JPH08511683A

JPH08511683A - Transgenic flowering plant

Info

Publication number: JPH08511683A
Application number: JP7500014A
Authority: JP
Inventors: アルバートホルトン，ティモシー; 良和田中
Original assignee: インターナショナルフラワーディベロップメンツプロプライアタリーリミティド
Priority date: 1993-05-20
Filing date: 1994-05-20
Publication date: 1996-12-10
Also published as: SG45175A1; WO1994028140A1; EP0703982A1; EP0703982A4; KR100337755B1; CA2163220A1; PL311691A1; NZ266401A; CN1127015A; PL177743B1

Abstract

(57)【要約】本発明は一般的に、トランスジェニック花舟植物に関する。さらに具体的には、本発明は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼの発現が可能なように遺伝的に修飾されそれによってフラボノイド経路の中間体の操作が可能となったトランスジェニックバラ、カーネーション及びキクに向けられる。 (57) [Summary] The present invention generally relates to transgenic flower florets. More specifically, the present invention relates to transgenic roses, carnations that have been genetically modified to allow the expression of flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase, thereby allowing manipulation of intermediates in the flavonoid pathway. And turned to chrysanthemum.

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニック顕花植物本発明は、一般に、トランスジェニック顕花植物に関する。さらに詳しくは、本発明は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼを発現できるように遺伝的に変更され、これによりフラボノイド経路における中間体の操作を可能とする、トランスジェニックのバラ、カーネーションおよびキク植物に関する。花弁の産業は、病気および病原体への耐性から改変された花序にわたる改良された特性をもつ、新しくかつ異なる品種の顕花植物を開発するために努力している。古典的な品種改良技術は多少の成功をもって使用されてきているが、このアプローチは特定の種の遺伝子プールの拘束により制限されてきた。例えば、有色の品種の完全なスペクトルを有することは、単一の種について稀である。したがって、所望の特性を示すトランスジェニック植物を発生させる試みに対して実質的な努力が払われてきた。主要な切り花の種、例えば、バラ、カーネーションおよびキクの青色の品種の開発は、切り花および観賞植物の両方のマーケットにおいて有意な機会を提供するであろう。花の色は主として２種類の色素：フラボノイド類およびカロテノイド類によっている。フラボノイド類は黄色から赤色から青色の色の範囲に寄与する。カロテノイド類はオレンジ色または黄色の色合いを付与し、そして一般に黄色またはオレンジ色の花の唯一の色素である。花の色の主要な寄与を構成するフラボノイド分子は、シアニジン、デルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジンおよびペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であるアントシアニン類であり、そして液胞の中に位置する。異なるアントシアニン類は色の顕著な差を生成することができる。花の色はまた、無色のフラボノイド類とのコピグメント化、金属との錯体形成、グリコシル化、アシル化、メチル化および液胞のpHにより影響を受ける（Forkmann，1991）。フラボノイド色素のための生合成経路（以後「フラボノイド経路」と呼ぶ）はよく確立されており、そして第１図に示す（EbelおよびHahlbrock，1988；Hahlb rockおよびGriscbach，1979；Wieringおよびde Vlaming，1984；Schramら、1984 ；Stafford，1990）。この経路において最初の行われるステップは３分子のマロニル−CoAと１分子のｐ−クマロイル−CoAとの縮合反応を含む。この反応は酵素カルコンシンターゼ（CHS）により触媒される。この反応の生成物の２′，４，４′，６′−テトラヒドロキシカルコンは、通常、酵素カルコンフロバノンイソメラーゼ（CHI）により急速に異性化されてナリンゲニンを生成する。ナリンゲニンは引き続いて中央の環の３位においてフラバノン３−ヒドロキシラーゼ（F3 H）によりヒドロキシル化されて、ジヒドロケンフェロール（DHK）を生成する。ジヒドロケンフェロールのＢ環は、３′、または３′と５′の両方の位置においてヒドロキシル化されて、それぞれ、ジヒドロケルセチン（DHQ）およびジヒドロミリセチン（DHM）を生成する。この経路に関係する２つの主要な酵素はフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼおよびフラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼである。フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼはDHKに作用してDHQを生成し、そしてナリンゲニンに作用してエリオジクチオールを生成する。フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ（以後３′，５′−ヒドロキシラーゼと呼ぶ）は、ナリンゲニンおよびDHKの３′および５′位、並びにエリオジクチオールおよびDHQの５′位のヒドロキシル化を触媒する広いスペクトルの酵素であり（StotzおよびForkmann，1982）、両方の場合において、それぞれ、ペンタヒドロキシフラバノンおよびDHMを生成する。アントシアニン類のＢ環のヒドロキシル化のパターンは花弁の色の決定において重要な役割を演ずる。前述の遺伝子プールの拘束のために、主要な切り花の多くは３′，５′−ヒドロキシラーゼを欠如し、従ってそうでなければ可能である色の範囲を表示することができない。これは特にバラ、カーネーションおよびキクの場合であり、これらは世界中の切り花のマーケットの主要な比率を構成する。したがって、植物、特にバラ、カーネーションおよびキクを変更して、３′，５′−ヒドロキシラーゼを生成し、これによりDHKの代謝、ならびに他の基質、例えば、DHQ、ナリンゲニンおよびエリオジクチオールの代謝を変更する手段を提供できるトランスジェニック植物を作出することが要求されている。