２５μｍ（ミクロン）の厚さを有する典型的な先行技術の重合体皮膜よりはるかに小さい。上記のＰＭａｈｙ重合体の製造方法は、 Kernらにより開示された、ポリメタクリロイル酸エステルを使用する方法よりも優れている。ヒドラジン水化物との反応に適したその様なエステルは、分子量が８０，０００ダルトン以上であることが多く、そこから導波管上に所望の薄い皮膜を形成するのは困難である。最後に、Fab'断片を、重合体被覆表面から突き出た遊離のマレイミド基に、次の様にして結合させた。製造された導波管表面を、５mMのＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中に１．５×１０⁷モル濃度のFab'断片を含む溶液中に、４℃で２４時間保持した。実施例 II 導波管表面−アビジン−ビオチンの製造この方法は、アビジンに対するビオチンの非常に強い結合親和力（結合定数約１０^-15）を利用することを意図している。アビジン被覆は、シリカ表面に物理的に吸着させることにより容易に行なった。次いでFab'断片をビオチンと共役させ、ビオチニル化Fab'断片またはｂ−Fab'断片とも呼ばれるビオチン−Fab'共役を形成した。ビオチンは、Fab'断片上の特定の位置に結合している。次いでアビジン被覆した表面をｂ−Fab'断片で処理することにより、ビオチンをアビジンに結合させ、それによってFab'断片を部位特異的にその表面に固定する。実際の実験手順は次のとおりである。クロム酸で洗浄したシリカ表面を３×１０^-6Ｍ（モル）アビジンの溶液に室温で約３時間浸漬した。次いで、表面をＰＢＳ中で数回洗浄し、吸着されていないアビジンを除去した。ビオチニル化Fab'共役物は、十分な量の４mMビオチン−ＨＰＤＰをジメチルホルムアミドに加えて２０倍モル過剰のビオチン−ＨＰＤＰを形成することにより、ＰＢＳ中Fab'断片溶液（０．５〜１mg/ml）から製造した。この混合物を室温で９０分間保持し、ビオチニル化Fab'断片（略してｂ−Fab'）を、ＰＢＳ中で平衡化したSephadex G25を使用するゲル透過クロマトグラフィーにより精製した。抗体全体をビオチニル化するために使用した別の方法では、ビオチン−ＬＣ− ヒドラジドを、抗体のＦｅ区域における酸化された炭水化物基に結合させた。９ −４０と呼ばれるＭａｂ（フルオレセインを結合する鼠のモノクローナルＩｇＧ₁ 抗体）を、１０mM過ヨウ素酸ナトリウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５中１〜２mg/mlタンパク質の濃度で約０℃で２０分間保持することにより、酸化した。次いで、グリセロールを最終濃度１５mMになるまで加え、反応を急冷し、混合物を０℃でさらに５分間保持した。酸化したＭａｂ９−４０は、０．１Ｍ酢酸ナトリウムはｐＨ５．５で平衡化したSephadex G25上のゲル瀘過クロマトグラフィーにより精製し、次いで５mMビオチン−ＬＣ−ヒドラジドと、撹拌しながら室温で２時間反応させた。未反応ビオチン−ＬＣ−ヒドラジドは、ＰＢＳ中で平衡化したSephadex G25カラムを使用して除去した。アビジン被覆した表面をｂ−Fab'断片の１．５×１０^-7Ｍ溶液中に、室温で約１時間浸漬し、続いてＰＢＳで洗浄し、結合していないｂ−Fab'断片を除去した。所望により、ポリエチレングリコール（略してＰＥＧ）を、予めｂ−Fab'断片で被覆した表面を約５×１０^-8〜１×１０^-7ＭＰＥＧの溶液に浸漬することにより、ｂ−Fab'断片被覆した表面に結合させた。未結合ＰＥＧは、ＰＢＳ中で洗浄することにより除去した。アビジン−ビオチン結合化学反応を使用して得た固定Fab'断片の密度は約１．４×１０^-12モル／cm²（平方センチメートル）であった。実施例 III 導波管表面−ＰＥＧ型の製造この方法では、それぞれエチレンジアミン（略してＥＤ）またはヒドラジン（略してＨＺ）との反応により、ポリエチレングリコール（略してＰＥＧ）の末端水酸基を第１級アミンまたはヒドラジド基に転化し、ＰＥＧ−ＥＤ₂またはＰＥＧ−ＨＺ₂を製造した。次いで、その様に変性したＰＥＧ分子を、ＡＰＳグルタルアルデヒドで活性化したシリカ表面に結合させた。それぞれのＰＥＧ−ＥＤ₂ 分子上の１個のＥＤ部分が、シラン化−グルタルアルデヒド処理した導波管表面上の遊離アルデヒド基と結合する。次いで、他のＥＤ（またはＰＥＧ−ＨＺ₂を使用する場合はＨＺ）が、酸化された抗体または抗体断片の様な捕獲分子（結合タンパク質）中のアルデヒド部分と結合させるのに使用できる。ダルトンで示された分子量の単官能性（ＰＥＧＭ２０００、Ｍ５０００）または２官能性（ＰＥＧ３４００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１８，５００）を、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（略してｐ−ＮＰＣ、Aldrich Chemicalsから入手）のベンゼン溶液と反応させた。この混合物を室温で約２４時間撹拌した。無水エチルエーテル（水分０．０１％未満、J.T．Baker Chemicalsから購入）を使用して溶液からＰＥＧ−（ｏ−ＮＰ）₂を沈殿させた。沈殿物を一晩真空乾燥させた。この処理により、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで加水分解して、ｐ−ニトロフェノール基を放出させることにより測定されるように、約５０％〜約１００％のＰＥＧ分子がＰＥＧ−Ｏｎｐに転化された。４０２nmにおける吸収を分光測定により決定し、転化量を決定するために、１８４００Ｍ^-1cm^-1のモル吸光係数を使用した。