JPH08511168A - ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体、これをコードする核酸およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプをコードする核酸、およびこれにコードされる蛋白が提供される。具体的な実施態様において、本発明の核酸は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３およびｍＧｌｕＲ５サブタイプをコードする。これらの核酸はメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの産生に有用である以外に、プローブとしても有用であり、従って当業者は不要な実験をすることなく、関連する受容体サブユニットを同定し単離することが可能である。本発明は、新規のメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプを開示する以外に、このような受容体の機能に影響を与える化合物（例えば、グルタミン酸受容体機能のアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーター（活性調節因子））を同定し性状解析するための、このような受容体サブタイプの使用方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体、これをコードする 核酸およびその用途 本発明は、核酸とこれによりコードされる受容体蛋白に関する。本発明の核酸 は、新規のヒトメタボトロピック（metabotropic）グルタミン酸受容体サブタイ プをコードする核酸に関する。本発明はまたこのような受容体サブタイプの作成 方法、およびこのような受容体の機能に影響を与える化合物（例えば、アゴニス ト、アンタゴニスト、およびヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のアロス テリックモジュレーター）の同定および性状解析のための受容体蛋白の使用方法 に関する。発明の背景 アミノ酸のＬ−グルタミン酸は、哺乳動物の中枢神経系の主要な興奮性神経伝 達物質である。解剖学的、生化学的および電気生理学的分析は、グルタミン酸産 生系が広範囲のニューロン作用過程（例えば、急速な興奮性シナプス伝達、神経 伝達物質放出の制御、長期増強、学習および記憶、成長性シナプス可塑性、低酸 素性虚血傷害およびニューロン細胞の死、てんかん様発作、およびいくつかの神 経変性障害の病変性）に関与していることを示唆している。一般的には、モナガ ン（Monaghan）ら、Ann．Rev．Pharmacol．Toxicol．，２９：３６５−４０２（ １９８０）を参照。この広範囲の機能（特に学習、神経毒性および神経病理に関 する機能）のために、近年グルタミン酸の作用機構を説明し規定しようという研 究が始まった。 現在グルタミン酸受容体の分類の概要は、薬理学的基準に基づいている。グル タミン酸は、２つの主要な受容体（イオノトロピック（ionotropic）受容体とメ タボトロピック（metabotropic）受容体）に分類されている受容体を介してその 作用を媒介することが認められている。イオノトロピックグルタミン酸受容体は 、完全な陽イオン特異的、リガンドゲート（ligand-gated）のイオンチャネルを 含有し、メタボトロピックグルタミン酸受容体は、細胞内第二メッセンジャー系 の 活性化を介して細胞外シグナルを変換するＧ蛋白結合受容体である。イオノトロ ピック受容体は、受容体の薬理学的および機能的性質に基づきさらに少なくとも ２つの範疇に分類されている。その２つの主要な型のイオノトロピック受容体は 、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体とカイニン酸（ＫＡ）／ ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロ ピオン酸）（以前はキスカル酸、すなわちＱＵＩＳと呼ばれていた）受容体であ る。メタボトロピック受容体はイオノトロピックグルタミン酸受容体が結合する リガンドと同じリガンドのいつくかに結合するが、メタボトロピック受容体はＧ ＴＰ−結合蛋白および第二メッセンジャー（例えば、サイクリックＡＭＰ、サイ クリックＧＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール１，４，５−三リン酸お よびカルシウム）を介してシナプスの生理機能を変更させる［例えば、グンデル セン（Gundersen）ら、Proc．R．Soc．LondonSer．２２１：１２７（１９８４） ；スラデツェック（Sladeczek）ら、Nature ３１７：７１７（１９８５）；ニ コレッティ（Nicoletti）ら、J．Neurosci．６：１９０５（１９８６）；スギヤ マ（Sugiyama）ら、Nature ３２５：５３１（１９８７）］。 メタボトロピックグルタミン酸受容体の電気生理学的および薬理学的性質は、 受容体供給源として動物組織や細胞株、および非ヒト組換え受容体を用いて研究 されている。ヒトの治療薬開発へのそのような研究の意義は、ヒトでない受容体 サブユニットのみしか入手できないことにより限定されている。さらに、メタボ トロピックグルタミン酸受容体の特性や構造が分子レベルで研究され出したのは つい最近である。しかしこのような研究は、ヒト以外の種でのみ行われている。 メタボトロピックグルタミン酸受容体の生理学的および病理学的重要性の可能性 により、グルタミン酸受容体の種々のクラスの代表的メンバーをコードするヒト の配列（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白）が利用（例えば、薬剤スクリーニン グ測定法のために）できることが必要である。そのようなヒトの配列が入手でき れば、ヒトでの受容体の分布の研究、特定の受容体の修飾と種々の疾患の発生の 関係の研究も可能になるであろう。発明の簡単な説明 本発明は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプをコード する新規の核酸、およびこれにコードされる蛋白を開示する。具体的な実施態様 において、新規の核酸は、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の全長ｍＧ ｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３およびｍＧｌｕＲ５サブタイプまたはそ の一部をコードする。これらの核酸はメタボトロピックグルタミン酸受容体サブ タイプ蛋白の産生に有用である以外に、プローブとしても有用であり、従って当 業者は不要な実験をすることなく、関連する受容体サブタイプをコードする核酸 を同定し単離することが可能である。 本発明は、新規のメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプを開示 する以外に、このような受容体に影響を与える化合物（例えば、グルタミン酸受 容体機能のアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーター（活性調節因子 ））を同定し性状解析するための、このような受容体サブタイプの使用方法を包 含する。また本発明は、未知の蛋白がメタボトロピックグルタミン酸受容体サブ タイプとして機能するか否かを測定する方法を包含する。図面の簡単な説明 図１は、ＣＭＶプロモーターをベースにしたベクターであるｐＣＭＶ−Ｔ７− ２とｐＣＭＶ−Ｔ７−３を示す。発明の詳細な説明 本発明において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコー ドする単離された核酸が提供される。本発明の１つの面において、ｍＧｌｕＲ１ サブタイプのヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする 核酸が提供される。別の面において、ｍＧｌｕＲ２サブタイプのメタボトロピッ クグルタミン酸受容体の少なくとも１部分をコードする核酸が提供される。さら に別の面において、ｍＧｌｕＲ３サブタイプのメタボトロピックグルタミン酸受 容体をコードする核酸が提供される。さらなる面において、ｍＧｌｕＲ５サブタ イプのメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードする核酸が提供される。さ らに別の面において、そのような核酸を含有する真核細胞、およびそのような核 酸を発現する真核細胞が提供される。 また前述の核酸によりコードされる蛋白、および該蛋白に対して産生される抗 体が提供される。本発明の別の面において、上記核酸のメタボトロピックグルタ ミン酸受容体サブタイプ−選択性部分よりなる核酸プローブが提供される。 本明細書において、「ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ」 とは、グルタミン酸産生リガンドに対する細胞のＧ−蛋白結合応答に参加する、 単離されたおよび／または精製された蛋白を意味する。このような受容体サブタ イプは、他のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードしない別 別の遺伝子により個々にコードされる（すなわち、各サブタイプはユニークな遺 伝子によりコードされる）。このような受容体サブタイプの典型的な特徴は、７ つの推定されるトランスメンブレンドメインと、その前に大きな推定される細胞 外アミノ末端ドメインと、その後に大きな推定される細胞内カルボキシ末端ドメ インを有することである。メタボトロピックグルタミン酸受容体は、基本的にメ タボトロピックグルタミン酸受容体でない他のＧ蛋白結合受容体と全くアミノ酸 配列相同性を有さない。 メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの各々の間の関係に関して、 ｍＧｌｕＲ１受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピ ックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約７０％未満で あり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。ｍＧｌｕＲ２受容体サブ タイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体 サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約６０％未満であり、典型的に観察され る同一性は４５％未満である。ｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプのアミノ酸配列は 一般に、他のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配 列との同一性は約６０％未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満で ある。ｍＧｌｕＲ５受容体サブタイプのアミノ酸配列は一般に、他のヒトメタボ トロピックグルタミン酸受容体サブタイプのアミノ酸配列との同一性は約７０％ 未満であり、典型的に観察される同一性は４５％未満である。 上記定義に含まれるものは、一次転写体の別のスプライシングにより産生され るｍＲＮＡによりコードされる変種、および上記の生理学的および／または物理 的性質の１つまたはそれ以上を有するその断片である。 本明細書および請求の範囲において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋 白の修飾物質としての「単離される」、「純粋な」という用語は、このように呼 ばれるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白はヒトの手によりそのような形 で産生され、従ってその本来のインビボの細胞環境からは分離されていることを 示す。このヒトの介入による結果、本発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチ ドおよび蛋白は、天然に存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白では 役に立たないような方法（例えば、選択的薬剤または化合物の同定）において有 用である。 本発明の受容体蛋白の修飾物質として使用される時、「機能性」とは、グルタ ミン酸産生関連リガンド（例えばＡＣＰＤまたはＡＣＰＤ様リガンド、ＱＵＩＳ 、ＡＰ４など）に受容体蛋白に結合すると、Ｇ蛋白との受容体の相互作用を修飾 し、これは細胞内第２メッセンジャーのレベルに影響を与え、種々の生理学的作 用を引き起こす。言い換えると「機能性」とは、受容体蛋白のアゴニスト活性化 の結果として応答が産生されることを意味する。 本明細書においてスプライス変種とは、ゲノムＤＮＡの一次転写体の差別的処 理により産生され、その結果２つ以上の型のｍＲＮＡの産生に至る、変種メタボ トロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸を意味する。差別的 に処理された一次転写体から得られるｃＤＮＡは、アミノ酸が完全に同一の領域 と、異なるアミノ酸配列を有する領域を有する、メタボトロピックグルタミン酸 受容体サブタイプをコードするであろう。すなわち同じゲノム配列から、多数の 関連するｍＲＮＡや蛋白が得られる。得られるｍＲＮＡや蛋白はいずれも本明細 書では「スプライス変種」と呼ぶ。 従って、前記で定義したメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコ ードするが、遺伝コードの縮重のため特定のハイブリダイゼーション条件下で開 示された核酸に必ずしもハイブリダイズしない核酸も、本発明の範囲内にあると 考えられる。本明細書に記載の方法または当業者に公知の方法により評価すると 、そのようなサブタイプもまた、機能性受容体を形成する。典型的には、メタボ トロピックグルタミン酸受容体サブタイプが代替スプライシングにより得られる ＲＮＡにコードされない（すなわち、スプライス変種）なら、メタボトロピック グルタミン酸受容体サブタイプをコードする核酸とこれによりコードされるメタ ボトロピックグルタミン酸受容体蛋白は、本明細書に記載の少なくとも１つのメ タ ボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ核酸（およびこれによりコードされ る蛋白）と実質的な配列相同性を有する。スプライス変種をコードするＤＮＡま たはＲＮＡは、本明細書で提供されるＤＮＡまたはＲＮＡとの配列全体の相同性 は９０％未満であるが、本明細書中のＤＮＡ断片とほとんど１００％の相同性を 有する領域を含有し、開始コドンおよび停止コドンを含むオープンリーディング フレームをコードし、機能性メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを コードすることを理解すべきである。 ヒトｍＧｌｕＲ１サブタイプをコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号２に記 載されるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示さ れる。現在好適な配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする。 別のＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ１サブタイプをコードし、高緊縮性条件下 で配列番号１の実質的に配列全体、またはその大部分（すなわち、典型的には少 なくともその２５−３０個の隣接ヌクレオチド）にハイブリダイズするヌクレオ チドであることが特徴である。 本明細書において、ハイブリダイゼーションの緊縮性とは、ポリ核酸ハイブリ ッドが安定である条件を意味する。当業者に公知なように、ハイブリッドの安定 性はハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。Ｔｍは式： 81.5℃−16.6（log₁₀［Ｎａ⁺］）＋0.41（％Ｇ＋Ｃ）−600／1 （式中、１はヌクレオチド中のハイブリッドの長さである）により近似的に表さ れる。配列の相同性が１％減少する毎に、Ｔｍは約１−１．５℃低下する。一般 にハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的 には、ハイブリダイゼーション反応を低緊縮性条件下で行い、次に種々の（ただ し、より高い緊縮性の）条件下で洗浄する。ハイブリダイゼーション緊縮性は、 このような洗浄条件に関する。すなわち、本明細書において、 （１）断片のハイブリダイゼーションに関して、高緊縮性条件とは、６５℃で０ ．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブ リダイゼーションを可能にする条件を意味する（すなわち、本明細書で企図され るように、もしハイブリッドが６５℃で０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定でない 場合、高緊縮性条件下で安定ではないであろう）。高緊縮性条件は、例えば５０ ％ ホルムアミド、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％Ｓ ＤＳ中で４２℃でハイブリダイゼーションし、次に６５℃で０．１ＸＳＳＰＥ、 そして０．１％ＳＤＳによる洗浄により提供される。 （２）断片のハイブリダイゼーションに関して、中緊縮性条件とは、４２℃で５ ０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハ イブリダイゼーションし、次に６５℃で０．２×ＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤ Ｓによる洗浄と同等の条件を意味する。 （３）断片のハイブリダイゼーションに関して、低緊縮性条件とは、４２℃で１ ０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハ イブリダイゼーションし、次に５０℃で１ＸＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤＳに よる洗浄と同等の条件を意味する。そして、 （４）オリゴヌクレオチド（すなわち、長さが約３０ヌクレオチド以下の合成Ｄ ＮＡ）に関して、高緊縮性条件とは、４２℃で１０％ホルムアミド、５×デンハ ルツ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションし、次に ５０℃で１×ＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤＳによる洗浄に等しい条件を意味す る。 種々の緩衝液や温度を用いてこれらの条件を再現することができ、これらは必 ずしも正確である必要はないことを理解すべきである。 デンハルツ溶液およびＳＳＰＥ（例えば、サムブルーク、フリッチ、およびマ ニアチス（Sambrook，Fritsch，and Maniatis）、モレキュラークローニング、 実験室マニュアル（Molecular Cloning、A Laboratory Manual）、コールド・ス プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９）は、他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に、 当業者に公知である。例えば、ＳＳＰＥはpH７．４のリン酸緩衝化された０．１ ８ＭのＮａＣｌである。ＳＳＰＥは例えば、１７５．３ｇのＮａＣｌ、２７．６ ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄および７．４ｇのＥＤＴＡを８００mlの水に溶解しpHを７．４ に調整して、次に１リットルになるように水を加えて２０×保存溶液として調製 することができる。デンハルツ溶液（デンハルト（Denhart）（１９６６）Bioch em．Biophys．Res．Commun．２３：６４１を参照）は、例えば５ｇのFicoll （タイプ４００、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社（Pharmacia LKB Bi otechnology、INC.）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州） 、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのウシ血清アルブミン（第５画分；シグマ （Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）、そして水を５００mlになるように加 え、濾過して粒状物質を除去することにより、５０×保存溶液として調製するこ とができる。 ヒトｍＧｌｕＲ１サブタイプをコードする特に好適な配列は、配列番号１と実 質的に同じヌクレオチド配列を有するものであり、配列番号１のコーディング配 列と実質的に同じ配列を有するポリ核酸が特に好ましい。 本明細書において、「実質的な配列相同性」とは、少なくとも約９０％の相同 性を有するヌクレオチド配列、そして典型的には９５％以上のアミノ酸の同一性 を有するヌクレオチド配列を意味する。しかし、スプライス変種であること、ま たは保存的アミノ酸置換（または縮重コドンの置換）により修飾されているため 、前記レベルより低い相同性を有する蛋白（およびこのような蛋白をコードする ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）は、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。 