このような変更はアントシアニン類のヒドロキシル化のパターンに影響を及ぼし、そしてデルフィニジンから誘導されるアントシアニン類の生産を可能とし、これにより花弁の色を変更しそして単一の種が花の色のより広いスペクトルを発現できるようにする。高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類を生産するトランスジェニック植物を作出することが特に要求されている。本発明によれば、遺伝子構成体を発生させ、そして同一種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジンおよび／またはその誘導体を発現するトランスジェニック植物をつくるために使用する。これらの高いレベルのデルフィニジンおよび関係する分子の生産は、変更された開花特性を示すある範囲の植物を作出する場合に特に有用である。したがって、本発明の１つの面は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドを生産し、そして同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類を生産する、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物またはその後代に関する。さらに詳しくは、本発明は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し、そして同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジンおよび／またはデルフィニジンの誘導体を生産する、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物またはその後代に関する。好ましくは、ポリペプチドはペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである。好ましくは、ポリペプチドはフラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼであり、そして最も好ましくはペチュニアの３′，５′−ヒドロキシラーゼである。本発明の遺伝子構成体は、３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする配列をコードする核酸分子を含みそして必要に応じて追加の配列、例えば、トランスジェニック植物中で前記分子の発現を可能とするプロモーターおよびターミネーター配列を含む。遺伝子構成体がDNAである場合、それはcDNAまたはゲノムDNAであることができる。好ましくは、DNAは植物のゲノムの中に組込まれて本発明のトランスジェニック植物を生産することができるキメラ遺伝子構成体を含んでなるバイナリーベクターの形態である。キメラ遺伝子構成体はCHSのような植物プロモーターを有することができるが、あるいは３′，５′−ヒドロキシラーゼの遺伝子配列は発現を増強しそしてデルフィニジンおよび／またはその誘導体のレベルの増加に導くように修飾することができる。CHSプロモーターは、フラボノイド経路における植物プロモーターでありそしてプロモーターの下流の遺伝配列の高いレベルの発現を指令するので、特に便利である。最も好ましいバイナリーベクターはpCGP484，pCGP485，pCGP628 ，pCGP653およびpCGP1458である。「核酸分子」とは、ここにおいて使用するとき、３′，５′−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列を特定するヌクレオチド塩基の隣接する列を意味する。核酸は全長の酵素またはその機能的誘導体をコードすることができる。「誘導体」とは、天然に存在する酵素に対して、任意の単一または複数のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を意味する。これに関して、核酸は３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする天然に存在するヌクレオチド配列を包含するか、あるいは前記天然に存在する配列に対する単一または複数のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を含有することができる。用語「類似体」および「誘導体」はまた、３′，５′−ヒドロキシラーゼの任意の機能的化学的同等体に拡張され、前記核酸分子の唯一の要件は、本発明に従いトランスジェニック植物を生産するために使用するとき、前記トランスジェニック植物が次の性質の１または２以上を示すことである：（ｉ）３′，５′−ヒドロキシラーゼ特異的mRNAの生産；（ii）３′，５′−ヒドロキシラーゼタンパク質の生産；（iii）デルフィニジンおよび／またはその誘導体の生産；および／または（iv）改変された花序。さらに詳しくは、前記トランスジェニック植物は次の性質の１または２以上を示す：（ｉ）非トランスジェニックの内因性レベルを超えた増加したレベルの３′，５′−ヒドロキシラーゼ特異的mRNA （ii）３′，５′−ヒドロキシラーゼのタンパク質の増加した生産；（iii）非トランスジェニックの内因性レベルを超えた増加したレベルのデルフィニジンおよび／またはその誘導体の生産；および／または（iv）改変された花序。ここにおいて使用する核酸分子は単独で、あるいはベクター分子および好ましくは発現ベクターと組み合わせて存在することができる。このようなベクター分子は真核細胞および／または原核細胞の中で複製および／または発現することができる。好ましくは、ベクター分子またはその部分は植物ゲノムの中に組込まれることができる。核酸分子は、さらに、前記組込みを促進するときに有用な配列および／または植物細胞の中の核酸分子の発現を指令することができるプロモーター配列を含有することができる。核酸分子およびプロモーターは、任意の数の手段、例えば、エレクトロポレイション、パーティクルガンまたはアグロバクテリウム（Agrobacteriumu）仲介転移により細胞の中に導入することができる。本発明によれば、３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする核酸分子は、バラ、カーネーションおよびキクから成るリストから選択されるトランスジェニック植物の中に導入しそしてその中で発現させ、これによりDHKおよび／または他の適当な基質をアントシアニン類のアントシアニン誘導体、例えば、ペチュニジン、マルビジンおよび殊にデルフィニジンに変換する手段を提供することができる。これらのアントシアニン類の生産は青色または青色様の色の種々の色彩の生成に寄与することができるか、あるいはそうでなければペラルゴニジン、シアニジンおよびペオニジンおよびそれらの誘導体からデルフィニジンおよびその誘導体に向けることによって花の色を変更することができる。植物の中の核酸配列の発現は構成的、誘導可能または発生に依存性であることができる。「改変された花序」という表現は、花弁の間の通常の変動を考慮して天然に存在する花の色に対する花の色の任意の変更を意味する。好ましくは、改変された花序は非トランスジェニック植物におけるそれらと異なる青、紫またはピンクの着色の種々の色彩の生成を包含する。