JPH08510721A - 乳からの対象化合物の単離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 乳試料から対象成分を単離する方法を記載する。該方法は、対象成分が有意な損失を伴わずに単離されうるようなやりかたで全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化される段階を包含する。対象成分を含有する乳試料の全蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化するためのキットも記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 乳からの対象化合物の単離発明の背景 天然の乳成分は、ヒトの食事に取り入れられてから長い歴史があり、比較的単 離し易いため、長い間研究対象となってきた（スウェイスグッド,エイチ・イー （Swaisgood,H.E.）,ディベロップメンツ・イン・デイリー・ケミストリー−Ｉ ：ケミストリー・オブ・ミルク・プロテイン（Developments in Dairy Chemistr y-I:Chemistry of Milk Protein），（ニューヨークのアプライド・サイエンス ・パブリッシャーズ（Applied Science Publishers），１９８２年）。最近にな って、研究者らは、対象とする特定の蛋白をトランスジェニック動物の乳腺組織 に合成させることにより、乳中に通常は産生されない蛋白の便利な源として乳を 利用している。例えば、研究者らは、β−ラクトグロブリン遺伝子およびヒト・ 抗血友病因子IX遺伝子の暗号配列からなる融合遺伝子をヒツジ・生殖細胞系に導 入した（クラーク,エイ・ジェイ（Clark,A.J.）ら，（１９８９年５月）バイオ テクノロジー（Biotechnology）第７巻：４８７〜４９２頁）。結果的に、乳を 分泌するトランスジェニックヒツジはその乳中に因子IXを分泌した。同様に、ヤ ギ・生殖細胞系を操作して、ヒト・長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベー ター（longer-acting tissue-type plasminogen actinator）の暗号配列に結合 したネズミ・乳清酸性蛋白の遺伝子由来の調節配列を含む融合遺伝子を取り込ま せた（エバート,ケイ・エム（Ebert,K.M.）ら，（１９９１年９月）バイオテク ノロジー（Biotechnology）第２巻：８３５〜８３８頁）。トランスジェニック 乳ヤギ由来の乳は、修飾された組織プラスミノゲンアクチベーターを含有してい た。 トランスジェニック家畜の乳中の治療薬のごとき対象蛋白の生産は、哺乳動物 細胞培養系における複雑な組み換え蛋白の慣用的な生産に典型的に付随する経費 が軽減された、かかる蛋白の大規模生産を提供する。乳中における蛋白のトラン スジェニック発現は、組み換え蛋白発現という伝統的な方法に優る利点を提供す るが、いくつかの問題もある。これらの問題は、乳中における組み換え蛋白の活 性の保持および実行可能な商業的生産のための精製度にまで蛋白を精製すること を包含する。 乳からの対象蛋白の伝統的単離方法は、しばしば、沈降（スウェイスグッド, エイチ・イー（Swaisgood,H.E.），ディベロップメンツ・イン・デイリー・ケミ ストリー−Ｉ：ケミストリー・オブ・ミルク・プロテイン（Developments in Da iry Chemistry-I:Chemistry of Milk Protein），（ニューヨークのアプライド ・サイエンス・パブリッシャーズ（Applied Science Publishers），１９８２年 ）、沈殿（コーセ（Kothe）ら,米国特許第４６４４０５６号；グローブス,エム ・エル（Groves,M.L.）ら，（１９８５年）バイオケミ・エト・バイオフィジ・ アクタ（Biochem.et.Biophys.Acta）第８４４巻：１０５〜１１２頁；マッケン ジー,エイチ・エイ（McKenzie,H.A.），ミルク・プロテインズ：ケミストリー・ アンド・モレキュラー・バイオロジー（Milk Proteins:Chemistry and Molecula r Biology），ニューヨークのアカデミック・プレス（Academic Press），１９ ７１年,８８頁）またはレニンもしくはキモトリプシンを用いる酵素的凝固（ス ウェイスグッド,エイチ・イー（Swaisgood,H.E.），ディベロップメンツ・イン ・デイリー・ケミストリー−Ｉ：ケミストリー・オブ・ミルク・プロテイン（De velopments in Dairy Chemistry-I:Chemistry of Milk Protein），（ニューヨ ークのアプライド・サイエンス・パブリッシャーズ（Applied Science Publishe rs），１９８２年）のいすれかによる主要乳成分の分画を、その最初の段階とし て必要としていた。これらの方法に伴う問題は、除去されるべき乳成分の沈殿中 への捕捉による対象蛋白の損失が原因である低収率、および酸沈殿にしばしば必 要とされる低ｐＨによる対象蛋白の生物学的活性の損失を包含する。デンマン, ジェイ（Denmen,J.）ら，（１９９１年９月）バイオテクノロジー（Biotechnolo gy）第９巻：８３９〜８４３頁参照。そのうえ、乳からの対象蛋白の伝統的単離 方法は、主要乳成分の沈降、沈殿または凝固を必要とするため、乳試料は、容易 に濾過により処理できない。発明の概要 本発明は、乳からの蛋白のごとき対象成分の単離方法に関する。本発明は、少 なくとも部分的には、伝統的方法を用いて乳試料から得られた対象とする生物学 的に活性な成分の低収率は、本質的には、最初の分画段階の沈殿に対象成分が捕 捉されるためであるという認識に基づく。本発明方法は、全乳蛋白の少なくとも 一部の溶解性を安定化する安定化剤を提供することにより、対象成分の不活性化 および捕捉を回避するものである。安定化した乳試料から沈降または沈殿すると いうよりはむしろ、そして対象成分と結合するというよりはむしろ、全乳蛋白の 少なくとも一部は可溶性のままであり、その結果、対象成分の精製の間に除去さ れる。