本明細書において、「実質的に同じ」とは、本明細書に記載の実際の配列とは わずかに異なるかまたは重大でない配列の変化を有する、ＤＮＡのヌクレオチド 配列、ＲＮＡのリボヌクレオチド配列、または蛋白のアミノ酸配列を意味する。 実質的に同じ分子種は、開示された配列と同等であると考えられ、従って本発明 の請求の範囲に包含されると考えられる。この点で「わずかに異なるかまたは重 大でない配列の変化」は、開示され、特許請求のされているＤＮＡ、ＲＮＡ、ま たは蛋白と実質的に同じ配列が、開示され特許請求のされているヒト由来の配列 と機能的に同等であることを意味する。機能的に同等の配列は、実質的に同じ方 法で機能して、ヒト由来の核酸および本明細書に開示され特許請求されているア ミノ酸組成物と実質的に同じ組成物を産生する。特に機能的に同じＤＮＡは、本 明細書に開示されたものと同じであるか、または保存性のアミノ酸変化（例えば 非極性残基を別の非極性残基で置換、または荷電残基を類似の荷電残基で置換） を有するものと実質的に同じヒト由来の蛋白をコードする。これらの変化には、 当業者に認識される、蛋白の３次元構造を実質的に変化させないものが含まれる 。 ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部をコードするＤＮＡ配列の例は、配 列番号４に記載のものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド（ 随時、配列番号１３に記載の３’非翻訳配列の３４３ヌクレオチドの一部または すべてを含む）、またはクローンＭＥＴＡＢ４０（１９９３年５月４日に整理番 号７５４６５でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託さ れた）のヒトｍＧｌｕＲ２をコードする部分によりコードされるものと実質的に 同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。 寄託されたクローンは、１９９３年５月４日に「特許手続上の微生物の寄託の 国際的承認に関するブダペスト条約」（the Budapest Treaty on the Internati onal Recognition of Deposits of Microorganisms for Purposes of Patent Pr ocedure）の条件と、この条約の名のもとに公布された規則に従い、アメリカン タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１ パークローンドライ ブ（Parklawn Drive）、ロックヴィル（Rockville）、メリーランド州、アメリ カ合衆国 ２０８５２）に寄託されている。この条約と規則の条件下で、および さもなくばアメリカ合衆国の特許法や規則に従い受領する法的資格のある工業所 有権事務所および他の個人、または本出願または本出願の優先権を主張する出願 が提出されたかまたはこのような出願に対して何らかの特許権が与えられた国ま たは国際組織は、寄託された物質の試料を入手することができる。特にこれに基 づきまたはこの優先権を主張する出願またはこれに関する出願を取り込んでいる 出願に基づき米国特許の与えられた時点で、本寄託物質の入手に関するすべての 規制は永久に取り消されるであろう。 ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部をコードする好適なポリ核酸配列は 、配列番号４に記載のものと同じアミノ酸配列、またはクローンＭＥＴＡＢ４０ （１９９３年５月４日に整理番号７５４６５でアメリカンタイプカルチャーコレ クション（ＡＴＣＣ）に寄託された）のヒトｍＧｌｕＲ２をコードする部分によ りコードされるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするものである。 あるいはＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプをコードするヌク レオチド配列であり、高緊縮性条件下で配列番号３またはその大部分（すなわち 、典型的にはその少なくとも２５−３０個の隣接ヌクレオチド）、またはクロー ン ＭＥＴＡＢ４０（ＡＴＣＣ整理番号７５４６５）のヒトｍＧｌｕＲ２をコードす る部分とまたはその大部分とハイフリダイズするヌクレオチド配列として特徴付 けられる。ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの部分をコードする特に好適な配 列は、配列番号３のコーディング配列と同じヌクレオチド配列、またはクローン ＭＥＴＡＢ４０のヒトｍＧｌｕＲ２コーディング部分中のコーディング配列のヌ クレオチド配列を有するポリ核酸により示される。 ヒトｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプをコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号 ６に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド により示される。好適なポリ核酸配列は、配列番号６と同じ配列をコードするも のである。 あるいはＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプをコードするヌク レオチド配列であり、高緊縮性条件下で配列番号５またはその大部分（すなわち 、典型的にはその少なくとも２５−３０個の隣接ヌクレオチド）とハイブリダイ ズするヌクレオチド配列として特徴付けられる。ヒトｍＧｌｕＲ３サブタイプの 部分をコードする特に好適な配列は、配列番号５のコーディング配列と実質的に 同じヌクレオチド配列を有するものであり、配列番号５のコーディング配列と同 じヌクレオチド配列を有するポリ核酸が最も好ましい。 ＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ３受容体サブタイプまたはその部分をコードす るヌクレオチド配列であり、配列番号８、１０または１２のアミノ酸配列と実質 的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドにより示される。好適なポリ核 酸配列は、配列番号８、１０または１２と同じ配列をコードするものである。 あるいはＤＮＡの例は、ヒトｍＧｌｕＲ５受容体サブタイプをコードするヌク レオチド配列であり、高緊縮性条件下で配列番号７、９または１１の実質的に全 配列、またはそれらの大部分（すなわち、典型的には少なくとも２５−３０個の 隣接ヌクレオチド）にハイブリダイズするヌクレオチドとして特徴付けられる。 ヒトｍＧｌｕＲ５サブタイプをコードする特に好適な配列は、配列番号７、９ま たは１１のコーディング配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有するものであ り、配列番号７、９または１１のコーディング配列と同じ配列を有するポリ核酸 が最も好ましい。 ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡは、 本明細書に開示したＤＮＡ（配列番号１、３、５、７、９または１１の任意のも のより得られるヌクレオチドを含む）により、適当なハイブリダイゼーション条 件下で適当なヒトｃＤＮＡまたはヒトゲノムライブラリーをスクリーニングする ことにより単離される。適当なライブラリーは、神経組織試料（例えば、海馬や 小脳組織、細胞株など）から調製される。例えばライブラリーは、その実質的に 全ての受容体サブタイプコーディング配列を含むＤＮＡの一部を用いてスクリー ニングされるか、あるいはそのＤＮＡの一部に基づく適当なオリゴヌクレオチド プローブでスクリーニングされる。 本明細書においてプローブは、配列番号１、３、５、７、９または１１に記載 の任意のものの２５またはそれ以上の隣接する塩基と同じであるか少なくとも約 ２５−３０個の隣接する塩基（またはその相補物）を含む、ヌクレオチドの配列 を有する１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブを作成するのに好適な領域 は、５’および／または３’コーディング配列、トランスメンブレンドメインを コードすると予測される配列、細胞質ループをコードすると予測される配列、シ グナル配列、リガンド結合部位などがある。 全長ｃＤＮＡクローン、その断片、またはそのＤＮＡの部分に基づくオリゴヌ クレオチドはプローブとして使用され、好ましくは容易に検出するために適当な 標識物で標識される。断片がプローブとして使用される時、そのプローブのＤＮ Ａ配列は好ましくはＤＮＡのカルボキシ末端をコードする部分由来であり、最も 好ましくはＤＮＡ配列の予測されるトランスメンブレンドメインをコードする部 分を含む（ドメインは、例えばカイトとドーリトル（Kyte and Doolittle）（１ ９８２）、J．Mol．Biol．第１５７巻：１０５の方法を用いて、推定されるアミ ノ酸配列のハイドロパシー解析に基づき予測される）。これらのプローブは例え ば、グルタミン酸受容体ファミリーの追加メンバーの同定と単離のために使用さ れる。 本発明の配列の特定の応用として、本発明のヌクレオチド配列をプローブとし て使用して遺伝子スクリーニングを実施することができる。すなわち、任意の内 因性グルタミン酸受容体に異常が存在するか否かを測定するために、グルタミン 酸受容体の任意の１つまたはそれ以上の変化／修飾が関与していることが疑われ る神経病理的症状を有する患者の核酸試料を、適当なプローブでスクリーニング することができる。同様に、グルタミン酸受容体の機能不全に関連する疾患の家 族歴がある患者をスクリーニングして、このような疾患に罹りやすい体質である か否かを決定することができる。 本発明の別の実施態様において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋 白サブタイプをコードするＤＮＡの同定方法が提供され、この方法は、ヒトＤＮ Ａを上記の核酸プローブと接触させ（使用されるプローブがポリ核酸断片の時は 低緊縮性または中緊縮性条件下で接触させ、または使用されるプローブがオリゴ ヌクレオチドの時は高緊縮性条件下で接触させる）、そして該プローブにハイブ リダイズするＤＮＡを同定することよりなる。 ライブラリーのスクリーニング後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出し て陽性クローンを同定する。同定されたクローンを制限酵素マッピングおよび／ またはＤＮＡ配列解析により性状解析し、次にこれらが完全なメタボトロピック グルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡを含有するか否か（すなわち 、これらが翻訳開始コドンおよび停止コドンを含有するか否か）を確認するため に本明細書に記載の配列と比較することにより試験する。選択された配列が不完 全な場合はこれらを用いて、同じかまたは異なるライブラリーを再スクリーニン グして重複するクローンを得ることができる。もしライブラリーがゲノム性の場 合は、重複クローンはエクソンとイントロンを含有してもよい。もしライブラリ ーがｃＤＮＡライブラリーの場合は、重複クローンはオープンリーディングフレ ームを含有するであろう。いずれの場合も完全なクローンは、本明細書で提供さ れるＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列と比較して同定される。 種々のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（例えば、ｍＧｌ ｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ５）をコードする、相補的な ＤＮＡクローンが単離されている。各サブタイプは、異なる遺伝子にコードされ ているようである。本明細書に記載されるＤＮＡクローンは、各サブタイプをコ ードするゲノムクローンを単離し、異なる神経組織から調製されたライブラリー をスクリーニングすることにより、スプライス変種を単離するために使用 できる。当業者に公知の核酸増幅法を使用して、ヒトメタボトロピックグルタミ ン酸受容体サブタイプのスプライス変種をコードするＤＮＡを見つけることがで きる。これは、公知のまたは予測される互いに異なる配列を取り囲むＤＮＡ配列 に基づくオリゴヌクレオチドを、ヒトＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを増幅するため のプライマーとして用いることにより達成される。増幅生成物のサイズと配列の 測定により、スプライス変種の存在が明らかになる。さらにハイブリダイゼーシ ョンによるヒトゲノムＤＮＡ配列の単離により、ヒトメタボトロピックグルタミ ン酸受容体サブタイプをコードする転写体の異なるスプライス変種に対応する、 イントロンにより分離された多数のエクソンを含有するＤＮＡが得られる。 必ずしもすべてのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（およびそ の変種）がすべての神経組織または脳のすべての部分に発現されているのではな いことは、わかっている。すなわち特定のサブタイプ（またはそのスプライス変 種）をコードするｃＤＮＡを単離するためには、異なるニューロンまたは神経組 織または細胞から調製されるライブラリーをスクリーニングすることが好ましい 。各サブユニットをコードするＤＮＡを得るために好適なライブラリーは：ヒト ｍＧｌｕＲ１をコードするＤＮＡを単離するための小脳；ｍＧｌｕＲ２をコード するＤＮＡを単離するための海馬；ｍＧｌｕＲ３をコードするＤＮＡを単離する ための海馬と小脳；ｍＧｌｕＲ５をコードするＤＮＡを単離するための海馬と小 脳などがある。 特定の受容体サブタイプをコードするＤＮＡが一旦単離されると、そのような サブタイプ（またはそのスプライス変種）をコードするｍＲＮＡを発現する組織 を決定するために、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）保護測定法が実施される。 この測定法は、全細胞性ＲＮＡの複雑な混合物中の１つのＲＮＡ種を検出し定量 するための高感度の手段を与える。サブタイプＤＮＡは標識され、細胞性ＲＮＡ とハイブリダイズされる。もし細胞性ＲＮＡ中に相補的なｍＲＮＡが存在する場 合、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが得られる。次にＲＮＡ試料をＲＮａｓｅで処 理する（これは１本鎖ＲＮＡを分解する）。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドはＲＮ ａｓｅ分解から保護され、ゲル電気泳動やオートラジオグラフィーにより肉眼で 見ることができる。特定のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ をコードするｍＲＮＡを発現する組織を決定するために、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイ ブリダイゼーションを使用することができる。こうして、標識されたサブタイプ ＤＮＡは異なる脳の領域のスライスとハイブリダイズして、サブタイプｍＲＮＡ 発現が肉眼で見えるようになる。 いくつかのヒトのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの発現の分 布は、この受容体のラットでの分布とは異なる。例えばラットのｍＧｌｕＲ５サ ブタイプをコードするＲＮＡはラットの海馬に多く存在し、ラットの小脳にはあ まり存在しない［例えば、アベ（Abe）ら、J．Biol．Chem．２６７：１３３６１ −１３３６８（１９９２）を参照］が、ヒトの小脳ライブラリーからは無数のヒ トｍＧｌｕＲ５をコードするｃＤＮＡが得られている。すなわちヒトとラットで はいくつかのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの分布が異なって いるようである。 前述のヌクレオチド配列はベクターに取り込んでさらに操作することができる 。本明細書においてベクター（またはプラスミド）とは、異種ＤＮＡを細胞に取 り込んでそれを発現または複製をさせるのに使用される、独立した成分である。 このような担体（vehicle）の選択と使用は、当業者には公知である。 発現ベクターとは、ＤＮＡ断片の発現を制御することができる制御配列（例え ばプロモーター領域）に機能的に結合したＤＮＡを発現することができるベクタ ーを含む。すなわち発現ベクターとは、適当な宿主細胞内に取り込まれるとクロ ーン化ＤＮＡを発現する、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ作成体（例えば、プラスミ ド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクター）を意味する。適当な発現ベ クターは当業者に公知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複製される もの、およびエピソームとしてとどまるか宿主細胞ゲノム内に取り込まれるもの も含まれる。真核生物の宿主細胞（特に哺乳動物細胞）中での本発明のメタボト ロピックグルタミン酸受容体サブタイプの発現のために好適なプラスミドには、 例えば、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３（図１を参照）、ｐｃＤＮＡ １などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター含有ベクター、そしてＳ Ｖ４０プロモーター含有ベクター、およびｐＭＭＴＶＴ７（＋）またはｐＭＭＴ ＶＴ７（−）（本明細書に記載のように調製されたｐＭＡＭｎｅｏ（ク ロンテク（Clontek）、パロアルト（PaloAlto）、カリホルニア州）を修飾した もの）などのＭＭＴＶＬＴＲプロモーター含有ベクターがある。 本明細書において、プロモーター領域とは、そこに機能的に結合したＤＮＡの 転写を調節するＤＮＡのセグメントを意味する。プロモーター領域は、ＲＮＡポ リメラーゼによる認識、結合および転写の開始に充分な特異的配列を含有する。 このプロモーター領域の部分をプロモーターと呼ぶ。さらにこのプロモーター領 域は、このＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始を調節する配列を含 む。これらの配列はｃｉｓ作用性であるか、またはｔｒａｎｓ活性化因子に対し て応答する。制御の性質により、プロモーターは構成性（constitutive）である かまたは制御されている。本発明の実施において使用されるプロモーターの例に は、ＳＶ４０早期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター 、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニー（ Moloney）マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどがある。 本明細書において、「機能的に結合している」とは、ＤＮＡとヌクレオチドの 制御配列やエフェクター配列（例えばプロモーター、エンハンサー、転写および 翻訳停止部位、および他のシグナル配列）との機能的関係を意味する。例えば、 ＤＮＡとプロモーターの機能的結合は、ＤＮＡの転写はプロモーターを特異的に 認識してこれに結合し、ＤＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモータ ーから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的および機能的結合 を意味する。発現および／またはインビトロの転写を最適化するために、転写ま たは翻訳のレベルで発現を妨害するかまたは低下させる、不適当な代替翻訳開始 コドンまたは他の配列を除去するために、クローンの５’および／または３’非 翻訳部分を除去、付加または変更することが必要なこともある。あるいはコンセ ンサスリボゾーム結合部位（例えば、コザック（Kozak））（１９９１）J．Biol ．Chem．２６６：１９８６７−１９８７０）を開始コドンの５’のすぐ近くに挿 入して、発現を増強させることもできる。同様に、転写を増強するために、メタ ボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットのコーディング配列の代わりに同 じアミノ酸をコードする代替コドンを用いることができる（例えば、宿主細胞の コドンの選択性が採用され、Ｇ−Ｃの豊富なドメインを減少させるなど）。さら に 両生類の卵母細胞中のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットの発現 増強の可能性のために、サブユニットコーディング配列を随時発現作成体中に取 り込むことができる（ここではコーディング配列の５’末端と３’末端は、それ ぞれツメガエル（Xenopus）のβ−グロビン遺伝子の５’と３’の非翻訳配列に 隣接している）。例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットコ ーディング配列は、ｐＳＰ６４（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコン シン州、より入手できる）の修飾型であるベクターｐＳＰ６４Ｔに取り組むこと ができる（クリーグとメルトン（Krieg and Melton）（１９８４）Nucleic Acid s Research １２：７０５７−７０７０を参照）。