JPH08511508A - ボツリヌス毒素ポリペプチドおよびワクチン増強剤としてのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 短いポリペプチドは、代表的には７〜３５個のアミノ酸残基の範囲であり、それはボツリヌス毒素Ｔ細胞エピトープを含有し、そしてワクチン接種治療の一部として哺乳動物に投与するに有用である。ポリペプチドの投与に続いて、個体はトキソイドワクチンのような公知のボツリヌス毒素ワクチンに対して増強された応答を有する；従って、ワクチンの効果を改良し得そして増大し得る。ポリペプチド製剤およびワクチン接種の方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 ボツリヌス毒素ポリペブチドおよび ワクチン増強剤としてのその使用 本発明は、ボツリヌス中毒に対して患者にワクチン接種するために用いるワク チン増強剤として有用なポリペプチドに関する。本発明はまた、ポリペプチドを 含むワクチン、ワクチンと組み合わせたポリペプチドを用いてボツリヌス中毒に 対して患者にワクチン接種する方法、およびポリペプチドを含みそしてワクチン を任意に包含するキットに関する。 Clostrldium botulinumは、Ａ、Ｂ、Ｃ₁、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと表記される タイプの抗原的に区別される神経毒を生産する７つの嫌気性細菌株の１つの群で あり、神経毒は動物およびヒトに致死的な、極度に強力にシナプス前部に作用す る神経麻痺剤である。タイプＡ、Ｂ、Ｅ、およびＦのボツリヌス神経毒はヒトの 病気、食品媒介されたおよび初期のボツリヌス中毒の両方を起こすと証明されて いた。40年よりも長い間、ボツリヌストキソイドでの免疫を用いて、神経毒素と の接触によるボツリヌス中毒の危険から実験従事者を保護してきた。 公知のトキソイドワクチン調製の問題は、調製が比較的粗製でありそして所望 されない局所的および全身的反応を起こ すことである。Michigan Department of Public Healthにより製造された現在の ５価（ＡＢＣＤＥ）のトキソイドはまた、タイプＢに対して改良された応答を顕 著に誘起するが、タイプＡおよびＥ毒素に対して応答しない。さらに、長期間、 代表的には12〜25週間が、保護レベルを達成するために必要とされ、そして同じ 回数の免疫を受けた個体間での抗体力価の範囲は非常に広い。 他のワクチンの発達、ワクチン成分、およびボツリヌス毒素により引き起こさ れる病気に対して患者にワクチン接種するための方法が所望されている。 公知の例えば、５価のトキソイドの使用が必要である免疫化の回数を減少する ワクチン接種の方法の発達は、これにより所望されない反応が減少され得るとし て所望されている。 従って、本発明は一般に、ボツリヌス中毒に対して改良されたワクチン接種を 提供する問題に注意を向けている。 公知のワクチンおよびワクチン接種の方法におけるいくつかの不利益を克服す るおよび／または少なくとも緩和することが本発明の目的である。 本発明は、ポリペプチドの形態の現在のワクチンで遭遇した問題の解決を提供 し、これはボツリヌス毒素活性がないが、Ｔ細胞エピトープを含み、そしてボツ リヌストキソイドの連続投与に応答して、患者でＴ細胞増殖および抗ボツリヌス 毒素抗体の増強された生産を刺激し得る。本発明はまた、公知のワクチンと組み 合わせた本発明のポリペプチドの投与を包 含する方法の形態におけるワクチン接種方法に本来存在する問題の解決を提供す る。 本発明の第一の局面によれば、実質的にボツリヌス毒素活性のないポリペプチ ドが提供され、それは、ボツリヌストキソイドに応答して増殖するために哺乳動 物中でＴ細胞の集団をプライミング（初回免疫）する能力がある。「プライミン グ」により、最初にポリペプチドに曝すことは、続いてボツリヌストキソイドに 曝す反応が、最初にポリペプチドに曝さないボツリヌストキソイドとの反応と比 較して、増加する効果を有することを意味することを意図する。 第二の局面で、本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞エピトープを包含し、そして 続いてボツリヌストキソイドとの接触に曝すことに応答して増殖するためにＴ細 胞の集団をプライミングする能力がある：ポリペプチドは実質的に毒素活性がな い。 使用するポリペプチドの例として、ポリペプチドはボツリヌス毒素により起こ った病気の危険性に対して保護するためにヒトに投与される。ポリペプチドの効 果は、ボツリヌストキソイドにより感受性であるヒトの免疫系を作ることである 。このヒトは続いてある投与量のボツリヌストキソイドを与えられる。増加した 感受性は、ボツリヌス毒素に対して保護するトキソイドに対する増加した抗体の 形成を生じる。 