さらに、本発明方法は、先行方法のような低ｐＨを必要としないため、ｐ Ｈ感受性対象成分の不活性化が回避される。 本発明は、対象成分を含有する乳試料から対象成分をその生物学的活性形態で 単離する方法に関する。より詳細には、本発明は、全乳蛋白の少なくとも一部の 溶解性を安定化させる条件下で、対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触さ せることによる、乳試料からの対象成分の単離方法に関する。安定化後、有意な 損失を伴わずに対象成分をを単離することができ、安定化した乳試料から対象成 分をその生物学的に活性な形態で単離することができる。 さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料を、乳試料を濾過により処理可能 な形態にする安定化剤と接触させることによる、乳試料からの対象成分の単離方 法に関する。次いで、対象成分は、濾過により処理可能な乳試料から単離される 。 さらに本発明は、上記方法および対象成分を含有する乳試料中の全乳蛋白の少 なくとも一部の溶解性を安定化する方法を用いて単離された対象成分に関する。 単離された対象蛋白を、細胞培養用培地への添加物、食料品、医薬組成物として 使用することができる。さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料の全蛋白の 少なくとも一部の溶解性を安定化させるキットを使用するための説明書を伴った 上記方法に使用される試薬を含むキットに関する。図面の簡単な説明 図１は、１２種の異なる濃度のアルギニンに関し、乳試料中の全乳蛋白の一部 の可溶化の程度を示す写真である。 図２は、１２種の濃度のアルギニンに関し、図１で示したアルギニン可溶化段 階から得られた上清の長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター（ＬＡ− ｔＰＡ）に対する相対蛋白濃度を示す。 図３は、１２種の異なるイミダゾール濃度に関し、乳試料中の全乳蛋白の一部 の可溶化の程度を示す写真である。 図４は、１２種の異なるイミダゾール濃度に関し、図３で示したイミダゾール 可溶化段階からの上清のＬＡ−ｔＰＡ活性に対する相対蛋白濃度を示す。 図５は、１０種の異なる濃度のビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）に関し、乳 試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す写真である。 図６は、１０種の異なるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度に関し、図５で示したＢｉｓ− Ｔｒｉｓ可溶化段階からの上清のＬＡ−ｔＰＡ活性に対する相対蛋白濃度を示す 。 図７Ａ〜７Ｅは、ｐＨを変化させた場合の種々の濃度のアルギニンに関する、 乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す５枚の写真である。 図８は、乳試料のｐＨの調節前にアルギニンを乳試料に添加した場合に、アル ギニンにより媒介される全乳蛋白の一部の可溶化の際得られた上清のＬＡ−ｔＰ Ａ活性に対する相対蛋白濃度を示す。発明の詳細な説明 本発明は、対象成分の有意な損失を伴わずに、対象成分を含有する乳試料から 対象成分を単離する方法に関する。該方法は、全乳蛋白のうち少なくとも一部の 溶解性を安定化させる条件下で、対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触さ せて対象成分が安定化された乳試料から単離されうるようにすることを包含する 。次いで、対象成分は生物学的に活性な形態で、安定化された乳試料から単離さ れる。 「対象成分」なる語は、該対象成分に有意な悪影響を伴わずに、上記方法を用 いて乳から単離されうる、乳試料中に存在する物質を包含する。対象成分は、乳 試料中の天然物質であってもよく、あるいは乳試料中に通常は存在しない物質で あってもよいが、トランスジェニック動物の乳腺組織において、最終的にはかか る動物の乳中に誘導される物質を目的とする。対象成分は遊離形態であってもよ く、あるいは乳中に存在する他の物質中、例えば、乳脂肪球および／または乳脂 肪球を包んでいる膜の中に捕捉または封入されていてもよい。（例えば、ディト リオ（DiTollio）ら，（１９９２年）バイオテクノロジー（Biotechnology）第 １０巻：７４〜７７頁参照）。対象成分の例は、カゼイン、ラクトフェリン、β −ラクトグロブイン、免疫グロブリンのごとき蛋白、オレイン酸、パルミチン酸 およびミリスチン酸のグリセリドのごとき脂質、ラクトースおよびより複雑なオ リゴ糖のごとき多糖、またはビタミンＡおよびビタミンＢ複合体のごときビタミ ン、リン、カリウム、鉄、マグネシウム、銅ならびにカルシウムのごときミネラ ルと一緒になった上記成分のいずれかを包含する。例えば、対象成分を、正常な 分泌経路を通して乳中に産生させることができる。蛋白の正常な分泌経路は、粗 面小胞体での蛋白の合成、小胞体内腔中の蛋白の通過、次いで、ゴルジ体への輸 送を包含しうる。最終的には、蛋白（または糖鎖付加蛋白）は、細胞質中につま み出され、その結果、細胞質膜に融合する小胞中に詰められる。別の分泌経路は 、嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーター（cystic fibrosis transmembrane co nductance regulator）の場合のように、膜から対象成分を含有する乳脂肪球を 泡のように放出することを包含する。 天然乳成分は、培養において、ある種の細胞の無血清下での増殖時に添加する のに有用であることがわかっている。ステイマー,ケイ・エス（Steimer,K.S.） ら，（１９８１年１１月）ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー（J.Cell P hysiol.）第１０９巻（２）：２２３〜２３４頁（上皮細胞および線維芽細胞） ；ステイマー,ケイ・エス（Steimer,K.S.）およびクラグスブルン,エム（Klagsb run,M.）