本発明は、また、非トランスジェニック植物の内因性レベルを超えた増加したレベルのデルフィニジンおよび／またはその誘導体の生産を示すトランスジェニック顕花植物を生産する方法に関し、前記方法はバラ、カーネーションおよびキクから成るリストから選択される植物の細胞の中に、３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする配列をコードする核酸分子を、前記核酸分子の究極的発現を可能とする条件下に導入し、前記細胞からトランスジェニック植物を再生し、そして前記トランスジェニック植物を核酸分子の３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素への発現を可能とするために十分な時間かつ条件下に成長させることからなる。本発明は、また、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物を生産する方法に関し、この方法は前記植物の中にフラボノイド３′ ，５′−ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列を含有する遺伝子構成体を導入することからなり、前記トランスジェニック植物は同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニンを生産することを特徴とする。好ましい態様において、トランスジェニック顕花植物は増加したレベルのデルフィニジンの生産と一致する改変された花序の性質を示し、そして改変された花序は受容体植物の生理的条件に依存して青色の花または青色がかった色彩の生成を包含する。ある種の植物の種において、「高pH系」を選択することが好ましく、これは平均の花弁の液胞pHより高いpHを有する品種として定義される。組換え３′，５′−ヒドロキシラーゼまたはその変異体および誘導体の起源は、ペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、トルコギキョウ、カンパネラおよびナスを包含する。結局、本発明は、３′，５′−ヒドロキシラーゼを表す核酸分子のすべてまたは一部分および／またはそれらの任意の相同体または関係する形態を含有するトランスジェニックのバラ、カーネーションおよびキク植物および特に増加した３ ′，５′−ヒドロキシラーゼ特異的mRNAおよび／またはデルフィニジンの増加した生産および／または改変された花序を示すトランスジェニック植物に拡張される。したがって、トランスジェニック植物は３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含む安定に導入された核酸分子を含有する。本発明は、また、このようなトランスジェニック植物の後代に拡張され、そしてまたその生殖材料（例えば、種子）に拡張される。このような種子は、殊に有色の場合、なかでも植物の登録標識として有用であろう。次の非限定的図面および実施例を参照して、本発明をさらに説明する。図面において、第１（Ａ）図および第１（Ｂ）図は、フラボノイド色素のための生合成経路の概略的表示である。この経路の最初の部分に関係する酵素は次の通りである：PA L＝フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ；C4H＝シンナメート４−ヒドロキシラーゼ；４CL＝４−クマレート；CoAリガーゼ；CHS＝カルコンシンターゼ；CHI＝カルコンフロバノンイソメラーゼ；F3 H＝フラバノン３−ヒドロキシラーゼ；DFR＝ジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ；UFGT＝UDP-グルコース；フラボノイド−３−Ｏ−グリコシルトランスフェラーゼ。後のステップはペチュニア・ハイブリダ（Ｐ．hybrida）の花において起こることができる変換に相当しそして次のものを包含する：Ｉ＝シアニジン −３−グルコシドおよびデルフィニジン−３−グルコシドのグリコシル残基へのラムノース糖の付加；２＝アシル化および５−Ｏ・グリコシル化；３＝３′メチル化；４＝５′メチル化；５＝３′５′メチル化。第２図は、その構成を実施例３に記載するバイナリー発現ベクターpCGP812のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット；GUS＝β−グルクロニダーゼコーディング領域。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例３に記載されている。制限酵素部位は印されている。第３図は、その構成を実施例４に記載するバイナリー発現ベクターpCGP485のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例４に記載されている。制限酵素部位は印されている。第４図は、その構成を実施例５に記載するバイナリー発現ベクターpCGP628のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例５に記載されている。制限酵素部位は印されている。第５図は、その構成を実施例６に記載するバイナリー発現ベクターpCGP653のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例６に記載されている。制限酵素部位は印されている。第６図は、その構成を実施例７に記載するバイナリー発現ベクターpCGP484のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例７に記載されている。制限酵素部位は印されている。第７図は、その構成を実施例８に記載するバイナリー発現ベクターpCGP1458のダイアグラム表示である。nptI＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼＩ耐性遺伝子；LB＝左ボーダー；RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例８に記載されている。制限酵素部位は印されている。第８図は、pCGP628で形質転換したロイアルティ（Royalty）カルス組織のサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの表示の写真を示す。ゲノムDNAをEcoRIで消化し、そしてHflcDNAの720bpのEcoRV内部断片でプロービングした。陰性対照（Ｎ）はpCGP293で形質転換したロイアルティカルス組織である。陽性対照（Ｈ）は10pgのHfl断片を含有する。矢印は形質転換された植物において期待される２kbのEcoRI断片を示す。第９図はpCGP484で形質転換したクリサンテナム（Chrysanthemum）cv.ブルー・リッジ（Blue Ridge）植物のサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの表示の写真を示す。ゲノムDNAをXbaIで消化し、これは2.3kbのHfl-PL TP断片を解放し、そしてHflcDNAを含有する、pCGP602から解放された1.8kbのFsp I／BspHI断片でプロービングした。陰性対照（Ｎ）は形質転換しないブルー・リッジ植物から単離されたゲノムDNAである。陽性対照（Ｐ）はXbaIで消化したpCG P485のプラスミドDNAである。矢印は形質転換された植物において期待される2.3 kbの生成物を示す。実施例１材料エリオジクチオール（Eriodictyol）およびジヒドロケルセチンをカール・ロス（Carl Roth）KGから入手しそしてナリンゲニンをシグマ（Sigma）から入手した。ジヒドロミリセチンをミリセチン（Extra Synthese、フランス国）からVerc ruysseら（1985）の方法により化学的に合成した。