転化の水準は、ＭＰＥＧのＰＥＧ分子量にある程度依存する。ＰＥＧ−（ｏ−ＮＰ）₂をエチレンジアミンに溶解させ、室温で約３時間穏やかに撹拌した。次いで十分な量の無水エチルエーテルを加えてＰＥＧ−（ＥＤ）₂ を沈殿させた。１２Ｎ（ノルマル）塩酸１滴を加えて黄色のＰＥＧ−（ＥＤ）₂ 溶液を無色化し、エチルエーテルによる沈殿をさらに２回繰り返した。湿ったＰＥＧ−（ＥＤ）₂を一晩真空乾燥させた。別に、エチレンジアミンの代わりに、ＰＥＧをヒドラジンで誘導体化し、ＰＥＧ−Ｈｚ²を製造した。変性したＰＥＧを、実施例Ｉに記載する様に製造したシラン化−グルタルアルデヒド処理した導波管表面に結合させた。２４ミリグラム（mg）のＰＥＧ−ＥＤ粉末を１．２ミリリットル（ml）の０．１５ＭＰＢＳｐＨ７．４または同じ容積の１１％硫酸カリウム−酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．２に溶解させた溶液。製造した導波管表面をＰＥＧ−ＥＤ溶液に浸漬し、６０℃で約２４時間保持した。Ｋ₂ＳＯ₄酢酸塩緩衝液を使用する手順は、ＰＢＳ緩衝液を使用する手順より、その表面に付加したより高密度のＰＥＧ分子を生じた。抗体または他の結合タンパク質を、下記の様にしてＰＥＧ被覆した導波管に固定した。約３mg/mlの抗体の溶液を０．１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．２に溶解させた。次いで等重量の５０mMメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ₄）の溶液を加え、反応物を室温で約１時間撹拌した。反応混合物を、酢酸ナトリウム緩衝液で予め平衡化した脱塩カラム（Pharmaciaから入手したタイプＰＤ−１０）に通すことにより、未反応メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。次いで、ＰＥＧ被覆した導波管を、酸化抗体の酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．２の溶液中に４℃で３日間保持し、次いですすぎ、結合していない抗体を除去した。実施例Ｉ乃至IIIの各被覆手順により、並びに先行技術の不規則部位結合法により製造した導波管を分析し、蛍光全体に対する非特異的結合の程度、および固定された抗体および使用可能な結合部位の量を決定した。これらの分析の比較結果を表Ｉに示す。表Ｉのデータは、エピトープ密度が９である（すなわち、ＢＳＡ分子１個あたり約９個のフルオレセイン分子が結合する）フルオレセイン−ＢＳＡ（ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン）共役物、および抗フルオレセイン抗体（Ｍａｂ９−４０、または断片についてはFab'９−４０と呼ばれる）を使用して得た。この抗体を分泌するハイブリドーマ細胞群は、Urbana-Champaignでイリノイ大学のE.W．Voss 教授から得た。これらの実験および結果を図７Ａ、７Ｂ、８、９Ａ乃至９Ｆ、および１０Ａ乃至１０Ｄに示す実験では、データの取得および処理は、Photometri cs Series 200と共に供給されたソフトウェアを使用して行なった。絶対抗原結合は、放射線標識を付けたトレーサーまたは捕獲分子を使用して測定した。例えば、放射線標識を付けたＢＳＡ−ＦＬ₉は、固定されたFab'断片とリン酸塩緩衝液ｐＨ７．３中、室温で５または６０分間で結合させた。トレーサー濃度は１．５×10^-7Ｍであった。試料あたり３mlの、濃度１０^-1 ⁰ Ｍ〜１０^-7Ｍのフルオレセイン標識を付けたＢＳＡ（ＢＳＡ−ＦＬ₉）の試料をフローセル中に注入した。注入は、５分間隔で行なった。波長４８８nmにおけるスペクトルを取り、ＰＢＳ緩衝液で洗い流すことにより、大部分のＢＳＡ−ＦＬ₉ を除去した。さらに３つのスペクトルを取り、５１３〜５１７nmのフルオレセインピークを積分した。これらの値はＢＳＡ−ＦＬ₉濃度のｌｏｇに対して配置し、結合等温線を得た。放射能測定では、固定した放射能標識を付けた捕獲分子、または標識を付けていない捕獲分子に結合した標識トレーサー分子、を有する被覆シリカチップを適当な緩衝液中で十分に洗浄し、ガンマ計数管で計数した。放射能標識には、¹²⁵ Ｉ標識を付けた抗体または抗原が好ましく、これはクロラミンＴ法（Greenwood ら、Biochem.J．89:114-123（1963）参照）を使用して行なった。アビジン−ビオチン（実施例II、表Ｉの上から７および８列）またはヒドロゲル（実施例Ｉ、表Ｉの下の２列）との部位特異的な結合により製造した導波管上の、抗原の非特異的吸収水準は、先行技術の結合方法のほとんどよりも著しく優れており、一般的に１〜３％である（表Ｉ）。また、これらの結果は、アビジン被覆した導波管への非特異的結合が、約１０^-5Ｍ未満の分析物分子濃度に対して、洗浄工程なしで、十分に低いことを示している。活性な（分析物を結合し得る）固定された分子の百分率も、アビジン−ビオチンおよびヒドロゲル結合化学作用で著しく高く、Fabに対して５０％〜７５％である。熱処理、酸処理または酸化により結合したＩｇＧ捕獲分子に関する結果は、ＩｇＧ結合部位の低い百分率はで活性であることを示している（表Ｉ、上から１、２、４、５、６、１０列）。ビオチン−ＰＥＧで標識を付けたシリカ−アビジン列は、その表面（捕獲分子を付加した後）にビオチン−ＰＥＧ共役物を予め加えることによりさらに精製して得たデータを示す。