（１９８１年２月）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell.B iol.）第８８巻（２）：２９４〜３００頁（正常および形質転換線維芽細胞）参 照。乳成分は食品にも使用されうる。例えば、乳成分の餌への混合は、最終産物 の栄養価を増大させる。例えば、ルデル,エイチ・ダブリュウ（Rudel,H. W.）ら，米国特許第５１７８８９４号参照。別法として、乳成分を、冷凍乳製品 デザート類のごとき乳製品に添加してボディーやテクスチャーを成分に付加し、 温度不安定性を減少させることもできる（フアング,ブイ・ティー（Huang,V.T. ）ら，米国特許第５１７５０１３号）。乳成分をチーズ製造に使用することもで きる（イー,ジェン−ジュング（Yee,Jen-Jung）ら，米国特許第５１６５９４５ 号）。 さらに、「対象成分」なる語は、非トランスジェニック哺乳動物から得られる 乳試料中に通常は存在しないがトランスジェニック哺乳動物から得られる乳試料 中に分泌される化合物をも包含する。かかる対象成分の例は治療薬を包含する。 治療薬は、適当な条件下で適量投与した場合、哺乳動物に治療効果をもたらす薬 剤である。望ましい治療効果は、治療すべき疾病または症状による。上記適量ま たは症状は、個体により決定され、治療すべき個体の大きさ、治療すべき徴候の 重大さ、および選択された治療薬の投与経路によるであろう。治療薬の例は、イ ンシュリン、長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター（ＬＡ−ｔＰＡ） 、アンチトロンビンIII、ａ−１−抗−トリプシン、可溶性ＣＤ４、インターロ イキン−２、免疫グロブリン、嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーター、および 凝固因子VIIIならびにIXを包含する。 「トランスジェニック哺乳動物」なる語は、例えば、その生殖細胞または体細 胞のごとき細胞が、遺伝的に、外来ＤＮＡセグメントが導入されるように操作さ れている哺乳動物をいう。トランスジェニック哺乳動物の例は、トランスジェニ ックウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスを包含する。典型 的には、低費用で対象成分の大規模生産を行うためには、産生する乳量に応じて 哺乳動物を選択すべきである。好ましくは、大量の乳を産生できるという理由で 、ウシ、ヒツジおよびヤギのごとき大型のトランスジェニック家畜が選択される 。 「生物学的に活性のある」なる語は、その意図された機能を発揮することを可 能にする対象成分に関する活性を包含する。該対象成分は、天然に存在するもの と同等の活性を有することはないが、それに非常に近い活性を有する。 「乳試料」なる語は、対象成分を含有する哺乳動物由来の乳を含んでいる試料 を包含する。乳試料は、哺乳動物から直接得られる試料であってもよく、あるい は、意図された機能を発揮するために、対象成分または安定化剤の能力に悪影響 を及ぼさないやり方で処理された試料であってもよい。さらに、意図された機能 を発揮させるために、対象成分または安定化剤の能力に悪影響を及ぼさない薬剤 を用いて乳試料を濃縮または希釈してもよい。乳試料中の乳量は、対象成分の存 在を確認するに十分な量である。 「安定化剤」なる語は、全乳蛋白および／または対象成分の少なくとも一部を 可溶化および／またはその溶解性を維持させる化合物を包含する。「〜の溶解性 を維持」なる語は、後の処理段階、例えば、ｐＨ調節の間において、全乳蛋白の 一部を乳試料から沈殿させないでおき、乳試料のさらなる処理または対象成分の 単離を妨害させないでおく程度の溶解性の維持を包含する。この溶解性の維持は 、一定値の溶解性の維持である必要はないが、適当な範囲での溶解性の維持であ ってよい。かかる薬剤の例は、アミノ酸および正に荷電したバッファーのごとき １価および多価カチオン性薬剤である。正に荷電した有用なバッファーは、アル ギニン、イミダゾールおよびＢｉｓ−Ｔｒｉｓを包含する。安定化剤のｐＨは、 典型的には、該薬剤が正に荷電するように選択される。 「溶解性を安定化」なる語は、全乳蛋白の少なくとも一部を可溶化および／ま たはその可溶化の維持を包含する。カゼインのごときある種の主要乳蛋白は、本 質的には乳中において部分的に不溶性または不溶性形態である。乳のｐＨの低下 は、これらの乳蛋白の少なくとも一部の沈殿を生じさせうる。しかしながら、対 象成分の単離には、対象成分が可溶性のままであるように乳試料のｐＨを調節す ることが必要となりうる。さらに、乳試料のｐＨの調節は、全乳蛋白の少なくと も一部の沈殿を促進する傾向がある。ｐＨ調節の前、調節中、後において、可溶 化剤は、これらの蛋白を可溶化そして／またはそれらの溶解性を維持する。さら に、別の対象とする成分の単離は、それを可溶化またはその溶解性を維持するた めのｐＨ調節を必要としないが、沈殿した乳蛋白による妨害なしに全乳蛋白の少 なくとも一部を可溶化させ、そして／またはその溶解性を維持してさらなる乳試 料の処理を行うには、やはり、可溶化剤は必要である。 安定化剤の濃度は、安定化剤が対象成分の機能特性を保存し、全乳蛋白の少な くとも一部の溶解性を安定化させるように選択される。例えば、対象成分が酵素 である場合、高イオン強度は酵素活性を減少させる可能性があるため、バッファ ー濃度は可能なかぎり低くすべきである。それゆえ、乳からの特定の対象成分の 単離に必要な安定化剤の濃度は、安定化剤自体の特性および単離される対象成分 の特性に応じて変更されよう。例えば、約０.３Ｍのアルギニン濃度は、ＬＡ− ｔＰＡの機能特性の保存および全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定化にお いて、０.３Ｍのイミダゾールよりも効果的である。 安定化剤が乳試料と接触して安定化された乳試料を生成する条件は、対象成分 の機能特性が保存され、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化されるよう に選択される。通常の当業者は、通常の実験のみにより、乳試料のｐＨ、単離に 使用する薬剤濃度、および対象成分の機能特性ならびに全乳蛋白の少なくとも一 部の溶解性の安定性に影響しうる他の因子のごとき条件を操作することができよ う。 