従って、本発明のポリペプチドは、存在しているトキソイドワクチンの効果を 増強し得または増大し得る点で特に有利 である。さらに、このポリペプチドを用いることで援助されたワクチン接種は、 以前に可能であったよりも短時間で達成され得る。 本発明は、ボツリヌス毒素分子がある領域を含むことの発見に基づいており、 その領域は、毒素の残部からの単離物中で、続いてこの同じ領域との接触に対し て患者を感受性にするために用いられ得る。本発明は、ボツリヌストキソイドワ クチンの特性を増強するために働く感受性化領域の濃縮された非毒性供給源を提 供するために、この発見を利用する。 本発明の実施態様では、ポリペプチドは少なくとも１つのサブタイプのボツリ ヌス毒素に対応する配列と少なくとも50％の相同性の程度を有する35個のアミノ 酸の配列を含み、そしてボツリヌス毒素活性がなく、または長さが少なくとも７ 個のアミノ酸のそのサブフラグメントを含む。ポリペプチドフラグメントは好ま しくは長さが25個までのアミノ酸、そして最も好ましくは長さが18個までのアミ ノ酸である。 示したように、本発明により提供されたポリペプチドは７〜35個のアミノ酸の 特異的な配列を含み得る。従って、このような配列のみからなり得、または他の 配列に結合した若しくは別な方法で連結した７〜35個のアミノ酸の特定の配列か らなり得る。明らかにこのような他の配列は、ポリペプチドが全体としてボツリ ヌス毒素活性を有するようなことがあるべきではない。 本発明の特に好ましい実施態様では、ポリペプチドは７〜 35個のアミノ酸の配列からなり、すなわちポリペプチドは特定の配列の他に配列 を含まない。 本発明の実施態様では、ボツリヌス毒素に対応する配列との相同性の程度は、 少なくとも75％であり、そして好ましい実施態様では少なくとも90％である。さ らに好ましい実施態様では、相同性は少なくとも95％である。 本発明の第一および第二の局面のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列 を含むポリペプチド、または長さが少なくとも７個のアミノ酸残基の前記アミノ 酸配列のＮ末端フラグメントにより例示される。特に好ましい実施態様は、配列 番号１の７個のＮ末端アミノ酸からなる。本発明は、さらに、３個までの付加、 置換、または欠失を包含するこのようなアミノ酸配列（生じたポリペプチドは少 なくとも７個のアミノ酸長であることが提供される）を含む。 本発明のこのようなポリペプチドでは、多くて２個のアミノ酸が置換、付加、 または欠失されることが特に好ましく、そして非常に好ましくは０または１個の アミノ酸が置換、付加、または欠失される。 配列番号１のポリペプチド配列に対する置換は、どのアミノ酸も他のアミノ酸 に置換し得るが、好ましくは以下の表に従ってなされる。 本発明のおよび配列番号１に基づくポリペプチドは、好ましくは長さが30個ま でのアミノ酸である。 本発明の第三の局面によれば、適切な薬学的な賦形剤または担体との組み合わ せで本発明の第一または第二の局面のいずれかによるポリペプチドを含む、ボツ リヌス中毒に対して患者にワクチン接種するために用いるワクチン増強剤が提供 される。 本発明の第三の局面の実施態様では、ワクチン増強剤は、 例えば５価（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）のトキソイドワクチンのような公知のボツリ ヌストキソイドワクチンをさらに包含する。 本発明の第四の局面によれば、以下の工程を包含する、ボツリヌス中毒に対し て哺乳動物にワクチン接種する方法が提供される： （１）哺乳動物に本発明に従って第一回目のポリペプチドを投与する工程、お よび （２）該哺乳動物に公知のボツリヌストキソイドワクチンを含む第二回目のワ クチンを連続または同時に投与する工程。 本発明の第四の局面の他の一つの方法は、公知のボツリヌストキソイドワクチ ンを最初に投与することであり、そして本発明の第三の局面のポリペプチドを続 いて投与することである。 本発明の第五の局面では、本発明のポリペプチドの供給と一緒に公知のボツリ ヌストキソイドワクチンの供給を包含する、ボツリヌス中毒に対して患者にワク チン接種するためのキットが提供される。 本発明の第六の局面によれば、以下の工程を包含するポリペプチド毒素により 起こった病気に対して哺乳動物にワクチン接種する方法が提供される： （１）実質的に毒素活性のないポリペプチドを包含するワクチン増強剤を患者 へ投与する工程、ここで、このポリペプチドはＴ細胞のエピトープを含みそして 毒素でまたは化学的に脱活性化した毒素で続いてチャレンジ（抗原投与）した患 者 の抗毒素抗体力価を増加する能力がある、および （２）毒素または化学的に脱活性化した毒素を患者へ連続投与する工程。 