これは、潜在的な非特異的結合区域を不動態化するために行なった。しかし、ビオチン−ＰＥＧを予め加えることにより、大きな改良は見られなかった。結果を表IIおよびIIIに示す実験に関して、鼠の抗ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（抗−ｈＣＧ）モノクローナルＩｇＧ抗体に由来するFab'断片を使用した。親のモノクローナル抗体は、van Erpら、J．Immunol．Methods，140:235-241（1991 ）に記載されている様にして精製した。この抗−ｈＣＧ−Ａと呼ばれるマウス抗体は、ｈＣＧ（BoxtelのOrganon-Technika、オランダから供給）のβサブユニットの一部に対して向けられる。実験ではモノクローナル抗体抗−ｈＣＧ−Ａ全体を使用し、その結果を図７Ａ、７Ｂ、８、９Ａ乃至９Ｆ、および１０Ａ乃至１０Ｄに示す。 F（ab'）₂断片は、GreyおよびKunkel，“H Chain subgroups ofmyeloma prote ins and normal 7S globulin”，Ｊ．Exp．Med．120：253-266，1964に記載されている方法を使用し、ペプシンで消化することにより製造した。消化に続いて、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を使用してF（ab'）2断片をFab'断片に還元した。具体的には、３３mgの精製した抗体および１mgのペプシン（シグマ）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）中に溶解させ、３７℃で１６時間消化した。２Ｍトリス塩基で反応混合物のｐＨを８．０に調節することにより、消化を終了させた。F （ab'）₂画分を、リン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．７を溶離液として使用するゲル透過クロマトグラフィー（Superdex Hiload，Pharmacia）により分離した。Fab'断片は、F（ab'）₂断片（１mg/ml）を、０．１７Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中、１．７５mMのＤＴＴおよび３．５mMの四酢酸エチレンジアミン（ＥＤＴＡ）により、室温で４５分間還元して製造した。還元後、過剰のＤＴＴを、５mMのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で平衡化したSephadex G25カラム（Pharmacia）を使用するゲル透過クロマトグラフィーにより除去した。表IIおよびIIIに結果を示す実験では、特異的結合値を、表Ｉに示す様に、¹²⁵ Ｉで標識を付けたｈＣＧを使用して測定し、非特異的結合の測定には¹²⁵Ｉで標識を付けたＢＳＡを使用した。表IIおよびIIIの両方で、固定した抗体は抗−ｈＣＧＡであった。図７Ａ、７Ｂ、８、９Ａ乃至９Ｆ、および１０Ａ乃至１０Ｄおよび表Ｉ乃至II Iの蛍光免疫検定は、ユタ大学で製造した界面フルオロメーターを使用して行なった。それぞれの適当な抗原を固定したシリカ導波管を図３Ａおよび３Ｂの２チャネルフローセルの中に置いた。２つのチャネルは、図４Ａ乃至４Ｃに関して説明した様に、試料および比較物質の測定に使用した。光源は５１４．５nmで放射する空冷式アルゴン−イオンレーザーであった。レーザー光線は２つの平行な光線に分割し、レンズで導波管の２つのチャネルに集束させた。蛍光放射は、コンピュータ制御ＣＣＤカメラに接続したモノクロメーターを使用して５２０〜６２０nmから記録した。蛍光スペクトルは５６０nm〜６００nmで積分し、信号−ノイズ比を改良した。図７Ａ、７Ｂおよび８は、蛍光免疫検定を行なって抗体を検出するための２つの別のフォーマットを使用して得た蛍光強度データを示す。これらの実験では、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（略してｈＣＧ）に対する抗体の検出を、どのフォーマットが最高の感度を与えるかを決定するためのモデルとして使用した。上記の方法は、捕獲分子として使用するために必要な抗原を得さえすれば、プラズマまたは血清の様な生物学的な液体におけるすべての所望の抗体の検出、例えばウイルスおよび細菌性病原体のタンパク質に対する抗体の検出に使用できる。図７Ａ、７Ｂおよび８に示す試験の目的に、検出すべき抗体（分析物）として、ｈＣＧ抗原（ｈＣＧ−Ａと呼ぶ）に対するモノクローナル抗体（抗−ｈＣＧ−Ａと呼ぶ）を選択した。図７Ａのデータは、検定で捕獲分子（抗原または分析物を結合する分子）として作用するｈＣＧ分子全体で得た。図７Ｂのデータは、捕獲分子として、抗−ｈＣＧ−Ａ抗体を選択的に結合する様に構築したオリゴペプチドを使用して得た。この目的に好適な、公知のすべての抗原分析物分子のためのオリゴペプチドは、特許公開第ＷＯ８６／８６４８７号および米国特許第４，７０８，８７１号、並びに科学文献に記載されている様なGeysenらの方法を使用して得ることができる。必要な蛍光染料を付加するために、オリゴペプチドのＮ−末端を変性してアミノ反応性染料用のアミノ基を与えるか、またはＣ−末端を変性してチオール反応性染料用のシステインチオール基を与える。また、完全なオリゴペプチド配列は、付加された染料が結合部位から少なくとも２または３個の残基だけ離れて配置されるのに十分な長さを有するのが好ましい。図７Ａおよび７Ｂの両方の実験において、トレーサーは、テトラメチルローダミン（略してＴＭＲ）で標識を付けたヤギの抗マウスＩｇＧであった。