乳試料対象成分を含有する乳試料のｐＨは、通常には、対象成分がその溶解性 および機能特性を保持し、全乳蛋白の一部の溶解性が安定化されるようなレベル に調節される。ｐＨが調節されるレベルは、いくつかの因子により決定されうる 。対象成分が、その天然のおよび／または生物学的な活性形態にあるｐＨ範囲は 、これらの因子に包含される。例えば、酵素のごときある種の対象成分は、狭い ｐＨ範囲において活性でありうるし、この範囲外のｐＨに曝露することは不可逆 的な活性の損失を引き起こす可能性がある。それゆえ、対象成分の機能的形態ま たは天然型の対象成分を得るためには、許容される範囲内にｐＨを調節しなくて はならない。約５.０ないし約９.０のｐＨ範囲は、生物学的活性を有する多くの 対象成分がその活性を保持する典型的な範囲の例である。「約５.０」なる語は 、下記において定義される。「約９.０」なる語は、ｐＨ９.０と同一または同様 の影響を対象成分に及ぼす９.０に近いｐＨを包含し、例えば、好ましくは８.５ およびそれ以上、より好ましくは８.８およびそれ以上を包含する。 ｐＨ調節において考慮すべき別の因子は全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が 安定化されるレベルである。対象蛋白を含有する乳試料のｐＨは、一般的には、 乳成分が乳から沈殿するレベルよりも低くなってはならない。例えば、２０℃、 約４.６においてカゼインは沈殿する。ｐＨは、対象成分が不溶性になるのを防 止するレベルに維持されるべきである。例えば、ヒト・長期作用性組織型プラス ミノゲンアクチベーター（ＬＡ−ｔＰＡ）含有乳試料のｐＨを約５.０まで低下 させるとＬＡ−ｔＰＡは可溶性のままである。「約５.０」なる語は、ｐＨ５.０ と同一または同様の影響を対象成分に及ぼす５.０に近いｐＨを包含し、例えば 、好ましくは４.６ないし５.４、より好ましくは４.８ないし５.２を包含する。 「有意な損失」なる語は、上記の対象成分単離方法が、対象成分の商業的生産 を成功させないような対象成分の損失を包含する。好ましくは、本発明方法は、 対象成分の損失が５０％未満、より好ましくは約２０％未満、最も好ましくは約 １０％未満である。慣用的乳処理方法は、対象成分が沈降物、沈殿物または凝固 物中に捕捉されるため、対象成分の有意な損失を引き起こす。例えば、クラーク ,エイ・ジェイ（Clark,A.J.）ら，（１９８９年５月）バイオテクノオジー（Bio technology）第７巻：４８７〜４９２頁は、トランスジェニックヒツジから得た 乳試料から酸沈殿を用いて乳カゼインを除去した場合、約２.０ないし２.５％の 抗血友病因子IXの回収率を報告している。これは損失が約９８％と解釈される。 デンマン,ジェイ（Denman,J.）ら，（１９９１年９月）バイオテクノロジー（Bi otechnology）第９巻：８３９〜８４３頁は、トランスジェニック乳ヤギから得 た乳試料から酸沈殿を用いて乳カゼインを除去した場合、約２５％のＬＡ−ｔＰ Ａ回収率、よって７５％の損失を報告している。さらにデンマンらは、レニン処 理および酸沈殿のごとき他の最初の分画段階は、ＬＡ−ｔＰＡ収率の有意な増加 を提供しなかったと報告している（デンマン,ジェイ（Denman,J.）ら，（１９９ １年９月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第９巻：８３９〜８４３頁） 。 「全乳蛋白の少なくとも一部」なる語は、部分的に不溶性または不溶性形態で 乳中に通常存在する少なくとも１種の蛋白の少なくとも一部を包含する。溶解性 が安定化されている全乳蛋白の一部は、要するに、その除去が対象成分の単離に おいて無意味な段階よりも多くを構成するものでなくてはならない。種々の乳蛋 白の一部の溶解性が安定化されうるか、または１種もしくはそれ以上の乳蛋白の 全体の溶解性が安定化されうる。下記実施例において、アルギニンおよびイミダ ゾールは、下記実施例における全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化し、 蛋白のうち少なくともカゼイン族、すなわち乳蛋白の少なくとも１つのタイプの 全体または実質的に全体の溶解性を安定化させた。 慣用的方法を用いて、対象成分を安定化された乳試料から単離することができ ることが理解されるべきである。分離または単離方法の選択は、単離されるべき 対象成分のタイプおよび乳試料中に存在する対象成分の量による。さらに、安定 化された乳試料からの対象成分の単離または分離を、単一方法もしくは連続した 複数の方法を用いて行うことができる。これらの方法は、濾過およびクロマトグ ラフィー法を包含する。濾過の例は、デッドエンド濾過フィルターユニットおよ びクロスフロー濾過を包含する。クロマトグラフィー法の例は、イオン交換、疎 水性、アフィニティー、およびゲル濾過クロマトグラフィー法を包含する。同様 に、対象成分の単離前または後における乳試料の分画によるさらなる処理を、上 記分離方法を用いて行うことができる。例えば、蛋白または他の成分の分画を、 単離すべき成分の特性に応じた種々のクロマトグラフィー法のいずれかにより行 うことができる。蛋白は、最も頻繁には、溶液中の蛋白混合物を多孔性固体マト リックスを有するカラムに通過させるカラムクロマトグラフィーにより分画され 、蛋白がカラムの底部から流出するにつれて、蛋白を、それらの元々の機能的状 態で分別収集することができる。使用するマトリックスの種類、例えば電荷（イ オン交換クロマトグラフィー）、疎水性（疎水性クロマトグラフィー）、特定の 化学官能基への結合能（アフィニティークロマトグラフィー）およびサイズ（ゲ ル濾過クロマトグラフィー）に応じて蛋白が分離される。高度な分析のため、高 性能液体クロマトグラフィーを使用してもよい。当業者は、必要な純度にまで対 象とする乳成分を単離するために、通常の実験により、上記分離方法の順序およ び回数を変更することができよう。 さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触させ、濾過によ り処理可能な乳試料を生成することによる、乳試料からの対象成分の単離方法に 関する。