このコーディング配列は、β −グロビン遺伝子の５’末端とＳＰ６プロモーターの下流に位置する３’非翻訳 配列の間に挿入される。次に得られるベクターから、インビトロの転写体が作成 される。このような修飾の好ましい点（またはニーズ）は実験的に決定されてい る。 本明細書において、発現とはポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリ ペプチドまたは蛋白に翻訳される過程を意味する。ポリ核酸がゲノムＤＮＡから 得られる場合、適当な真核生物宿主細胞または微生物が選択されるなら、発現に はｍＲＮＡのスプライシングを含む。 哺乳動物細胞のトランスフェクションのための、ヒトメタボトロピックグルタ ミン酸受容体をコードするＤＮＡに結合した制御成分を含有する特に好適な基礎 ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをベースにしたベク ター（例えば、ｐＣＭＶ−Ｔ７−２およびｐＣＭＶ−Ｔ７−３（本明細書に記載 ）、またはｐｃＤＮＡ１（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、カリホ ルニア州））、およびＭＭＴＶプロモーターをベースにしたベクター（例えば、 ｐＭＭＴＶＴ７（＋）またはｐＭＭＴＶＴ７（−）（本明細書中に記載））、お よびＳＶ４０プロモーターをベースにしたベクター（例えば、ｐＳＶβ（クロン テック（Clontech）、パロアルト（PaloAlto）、カリホルニア州））である。 ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする全長ＤＮＡ は、ベクターｐＭＭＴＶＴ７（＋）、ｐＭＭＴＶＴ７（−）、ｐＣＭＶ−Ｔ７− ２またはｐＣＭＶ−Ｔ７−３に挿入されている。ｐＣＭＶ−Ｔ７−２（およびｐ ＣＭＶ−Ｔ７−３）は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、プロモーターの すぐ下流に存在するＳＶ４０スプライス／ドナー部位、スプライス部位の下流に 位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、その後にＳ Ｖ４０ポリアデニル化シグナル、そしてＴ７プロモーターとポリアデニル化シグ ナルの間にポリリンカーを有する、ｐＵＣｌ９をベースにした哺乳動物細胞発現 ベクターである。ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの間に メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを配置させると、この作成体に よりトランスフェクションされた哺乳動物の宿主細胞中で外来ＤＮＡの構成的発 現（constitutive expression）が与えられる。 ベクターｐＭＭＴＶＴ７（＋）とｐＭＭＴＶＴ７（−）はベクターｐＭＡＭｎ ｅｏ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（PaloAlto）、カリホルニア州） を修飾することにより調製された。ｐＭＡＭｎｅｏは、デキサメタゾン誘導性マ ウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）−ＬＴＲプロモーターに結合した（この後にＳＶ ４０スプライス部位とポリアデニル化部位が続く）ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）を含有する、哺乳動物の発現ベクターである。 ｐＭＡＭｎｅｏはまた、大腸菌の増殖のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピ シリン耐性を与える蛋白をコードする）と同様に、形質転換体の選択のための大 腸菌ｎｅｏ遺伝子を含有する。 ベクターｐＭＭＴＶＴ７（＋）は、ｐＭＡＭｎｅｏからｎｅｏ遺伝子を除去し 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイア（La Jol la）、カリホルニア州）からのマルチプルクローニング部位とＴ７およびＴ３プ ロモーターを挿入することにより作成される。従ってｐＭＭＴＶＴ７（＋）はＭ ＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターに結合したＲＳＶ−ＬＴＲエンハンサー、ＭＭＴＶ −ＬＴＲプロモーターの下流に位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラ ーゼプロモーター、Ｔ７プロモーターの下流に位置するポリリンカー、Ｔ７プロ モーターの下流に位置するＴ３バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモー ター、そしてＴ３プロモーターの下流に位置するＳＶ４０スプライシング部位と ポリアデニル化部位を含有する。ｐＭＡＭｎｅｏからのβ−ラクタマーゼ遺伝子 （アンピシリン耐性を与える蛋白をコードする）はｐＭＭＴＶＴ７（＋）中で保 持されるが、ｐＭＡＭｎｅｏ中の配向に対して配向は逆転している。 ベクターｐＭＭＴＶＴ７（−）はｐＭＭＴＶＴ７（＋）と同じであるが、Ｔ７ プロモーターとＴ３プロモーターの位置が逆転しており、ｐＭＭＴＶＴ７（−） 中のＴ３プロモーターはｐＭＭＴＶＴ７（＋）中のＴ７プロモーターがある場所 に位置しており、ｐＭＭＴＶＴ７（−）中のＴ７プロモーターはｐＭＭＴＶＴ７ （＋）中のＴ３プロモーターがある場所に位置している。従ってｐＭＭＴＶＴ７ （＋）とｐＭＭＴＶＴ７（−）ベクターは、哺乳動物宿主細胞中で異種ＤＮＡ（ ここで異種ＤＮＡはポリリンカーでベクター内に取り込まれている）が発現する のに必要な制御成分のすべてを含有している。さらにＴ７プロモーターとＴ３プ ロモーターはポリリンカーのどちらかの側に位置しているため、これらのプラス ミドはポリリンカーでベクター内にサブクローニングされている異種ＤＮＡのイ ンビトロ転写体の合成に使用することができる。 哺乳動物細胞中のヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコー ドするＤＮＡの誘導性発現のために、ＤＮＡをｐＭＭＴＶＴ７（＋）またはｐＭ ＭＴＶＴ７（−）のようなプラスミド中に挿入することができる。これらのプラ スミドは、機能的に関連する外来ＤＮＡのステロイド誘導性発現のためのマウス 乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＬＴＲプロモーターを含有する。宿主細胞が細胞内へ の糖質コルチコイド（すなわちＭＭＴＶＬＴＲプロモーターの誘導物質）の摂取 に必要な内因性糖質コルチコイド受容体を発現しない場合は、糖質コルチコイド 受容体をコードするＤＮＡ（ＡＴＣＣ整理番号６７２００）で細胞を追加的にト ランスフェクションする必要がある。インビトロ転写体の合成のために、ヒトｍ ＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ３、およびｍＧｌｕＲ５をコードする全長ヒトＤＮＡク ローンを、ｐＩＢＩ２４（インターナショナル・バイオテクノロジーズ社（Inte rnational Biotechnologies，Inc.）、ニューヘーブン、コネチカット州）、ｐ ＣＭＶ−Ｔ７−２、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３（図１参照）、ｐＭＭＴＶＴ７（＋）、 ｐＭＭＴＶＴ７（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Stratagene ）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）またはｐＧＥＭ７Ｚ（プロメガ（ Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）などの中にサブクローニングするこ ともできる。 本発明の別の実施態様において、前述のポリ核酸（すなわちＤＮＡまたは ｍＲＮＡ）を含有する細胞が提供される。細菌、酵母および哺乳動物のような宿 主細胞は、ＤＮＡを複製しメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを産 生するために使用することができる。本発明に記載の発現ベクターの作成、イン ビトロ転写体の調製、哺乳動物細胞へのＤＮＡのトランスフェクション、卵母細 胞の注入の方法、および受容体の発現と機能の評価のための電気生理的および他 の分析方法は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５６２５とＰＣＴ／ＵＳ９２／ １１０９０、および同時係属出願米国特許出願第０７／５６３，７５１号と０７ ／８１２，２５４号にも記載されている。これらの文献の主題はその全体が参考 のため本明細書中に引用されている。 適当な発現ベクターへのクローン化ＤＮＡの導入法、１つのプラスミドベクタ ーまたはプラスミドベクターの組合せ（それぞれが１つまたはそれ以上の異なる 遺伝子をコードする）または線状ＤＮＡによる真核細胞のトランスフェクション 、そしてトランスフェクションした細胞の選択法は公知である（例えば、サムブ ルーク（Sambrook）ら、（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル（Mo lecular Cloning：A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハ ーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参 照）。異種ＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法により宿主細胞に導入される： 例えば、ＣａＰＯ₄沈殿法（例えば、ウィグラー（Wigler）ら、（１９７９）、P roc．Natl．Acad．Sci．７６：１３７３−１３７６）を用いる、異種ＤＮＡをコ ードするベクターによるトランスフェクション。次に組換え細胞は、ＤＮＡによ りコードされたサブタイプが発現される条件下で培養することができる。好適な 細胞は哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、およびＬｔｋ^-細胞）、 酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）のようなメチル親 和性（methilotrophic）酵母細胞）、細菌細胞（例えば大腸菌）などがある。 本明細書で提供されるＤＮＡは任意の真核細胞（例えば、ピキア・パストリス （Pichia Pastoris）（米国特許第４，８８２，２７９号、４，８３７，１４８ 号、４，９２９，５５５号および４，８５５，２３１号を参照）、サッカロミセ ス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・トロピカリス（Ca ndida tropicalis）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）など の酵母 細胞）中で発現されるが、本明細書で提供されるヒトメタボトロピックグルタミ ン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡの発現のためには、Ｇ蛋白を発現する （内因性にまたは組換えで）市販の発現系や当業者に公知の他の発現系を含む哺 乳動物発現系が好ましい。ＰＩ加水分解／Ｃａ⁺⁺シグナル経路に結合したヒトメ タボトロピック受容体サブタイプをコードするＤＮＡのインビトロｍＲＮＡ転写 体の発現にはツノガエル（Xenopus）卵母細胞が好適である。卵母細胞中の内因 性イノシトール３’末端リン酸第二メッセンジャー介在経路は、これらの細胞に おけるヒトメタボトロピック受容体の機能性発現を可能にする。組換えヒトメタ ボトロピック受容体を発現する卵母細胞は、卵母細胞Ｇ蛋白結合ＩＰ₃生成経路 を介してアゴニストに応答し、内部の貯蔵状態からＣａ⁺⁺を放出し、電圧固定記 録法により遅延振動電流として検出される塩素チャネルを活性化すると報告され ている。 ヒトメタボトロピック受容体の機能性組換え発現のための宿主細胞は、好まし くは内因性または組換えグアニンヌクレオチド結合蛋白（すなわちＧ蛋白）を発 現する。Ｇ蛋白はα、βおよびγサブユニットよりなる高度に保存された膜関連 蛋白のファミリーの１つである。αサブユニットはＧＤＰとＧＴＰに結合し、異 なるＧ蛋白毎に異なる。結合した対のβおよびγサブユニットはユニークである こともそうでないこともあり、異なるα鎖が同じβγ対または異なる対に結合し ている［リンダーとギルマン（Linder and Gilman）、Sci．Am．２６７：５６− ６５（１９９２）］。Ｇ蛋白α鎖をコードする３０以上の異なるｃＤＮＡがクロ ーン化されている［サイモン（Simon）ら、Science２５２：８０２（１９９１） ］。４つの異なるβポリペプチドが知られている［サイモン（Simon）ら、Scien ce２５２：８０２（１９９１）］。同定された５つのγｃＤＮＡのうち３つがク ローン化されている［ハーレー（Hurley）ら、PNAS U.S.A．８１：６９４８（１ ９８４）：ガウタム（Gautam）ら、Science２４４：９７１（１９８９）：ガウ タム（Gautam）ら、PNAS U.S.A．８７：７９７３（１９９０）：］。４番目のγ ｃＤＮＡ［クレウス（Kleus）ら、Science２５９：８３２（１９９３）］と５番 目のγｃＤＮＡ［フイッシャーとアロンソン（Fischer and Aronson）、Mol．Ce ll．Bio．１２：１５８５（１９９２）］の配列は確立されており、さらに追 加のγサブユニットが存在するかも知れない［タミール（Tamir）ら、Biochemis try ３０：３９２９（１９９１）］。グアニンヌクレオチド交換とＧＴＰ加水 分解により、Ｇ蛋白は活性状態と不活性状態の間で変化する。不活性Ｇ蛋白は、 リガンド活性化受容体により剌激されてＧＤＰをＧＴＰに交換する。活性型では 、ＧＴＰに結合したαサブユニットはβγ複合体から解離し、次にサブユニット は細胞性エフェクター分子と特異的に相互作用して細胞性応答を引き出す。異な るＧ蛋白は異なるエフェクター系（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルサイク ラーゼ系）や異なる受容体と相互作用することができるため、異なる組換えヒト メタ受容体サブタイプの発現のための異なる宿主細胞を研究することは有用であ る。あるいは宿主細胞は、異なるＧ蛋白の異種発現のためにＧ蛋白サブユニット をコードするＤＮＡでトランスフェクションすることができる。 好適な実施態様において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイ プをコードするＤＮＡは、ベクターに結合され、適当な宿主細胞中に導入されて 、特異的なヒトメタボトロピックルグルタミン酸受容体サブタイプまたはサブタ イプの特異的な組合せを発現する、形質転換された細胞株を産生する。得られる 細胞株は次に、公知の薬剤または可能性のある薬剤の受容体機能への影響の再現 性のある定量的解析のために大量に産生される。他の実施態様においては、各サ ブタイプをコードするＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡが産生される。こ のｍＲＮＡ（単一のサブタイプクローンからであってもまたはクローンの組合せ からであっても）は、ツノガエル（Xenopus）卵母細胞に注入され、ここでｍＲ ＮＡはヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの合成を指令する。 あるいは機能性ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの発現のた めに、サブタイプをコードするＤＮＡは卵母細胞に直接注入される。次にトラン スフェクションされた哺乳動物細胞または注入された卵母細胞は、本明細書に記 載の薬剤スクリーニング法に使用される。 ＤＮＡまたはＲＮＡが導入される真核細胞は、このようなＤＮＡまたはＲＮＡ によりトランスフェクションされることができる細胞、またはこのようなＤＮＡ またはＲＮＡを注入されてＧ蛋白を（内因性にまたは組換えにより）発現するこ とができる細胞である。好適な細胞は、内因性メタボトロピックグルタミン酸受 容体を（あったとしても）ほんの少ししか発現せず、かつ一時的または安定にト ランスフェクションされ、また本発明のＤＮＡやＲＮＡを発現するものである。 最も好適な細胞は、異種ＤＮＡによりコードされる１つまたはそれ以上のサブタ イプよりなる組換えまたは異種ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を形成 することができるものである。このような細胞は経験的に同定されるか、または 容易にトランスフェクションまたは注入されることが知られているものの中から 選択される。 ＤＮＡを導入するための細胞の例は、哺乳動物起源の細胞（例えば、ＣＯＳ細 胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎 （ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル（African green monkey）細胞および当業 者に公知の他の細胞）、両生類の細胞（例えば、ゼノプス・ラエビス（Xenopus laevis）卵母細胞）、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビッシェ（Sacc haromyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia Pastoris））などがあ る。注入されたＲＮＡ転写体を発現するための細胞の例は、ゼノプス・ラエビス （Xenopus laevis）卵母細胞がある。ＤＮＡのトランスフェクションに好適な細 胞は、当業者に公知であるかまたは経験的に同定され、ＨＥＫ２９３細胞（整理 番号＃ＣＲＬ１５７３でＡＴＣＣより入手できる）；Ｌｔｋ^-細胞（整理番号＃ ＣＣＬ１．３でＡＴＣＣより入手できる）；ＣＯＳ−７細胞（整理番号＃ＣＲＬ １６５１でＡＴＣＣより入手できる）；ＣＨＯ細胞（整理番号＃ＣＲＬ９６１８ 、ＣＣＬ６１またはＣＲＬ９０９６でＡＴＣＣより入手できる）；ＤＧ４４細胞 （ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞；例えば、ウーラウプ（Urlaub）ら（１９８６）Cell．M olec．Genet．１２：５５５を参照）；そしてＢＨＫ細胞（ウェクターとバセル ガ（Waechter and Baserga）、PNAS U.S.A．７９：１１０６−１１１０（１９８ ２）；整理番号＃ＣＲＬ１０３１４でＡＴＣＣより入手できる）を参照）がある 。好適な細胞には、ＣＨＯ細胞とＨＥＫ２９３細胞があり、特に液体窒素中で凍 結され次に融解されて再増殖されるＨＥＫ２９３細胞（例えば、ゴーマン（Gorm an）の米国特許第５，０２４，９３９号（またスティルマン（Stillman）ら、（ １９８５）Mol．Cell．Biol．５：２０５１−２０６０も参照）に記載のもの） 、ＤＧ４４細胞、ＬＴＫ^-細胞などがある。使用される宿主細胞にかかわ らず、使用されるリガンドに誘導されるグルタミン酸産生のバックグランドレベ ルの測定、またはリガンドの非存在下での宿主細胞中に存在するグルタミン酸の バックグランドレベルの測定のために、比較実験を実施すべきであることは、当 業者は理解できるであろう。 ＤＮＡは当業者に公知の方法を用いて細胞内に安定に取り込まれるか、または 一時的に発現される。安定にトランスフェクションされる哺乳動物細胞は、選択 マーカー遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイ シン耐性などの遺伝子）を有する発現ベクターで細胞をトランスフェクションし 、トランスフェクションした細胞をマーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条 件下で増殖させることにより調製される。一時的トランスフェクション体を調製 するためには、哺乳動物細胞をレポーター遺伝子（例えば大腸菌β−ガラクトシ ダーゼ遺伝子）でトランスフェクションしてトランスフェクション効率を追跡す る。トランスフェクション体は典型的には選択性条件下では増殖せず、普通トラ ンスフェクション後数日以内に分析されるため、選択マーカー遺伝子は一時的ト ランスフェクション体には含有されない。 このような安定トランスフェクション細胞または一時的トランスフェクション 細胞を産生するために、細胞を充分な濃度のサブタイプをコードする核酸でトラ ンスフェクションして、異種ＤＮＡにコードされるヒトサブタイプを示すヒトメ タボトロピックグルタミン酸受容体を形成させる。サブタイプをコードするＤＮ Ａの正確な量は経験的に決定されるか、または特定のサブタイプ、細胞および測 定条件について最適化される。異種ＤＮＡまたはＲＮＡのみにコードされるサブ タイプを含有するメタボトロピックグルタミン酸受容体を発現する組換え細胞が 特に好適である。 異種ＤＮＡは細胞中でエピソーム成分として維持されるか、または細胞の染色 体ＤＮＡに取り込まれる。次に得られる組換え細胞を培養し、この培養物または サブ培養物からサブ培養（または、哺乳動物細胞の場合は継代する）する。組換 え細胞のトランスフェクション、注入および培養法は当業者に公知である。同様 に当業者に公知の蛋白精製法を用いて、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容 体サブタイプが精製される。