〔³Ｈ〕−ナリンゲニン（5.7 Ci／mM）および〔³Ｈ〕−ジヒドロケルセチン（12.4Ci／mM）をアマーシャム（A mersham）から入手した。すべての酵素は商業的源から入手し、そして製造業者の推奨に従い使用した。使用した大腸菌（Escherichia coli）株は次の通りであった：DH５α supE 44，Δ（lacZYA-ArgF）Ｕ169，φ80 lacZ ΔＭ15，hsdＲ17（ｒ_k−，ｍ_k＋）， recAl、endAl，gyrA96，thi−１，relAl，deoR。（Hanahan，1983およびBRL，19 86）。ディスアームド（disarmed）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agroba cterium tumefaciens）株AGLO（Lazoら、1991）およびLBA4404（Hockemaら、1983）を、それぞれ、R Ludwig博士（カリフォルニア大学、生物学部、米国サンタクルズ）およびカルジーン・インコーポレーテッド（Calgone，Inc.）カリフォルニア州、米国、から入手した。アームド（armed）アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ICMP8317をRicha rd Gardner博士（オークランド大学、細胞および分子生物学部、遺伝子技術センター、ニュージーランド国）から入手した。クローニングベクターpBluescrptはストラタジーン（Stratagene）から入手した。植物を特殊化成長室の中で14時間の昼間の長さで10,000ルックスの最小光強度および22〜26の温度において成長させた。実施例２ pCGP90の構築 pCGP602（国際特許出願PCT／AU92／00334号；公開番号WO93／01290号）からの cDNAインサートをセンスの向きでpCGP293のMacプロモーター（Comaiら、1990）の背後でクローニングすることによって、プラスミドpCGP90を構築した。バイナリー発現ベクターpCGP293はTiバイナリーベクターpCGN1559（McBrideおよびSummerfelt，1990）から誘導した。プラスミドpCGN1559をKpnIで消化し、そして突出した３′末端をT4DNAポリメラーゼで標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従い除去した。次いで、このベクターをXbaIでさらに消化し、そして生ずる５′突出をDNAポリメラーゼＩのクレノー断片で修復した。次いでこのベクターを再結合してpCGP67を得た。Macプロモーター、masターミネーターおよび種々のクローニング部位を含有する1.97kbのPstI断片（Comaiら、1990）をpCGP4 0から単離し、そしてpCGP67のP st I部位に挿入してpCGP293を得た。 pCGN7334からBamHI−SacI断片としてGUS遺伝子（Jeffersonら、1987）を除去し、そしてそれをマルチクローニング部位を含むpBluescribe M13からのBamHI−Sac I断片と置換することによって、プラスミドpCGP40を構成した。キメラMac-GU Smas遺伝子を含有する断片をpCGN7329（Comaiら、1990）のXhoI部位の中に挿入することによって、プラスミドpCGN7334（Calgene，Inc.，米国カリフォルニア州、から入手し）を構築した。次いで、前述cDNAインサートを含有するBamHI−KpnI断片をpCGP602から単離し、そしてpCGP293のBamHI−KpnI断片と結合した。pCGP90の中のインサートの正しい挿入は、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離したDNAの制限分析により確立された。実施例３ pCGP812の構築バイナリー発現ベクターpCGP812はTiバイナリーベクターpCGN1558（McBrideおよびSummerfelt，1990）から誘導した。キメラmas-35S-GUS-ocs遺伝子を含有する5.2kbのXhoI断片をpKIWI101（JannsenおよびGardner，1989）から単離し、そしてpBliescript KSのXhoIの中にサブクローニングしてpCGP82を得た。次いで、 5.2kbの断片をHindIII／KpnI消化により再結合し、そしてpCGN1558のHindIII／K pn I部位の中にサブクローニングしてpCGP83を得た。プラスミドpCGP83をKpnIで制限酵素処理し、そして突出した３′末端を標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従いT4DNAポリメラーゼで除去した。次いで、SmaI−BamHIアダプター（Pharmasia）を平滑化したKpnI部位に結合してBamH I「粘着」末端を得た。pCGP807（後述する）からのキメラMac-Hf1-mas遺伝子を含有する3.8kbのBglII断片をpCGP83のBamHI「粘着」末端と結合してpCGP 812を生成した（第２図）。 pCGP602からの前述のHflcDNAを含有する1.8kbのBamHI−KpnI断片をpCGP40のBa m HI−KpnI末端と結合することによって、プラスミドpCGP807を構築した。実施例４ pCGP485の構築バイナリー発現ベクターpCGP485はTiバイナリーベクターpCGN1547（McBrideおよびSummerfelt，1990）から誘導した。（ｉ）キンギョソウのCHS遺伝子からのプロモーター配列；（ii）ペチュニアからのpCGP602からの前述のcDNAインサートのコーディング領域、および（iii）ペチュニアのリン脂質トランスフェラーゼのタンパク質（PLTP）ターミネーター配列から成るキメラ遺伝子を構成した。 CHSプロモーターは、翻訳開始の部位の５′の1.2kbの遺伝子断片から成る（Somm erおよびSaedler，1986）。ペチュニアのcDNAインサートは、pCGP602のcDNAクローンからの1.6kbのBclI／FspI断片から成る（国際特許出願PCT／AU92／00334号；公開番号WO93／01290）。PLTPターミネーター配列はpCGP13ΔBam（Holton，19 92）からの0.7kbのSmaI／XhoI断片から成り、これはPLTP遺伝子の転写された領域の150bpの未翻訳範囲を含む。キメラCHS／cDNAインサート／PLTP遺伝子をpCGN 1547のPstI部位の中にクローニングしてpCGP485を構築した。実施例５ pCGP628の構築プラスミドpCGP176（国際特許出願PCT／AU92／00334号；公開番号WO93／01290 ）をEcoRIおよびSpeIで消化した。消化したDNAをクレノー断片で標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従いフィルインし、そして自己連結した。これにより得られたプラスミドをpCGP627と表示した。pCGP627のXbaI／KpnI消化物は1.8kbの断片を生成し、この断片をpCGP293のXbaI／KpnI消化により得られた14.5kbの断片と結合した。こうしてつくられたプラスミドをpCGP628と表示した。