次いで、対象成分を、濾過により処理可能な乳試料から単離することが できる。対象成分および安定化剤なる語は上記定義に同じである。 「濾過により処理可能」なる語は、安定化された乳試料がフィルターを通過し 濾液の一部となりうる程度にまで全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化さ れている乳試料を包含する。フィルターは、乳または乳類似物質の処理に典型的 に使用されるタイプのものである。孔は乳中の成分により詰まるため、一般的に は、フィルターは、典型的に乳処理に使用されるサイズの孔を有するものである 。本発明の乳試料の処理に使用できるフィルターのタイプの例は、約０.２μｍ ないし約５.０μｍの範囲の孔サイズを有する。次いで、当業者に知られた順序 の蛋白単離法のいずれかにより、対象成分を濾液から単離することができる。 さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料中の全乳蛋白の少なくとも一部の 溶解性を安定化させる方法に関する。該方法は、対象成分の有意な損失なく全乳 蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、乳試料を安定化剤と接 触させることを包含する。「安定化剤」、「溶解性を安定化させる条件下」およ び「全乳蛋白の少なくとも一部」なる語は上記定義に同じである。 また本発明は、対象成分を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解 性を安定化させるためのキットに関する。該キットは、安定化剤を保持する容器 、および有意な損失を伴わずに安定化された乳試料からの対象成分の単離を可能 にする程度にまで、対象成分を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶 解性の安定化を行うための安定化剤の使用に関する説明書を包含する。さらに該 キットは、対象成分の生物学的活性が保持され、全乳蛋白の一部の溶解性が安定 化されるように選択されたレベルにまで試料のｐＨを調節するための薬剤を保持 するための容器を包含していてもよい。 「ｐＨを調節するための薬剤」なる語は、通常の当業者が乳試料のごとき溶液 のｐＨを調節するのに用いる化合物を包含する。かかる薬剤は、ＨＣｌおよび酢 酸のごとき酸、ＮａＯＨのごとき塩基を包含する。さらに、ＣＯ₂のごとき気体 によってもｐＨを調節することができる。乳試料のｐＨを調節するための薬剤が 液体である場合、ｐＨ調節剤の送達の便利な手段を提供する容器の例は、ピペッ トまたは医療用ドロッパーの付いたバイアル、ビン等を包含する。 さらに限定的であってはならない下記実施例により、本発明はさらに説明され る。本願のすべての部分（発明の背景を含む）において引用されるすべての文献 および交付された特許の内容は、参照により特別に取り入れられる。本発明は、 以下の実施例によりさらに説明される。実施例１ ： アルギニンを安定化剤として用いる、長期作用性組織型プラスミノ ゲンアクチベーター（ＬＡ−ｔＰＡ）を含有するトランスジェニック乳ヤギの乳 からの乳蛋白の溶解性の安定化 エバート,ケイ・エム（Ebert,K.M.）ら（１９９１年９月）バイオテクノロジ ー（Bioechnology）第９巻：８３５〜８３８頁の方法に従って得た乳を分泌する トランスジェニック乳ヤギから得た乳試料を−２０℃で凍結保存し、分析前に３ ７℃の水浴中で融解した。乳ヤギの乳中に生成された対象成分はＬＡ−ｔＰＡ、 すなわち野生型ｔＰＡよりも長い循環半減期を示すヒト・組織型プラスミノゲン アクチベーターの糖鎖付加変種であった（トランスジェニック乳ヤギの乳中に生 成されるＬＡ−ｔＰＡの特徴付けについては、デンマン,ジェイ（Denman,J.）ら の上で引用した文献参照）。 次いで、１.０Ｍ酢酸を用いて乳試料のｐＨを６.７から５.０にした。次いで 、乳試料を５００μｌずつ１２個に分け、それらを１.５ｍｌポリプロピレン試 験管に入れた。異なる量の２.０Ｍアルギニン−ＨＣｌ（ｐＨ５.５）を各試験管 に添加して０.０Ｍから１.０Ｍの範囲のアルギニン濃度とした（表Ｉ）。リン酸 緩衝化セイライン（ＰＢＳ）を添加して最終体積を１.０ｍｌとした。 試験管を、ブリンクマン（Brinkman）５３１５型遠心機で１０００ｒｐｍで１ ０分間遠心分離した。試験管を取り、写真を取って各アルギニン濃度についての カゼインペレットのサイズを調べることにより可溶化の程度を示した（図１）。 上清を定量分析用に取った。図１は、１２種の異なるアルギニン濃度についての 乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す。０.４Ｍより低いアルギニン 濃度については、蛋白（おそらく、大部分がカゼインからなるであろう）のペレ ットがはっきりと認められた。約０.４Ｍより高いアルギニン濃度については、 蛋白ペレットはほとんどないかまたは認められなかった。 ２８０ｎｍにおける吸光度測定により上清の蛋白濃度を算出した。１２個の上 清それぞれをＰＢＳで１：５０に希釈し、ベックマン（Beckman）ＤＵ−６分光 器で読むことにより２８０ｎｍにおける吸光度を読み取った。１２個の試料それ ぞれには、乳のかわりにＰＢＳを用い、さらにＰＢＳで１：５０に希釈したブラ ンクを付けた。ＬＡ−ｔＰＡ活性を、ラウ,ディー（Lau,D.）ら，（１９８７年 ９月）バイオテクノロジー（Biotechnology）第５巻：９５３〜９５８頁のごと く、プラスミン基質（Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−パラニトロアニリド）を用いる アミド分解活性の間接的測定において測定した。結果を図２に示す。必要な希釈 は１：５０００００であった。図２は、アルギニン量を増加させるにつれ、乳試 料中の全蛋白濃度およびＬＡ−ｔＰＡ活性の双方の増加が見られたことを示す。 これらの結果は、アルギニンは全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させ うることができ、それにより、ＬＡ−ｔＰＡ単離量を増加させることができるこ とを示す。