本発明のポリペプチドは、容易に合成され得、そしてそのことによりボツリヌ ス中毒に対して哺乳動物にワクチン接種に用いるために高純度で利用可能な点で 有利である。 ボツリヌス毒素は約150,000ダルトンの分子量を有するので、本発明のポリペ プチドは、比較的非常に短い分子でありそしてボツリヌス毒素活性がなく、ワク チン接種した被験者にボツリヌス中毒を起こさない。 本発明の例として実施態様の説明を以下に示す： 図１は、ボツリヌストキソイドに対するＥＬＩＳＡ抗体応答を示す。 図２は、毒素に対するＥＬＩＳＡ抗体応答を示す。 抗体力価は、ボツリヌストキソイドのみ（四角）で；トキソイドおよびミョウ バン（丸）で；およびミョウバンのみ（三角）で免疫したマウスの３つの群から 得た血清についてアッセイした。 図３は、P1、本発明のポリペプチドで免疫したマウスの増殖性Ｔ細胞の応答を 示す。値は平均±１SEM、Ｎ＝３である。用いた刺激性抗原は、med、培地コント ロール；PHA、フィトヘマグルチニン；TTxd、破傷風トキソイド；Btxd A、ボツ リヌストキソイドＡ；L、Btxd AのＬ鎖であった。刺激のために 用いた抗原濃度は、２μg/ml（斜線、左下から右上）、10μg/ml（斜線、左上か ら右下）、および50μg/ml（白抜きの枠）であった。 図４はP1でプライミングすることの抗体応答への効果を示す。結果は、アジュ バントコントロールで予めプライミングしたBtxd Aでの免疫の10日後の応答（白 抜きの枠）、および同様の21日後（斜線、右上から左下）、およびP1で予めプラ イミングした同様の免疫の10日後の応答（斜線、左上から右下）および次いで21 日後（水平な線）を示す。 実施例１ ５価のボツリヌストキソイド（Ａ〜Ｅ）ワクチンで免疫化した３人のヒトドナ ーは、トキソイドＡおよびボツリヌス毒素Ａ（BoNT/A）の合成的に開裂されたフ ラグメントＬ、Ｈ、およびＬ-Ｈ_Nに対する強い増殖性Ｔ細胞応答を示した。毒素 のＮ末端領域の27マーペプチド（配列番号１に示されたアミノ酸２9〜54）はま た３人のうちの２人のドナーのＴ細胞によって認識された。このようなＴ細胞の 応答の重要性は、ミョウバンの存在下または非存在下でトキソイドＡで免疫され たマウスでさらに研究された。ネズミＴ細胞はまた、トキソイド、BoNT/Aフラグ メントおよびアミノ酸29〜54のペプチドを認識した。このような増殖性Ｔ細胞応 答は、アジュバントとしてのミョウバンの存在により増大される。トキソイドＡ で免疫した数匹のマウスから得た抗体は、インビトロでボツリヌス毒 素Ａを中和することおよびインビボで連続注射で神経毒性に対してマウスを保護 することが可能であった。保護抗体力価は、ミョウバンなしよりもミョウバンと ともにトキソイドを与えた群で７倍高かった。ミョウバンなしの群と比較してミ ョウバンとともにトキソイドを与えた群では、ＥＬＩＳＡ抗毒素抗体応答に10倍 の増加があったが、トキソイドに対するＥＬＩＳＡ抗体力価での違いは群の間に 検出されず、これはまさに抗毒素抗体応答が増大されることを示す。従って、Ｔ 細胞応答をともなう高い（７〜10倍）保護抗毒素応答の共誘導は、効果的な保護 が、強いＴおよびＢ細胞応答の共誘導を必要とすることを示唆する。 材料および方法マウス ８〜10週齢の間のメスBALB/cマウスをNIBSCで飼育した。18〜20gの間の 体重のメスMF1マウスをHarland Olac（Bicester，Oxon，UK）から得た。免疫 BALB/cマウスをマウス１匹あたり10μgのボツリヌストキソイドタイプＡ で脇腹および足蹠に皮下に免疫した。水酸化アルミニウムをアジュバントとして 用いた場所で、Alhydrogel（Superfos Vedbaek，Sweden）の１：10希釈を混合し 、そして使用する前にリン酸緩衝化生理食塩水中でトキソイドとともに４℃で一 晩インキュベートした。動物を２週間後にブースター免疫（追加免疫）し、続い てその４週間後に二回目のブースターを行った。ボッリヌストキソイドおよび毒素フラグメントＨ、Ｌ、およびＬ-Ｈ_Nの調製 ボツリヌス毒素タイプＡをClostridium botulinumタイプＡ（Ａ7272）の48時 間の培養上清20リットルから酸沈澱により、続いてアフィニティークロマトグラ フイー（ShoneによるEur．J．Biochem 151:75-82に記載のとおり）により精製し た。このようにして得た神経毒素は比活性1.5〜２×10⁸LD₅₀/mgを有した。この 毒素を0.2％ホルムアルデヒドとともに37℃で25日間インキュベートすることに より解毒した。生じたトキソイドを、0.2M NaClを含むHEPES緩衝液（0.O5M、pH7 .4）に対して大量に透析して、使用前に過剰なホルムアルデヒドを除去した。タ ンパク質濃度を、標準として結晶ウシ血清アルブミン（画分Ｖ、SIGMA）を用い て、Bradford（Anal．