【発明の詳細な説明】
ボツリヌス毒素ポリペブチドおよび
ワクチン増強剤としてのその使用
本発明は、ボツリヌス中毒に対して患者にワクチン接種するために用いるワク
チン増強剤として有用なポリペプチドに関する。本発明はまた、ポリペプチドを
含むワクチン、ワクチンと組み合わせたポリペプチドを用いてボツリヌス中毒に
対して患者にワクチン接種する方法、およびポリペプチドを含みそしてワクチン
を任意に包含するキットに関する。
Clostrldium botulinumは、Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと表記される
タイプの抗原的に区別される神経毒を生産する７つの嫌気性細菌株の１つの群で
あり、神経毒は動物およびヒトに致死的な、極度に強力にシナプス前部に作用す
る神経麻痺剤である。タイプＡ、Ｂ、Ｅ、およびＦのボツリヌス神経毒はヒトの
病気、食品媒介されたおよび初期のボツリヌス中毒の両方を起こすと証明されて
いた。40年よりも長い間、ボツリヌストキソイドでの免疫を用いて、神経毒素と
の接触によるボツリヌス中毒の危険から実験従事者を保護してきた。
公知のトキソイドワクチン調製の問題は、調製が比較的粗製でありそして所望
されない局所的および全身的反応を起こ
すことである。Michigan Department of Public Healthにより製造された現在の
５価（ＡＢＣＤＥ）のトキソイドはまた、タイプＢに対して改良された応答を顕
著に誘起するが、タイプＡおよびＥ毒素に対して応答しない。さらに、長期間、
代表的には12〜25週間が、保護レベルを達成するために必要とされ、そして同じ
回数の免疫を受けた個体間での抗体力価の範囲は非常に広い。
他のワクチンの発達、ワクチン成分、およびボツリヌス毒素により引き起こさ
れる病気に対して患者にワクチン接種するための方法が所望されている。
公知の例えば、５価のトキソイドの使用が必要である免疫化の回数を減少する
ワクチン接種の方法の発達は、これにより所望されない反応が減少され得るとし
て所望されている。
従って、本発明は一般に、ボツリヌス中毒に対して改良されたワクチン接種を
提供する問題に注意を向けている。
公知のワクチンおよびワクチン接種の方法におけるいくつかの不利益を克服す
るおよび／または少なくとも緩和することが本発明の目的である。
本発明は、ポリペプチドの形態の現在のワクチンで遭遇した問題の解決を提供
し、これはボツリヌス毒素活性がないが、Ｔ細胞エピトープを含み、そしてボツ
リヌストキソイドの連続投与に応答して、患者でＴ細胞増殖および抗ボツリヌス
毒素抗体の増強された生産を刺激し得る。本発明はまた、公知のワクチンと組み
合わせた本発明のポリペプチドの投与を包
含する方法の形態におけるワクチン接種方法に本来存在する問題の解決を提供す
る。
本発明の第一の局面によれば、実質的にボツリヌス毒素活性のないポリペプチ
ドが提供され、それは、ボツリヌストキソイドに応答して増殖するために哺乳動
物中でＴ細胞の集団をプライミング（初回免疫）する能力がある。「プライミン
グ」により、最初にポリペプチドに曝すことは、続いてボツリヌストキソイドに
曝す反応が、最初にポリペプチドに曝さないボツリヌストキソイドとの反応と比
較して、増加する効果を有することを意味することを意図する。
第二の局面で、本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞エピトープを包含し、そして
続いてボツリヌストキソイドとの接触に曝すことに応答して増殖するためにＴ細
胞の集団をプライミングする能力がある：ポリペプチドは実質的に毒素活性がな
い。
使用するポリペプチドの例として、ポリペプチドはボツリヌス毒素により起こ
った病気の危険性に対して保護するためにヒトに投与される。ポリペプチドの効
果は、ボツリヌストキソイドにより感受性であるヒトの免疫系を作ることである
。このヒトは続いてある投与量のボツリヌストキソイドを与えられる。増加した
感受性は、ボツリヌス毒素に対して保護するトキソイドに対する増加した抗体の
形成を生じる。
従って、本発明のポリペプチドは、存在しているトキソイドワクチンの効果を
増強し得または増大し得る点で特に有利
である。さらに、このポリペプチドを用いることで援助されたワクチン接種は、
以前に可能であったよりも短時間で達成され得る。
本発明は、ボツリヌス毒素分子がある領域を含むことの発見に基づいており、
その領域は、毒素の残部からの単離物中で、続いてこの同じ領域との接触に対し
て患者を感受性にするために用いられ得る。本発明は、ボツリヌストキソイドワ
クチンの特性を増強するために働く感受性化領域の濃縮された非毒性供給源を提
供するために、この発見を利用する。
本発明の実施態様では、ポリペプチドは少なくとも１つのサブタイプのボツリ
ヌス毒素に対応する配列と少なくとも50％の相同性の程度を有する35個のアミノ
酸の配列を含み、そしてボツリヌス毒素活性がなく、または長さが少なくとも７
個のアミノ酸のそのサブフラグメントを含む。ポリペプチドフラグメントは好ま
しくは長さが25個までのアミノ酸、そして最も好ましくは長さが18個までのアミ
ノ酸である。
示したように、本発明により提供されたポリペプチドは７〜35個のアミノ酸の
特異的な配列を含み得る。従って、このような配列のみからなり得、または他の
配列に結合した若しくは別な方法で連結した７〜35個のアミノ酸の特定の配列か
らなり得る。明らかにこのような他の配列は、ポリペプチドが全体としてボツリ
ヌス毒素活性を有するようなことがあるべきではない。
本発明の特に好ましい実施態様では、ポリペプチドは７〜
35個のアミノ酸の配列からなり、すなわちポリペプチドは特定の配列の他に配列
を含まない。
本発明の実施態様では、ボツリヌス毒素に対応する配列との相同性の程度は、
少なくとも75％であり、そして好ましい実施態様では少なくとも90％である。さ
らに好ましい実施態様では、相同性は少なくとも95％である。
本発明の第一および第二の局面のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列
を含むポリペプチド、または長さが少なくとも７個のアミノ酸残基の前記アミノ
酸配列のＮ末端フラグメントにより例示される。特に好ましい実施態様は、配列
番号１の７個のＮ末端アミノ酸からなる。本発明は、さらに、３個までの付加、
置換、または欠失を包含するこのようなアミノ酸配列（生じたポリペプチドは少
なくとも７個のアミノ酸長であることが提供される）を含む。
本発明のこのようなポリペプチドでは、多くて２個のアミノ酸が置換、付加、
または欠失されることが特に好ましく、そして非常に好ましくは０または１個の
アミノ酸が置換、付加、または欠失される。
配列番号１のポリペプチド配列に対する置換は、どのアミノ酸も他のアミノ酸
に置換し得るが、好ましくは以下の表に従ってなされる。
本発明のおよび配列番号１に基づくポリペプチドは、好ましくは長さが30個ま
でのアミノ酸である。
本発明の第三の局面によれば、適切な薬学的な賦形剤または担体との組み合わ
せで本発明の第一または第二の局面のいずれかによるポリペプチドを含む、ボツ
リヌス中毒に対して患者にワクチン接種するために用いるワクチン増強剤が提供
される。
本発明の第三の局面の実施態様では、ワクチン増強剤は、
例えば５価（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）のトキソイドワクチンのような公知のボツリ
ヌストキソイドワクチンをさらに包含する。
本発明の第四の局面によれば、以下の工程を包含する、ボツリヌス中毒に対し
て哺乳動物にワクチン接種する方法が提供される：
（１）哺乳動物に本発明に従って第一回目のポリペプチドを投与する工程、お
よび
（２）該哺乳動物に公知のボツリヌストキソイドワクチンを含む第二回目のワ
クチンを連続または同時に投与する工程。
本発明の第四の局面の他の一つの方法は、公知のボツリヌストキソイドワクチ
ンを最初に投与することであり、そして本発明の第三の局面のポリペプチドを続
いて投与することである。
本発明の第五の局面では、本発明のポリペプチドの供給と一緒に公知のボツリ
ヌストキソイドワクチンの供給を包含する、ボツリヌス中毒に対して患者にワク
チン接種するためのキットが提供される。