実施例２ ： イミダゾールを安定化剤として用いる、ＬＡ−ｔＰＡを含有するト ランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化 アルギニンのかわりに２.０Ｍイミダゾールを用いる以外は実施例１記載の方 法に従った。表IIは、試験したイミダゾール濃度範囲を示す。図３は、イミダゾ ール濃度範囲についての乳試料の可溶化の程度を示す写真である。約０.７Ｍよ り低いイミダゾール濃度については、蛋白（おそらく、大部分がカゼインからな るであろう）のペレットがはっきりと認められた。約０.７Ｍより高いイミダゾ ール濃度については、蛋白ペレットはほとんどないかまたは認められなかった。 図４は、１２種のイミダゾール濃度に関するＬＡ−ｔＰＡ活性に対する上清の相 対的蛋白濃度を示す。アルギニンの場合と同様に、イミダゾールは、全乳蛋白の 少なくとも一部の溶解性を安定化させることができ、それにより、ＬＡ−ｔＰＡ 単離量を増加させることができた。図４は、乳試料中のイミダゾール濃度の増加 に伴い、乳試料中の全蛋白濃度およびＬＡ−ｔＰＡ活性の増加が起こったことを 示す。 実施例３： Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを安定化剤として用いる、ＬＡ−ｔＰＡを含有す るトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化 アルギニンのかわりに１.７Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを用いる以外は実施例１記 載の方法に従った。表IIIは、実験に用いたＢｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度範囲を示す。 図５は、蛋白ペレットのサイズを示すことにより、試験したＢｉｓ−Ｔｒｉｓ 濃度の範囲についての乳試料の可溶化の程度を示す。０.２Ｍより低いＢｉｓ− Ｔｒｉｓ濃度については、蛋白ペレットはほとんどないかまたは認められなかっ た。図６は、１０種のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度範囲に関するＬＡ−ｔＰＡ活性に対 する上清の相対的蛋白濃度を示す。図６は、乳試料中のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度が 増加するにつれ、乳試料中の全蛋白濃度およびＬＡ−ｔＰＡ活性の増加が見られ たが、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ濃度が約０.６５Ｍおよびそれ以上の場合はＬＡ−ｔＰ Ａ活性が減少したことを示す。実施例４ ： 異なるｐＨにおいてアルギニンを可溶化剤として用いる、ＬＡ−ｔ ＰＡを含有するトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化 乳試料の最初のｐＨは６.７であった。この点から試料のｐＨを所望のｐＨ、 例えば、４.３、６.０、７.０および８.０に調節した。試験される安定化剤のｐ Ｈが６.７である場合には、乳試料のｐＨを調節しなかった。同様に、２.０Ｍの アルギニンのｐＨを試料のｐＨに調節し、それを試料に添加して最終試料のｐＨ 変動を防止した。次いで、ｐＨを調節した試料を５００μｌずつに分け、１.５ ｍｌポリプロピレン試験管に入れた。種々の量の２.０Ｍアルギニンを乳試料に 添加して種々のｐＨにおいて種々の濃度のアルギニンを含有する乳試料を得た。 ＰＢＳを添加して最終体積を１.０ｍｌとした。 試験管を、ブリンクマン（Brinkman）５３１５型遠心機で１０００ｒｐｍで１ ０分間遠心分離した。試験管を取り、写真を取って、ｐＨ４.３、６.０、７.０ および８.０における各アルギニン濃度についてのカゼインペレットのサイズを 調べることにより可溶化の程度を示した。写真を図７に示す。図７に示すように 、ｐＨ６.０においてアルギニンは、約０.５ないし約１.０Ｍの濃度において乳 蛋白の溶解性に対する最良の安定化剤として作用した。ｐＨ７.０における約０. ６ないし１.０Ｍの範囲の濃度のアルギニンもまた、乳蛋白の溶解性に対する良 好な安定化剤であった。ｐＨ４.３においては、アルギニンは、約０.１Ｍないし 約１.０Ｍの濃度範囲において、乳蛋白の溶解性をほとんど安定化しなかった。実施例５ ： 最初にアルギニン添加、次いで、乳試料のｐＨを調節することによ る、トランスジェニック乳ヤギの乳からのＬＡ−ｔＰＡの単離 ２.０Ｍアルギニン（ｐＨ５.５）をｐＨ調節前に添加すること以外は、実施例 １記載の方法に従った。実験において試験したアルギニン濃度範囲は実施例１に おいて試験したものと同じであり、表Ｉに示す。図８は、１２種のアルギニン濃 度についてのＬＡ−ｔＰＡ活性に対する上清の相対的蛋白濃度を示す。アルギニ ン濃度の増加に伴い、全乳蛋白濃度およびＬＡ−ｔＰＡ活性の双方が増加した。 しかしながら、ＬＡ−ｔＰＡ活性はピークを形成し、約１.０Ｍのアルギニン濃 度において約１．２０ｅ＋６ＩＵ／ｍｌのレベルであり、対照的に、実施例１に おいては、同じアルギニン濃度について、ピークＬＡ−ｔＰＡ活性は約１．５０ ｅ＋６ＩＵ／ｍｌであった。実施例６ ： アルギニンを安定化剤として用いる、トランスジェニックマウスの 乳からのアンチトロンビンIIIの単離 乳を分泌するトランスジェニックマウスから得た乳試料を−８０℃で凍結し、 分析前に室温で融解した。マウスの乳中の対象成分はヒト・アンチトロンビンII Iであった。 体積が非常に小さかったため、乳試料のｐＨを調節しなかった。次いで、乳試 料を５００μｌずつに分け、１.５ｍｌポリプロピレン試験管に入れた。２.０Ｍ アルギニン５００μｌを１の試験管に入れ、１.０Ｍイプシロン−アミノカプロ ン酸（ＥＡＣＡ）を４００μｌのＰＢＳとともに他の試験管に入れて各試験管中 の体積を１.０ｍｌとした。０.４５μｍのフィルターユニット（マサチューセッ ツ州ベッドフォード（Bedford）のミリポア（Millipore）社製）を用いて試験管 の内容物を濾過した。結果は、アルギニン含有試料は容易に濾過され、初発アン チトロンビンの回収率は８３％であったことを示す。ＥＡＣＡを伴う材料は濾過 が困難で、アンチトロンビン回収率は５０％であった。