例えば１つまたはそれ以上のサブタイプに特異的に 結合する抗体または他のリガンドが、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体 の親和性精製に使用される。 本明細書において、異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡおよびＲＮＡは、互いに交換 して使用することができ、細胞のゲノムの一部としては天然には存在しないか、 または天然に存在するものとは異なるゲノム中の位置に見いだされるＤＮＡまた はＲＮＡを意味する。典型的には異種または外来ＤＮＡおよびＲＮＡは、宿主細 胞に内因性ではなく人工的に細胞に取り込まれたＤＮＡまたはＲＮＡを意味する 。異種ＤＮＡの例としては、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイ プをコードするＤＮＡ、転写、翻訳または他の制御可能な生化学過程などに影響 を与えることにより内因性ＤＮＡの発現を媒介または変更するＲＮＡまたは蛋白 をコードするＤＮＡなどがある。異種ＤＮＡを発現する細胞は、同じであるかま たは異なる発現生成物をコードするＤＮＡを含有する。異種ＤＮＡは発現される 必要はなく、宿主細胞ゲノム中に取り込まれるかまたはエピソーム的に維持され る。 機能性ｍＧｌｕＲの発現を検出するために使用する種々の測定法を当業者は容 易に見いだすことができる。その例としては、ＰＩターンオーバー測定法［例え ば、ナカジマ（Nakajima）ら、J．Biol．Chem．２６７：２４３７−２４４２（ １９９２）および実施例３．Ｃ．２を参照］、ｃＡＭＰ測定法［例えば、ナカジ マ（Nakajima）ら、前述、および実施例３．Ｃ．４を参照］、カルシウムイオン 流入測定法［例えば、イトウ（Ito）ら、J．Neurochem．５６：５３１−５４０ （１９９１）、および実施例３．Ｃ．１を参照］、ｃＧＭＰ測定法［例えば、ス タイナー（Steiner）ら、J．Biol．Chem．２４７：１１０６−１１１３（１９７ ２）］、アラキドン酸放出測定法［例えば、フェルダー（Felder）ら、J．Biol ．Chem．２６４：２０３５６−２０３６２（１９８９）を参照］などがある。さ らに、陽イオンをベースにした測定法（本明細書に記載）を、細胞内サイクリッ クヌクレオチドレベルの受容体誘導変化を追跡するために使用することができる 。そのような測定法は、サイクリックヌクレオチドゲートのイオンチャネルを発 現する宿主細胞を使用する。例えば棹状光受容体細胞、嗅覚細胞およびウシ腎細 胞中に存在するこれらのチャネル（例えば、カウプ（Kaupp）ら、Noture ３４ ２：７６２−７６６（１９８９）、ダレン（Dallen）ら、Noture ３４７：１８ ４−１８７ （１９９０）、およびビエル（Biel）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ９１： ３５０５−３５０９（１９９４））は、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの結合による活 性化により陽イオンに対して透過性となる。すなわち本発明の測定法において、 内因性または組換えサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現する宿主 細胞は、サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる受容体 をコードする核酸（例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体をコードする ＤＮＡ）でトランスフェクション（または注入）され、次にチャネルのサイクリ ックヌクレオチド活性化の量の変化を追跡する。チャネルのサイクリックヌクレ オチドの活性化の変化を追跡すると、活性化された時ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの 変化を引き起こす受容体を機能性であるとして間接的に同定することができる。 サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルの活性化の量の変化は、チャネルを 介するイオンの流入を測定するか、または電流の電気生理学的測定または細胞内 陽イオンレベルの変化を測定（例えば、細胞内カルシウムの蛍光測定）すること により、決定することができる。 活性化によりサイクリックヌクレオチドの低下を引き起こす受容体（例えば、 メタボトロピックグルタミン酸受容体）を発現する細胞の測定法において、受容 体活性化化合物を測定物内の細胞に添加する前に、サイクリックヌクレオチドの 細胞内レベルを上昇させる物質（例えば、フォルスコリンやＩＢＭＸ）に細胞を 暴露させることが好ましい。 上記の測定法での使用に適した宿主細胞は、検討される受容体の発現に適した 宿主細胞を含む（例えば、メタボトロピックグルタミン酸受容体の測定のための Ｌ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞またはツノガエル（Xenopus）卵母細胞 ）。細胞は、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルをコードする核酸と受 容体をコードする核酸で連続的にトランスフェクション（または注入）されるか 、または細胞は２つの核酸で同時トランスフェクションされる。実施例３Ａと３ Ｂに記載の一時的または安定なトランスフェクションを実施することができる。 サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルでトランスフェクション（または 注入）された細胞は、機能の測定の前にインキュベートされる（典型的には約２ ４−４８時間）。チャネルの活性は、トランスフェクションされた細胞からの引 き剥がした裏返した膜パッチを用いて測定される（こうして細胞質面に達するｃ ＡＭＰの濃度が調節される）。トランスフェクション体はまた、内部カルシウム レベル（［Ｃａ⁺⁺］_i）の単細胞ビデオイメージングにより分析される。この方 法は、細胞内カルシウムレベル（これはチャネルのサイクリックヌクレオチド活 性化により制御される、チャネルを介するカルシウムの流入量とともに変化する ）の測定によるサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルの分析を可能にする 。イメジーング測定法は、基本的に実施例３．Ｃ．４．ｂに記載のように実施さ れる。 本明細書に記載のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ベクター、受容体サブタイプおよび細胞 により、選択されたメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプやその受容 体サブタイプに対する抗体の産生が可能である。これは、その存在が単一のメタ ボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの分析を妨害する多くの他の受容体 蛋白の汚染が実質的にない、合成または組換え受容体および受容体サブタイプを 調製する手段を与える。目的の受容体サブタイプが利用できることが、特定の受 容体サブタイプまたはメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの組合せ への薬剤の影響を観察し、従ってヒトに特異的でありヒトメタボトロピックグル タミン酸受容体サブタイプまたはメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイ プの組合せに特異的な試験系で、薬剤の初期のインビトロスクリーニングを行う ことを可能にする。特異的抗体が利用できることは、インビボで発現されるサブ タイプの組合せを同定することを可能にする。すなわち、このような特異的組合 せは、薬剤スクリーニングの好適な標的として使用される。 特異的な受容体組成物への薬剤の影響を測定するためにインビトロで薬剤物質 をスクリーニングすることができることは、受容体サブタイプ特異的または疾患 特異的薬剤の開発とスクリーニングを可能にするはずである。また単一の受容体 サブタイプまたは種々の受容体サブタイプと種々のアゴニストまたはアンタゴニ ストの可能性のある物質との特定の組合せを試験することにより、個々のサブタ イプの機能と活性に関する追加情報が得られ、１つまたはそれ以上の受容体サブ タイプと非常に特異的に相互作用することができる化合物の同定と設計を可能に するであろう。得られる薬剤は、種々の受容体サブタイプを発現する細胞を用い てスクリーニングすることにより同定される薬剤より、不要な副作用はより少な いであろう。 さらに種々の疾患の薬剤開発と治療法に関して、ヒトメタボトロピックグルタ ミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡが利用できることは、ある種の疾患 の発症に相関する遺伝子の変化（例えば、突然変異）の同定を可能にする。さら に、このような突然変異を合成ＤＮＡ配列に特異的に導入し、次にこれを実験室 動物に導入するかまたはその効果を測定するためのインビトロ測定系により、そ のような疾患の動物モデルの作成が可能になる。 別の面において、本発明は本発明のＤＮＡによりコードされる機能性ペプチド 断片およびその機能性組合せよりなる。ペプチドがグルタミン酸受容体として機 能するのに必須ではない配列中のアミノ酸の一部またはすべてを排除することに より、不要な実験をすることなく当業者はこのような機能性ペプチド断片を産生 することができる。グルタミン酸受容体機能に必須のアミノ酸は、例えばペプチ ドをコードするＤＮＡの体系的消化および／またはＤＮＡへの欠失の導入により 決定することができる。修飾（例えば欠失または消化）ＤＮＡは、例えばＤＮＡ を転写し、次に得られるｍＲＮＡをツノガエル（Xenopus）卵母細胞に導入して 、ｍＲＮＡを翻訳させることにより発現することができる。卵母細胞中のこうし て発現された蛋白の機能的分析は、グルタミン酸受容体に結合しこれを機能的に 活性化することが公知のリガンドに卵母細胞を暴露して、次に内因性チャネルが 活性化されるか否かについて卵母細胞を追跡することにより、行われる。電流が 検出されるなら、断片はグルタミン酸受容体として機能する。 本発明の別の実施態様において、競合的結合測定法で本発明の受容体蛋白を使 用することよりなる、メタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプに結合す る化合物の同定方法が提供される。この測定法は多数の化合物を迅速にスクリー ニングして、どの化合物（もし、あるとすれば）が、特異的に結合した［³Ｈ］ グルタミン酸を排除することができる（すなわち、メタボトロピックグルタミン 酸受容体に結合することができる）かを調べることができる。結合することが見 いだされた化合物を用いて、このような化合物が本発明の受容体のモジュレータ ー、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用するのか否かをさらに調べるた めに、 さらに詳しい測定法が実施される。 本発明の結合測定法の別の応用は、本発明の受容体の存在の有無に関する試料 （例えば生物学的液体）の測定である。例えばグルタミン酸産生経路の機能不全 に関連する症状を示す患者の血清を測定して、観察される症状がこのような受容 体の型の産生過剰または不足により引き起こされるのかを決めることができる。 本発明において企図される結合測定法は、当業者は容易に判定できるように種 種の方法で実施することができる。例えばラジオリセプター測定法などの競合的 結合測定法を使用することができる。 本発明のさらなる実施態様において、本発明のヒトメタボトロピックグルタミ ン酸受容体サブタイプの活性を調節する化合物を同定するための生物測定法が提 供され、該方法は： （ａ）ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードするＤＮＡ を含有する細胞（この細胞は機能性メタボトロピックグルタミン酸受容体を発現 する）を、受容体の活性の調節能力を測定すべき少なくとも１つの化合物に暴露 させて、 （ｂ）第二メッセンジャー活性の変化について細胞を追跡する ことよりなる。 上記の生物測定法はヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体のアゴニストや アンタゴニストおよびアロステリックモジュレーターの同定を可能にする。この 方法では組換えメタボトロピックグルタミン酸受容体に「未知の」すなわち試験 物質と（アンタゴニスト活性が試験される時は、さらに公知のメタボトロピック グルタミン酸アゴニストの存在下で）接触させ、この「未知の」すなわち試験物 質との接触後、公知のグルタミン酸受容体の第二メッセンジャー活性を追跡し、 公知のグルタミン酸受容体の活性を追跡し、公知のグルタミン酸受容体の第二メ ッセンジャー応答を増加または減少させる物質は、ヒトメタボトロピックグルタ ミン酸受容体の機能性リガンド（すなわち、モジュレーター、アゴニストまたは アンタゴニスト）として同定される。追跡することができる第二メッセンジャー 活性には、細胞内カルシウムイオンの濃度、ＩＰ₃、ｃＡＭＰレベルの変化、ま たはアラキドン酸放出またはイオン電流の活性または阻害の追跡（細胞が卵母細 胞の場合）がある。 本発明の特定の実施態様において、組換えヒトメタボトロピックグルタミン酸 受容体を発現する哺乳動物細胞または卵母細胞を試験化合物と接触させて、次に 試験化合物がある場合またはない場合のメタボトロピックグルタミン酸受容体介 在応答を比較し、化合物の存在に対する試験細胞または対照細胞（すなわち、メ タボトロピックグルタミン酸受容体を発現しない細胞）のメタボトロピックグル タミン酸受容体介在応答を比較して、その調節作用を評価することができる。 本明細書において、「メタボトロピックグルタミン酸受容体の活性を調節する 」化合物またはシグナルとは、メタボトロピックグルタミン酸受容体の活性を変 化させ、化合物またはシグナルの存在下ではこれらが存在しない場合とはメタボ トロピックグルタミン酸受容体の活性が異なるようになる化合物またはシグナル を意味する。特にこのような化合物またはシグナルはアゴニストやアンタゴニス トを含む。アゴニストという用語は、受容体機能を活性化するグルタミン酸また はＡＣＰＤのような物質またはシグナルを意味し；アンタゴニストという用語は 、アゴニストに誘導される受容体活性化を妨害する物質を意味する。アンタゴニ ストには競合的および非競合的アンタゴニストがある。競合的アンタゴニスト（ または競合的ブロッカー）は、アゴニスト（例えば、リガンドまたは神経伝達物 質）の近傍または特異的な部位と、その同じ部位または近傍に対して相互作用す る。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニストと相互作用する部 位とは異なる部位と相互作用することにより、受容体の機能を不活性化する。 当業者は理解できるように、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体活性を 調節する化合物（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）の同定方法には、 一般に対照との比較が必要である。「対照」細胞または「対照」培養物の１つの タイプは、試験化合物に暴露された細胞または培養物と実質的に同様に処理され た細胞または培養物である（ただし、対照培養物は試験化合物に暴露されない） 。例えば、電圧固定電気生理学的方法を用いる方法では、細胞を浸漬している外 部溶液を単に交換することにより、試験化合物の存在下または非存在下で同じ細 胞を試験することができる。別のタイプの「対照」細胞または「対照」培養物は 、トランスフェクションされた細胞と同一の細胞または細胞の培養物である（た だ し、対照培養物に使用される細胞は、トランスフェクションされた細胞に発現さ れる組換えヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプを発現しない） 。この場合、細胞または各タイプの細胞の培養物が、測定される化合物の存在下 と実質的に同じ反応条件下に暴露される時、試験化合物に対する試験細胞の応答 は、受容体のない（対照）細胞の試験化合物に対する応答（または応答の欠如） と比較される。 本発明のさらに別の実施態様において、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受 容体の第二メッセンジャー活性は、この受容体を、上記生物測定法により同定さ れる少なくとも１つの化合物の有効量と接触させることにより調節される。 本発明のさらに別の実施態様において、上記の受容体蛋白に対して産生された 抗体が提供される。この抗体は、受容体組織局在化、サブタイプ組成、機能性ド メインの構造の研究用、受容体の精製、および診断応用治療応用などに使用する ことができる。好ましくは治療用途では、使用される抗体はモノクローナル抗体 である。 本発明の受容体蛋白またはその部分を抗体産生の抗原として用いることにより 、上記の抗体は当業者に公知の標準的方法を使用して産生することができる。抗 ペプチドおよび抗融合蛋白抗体ともに使用することができる［例えば、バホウト （Bahouth）ら、（１９９１）Trends Parmacol Sci．第１２巻：３３８−３４３ ；Current Protocols in Molecular Biology（アウスベル（Ausubel）ら編、ジ ョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク（１ ９８９）］。免疫原として（合成ペプチドまたは組換え産生細菌融合蛋白として ）使用するためのメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの部分を選択 する場合に考慮すべき因子は、抗原性、入手し易さ（すなわち、細胞外ドメイン および細胞質ドメイン）、特定のサブタイプに特異的であるかなどである。 サブタイプ特異的抗体が利用できることは、（例えば、正常の脳組織対疾患の 脳組織中の）種々のサブタイプの分布と発現密度を追跡するのに免疫組織学的方 法を使用することを可能にする。このような抗体はまた、診断および治療応用に 利用できる。 本発明のさらに別の実施態様において、有効量の上記の抗体に本発明の受容体 を接触させることにより、該受容体のイオンチャネル活性を調節する方法が提供 される。 本発明の抗体は、標準的方法（例えば、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与 、または皮下注射、移植または経皮的投与法など）により、対象者に投与するこ とができる。当業者は、使用される投与法により、投与型、治療処方などを容易 に決定することができる。 本発明のさらなる実施態様において、細胞内サイクリックヌクレオチドレベル の受容体に誘導される変化を追跡するための、陽イオンベースの生物測定法が提 供され、該生物測定法は： 内因性または組換えサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現する宿主 細胞に、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる 受容体をコードする核酸を導入し、そして 細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えることが疑われる、該受容 体に対するリガンドの存在下または非存在下で、サイクリックヌクレオチドゲー トのチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化の量の変化を追跡することより なる。 以下の非限定的実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。実施例１ ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体をコードするＤＮＡの単離 Ａ．ｍＧｌｕＲ５受容体ｃＤＮＡ ｃＤＮＡライブラリースクリーニング ヒト海馬組織から単離したＲＮＡを、標準的方法［例えば、グブラーとホフマ ン（Gubler and Hoffman）、（１９８３）Gene ２５：２６３−２６９］に従い 、オリゴｄＴ−プライムした１本鎖ｃＤＮＡの合成のための鋳型として使用した 。１本鎖ｃＤＮＡを２本鎖ｃＤＮＡに変換し、そのｃＤＮＡの末端にＥｃｏＲＩ ／ＳｎａＢＩ／ＸｈｏＩアダプターを付け加えた。アガロースゲル電気泳動を用 いてサイズによりｃＤＮＡを分離し、＞２．５kbのものをＥｃｏＲＩ消化したλ ｇｔ１０バクテリオファージベクターに結合させた。得られる一次ヒト海馬ｃＤ ＮＡライブラリー（約２×１０⁵組換え体）を、ラットｍＧｌｕＲ１受容体 （ヌクレオチド１から１７２３＋５’非翻訳配列：マス（Masu）ら、（１９９１ ）Nature ３４９：７６０−７６５を参照）をコードするＤＮＡの断片に対する ハイブリダイゼーションについてスクリーニングした。ハイブリダイゼーション は、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルム アミド、０．２％ＳＤＳおよび２００μg／mlの変性した超音波処理したニシン 精子ＤＮＡ中で行ない、洗浄は６５℃で１ＸＳＳＰＥと０．２％ＳＤＳ中で行な った。３２７３塩基対を含有するハイブリダイズする１つのプラーク（ＭＥＴＡ Ｂ１）を同定した。 追加のヒトｍＧｌｕＲ５コーディングクローンを得るために、ＭＥＴＡＢ１を 放射標識し、以下のように調製した２つのヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをスク リーニングするのに使用した。