本発明の第六の局面によれば、以下の工程を包含するポリペプチド毒素により
起こった病気に対して哺乳動物にワクチン接種する方法が提供される：
（１）実質的に毒素活性のないポリペプチドを包含するワクチン増強剤を患者
へ投与する工程、ここで、このポリペプチドはＴ細胞のエピトープを含みそして
毒素でまたは化学的に脱活性化した毒素で続いてチャレンジ（抗原投与）した患
者
の抗毒素抗体力価を増加する能力がある、および
（２）毒素または化学的に脱活性化した毒素を患者へ連続投与する工程。
本発明のポリペプチドは、容易に合成され得、そしてそのことによりボツリヌ
ス中毒に対して哺乳動物にワクチン接種に用いるために高純度で利用可能な点で
有利である。
ボツリヌス毒素は約150,000ダルトンの分子量を有するので、本発明のポリペ
プチドは、比較的非常に短い分子でありそしてボツリヌス毒素活性がなく、ワク
チン接種した被験者にボツリヌス中毒を起こさない。
本発明の例として実施態様の説明を以下に示す：
図１は、ボツリヌストキソイドに対するＥＬＩＳＡ抗体応答を示す。
図２は、毒素に対するＥＬＩＳＡ抗体応答を示す。
抗体力価は、ボツリヌストキソイドのみ（四角）で；トキソイドおよびミョウ
バン（丸）で；およびミョウバンのみ（三角）で免疫したマウスの３つの群から
得た血清についてアッセイした。
図３は、P1、本発明のポリペプチドで免疫したマウスの増殖性Ｔ細胞の応答を
示す。値は平均±１SEM、Ｎ＝３である。用いた刺激性抗原は、med、培地コント
ロール；PHA、フィトヘマグルチニン；TTxd、破傷風トキソイド；Btxd A、ボツ
リヌストキソイドＡ；L、Btxd AのＬ鎖であった。刺激のために
用いた抗原濃度は、２μg/ml（斜線、左下から右上）、10μg/ml（斜線、左上か
ら右下）、および50μg/ml（白抜きの枠）であった。
図４はP1でプライミングすることの抗体応答への効果を示す。結果は、アジュ
バントコントロールで予めプライミングしたBtxd Aでの免疫の10日後の応答（白
抜きの枠）、および同様の21日後（斜線、右上から左下）、およびP1で予めプラ
イミングした同様の免疫の10日後の応答（斜線、左上から右下）および次いで21
日後（水平な線）を示す。
実施例１
５価のボツリヌストキソイド（Ａ〜Ｅ）ワクチンで免疫化した３人のヒトドナ
ーは、トキソイドＡおよびボツリヌス毒素Ａ（BoNT/A）の合成的に開裂されたフ
ラグメントＬ、Ｈ、およびＬ-ＨNに対する強い増殖性Ｔ細胞応答を示した。毒素
のＮ末端領域の27マーペプチド（配列番号１に示されたアミノ酸２9〜54）はま
た３人のうちの２人のドナーのＴ細胞によって認識された。このようなＴ細胞の
応答の重要性は、ミョウバンの存在下または非存在下でトキソイドＡで免疫され
たマウスでさらに研究された。ネズミＴ細胞はまた、トキソイド、BoNT/Aフラグ
メントおよびアミノ酸29〜54のペプチドを認識した。このような増殖性Ｔ細胞応
答は、アジュバントとしてのミョウバンの存在により増大される。トキソイドＡ
で免疫した数匹のマウスから得た抗体は、インビトロでボツリヌス毒
素Ａを中和することおよびインビボで連続注射で神経毒性に対してマウスを保護
することが可能であった。保護抗体力価は、ミョウバンなしよりもミョウバンと
ともにトキソイドを与えた群で７倍高かった。ミョウバンなしの群と比較してミ
ョウバンとともにトキソイドを与えた群では、ＥＬＩＳＡ抗毒素抗体応答に10倍
の増加があったが、トキソイドに対するＥＬＩＳＡ抗体力価での違いは群の間に
検出されず、これはまさに抗毒素抗体応答が増大されることを示す。従って、Ｔ
細胞応答をともなう高い（７〜10倍）保護抗毒素応答の共誘導は、効果的な保護
が、強いＴおよびＢ細胞応答の共誘導を必要とすることを示唆する。
材料および方法マウス
８〜10週齢の間のメスBALB/cマウスをNIBSCで飼育した。18〜20gの間の
体重のメスMF1マウスをHarland Olac（Bicester，Oxon，UK）から得た。免疫
BALB/cマウスをマウス１匹あたり10μgのボツリヌストキソイドタイプＡ
で脇腹および足蹠に皮下に免疫した。水酸化アルミニウムをアジュバントとして
用いた場所で、Alhydrogel（Superfos Vedbaek，Sweden）の１：10希釈を混合し
、そして使用する前にリン酸緩衝化生理食塩水中でトキソイドとともに４℃で一
晩インキュベートした。動物を２週間後にブースター免疫（追加免疫）し、続い
てその４週間後に二回目のブースターを行った。ボッリヌストキソイドおよび毒素フラグメントＨ、Ｌ、およびＬ-ＨNの調製
ボツリヌス毒素タイプＡをClostridium botulinumタイプＡ（Ａ7272）の48時
間の培養上清20リットルから酸沈澱により、続いてアフィニティークロマトグラ
フイー（ShoneによるEur．J．Biochem 151:75-82に記載のとおり）により精製し
た。このようにして得た神経毒素は比活性1.5〜２×108LD50/mgを有した。この
毒素を0.2％ホルムアルデヒドとともに37℃で25日間インキュベートすることに
より解毒した。生じたトキソイドを、0.2M NaClを含むHEPES緩衝液（0.O5M、pH7
.4）に対して大量に透析して、使用前に過剰なホルムアルデヒドを除去した。タ
ンパク質濃度を、標準として結晶ウシ血清アルブミン（画分Ｖ、SIGMA）を用い
て、Bradford（Anal．Biochem．72:248-254）の方法により測定した。
ボツリヌス毒素（BoNT/A）の重（Ｈ）および軽（Ｌ）鎖フラグメントを上記の
とおりいくらか改変して調製した。簡単にいえば、ホウ酸／リン酸緩衝液（0.05
M、pH8.5）中の0.5mgの精製されたボツリヌス毒素を、同じ緩衝液で予め平衡化
した3mlのQAE Sephadex A50（Pharmacia）カラムに載せ、そしてカラムを10mMジ
チオスレイトール（DTT）を含有する約20mlのホウ酸／リン酸緩衝液で洗浄した
。次いで、カラムの空隙容量と等量のホウ酸／リン酸緩衝液中の10OmM DDTおよ
び２M尿素の１容量を、カラムにかけて、そして全体を４℃で一晩インキュベー
トした。フラグメントＬを４℃でホウ酸／リン酸緩衝液中の
10mM DDT、２M尿素で溶出した。続いてフラグメントＨをホウ酸／リン酸緩衝液
中の0.2M塩化ナトリウムで溶出した。両方のタンパク質フラグメントを別々に集
収し、そして0.15M塩化ナトリウムを含有するHEPES緩衝液（0.05M、pH7.4）で大
量に透析した。
ボッリヌス毒素の105kDaのＬ-ＨNフラグメントを本質的に上記のように調製し
た。簡単に説明すると、精製した毒素をリン酸生理食塩緩衝液（0.15M NaCl、 0
.05Mリン酸ナトリウムpH8.0）中の50μg/mlトシルフェニルアラニンクロロメタ
ン処理したトリプシンを用いて20℃で72時間処理した。消化物を、１mlのトリプ
シンインヒビター−アガロースリン酸／生理食塩緩衝液の上に層積した２mlのα2
-マクログロブリン-アガロースからなるカラム上でクロマトグラフを行った。
リン酸／生理食塩緩衝液で溶出した主な画分をプール、濃縮しそして同じ緩衝液
で予め平衡化したSephadex G200（Pharmacia）カラム上で再度クロマトグラフを
行った。Ｌ-ＨNを含む最初のタンパク質ピークからの画分を集収しそしてプール
した。ELISAアッセイ
ELISAアッセイを前記（Voller、Bull．World Health Organisat
ion 53:55-65）のとおり行った。簡単に説明すると、0.1M炭酸緩衝液pH9.6中に
１μg/mlで100μl/ウェルのボツリヌストキソイドまたは毒素を用いて、96ウェ
ルマイクロタイタープレート（Nunc、maxi sorb）を４℃で一晩コートした。示
された希釈の血清およびウサギ抗マウスIgとペルオキシダーゼの結合体（１:500
0、SIGMA）を0.05％ Tween20を含
有するPBSで希釈した。全ての洗浄は、0.1％脱脂粉乳および0.05％ Tween20を含
有するPBSを用いた。用いた酵素基質は、過酸化水素とともに2,2'-アジノ-ビス(
3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸(SIGMA))であり、そしてO.D.示数をAn