実施例７ ： アルギニンを安定化剤として用いる、トランスジェニック乳ヤギの 乳からのＬＡ−ｔＰＡの単離 乳を室温で融解し、１.０Ｍ酢酸を用いてｐＨを５.０に調節し、同体積の１. ０Ｍアルギニンで希釈し、公称孔径０.２２μｍのフィルター（ニューヨークの ボヘミア（Bohemia）のザルトリウス（Sartorius）社製）、次いで、絶対孔径０ .２０μｍのフィルター（マサチューセッツ州ベッドフォード（Bedford）のミ リポア（Millipore）社製）によりデッドエンド濾過した。ＬＡ−ｔＰＡを、最 初にＴＳＫ−ブチルカラムに結合させることにより、濾液から精製した。カラム を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.０）、１００ｍＭアルギニン−ＨＣｌ、 ０.０１％ツイン８０で平衡化し、次いで洗浄し、次いで、２０ｍＭリン酸ナト リウム、１００ｍＭアルギニン−ＨＣｌおよび７０％エチレングリコールを用い て段階的に溶離した。溶離物の収集を、１.０ＡＵＦＳにおける２８０ｎｍの吸 光度をモニターすることにより行った。ベースラインより上であることが検知さ れた時点で収集を開始した。この最初の段階は、酵素を濃縮し実質的に精製する 手段を提供する。この工程からのＬＡ−ｔＰＡの回収率は、アルギニン無添加の 場合は２５ないし５０％であるが、これとは対照的に、初発活性の９５％であっ た。均等物 当業者は、通常の実験以上のものを用いずに、本明細書記載の本発明の特定の 具体例の多くの均等物を認識し、あるいは確認することがすることができよう。 かかる均等物は、下記の請求の範囲に包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/04 Ｃ０７Ｋ 16/04 Ｃ１２Ｎ 15/09 9452−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/46 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 38/55 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/54 Ｃ１２Ｐ 21/02 9455−4Ｃ 37/64

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象成分を 含有する乳試料を安定化剤と接触させて対象成分の有意な損失を伴わずに安定化 された乳試料から対象成分が単離されうるようにし；次いで 安定化された乳試料から対象成分を生物学的に活性な形態で単離すること からなる乳試料からの対象成分の単離方法。 ２．接触段階において対象成分の溶解性が安定化される請求項１記載の方法。 ３．乳試料がトランスジェニック哺乳動物から得られるものである請求項１記 載の方法。 ４．トランスジェニック哺乳動物が、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサ ギ、ラットおよびマウスからなる群より選択される請求項３記載の方法。 ５．対象成分が天然に存在する乳成分である請求項１記載の方法。 ６．対象成分がトランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌される成分である請 求項３記載の方法。 ７．対象成分が蛋白である請求項３記載の方法。 ８．蛋白が治療薬である請求項７記載の方法。 ９．治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター（longer-actin g tissue-type plasminogen activator）である請求項８記載の方法。 １０．治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項８記載の方法。 １１．対象成分が免疫グロブリンである請求項３記載の方法。 １２．安定化剤を含有している乳試料のｐＨが約５.０ないし約９.０の範囲で ある請求項３記載の方法。 １３．安定化剤が正に荷電している請求項３記載の方法。 １４．正に荷電している薬剤が、アルギニン、イミダゾールおよびビス−トリ ス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）からなる群より選択される請求項１３記載の方法。 １５．正に荷電している薬剤がアルギニンである請求項１４記載の方法。 １６．請求項１の方法により単離される対象成分。 １７．請求項３の方法により単離される対象成分。 １８．請求項１の方法を用いて単離される対象成分を細胞培養培地に含めるこ とからなる改良。 １９．請求項１の方法を用いて単離される対象成分を食品に含めることからな る改良。 ２０．接触段階における条件が、対象成分がその生物学的活性を保持し全乳蛋 白の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象成分を含有する 乳試料のｐＨを調節することを包含する請求項３記載の方法。 ２１．乳試料が調節されるｐＨが約５.０ないし約９.０の範囲である請求項１ ９記載の方法。 ２２．対象成分が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターであり、乳 試料が調節されるｐＨが約５．０である請求項２０記載の方法。 ２３．全乳蛋白の一部がカゼインを含んでいる請求項１記載の方法。 ２４．さらに、安定化された乳試料を濾過し、濾過された乳試料から対象成分 を単離することからなる請求項１記載の方法。 ２５．対象成分が、濾過された乳試料からクロマトグラフィーにより単離され る請求項２３記載の方法。 ２６．対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触させ、濾過により処理可能 な乳試料を生成し；次いで 濾過により処理可能な乳試料から対象成分を単離すること からなる乳試料からの対象成分の単離方法。 ２７．乳試料がトランスジェニック哺乳動物から得られるものである請求項２ ６記載の方法。 ２８．対象成分が蛋白である請求項２７記載の方法。 ２９．蛋白が治療薬である請求項２８記載の方法。 ３０．