実施例６ pCGP653の構築プラスミドpCGP293（実施例２に前述した）をXbaIで消化し、そして生ずる５ ′突出を標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従いクレノー断片でフィルインした。次いでそれをHindIIIで消化した。この手順の間に、Macプロモーター（Comaiら、1990）を欠失した。pCGP669（後述する）からの0.8kbのペチュニアのCHS-Ａプロモーターをバックボーンの中に平滑末端化したEcoRI／HindIII断片として結合した。このプラスミド生成物をpCGP672と表示した。 pCGP807（上の実施例３に記載する）のXbaI／Asp718消化はHflcDNAを含有する 1.8kbの断片を生成し、この断片をpCGP672からの16.2kbのXbaI／Asp718断片と結合した。こうしてつくったプラスミドをpCGP653と表示した。 CHS-Ａ遺伝子のプロモーター断片をPCRにより、プライマーとしてオリゴヌクレオチドCHSA-782およびCHSA＋34（下の配列を参照のこと）および鋳型としてペチュニア・ハイブリダ（Pctunia hybrida）Ｖ30ゲノムDNAを使用して増幅した。 PCR生成物をddTテイルドpBluescript（HoltonおよびGraham，1991）の中にクローニングし、そして遺伝子断片の向きを制限酵素地図により評価した。こうしてつくったプラスミドをpCGP669と表示した。オリゴヌクレオチドのプライマーは、ペチュニアのCHS-Ａプロモーターの発表された配列に対して設計した（Koes， 1988）。実施例７ pCGP484の構築 pCGP484の構築は、実施例４において上に概説した、pCGP485についての構築と同一であったが、ただしpCGP484は3.5kbのPstI断片（キメラ遺伝子CHS-Hf1-PLTP を含む）を反対方向に含有した。実施例８ pCGP1458の構築プラスミドpCGP1458は、バックボーンとして10kbのバイナリーベクターpBIN19 （Bevan，1984）を使用して構成した。プラスミドpBIN19をEcoRIで消化し、そして生ずる突出した５′末端を、標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従い、クレノー断片を使用してフィルインした。プラスミドpCGP485をPstIで消化して、キメラCHS／cDNAインサート／PLTP遺伝子を3.5kbの断片として除去した。Ps t Iから生ずる３′突出をT4DNAポリメラーゼで除去し、次いでこの断片をプラスミドpBIN19のフィルインしたEcoRI部位の中に結合した。実施例９大腸菌（E．coli）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換ベクターpCGP812，pCGP90，pCGP485，pCGP628，pCGP653，pCGP484またはpCGP1 458の１つまたは他のものを使用する大腸菌（Escherichia coli）株DH５α−細胞の形質転換を、標準のプロトコール（Sambrookら、1989）またはInoueら、（1 990）に従い実施した。 50mlのMG／Ｌ（GarfinkelおよびNester，1980）培養物を接種しそして16時間震盪しながら28℃において増殖させることによって調製した、コンピテントアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞の100μｌに、５μｇのプラスミドDNAを添加することによって、プラスミドpCGP8I2，pCGP90，pCGP485，pCG P628，pCGP653，pCGP484またはpCGP1458を適当なアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の中に導入した。次いで、細胞を沈降させ、そして0.5mlの85％（ｖ／ｖ）100mMのCaCl₂／15％（ｖ／ｖ）グリセロールの中に再懸濁させた。DNA-アグロバクテリウム混合物を液体Ｎ₂の中で２分間インキュベートすることによって凍結させ、次いで37℃において５分間インキュベートすることによって融解させた。次いで、このDNA／細胞混合物を氷上にさらに10分間配置した。次いで細胞を１mlのMG／Ｌ培地と混合し、そして震盪しながら16時間28℃においてインキュベートした。pCGP812，pCGP90，pCGP485，pCGP628，pCGP653またはpCGP484を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞を、100μｇ／mlのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で選択した。pCGP1458を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞を、100μｇ／mlのカナマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で選択した。プラスミドの存在はゲンタマイシン耐性形質転換体から単離したDNAのサザン分析により確証された。実施例10 ジアンサス・カリオフィルス（Dianthus caryophyllus）の形質転換ａ．植物の材料ジアンサス・カリオフィルス（Dianthus caryophyllus）（cv．Crowley Sim. ，Red Sim，Laguna）の挿木を、バン・ウィク・アンド・サン・フラワー・サプライ（Van Wyk and Son Flower Supply）、オーストラリア国ヴィクトリア州、から入手した。外側の葉を除去し、そして挿木を短時間70％（ｖ／ｖ）エタノール、次いで1.25％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム（ツイーン２０を含む）中で６分間滅菌し、そして無菌の水で３回すすいだ。すべての見える葉および腋芽を同時培養の前に解剖顕微鏡下に除去した。ｂ．アグロバクテリウムおよびジアンサス（Dianthus）組織の同時培養バイナリーベクターpCGP90，pCGP812，pCGP485またはpCGP653の１つを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGLO（Lazoら、1991）を、100mg／ｌのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ（GarfinkelおよびNester，1980）寒天培地上で４℃において維持した。単一のコロニーを液体MG／Ｌ培地中で一夜成長させ、そして接種のすぐ前の口に５×10⁸細胞／mlに希釈した。３％（ｗ／ｖ）のスクロース、５mg／ｌのα−ナフタレン酢酸（NAA）、20μＭのアセトシリンゴンおよび0.8％のディフ・コ・バクト・アガー（Difco Bacto Agar）（pH5.7）を補充したムラシゲ（Murashige）およびスクーグ（Skoog）（1962）培地（MS）上で、ジアンサス（Dianthus）組織をアグロバクテリウムと同時培養した。ｃ．トランスジェニック・ジアンサス（Dianthus）植物の再生１mg／ｌのベンジルアミノプリン（BAP）、0.1mg／ｌのNAA、150mg／ｌのカナマイシン、500mg／ｌのチカルシリンおよび0.8％のディフコ・バクト・アガー（ Difco Bacto Agar）（選択培地）を補充したMS培地に、同時培養した組織を移した。