両検定フォーマットに対して、捕獲分子は、実施例IIに記載する様にしてビオチニル化し、アビジン被覆したシリカ基材上に固定した。試験抗体、抗−ｈＣＧＡは、試験溶液中でトレーサー（ヤギの抗マウスＩｇＧ−ＴＭＲ）と予め混合した。サンドイッチ蛍光免疫検定分野の当業者には明らかな様に、抗−ｈＣＧＡ抗体は固定された捕獲分子に結合し、ヤギの抗マウスＩｇＧ−ＴＭＲは今度はマウス抗−ｈＣＧＡ抗体に結合した。この様にして、蛍光サンドイッチが、基材表面上に、消失性光励起の区域内に保持されるトレーサー分子のＴＭＲ部分により形成された。図７Ａおよび７Ｂのデータは下記の方法により得た。異なった濃度の抗−ｈＣＧＡをトレーサー抗体（濃度は１０^-8Ｍに固定）と予め混合し、試料チャネル中に注入した。１０^-8Ｍ濃度のトレーサー抗体を比較試料として比較チャネル中に注入した。試料チャネルの蛍光強度を抗−ｈＣＧＡ濃度に対してプロットし、比較チャネルの蛍光強度も同じ軸の組にプロットした（比較チャネルには抗− ｈＣＧＡを注入していないので、これは実際にはトレーサー抗体の非特異的結合と時間の関係をプロットしたものである）。図７Ａおよび７Ｂは、抗−ｈＣＧＡが固定ｈＣＧおよびオリゴペプチドにそれぞれ結合した後の、サンドイッチフォーマットに関する結果を示す。図８は両方の場合に対応する蛍光増加を示す。図７Ａおよび７Ｂから得たデータを、背景蛍光に関して標準化し、蛍光増加（Ｆ_sample／Ｆ_reference）対ｌｏｇ分析物濃度として再プロットした。応答曲線は、両方の固定抗原（ｈＣＧ全体およびオリゴペプチド抗原）に関して、１０^-13Ｍ〜１０^-10Ｍの抗体濃度の範囲にわたって同様である。しかし、ｈＣＧ全体は精度がより優れていた。また、図７Ａ、７Ｂおよび８から、この検定により、１０^-13モルまでの低い分析物水準（抗−ｈＣＧＡ）を検出できることも明らかである。さらに別の実施態様では、トレーサー抗体濃度を１０^-10Ｍ以下に下げる。これによって、トレーサー抗体の非特異的吸着のために背景蛍光が減少し、そのために感度が１０^-14 Ｍ以上に改良されることが期待される。図９Ａ乃至９Ｃは、サンドイッチ型検定で、抗原を検出するための捕獲分子として抗体を使用して得たデータを示す。前に述べた様に、サンドイッチ免疫検定では、固定された捕獲抗体および溶液中の標識を付けたトレーサー抗体の２種類の異なった抗体を使用する。捕獲抗体およびトレーサー抗体は、抗原の異なった区域に結合しなければならないので、その様な検定では、抗原上の異なったエピオトープに結合する２種類の異なったモノクローナル抗体を一般的に使用する。抗−ｈＣＧ−Ａに加えて、抗−ｈＣＧ−Ａとは異なったエピオトープに結合する他の３種類の抗−ｈＣＧ抗体（それぞれ抗−ｈＣＧ−Ｂ、抗−ｈＣＧ−Ｃおよび抗−ｈＣＧ−Ｄ）をOrganon Teknikaから入手した。抗−ｈＣＧＡだけがｈＣＧに特異的である（他はｈＣＧに関連する特定のホルモンにも結合する）ので、可能な１２対の抗体組合わせの中の６つだけがｈＣＧに対する厳密な選択性を示す。図９Ａ乃至９Ｆは、Fab'断片を抗−ｈＣＧＡ（Fab'−Ａ）から製造し、アビジン−ビオチン結合化学反応を使用して導波管に固定した、異なった組合わせ対から得た結果を示す。抗−ｈＣＧＢ、抗−ｈＣＧＣおよび抗−ｈＣＧＤから製造したFab'断片をテトラメチルローダミンで標識を付け、トレーサー抗体として使用した。図９Ａおよび９Ｂは、トレーサー分子としてのFab'−Ｂを使用した結果を示す。図９Ｃ、９Ｄは、トレーサー分子としてのFab'−Ｃを使用した結果を示す。図９Ｅ、９Ｆは、トレーサー分子としてのFab'−Ｄによる結果を示す。現時点では、ｈＣＧ検定に使用するトレーサーとしてはFab'−ＢおよびFab'− Ｃが好ましい。別のフォーマットでは、逆の方法、すなわち、Fab'−Ａをトレーサー分子とし、Fab'−Ｂ、−Ｃまたは−Ｄを捕獲分子として使用した。しかし、Fab'−Ａを捕獲抗体として使用するフォーマットは一般的に感度が優れている。図９Ｂから、１０^-12Ｍまで低いｈＣＧ濃度は、Fab'−Ａを捕獲分子とする検定により検出できることが分かる。図１０Ａ乃至１０Ｄは、競合または排除検定から得られるデータを示す。アビジン−ビオチン化学反応（図１０Ａ、１０Ｂ）またはヒドロゲル結合化学反応（図１０Ｃ、１０Ｄ）のいずれかを使用してFab'−Ａ断片を導波管に固定した。固定したFab'−Ａ断片にトレーサーオリゴペプチドを１０^-8Ｍの濃度で予め加えた。フローセルの一方のチャネル（試料）に増加する濃度のｈＣＧを加え、他方（比較物質）にＰＢＳ緩衝液を加えた。それぞれの結合化学反応に対して、試料および比較物質の蛍光強度を左側のパネル（１０Ａ＆１０Ｃ）に示し、完全な蛍光の百分率（ｈＣＧが存在しない）を右側のパネル（１０Ｂ＆１０Ｄ）に示す。後者の値は、比較物質の蛍光の変化に対して標準化した。標準誤差をすべてのデータ点についてプロットしたが、場合によってはプロットの記号よりも小さかった。現在、幾つかの理由からサンドイッチ免疫検定が好ましい。第一に、競合検定に対するピコモル濃度と比較して、少なくとも０．１ピコモルまでの濃度の検出を立証することができる。また、本サンドイッチ免疫検定は、５つのlogすなわち１０^-8Ｍ〜１０^-13Ｍの範囲の濃度を検出することができた。したがって、サンドイッチ方法を使用する単一の検定方式が、異なった検出限界を必要とする様々な用途に使用できる。被覆化学作用の別の実施態様、および現時点で非常に好ましい実施態様は、導波管表面に対する結合部分（Fab'断片、抗体、その他）の光活性化された結合部分を与える。