治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターである請求項 ２９記載の方法。 ３１．治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項２９記載の方法。 ３２．蛋白が免疫グロブリンである請求項２８記載の方法。 ３３．安定化剤が正に荷電している請求項２７記載の方法。 ３４．正に荷電している薬剤が、アルギニン、イミダゾールおよびＢｉｓ−Ｔ ｒｉｓからなる群より選択される請求項３３記載の方法。 ３５．正に荷電している薬剤がアルギニンである請求項３４記載の方法。 ３６．さらに、濾過により処理可能な乳試料を濾過すること、次いで濾過され た試料から対象成分を単離することからなる請求項２６記載の方法。 ３７．対象成分が、濾過された乳試料からクロマトグラフィーにより単離され る請求項３６記載の方法。 ３８．請求項２６の方法を用いて単離される対象成分を細胞培養培地に含める ことからなる改良。 ３９．請求項２６の方法を用いて単離される対象成分を食品に含めることから なる改良。 ４０．対象成分がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の少なくとも一部の溶解 性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象成分を含有する乳試料の ｐＨを調節し； 全乳蛋白の一部の溶解性を安定化する条件下で、対象成分を含有する乳試料を 安定化剤と接触させて対象成分の有意な損失を伴わずに安定化された乳試料から 対象成分が単離されるようにし；次いで 安定化された乳試料から対象成分を生物学的に活性な形態で単離すること からなる乳試料から対象成分を単離する方法。 ４１．乳試料がトランスジェニック哺乳動物から得られる請求項４０記載の方 法。 ４２．対象成分が蛋白である請求項４１記載の方法。 ４３．蛋白が治療薬である請求項４２記載の方法。 ４４．治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターである請求項 ４３記載の方法。 ４５．治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項４３記載の方法。 ４６．乳試料が調節されるｐＨが約５.０ないし約９.０の範囲である請求項４ １記載の方法。 ４７．対象成分が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターであり、乳 試料が調節されるｐＨが約５.０である請求項４５記載の方法。 ４８．調節および接触段階が同時に行われる請求項４０記載の方法。 ４９．接触段階が調節段階の前に行われる請求項４０記載の方法。 ５０．安定化剤が正に荷電している請求項４１記載の方法。 ５１．正に荷電している薬剤が、アルギニン、イミダゾールおよびＢｉｓ−Ｔ ｒｉｓからなる群より選択される請求項５０記載の方法。 ５２．全乳蛋白の一部がカゼインを含んでいる請求項４１記載の方法。 ５３．全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象成分 を含有する乳試料を安定化剤と接触させて対象成分の有意な損失を伴わずに安定 化された乳試料から対象成分が単離されうるようにすることからなる、対象成分 を含有する乳試料中の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化する方法。 ５４．接触段階における条件が、対象成分がその生物学的活性を保持し全乳蛋 白の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象成分を含有する 乳試料のｐＨを調節することを包含する請求項５３記載の方法。 ５５．接触段階において対象成分の溶解性が安定化される請求項５３記載の方 法。 ５６．全乳蛋白の一部がカゼインを含んでいる請求項５３記載の方法。 ５７．乳試料がトランスジェニック哺乳動物から得られるものである請求項５ ３記載の方法。 ５８．対象成分が蛋白である請求項５３記載の方法。 ５９．蛋白が治療薬である請求項５８記載の方法。 ６０．治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターである請求項 ５９記載の方法。 ６１．治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項５９記載の方法。 ６２．安定化剤；および 前もって全乳蛋白の一部を除去することによる有意な損失を伴わずに安定化さ れた乳試料からの対象成分の単離を可能にする程度にまで、対象成分を含有する 乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定化を行うための安定化剤の使 用に関する説明書 からなる、対象成分を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安 定化するためのキット。 ６３．さらに、対象成分がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の一部の溶解性 が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象成分を含有する乳試料のｐ Ｈを調節するための薬剤を入れておく容器からなる請求項６２記載のキット。 ６４．蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーター（cystic fibrosis tran smembrane conductance regulator）である請求項７記載の方法。 ６５．蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーターである請求項２８記載の 方法。 ６６．蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーターである請求項４２記載の 方法。 ６７．蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーターである請求項５８記載の 方法。