Biochem．72:248-254）の方法により測定した。 ボツリヌス毒素（BoNT/A）の重（Ｈ）および軽（Ｌ）鎖フラグメントを上記の とおりいくらか改変して調製した。簡単にいえば、ホウ酸／リン酸緩衝液（0.05 M、pH8.5）中の0.5mgの精製されたボツリヌス毒素を、同じ緩衝液で予め平衡化 した3mlのQAE Sephadex A50（Pharmacia）カラムに載せ、そしてカラムを10mMジ チオスレイトール（DTT）を含有する約20mlのホウ酸／リン酸緩衝液で洗浄した 。次いで、カラムの空隙容量と等量のホウ酸／リン酸緩衝液中の10OmM DDTおよ び２M尿素の１容量を、カラムにかけて、そして全体を４℃で一晩インキュベー トした。フラグメントＬを４℃でホウ酸／リン酸緩衝液中の 10mM DDT、２M尿素で溶出した。続いてフラグメントＨをホウ酸／リン酸緩衝液 中の0.2M塩化ナトリウムで溶出した。両方のタンパク質フラグメントを別々に集 収し、そして0.15M塩化ナトリウムを含有するHEPES緩衝液（0.05M、pH7.4）で大 量に透析した。 ボッリヌス毒素の105kDaのＬ-Ｈ_Nフラグメントを本質的に上記のように調製し た。簡単に説明すると、精製した毒素をリン酸生理食塩緩衝液（0.15M NaCl、 0 .05Mリン酸ナトリウムpH8.0）中の50μg/mlトシルフェニルアラニンクロロメタ ン処理したトリプシンを用いて20℃で72時間処理した。消化物を、１mlのトリプ シンインヒビター−アガロースリン酸／生理食塩緩衝液の上に層積した２mlのα₂ -マクログロブリン-アガロースからなるカラム上でクロマトグラフを行った。 リン酸／生理食塩緩衝液で溶出した主な画分をプール、濃縮しそして同じ緩衝液 で予め平衡化したSephadex G200（Pharmacia）カラム上で再度クロマトグラフを 行った。Ｌ-Ｈ_Nを含む最初のタンパク質ピークからの画分を集収しそしてプール した。ELISAアッセイ ELISAアッセイを前記（Voller、Bull．World Health Organisat ion 53:55-65）のとおり行った。簡単に説明すると、0.1M炭酸緩衝液pH9.6中に １μg/mlで100μl/ウェルのボツリヌストキソイドまたは毒素を用いて、96ウェ ルマイクロタイタープレート（Nunc、maxi sorb）を４℃で一晩コートした。示 された希釈の血清およびウサギ抗マウスIgとペルオキシダーゼの結合体（１:500 0、SIGMA）を0.05％ Tween20を含 有するPBSで希釈した。全ての洗浄は、0.1％脱脂粉乳および0.05％ Tween20を含 有するPBSを用いた。用いた酵素基質は、過酸化水素とともに2,2'-アジノ-ビス( 3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸(SIGMA))であり、そしてO.D.示数をAn thos ELISAプレートリーダーモデル2001（Anthos Labtec Instruments，Austria ）を用いて405nmで測定した。ペプチドの合成 ペプチドを、Applied Biosystems' FastMoc^TM化学を用いる、 自動固相ペプチド合成機（モデル431A、Applied Biosystems Inc.、Foster City 、CA.）を用いて合成した。ペプチドを、予めロードしたp-ベニロキシベンジル アルコール樹脂または4-(2',4'-ジメトキシフェニルFmoc-アミノメチル)-フェノ キシ樹脂（Novabiochem(UK)Ltd.）のいずれかの上で合成し、そしてHPLC分析に より純度を調べた。増殖アッセイ 全てのアッセイを、前記（Chan、Immunology.68:96-101）のとお り、96ウェル平底組織培養プレートで３つ組で行った。排出されている（draini ng）リンパ節を第二回目のブースト後７日目にマウスから得た。リンパ節細胞懸 濁液を、２mM L-グルタミン、２×10^-5M 2-ME、および0.5％正常マウス血清を追 加した100μlのClick'ｓ Eagle's高アミノ酸培地中に４×10⁵細胞／ウェルで分 配した。ヒトドナーは、５価のボツリヌストキソイドワクチンでワクチン接種さ れた健康な男性および女性である。ヒト非分画単核細胞を、曲がっているガラス 棒で線維素除去（defribrination）した後、lymphoprep（Nyegaard and Co.，Os lo，Norway）を通して勾配遠心分 離により末梢血から得、そして２mM L-グルタミン、２×10^-5M 2-MEおよび12.5 ％自己血清を追加したRPMI-1640培地100μl中に２×10⁵細胞／ウェルで分配した 。