３週後、外植体を新鮮な選択培地に移し、そしてこの段階において茎外植体からの腋生苗条を除去するように注意を払った。選択培地上で６〜８週後、健康な不定芽を３％のスクロース、150mg／ｌのカナマイシン、500mg／ｌのチカルシリン、0.8％のディフコ・バクト・アガー（Difco Bacto Agar）を含有するホルモン不含MS培地に移した。この段階において、GUS組織化学的検定（Jefferson，1987）および／またはNPT IIドットブロット検定（McDonnellら、1987）を使用してトランスジェニック苗条を同定した。トランスジェニック苗条を３％のスクロース、500mg／ｌのチカルシリンおよび0.4％（ｗ／ｖ）のゲライト・ゲラン・グム（Gelrite Gellan Gum）（Sch weizerhall）を補充した含MS培地に根の誘導のために移した。すべての培養物は 16時間の光周期（120μＥの冷白色螢光灯）下に23±２℃において維持した。植物が根を形成し、そして４〜６cmの高さに到達したとき、植物をミスト下に順化した。養液栽培混合物（KandreckおよびBlack，1984）中で液浸した高い比のパーライト（75％またはそれより大きい）を含有する混合物を順化に使用し、これは典型的には４〜５週持続させた。植物を14時間の光周期（200μＥのハロゲン化水銀灯）下に23℃において順化した。実施例11 ロサ・ハイブリダ（Rosa hybrida）の形質転換１．ロサ・ハイブリダ（Rosa hybrida）cvロイアルティ（Royalty）バラ園芸品種ロイアルティ（Royalty）の植物組織を、PCT91/04412、公開番号 WO92/00371に開示されている方法に従い形質転換した。２．ロサ・ハイブリダ（Rosa hybrida）cvカルディナール（Kardinal）ａ．植物材料カルディナール（Kardinal）の苗条を、バン・ウィク・アンド・サン・フラワー・サプライ（Van Wyk and Son Flower Supply）、オーストラリア国ヴィクトリア州、から入手した。葉を除去し、そして残りの苗条（５〜６cm）を1.25％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム（ツイーン２０を含む）中で５分間滅菌し、次いで無菌の水で３回すすいだ。単離した苗条の先端を無菌の水中で１時間液浸し、そして同時培養の前に、３％のスクロース、0.1mg／ｌのBAP、0.1mg／ｌのカイネチン、0.2mg／ｌのジベレリン酸、0.5％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンおよび0.2％のゲライト・ゲラン・ガム（Gelrite Gellan Gum）を含有するMS培地上で２日間前培養した。ｂ．アグロバクテリウムおよびロサ（Rosa）苗条組織の同時培養バイナリーベクターpCGP812を含有する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスICMP8317（JanssenおよびGardner，1989）およびAGLOを、100mg／ｌのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で４℃において維持した。各アグロバクテリウム株からの単一のコロニーを液体MG／Ｌ培地中で一夜増殖させた。５ ×10⁸細胞／mlの最終濃度を、液体MG／Ｌ培地中の希釈の前の日に、調製した。接種前に、２つのアグロバクテリウム培養物を10：１の比で混合した。（AGLO／ pCGP812：8317／pCGP812）。苗条の茎頂を通して縦方向に切断し、そして混合したアグロバクテリウム培養物の２μｌの分注物を苗条の茎頂に滴として配置した。苗条の茎頂を前培養に使用したのと同一の培地上で５日間同時培養した。バイナリーベクターpCGP1458を含有する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスAGLOを、100mg／ｌのカナマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で４℃ において維持した。各アグロバクテリウム株からの単一のコロニーを液体MG／Ｌ培地中で一夜増殖させた。５×10⁸細胞／mlの最終濃度を、液体MG／Ｌ中の希釈の前の日に、調製した。ｃ．トランスジェニック・ロサ（Rosa）植物の再生同時培養後、苗条の茎頂を選択培地に移した。苗条の茎頂を３〜４週毎に新鮮な選択培地に移した。苗条の茎頂に観察されたゴールを、それらが直径６〜８mmに到達したとき、切除した。単離したゴールを、苗条の形成のために、３％のスクロース、25mg／ｌのカナマイシン、250mg／ｌのセフォタキシムおよび0.25％のゲライト・ゲラン・ガム（Gelrite Gellan Gum）を含有するMS培地に移した。ゴール組織から再生した苗条を単離し、そして選択培地に移した。GUS組織化学的検定およびカルスの検定を使用して、トランスジェニック苗条を同定した。トランスジェニック苗条を、根の誘導のために、３％のスクロース、200mg／ｌのセフォタキシムおよび0.25％のゲライト・ゲラン・ガム（Gelrite Gellan Gum）を含有するマンヅカ・セクスタ（Maduca sexta）培地に移した。すべての培養物を16時間の光周期（60μＥの冷白色蛍光灯）下に23± ２℃において維持した。根系をよく発育させそして苗条が５〜７cmの長さに到達したとき、トランスジェニックバラ植物を８cmの管中のオートクレーブ処理したデブコ（Debco）514110/2鉢植混合物に移した。２〜３週後、植物を15cmのポットの中に同一の鉢植え混合物を使用して再び植え、そして23℃において14時間の光周期（300μＥのハロゲン化水銀灯）下に維持した。１〜２週後、鉢植えした植物をガラス室（日中／夜の温度：25〜28／14℃）に動かし、そして開花まで成長させた。実施例12 クリサンテナム・モリフォリウム（Chrysanthemum morifolium）の形質転換ａ．植物材料クリサンテナム・モリフォリウム（Chrysanthemum morifolium）（cv．Blue Ridge，Pnennine Chorus）挿木を、Ｆ＆Ｉバグレイ・フラワー・アンド・プラント・グロウワーズ（Baguley Flower and Plant Growers）、オーストラリア国ヴィクトリア州、から入手した。葉を挿木から除去し、次いでこれを短時間70％（ｖ／ｖ）エタノール、次いで1.25％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム（ツイーン20を含む）中で３分間滅菌し、そして無菌の水で３回すすいだ。節間茎切片を同時培養のために使用した。ｂ．アグロバクテリウムおよびクリサンテナム（Chrysanthemum）組織の同時培養バイナリーベクターpCGP90，pCGP484，pCGP485またはpCGP628の１つを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株LBA4404（Hoekemaら、1983）を、50 mg／ｌリファンピシンンおよび10mg／ｌのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で成長させた。各アグロバクテリウムからの単一のコロニーを同一液体培地中で一夜成長させた。これらの液体培養物にグリセロールを10％加え、そして１mlの分注物をフリーザー（−80℃）に移した。