ランダムプライマーを使用して、ヒト小脳組織か ら単離したＲＮＡから最初のｃＤＮＡ合成をプライムしてｃＤＮＡを合成した。 長さを基準にしてｃＤＮＡをプールし、２つのライブラリーを作成した：１つは ２．８kb以上の長さの挿入体を有し（すなわち、大挿入体ライブラリー）、もう １つは１−２．８kbの長さの挿入体を有する（すなわち、中挿入体ライブラリー ）。ラットｍＧｌｕＲ１ＤＮＡ断片へのハイブリダイゼーションに対して海馬ラ イブラリーをスクリーニングするために使用したのと同じハイブリダイゼーショ ン条件を用いて、ＭＥＴＡＢ１に対するハイブリダイゼーションについてライブ ラリーをスクリーニングした。洗浄は５５℃で１ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中 で行なった。大挿入体ライブラリー中に１つのハイブリダイズするプラーク（Ｍ ＥＴＡＢ２）を同定し、中挿入体ライブラリー中に４つのハイブリダイズするプ ラーク（ＭＥＴＡＢ３−ＭＥＴＡＢ６）を同定した。 ヒトｍＧｌｕＲ５をコードするＤＮＡの別のスクリーニングで、ＭＥＴＡＢ１ により大挿入体または中挿入体小脳ライブラリーをスクリーニングするのに使用 した条件と同じ条件を用いて、サイズが１−２kbの範囲の挿入体を含有するラン ダムにプライムしたヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー（２×１０⁶組換え体）およ び中挿入体小脳ｃＤＮＡライブラリーを、放射能標識したＭＥＴＡＢ５へのハイ ブリダイゼーションについてスクリーニングした。海馬ライブラリーに３つのハ イブリダイズするプラーク（ＭＥＴＡＢ１０−ＭＥＴＡＢ１２）が同定され、小 脳ライブラリーの別の一次スクリーニングで５つの追加のハイブリダイズするプ ラーク（ＭＥＴＡＢ１３−ＭＥＴＡＢ１７）が同定された。選択されたプラーク を精製した。単離されたクローンの性状解析 制限酵素マッピングとＤＮＡ配列解析による精製したプラークの挿入体の性状 解析から、単離されたクローンによりヒトｍＧｌｕＲ５転写体の少なくとも３つ の明らかなスプライス変種が表されていることが判明した。ＭＥＴＡＢ１の分析 により、これは翻訳開始コドンを含有するが翻訳停止コドンは含有しないことが 示された。推測されるアミノ酸配列は、ラットのｍＧｌｕＲ１の推測されるアミ ノ酸配列に約７０％同一であり、ラットのｍＧｌｕＲ５の推測されるアミノ酸配 列とは＞９０％の同一性を有している［アベ（Abe）ら、（１９９２）J．Biol． Bhem．２６７：１３３６１−１３３６８］。 ＭＥＴＡＢ５のＤＮＡ配列解析は、ＭＥＴＡＢ５は５’末端でＭＥＴＡＢ１の ３’末端と重複し、３’方向へ追加の３４３ヌクレオチドが続いていることを示 した。ＭＥＴＡＢ１とＭＥＴＡＢ５の重複領域を比較すると、ＭＥＴＡＢ１はＭ ＥＴＡＢ５に存在しない９６ヌクレオチドを有していた（すなわち、ＭＥＴＡＢ １はＭＥＴＡＢ５に対して９６ヌクレオチド挿入を含有する）。ＭＥＴＡＢ５は また、翻訳停止コドンを持っていない。ＭＥＴＡＢ１２挿入体は５’末端でＭＥ ＴＡＢ５の３’末端と重複するが、さらに３’末端方向に延長して翻訳停止コド ンを有する。 ＭＥＴＡＢ２のＤＮＡ配列解析により、５’末端の最初の８６９ヌクレオチド はＭＥＴＡＢ１の３’末端の一部と重複し、同じであった。しかし、ＭＥＴＡＢ １とＭＥＴＡＢ２の配列はＭＥＴＡＢ１の９６ヌクレオチド挿入の最初で分岐し ていた。ＭＥＴＡＢ２は３’末端方向に約２７００ヌクレオチド延長し、ＭＥＴ ＡＢ１との分岐点の４ヌクレオチドだけ３’方向に推定翻訳停止コドンを有する 。 ＭＥＴＡＢ４の部分的ＤＮＡ配列解析は、これが別のヒトメタボトロピック受 容体であるｍＧｌｕＲ１の一部を含有することを示していた（実施例１．Ｂ．を 参照）。全長ｍＧｌｕＲ５ ｃＤＮＡ作成体の調製 ｃＤＮＡのインビトロ転写体の調製および／または哺乳動物細胞でのｃＤＮＡ の発現に使用するために、ヒトｍＧｌｕＲ５転写体の３つの推定スプライス変種 を表す全長作成体（ｍＧｌｕＲ５ａ、ｍＧｌｕＲ５ｂそしてｍＧｌｕＲ５ｃと呼 ぶ）を作成し、発現ベクター中に取り込むことができる。典型的に使用される基 礎となる発現ベクターは、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３またはｐＣＭＶ−Ｔ７−２である （図１を参照）。プラスミドｐＣＭＶ−Ｔ７−３はｐＵＣ１９ベースのベクター であり、ＣＭＶ（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、プロモーターのすぐ下 流に位置するＳＶ４０スプライスドナー／スプライスアクセプター部位、ＳＶ４ ０スプライス部位のすぐ下流に位置するＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラ ーゼプロモーター、Ｔ７プロモーターの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル 、およびＴ７プロモーターとポリアデニル化シグナルの間のポリリンカーを含有 する。すなわちこのベクターは、哺乳動物宿主細胞中での異種ＤＮＡの発現に必 要なすべての制御成分を含有する（異種ＤＮＡはポリリンカーでベクターに取り 込まれる）。さらにＴ７プロモーターはポリリンカーのすぐ上流に位置するため 、このプラスミドは、ポリリンカーでベクターにサブクローニングされた異種Ｄ ＮＡのインビトロ転写体の合成に使用される。ｐＣＭＶ−Ｔ７−３とｐＣＭＶ− Ｔ７−２は、ポリリンカー中の制限酵素部位の配向のみが異なる。 全長ｍＧｌｕＲ５ａ作成体（配列番号７を参照）を調製するために、クローン ＭＥＴＡＢ１、ＭＥＴＡＢ５およびＭＥＴＡＢ１２の部分を一緒に結合させた。 まず操作を容易にするために、ＭＥＴＡＢ１、ＭＥＴＡＢ５およびＭＥＴＡＢ１ ２の挿入体をＥｃｏＲＩ断片としてλｇｔ１０から別々に、ＥｃｏＲＩ消化ｐＧ ＥＭ−７Ｚｆ（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン州）に移した 。ＭＥＴＡＢ１挿入体を含有するｐＧＥＭ−７ＺｆベクターをＳｃａＩ／Ｎｈｅ Ｉで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分とＭＥＴＡＢ１挿入体の５’ 部分（配列番号７のヌクレオチド１−２７２４）を含有する３．８kb断片を放出 させた。ＭＥＴＡＢ５の挿入体を含有するｐＧＥＭ−７ＺｆベクターをＳｃａＩ ／ＮｈｅＩで消化して、アンピシリン耐性遺伝子の３’半分とＭＥＴＡＢ５挿入 体の３’部分（配列番号７のヌクレオチド２７２５−３４６９） を含有する２．６kb断片を放出させ、この断片を、ＭＥＴＡＢ１を含有するｐＧ ＥＭ−７Ｚｆベクターからの３．８kb断片に結合させてｐＧＥＭ−ＭＥＴＡＢ１ ＋５を作成した。ｐＧＥＭ−ＭＥＴＡＢ１＋５をＳｃａＩ／ＮｈｅＩで消化して 、アンピシリン耐性遺伝子の５’半分と配列番号７のヌクレオチド１−３３１６ を含有する４．４kb断片を放出させた。次にこの４．４kb断片を、ＭＥＴＡＢ１ ２挿入体を含有するｐＧＥＭ−７ＺｆベクターのＳｃａＩ／ＮｈｅＩ（部分）消 化により得られた２．６kb断片［この２．６kb断片はアンピシリン耐性遺伝子の ３’半分とＭＥＴＡＢ１２の３’部分（配列番号７のヌクレオチド３３１７−４ ０８５）を含有する］に結合させた。得られたベクターはｐＧＥＭ−７Ｚｆ中に 完全なｍＧｌｕＲ５ａコーディング配列を含有していた。全長mＧｌｕＲ５ａ ｃＤＮＡを、ＡａｔII（平滑末端）−ＨｉｎｄIII断片としてベクターから単離 し、ＮｏｔＩ（平滑末端）／ＨｉｎｄIII消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−３にサブクロー ニングして、作成体ｍＧｌｕＲ５ａ１を作成した。 要約すると、作成体ｍＧｌｕＲ５ａ１は、ＭＥＴＡＢ１からの５’非翻訳配列 の３６９塩基対（配列番号７のヌクレオチド１−３６９）と、ｍＧｌｕＲ５受容 体のｍＧｌｕＲ５ａ変種の完全なコーディング配列（配列番号７のヌクレオチド ３７０−３９１２）、および３’非翻訳配列の１７３塩基対（配列番号７のヌク レオチド３９１３−４０８５）を含有する。ｍＧｌｕＲ５ａをコードする配列は 、哺乳動物宿主細胞中で受容体を発現するために、そしてツノガエル（Xenopus ）卵母細胞で発現されるＤＮＡのインビトロ転写体を作成するのに使用するため に、ｐＣＭＶ−Ｔ７−３中の制御成分に機能的に結合している。 ２つの追加のｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ｍＧｌｕＲ５ａ２とｍＧｌｕＲ５ａ３） を、最初のｍＧｌｕＲ５ａ作成体の５’非翻訳領域を修飾して調製した。上記の ｍＧｌｕＲ５ａ作成体は、提唱されている翻訳開始コドン（配列番号７のヌクレ オチド３７０から３７２）に先行する５’非翻訳領域中に７つのおそらく不適切 なＡＴＧコドンを含有する。ｍＧｌｕＲ５ａ１作成体をＢＡ１３１で消化して、 以下を行う：（１）配列の２５５ヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド１− ２５５であり、上流のＡＴＧトリプレット７つのうち６つを含有する）を除去し て、ｍＧｌｕＲ５ａ２を作成する、そして（２）配列の３４８ヌクレオチド（配 列番号７のヌクレオチド１−３４８であり、上流のＡＴＧトリプレットのすべて を含有する）を除去して、ｍＧｌｕＲ５ａ３を作成する。すなわち、ｍＧｌｕＲ ５ａ２は、５’非翻訳配列の一部が欠如していること以外はｍＧｌｕＲ５ａ１と 同じであり、従って提唱される翻訳開始コドンの上流に１つのみのＡＴＧトリプ レットを含有する。同様に、ｍＧｌｕＲ５ａ３は、提唱される翻訳開始コドンの 上流のすべてのＡＴＧトリプレットが欠如していること以外はｍＧｌｕＲ５ａ１ と同じであり、５’非翻訳配列の２１ヌクレオチドのみを含有する。 ３つ目のｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａ）は、以下のよ うにｍＧｌｕＲ５ａのＭＭＴＶプロモーター制御発現に使用するために調製した 。ｍＧｌｕＲ５ａ３をＸｂａＩで消化した。ＳＶ４０スプライス部位、全長ｍＧ ｌｕＲ５ａコーディング配列（および５’非翻訳配列の２１ヌクレオチドと３’ 非翻訳配列の１７３ヌクレオチド）、およびポリアデニル化シグナルを含有する ４．１kb断片を単離し、平滑末端とし、ｐＢＲ３２２の２kbのＥｃｏＲＩ−Ｎｄ ｅＩ（平滑末端）断片に結合させて、ｐＢＲ−ｈｍＧｌｕＲ５を作成した。ＭＭ ＴＶＬＴＲプロモーターとアンピシリンおよびネオマイシン耐性遺伝子を含有す るベクターｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alt o）、カリホルニア州）をＢａｍＨＩで消化して、ネオマイシン耐性遺伝子を除 去し、再結合させた。次にこのベクターをＥｃｏＲＩで消化し、アンピシリン耐 性遺伝子を含有する断片を逆配向で大きい方のベクター断片に再結合させてｐＭ ＡＭｎｅｏ ａｍｐｏｐｐを作成した。このベクターをＰｓｔＩ／ＮｈｅＩで消 化して、アンピシリン耐性遺伝子の５’部分とＭＭＴＶ−ＬＴＲを含有する２． ３kbの断片を単離した。プラスミドｐＢＲ−ｈｍＧｌｕＲ５をＰｓｔＩ／Ｘｂａ Ｉで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の３’部分とｍＧｌｕＲ５ａ配列（ＳＶ４ ０スプライス部位とポリアデニル化シグナルとともに）を含有する５．３kbの断 片を、ｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐｏｐｐの２．３kbのＰｓｔ／ＮｈｅＩ断片に結合 させてＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａを作成した。 すなわち、ｐＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａは、ＭＭＴＶ−ＬＴＲを含有し、ｍ ＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡ（配列番号７のヌクレオチド３４９−４０８５を含有する ）と機能的に結合したＳＶ４０スプライス部位が続き、この後にポリアデニル 化シグナルが続く。 ４つ目のｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ５）は、以下のように ｍＧｌｕＲ５ａのＳＶ４０プロモーター制御発現に使用するために調製した。ｍ ＧｌｕＲ５ａ３をＸｈｏＩで部分的に消化し、クレノウ（Klenow）で処理し、自 身と再結合させ、こうしてｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡの３’に位置するＸｈｏＩ部 位を破壊した。次にプラスミドをＳｃａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＳＶ４０スプラ イス部位、全長ｍＧｌｕＲ５ａコーディング配列（および５’非翻訳配列の２１ ヌクレオチドと３’非翻訳配列の１７３ヌクレオチド）、ポリアデニル化シグナ ルおよびアンピシリン耐性遺伝子の３’部分を含有する断片を作成した。プラス ミドｐＳＶβ（クロンテック（Clontech）、パロアルト（Palo Alto）、カリホ ルニア州）をＳｃａＩ／ＸｈｏＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子とＳＶ４０ 早期プロモーターを含有する断片を、ｍＧｌｕＲ５ａ ＤＮＡを含有するＳｃａ Ｉ／ＸｈｏＩ断片に結合させて、ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ５を作成した。すなわち 、ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ５は、ＳＶ４０早期プロモーターを含有し、ｍＧｌｕＲ ５ａ ＤＮＡ（配列番号７のヌクレオチド３４９−４０８５を含有する）と機能 的に結合したＳＶ４０スプライス部位が続き、この後にポリアデニル化シグナル が続く。 全長ｍＧｌｕＲ５ｂ作成体を調製するために、ｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ｍＧｌ ｕＲ１ａ１、ｍＧｌｕＲ５ａ２またはｍＧｌｕＲ５ａ３）をＮｈｅＩ／ＰｍｌＩ で消化し、配列番号７のヌクレオチド２７２５−３０２０を含有する断片を放出 させる。次に残りのベクター断片を、ＭＥＴＡＢ１からの単離したＮｈｅＩ／Ｐ ｍｌＩ断片に結合させる。得られるベクター（ｍＧｌｕＲ５ｂ）は、配列番号７ のヌクレオチド２９９９と３０００の間に位置する９６塩基対の挿入体（配列番 号９のヌクレオチド３０００−３０９５）を含有する以外は、これが得られたｍ ＧｌｕＲ５ａ作成体と同じである。配列番号９は、ベクターｍＧｌｕＲ５ａ１か ら調製した全長ｍＧｌｕＲ５ｂ ｃＤＮΛの完全なヌクレオチド配列である。 全長ｍＧｌｕＲ５ｃ作成体を調製するために、ｍＧｌｕＲ５ａ作成体（ｍＧｌ ｕＲ１ａ１、ｍＧｌｕＲ５ａ２またはｍＧｌｕＲ５ａ３）をＮｈｅＩ／ ＨｉｎｄIII（ＨｉｎｄIII部位は、ｍＧｌｕＲ５ａベクターのｐＣＭＶ−Ｔ７− ３部分のポリリンカー内に存在する）で消化し、配列番号７のヌクレオチド２７ ２５−４０８５を含有する断片を放出させる。次に残りのベクター断片を、ＭＥ ＴＡＢ２から単離したＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片に結合させる。得られる全長 ｃＤＮＡ（ｍＧｌｕＲ５ｃ）（配列番号１１）は、コーディング配列の最初の２ ６３０ヌクレオチドについては、これが調製されたｍＧｌｕＲ５ａ作成体と同じ であるが、コーディング配列のヌクレオチド２６３１で、ｍＧｌｕＲ５ｃとｍＧ ｌｕＲ５ａのコーディング配列は分岐（例えば、配列番号７のヌクレオチド３０ ００で始まる）し、ｍＧｌｕＲ５ｃコーディング配列はコーディング配列のヌク レオチド２６３１としてグアニンヌクレオチドを有し、その後に翻訳停止コドン （配列番号１１のヌクレオチド３００１−３００３）が続く。Ｂ．ｍＧｌｕＲ１受容体ｃＤＮＡ ｃＤＮＡライブラリースクリーニング 中挿入体小脳ライブラリーを、ラットのｍＧｌｕＲ１受容体（ヌクレオチド１ から３０３１および５’非翻訳配列：マス（Masu）ら、（１９９１）Nature３４ ９：７６０−７６５）をコードするＤＮＡの断片へのハイブリダイゼーションに ついてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ 、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５０％ホルムアルミド、０．２％ＳＤＳ および２００μg/mlの変性した超音波処理したニシン精子ＤＮＡ中で行ない、洗 浄は５５℃で１ＸＳＳＰＥと０．２％ＳＤＳ中で行なった。３つのハイブリダイ ズするクローン（ＭＥＴＡＢ７−ＭＥＴＡＢ９）が同定された。 次のスクリーニングで、ヒト中挿入体小脳ｃＤＮＡライブラリーの１×１０⁶ 組換え体の各平板を、追加のヒトｍＧｌｕＲ１クローンとプローブ結合させた。 この平板をまず、ラットのｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド１−１２５６ （および５’非翻訳配列）を含有するＤＮＡ断片（すなわち、５’プローブ）と ハイブリダイゼーションさせ、次にクローンＭＥＴＡＢ７−ＭＥＴＡＢ９を同定 したこの前のスクリーニングで使用したものと同じハイブリダイゼーション条件 と洗浄条件を用いて、ラットｍＧｌｕＲ１ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド２０７５ −３３１０を含有するＤＮＡ断片（すなわち、３’プローブ）に連続してハイブ リダイズさせた。５’プローブへのハイブリダイゼーションにより３つのクロー ン（ＭＥＴＡＢ１８、ＭＥＴＡＢ２１およびＭＥＴＡＢ２２）が同定され、そし て３’プローブへのハイブリダイゼーションにより４つのクローン（ＭＥＴＡＢ １４、ＭＥＴＡＢ２０、ＭＥＴＡＢ３２およびＭＥＴＡＢ３５）が同定された。 このラットのｍＧｌｕＲ１断片をプローブとして使用して、さらなるｍＧｌｕ Ｒ１クローンのために大挿入体ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング した。ハイブリダイゼーションと洗浄条件は、中挿入体小脳ライブラリーから６ つのｍＧｌｕＲ１クローンを単離した時に使用したものと同じである（例えば、 ハイブリダイゼーション溶液では２０％ホルムアルデヒドを使用した）。３つの プラーク（ＭＥＴＡＢ５８、ＭＥＴＡＢ５９およびＭＥＴＡＢ６０）がプローブ にハイブリダイズした。単離されたクローンの性状解析 精製したプラークの挿入体を制限酵素マッピングとＤＮＡ配列解析により性状 解析した。ＭＥＴＡＢ５８は、約２．８kbであり、５’非翻訳配列、翻訳開始コ ドンおよび約２．３kbのコーディング配列を含有する。ＭＥＴＡＢ５８の３’末 端は、ＭＥＴＡＢ１４の５’末端と重複する。ＭＥＴＡＢ１４は３’方向へ約７ ００塩基対延長し、翻訳停止コドンを含有する。すなわち、ＭＥＴＡＢ５８とＭ ＥＴＡＢ１４は重複して、全長ｍＧｌｕＲ１受容体をコードする（配列番号１を 参照）。他のクローンも、翻訳開始コドンと翻訳停止コドンの間に位置するｍＧ ｌｕＲ１コーディング配列の部分からのヌクレオチド配列を含有する、部分ｍＧ ｌｕＲ１ ｃＤＮＡである。 ヒトｍＧｌｕＲ１転写体の３’末端をコードする追加のクローンがヒトｃＤＮ Ａライブラリー中に存在するか否かを測定するために、海馬／脳幹神経節および 小脳ライブラリーからのｃＤＮＡの核酸増幅を行なった。５’プライマーは配列 番号１のヌクレオチド２２１８から２２４０よりなり、３’プライマーは、ラッ トのｍＧｌｕＲ１ａコーディング配列のアミノ酸８９０−８９７に基づく縮重オ リゴヌクレオチドであった（ピン（Pin）ら、（１９９２）Neurobiology ８９： １０３３１−１０３３５を参照）。増幅生成物をゲル電気泳動で解析した。海馬 ／脳幹神経節中にのみ１つの生成物（すなわち、５００塩基対断片）が検出 された。 ｍＧｌｕＲ１転写体の３’末端を示す追加のクローンを得るために、海馬およ び小脳ｃＤＮＡライブラリーを、前述のヒトｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡを得るのに 使用した条件と同様の条件を使用してラットのｍＧｌｕＲ１ａ ｃＤＮＡの３’ 末端からの断片（例えば、ラットのｍＧｌｕＲ１ａ ｃＤＮＡの約２kbのＮｃｏ Ｉ／ＣｌａＩ断片）でスクリーニングすることができる。このプローブは、択一 的にスプライスされるようではないｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡの３’部分に対応す る。次にハイブリダイズするクローンを制限酵素マッピングとＤＮＡ配列決定に より解析して、異なる３’末端が示されるか否かを決定する。全長ｍＧｌｕＲ１ ｃＤＮＡ作成体の調製 ヒトｍＧｌｕＲ１受容体のＢ型をコードする全長作成体を調製するために、ク ローンＭＥＴＡＢ５８とＭＥＴＡＢ１４の一部を結合させた。ＭＥＴＡＢ５８を ＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩで消化し、配列番号１のヌクレオチド１５４−２６１２を 含有する２４５９塩基対の断片を単離する。ＭＥＴＡＢ１４の７０４塩基対断片 （配列番号１のヌクレオチド２６１３−３３２１を含有する）を、ＭＥＴＡＢ１ ４のＡｃｃＩ／ＸｈｏＩ消化により単離する。次にこの断片をＭＥＴＡＢ５８の ２４５９塩基対に結合させて、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ消化ベクターｐＣＭＶ−Ｔ ７−３に結合させる。