抗原をともなうまたはともなわない各培養物を、５％ＣＯ₂の雰囲気中37℃で マウス細胞では４日間、ヒト細胞の場合は５日間インキュベートし、最後の18時 間で１μＣｉ／ウェルの［³H］チミジン（Amersham、Bucks）を用いてパルスし 、そして細胞ハーベスターで採集した。インビボでのボツリヌス毒素中和アッセイ トキソイドＡで免疫したマウスの血 清中のボツリヌス抗毒素の効力をボツリヌス抗毒素の標準調製物（タイプＡ抗毒 素についてのＷＨＯInternational Standard、IU＝0.136mgタンパク質で500IU/ アンプル）に対する滴定により決定し、ボツリヌス毒素の固定した投与量（50LD₅₀ ）と同じ程度の保護を得た。各群の３匹のマウス各々から等量の血清をプール し、そしてゼラチンリン酸緩衝液（0.2％ゼラチンを含む0.05Mリン酸ナトリウム 緩衝液pH6.5）に１：100希釈した。次いで、希釈した血清または参照用の抗血清 （0.5IU/ml）の段階に分けた容量を、4.5ml／抗体希釈／４匹のマウスの群の最 終容量になるまで、ボツリヌス毒素の固定した濃度（50LD₅₀／マウスの投与量を 送達するために計算された）とそれぞれに混合した。MF1マウス毎に1mlを腹腔内 に注射する前に、混合物を室温で１時間インキュベートした。動物を４日間にわ たって神経毒性の徴候について観察した。ヒト血清試料の効力についてのアッセ イは、ボツリヌス 毒素Ａの投与量が10LD₅₀／マウスでありそして参照用の抗血清の用いた濃度が0. 1U/mlであること除いて、本質的には同じである。 以下の結果を得た。ボツリヌストキソイドでワクチン接種したヒトにおける増殖性Ｔ細胞の応答 ３ 人の個体をインビトロで増殖性Ｔ細胞応答についての刺激性抗原の存在下で試験 する前に、２（ＶＫ）または３回（ＤＳおよびＭＪＣ）の５価のボッリヌストキ ソイドワクチンでワクチン接種した。表２に示すように、全ての３人の個体から の細胞は、ボツリヌストキソイド（BTxd）ならびにBoNT/AフラグメントＨおよび Ｌによく応答した；ＭＪＣのＴ細胞は他の２個体のＴ細胞よりも非常に強い応答 を示す。Ｔ細胞のどれもコントロールタンパク質であるウシ血清アルブミン（BS A）に応答しなかった。しかし、５つのペプチドが、各27マー長でありそして毒 素のフラグメントＬのアミノ酸配列（ペプチド１および２）（配列番号１、配列 番号２）またはフラグメントＨのアミノ酸配列（ペプチド３〜５）（配列番号３ 〜配列番号５）から合成され、刺激性抗原として用いられる場合、ペプチド１（ ボツリヌス毒素Ａのアミノ酸２８〜５３にわたる）は、２個体からのＴ細胞によ り認識された。ペプチド１に対するＶＫからの増殖性Ｔ細胞の応答は非常に強い が、ＶＫはＤＳより１回免疫化が少ないにもかかわらず、より弱い応答がＤＳか らの細胞で検出された。ＭＪＣのＴ細胞は、ペプチド４およびより小さい長さの ペプチド３を認識した。マウスにおける増殖性Ｔ細胞の応答 アジュバントとしてのミョウバンの存在下 でボツリヌストキソイドタイプＡで免疫したBALB/cマウスは、ミョウバンなしで 免疫されたマウスよりもボツリヌストキソイド（BTxd）、BoNT/AフラグメントＬ 、Ｈ、およびＬ-Ｈ_Nに対して、インビトロで増殖性Ｔ細胞のより強い応答を示し た（表３）。ミョウバンだけ与えられたコントロールマウスからの細胞は、イン ビトロでいかなる抗原に対しても応答しなかった。さらに、ヒトＴ細胞のように 、ネズミＴ細胞もまたペプチド１（アミノ酸29〜54）を認識した；この応答はミ ョウバンの非存在下よりも存在下でトキソイドで免疫したマウスで顕著に強い。トキソイドおよび毒素に対するＥＬＩＳＡ抗体の応答 ミョウバンの存在下また は非存在下てトキソイドで免疫したマウスからの血清のボツリヌストキソイド、 Ｌ、およびＨに対するＥＬＩＳＡ抗体力価に顕著な違いはなかった（図１）。し かし毒素について試験した場合、ＥＬＩＳＡ抗体力価はミョウバンとともにトキ ソイドを与えた群で10倍高かった（図２）。毒素に対する保護抗体の応答 ミョウバンの存在下または非存在下でトキソイド Ａで免疫したマウスの群からの血清は、毒素を中和することができる保護抗毒素 抗体を含む。重要なことに、ミョウバンの存在下でトキソイドで免疫した群から のマウスは、ミョウバンを与えなかったものより７倍高いレベルの抗毒素抗体の 応答を有した（表４）。 保護抗毒素抗体のレベルをまたヒト血清で測定した。たと えＶＫがたった２回のワクチン接種を受けただけでも、彼女は最も高い中和抗毒 素抗体を有したが、ＤＳは３回のワクチン接種にもかかわらす最も低い力価を有 した（表４）。 実施例２Clostridium botulinum神経毒素Ａの精製 Clostridium botulinumタイプＡ（72 72株）をＵＳＡ２増殖培地で20Lバッチで増殖し、そして神経毒素をボツリヌス タイプＦ神経毒素について記載された方法の改変により総計200Lの細菌培養物か ら精製した。