各凍結したアグロバクテリウムの100〜200μｌの分注物を50mg／ｌのリファンピシンンおよび10mg／ｌのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ中で一夜成長させた。５×10⁸細胞／mlの最終濃度を、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含有する液体MG／Ｌ中の希釈の前の日に、調製した。茎切片を、LBA4404/pCGP90，LBA4404/pCGP484，LBA4404/pCGP485またはLBA4404/pCGP628のいずれか１つを含有するアグロバクテリウムと、同時培養培地上で４日間同時培養した。ｃ．トランスジェニック・クリサンテナム（Chrysanthemum）植物の再生同時培養後、茎切片を選択培地に移した。３〜４週後、再生する外植体を新鮮な培地に移した。カナマイシンの選択に生き残る不定芽を単離し、そしてカナマイシンおよびセフォタキシムを含有するMS培地に苗条の伸長および根の誘導のために移した。すべての培養物を16時間の光周期（80μＥの冷白色蛍光灯）下に23 ±２℃において維持した。カナマイシンで根を形成した植物から葉の試料を集め、そしてサザンブロット分析を使用してトランスジェニック植物を同定した。トランスジェニッククリサンテナム（Chrysanthemum）植物が４〜５cmの長さに到達したとき、それらを８cmのオートクレーブ処理したデブコ（Debco）514110/2鉢植混合物に移した。２週後、植物を15cmのポットの中に同一の鉢植え混合物を使用して再び植え、そして23℃において14時間の光周期（300μＥのハロゲン化水銀灯）下に維持した。２週後、鉢植えした植物を温室（日中／夜の温度：25〜28℃／14℃）に動かし、そして開花まで成長させた。実施例13 サザン分析ａ．ジアンサス（Dianthus）からのゲノムDNAの単離 DNAを組織から本質的にDellaportaら、（1983）に記載されているように単離した。DNA調製物をCsCl浮力密度遠心（Sambrookら、1989）によりさらに精製した。ｂ．クリサンテナム（Chrysanthemum）からのゲノムDNAの単離 4.5Ｍのグアニジウムチオシアネート、50mMのEDTA pH8.0、25mMのクエン酸ナトリウムpH7.0、0.1Ｍの２−メルカプトエタノール、２％（ｖ／ｖ）のラウリルサルコシンを含有する抽出緩衝液を使用して、DNAを葉組織から単離した。植物組織を液体Ｎ₂中で微粉末に粉砕し、次いで抽出緩衝液を添加し（５ml／ｇの組織）そしてこの溶液を回転ホイール上で16時間混合した。次いでこの混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（50：49：１）で２回抽出し、そしてゲノムDNAを３体積のエタノールの添加および10,000rpmにおける15分間の遠心により沈澱させた。ｃ．ロサ（Rosa）からのゲノムDNAの単離組織を液体Ｎ₂の存在下に乳鉢と乳棒で粉砕し、そして１mlの65 ℃に加熱した抽出緩衝液（0.14Ｍのソルビトール、0.22Ｍのトリス−HCl〔pH8.0 〕、0.022ＭのEDTA、0.8ＭのNaCl、0.8％（ｗ／ｖ）のCTAB、１％のＮ−ラウリルサルコシン）を添加することによって、DNAを抽出した。クロロホルム（200μ ｌ）を添加し、そしてこの混合物を65℃において15分間インキュベートした。遠心後、上澄液をフェノール−クロロホルムで抽出し、次いで等しい体積のイソプロパノールに添加し、倒立させて混合した。この混合物を遠心し、そしてペレットを95％エタノールで洗浄し、再遠心し、そして70％エタノールで洗浄した。ペレットを真空乾燥し、そして30μｌのTE緩衝液（pH8.0）の中に再懸濁させた。ｄ．サザンブロットゲノムDNA（10μｇ）を16時間60単位のEcoR Ｉで消化し、そしてTAE（40mMのトリス−アセテート、50mMのEDTA）緩衝液中で0.7％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルを通して電気泳動させた。次いでDNAを変性溶液（1.5ＭのNaCl/0.5ＭのNaOH）中で１〜1.5時間変性し、0.5Ｍのトリス−HCl（pH7.5）／1.5ＭのNaCl中で２〜３時間中和し、次いでDNAをハイボンドＮ（Amersham）フィルターに20×SSC中で転写した。カナマイシンに対する選択後に得られた推定上のジアンサス（Dianthus）、ロサ（Rosa）およびクリサンテナム（Chrysanthemum）植物のサザン分析は、ゲノムの中への適当なキメラ遺伝子の組込みを確証した。実施例14 ノザン分析ａ．ジアンサス（Dianthus）およびクリサンテナム（Chrysanthemum）のRNA 液体Ｎ₂中で凍結しそして乳鉢と乳棒を使用して微粉末に粉砕した組織から、全体のRNAを単離した。４Ｍのグアニジウムイソチオシアネート、5 0mMのトリス−HCl（pH8.0）、20mMのEDTA、0.1％（ｖ／ｖ）のサルコシルの抽出緩衝液を組織に添加し、そしてこの混合物をポリトロン（polytron）を最大速度で使用して１分間均質化した。懸濁液をミラクロス（Calbiochem）を通して濾過し、そしてJA20ローター中で10分間10,000rpmにおいて遠心した。上澄み液を集め、そして0.2ｇ／mlのCsCl（ｗ／ｖ）とした。次いで、試料を38.5mlのクイック−シール遠心管（Beckman）中で5.7ＭのCsCl、50mMのEDTA（pH7.0）の10mlのクッションの上に層状にし、そしてTi−70ローター中で42,000rpmで23において1 2〜16時間遠心した。ペレットをTE/SDS（10mMのトリス−HCl（pH7.5）、１mMのE DTA、0.1％（ｖ／ｖ）のSDS）の中に再懸濁させ、そして10mMのEDTA（pH7.5）中で飽和させたフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１）で抽出した。エタノール沈澱後、RNAペレットをTE/SDSの中に再懸濁させた。 40mMのモルホリノプロパンスルホン酸（pH7.0）、５mMの酢酸ナトリウム、0.1 mMのEDTA（pH8.0）を含有する泳動用緩衝液を使用して、2.2Ｍのホルムアルデヒド／1.2％（ｗ／ｖ）アガロースを通してRNAの試料を電気泳動させた。RNAを製造業者が記載するようにハイボンド−Ｎフィルター（Amersham）に移し、そして³² Ｐ標識化cDNA断片（10⁸cpm／μｇ，２×10⁶cpm／ml）でプロービングした。プレハイブリダイゼーション（42℃において１時間）およびハイブリダイゼーション（42℃において16時間）を、50％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、１ＭのNaCl、１％（ｗ／ｖ）のSDS、10％の硫酸デキストラン中で実施した。分解したサケ精子D NA（100μｇ／ml）をハイブリダイゼーションステップのために³²Ｐ標識化プローブとともに添加した。フィルターを２×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS中で65℃において１〜２時間洗浄し、次いで0.2×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS中で65℃において0.5〜１時間洗浄した。フィルターをコダックXARフィルムに増感スクリーンを使用して−70℃において4 8時間感光した。