光活性化方法を局所的な照射（例えばマスキングによる）と組合せることにより、異なった結合種を導波管表面の異なった区域に順次結合させることができる。この様にして、それぞれ異なった捕獲分子種（FabまたはFab断片）のパッチでパターン化した導波管表面を、異なった種同士の間に壁を設ける必要なしに、都合よく製造することができる。この型の消失性光センサーに関して、不必要な壁を除去することにより、背景を減少させ、消失性光界強度を高めることにより、装置の感度を著しく改良することができる。非常に好ましい実施態様では、被覆化学反応も表面を“不動態化”する、すなわち蛍光トレーサーの非特異的結合を抑え、したがって背景信号を減少させる。現時点で好ましい被覆は、ここで“ブロック共重合体”と呼ばれる種類の化合物である。これは、重合した疎水性残基（ポリプロピレンオキシド、“ＰＰＯ” ）を含む少なくとも１個の疎水性ブロックに隣接する、重合した親水性残基（ポリエチレンオキシド、“ＰＥＯ”）を含む少なくとも１個の親水性ブロックを含む。その様な化合物の、ここで“３ブロック共重合体”または“ＴＢＣＰ”と呼ばれるサブクラスは、親水性ブロックが側面に位置する疎水性ブロックを含む。一連のＴＢＣＰがBASF CorporationからPLURONICSの商品名で市販されている。現時点で好ましい化合物の例は、一般的に文献中でPLURONICS F108または“PF10 8”として知られているが、これは分子量（ＭＷ）が約１４，６００であり、一般式（ＰＥＯ）_x（ＰＰＯ）_y（ＰＥＯ）_xを有し、ｘ＝１２９およびｙ＝５６である。ブロック共重合体の中で、疎水性ＰＰＯ部分がポリスチレンを含むプラスチックに強く吸着し、比較的移動し易い状態のＰＥＯ側方アームを残す傾向がある。ブロック共重合体は、非特異的タンパク質吸着を抑制し、FabまたはFab断片を含むタンパク質に付着するのに有用な親水性側鎖を与える一般的な特性を有する。また、本説明は主としてPLURONICS型化合物に関するが、親水性部分および疎水性部分を有し、タンパク質または光活性化結合剤を付加するための突き出たＯＨ基を与える他の重合体化合物も有用である。この分野で公知の様に、これらの化合物は、SEPHAROSE型物質および他の多糖を含む。また、親水性ブロックとしてポリウレタン部分を含むブロック共重合体も有用である。図１６に関して、パターン化されたポリスチレン導波管を製造する一般的な方法は下記のとおりである。第一に、PF108分子７０２で被覆した導波管表面７００を製造する。次に、導波管の選択された区域におけるPF108分子７０２の遊離ＰＥＯ鎖末端７０４を、光活性化結合反応において光親和力架橋剤７０６を用いて誘導体化する。好適な架橋剤は、イソチオシアネート、スクシンイミドまたはマレイミドの様な反応性官能基に共役結合した光活性化し得る基を有するヘテロ２官能性試薬である。好適な波長（一般的に紫外領域）の光線７０１で照射することにより、架橋剤７０６の光活性化し得る基が反応し、遊離ＰＥＯ鎖末端７０４に共有結合する。マスク７１２が照射を導波管の第一区域７１４に限定する。その結果、導波管表面の第一区域７１４が、Fab'断片だけを結合するのに有用な反応性官能基を有する。次に、導波管表面を第一の種（図１６におけるＦＡＢ１７２０）のFab'断片の溶液中に、Fab'断片を誘導体化した区域に完全に結合するのに十分な時間保持する。次いで未反応のFab'断片を洗い流し、光活性化による誘導体化方法を、導波管の第二の区域で繰り返し、続いてFab'断片の第二の種と反応させる。 Fab'断片を遊離のマレイミド基で誘導体化した導波管区域に結合させる（図１６の手順）には、Fab'断片の溶液による処理を、本質的にＰＭａｈｙ被覆に関して記載した様にして行なうことができる。別の実施態様では、架橋剤がＰＥＯ鎖末端７０４と光反応する前に、Fab'断片７２０を架橋剤７０６に結合させる（図１７）。現時点ではこの実施態様が好ましい。というのは、この様にして形成された表面は、図１６の方法により製造した表面よりも、単位面積あたり多くの分析物並びにトレーサーを結合できるためである。好適な光親和力架橋剤には、アリールアジド（アミンとアミンとの結合）、フッ素化アリールアジド（Ｃ−Ｈ結合手とチオールとの結合）、およびベンゾフェノン（特定の化合物に応じて、Ｃ−Ｈ結合手とアミンとの結合またはＣ−Ｈ結合手とチオールとの結合）がある。それぞれの種類の例を、対応する光活性化結合反応と共に、図１８Ａ乃至１８Ｄに示す。現在、Ｃ−Ｈ結合手とチオールとの結合を与えるベンゾフェノンが、Fab'断片への部位特異的な結合を達成するのに使用できるので好ましい。ベンゾフェノンのヨードアセトアミドまたはマレイミド誘導体（それぞれ“ＢＰＬＡ”または“ＢＰＭ”）がこの目的を達成することができる。現在、特異的結合の程度がより高く、非特異的吸着の程度が低いので、ＢＰＭが好ましい。これは、前にＰＭａｈｙ被覆に関して説明した様に、Fab'断片のＣ−末端チオール基を介して結合が起こるからである。遊離のマレイミド基を与える他の光親和力架橋剤も同様に好適であろう。光結合方法で、PF108に結合する架橋剤の量は、照射の期間および強度、架橋剤分子の濃度等により異なる。これらの変動要素は、容易に試験および最適化することができ、導波管表面に結合する架橋剤および／またはFab'タンパク質の所望の程度を達成するパラメータを発見することができる。一般的に、約０．５mg /ml〜１mg/mlのFab'濃度、および２０倍モル過剰の架橋剤が、図１６および１７の工程に有効である。表IVは、架橋剤ＢＰＭ対ＢＰＩＡに対して、異なる４種類のＴＢＣＰのひとつで被覆した、または被覆していない表面に対して、および図１６の手順対図１７の手順に対して得た、特異的結合および非特異的結合の程度に関する比較データを示す。