最終のクロマトグラフィーの段階については、神経毒素を、101、0 .05Mコハク酸ナトリウム、pH5.5に対して透析し、そしてSepharose S(Pharmacia )のカラム（2.6cm×６cm）の上に載せ、そしてコハク酸緩衝液で200mlの直線NaC l勾配（０〜0.3M）で溶出した。BoNTAは、NaCl勾配の間に溶出した主要なタンパ ク質ピークであり、0.15M NaClを含む0.05M Hepes、pH7.4(Hepes/NaCl)に対し透 析し、分割しそして-80℃で保存した。 実施例３タイプＡ神経毒素のＬＨ_Nフラグメントの精製 。100mM NaClを含有する0.15M Tri s/HCl緩衝液、pH8.0中のボツリヌス神経毒素（15ml中40mg）をトリプシン（50μ g/ml）で20℃にて72〜96時間処理し、100mM NaClを含有する20mMトリエタノール アミン緩衝液pH7.8に対し透析し、濾過し（0.22μmの孔サイズ）、そして次いで 、後者の緩衝液で平衡化したMono Q（HR 10/10、Pharmacia）でクロマトグラフ （高速プロテインリキッドクロマトグラフィーシステム、Pharmacia）した。こ のカラムをさらに100mlのトリエタノールアミン緩衝液で洗浄し、そして次い でＨ₂Ｌフラグメントを200mM NaClを含有するトリエタノールアミン緩衝液（20m M、pH7.8）で溶出した。精製したフラグメント（約1.5mg/ml）をトリプシンイン ヒビターで５μg/mlにし、５mM NaClを含有する0.15M Tris/HCl緩衝液、pH8.0に 対して透析し、そして-20℃で保存した。 実施例４ 本研究では、発明者らがボツリヌストキソイドＡでマウスを免疫した場合、毒 素Ａに対する増強した中和抗体の応答は、増殖性Ｔ細胞の応答を誘導する本発明 の27マーの毒素Ａペプチドで予めプライミングしたマウスでのみ誘起された。こ の結果は、本発明のペプチドを用いるＴ細胞レベルでのプライミングが、促進さ れた抗体の応答を操作して、そしてそれにより、免疫化の期間およびトキソイド ワクチンの有害な副作用に不必要に曝すことが減少するための十分な助けを提供 することを示す。材料および方法 マウス 実施例１と同様。免疫化 BALB/cマウスを、Freund's完全アジュバントの存在下で50μg P1／マウ スで脇腹の皮下に免疫した。動物をリン酸緩衝化生理食塩水中の抗原のブースタ ー免疫を皮下に行った。ボツリヌストキソイドおよび毒素のフラグメントＨおよびＬ の調製 実施例１と同様。ラジオイムノアッセイ ＲＩＡをJ．Exp．Med．162:1304に既に記載されたとお りに行った。簡単に説明すれば、0.1M炭酸緩衝液pH9.6中１μg/mlのボツリヌス トキソイドまたは毒素の100μl／ウェルを用いて、可変性の96ウェルマイクロタ イタープレート（Falcon）を４℃で一晩コートした。示された希釈の血清および¹²⁵ Ｉで標識されたウサギ抗マウスIgを10％New bornウシ血清および0.05％ Twee n20を含有するPBSで希釈した。全ての洗浄は、0.05％ Tween20を含有するPBSを 用いた。ウェルを切り出しそして放射活性をガンマカウンターで測定した。ペプチドの合成 実施例１と同様。増殖アッセイ 全てのアッセイは、前記のとおり、96ウェル平底組織培養プレー トで３つ組で行われた。排出されているリンパ節を第一回目のブースト後７〜14 日目にマウスから得た。リンパ節細胞懸濁液を２mM L-グルタミン、２×10^-5M 2 -ME、および0.5％正常マウス血清を追加した100μlのClick's Eagle's高アミノ 酸培地中に４×10⁵細胞／ウェルで分配した。抗原をともなうまたはともなわな い各培養物を５％ＣＯ₂の雰囲気中37℃で４日間インキュベートし、最後の18時 間で１μＣｉ／ウェルの［³H］チミジン（Amersham、Bucks）を用いてパルスし 、そして細胞ハーベスターで採集した。 細胞増殖はＳＩ［刺激インデックス＝（抗原をともなうc.p.m.）／（抗原をと もなわないc.p.m.）］で表される。2.5より大きいＳＩ値が有意と考えられる。インビボでのボツリヌス毒素中和アッセイ 実施例１と同様。 結果P1で免疫したマウスの増殖性Ｔ細胞の応答 Freund's完全アジュバントの存在下 でP1で免疫した３匹のマウスからの排出されているリンパ節細胞を、インビトロ での増殖性Ｔ細胞の応答の存在について試験した。図３に示すように、細胞はBT xd Ａ、Ｌによく応答し、そしてP1に応答した。P1に対する応答は、50〜２μg/m lのペプチド濃度を刺激のために用いた場合、ＳＩ＝74〜33で非常に強かった。B Txd ＡおよびＬに対する応答は、用いた２つの抗原の同じ濃度範囲について約10 倍低かった。