ヒトｍＧｌｕＲ１Ｂをコードする得られた作成体は、５’ 非翻訳配列の２３４ヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド１５４−３８７） 、全ｍＧｌｕＲ１Ｂコーディング配列（配列番号１のヌクレオチド３８８−３１ ０８）、および３’非翻訳配列の２１３ヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチ ド３１０９−３３２１）を含有する。ｍＧｌｕＲ１Ｂをコードする配列は、哺乳 動物細胞中での発現のためのｐＣＭＶ−Ｔ７−３中の制御成分に機能的に結合し ている。 種々のヒト組織中で実際に発現されるｍＧｌｕＲ５およびｍＧｌｕＲ１受容体 を決定するために、種々の方法が使用できる。例えば、本明細書に記載のｍＧｌ ｕＲ転写体の挿入／欠失（すなわち、分岐の領域）の５’と３’に位置するヌク レオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、種々の組織から単離され たＲＮＡおよび／または種々の組織から調製されたｃＤＮＡライブラリー の核酸増幅をプライムすることができる。増幅生成物の有無および生成物のサイ ズは、組織中で発現される変種を示す。生成物はまた、ＤＮＡ配列解析により詳 細に性状解析される。 ＲＮａｓｅ保護測定法を用いて、種々の組織中で発現される変種転写体を決定 することもできる。これらの測定法は、総細胞性ＲＮＡの複雑な混合物中のＲＮ Ａ種を検出し定量するための感度の良い方法である。ｍＧｌｕＲＤＮＡの一部を 標識し、細胞性ＲＮＡとハイブリダイズさせる。細胞性ＲＮＡ中に相補的なｍＲ ＮＡが存在する場合は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成する。次にこのＲＮ Ａ試料をＲＮａｓｅで処理して、１本鎖ＲＮＡを分解させる。ＲＮＡ−ＤＮＡは ＲＮａｓｅ分解から保護され、ゲル電気泳動やオートラジオグラフィーにより目 視できるようにされる。 例えばヒトｍＧｌｕＲ ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションによるヒトメタ ボトロピック受容体をコードする配列を含有するゲノムクローンの単離と、引き 続くクローンの性状解析は、ｍＧｌｕＲ一次転写体の可能なスプライス変種に関 してさらなる情報を与える。Ｃ．ｍＧｌｕＲ３受容体ｃＤＮＡ ｃＤＮＡライブラリースクリーニング ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡ合成を プライムさせ、次にλｇｔ１０ベクターへの結合について１．０−２．８kbのｃ ＤＮＡを選択することにより作成された）を、ラットｍＧｌｕＲ２ ｃＤＮＡの ５００塩基対のＳｍａＩ／ＸｂａＩ断片とラットｍＧｌｕＲ３ ｃＤＮＡの３kb のＡｃｃＩ／ＢａｍＨＩ断片へのハイブリダイゼーションについて選択した［タ ナベ（Tanabe）ら、（１９９２）Neuron ８：１６９−１７９］。ハイブリダイ ゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、５ ０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳおよび２００μg/mlの変性した超音波処理し たニシン精子ＤＮＡ中で行ない、洗浄は６５℃で０．５×ＳＳＰＥと０．２％Ｓ ＤＳ中で行なった。３つのハイブリダイズするクローン（ＭＥＴＡＢ４０、ＭＥ ＴＡＢ４１、およびＭＥＴＡＢ４５）が同定された。 次にＭＥＴＡＢ４５の５’末端の一部（すなわち、最初の２４４塩基対；配列 番号５のヌクレオチド２６３４−２８７７）を用いて、増幅した小脳ライブラリ ー（ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡ合成をプライムし、次にλｇｔ１０ベ クターへの結合について＞２．８kbのｃＤＮＡを選択することにより作成される ）、そして増幅した海馬ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライマーを用いてｃ ＤＮＡ合成をプライムし、次にλｇｔ１０ベクターへの結合について＞２．０kb のｃＤＮＡを選択することにより作成される）を追加のｍＧｌｕＲ３についてス クリーニングした。各ライブラリーから１００万のクローンがスクリーニングさ れた。ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件は、海馬ライブラリーからのＭＥ ＴＡＢ４０、ＭＥＴＡＢ４１およびＭＥＴＡＢ４５を単離するのに使用したもの と同じである。３つのハイブリダイズするクローンが各ライブラリーで同定され た（小脳ライブラリーではＭＥＴＡＢ４６、ＭＥＴＡＢ４９およびＭＥＴＡＢ５ ０、そして海馬ライブラリーではＭＥＴＡＢ４７、ＭＥＴＡＢ４８およびＭＥＴ ＡＢ５１Ｂ）。単離したクローンの性状解析 精製したプラークの挿入体を、制限酵素マッピングとＤＮＡ配列解析により性 状解析した。単離したクローンのおのおのは、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体の一部を コードするクローンメタボトロピック４０（例えば実施例１．Ｄ．を参照）を除 いて、ヒトｍＧｌｕＲ３受容体の一部である。クローンＭＥＴＡＢ４１、ＭＥＴ ＡＢ４５、ＭＥＴＡＢ４７−４９は、ｍＧｌｕＲ３コーディング配列の３’から の配列および翻訳停止コドンを含有する。クローンＭＥＴＡＢ４６、ＭＥＴＡＢ ５０およびＭＥＴＡＢ５１Ｂは、ｍＧｌｕＲ３ ｃＤＮＡの５’末端からの配列 （翻訳開始コドンと種々の量の５’非翻訳配列を含む）を含有する。全長ｍＧｌｕＲ３ ｃＤＮＡ作成体の調製 ＭＥＴＡＢ４８とＭＥＴＡＢ４６またはＭＥＴＡＢ５１Ｂの一部を結合させて 、全長ヒトｍＧｌｕＲ３コーディング配列を含有する４つの作成体を調製した。 この全長コーディング配列は配列番号５（ヌクレオチド１０６４−３７０３）に 与えられる。クローンＭＥＴＡＢ４６とＭＥＴＡＢ５１Ｂの挿入体は、ＥｃｏＲ Ｉ断片としてｐＣＭＶ−Ｔ７−３中に別々にサブクローニングされた。クローン ＭＥＴＡＢ４８の挿入体は、ＥｃｏＲＩ断片としてｐＣＭＶ−Ｔ７−２にサブク ローニングされた。 作成体ｍＧｌｕＲ３Ｂを作成するために、ＭＥＴＡＢ５１Ｂ挿入体を含有する ｐＣＭＶ−Ｔ７−３プラスミドをＳｃａＩ／Ｂｇｌ IIで消化し、アンピシリン 耐性遺伝子の５’半分とＭＥＴＡＢ５１Ｂ挿入体の５’部分（配列番号５のヌク レオチド７４８−１６７１）を含有する２．６kbの断片を単離した。この断片を 、ＭＥＴＡＢ４８の挿入体を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−２プラスミドのＳｃａＩ／ Ｂｇｌ II消化物から単離した４．３kbの断片［この４．３kbの断片はアンピシ リン耐性遺伝子の３’半分とＭＥＴＡＢ４８の３’部分を有する（配列番号５の ヌクレオチド１６７２−３９１９）］に結合させた。得られた作成体（ｍＧｌｕ Ｒ３Ｂ）は、３１６ヌクレオチドの５’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド ７４８−１０６３）、全ｍＧｌｕＲ３コーディング配列（配列番号５のヌクレオ チド１０６４−３７０３）、および２１６ヌクレオチドの３’非翻訳配列（配列 番号５のヌクレオチド３７０４−３９１９）を含有する。ｍＧｌｕＲ３Ｂをコー ドする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためにベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−３と ｐＣＭＶ−Ｔ７−２からの制御成分に機能的に結合している。 作成体ｍＧｌｕＲ３Ｃを作成するために、ＭＥＴＡＢ４６の挿入体を有するｐ ＣＭＶ−Ｔ７−３プラスミドを、ＳｃａＩ／Ｂｇｌ IIで消化し、アンピシリン 耐性遺伝子の５’半分とＭＥＴＡＢ４６の５’部分を含有する３．４kbの断片（ 配列番号５のヌクレオチド１−１６７１）を単離した。この断片を、ＭＥＴＡＢ ４８の作成体ｍＧｌｕＲ３Ｂで使用したものと同じＳｃａＩ／Ｂｇｌ II断片に 結合させた。得られた作成体（ｍＧｌｕＲ３Ｃ）は、５’非翻訳配列の１０６３ ヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド１−１０６３）、全ｍＧｌｕＲ３コー ディング配列（配列番号５のヌクレオチド１０６４−３７０３）、および３’非 翻訳配列の２１６ヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド３７０４−３９１９ ）を含有する。このｍＧｌｕＲ３Ｃをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発 現のためにベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−２とｐＣＭＶ−Ｔ７−３からの制御成分に 機能的に結合している。 作成体ｍＧｌｕＲ３Ａは、ｍＧｌｕＲ３ＣをＥｃｏＲＶとＮｏｔＩで消化して 、配列番号５のヌクレオチド１−１０３５を含有する断片を除去して、ＮｏｔＩ 部 位を平滑末端として、次に大きい方のベクター断片を再結合させることにより作 成した。作成体ｍＧｌｕＲ３Ａは、２８ヌクレオチドの５’非翻訳配列（配列番 号５のヌクレオチド１０３６−１０６３）、全ｍＧｌｕＲ３コーディング配列（ 配列番号５のヌクレオチド１０６４−３７０３）、および２１６ヌクレオチドの ３’非翻訳配列（配列番号５のヌクレオチド３７０４−３９１９）を含有する。 このｍＧｌｕＲ３Ａをコードする配列は、哺乳動物細胞中での発現のためにベク ターｐＣＭＶ−Ｔ７−３とｐＣＭＶ−Ｔ７−２からの制御成分に機能的に結合し ている。 作成体ｐＳＶ−ｈｍＧｌｕＲ３Ｃ（ｍＧｌｕＲ３のＳＶ４０プロモーター制御 発現に使用するため）を作成するために、ＭＥＴＡＢ４６の挿入体を有するｐＣ ＭＶ−Ｔ７−３プラスミドをＳｃａＩ／ＮｏｔＩで消化し、アンピシリン耐性遺 伝子の３’部分と全ＭＥＴＡＢ４６挿入体を含有する断片を単離した。プラスミ ドｐＳＶβをＳｃａＩ／ＮｏｔＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子５’部分と ＳＶ４０早期プロモーターおよびスプライス部位を含有する断片を、ＭＥＴＡＢ ４６を有するｐＣＭＶ−Ｔ７−３ベクターからのＳｃａＩ／ＮｏｔＩ断片に結合 させて、ｐＳＶ−ＭＥＴＡＢ４６を作成した。プラスミドｐＳＶ−ＭＥＴＡＢ４ ６をSｃａＩ／Ｂｇｌ IIで消化し、アンピシリン耐性遺伝子の５’部分、ＳＶ４ ０早期プロモーターおよびスプライス部位そしてＭＥＴＡＢ４６の５’部分（配 列番号５のヌクレオチド１−１６７１）を含有する断片を単離した。この断片を 、作成体ｍＧｌｕＲ３ＢやｍＧｌｕＲ３Ｃで使用したものと同じＭＥＴＡＢ４８ のＳｃａＩ／Ｂｇｌ II断片に結合させた。得られた作成体（ｐＳＶ−ｈｍＧｌ ｕＲ３Ｃ）は、ＳＶ４０プロモーターを含有し、ｍＧｌｕＲ３ ＤＮＡ（配列番 号５のヌクレオチド１−３９１９を含有する）と機能的に結合したＳＶ４０スプ ライス部位が続き、この後にポリアデニル化シグナルが続く。Ｄ．ｍＧｌｕＲ２受容体ｃＤＮＡ 実施例１．Ｃ．に記載したようにヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからクローン ＭＥＴＡＢ４０を単離した。このＭＥＴＡＢ４０の挿入体ｃＤＮＡは長さが１１ ００塩基対であり、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体の３’末端（翻訳停止コドンと３’ 末端非翻訳配列を含む）をコードする。ＭＥＴＡＢ４０の最初の３５５ヌクレオ チドは配列番号３に提供され、ＭＥＴＡＢ４０の最後の３４３ヌクレオチド（す べて３’非翻訳配列からである）は配列番号１３に提供される。 ｍＧｌｕＲ２転写体の５’部分を示すＤＮＡを含有するクローンを単離するた めに、ＭＥＴＡＢ４０の５’末端に対応するオリゴヌクレオチドへのハイブリダ イゼーションについて、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ とができる。ハイブリダイズするクローンを精製し、ＤＮＡ配列解析により性状 解析する。ＭＥＴＡＢ４０に重複し翻訳開始コドンを含有するクローンを、適当 な制限部位でＭＥＴＡＢ４０に結合させて、全長ｍＧｌｕＲ２をコードするｃＤ ＮＡ作成体を作成することができる。 実施例２ 卵母細胞中の組換えヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体の発現 ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡを含有する作成体から調製し たインビトロ転写体を、ツノガエル（Xenopus）卵母細胞に注入した。２電極の 電位固定法（例えば、スツマー（Stuhmer）（1992）Meth．Enzymol．２０７：３ １９−３３９を参照）を用いて、卵母細胞トランスメンブレン電流の電気生理的 測定を行なった。Ａ．インビトロ転写体の調製 作成体ｍＧｌｕＲ５ａ３中に含有されるメタボトロピック受容体ｃＤＮＡのキ ャップされた組換え転写体を、メガスクリプト（Megascript）キット（カタログ 番号＃１３３４、アンビオン社（Ambion Inc.）、オースチン、テキサス州）を 用いて、線状化したプラスミドから合成した。各合成転写体の質量を紫外吸光度 法により測定し、各転写体の完全性をアガロースゲルの電気泳動により測定した 。Ｂ．電気生理学 卵母細胞１つにつき、１０−５０ngのメタボトロピック受容体転写体を、ツノ ガエル（Xenopus）卵母細胞に注入した。卵母細胞の調製と注入は、ダスカル（D ascal）の方法［（１９８７）Crit．Rev．Biochem．２２：３１７−３８７］に 従って行なった。ｍＲＮＡ注入の２から６日後、２電極電位固定法を用いて卵母 細胞を試験した。細胞はリンゲル溶液（１１５mM ＮａＣｌ、２．５mM ＫＣｌ 、１．８mM ＣａＣｌ₂、１０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．３）浴に浸漬し、膜電位 は −８０から−１００mVに固定した。薬剤含有溶液の６０μlずつをピペットで直 接浴に入れた。アクソテープ（AXOTAPE）バージョン１．２ソフトウェア（アク ソン・インスツルメンツ（Axon Instruments）、フォスターシティ、カリホルニ ア州）を用いてＰＣ−３８６中のラボマスター（Labmaster）データ採取ボード を用いて２−５Hzでデータをサンプリングした。データをレーザープリンターに 取り出すか、またはシグマプロット（Sigmaplot）バージョン５．０を用いてプ ロットした。 メタボトロピック受容体調節化合物（すなわち、０．００１−０．１μMキス カル酸、０．１−１０μMグルタミン酸および０．１−３００μM １Ｓ，３Ｒ− ＡＣＰＤ（１−アミノ−シクロペンチル−１，３−ジカルボン酸）を浴に適用し 、トランスメンブレン電流を記録した。化合物の適用後相当の電流が検出された 。種々の量の各化合物を適用後の電流を比較する用量応答試験で、電流の大きさ は各化合物の濃度の上昇に伴い増加することが明らかになった。これらのデータ を解析した結果、各化合物のＥＣ₅₀を計算することができ、これを化合物の相対 電位の測定に使用した。実施例３ 哺乳動物細胞におけるヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブユニットの 組換え発現 ヒト胎児性腎（ＨＥＫ）細胞とチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ すなわち、ＤＧ４４細胞；ウーラウプ（Urlaub）ら（１９８６）Som．Cell．Mol ec．Genet．１２：５５５を参照）を、ヒトメタボトロピック受容体をコードす るＤＮＡでトランスフェクションさせた。種々の方法（例えば、イノシオトール リン酸（ＩＰ₁）測定法、Ｃａ⁺⁺−感受性蛍光指示薬ベースの測定法、および［³ Ｈ］−グルタミン酸結合測定法）を用いて、メタボトロピック受容体の発現につ いて解析した。Ａ．ＨＥＫ２９３細胞の一時的トランスフェクション ＨＥＫ２９３細胞を、ｍＧｌｕＲ５ａ（作成体ｍＧｌｕＲ５ａ２とｍＧｌｕＲ ５ａ３および作成体ＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａ）受容体をコードするＤＮＡで 一時的トランスフェクションを行なった。約２×１０⁶のＨＥＫ２９３細胞を標 準的ＣａＰＯ₄トランスフェクション法［ウィグラー（Wigler）ら、（１９７９ ）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A ７６：１３７３−１３７６を参照］に従い、 目的のプラスミドの５−１８μg（あるトランスフェクション体においては０． １８μg、実施例３．Ｃ．２．を参照）で一時的にトランスフェクションした。 さらにＣＭＶプロモーターに融合した大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有 する、プラスミドｐＣＭＶβｇａｌ（クロンテック・ラボラトリーズ（Clontech Laboratories）、パロアルト（PaloAlto）、カリホルニア州）０．５−２μgを 、レポーター遺伝子として同時トランスフェクションして、トランスフェクショ ンの効率を追跡した。β−ガラクトシダーゼとＸ−ｇａｌ基質を含む反応の生成 物の直接染色により、β−ガラクトシダーゼ発現についてトランスフェクション 体を解析した［ジョーンズ（Jones）（１９８６）EMBO ５：３１３３−３１４ ２］。トランスフェクション体はまた、β−ガラクトシダーゼ活性の測定による β−ガラクトシダーゼ発現について解析することもできる［ミラー（Miller）（ １９７２）分子遺伝子学実験（Experiments in Molecular Genetics）のPP．３ ５２−３５５，コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）］。 ５μgのＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５Ａで一時的トランスフェクションを行なっ たＨＥＫ２９３細胞は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターに機 能的に結合した糖質コルチコイド受容体をコードするＤＮＡを含有するｐＲＳｈ ＧＲ（ＡＴＣＣ整理番号６７２００）５μgと同時トランスフェクションをした 。これらの細胞における糖質コルチコイド受容体の同時トランスフェクションは 、細胞への糖質コルチコイド（例えば、デキサメタゾン）の添加によるＭＭＴＶ プロモーター−ｍＧｌｕＲ５ａＤＮＡの発現の誘導を確実にする。 ＨＥＫ細胞のこれらのトランスフェクションの効率は、標準的効率に典型的な ものであった（すなわち、約５０％）。Ｂ．哺乳動物細胞の安定なトランスフェクション ＨＥＫ２９３細胞、Ｌｔｋ 細胞およびＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞は、 リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて安定にトランスフェクション することができる［Current Protocols in Molecular Biology，Vol.１，ワイリ ー・インターサイエンス（Wiley Inter-Science）、増刊１４号、単元９．１． １．−９．１．９（１９９０）］。ＣＨＯ細胞を宿主として使用するときは、ヒ トメタボトロピック受容体をコードするｃＤＮＡの発現を制御するにはＳＶ４０ プロモーターの使用が一般に好ましい。それぞれ１−２×１０⁶細胞を含有する １０cmのプレートを、メタボトロピック受容体をコードするＤＮＡ約５−１０μ gと選択マーカー（例えば、ネオマイシン−耐性遺伝子（すなわち、ＨＥＫ２９ ３形質転換体の選択にはネオマイシン耐性遺伝子（すなわち、ｐＳＶ２ｎｅｏ） 、Ｌｔｋ^-細胞トランスフェクション体にはチミジンキナーゼ遺伝子、またはＤ Ｇ４４細胞形質転換体の選択にはジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子）） をコードするＤＮＡ ０．５−１μgを含有するＤＮＡ／リン酸カルシウム沈殿 物でトランスフェクションする。適当な培地中で約１４日間の増殖の後、コロニ ーが形成され、クローニングシリンダーを用いて個々に単離される。次に単離物 を限界希釈を行いスクリーニング化て、例えば後述の方法を用いてメタボトロピ ック受容体を発現するものを同定する。Ｃ．トランスフェクション体の解析 １．蛍光指示薬に基づく測定 アゴニストによるＧ蛋白結合メタボトロピック受容体の活性化により、ホスフ ァチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解／細胞内Ｃａ⁺⁺シグナル化経路および／ または阻害性ｃＡＭＰカスケードが刺激される。細胞内カルシウム濃度の一時的 上昇の検出法は、ＰＩ加水分解/Ｃａ⁺⁺動員（mobilization）経路またはＰＩ加 水分解／Ｃａ⁺⁺動員（mobilization）経路と阻害性ｃＡＭＰカスケードの両方に カップリングしたメタボトロピック受容体の機能性発現の解析に適用できる。細 胞内カルシウムレベルを測定する１つの方法は、カルシウム感受性蛍光指示薬を 用いる。 フルオ−３（fluo−３）やフラ−２（fura−２）（モレキュラー・プローブズ 社（Molecular Probes Inc.）、ユージーン（Eugene）、オレゴン州）のような カルシウム感受性指示薬は、膜透過性であるアセトキシメチルエステルとして入 手できる。アセトキシメチルエステル型の指示薬が細胞内に入ると、サイトゾル 性エステラーゼによりエステル基は除去され、このため遊離の指示薬はサイトゾ ル 内に捕捉される。遊離の指示薬とカルシウムが相互作用すると、指示薬の蛍光強 度が増加する。従って、指示薬を含有する細胞の細胞内Ｃａ⁺⁺濃度の上昇は直接 蛍光の増強（または、フラ−２を使用する時は、２つの波長での蛍光の比率の増 強）として発現される。