これらのＴＢＣＰは、PF108とやはりBASFから市販の、商品名PP105、PF 68、およびPF88で呼ばれる他の３種類である。これらの化合物の、それぞれのＰＥＯ／ＰＰＯ／ＰＥＯ比および分子量は、３７／５６／３７（PP105、ＭＷ＝６５００）、７６／３０／７６（PF68、ＭＷ＝８４００）、および１０４／３９／１０４（PF88、ＭＷ＝１１，４００）である。モデル方式として、９−４０抗−フルオレイン抗体に由来するFab'断片を捕獲分子として、分析物を表わすフルオレセイン共役ＢＳＡを用いて使用する。ＢＳＡに放射能標識を付けた。特異的結合は、フルオレセイン−ＢＳＡ−共役の結合として測定し、非特異的結合は本来の（共役していない）ＢＳＡの結合から測定した。表IVのデータから、非特異的結合の程度は、PF68およびPF88に関するよりも、 PF108およびPP105被覆に関して著しく低いことが明白である。この理由から、PF 108およびPP105が、現時点で好ましいＢＣＰである。一般的に、ＴＢＣＰ化合物の中で、非特異的結合に対して優れた耐性を示す（したがって現在好ましい）化合物は、長さが約４５〜５０残基以上のＰＰＯ部分を有する化合物である。望ましくは、非特異的結合の程度は、特異的結合の程度の約１０％以下、好ましくは約１％〜２％未満である。あるいは、またはそれに加えて、非特異的結合の絶対量は約５×１０^-14未満、好ましくは約５×１０^-15未満であるのが望ましい。ＴＢＣＰの親水性／疎水性バランスも、総ＭＷも、化合物中のＰＥＯ対ＰＰＯの分子量比も、良好な効率で非特異的結合を抑制するＴＢＣＰを選択する上で、ＰＰＯ断片の長さ程重要であるとは思われない。表Ｖは、PF108被覆したポリスチレン導波管への非特異的結合に対する様々なＴＢＣＰの被覆時間の効果に関する比較データを示す。達成された非特異的結合の水準は、短くて少なくとも１０分間から、長くて少なくとも２４時間までの被覆時間に対して見分けがつかないことが分かる。表IVおよびＶに示すデータから、最良の結果は、PF108およびPP105およびFab' 濃度１．５×１０^-6Ｍで得られる様である。上記のＴＢＣＰに加えて、ＰＥＯ／ＰＰＯのジブロック共重合体（ＤＢＣＰ）も、非特異的結合を抑制するための導波管被覆として効果的であろう。ここで、ＴＢＣＰと同様に、一般的に約４０〜４５残基を超える、十分な長さのＰＰＯ断片を有する化合物がより効果的であろう。現在、これらの化合物の非特異的結合抑制にはＰＥＯブロックが大きく寄与するので、ＤＢＣＰよりＴＢＣＰの方が好ましい。上記の結合方法はポリスチレン導波管で非常に効果的であるが、石英、ガラス、およびオキシ窒化ケイ素の様なシリカ系基材にはあまり効果的ではない。シリカ系基材は、“集積導波管チップ”バイオセンサーの開発の観点から得に重要である。したがって、オキシ窒化ケイ素導波管のための光結合方法の別の実施態様では、表面のシリカと自由に反応するシリル基を有するシリカ親和性付与剤をPF 108の代わりに使用する。有用なシラン化（シリカ親和性付与）剤の例は、分子量約３５００〜５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）トリメトキシシラン（“ＰＥＧ−シラン”）、アミノプロピル−トリエトキシシラン（ＡＰＳ）、およびジクロロジメチルシラン（ＤＤＳ）である。この実施態様では、より良い非特異的結合抑制特性のために、ＰＥＧ−シランおよびＡＰＳが現在好ましい。シリカ系基材に関する別の実施態様では、表面をシラン化剤で被覆する。次いで、シラン化した表面を、選択された区域で、ポリスチレン/PF108の方法に関して説明したのと同様の方法で、光−親和力架橋剤で変性する。基礎被覆としてＡＰＳを使用する場合、好適な架橋剤は、ＡＰＳ中のアミノ基をFab中のアミン基に架橋するアリールアジド（図１８Ａ乃至１８Ｄ）であろう。しかし、この方法では、Fabが複数のアミン基を有するので、Fabが導波管表面に部位特異的に付着しない。あるいは、部位特異的なFab付着を達成するために、前に説明した様に、ＰＥＧをＡＰＳに結合させ、Fab断片をＰＥＧに付着させるのにベンゾフェノン架橋剤を使用できた。後者の方法に関する化学反応は、ベンゾフェノン架橋剤によるFab断片のPF108への部位特異的な結合と同様であろう。次に、選択されたFab'断片を架橋剤上の遊離官能基に結合させる。この方法の残り（様々な種のFab'に対する上記工程の繰り返し）は、ポリスチレン導波管のそれと同様である。さらに他の、シリカ型導波管に有用な実施態様では、ＤＤＳ（ジクロロジメチルシラン）の様な、疎水性表面を形成するシリカ親和性付与剤で導波管を被覆し、続いてPF108の様なブロック共重合体で被覆する。PF108は疎水性の第一被覆に接着し、結合方法の残りの部分は、ポリスチレン導波管に関して説明したのと実質的に同様である。好ましいＴＢＣＰ化合物およびシリカ親和性被覆剤の選択において、非特異的結合の相対的および／または絶対的な水準の同様な考え方が適用される。上記のパターン化方法は、局所的架橋剤光活性化の好適な光源を必要とする。上記の様に、局所的な光結合は、レンズおよびマスクを備えた、キセノンランプの様な非干渉性光源で実行することができる（図１５）。３００nm帯域フィルターおよびマスクを備えた水銀蒸気ランプは、有用な非干渉性光源のもう一つの例である。あるいは、アルゴンイオンレーザーの様な干渉性ＵＶ光源を、変換工程と組合せて使用することができる。後者の実施態様では、所望の局所的な照射に、マスクを使用しても、しなくてもよい。