コントロールペプチド２（P2、アミノ酸214〜238）および破傷風ト キソイド（TTXd）に対する応答がなかった。ペプチド１でのプライミングはＨおよびBtxd Aに対するＲＩＡ抗体力価を増大す る マウスを、BTxd Ａでの免疫化前にFreund's完全アジュバントの存在下でP1 で予めプライミングした場合、ＨおよびBTxd Ａに対して10および21日後に採取 した血清のＲＩＡ抗体力価は、Freund's完全アジュバントのみを与えたコントロ ールマウスのものよりも４〜10倍高く、BTxd Ａが続く（図４）。ペプチドP1でプライミングしたマウスでの促進された抗毒素抗体の応答 P1の存 在または非存在下で、Freund's完全アジュバントで予めプライミングした後、BT xd Ａで免疫したマウスからの血清は、ボツリヌス毒素Ａを中和することが出来 る 保護抗毒素抗体を含む。重要なことには、BTxd Ａでの免疫化の21日後に、P1で 予めプライミングした群からのマウスは、ペプチドを与えなかったマウスよりも 10倍高いレベルの抗毒素抗体の応答を有した（表５）。ヘルパーＴ細胞のエピトープはトキソイドＡ、Ｂ、およびＥの相同領域に存在す る P1でプライミングしたマウスからの排出されているリンパ節細胞がインビト ロでBTxd Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、またはＦで刺激される場合、BTxd Ａ、Ｂ、およびＦ に対して強い増殖性Ｔ細胞の応答があり、そしてBTxd Ｃに対して非常に弱い応 答があった。Ｔ細胞はBTxd Ｅに対して応答しなかった。10マーが重複する３つ のペプチドを用いたThエピトープのさらなるマッピングは、アミノ酸29〜43の中 に位置することを示す（表６）。 従って、P1でプライミングすることは、BTxd Ａにより誘導された増強した抗 体応答を生じる。BTxd ＢおよびＦに対する、ならびに限定された大きさのＣに 対する、P1により誘導された交叉反応性Ｔ細胞の応答は、P1での免疫化が、抗Ａ 応答ならびに抗ボツリヌス毒素Ｂ、Ｃ、およびＦの応答を増強するに潜在的に使 用されることを示唆する。従って、BTxd Ａにより例示されるトキソイドワクチ ンのような異なったワクチンでの免疫化前に、Thエピトープを含有する本発明の ペプチドで免疫することは、抗毒素抗体応答を増強する。このような療法はトキ ソイドワクチンに対する免疫応答をブーストすることを助け、従って、免疫化の 継続時間および回数、ならび にワクチンに曝すことによる副作用もまた減少させる。 プライミングのために用いたアジュバントは完全Freund'ｓアジュバント（CFA ）であった。 本明細書中の結果から評価されるように、本発明は、ボツリヌス毒素により起 こされた病気に対してワクチン接種するための治療の使用のためのワクチン増強 剤を提供し、ならびにボツリヌス毒素のようなポリペプチド毒素により起こされ た病気に対して被験者にワクチン接種するための改良された方法の提供する。 実施例は、長さがほんの27アミノ酸までの比較的小さなポリペプチドが、分子 量約150,000ダルトンの毒素分子に対して生じる免疫性についてのワクチン増強 剤の主薬（basis）をどのように提供し得るかを示す。この実施例で効果のある 特定のアミノ酸配列は、免疫原性である全体の毒素ポリペプチドの 領域のみではなく、そして本発明はまた免疫原性である毒素分子の他のポリペプ チド領域に関する。そして、毒素の残部からの単離に用いた毒素分子は、抗毒素 抗体の生産を刺激するに有効であるが、毒素活性は実質的にない。 実施例５ペプチドおよびボツリヌストキソイドの組み合わせワクチン 本発明のある量のペプチド（例えば、0.1〜50μg/mlの範囲で）およびある量 のボツリヌストキソイド（例えば、0.1〜20μg/mlの範囲で）からなるワクチン は、保存剤、例えばチメリソール（thimerisol）（最終濃度が0.01％より大きく ない）の存在下で適切な担体、例えば、アルヒドロゲル（ミョウバン）（最終濃 度が0.15mg/mlアルミニウムより大きくない）の上で吸収した。１回またはそれ 以上の用量（0.5〜１ml）の投与は、種々の間隔で種々の経路（例えば、筋肉内 、皮下）による。ワクチンはまた、存在するボツリヌスワクチンとともに本発明 の吸収されたペプチドを混合することにより作られ得る。 実施例６２成分ワクチン 成分１は、実施例５に前述のとおり、保存剤をともなうまたはともなわない適 切な担体に吸収された本発明のペプチドからなる。成分２は、公知のボツリヌス ワクチンからなる。成分１の１回またはそれ以上の用量の投与は、成分２の１回 またはそれ以上の用量による間隔（例えば、７〜14日）の後に続く。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 セサルディック，ドローシア イギリス国 ハートフォードシャー イー エヌ６ ３キュー６，サウス ミムズ，ブ ランシュ レーン（番地なし），エヌアイ ビーエスシー (72)発明者 チャン，ウーン リン イギリス国 ハートフォードシャー イー エヌ６ ３キュー６，サウス ミムズ，ブ ランシュ レーン（番地なし），エヌアイ ビーエスシー (72)発明者 ショーン，クリフォード チャールズ イギリス国 ウィルスシャー エスピー４ ０ジェイジー，サリスバリー，ポートン ダウン（番地なし），ピーエイチエルエ ス シーエイエムアール