thos ELISAプレートリーダーモデル2001（Anthos Labtec Instruments，Austria
）を用いて405nmで測定した。ペプチドの合成
ペプチドを、Applied Biosystems' FastMocTM化学を用いる、
自動固相ペプチド合成機（モデル431A、Applied Biosystems Inc.、Foster City
、CA.）を用いて合成した。ペプチドを、予めロードしたp-ベニロキシベンジル
アルコール樹脂または4-(2',4'-ジメトキシフェニルFmoc-アミノメチル)-フェノ
キシ樹脂（Novabiochem(UK)Ltd.）のいずれかの上で合成し、そしてHPLC分析に
より純度を調べた。増殖アッセイ
全てのアッセイを、前記（Chan、Immunology.68:96-101）のとお
り、96ウェル平底組織培養プレートで３つ組で行った。排出されている（draini
ng）リンパ節を第二回目のブースト後７日目にマウスから得た。リンパ節細胞懸
濁液を、２mM L-グルタミン、２×10-5M 2-ME、および0.5％正常マウス血清を追
加した100μlのClick'ｓ Eagle's高アミノ酸培地中に４×105細胞／ウェルで分
配した。ヒトドナーは、５価のボツリヌストキソイドワクチンでワクチン接種さ
れた健康な男性および女性である。ヒト非分画単核細胞を、曲がっているガラス
棒で線維素除去（defribrination）した後、lymphoprep（Nyegaard and Co.，Os
lo，Norway）を通して勾配遠心分
離により末梢血から得、そして２mM L-グルタミン、２×10-5M 2-MEおよび12.5
％自己血清を追加したRPMI-1640培地100μl中に２×105細胞／ウェルで分配した
。抗原をともなうまたはともなわない各培養物を、５％ＣＯ2の雰囲気中37℃で
マウス細胞では４日間、ヒト細胞の場合は５日間インキュベートし、最後の18時
間で１μＣｉ／ウェルの［3H］チミジン（Amersham、Bucks）を用いてパルスし
、そして細胞ハーベスターで採集した。インビボでのボツリヌス毒素中和アッセイ
トキソイドＡで免疫したマウスの血
清中のボツリヌス抗毒素の効力をボツリヌス抗毒素の標準調製物（タイプＡ抗毒
素についてのＷＨＯInternational Standard、IU＝0.136mgタンパク質で500IU/
アンプル）に対する滴定により決定し、ボツリヌス毒素の固定した投与量（50LD50
）と同じ程度の保護を得た。各群の３匹のマウス各々から等量の血清をプール
し、そしてゼラチンリン酸緩衝液（0.2％ゼラチンを含む0.05Mリン酸ナトリウム
緩衝液pH6.5）に１：100希釈した。次いで、希釈した血清または参照用の抗血清
（0.5IU/ml）の段階に分けた容量を、4.5ml／抗体希釈／４匹のマウスの群の最
終容量になるまで、ボツリヌス毒素の固定した濃度（50LD50／マウスの投与量を
送達するために計算された）とそれぞれに混合した。MF1マウス毎に1mlを腹腔内
に注射する前に、混合物を室温で１時間インキュベートした。動物を４日間にわ
たって神経毒性の徴候について観察した。ヒト血清試料の効力についてのアッセ
イは、ボツリヌス
毒素Ａの投与量が10LD50／マウスでありそして参照用の抗血清の用いた濃度が0.
1U/mlであること除いて、本質的には同じである。
以下の結果を得た。ボツリヌストキソイドでワクチン接種したヒトにおける増殖性Ｔ細胞の応答
３
人の個体をインビトロで増殖性Ｔ細胞応答についての刺激性抗原の存在下で試験
する前に、２（ＶＫ）または３回（ＤＳおよびＭＪＣ）の５価のボッリヌストキ
ソイドワクチンでワクチン接種した。表２に示すように、全ての３人の個体から
の細胞は、ボツリヌストキソイド（BTxd）ならびにBoNT/AフラグメントＨおよび
Ｌによく応答した；ＭＪＣのＴ細胞は他の２個体のＴ細胞よりも非常に強い応答
を示す。Ｔ細胞のどれもコントロールタンパク質であるウシ血清アルブミン（BS
A）に応答しなかった。しかし、５つのペプチドが、各27マー長でありそして毒
素のフラグメントＬのアミノ酸配列（ペプチド１および２）（配列番号１、配列
番号２）またはフラグメントＨのアミノ酸配列（ペプチド３〜５）（配列番号３
〜配列番号５）から合成され、刺激性抗原として用いられる場合、ペプチド１（
ボツリヌス毒素Ａのアミノ酸２８〜５３にわたる）は、２個体からのＴ細胞によ
り認識された。ペプチド１に対するＶＫからの増殖性Ｔ細胞の応答は非常に強い
が、ＶＫはＤＳより１回免疫化が少ないにもかかわらず、より弱い応答がＤＳか
らの細胞で検出された。ＭＪＣのＴ細胞は、ペプチド４およびより小さい長さの
ペプチド３を認識した。マウスにおける増殖性Ｔ細胞の応答
アジュバントとしてのミョウバンの存在下
でボツリヌストキソイドタイプＡで免疫したBALB/cマウスは、ミョウバンなしで
免疫されたマウスよりもボツリヌストキソイド（BTxd）、BoNT/AフラグメントＬ
、Ｈ、およびＬ-ＨNに対して、インビトロで増殖性Ｔ細胞のより強い応答を示し
た（表３）。ミョウバンだけ与えられたコントロールマウスからの細胞は、イン
ビトロでいかなる抗原に対しても応答しなかった。さらに、ヒトＴ細胞のように
、ネズミＴ細胞もまたペプチド１（アミノ酸29〜54）を認識した；この応答はミ
ョウバンの非存在下よりも存在下でトキソイドで免疫したマウスで顕著に強い。トキソイドおよび毒素に対するＥＬＩＳＡ抗体の応答
ミョウバンの存在下また
は非存在下てトキソイドで免疫したマウスからの血清のボツリヌストキソイド、
Ｌ、およびＨに対するＥＬＩＳＡ抗体力価に顕著な違いはなかった（図１）。し
かし毒素について試験した場合、ＥＬＩＳＡ抗体力価はミョウバンとともにトキ
ソイドを与えた群で10倍高かった（図２）。毒素に対する保護抗体の応答
ミョウバンの存在下または非存在下でトキソイド
Ａで免疫したマウスの群からの血清は、毒素を中和することができる保護抗毒素
抗体を含む。重要なことに、ミョウバンの存在下でトキソイドで免疫した群から
のマウスは、ミョウバンを与えなかったものより７倍高いレベルの抗毒素抗体の
応答を有した（表４）。
保護抗毒素抗体のレベルをまたヒト血清で測定した。たと
えＶＫがたった２回のワクチン接種を受けただけでも、彼女は最も高い中和抗毒
素抗体を有したが、ＤＳは３回のワクチン接種にもかかわらす最も低い力価を有
した（表４）。
実施例２Clostridium botulinum神経毒素Ａの精製
Clostridium botulinumタイプＡ（72
72株）をＵＳＡ２増殖培地で20Lバッチで増殖し、そして神経毒素をボツリヌス
タイプＦ神経毒素について記載された方法の改変により総計200Lの細菌培養物か
ら精製した。最終のクロマトグラフィーの段階については、神経毒素を、101、0
.05Mコハク酸ナトリウム、pH5.5に対して透析し、そしてSepharose S(Pharmacia
)のカラム（2.6cm×６cm）の上に載せ、そしてコハク酸緩衝液で200mlの直線NaC
l勾配（０〜0.3M）で溶出した。BoNTAは、NaCl勾配の間に溶出した主要なタンパ
ク質ピークであり、0.15M NaClを含む0.05M Hepes、pH7.4(Hepes/NaCl)に対し透
析し、分割しそして-80℃で保存した。
実施例３タイプＡ神経毒素のＬＨNフラグメントの精製
。100mM NaClを含有する0.15M Tri
s/HCl緩衝液、pH8.0中のボツリヌス神経毒素（15ml中40mg）をトリプシン（50μ
g/ml）で20℃にて72〜96時間処理し、100mM NaClを含有する20mMトリエタノール
アミン緩衝液pH7.8に対し透析し、濾過し（0.22μmの孔サイズ）、そして次いで
、後者の緩衝液で平衡化したMono Q（HR 10/10、Pharmacia）でクロマトグラフ
（高速プロテインリキッドクロマトグラフィーシステム、Pharmacia）した。こ
のカラムをさらに100mlのトリエタノールアミン緩衝液で洗浄し、そして次い
でＨ2Ｌフラグメントを200mM NaClを含有するトリエタノールアミン緩衝液（20m
M、pH7.8）で溶出した。精製したフラグメント（約1.5mg/ml）をトリプシンイン
ヒビターで５μg/mlにし、５mM NaClを含有する0.15M Tris/HCl緩衝液、pH8.0に