上記の実験例および結果は、hCG抗原／抗hCG抗体およびフルオレセイン／抗フルオレセイン抗体系を使用して得たが、当業者には明らかな様に、この装置およびバイオセンサー、並びに部位特異的な導波管結合方法および検定フォーマットはすべて、適当な捕獲分子の様な必要な試薬が得られるすべての抗原および抗体の検定に、過度の実験なしに応用できる。さらに、トレーサー分子の標識付けに有用であるとして、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、およびシアニン染料を具体的に挙げたが、この装置および方法は、所望のトレーサー分子に共役させることができる他の蛍光染料でも有用であることは明らかである。また、本出願の新規な主題を、主として、消失性光界により励起し、消失性光界は光線を導波管の縁部または末端に向けることにより形成し、得られた蛍光を消失性光区域から直接（例えば、導波管中に戻る消失性光を経由してではなく）収集する装置に関して説明したが、この主題の光学的並びに化学的部分の多くの要素の有用性は、その様に限定されるものではない。本主題における多くの要素は、消失性光バイオセンサーの別の形態でも有用である。その様な他の形態の一つは、トレーサー分子が非消失性光源により励起され、蛍光が、導波管中を伝播し、縁部または末端で収集される消失性光として収集される形態である。その様な他の形態のもう一つは、縁部または末端から照明される導波管を経由して消失性光界励起を与え、導波管中に逆透過する消失性光による蛍光を収集する。さらに、本発明の概念および範囲から逸れることなく、上記の装置およびバイオセンサーに様々な修正および置き換えが可能であることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ワン，フ−クンアメリカ合衆国．84102 ユタ，ソルトレイクシティ，ナンバー２，エリザベスストリート 73 (72)発明者コールドウェル，カリン，ディー. アメリカ合衆国．84121 ユタ，ソルトレイクシティ，イーストゴールデンヒルスドライヴ 3645 (72)発明者ヤナトワ，ヴェラチェッコ，162 00 プラハ６，ナペトリナッハ（番地なし) (72)発明者ホアン，シャオ−チーアメリカ合衆国．84107 ユタ，ソルトレイクシティ，ナンバー24，サウス 4900 イースト 800 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．第一および第二の平行で平らな表面、および該第一および第二表面の間を伸びる縁部を有する平らな導波管をであって、該縁部が光を受けるための受光区域を有し、該表面の少なくとも一方がその上に固定された複数の捕獲分子を有し、該捕獲分子がそれぞれ分析物を選択的に結合する結合部位を有する導波管と、該受光縁部に隣接して該導波管に一体化されている半円筒形のレンズとからなることを特徴とする均質固相蛍光免疫検定用装置。２．所望の波長領域の光線を与え、かつ該光線を前記レンズ中に向ける様に配置された光源、前記導波管表面の少なくとも一方の上に形成された１個以上の貯蔵部であって、該貯蔵部のそれぞれが、緩衝液、少なくとも１種の前記分析物の複数の分子、および前記光線から生じた消失性光で刺激したときに蛍光を放射し得る複数のトレーサー分子を含む試料溶液を含む様に形成された貯蔵部、および本質的に前記蛍光からなる蛍光信号を直接検出する様に配置された検出手段であって、前記表面に対して平行で前記表面から離れた平面上に前記蛍光が衝突するように前記蛍光を収集する配置されたレンズ手段を含む検出手段をさらに含む請求項１の装置。３．間隔を置いて配置された前記固定捕獲分子の複数のパッチを有し、かつ前記検出手段が、該パッチの個々の一つにそれぞれ対応する複数の蛍光信号を同時に個別に収集する様に形成されている請求項２の装置。４．前記検出手段が、前記離れた平行な平面内で互いに間隔を置いて配置された複数の光検出素子、および前記蛍光信号のそれぞれを該光検出素子のそれぞれの一つに集める様に配置されたレンズ手段を有する画像形成検出器を含む請求項３の装置。５．前記導波管および前記レンズが、光学プラスチックで形成されかつ一体成形されている請求項１または２の装置。６．前記半円筒形レンズが、シート状の光線を非ゼロ角度で前記受光縁部の中に向ける方向で配置された焦点区域を有し、該角度が前記導波管および水性媒体の間の界面で光の全内部反射をする臨界角度未満である請求項１、２または５の装置。７．前記導波管が、末端縁部を形成する鋸歯状部分を有し、該末端縁部が前記受光縁部および前記半円筒形レンズと反対側の末端に配置されている請求項１または６の装置。８．前記導波管が請求項９の光学基材である請求項１、２、３又は４の装置。９．前記導波管が、請求項１０による光学基材であり、かつ導波管厚さを有し、さらに、前記光源と前記半円筒形レンズの間に位置して、光線を一般的に前記導波管の厚さの約２倍未満の厚さを有するシート状光線に形状変換するための光線形状変換手段を含む請求項２、３又は４の装置。１０．光信号により対応する分析物を検出するために、該分析物を特異的に捕獲するのに有用な捕獲分子が結合されている、固相検定に有用な光学基材であって、該基材に対する非特異的な結合の量を適度に低くする被覆を施した区域を有する光学表面を含み、該被覆が、ポリメタクリロイル重合体からなるヒドロゲル、シリル−誘導体化されたポリエチレングリコール、アビジン、および本質的に親水性残基からなる少なくとも１種の親水性重合体ブロックに隣接する、本質的に疎水性残基からなる少なくとも１種の疎水性重合体ブロックを含むブロック共重合体からなる群から選択されることを特徴とする光学基材。