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ボツリヌス毒素に対して哺乳動物にワクチン接種するために用いるワクチン 増強剤であって、（ａ）ボツリヌス毒素活性がない、（ｂ）ボツリヌス毒素Ｔ細 胞エピトープを含有する、および（ｃ）ボツリヌストキソイドに応答して増殖す るためにＴ細胞をプライミングする、ポリペプチド；および薬学的に受容可能な 担体を含有するワクチン増強剤。 ２．前記ポリペプチドが、ボツリヌストキソイドの連続投与の応答に続き、抗体 を生産するためにＢ細胞を刺激するＴ細胞をプライミングすることでさらに特徴 づけられる、請求項１に記載のワクチン増強剤。 ３．前記ポリペプチドがＴ細胞を刺激し、抗体を生産するためにＢ細胞を刺激す ることでさらに特徴づけられる、請求項１または２に記載のワクチン増強剤。 ４．前記ポリペプチドが７から３５個のアミノ酸の配列を含み、該配列が少なく とも１つのサブタイプのボツリヌス毒素に対応する配列と少なくとも５０％の相 同性の程度を有し、そしてボツリヌス毒素活性がない、上記いずれかの請求項に 記載のワクチン増強剤。 ５．前記ポリペプチドが前記配列の２５アミノ酸までを含む、請求項４に記載の ワクチン増強剤。 ６．前記相同性の程度が少なくとも７５％である、請求項４または５に記載のワ クチン増強剤。 ７．前記ポリペプチドが前記７から３５個のアミノ酸の配列からなる、請求項４ 、５、または６に記載のワクチン増強剤。 ８．前記ポリペプチドが以下のアミノ酸配列： あるいは、そのＮ末端フラグメントまたは３個までの付加、置換、または欠失を 含む変異Ｎ末端フラグメントを含み、該変異フラグメントは、長さが少なくとも ７アミノ酸であり、該変異フラグメントがボツリヌス毒素Ｔ細胞エピトープを含 み、そしてボツリヌストキソイドに応答して増殖するためにＴ細胞をプライミン グすることを提供する、上記いずれかの請求項に記載のワクチン増強剤。 ９．前記ポリペプチドが７個のＮ末端アミノ酸からなるフラグメントである、請 求項８に記載のワクチン増強剤。 １０．ポリペプチド置換が以下の表により作成される、請求項８に記載のワクチ ン増強剤： １１．２個までのアミノ酸が置換、付加、または欠失される、請求項１０に記載 のワクチン増強剤。 １２．０または１個のアミノ酸が置換、付加、または欠失される、請求項１０に 記載のワクチン増強剤。 １３．前記ポリペプチドが３５個までのアミノ酸からなる、 上記いずれかの請求項に記載のワクチン増強剤。 １４．ボツリヌス毒素に対して哺乳動物にワクチン接種するためのワクチンであ って、請求項１〜１３のいずれかに記載のワクチン増強剤およびボツリヌストキ ソイドワクチンを含む、ワクチン。 １５．以下の工程を包含する、ボツリヌス中毒に対して哺乳動物にワクチン接種 する方法： （１）該哺乳動物に請求項１〜１４のいずれかに記載のワクチン増強剤またはワ クチンを投与する工程、および （２）該哺乳動物にボツリヌストキソイドワクチンを含むワクチンを連続または 同時に投与する工程。 １６．以下の工程を包含する、ボツリヌス中毒に対して哺乳動物にワクチン接種 する方法： （１）該哺乳動物にボツリヌストキソイドワクチンを含む第一回のワクチンを投 与する工程、および （２）該哺乳動物に請求項１〜１４のいずれかに記載のワクチン増強剤またはワ クチンを連続投与する工程。 １７．前記トキソイドワクチンが５価のボツリヌス（Ａ−Ｅ）トキソイドワクチ ンである、請求項１５または１６に記載の方法。 １８．請求項１〜１３のいすれかに記載のワクチン増強剤の供給およびボツリヌ ストキソイドワクチンの供給を包含する、ボツリヌス毒素に対して患者にワクチ ン接種するためのキット。 １９．（ａ）ボツリヌス毒素活性がなく、（ｂ）ボツリヌス毒素Ｔ細胞エピトー プを含有し、（ｃ）ボツリヌストキソイドに応答して増殖するためにＴ細胞をプ ライミングし、そして（ｄ）３５個までのアミノ酸からなる、ことで特徴づけら れる、ポリペプチド。 ２０．ボツリヌス毒素に対して哺乳動物にワクチン接種するに用いるための、単 独またはボツリヌストキソイドと組み合わせる、請求項１９に記載のポリペブチ ド。 ２１．ボツリヌス中毒に対して哺乳動物にワクチン接種するための薬剤の製造に おける、請求項１９に記載のポリペプチドの使用。