対して透析し、そして-20℃で保存した。
実施例４
本研究では、発明者らがボツリヌストキソイドＡでマウスを免疫した場合、毒
素Ａに対する増強した中和抗体の応答は、増殖性Ｔ細胞の応答を誘導する本発明
の27マーの毒素Ａペプチドで予めプライミングしたマウスでのみ誘起された。こ
の結果は、本発明のペプチドを用いるＴ細胞レベルでのプライミングが、促進さ
れた抗体の応答を操作して、そしてそれにより、免疫化の期間およびトキソイド
ワクチンの有害な副作用に不必要に曝すことが減少するための十分な助けを提供
することを示す。材料および方法 マウス
実施例１と同様。免疫化
BALB/cマウスを、Freund's完全アジュバントの存在下で50μg P1／マウ
スで脇腹の皮下に免疫した。動物をリン酸緩衝化生理食塩水中の抗原のブースタ
ー免疫を皮下に行った。ボツリヌストキソイドおよび毒素のフラグメントＨおよびＬ の調製
実施例１と同様。ラジオイムノアッセイ
ＲＩＡをJ．Exp．Med．162:1304に既に記載されたとお
りに行った。簡単に説明すれば、0.1M炭酸緩衝液pH9.6中１μg/mlのボツリヌス
トキソイドまたは毒素の100μl／ウェルを用いて、可変性の96ウェルマイクロタ
イタープレート（Falcon）を４℃で一晩コートした。示された希釈の血清および125
Ｉで標識されたウサギ抗マウスIgを10％New bornウシ血清および0.05％ Twee
n20を含有するPBSで希釈した。全ての洗浄は、0.05％ Tween20を含有するPBSを
用いた。ウェルを切り出しそして放射活性をガンマカウンターで測定した。ペプチドの合成
実施例１と同様。増殖アッセイ
全てのアッセイは、前記のとおり、96ウェル平底組織培養プレー
トで３つ組で行われた。排出されているリンパ節を第一回目のブースト後７〜14
日目にマウスから得た。リンパ節細胞懸濁液を２mM L-グルタミン、２×10-5M 2
-ME、および0.5％正常マウス血清を追加した100μlのClick's Eagle's高アミノ
酸培地中に４×105細胞／ウェルで分配した。抗原をともなうまたはともなわな
い各培養物を５％ＣＯ2の雰囲気中37℃で４日間インキュベートし、最後の18時
間で１μＣｉ／ウェルの［3H］チミジン（Amersham、Bucks）を用いてパルスし
、そして細胞ハーベスターで採集した。
細胞増殖はＳＩ［刺激インデックス＝（抗原をともなうc.p.m.）／（抗原をと
もなわないc.p.m.）］で表される。2.5より大きいＳＩ値が有意と考えられる。インビボでのボツリヌス毒素中和アッセイ
実施例１と同様。
結果P1で免疫したマウスの増殖性Ｔ細胞の応答
Freund's完全アジュバントの存在下
でP1で免疫した３匹のマウスからの排出されているリンパ節細胞を、インビトロ
での増殖性Ｔ細胞の応答の存在について試験した。図３に示すように、細胞はBT
xd Ａ、Ｌによく応答し、そしてP1に応答した。P1に対する応答は、50〜２μg/m
lのペプチド濃度を刺激のために用いた場合、ＳＩ＝74〜33で非常に強かった。B
Txd ＡおよびＬに対する応答は、用いた２つの抗原の同じ濃度範囲について約10
倍低かった。コントロールペプチド２（P2、アミノ酸214〜238）および破傷風ト
キソイド（TTXd）に対する応答がなかった。ペプチド１でのプライミングはＨおよびBtxd Aに対するＲＩＡ抗体力価を増大す る
マウスを、BTxd Ａでの免疫化前にFreund's完全アジュバントの存在下でP1
で予めプライミングした場合、ＨおよびBTxd Ａに対して10および21日後に採取
した血清のＲＩＡ抗体力価は、Freund's完全アジュバントのみを与えたコントロ
ールマウスのものよりも４〜10倍高く、BTxd Ａが続く（図４）。ペプチドP1でプライミングしたマウスでの促進された抗毒素抗体の応答
P1の存
在または非存在下で、Freund's完全アジュバントで予めプライミングした後、BT
xd Ａで免疫したマウスからの血清は、ボツリヌス毒素Ａを中和することが出来
る
保護抗毒素抗体を含む。重要なことには、BTxd Ａでの免疫化の21日後に、P1で
予めプライミングした群からのマウスは、ペプチドを与えなかったマウスよりも
10倍高いレベルの抗毒素抗体の応答を有した（表５）。ヘルパーＴ細胞のエピトープはトキソイドＡ、Ｂ、およびＥの相同領域に存在す る
P1でプライミングしたマウスからの排出されているリンパ節細胞がインビト
ロでBTxd Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、またはＦで刺激される場合、BTxd Ａ、Ｂ、およびＦ
に対して強い増殖性Ｔ細胞の応答があり、そしてBTxd Ｃに対して非常に弱い応
答があった。Ｔ細胞はBTxd Ｅに対して応答しなかった。10マーが重複する３つ
のペプチドを用いたThエピトープのさらなるマッピングは、アミノ酸29〜43の中
に位置することを示す（表６）。
従って、P1でプライミングすることは、BTxd Ａにより誘導された増強した抗
体応答を生じる。BTxd ＢおよびＦに対する、ならびに限定された大きさのＣに
対する、P1により誘導された交叉反応性Ｔ細胞の応答は、P1での免疫化が、抗Ａ
応答ならびに抗ボツリヌス毒素Ｂ、Ｃ、およびＦの応答を増強するに潜在的に使
用されることを示唆する。従って、BTxd Ａにより例示されるトキソイドワクチ
ンのような異なったワクチンでの免疫化前に、Thエピトープを含有する本発明の
ペプチドで免疫することは、抗毒素抗体応答を増強する。このような療法はトキ
ソイドワクチンに対する免疫応答をブーストすることを助け、従って、免疫化の
継続時間および回数、ならび
にワクチンに曝すことによる副作用もまた減少させる。
プライミングのために用いたアジュバントは完全Freund'ｓアジュバント（CFA
）であった。
本明細書中の結果から評価されるように、本発明は、ボツリヌス毒素により起
こされた病気に対してワクチン接種するための治療の使用のためのワクチン増強
剤を提供し、ならびにボツリヌス毒素のようなポリペプチド毒素により起こされ
た病気に対して被験者にワクチン接種するための改良された方法の提供する。
実施例は、長さがほんの27アミノ酸までの比較的小さなポリペプチドが、分子
量約150,000ダルトンの毒素分子に対して生じる免疫性についてのワクチン増強
剤の主薬（basis）をどのように提供し得るかを示す。この実施例で効果のある
特定のアミノ酸配列は、免疫原性である全体の毒素ポリペプチドの
領域のみではなく、そして本発明はまた免疫原性である毒素分子の他のポリペプ
チド領域に関する。そして、毒素の残部からの単離に用いた毒素分子は、抗毒素
抗体の生産を刺激するに有効であるが、毒素活性は実質的にない。
実施例５ペプチドおよびボツリヌストキソイドの組み合わせワクチン
本発明のある量のペプチド（例えば、0.1〜50μg/mlの範囲で）およびある量
のボツリヌストキソイド（例えば、0.1〜20μg/mlの範囲で）からなるワクチン
は、保存剤、例えばチメリソール（thimerisol）（最終濃度が0.01％より大きく
ない）の存在下で適切な担体、例えば、アルヒドロゲル（ミョウバン）（最終濃
度が0.15mg/mlアルミニウムより大きくない）の上で吸収した。１回またはそれ
以上の用量（0.5〜１ml）の投与は、種々の間隔で種々の経路（例えば、筋肉内
、皮下）による。ワクチンはまた、存在するボツリヌスワクチンとともに本発明
の吸収されたペプチドを混合することにより作られ得る。
実施例６２成分ワクチン
成分１は、実施例５に前述のとおり、保存剤をともなうまたはともなわない適
切な担体に吸収された本発明のペプチドからなる。成分２は、公知のボツリヌス
ワクチンからなる。成分１の１回またはそれ以上の用量の投与は、成分２の１回
またはそれ以上の用量による間隔（例えば、７〜14日）の後に続く。
Detailed Description of the Invention
Botulinum toxin polypebtide and
Its use as a vaccine enhancer
The present invention provides a vaccine used to vaccinate patients against botulinum poisoning.