メタボトロピック受容体を測定するための自動蛍光検出 装置が、本出願人の係属中の米国特許出願第０７／８１２，２５４号およびその 対応するＰＣＴ特許出願ＵＳ９２／１１０９０号（参考のためその全体が本明細 書中に引用される）に記載されている。さらに細胞内Ｃａ⁺⁺振動を目視できるよ うにするために蛍光イメージング法を使用することができる。 ヒトｍＧｌｕＲ５ａ受容体をコードするＤＮＡで一時的トランスフェクション を行なったＨＥＫ細胞を、自動蛍光指示薬ベースの測定法と蛍光イメージング測 定法を用いて、機能性組換えメタボトロピック受容体の発現について解析した。 同様に、メタボトロピック受容体ＤＮＡで安定にトランスフェクションした細胞 も、これらの測定法系を用いて機能性メタボトロピック受容体について解析した 。ａ．自動蛍光測定法 ２×１０⁵細胞／ウェルの濃度でポリ−Ｌ−リジンでプレコーティングし、２ ０μMフルオ−３、０．２％プルロニック（Pluronic）Ｆ−１２７をＨＢＳ（１ ２５mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ．１．８mM ＣａＣｌ₂、０．６２mM ＭｇＣ ｌ₂、２０mMグルコース、２０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．４）中に含有する培地中 で、２０℃で２時間インキュベートしてフルオ−３を充填した９６ウェルマイク ロタイタープレート（ヌンク（Nunc）、カタログ番号１−６７０８、アラメダ・ インダストリーズ（Alameda Industries）、エスコンジド（Escondido）、カリ ホルニア州）に、トランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞（またはｐ ＣＭＶ−Ｔ７−３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞）およ びｍＧｌｕＲ５ａをコードするＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３ 細胞を広げた。次に細胞を測定緩衝液（すなわち、ＨＢＳ）で洗浄した。次にマ イクロタイタープレートを蛍光プレートリーダー（例えば、フルオロスカン（Fl uoroskan）II、ラボ・プロダクツ・インターナショナル社（Lab Products Inter national，Ltd.）、ラレー（Raleigh）、ノースカロライナ州）に入れ、各ウェ ルの基礎蛍光を測定し記録してから、ウェルにキスカル酸、グルタミン酸、ト ランス−ＡＣＰＤ（１−アミノ−シクロペンタン−１，３−ジカルボン酸）、１ Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤ、ＡＰ３（２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸）、ＡＰ ５（２−アミノ−５−ホスホノペンタノン酸）、およびＣＮＱＸ（６−シアノ− ７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン）を添加した。アゴニストの添加後ウ ェルの蛍光を繰り返し（０．６３秒間隔で７５回読む）追跡する。 一般に、トランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞の蛍光は、これら の化合物のどれを添加しても変化しなかった。ｍＧｌｕＲ５ａ３またはＭＭＴＶ −ｈｍＧｌｕＲ５ａ作成体のいずれかで一時的にトランスフェクションしたＨＥ Ｋ２９３細胞の蛍光は、グルタミン酸、キスカル酸、トランス−ＡＣＰＤ、また は１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤの添加に応答して上昇した。蛍光はピーク値まで増加し 、次に時間とともに化合物の添加前の細胞の基礎レベルまで低下した。ｍＧｌｕ Ｒ５ａ２でトランスフェクションした細胞について、グルタミン酸、キスカル酸 またはトランス−ＡＣＰＤ剌激蛍光の増強に対するＡＰ３、ＡＰ５またはＣＮＱ Ｘの影響を調べた。これらの化合物（ＡＰ３、ＡＰ５、またはＣＮＱＸ）のいず れも、これらの細胞中のアゴニスト誘導蛍光増強を阻害しなかった。 種々の量のグルタミン酸、キスカル酸または１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤを添加後に 測定したピーク蛍光値を比較する用量応答試験で、ピーク蛍光の大きさは各化合 物の濃度の上昇に伴い増加することが明らかになった。これらのデータを解析し た結果、各化合物のＥＣ₅₀を計算することができ、これを化合物の相対電位の測 定に使用した。 ＭＭＴＶ−ｈｍＧｌｕＲ５ａおよびｐＲＳｈｇＧＲ（糖質コルチコイド受容体 作成体）で一時的に同時トランスフエクションしたＨＥＫ２９３細胞も、この蛍 光測定法で解析した。これらの細胞の蛍光は１００μMのキスカル酸に応答して 増加し、測定前に細胞をデキサメタゾン（約１Ｍ）で３７℃で１６時間プレイン キュベートするとピーク応答は大きかった。ｂ．蛍光イメージング測定法 細胞内Ｃａ⁺⁺濃度のメタボトロピック受容体介在変化を目視できるようにする ために、ｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細 胞とトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３細胞（対照）を、デジタルビ デオイメージングで解析した。暗所中で室温で２５分間細胞を１μMのフラ−２ （アセトキシメチルエステル）に暴露することにより、トランスフェクション体 （ガラス挿入底を有する３５mm培養皿あたり４×１０⁵細胞）をフラ−２で充填 した。次に細胞をＤＭＥＭで３回そしてリンゲル溶液（１６０mM ＮａＣｌ、５ mM ＫＣｌ、２mM ＣａＣｌ₂、１mM ＭｇＣｌ₂、１１mMグルコース、５mM Ｈ ＥＰＥＳ、pH７．３）で４回洗浄した。 次にトランスフェクション体と非トランスフェクション細胞を、紫外光源とし て１５０Ｗのキセノンランプを有するアキシオベルト（Axiovert）１００ＴＶ倒 立顕微鏡（ツァイス（Zeiss）、オーベルコフレン（Oberkochren）、ドイツ）の ステージの上に広げた。４０×１．３Ｎ．Ａ．油浸対物レンズを介して細胞を３ ４０nmと３８０nmで交互励起するのに、イメージ１フルオル（Fluor）システム （ユニバーサル・イメージング（Univeersal Imaging）、ウェストチェスター、 ペンシルバニア州）を使用した。５１０nmより長い波長で出る光を、ＣＣＤ７２ 強化ＣＣＤカメラ（エム・ティー・アイ ダーゲ（ＭＴＩ Dage）、ミシガン・ シティ、インディアナ州）により集め、デジタル化した。３４０nmと３８０nmの 励起イメージからバックグランドの蛍光を差し引いた。補正値を使用して３４０ ／３８０強度比を計算した。較正していないフラ−２比は、細胞内Ｃａ⁺⁺濃度の 変化の信頼できる指標である。 較正していないフラ−２比を用いて、休止細胞内Ｃａ⁺⁺濃度（約１００nM）を 紫色で、高細胞内Ｃａ⁺⁺濃度（約１μM）を赤色で疑色イメージを作成した。実 験の各比率のイメージについて、定量解析のために、各細胞の１２×１２ピクセ ル領域内の平均比をソフトウェアにより計算し、さらに解析しグラフを描くため に表に取り込んだ。 ＨＥＫ２９３細胞は、ＰＩ加水分解／Ｃａ⁺⁺動員経路の受容体介在活性化に必 要な細胞内成分を発現することを証明するために、トランスフェクション体と非 トランスフェクション細胞（内因性Ｇ蛋白結合ムスカリン性アセチルコリン受容 体を発現する）を１mMのカルバミルコリン（ＣＣｈ；ムスカリン性アセチルコリ ン受容体アゴニスト）に暴露し、細胞内Ｃａ⁺⁺濃度の上昇を追跡した。典型的に は、イメージング試験でＣＣｈの添加に応答して、大多数の細胞の細胞内Ｃａ⁺⁺ 濃度の上昇が検出された。 トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞およびトランスフェクションして いないＨＥＫ２９３細胞を、１００μMキスカル酸に応答して細胞内Ｃａ⁺⁺濃度 が上昇するか否かについて追跡した。平均すると、非トランスフェクション細胞 の細胞内Ｃａ⁺⁺濃度は、キスカル酸への暴露後増加しない。これに対して、トラ ンスフェクションした細胞の２６．７±２２．３％のＣａ⁺⁺濃度は１００μMの キスカル酸の添加に応答して増加した。２．ホスファチジルイノシトール加水分解（ＩＰ₁）測定法 Ｇ蛋白結合メタボトロピック受容体のアゴニストによる活性化により、ホスフ ァチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解経路が刺激されるため、ＰＩ加水分解の 生成物（例えば、ＩＰ₃、ＩＰ₂またはＩＰ₁）の増加を検出する方法は、ＰＩ加 水分解／Ｃａ⁺⁺動員経路またはＰＩ加水分解／Ｃａ⁺⁺動員経路と阻害性ｃＡＭＰ カスケードにカップリングしたメタボトロピック受容体の機能性発現の解析に応 用することができる。ＰＩの加水分解により生成されるＩＰ₁および／またはＩ Ｐ₂および／またはＩＰ₃を測定する１つの方法は、細胞膜リン脂質内への［³Ｈ ］−ミオ−イノシトールを取り込み、次に［³Ｈ］−ＩＰ₁、［³Ｈ］−ＩＰ₂およ び［³H］−ＩＰ₃を分離し、以下のように各画分の放射能を定量する。 ｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、 ８×１０⁵細胞／ウェルで２４ウェルのマイクロタイタープレートに広げた。細 胞を数時間沈降させ、プレートの底に付着させた後、２μCiの［³Ｈ］−ミオ− イノシトール（アマーシャム（Amersham）、カタログ番号＃ＰＴ６−２７１、ア ーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州；比活性＝１７．７Ci/mm ol）を各ウェルに添加し３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ニコンダイア フォト（Nikon Diaphot）倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の形態の健常性を 評価し、ウェルがコンフルエント（confluent）な細胞層を含有するか否かを測 定した。次に培地を吸引し、細胞を０．５mlのクレブス重炭酸緩衝液［１１７． ９mM ＮａＣｌ、４．７２mM ＫＣｌ、２．５４mM ＣａＣｌ₂、１．１８mM ＭｇＳＯ₄、１．１９mM ＫＨ₂ＰＯ₄、２５mM ＮａＨＣＯ₃、１１．１mMデキス トロース（９５％ Ｏ₂、５％ ＣＯ₂、pH７．４で平衡化されている）］ で２回洗浄した。細胞を室温で４５分間インキュベートした。次に各ウェルから 緩衝液を吸引し、細胞を洗浄し、０．５ml／ウェルで室温で４５分間インキュベ ートした。次に緩衝液を各ウェルから吸引し、次に１０mM ＮａＣｌの代わりに １０mMのＬｉＣｌを含有する４５０μlのクレブス重炭酸緩衝液（ＩＰ₁のイノシ トールと無機リンへの加水分解を防ぐために）とともに細胞を３７℃で２０分間 インキュベートした。 メタボトロピック受容体調節化合物による細胞の処理を始める前に、５０μl のクレブス重炭酸緩衝液（対照）または化合物の最終濃度の１０×のものを各ウ ェルに添加し、４０分間インキュベートを続けた。各ウェルに１mlの氷冷メタノ ールを加えてインキュベートを停止させた。 細胞からＩＰ₁を単離するために、プラスチックピペットのチップでプレート の細胞を掻き取って、細胞懸濁物を１２×７５mmガラス試験管に移した。試験管 を完全にボルテックス混合し、各反応混合物の１５０μl分（すなわち、総量の １０分の１）を別の試験管に移して蛋白を測定した。１mlのクロロホルムによる 抽出により、放射標識膜リン脂質から水溶性リン酸イノシトールを分離した。試 験管を室温で３０分間インキュベートした後、４℃で５００×ｇで５分間遠心分 離した。［³Ｈ］−リン酸イノシトールを含有する水（上）層を、アクセルＱＭ Ａセパク（Accell ＱＭＡ ＳＥＰ−ＰＡＫ）カラム（ミリポア（Millipore） 、カリホルニア州）に接続した１０mlのシリンジに移した（これは、２０mlのシ ンチレーションバイアルに集められるように変更したアマーシャム・スーパーセ パレーター（Amersham Superseparator）装置に結合してある）。カートリッジ に水（１０ml）を入れて［³Ｈ］−イノシトール前駆体を除き、次に４mlの０． ０２Ｍトリエチルアンモニウム水素炭酸化緩衝液（ＴＥＡＢ、フルカ（Fluka） ；ニューヨーク）を加えた。カートリッジから［³Ｈ］−ＩＰ₁、［³Ｈ］−ＩＰ₂ そして［³H］−ＩＰ₃を別々に除去するために、４mlの０．１Ｍ ＴＥＡＢ、４m lの０．３Ｍ ＴＥＡＢ、そして４mlの０．４Ｍ ＴＥＡＢをカートリッジに連 続的に添加して、画分を溶出させ、大きいシンチレーションバイアルに採取した 。エコルメ・カクテル（Ecolume cocktail）（１５ml；ＩＣＮ；カリホルニア州 ）を各バイアルに加え、次にシンチレーション計測して別々の画分の各ＩＰの量 を測定し た。蛋白濃度は、バイオラッド（Bio−Rad）蛋白マイクロ測定法（バイオラッド （Bio−Rad）、リッチモンド、カリホルニア州）を用いて測定した。 この測定法で測定した時、１８μgのｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフ ェクションしたＨＥＫ２９３細胞は、比較的高い基礎レベルのＩＰ₁を示した。 しかし、０．１８μgのｍＧｌｕＲ５ａ３で一時的にトランスフェクションした ＨＥＫ２９３細胞は、低い基礎ＩＰ₁レベルを示し、１mMのグルタミン酸、１mM のキスカル酸または１mMの１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤで処理した時はＩＰ₁レベルの 検出できる増加を示した。ＩＰ₁レベルのキスカル酸に誘導される増加は、１mM のＡＰ３により影響を受けなかった。 ｍＧｌｕＲ５ａ３でトランスフェクションした細胞に、種々の濃度のグルタミ ン酸、キスカル酸または１Ｓ，３Ｒ−ＡＣＰＤの添加後測定したＩＰ₁レベルを 比較した用量応答試験では、各化合物の濃度の上昇とともにＩＰ₁レベルが増加 することを示していた。これらのデータの解析により、各化合物のＥＣ₅₀を計算 することができ、これを化合物の相対電位の測定に使用した。３．メタボトロピック受容体リガンド結合測定法 ｍＧｌｕＲ５ａ３またはｐＵＣ１９（陰性対照）で一時的にトランスフェクシ ョンしたＨＥＫ細胞を、［³Ｈ］−グルタミン酸結合について解析した。陽性対 照として結合測定法にラット脳の膜を加えた。ａ．膜の調製 ｉ．ラット前脳膜 シェープ（Schoepp）ら［（１９９２）Neurosci．Lett．１４５：１００］が 記載したように、ラット前脳膜を調製した。簡単に説明すると、１０個のラット 脳からの基本的に脳皮質、線条体と海馬よりなる前脳を、２．５mM ＣａＣｌ₂ 、pH７．６を含有する５０部の３０mMの氷冷トリス−塩酸中で、ポリトロン（Po lytron）（ブリンクマン（Brinkman）、ウェストベリー（Westbury）、ニューヨ ーク州））を用いてホモゲナイズした。ホモゲネートを４℃で３０、０００×ｇ で１５分間遠心分離した。上澄液を捨て、ポリトロンを用いてペレットを５０部 の緩衝液に再懸濁し、懸濁物を３０、０００×ｇで１５分間遠心分離した。この 工程を２回繰り返した。ペレットを緩衝液に再懸濁し、３７℃で３０分間イ ンキュベートした。次に懸濁物を４℃で３０、０００×ｇで１５分間遠心分離し た。この工程を３回繰り返した。最終ペレットを１５部の５０mM トリス−塩酸 、pH７．６に再懸濁し、分注し、急速に凍結し、−７０℃で保存した。ii．トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞およびトランスフェクションし ないＨＥＫ２９３細胞の膜 ｍＧｌｕＲ５ａをコードするＤＮＡまたはｐＵＣ１９（陰性対照）でトランス フェクションしたＨＥＫ２９３細胞から膜を調製するために、組織培養プレート から細胞を掻き取り、プレートを５mlのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水：１３ ７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ、１０mM Ｎａ₂ ＨＰＯ₄、１．７mM ＫＨ₂ ＰＯ₄）で洗浄した。卓上型遠心分離機で細胞を低速度で遠心分離し、細胞ペレ ットをＰＢＳで洗浄した。０．５mM ＰＭＳＦ、pH７．６を含有する５０mMトリ ス−塩酸２０部に、細胞ペレットを再懸濁した。ダウンス（Dounce）（テフロン ／ガラス）ホモゲナイザー中で１０−２０ストロークを用いて、細胞を氷の上で ホモゲナイズした。ホモゲネートを４℃で１２０、０００×ｇで３０分間遠心分 離した。最終の膜ペレットを、０．５mM ＰＭＳＦ、pH７．６を含有する５０mM トリス−塩酸再懸濁した。膜調製物を分注し、急速に凍結し、−７０１℃で保存 した。蛋白濃度は、ブラッドフォード（Bradford）［（１９７６）Anal．Bioche m．７２：２４８］の方法で測定した。ｂ．［³H］−グルタミン酸結合測定法 ラット前脳の膜中のメタボトロピック受容体への［³Ｈ］−グルタミン酸の特 異的結合は、基本的にシェープ（Schoepp）ら（前述）が記載したように調製し た。測定の日に凍結ホモゲネートを融解し、５０mMトリス−塩酸、pH７．６で３ 回洗浄した。最終ペレットを５０mMトリス−塩酸、pH７．６に再懸濁した。蛋白 濃度は、ブラッドフォード（Bradford）［（１９７６）Anal．Biochem．７２： ２４８］の方法で測定した。懸濁物を３０、０００×ｇで１５分間遠心分離し、 ペレットを１mg／mlの濃度で測定緩衝液（５０mMトリス−塩酸、０．５mM ＰＭ ＳＦ、０．１％ＢＳＡ、pH７．６）に再懸濁した。膜懸濁物を、総量０．５mlの 測定緩衝液［イオノトロピックグルタミン酸受容体への［³Ｈ］−グルタミン酸 の結合を組織するために、１００μM ＮＭＤＡ（シグマ（Sigma）、セントルイ ス、ミズーリ 州）、１００μM ＡＭＰＡおよび１００μMカイニン酸（リサーチ・バイオケミ カルズ社（Research Biochemiclas Inc）、ナチック（Natick）、マサチューセ ッツ州）を含有し、塩化物依存性摂取部位への［³Ｈ］−グルタミン酸の結合を 阻害するために、１００μM ＳＩＴＳ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズ ーリ州）を含有する］中で、３重測定で１０または１００nMの［³Ｈ］−グルタ ミン酸（ニュー・イングランド・ニュクレア（New England Nuclear）、ボスト ン、マサチューセッツ州；カタログ番号ＮＥＴ−４９０、比活性＝５７．４Ci/m mol）と、氷上で４５分間インキュベートした。ＳＭ−２４ローター（ソーバル （Sorvall）、ウィルミントン（Wilmington）、デラウェア（Delaware））中で ４℃で２０、０００×ｇで５分間遠心分離して、結合した放射能を遊離の放射能 から分離した。ペレットを５−６mlの氷冷５０mMトリス−塩酸、pH７．６で２回 洗浄した。ペレットを５mlのエコルメシンチレーションカクテル（Ecolume scin tillation cocktail）中でボルテックス混合して可溶化させた。ベックマン（Be ckman）シンチレーション計測機で放射能を測定した。総結合量から、１mMのグ ルタミン酸の存在下で得られた非特異的結合量を引いて、特異的結合量を求めた 。 ｍＧｌｕＲ５ａをコードするＤＮＡまたはｐＵＣ１９でトランスフェクション したＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への［³Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合 を、基本的にラット脳の膜への結合の測定で記載したように測定したが、若干の 修飾を行なった。測定の日に凍結ホモゲネートを融解し、ＭＲ−１５０高速冷却 マイクロ遠心分離機（ペニンスラ・ラボラトリーズ社（Peninsula Laboratories Inc．）、ベルモント（Belmont）、カリホルニア州）で遠心分離した。ペレッ トを測定緩衝液（５０mMトリス−塩酸、０．５mM ＰＭＳＦ、０．１％ＢＳＡ、 pH７．６）で２回洗浄し、最終ペレットを１mg／mlの濃度で測定緩衝液に再懸濁 した。ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡおよびカイニン酸を測定混合物から除きながら、ＨＥ Ｋ２９３細胞を［³Ｈ］−グルタミン酸への結合について解析した。 ２００μgの膜と１００nMの［³Ｈ］−グルタミン酸を用いて、ラット脳の膜へ の［³Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合を測定した。総結合量対非特異結合量の 比は約２：１であった。 ｍＧｌｕＲ５ａ３またはｐＵＣ１９でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３ 細胞から調製した膜への［³Ｈ］−グルタミン酸の特異的結合を、２００μgの膜 と１００nMの［³Ｈ］−グルタミン酸を用いて測定した。ｍＧｌｕＲ５ａ３でト ランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への特異的結合量は、 ｐＵＣ１９でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から調製した膜への結 合量より有意に高かった。競合結合試験を行い、種々の濃度の非標識グルタミン 酸の存在下でｍＧｌｕＲ５ａ３でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞か ら調製した膜への［³H］−グルタミン酸の特異的結合の量を測定した。