１１．前記被覆区域に共有結合された１種類以上の捕獲分子種をさらに含み、該１種類以上の種のそれぞれが、対応する分析物に特異的に結合する様に構築されている請求項１０の光学基材。１２．光応答性結合部分および捕獲分子を共有結合できるタンパク質結合部分を有する架橋剤をさらに含み、該架橋剤が、アリールアジド、フッ素化アリールアジド、およびベンゾフェノンからなる群から選択され、該架橋剤が、前記光応答性結合部分を介して前記被覆に共有結合する請求項１０の光学基材。１３．前記架橋剤の前記タンパク質結合部分を介して前記被覆区域に共有結合された１種類以上の捕獲分子種をさらに含み、該１種類以上の種のそれぞれが、対応する分析物に特異的に結合する様に構築されている請求項１２の光学基材。１４．前記被覆が、一般式（ＰＥＯ）_x（ＰＰＯ）_y（ＰＥＯ）_z （式中、ＰＥＯ＝ポリエチレンオキシドおよびＰＰＯ＝ポリプロピレンオキシドであり、ｘ、ｙおよびｚのそれぞれが約３０〜約１５０である）を有するブロック共重合体である請求項１０、１２又は１３の光学基材。１５．前記捕獲分子のそれぞれが、それぞれの中に反応により配置されたチオール基を有し、および前記捕獲分子が該チオール基を介して前記被覆に結合される、請求項１２又は１４の光学基材。１６．前記架橋剤がベンゾフェノンマレイミドである請求項１２又は１４の光学基材。１７．前記光学基材が、シリカ系材料であり、および前記光学表面と前記被覆の間で前記区域に塗布された下塗りをさらに含み、該下塗りが、少なくとも１個の反応性シリル基を有するシリカ親和性剤を含む請求項１０、１２又は１６の光学基材。１８．請求項１０の光学基材の製造方法であって、光学基材の区域を、ポリメタクリロイル重合体からなるヒドロゲル、アビジン、メトキシポリ（エチレングリコール）トリメトキシシラン、および本質的に親水性残基からなる少なくとも１種の親水性重合体ブロックに隣接する、本質的に疎水性残基からなる少なくとも１種の疎水性重合体ブロックを含むブロック共重合体、からなる群から選択された被覆で被覆する工程を含む方法。１９．光応答性結合部分および捕獲分子を共有結合できるタンパク質結合部分を有する、アリールアジド、フッ素化アリールアジド、およびベンゾフェノンからなる群から選択された光親和力架橋剤を用意する工程、該被覆した光学表面を、該光応答性結合部分を活性化するのに適した光で照射する手段を用意する工程、および該前記照射手段を操作し、該被覆した光学表面を該架橋剤の存在下で照射し、該光応答性結合部分を活性化し、それによって該架橋剤を該被覆に共有結合させる工程をさらに含む請求項１８の方法。２０．対応する分析物を特異的に結合する様にそれぞれ構築され、分子内にそれぞれ反応により配置されたチオール基を含む１種類以上の捕獲分子種を用意する工程、および該捕獲分子を、該チオール基を介して前記被覆に結合させる工程をさらに含む請求項１８又は１９の方法。２１．対応する分析物を特異的に結合する様にそれぞれ構築された１種類以上の捕獲分子種を用意する工程、および該捕獲分子を、前記架橋剤の前記タンパク質結合部分に結合させる工程をさらに含む請求項１９の方法。２２．複数の捕獲分子種を用意し、前記照射手段を用意する工程が、前記導波管の前記被覆区域の複数の部分を個別に順次照射する手段を用意する工程を含み、および前記照射工程が、前記被覆区域の前記部分を前記架橋剤の存在下で選択的に順次照射する工程である請求項２１の方法。２３．前記捕獲分子を前記架橋剤に結合させる前記工程が前記照射工程の前に行なわれる請求項２１または２２の方法。２４．前記の個別に順次照射する工程が、遊離架橋剤の存在下で前記被覆区域の前記部分の一つを照射する工程、前記捕獲分子種の１種類を前記架橋剤に結合させる工程、および部分を前記照射する工程および捕獲分子の１種を結合する工程を交互に繰り返す工程を含み、該交互に繰り返す工程が、前記部分のそれぞれに対して前記複数の種と異なった種で行なわれる請求項２２又は２３の方法。２５．分析物に特異的な捕獲分子を光学基材に結合させ、該分析物が該捕獲分子に結合することにより、試料中の該分析物の存在に対応する蛍光信号を発生させる固相蛍光免疫検定を行なう方法であって、請求項１のバイオセンサーを用意する工程、半円筒形レンズを通して導波管中に光線を送る様に配置された光源を用意する工程、導波管表面と平行なかつ導波管表面から離れた面上に当たる蛍光を検出するために配置された検出手段を用意する工程、表面上に固定した捕獲分子を有する該導波管表面を、緩衝液、分析物の存在下で該捕獲分子に結合することができかつ光線で刺激したときに蛍光信号を放射できる複数のトレーサー分子、および未知量の分析物分子を含む溶液と接触させる工程、該導波管表面と該接触溶液とを維持し、該トレーサー分子を該分析物分子および該捕獲分子と結合させる工程、光源を作動させ、該導波管から消失性光を発生させ、該トレーサー分子を刺激する工程、検出手段を作動させ、該トレーサー分子から放射された該蛍光信号を検出する工程、および該放射された蛍光信号を解析し、試験試料中の分析物の量を決定する工程を含むことを特徴とする方法。２６．前記導波管バイオセンサーを用意する工程において、前記導波管が請求項１０、１１または１２の光学表面を有し、前記用意された検出手段が、複数の光検出器素子および被覆区域の複数の部分からの光を該光検出器素子のそれぞれ対応する部分に向ける方向に配置されたレンズ手段を含む請求項２５の免疫検定方法。２７．結合していないトレーサーを前記表面から洗い流すための洗浄工程なしに行なわれる請求項２５の免疫検定方法。