A polypeptide useful as a tin enhancer. The invention also provides a polypeptide
Botulinum addiction using vaccine containing, polypeptide combined with vaccine
Method for vaccinating a patient, and vaccine comprising a polypeptide and a vaccine
And optionally a kit.
Clostrldium botulinumIs A, B, C1, D, E, F, and G
In one group of seven anaerobic bacterial strains that produce a type of antigenically distinct neurotoxin
Yes, neurotoxins are extremely potent presynaptic agents that are lethal to animals and humans
It is a nerve palsy drug. Botulinum neurotoxins of types A, B, E, and F are human
Proven to cause both disease, foodborne and early botulism
I was there. For over 40 years, immunization with botulinum toxoid was used to
Has protected the experimental personnel from the risk of botulism poisoning from contact with.
The problem with the known toxoid vaccine preparation is that the preparation is relatively crude and desirable
Cause unresolved local and systemic reactions
Is to do. Present manufactured by Michigan Department of Public Health
The pentavalent (ABCDE) toxoid also revealed an improved response to type B.
It induces markedly but does not respond to type A and E toxins. Furthermore, for a long time,
Typically 12-25 weeks are needed to achieve the level of protection, and the same
The range of antibody titers among individuals immunized multiple times is very wide.
Caused by the development of other vaccines, vaccine components, and botulinum toxins
A method for vaccinating patients against the diseases described is desired.
Known, for example, the use of pentavalent toxoids reduces the number of immunizations required
The development of vaccination methods says that this can reduce unwanted reactions
Is desired.
Accordingly, the present invention generally provides for improved vaccination against botulinum intoxication.
Attention is paid to the issues they provide.
Overcome some disadvantages of known vaccines and vaccination methods
And / or at least mitigating is an object of the present invention.
The present invention provides a solution to the problems encountered with current vaccines in the form of polypeptides
Which lacks botulinum toxin activity but contains T cell epitopes and
T Cell Proliferation and Antibotulinum in Patients in Response to Continuous Administration of Linustoxoid
It may stimulate enhanced production of toxin antibodies. The present invention also combines with known vaccines.
Including administration of a combined polypeptide of the invention
Provides a solution to the problems inherent in vaccination methods in the form of
It
According to the first aspect of the present invention, a polypeptide having substantially no botulinum toxin activity.
Are provided, which feed to grow in response to botulinum toxoid.
It has the ability to prime a population of T cells in the body. "Primin
First exposure to the polypeptide followed by botulinum toxoid
The exposure response is comparable to that of the botulinum toxoid that was not first exposed to the polypeptide.
By comparison, it is meant to have an increasing effect.
In a second aspect, the polypeptide of the invention comprises a T cell epitope, and
Subsequent T-cell growth in order to proliferate in response to exposure to botulinum toxoid.
Capable of priming a population of cells: the polypeptide is substantially non-toxic
Yes.
As an example of the polypeptide used, the polypeptide is caused by a botulinum toxin.
Administered to humans to protect against the risk of certain diseases. Effect of polypeptide
The fruit is to create a human immune system that is more sensitive to botulinum toxoid
. The human is subsequently given a dose of botulinum toxoid. Increased
Sensitivity of increased antibodies to toxoid protects against botulinum toxin
Results in formation.
Therefore, the polypeptide of the present invention is effective against the effects of existing toxoid vaccines.
Particularly advantageous in that it can be augmented or augmented
Is. In addition, vaccination aided by using this polypeptide
It can be achieved in less time than previously possible.
The present invention is based on the discovery that a botulinum toxin molecule contains a region,
The area was isolated in the isolate from the rest of the toxin, and subsequently contacted with this same area.
Can be used to sensitize patients. The present invention is a botulinum toxoid
Providing a concentrated, non-toxic source of sensitizing regions that act to enhance the properties of cutin
Take advantage of this discovery to serve.
In an embodiment of the invention the polypeptide is a botulinum of at least one subtype.
35 amino acids with a degree of homology of at least 50% with the sequence corresponding to Nus toxin
Acid sequence and is free of botulinum toxin activity or is at least 7 in length
Of that amino acid in its subfragments. Polypeptide fragments are preferred
Preferably up to 25 amino acids in length, and most preferably up to 18 amino acids in length.
No acid.
As shown, the polypeptide provided by the present invention comprises 7-35 amino acids.
It may include a specific sequence. Therefore, it may consist solely of such sequences, or
A specific sequence of 7-35 amino acids linked to the sequence or otherwise linked?
Can consist of Obviously, such other sequences would be
There should never be such a thing having nustoxin activity.
In a particularly preferred embodiment of the invention, the polypeptide is 7-
It consists of a sequence of 35 amino acids, that is, a polypeptide is a sequence of
Does not include.
In an embodiment of the invention, the degree of homology with the sequence corresponding to the botulinum toxin is
At least 75%, and in a preferred embodiment at least 90%. It
In an even more preferred embodiment, the homology is at least 95%.
The polypeptide of the first and second aspect of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
A polypeptide comprising, or the amino of at least 7 amino acid residues in length
It is exemplified by the N-terminal fragment of the acid sequence. A particularly preferred embodiment is the sequence
It consists of the 7 N-terminal amino acids of number 1. The present invention further comprises up to three additions,
Such amino acid sequences, including substitutions or deletions (the resulting polypeptide is
It is provided that it is at least 7 amino acids long).
In such polypeptides of the invention, at most 2 amino acids have been replaced, added,
Or especially deleted, and very preferably 0 or 1
Amino acids are replaced, added, or deleted.
Substitutions to the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 1 are made by replacing any amino acid with another amino acid.
Can be substituted, but preferably according to the table below.
The polypeptides of the present invention and based on SEQ ID NO: 1 preferably have a length of 30 or less.
Is an amino acid in.
According to a third aspect of the invention, a combination with a suitable pharmaceutical excipient or carrier
And a polypeptide comprising a polypeptide according to any of the first or second aspects of the invention.
Vaccine-enhancing agents used to vaccinate patients against Linus poisoning provided
To be done.