これらの 試験で得られたデータからＩＣ₅₀値を求めた。４．サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）測定 ａ．Ｒ１Ａベースの測定 ある種のＧ蛋白結合受容体の活性化は、ｃＡＭＰの（増加ではなく）低下を引 き起こすため、細胞内ｃＡＭＰレベルの測定法は、哺乳動物宿主細胞中で発現さ れる組換えヒトメタボトロピック受容体を評価するのに使用される。ヒトメタボ トロピック受容体をコードするＤＮＡまたはｐＵＣ１９（陰性対照）で一時的に または安定にトランスフェクションした哺乳動物細胞を、５×１０⁵細胞／ウェ ルの濃度で２４ウェルのマイクロタイタープレートに広げ、一晩インキュベート させる。翌日、ニコンダイアフォト（Nikon Diaphot）倒立顕微鏡下で細胞を観 察し、細胞の形態の健常性を評価し、ウェルはコンフルエントな細胞層を含有す るか否かを測定した。次に培地を吸引し、細胞を、１mMのＩＢＭＸ（３−イソブ チル−１−メチルキサンチン；シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州） と０．１％ＢＳＡを含有するクレブス重炭酸緩衝液０．５ml（ＰＩ加水分解測定 法で使用したものと同じ緩衝液：実施例３．Ｃ．２を参照）で２回洗浄した。あ るいはクレブス重炭酸緩衝液の代わりに１×ＰＢＳを使用することもできる。各 洗浄の後に３７℃で３０分間インキュベートを行う。各ウェルから緩衝液を吸引 し、次に細胞を、１mMのＩＢＭＸと０．１％ＢＳＡを含有する０．２mlのクレブ ス重炭酸緩衝液で３７℃で２０分間インキュベートする。 メタボトロピック受容体調節化合物による細胞の処理を始める前に、５０μl のクレブス重炭酸緩衝液（最終濃度の５×のフォルスコリンの有りまたは無し） を、一部の細胞（基礎対照）に加え、一部の細胞（試験細胞）に最小濃度の５× の化合物および最終濃度の５×のフォルスコリンを加え、３７℃で１５分間イン キュベートする。１５分間のインキュベートの最後に、１％トリトンＸ−１００ 溶液２５μlを加えて反応を停止させ、インキュベートをさらに１０分間続ける 。溶解した細胞および細胞懸濁物を、プラスチックピペットのチップで１２×７ ５mmのポリプロピレン試験管に移す。各ウェルを、１mMのＩＢＭＸと０．１％Ｂ ＳＡを含有するクレブス重炭酸緩衝液７５μlで洗浄する。洗浄物を細胞溶解物 を一緒にする。細胞溶解懸濁物を２３００×ｇで５分間遠心分離し、ＲＩＡキッ ト（アマーシャム・ライフサイエンシーズ（Amersham Life Sciences）カタログ ＃ＴＲＫ４３２；アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）を 用いて、上澄液のｃＡＭＰレベルを測定する。ｂ．サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルに基づく測定法 ５％の規定補足ウシ血清（ハイクローン（Hyclone））を含有するダルベッコ ー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ギブコ（ＧＩＢＣＯ））（１００Ｕ／mlのペニ シリンと１００μg／mlの硫酸ストレプトマイシンを含む）中で、ＨＥＫ２９３ 細胞を単層で増殖させた（１０cmのポリ−Ｄ−リジン被覆プレート当たり約２× １０⁶細胞）。ＣＭＶプロモーターに結合した５μgのｐＣＭＶ−ＯＣＮＡ（嗅覚 性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネル（ダレン（Dhallen）らを参照、 前述）、２μgのｐＣＭＶ−βｇａｌ（クロンテック（Clontech）、パロアルト （Palo Alto）、カリホルニア州）、および対照プラスミドとしての１３μgのｐ ＵＣ１９を用いて、細胞をリン酸カルシウム法（アウスベル（Ausubel）ら、前 述、pp９．１．１−９．１．７）で一時的にトランスフェクションした。ベクタ ーｐＣＭＶ−ＯＣＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳからの約３．０kbのＥｃ ｏＲＩ断片として嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルをコードす るＤＮＡを単離し、得られた断片をＥｃｏＲＩ消化ｐＣＭＶ−Ｔ７−３に結合さ せることにより、作成した。トランスフェクションの６時間後、リン酸カルシウ ム沈殿物を洗い流し、１０％透析胎児牛血清（ハイクローン（Hyclone））、１ ００Ｕ／mlのペニシリン、１００μg／mlのストレプトマイシン、および２mMグ ルタミンが補足されたＤＭＥＭを細胞に与えた。β−ガラクトシダーゼ活性の測 定によるトランスフェクション効率は、５０−７０％であった。 嗅覚性サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルＤＮＡでトランスフェクシ ョンしたＨＥＫ細胞を、２４−４８時間インキュベートしてから、機能を試験し た。まず、細胞質の面に達するｃＡＭＰの濃度が調節できるように（例えば、単 一チャネル記録（Single Channel Recording）、サクマンとネヘル（Sakman and Neher）編、プレヌム・プレス（Plenum Press）、ニューヨーク、（１９８３） ）、トランスフェクションした細胞から引っ張った裏返した膜パッチを用いて、 電気生理学的にチャネルの活性を測定した。パッチの両面を、Ｃａ⁺⁺／Ｍｇ⁺⁺を 含まないリンゲル液に接触させた。１つのパッチでは、１mMのｃＡＭＰの存在下 で膜電位を−１００から＋１００mVへ２秒で勾配をつけて電流を発生させた。こ の結果は、チャネルが機能的に発現されていることを示唆していた。 トランスフェクション体もまた、細胞内カルシウムレベル（［Ｃａ⁺⁺］）の単 細胞ビデオイメージングにより解析した。この方法は、細胞内カルシウムレベル の測定（これはチャネルのサイクリックヌクレオチド活性化により制御される、 チャネルを介するカルシウムの流入量とともに変化する）によるサイクリックヌ クレオチドゲートのチャネルの分析を可能にする。イメジーング測定法は、基本 的に実施例３．Ｃ．１．ｂに記載のように実施したが、若干の修飾を行なった。 色素を充填後、細胞をツァイスアクシオヴェルト（Zeiss Axiovert）顕微鏡と１ ００Ｗの水銀ランプ、デージ（Dage）増強ＣＣＤカメラ、そしてイメージ−１（ Image−１）ハードウェアとイメージ処理のソフトウェアを用いて観察した。こ のソフトウェアは、２０×１．３Ｎ．Ａ．油浸対物レンズを介して細胞を３５０ nmと３８５nmの交互励起を調節した（典型的には５秒毎）。５１０nmより長い波 長で出る光を、ＣＣＤカメラにより集め、デジタル化し、３５０nmと３８５nmの 励起イメージからバックグランドの発光を差し引いた後、３５０／３８５強度比 を計算した。 定量的解析のために、実験の各比率イメージについてソフトウェアにより各細 胞の１２×１２ピクセル領域内の３５０／３８５平均比を計算し、さらに解析し グラフを描くために表に取り込んだ。フラ−２シグナルを未変性の細胞で較正し 、細胞をリンゲル液（１０μMイオノマイシン、１０mM ＥＧＴＡを含有し、お よびＣａ⁺⁺の添加無し）に接触させてＲ_minを得た。次に細胞をリンゲル液（１ ０ μMイオノマイシン、１０mM Ｃａ⁺⁺を含有する）に接触させて３回洗浄してＲ_{m ax} を得た。生きている細胞中のフラ−２のＫ_d ２５０nMとグリンキーウイックツ （Grynkiewicz）ら（J．Biol．Chem．２６０：３４４０（１９８５））を使用し て、静止［Ｃａ⁺⁺］_iは典型的には１００nMであった。 これらの実験で、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる物質にＨＥＫ２９３細胞 トランスフェクション体を暴露し、以後の［Ｃａ⁺⁺］_iの変化を追跡した。１０ ０μMのフォルスコリン（アデニルシクラーゼのアクチベータ）の添加に応答し て、６４個の細胞の平均した結果と各細胞で、［Ｃａ⁺⁺］_iにわずかな増加が見 られた。１mMのＩＢＭＸ（ｃＡＭＰホスホジエステラーゼの阻害剤）の添加後、 さらに有意な増加が見られた。対照実験では、６４個の非トランスフェクション ＨＥＫ２９３細胞中の１つのみが、細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇に対応して、［ Ｃａ⁺⁺］_iの増加を示した。この応答は一時的であり、サイクリックヌクレオチ ドゲートのチャネルＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞中で見 られた持続性応答とは明らかに異なっていた。 これらの結果は、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現するＨＥ Ｋ細胞は、活性化された時細胞内サイクリックヌクレオチドレベルに変化を引き 起こす受容体（例えば、メタボトロピック受容体）の測定において宿主細胞とし て使用できることを証明している。５．ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析 ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションした 細胞はまた、ノーザンブロット解析により対応する転写体の発現について解析す ることができる。ヒトメタボトロピック受容体をコードするＤＮＡでトランスフ ェクションした約１×１０⁷個の細胞から総ＲＮＡを単離し、１０−１５μgのＲ ＮＡをノーザンハイブリダイゼーション解析に使用した。ヒトメタボトロピック 受容体をコードするプラスミドからの挿入体をニックトランスレーションし、プ ローブとして使用した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションの典型的な条 件は以下の通りである： ハイブリダイゼーションは、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ（Denhart' s）溶液、５０％ホルムアルミド中で行ない、洗浄は６５℃で０．２× ＳＳＰＥと０．１％ＳＤＳ中で行なった。 本発明をいくつかの好適な実施態様を参照して詳細に説明したが、ここに記載 され特許請求のされている本発明の精神と範囲を逸脱することなくその修飾や変 更が可能であることが理解されるであろう。 配列の要約 配列番号１は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（ｍ ＧｌｕＲ１Ｂ）をコードするＤＮＡの核酸配列（およびその推定アミノ酸配列） である。 配列番号２は、配列番号１のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。 配列番号３は、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの一部をコードする部分ク ローンのヌクレオチド配列（および推定アミノ酸配列）である。 配列番号４は、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるヒトｍＧｌ ｕＲ２受容体サブタイプの一部のアミノ酸配列である。 配列番号５は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプ（ｍ ＧｌｕＲ３）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である 。 配列番号６は、配列番号５のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。 配列番号７は、本発明のメタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ５ ａ１）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。 配列番号８は、配列番号７のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。 配列番号９は、本発明のｍＧｌｕＲ５変種メタボトロピックグルタミン酸受容 体（ｍＧｌｕＲ５ｂ）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列 ）である。 配列番号１０は、配列番号９のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である。 配列番号１１は、本発明のｍＧｌｕＲ５変種メタボトロピックグルタミン酸受 容体（ｍＧｌｕＲ５ｃ）をコードするＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配 列）である。 配列番号１２は、配列番号１１のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列である 。 配列番号１３は、ヒトｍＧｌｕＲ２受容体サブタイプの３’非翻訳配列の３４ ３ヌクレオチドである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/566 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 エリス，スチーブン ビー. アメリカ合衆国 92129 カリフォルニア 州サン ディエゴ，オビエド ストリート 8939 (72)発明者 リアウ，チェン アメリカ合衆国 92129 カリフォルニア 州サン ディエゴ，サリックス プレイス 7668 (72)発明者 ポンツラー，アーロン アメリカ合衆国 92071 カリフォルニア 州サンティー，ケリガン コート 10579 (72)発明者 ジョンソン，エドウィン シー. アメリカ合衆国 92129 カリフォルニア 州サン ディエゴ，グンナー アベニュー 13240 (72)発明者 ヘス，スチーブン ディー. アメリカ合衆国 92127 カリフォルニア 州サン ディエゴ，サウスビュー ドライ ブ 3735，ナンバー 309

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプをコードする単離さ れたＤＮＡ。 ２．サブタイプはｍＧｌｕＲ１である、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 ３．ＤＮＡのヌクレオチドは、実質的に配列番号２に記載のものと同じアミノ 酸配列をコードする、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。 ４．ＤＮＡのヌクレオチドは、高緊縮性条件下で配列番号１の実質的に全コー ディング領域にハイブリダイズする、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。 ５．ＤＮＡのヌクレオチドは、配列番号１に記載のものと実質的に同じヌクレ オチド配列を有する、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。 ６．サブタイプはｍＧｌｕＲ２である、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 ７．ＤＮＡのヌクレオチドは、配列番号４に記載のものと実質的に同じアミノ 酸配列、またはクローンＭＥＴＡＢ４０（ＡＴＣＣ寄託番号７５４６５）のヒト ｍＧｌｕＲ２をコードする部分のアミノ酸配列をコードするセグメントを含有す る、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ。 ８．ＤＮＡのヌクレオチドは、高緊縮性条件下で配列番号３の実質的に全ての 配列、またはクローンＭＥＴＡＢ４０（ＡＴＣＣ寄託番号７５４６５）のヒトｍ ＧｌｕＲ２をコードする部分にハイブリダイズする、請求の範囲第６項に記載の ＤＮＡ。 ９．ＤＮＡのヌクレオチドは、配列番号３と実質的に同じヌクレオチド配列、 またはクローンＭＥＴＡＢ４０（ＡＴＣＣ寄託番号７５４６５）のヒトｍＧｌｕ Ｒ２をコードする部分を含有する、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ。 10．サブタイプはｍＧｌｕＲ３である、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 11．ＤＮＡのヌクレオチドは、配列番号６と実質的に同じアミノ酸配列をコー ドする、請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ。 12．ＤＮＡのヌクレオチドは、高緊縮性条件下で配列番号５の実質的に全コー ディング領域にハイブリダイズする、請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ。 13．ＤＮＡのヌクレオチドは、配列番号５と実質的に同じヌクレオチド配列を 有する、請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ。 14．サブタイプはｍＧｌｕＲ５である、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 15．ＤＮＡのヌクレオチドは、配列番号８に記載のものと実質的に同じアミノ 酸配列をコードする、請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ。 16．ＤＮＡのヌクレオチドは、高緊縮性条件下で配列番号７の実質的に全コー ディング領域にハイブリダイズする、請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ。 17．ＤＮＡのヌクレオチドは、配列番号７に記載のものと実質的に同じヌクレ オチド配列を有する、請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ。 18．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡによりコードされる単離された蛋白。 19．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡの少なくとも１４の連続する塩基、また はその相補的な物質よりなる、核酸プローブ。 20．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡに相補的な単離されたｍＲＮＡ。 21．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡを含有する真核細胞。 22．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡを発現する真核細胞。 23．請求の範囲第２０項に記載のｍＲＮＡを発現する両生類卵母細胞。 24．ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体蛋白サブタイプをコードするＤ ＮＡの同定法であって、 ヒトＤＮＡを請求の範囲第１９項に記載のプローブと接触させ、ここで、使用さ れるプローブがポリ核酸断片の時は低緊縮性ハイブリダイゼーション条件から中 緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、または使用されるプローブが オリゴヌクレオチドの時は高緊縮性ハイブリダイゼーション条件下で接触させる 、そして 該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを同定することよりなる、上記方法。 25．競合的結合測定法において請求の範囲第１８項に記載の受容体蛋白を用い ることよりなる、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプに結合す る化合物の同定方法。 26．ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの活性を調節する化 合物を同定するための生物測定法であって、 （ａ）請求の範囲第２２項に記載の細胞を、受容体サブタイプの第二メッセンジ ャー活性の調節能力を測定すべき少なくとも１つの化合物に暴露させて、その後 （ｂ）第二メッセンジャー活性の変化について細胞を追跡する ことよりなる上記方法。 27．ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を、請求の範囲第２６項に記載 の生物測定法により同定される少なくとも１つの化合物の有効量に接触させるこ とよりなる、ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体サブタイプの第二メッセ ンジャー活性の調節方法。 28．請求の範囲第２６項に記載の方法により同定されるヒトメタボトロピック グルタミン酸受容体サブタイプのモジュレーター。 29．請求の範囲第１８項に記載の蛋白またはその免疫原性部分に対する抗体。 30．抗体はモノクローナル抗体である、請求の範囲第２９項に記載の抗体。 31．ヒトメタボトロピックグルタミン酸受容体を、請求の範囲第３０項に記載 の抗体の有効量に接触させることよりなる、ヒトメタボトロピックグルタミン酸 受容体サブタイプの第二メッセンジャー活性の調節方法。 32．細胞内サイクリックヌクレオチドレベルの受容体に誘導される変化を追跡 するための、陽イオンベースの生物測定法であって、 内因性または組換えサイクリックヌクレオチドゲートのチャネルを発現する宿主 細胞に、サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えると思われる受容体をコ ードする核酸を導入し、そして サイクリックヌクレオチドレベルに影響を与えると思われる、該受容体に対する リガンドの存在下または非存在下で、サイクリックヌクレオチドゲートのチャネ ルのサイクリックヌクレオチド活性化の量の変化を追跡することよりなる上記方 法。