In an embodiment of the third aspect of the invention, the vaccine enhancer comprises
Known bots such as, for example, pentavalent (A, B, C, D, E) toxoid vaccines.
Further included is a nustoxoid vaccine.
According to a fourth aspect of the present invention, against botulinum poisoning, which comprises the following steps:
Methods of vaccinating mammals are provided by:
(1) administering a first polypeptide according to the present invention to a mammal,
And
(2) The second vaccine containing a botulinum toxoid vaccine known to the mammal.
The step of administering cutin continuously or simultaneously.
Another method of the fourth aspect of the present invention is the known botulinum toxoid vaccine.
Is administered first, and the polypeptide of the third aspect of the invention is
Is to be administered.
In a fifth aspect of the invention, known botulinum is provided with the supply of the polypeptide of the invention.
Patients Excited Against Botulinum Poisoning Including Supply of Nustoxoid Vaccine
Kits for inoculating chin are provided.
According to a sixth aspect of the invention, a polypeptide toxin comprising the steps of:
Methods are provided for vaccinating mammals against the disease that has occurred:
(1) Patients with a vaccine enhancer including a polypeptide having substantially no toxin activity
Administering to the polypeptide, wherein the polypeptide comprises an epitope of T cells and
Patients subsequently challenged with a toxin or with a chemically deactivated toxin
Person
Has the ability to increase the antitoxin antibody titer of, and
(2) A step of continuously administering a toxin or a chemically deactivated toxin to a patient.
The polypeptides of the present invention can be readily synthesized and thereby allow botulinum
In high purity available for use in vaccination of mammals against
It is advantageous.
Since botulinum toxin has a molecular weight of about 150,000 daltons, it is
Ptide is a relatively very short molecule and lacking botulinum toxin activity,
Does not cause botulinum poisoning in vaccinated subjects.
A description of the embodiments is given below as an example of the invention:
FIG. 1 shows the ELISA antibody response to botulinum toxoid.
FIG. 2 shows the ELISA antibody response to the toxin.
Antibody titers are botulinum toxoid only (squares); toxoid and alum
From three groups of mice immunized with buns (circles); and alum only (triangles)
The obtained serum was assayed.
FIG. 3 shows the response of proliferating T cells of mice immunized with P1 and the polypeptide of the present invention.
Show. Values are mean ± 1 SEM, N = 3. The stimulating antigen used was med, medium control
Roll; PHA, phytohemagglutinin; TTxd, tetanus toxoid; Btxd A, bot
It was the L-chain of Linustoxoid A; L, Btxd A. For stimulation
The antigen concentration used was 2 μg / ml (shaded, lower left to upper right), 10 μg / ml (shaded, upper left)
From the bottom right) and 50 μg / ml (open frame).
Figure 4 shows the effect of priming with P1 on the antibody response. The result is Aju
Response 10 days after immunization with Btxd A pre-primed with bunto control (white
Punched), and 21 days later (shaded, upper right to lower left) and P1 in advance.
Responses 10 days after similar immunization (shaded, top left to bottom right) and then 21
Indicates the day (horizontal line).
Example 1
Three human donors immunized with a pentavalent botulinum toxoid (AE) vaccine
Is a synthetically cleaved subunit of toxoid A and botulinum toxin A (BoNT / A).
Lagment L, H, and L-HNShowed a strong proliferative T cell response to. toxin
The 27-mer peptide (amino acids 29 to 54 shown in SEQ ID NO: 1) in the N-terminal region of
It was recognized by T cells from 2 out of 3 donors. Of such T cells
The significance of the response is that immunization with toxoid A in the presence or absence of alum
Was further studied in mice. Murine T cells are also flagged with toxoid, BoNT / A
And a peptide of amino acids 29 to 54 was recognized. Such proliferative T cell response
The answer is augmented by the presence of alum as an adjuvant. Toxoid A
Antibodies from several mice immunized with botulinum were tested in vitro for botulinum venom.
Neutralizing Elemental A and Protecting Mice Against Neurotoxicity With Continuous Injection In Vivo
It was possible to The protective antibody titer is alum better than without alum.
Both were 7 times higher in the toxoid-fed group. Compared to the group without alum
The group receiving toxoid with alum showed 10 times higher ELISA anti-toxin antibody response
However, the difference in the ELISA antibody titer against toxoid was different between the groups.
Not detected, which just indicates that the antitoxin antibody response is increased. Therefore, T
Co-induction of a high (7-10 fold) protective antitoxin response with cellular response is effective protection
Require a co-induction of strong T and B cell responses.
Materials and methodsmouse
Female BALB / c mice between 8-10 weeks of age were housed in NIBSC. Between 18-20g
Body weight female MF1 mice were obtained from Harland Olac (Bicester, Oxon, UK).Immunity
BALB / c mouse is 10 μg / mouse of botulinum toxoid type A
Immunized subcutaneously into the flank and foot pad. Aluminum hydroxide as an adjuvant
Mix 1:10 dilution of Alhydrogel (Superfos Vedbaek, Sweden) where used.
, And at 4 ° C with toxoid in phosphate buffered saline before use.
Incubated overnight. Animals were boosted (boosted) two weeks later, followed by
Four weeks after that, a second booster was performed.Preparation of Borlinus toxoid and toxin fragments H, L, and L-H N
Botulinum toxin type AClostridium botulinumType A (A7272) at 4:00
Acid precipitation from 20 liters of the culture supernatant in between, followed by affinity chromatography
Purified by Fee (as described by Shone in Eur. J. Biochem 151: 75-82).
It was The neurotoxin thus obtained has a specific activity of 1.5 to 2 x 108LD50had / mg. this
Incubating the toxin with 0.2% formaldehyde for 25 days at 37 ° C
More detoxified. The resulting toxoid was added to HEPES buffer containing 0.2 M NaCl (0.05 M, pH 7).
.4) was dialyzed extensively against excess formaldehyde before use. Ta
Use crystalline bovine serum albumin (fraction V, SIGMA) as a standard for protein concentration
The measurement was carried out by the method of Bradford (Anal. Biochem. 72: 248-254).
The heavy (H) and light (L) chain fragments of botulinum toxin (BoNT / A) were prepared as described above.
Prepared as above with some modifications. Briefly, borate / phosphate buffer (0.05
0.5 mg of purified botulinum toxin in M, pH 8.5) pre-equilibrated with the same buffer
Loaded 3 ml QAE Sephadex A50 (Pharmacia) column, and loaded the column at 10 mM
Washed with about 20 ml borate / phosphate buffer containing thiothreitol (DTT)
. Then, a volume of 10OmM DDT in borate / phosphate buffer equal to the void volume of the column.
And 1 volume of 2M urea onto the column and incubate the whole at 4 ° C overnight.
I got it. Fragment L at 4 ° C. in borate / phosphate buffer
Eluted with 10 mM DDT, 2M urea. Then Fragment H was added to borate / phosphate buffer
Elute with 0.2 M sodium chloride in. Collect both protein fragments separately
And stored in HEPES buffer (0.05M, pH 7.4) containing 0.15M sodium chloride.
Dialyzed to volume.
Bordinus toxin 105kDa L-HNThe fragment was prepared essentially as described above
It was Briefly, purified toxin was added to phosphate buffered saline (0.15M NaCl, 0%
50 μg / ml tosylphenylalanine chlorometa in 0.05M sodium phosphate pH 8.0)
The treated trypsin was treated at 20 ° C. for 72 hours. Digest the digest with 1 ml of tryp
Syn-inhibitor-agarose phosphate / saline buffer 2 ml of alpha layered on top2
-Chromatographed on a column consisting of macroglobulin-agarose.
The main fractions eluted with phosphate / saline buffer are pooled, concentrated and concentrated in the same buffer.
Chromatograph again on a Sephadex G200 (Pharmacia) column pre-equilibrated with
went. L-HNFractions from the first protein peak containing
did.ELISA assay
The ELISA assay is described above (Voller, Bull. World Health Organisat
ion 53: 55-65). Briefly, in 0.1M carbonate buffer pH 9.6
96 μl with 100 μl / well botulinum toxoid or toxin at 1 μg / ml.
Le microtiter plates (Nunc, maxi sorb) were coated overnight at 4 ° C. Indication
Conjugate of peroxidase with diluted serum and rabbit anti-mouse Ig (1: 500
0, SIGMA) containing 0.05% Tween 20
Diluted with PBS. All washes contained 0.1% nonfat dry milk and 0.05% Tween 20.
PBS having the same was used. The enzyme substrate used was 2,2'-azino-bis (with hydrogen peroxide.
3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid (SIGMA)) and O.D.
thos ELISA plate reader model 2001 (Anthos Labtec Instruments, Austria
) Was used for measurement at 405 nm.Peptide synthesis
Peptides were applied to Applied Biosystems' FastMoc.TMUse chemistry,
Automated solid phase peptide synthesizer (Model 431A, Applied Biosystems Inc., Foster City
, CA.). Peptide preloaded with p-benzyloxybenzyl
Alcohol resin or 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl Fmoc-aminomethyl) -pheno
Synthesized on any of the xy resin (Novabiochem (UK) Ltd.) and for HPLC analysis
More purity was investigated.Proliferation assay
All assays were performed as described above (Chan, Immunology.68: 96-101).
And 96-well flat bottom tissue culture plates in triplicate. Emitted (draini
ng) Lymph nodes were obtained from mice 7 days after the second boost. Lymph node cell suspension
Suspend the suspension in 2 mM L-glutamine, 2 x 10-FiveAdd M2-ME and 0.5% normal mouse serum.
4 × 10 in 100 μl of added Click's Eagle's high amino acid mediumFiveMinutes per cell / well
I arranged it. Human donors were vaccinated with the pentavalent botulinum toxoid vaccine.
Healthy men and women. Human unfractionated mononuclear cells, bent glass
After defibrination with a stick, lymphophprep (Nyegaard and Co., Os
Lo, Norway) Gradient centrifugation
Obtained from peripheral blood by dissociation, and 2 mM L-glutamine, 2 x 10-FiveM 2-ME and 12.5
2 x 10 in 100 μl of RPMI-1640 medium supplemented with% autologous serumFiveDistributed in cells / well
. Each culture with or without antigen was treated with 5% CO2At 37 ℃ in an atmosphere of
Incubate for 4 days for mouse cells and 5 days for human cells, and
Between 1 μCi / well [3H] Thymidine (Amersham, Bucks)
, And harvested with a cell harvester.In vivo botulinum toxin neutralization assay
Blood of mice immunized with toxoid A
Efficacy of botulinum antitoxin in Seining standard preparation of botulinum antitoxin (type A antitoxin
WHO International Standard for elementary, 500 IU / IU = 0.136 mg protein
Fixed dose of botulinum toxin (50 LD50
) Obtained the same degree of protection. Pool equal volumes of serum from each of the 3 mice in each group
And gelatin phosphate buffer (0.05M sodium phosphate containing 0.2% gelatin)
Diluted 1: 100 in buffer pH 6.5). Then diluted serum or reference antiserum
(0.5 IU / ml) divided into 4.5 ml / antibody dilution / 4 group of mice
Fixed concentration of botulinum toxin (50 LD50/ Mouse dose
(Calculated for delivery) and mixed with each. Intraperitoneal 1 ml per MF1 mouse
The mixture was incubated at room temperature for 1 hour before injection into. Animals for 4 days
Observed for signs of neurotoxicity. Assessing the efficacy of human serum samples
Lee is botulinum
The dose of toxin A is 10LD50/ Mouse and the concentration used of the reference antiserum was 0.
Essentially the same, except at 1 U / ml.
The following results were obtained.Response of proliferating T cells in humans vaccinated with botulinum toxoid
Three
Testing human individuals in vitro in the presence of stimulatory antigens for proliferative T cell responses
2 (VK) or 3 times (DS and MJC) pentavalent boll
Vaccinated with Soid vaccine. As shown in Table 2, from all three individuals
Cells of botulinum toxoid (BTxd) and BoNT / A fragment H and
Responded well to L; MJC T cells had a much stronger response than the other two T cells
Is shown. Bovine serum albumin (BS
A) did not respond. However, five peptides are each 27-mer long and toxic
Amino acid sequence (peptides 1 and 2) of prime fragment L (SEQ ID NO: 1, sequence
No. 2) or the amino acid sequence of fragment H (peptides 3-5) (SEQ ID NO: 3)
~ SEQ ID NO: 5), when used as a stimulatory antigen, peptide 1 (
Botulinum toxin A spans amino acids 28-53) and is associated with T cells from two individuals.
Was recognized. The response of proliferating T cells from VK to peptide 1 is very strong
However, even though VK is less immunized once than DS, the weaker response is DS.
Were detected in these cells. MJC T cells have peptide 4 and smaller lengths.
Recognized peptide 3.Proliferative T cell responses in mice
In the presence of alum as an adjuvant
BALB / c mice immunized with botulinum toxoid type A in
Botulinum toxoid (BTxd), BoNT / A fragment L than immunized mice
, H, and L-HNResponse to proliferative T cells in vitro
(Table 3). Cells from control mice given only alum were
They did not respond to any antigen in vitro. Furthermore, like human T cells
, Murine T cells also recognized peptide 1 (amino acids 29-54); this response was
Significantly stronger in mice immunized with toxoid in the presence than in the absence of alum.Response of ELISA antibody to toxoid and toxin
In the presence of alum
Botulinum toxoid in serum from mice immunized with toxoid in the absence of
There was no significant difference in the ELISA antibody titers against L and H (Fig. 1). Shi
When tested for oak toxin, ELISA antibody titers were
It was 10 times higher in the group that received Soid (Fig. 2).Response of protective antibody to toxin
Toxoid in the presence or absence of alum
Sera from a group of mice immunized with A are able to neutralize the toxin
Contains antibodies. Importantly, from the group immunized with toxoid in the presence of alum
Mice have 7-fold higher levels of antitoxin antibodies than those not given alum.
It had a response (Table 4).
The level of protective antitoxin antibody was also measured in human serum. Tato
Even if VK receives only two vaccinations, she has the highest neutralizing anti-venom
Although it had a primary antibody, DS had the lowest titer despite three vaccinations.
(Table 4).
Example 2Purification of Clostridium botulinum neurotoxin A
Clostridium botulinumType A (72
72 strains) in USA 2 growth medium in 20 L batches and neurotoxins botulinum
A total of 200 L of bacterial culture due to a modification of the method described for type F neurotoxin?
Purified. For the final chromatographic step, the neurotoxin was
Dialyzed against .05M sodium succinate, pH 5.5, and separated with Sepharose S (Pharmacia
) Column (2.6 cm x 6 cm) and 200 ml of linear succinate buffered NaC
Elution was with a l gradient (0-0.3M). BoNTA is the major tamper that eluted during the NaCl gradient.
It is a crystalline peak and is transparent to 0.05M Hepes containing 0.15M NaCl, pH 7.4 (Hepes / NaCl).
Stored, aliquoted and stored at -80 ° C.
Example 3Purification of LH N fragment of type A neurotoxin
. 0.15M Tri containing 100 mM NaCl
Botulinum neurotoxin (40 mg in 15 ml) in s / HCl buffer, pH 8.0 was trypsinized (50 μm).
g / ml) at 20 ° C for 72-96 hours, 20 mM triethanol containing 100 mM NaCl.
Dialyzed against amine buffer pH 7.8, filtered (0.22 μm pore size), and then
, Chromatograph on Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) equilibrated with the latter buffer
(High-speed protein liquid chromatography system, Pharmacia). This
Column is washed with an additional 100 ml of triethanolamine buffer, and then
And H2L-fragment containing triethanolamine buffer containing 200 mM NaCl (20 mM
M, pH 7.8). The purified fragment (about 1.5 mg / ml) was added to trypsin
Adjust to 5 μg / ml with a hibitor and add 0.15 M Tris / HCl buffer containing 5 mM NaCl to pH 8.0.
It was dialyzed against and stored at -20 ° C.
Example 4
In the present study, when the inventors immunized mice with botulinum toxoid A
Enhanced Neutralizing Antibody Responses to Prime A Induce Proliferative T Cell Responses of the Invention
Was induced only in mice pre-primed with the 27-mer toxin A peptide. This
The result shows that priming at the T cell level using the peptide of the present invention was promoted.
Engineered antibody response, and thereby the duration of immunization and toxoid
Provides ample help to reduce unnecessary exposure to harmful side effects of vaccines
Indicates thatMaterials and methods mouse
Same as Example 1.Immunization
BALB / c mice were treated with 50 μg P1 / mouse in the presence of Freund's complete adjuvant.
Immunized subcutaneously on the flank. Animal booster for antigen in phosphate buffered saline
-Immune was given subcutaneously.Botulinum toxoid and toxin fragments H and L Preparation of
Same as Example 1.Radioimmunoassay
RIA to J. Exp. Med. As already mentioned in 162: 1304
I went to Briefly, 1 μg / ml botulinum in 0.1M carbonate buffer pH 9.6
Variable 96-well microtiter with 100 μl / well of toxoid or toxin
Iter plates (Falcon) were coated overnight at 4 ° C. The indicated dilution of serum and125
Rabbit anti-mouse Ig labeled with I was treated with 10% New born bovine serum and 0.05% Twee
Diluted in PBS containing n20. All washes were with PBS containing 0.05% Tween20.
Using. Wells were cut out and radioactivity was measured with a gamma counter.Peptide synthesis
Same as Example 1.Proliferation assay
All assays were performed in 96-well flat bottom tissue culture plates as described above.
It was done in a trio in To. Drained lymph nodes 7 to 14 after first boost
Obtained from mice on the day. Lymph node cell suspension with 2 mM L-glutamine, 2x10-FiveM 2
-ME, and 100 μl of Click's Eagle's high amino supplemented with 0.5% normal mouse serum
4 × 10 in acid mediumFiveCells / well were distributed. With or without trap
5% CO for each culture2Incubate for 4 days at 37 ° C in the atmosphere of
Between 1 μCi / well [3H] Thymidine (Amersham, Bucks)
, And harvested with a cell harvester.
Cell proliferation is SI [stimulation index = (c.p.m. with antigen) / (with antigen
C.p.m.)]]. SI values greater than 2.5 are considered significant.In vivo botulinum toxin neutralization assay
Same as Example 1.
resultResponse of proliferating T cells from mice immunized with P1
In the presence of Freund's complete adjuvant
Excreted lymph node cells from 3 mice immunized with P1 in
Were tested for the presence of proliferative T cell responses in E. coli. As shown in FIG. 3, the cells are BT
Responds well to xd A, L and to P1. Response to P1 is 50-2 μg / m
When a peptide concentration of 1 was used for stimulation, it was very strong with SI = 74-33. B
The response to Txd A and L was approximately 10 for the same concentration range of the two antigens used.
It was twice as low. Control peptide 2 (P2, amino acids 214-238) and tetanus gut
There was no response to xoid (TTXd).Priming with peptide 1 increases RIA antibody titers against H and Btxd A Ru
Mice were exposed to P1 in the presence of Freund's complete adjuvant prior to immunization with BTxdA.
Harvested after 10 and 21 days for H and BTxd A if pre-primed at
The RIA antibody titer of the sera obtained was determined using Freund's complete adjuvant alone.
4 to 10 times higher than that of the mouse, followed by BTxd A (Fig. 4).Enhanced antitoxin antibody response in mice primed with peptide P1.
Existence of P1
BT after pre-priming with Freund's complete adjuvant in the presence or absence of
Sera from mice immunized with xd A were able to neutralize botulinum toxin A.
Ru
Includes protective anti-toxin antibody. Importantly, 21 days after immunization with BTxdA, P1
Mice from the pre-primed group are better than mice not given the peptide
It had a 10-fold higher level of antitoxin antibody response (Table 5).Helper T cell epitopes are located in homologous regions of toxoids A, B, and E Ru
Excreted lymph node cells from P1-primed mice are in vitro
When stimulated with BTxd A, B, C, E, or F in Russia, BTxd A, B, and F
There is a strong proliferative T cell response to and a very weak response to BTxd C.
There was an answer. T cells did not respond to BTxd E. 3 overlapping 10-mer
Further mapping of Th epitopes using peptides from
(Table 6).
Therefore, priming with P1 was shown to enhance the BTxdA-induced enhanced anti-
It produces a body response. For BTxd B and F, and for C of limited size
In contrast, the response of cross-reactive T cells induced by P1 was such that immunization with P1
Potentially used to enhance the response and anti-botulinum toxin B, C, and F responses.
Suggest to be used. Therefore, the toxoid lacquer exemplified by BTxd A
Prior to immunization with different vaccines such as
Immunizing with the peptide enhances the antitoxin antibody response. Such a therapy is
Helps boost the immune response to the pseudovaccine, and thus of immunization
Duration and frequency, as well as
The side effects of exposure to the vaccine are also reduced.
The adjuvant used for priming was Complete Freund's Adjuvant (CFA
)Met.
As assessed from the results herein, the present invention is based on botulinum toxin.
Vaccine augmentation for the use of therapeutics to vaccinate against sickness
Agent, as well as caused by polypeptide toxins such as botulinum toxin
Provided is an improved method for vaccinating a subject against an illness.
The examples show that relatively small polypeptides up to only 27 amino acids
Vaccine enhancement for immunity against a toxin molecule of approximately 150,000 daltons
It shows how the basis of the agent can be provided. Effective in this embodiment
A particular amino acid sequence is that of an entire toxin polypeptide that is immunogenic.
Not only in the region, but the invention also includes other polypeptids of toxin molecules that are also immunogenic.
Regarding the Chid region. And the toxin molecule used to isolate the toxin from the rest was an antitoxin.
Although effective in stimulating antibody production, there is virtually no toxin activity.
Example 5Peptide and botulinum toxoid combination vaccine
An amount of peptide of the invention (eg, in the range of 0.1-50 μg / ml) and an amount
Vaccine consisting of botulinum toxoid (for example, in the range of 0.1 to 20 μg / ml)
Is a preservative, eg thimerisol (final concentration greater than 0.01%
In the presence of a suitable carrier, for example alhydrogel (alum) (final concentrate).
Degree not greater than 0.15 mg / ml aluminum). Once or that
Administration of the above doses (0.5 to 1 ml) can be carried out by various routes (eg, intramuscularly) at various intervals.
, Subcutaneously). The vaccine may also be used according to the invention with the botulinum vaccine present.
Can be made by mixing the absorbed peptides of
Example 6Two component vaccine
Component 1 is suitable as described above in Example 5 with or without a preservative.
It consists of a peptide of the invention absorbed on a sharp carrier. Ingredient 2 is a known botulinum
It consists of a vaccine. Administration of one or more doses of ingredient 1 is performed once of ingredient 2
Or more dose intervals (eg, 7-14 days) follow.
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フロントページの続き
(72)発明者 セサルディック，ドローシア
イギリス国 ハートフォードシャー イー
エヌ６ ３キュー６，サウス ミムズ，ブ
ランシュ レーン（番地なし），エヌアイ
ビーエスシー
(72)発明者 チャン，ウーン リン
イギリス国 ハートフォードシャー イー
エヌ６ ３キュー６，サウス ミムズ，ブ
ランシュ レーン（番地なし），エヌアイ
ビーエスシー
(72)発明者 ショーン，クリフォード チャールズ
イギリス国 ウィルスシャー エスピー４
０ジェイジー，サリスバリー，ポートン
ダウン（番地なし），ピーエイチエルエ
ス シーエイエムアール─────────────────────────────────────────────────── ───
Continued front page
(72) Inventor Cesar Dick, Drocia
United Kingdom Hertfordshire E
N 6 3 Cue 6, South Mims, B
Lansch Lane (No house number), NA
BS sea
(72) Inventor Chang, Woon Lin
United Kingdom Hertfordshire E
N 6 3 Cue 6, South Mims, B
Lansch Lane (No house number), NA
BS sea
(72) Inventor Sean, Clifford Charles
United Kingdom Willshire SP 4
0 Jay, Salisbury, Porton
Down (no address), PHE
Sushi AM