プラスミドpCGP90で形質転換したジアンツス（Dianthus）cv．レッド・シム（ Red sim）のノザン分析は、13植物のうちの８個体が陽性であることを示した。ｂ．ロサ（Rosa）のRNA Manning，1991の方法に従い花弁（収穫後５日の芽および花）から、全RNAを抽出した。実施例15 DNAプローブの³²Ｐ標識化 DNA断片（50〜100ng）を50μCiの〔α−³²Ｐ〕−dCTPでオリゴ標識化キット（ Bresatec）を使用して放射線標識化した。組込まれなかった〔α−³²Ｐ〕−dCTP をセファデックスＧ−50（Fine）カラムのクロマトグラフィーにより除去した。実施例16 アントシアニジンの分析 HPLC分析の前に、花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子を酸加水分解して、アントシアニジンのコアからグリコシル部分を除去した。アントシアニン色素のＢ環へのヒドロキシル化のパターンを、アントシアニジンのコア分子のHP LC分析により決定した。この分析において使用したHPLC系は、多波長の検出器（ MWD）を装備したヘウレット−パッカード（Hewlett-Packerd）1050であった。逆相クロマトグラフィーの分離をスフェリソーブ（Spherisorb）S50DS2キャリッジ・カラム、250mm×４mmのIDで実施した。ａ．アントシアニンおよびフラボノイド類の抽出１％（ｖ／ｖ）の水性６Ｍの塩酸を含有する５mlのメタノールを使用して、花弁セグメント（約50mg）から花の色素を抽出した。抽出液を水（１：９）で希釈し、そしてHPLC系の中に注入の前に、濾過（Millex HV，0.45μ）した。ｂ．アントシアニン類の加水分解上のａにおいて得られた粗製のメタノール抽出液（100μｌ）を、ピアース・レアクチ−バイアル（Pierce Reacti-Vial）中で、室温において乾燥窒素の流れを使用して蒸発乾固した。残留物を200μｌの２ＭのHCl中に溶解し、バイアルに蓋をし、次いで100℃で30分間加熱した。加水分解混合物を水（１：９）で希釈し、そして、HPLC分析前に、濾過（Millex HV，0.45μ）した。ｃ．クロマトグラフィー花の色素の分離は、次の系を使用する勾配溶離により実施した：溶媒Ａ：（トリエチルアミン：濃H₃PO₄：H₂O）（３：2.5：1000）溶媒Ｂ：アセトニトリル勾配条件：20分にわたって５％Ｂ〜40％Ｂ流速：１ml／分温度：35℃ 検出：MWD，280，350および546nmにおける同時のデータの獲得。アントシアニジンのピークを既知の標準を参照して同定した。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子の分析のための別の方法は、Bruglieraら、1994 の中に見出される。 HPLC分析を実施して、プラスミドpCGP90，pCGP485，pCGP484，pCGP628，pCGP6 53又はpCGP1458の１つまたは他のもので形質転換されたカーネーション、キクおよびバラの試料の中のデルフィニジン、ペラルゴニジンおよびシアニジンの色素の存在を決定する。トランスジェニックカーネーションの花中のpCGP90，pCGP485およびpCGP653の代表的なデータを表１に示す。実施例17 ３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性について検定のための植物抽出物の調製植物組織を10倍体積の氷冷抽出用緩衝液（100mMのリン酸カリウム（pH7.5）、１mMのEDTA、0.25Ｍのスクロース、25Ｍのマンニトール、0.1％（ｗ／ｖ）のBSA 、0.1mg／mlのPMSF、20mMの２−メルカプトエタノールおよび10mg／mlのポリクラール（polyclar）AT）中で均質化した。ホモジネートを13,000rpmでJA20ローター（Beckman）中で４℃において10分間遠心し、そして上澄み液の一部を３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性について検定した。３′，５′−ヒドロキシラーゼの検定３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性をstotzおよびForkmann（1982）に記載されている方法の変法により測定した。検定反応混合物は、典型的には、200μｌの最終体積において検定緩衝液（100mMのリン酸カリウム（pH8.0）、１mMのEDTA および20mMの２−メルカプトエタノール）中に195μｌの植物抽出物、５μｌの5 0mMのNADPH、および10⁵dpm〔¹⁴Ｃ〕ナリンゲニンを含有した。23℃において一夜のインキュベーション後、反応混合物を0.5mlの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル相を真空下に乾燥し、次いで10μｌの酢酸エチルの中に再懸濁させた。次いで、放射線標識化したフラボノイド分子を、セルロースの薄層プレート（Me rck Art 5577、ドイツ国）上でクロロホルム：酢酸：水（10：９：１，ｖ／ｖ）溶媒系を使用して分離した。クロマトグラフィーの完結後、TLCプレートを空気乾燥し、そして反応生成物をオートラジオグラフィーで局在化し、そして反応生成物に沿って展開しそして紫外線下に可視化した非放射性ナリンゲニン、エリオジクチオール、ジヒドロケルセチンおよびジヒドロミリセチンの標準と比較することによって同定した。実施例18 種々の園芸品種の形質転換構成体pCGP90，pCGP812，pCGP628，pCGP485，pCGP653，pCGP484またはpCGP145 8のいずれか１つを含有するキメラ遺伝子を、実施例10，11および12に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、バラ、カーネーションおよびキクの植物変種の中に導入する。植物ゲノムの中への適当なキメラ遺伝子の組込みはカナマイシンの選択後に得られた植物のサザン分析により確証され、そして上の実施例16に記載するように、HPLC分析を使用してアントシアニン類の存在を検出する。首尾よくトランスジェニックとされそして本発明に従い転移遺伝子を発現することができる植物は、３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性の生成に必要な遺伝子を含有しない非トランスジェニック対照と比較して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類に加えて有意なレベルの３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する（実施例16参照）。実施例19 カーネーションcv．クロウレイ・シム（Crowley Sim）＋pCGP90 プラスミドpCGP90を、実施例10に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、カーネーションの園芸品種クロウレイ・シム（Crowley Si m）の中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。９つの植物をnptIIおよびHf１遺伝子の存在についてそしてデルフィニジンの生産について検査した。分析した９つの植物のうちの８つはnptIIおよびHf１の両方について陽性であったが、HPL C分析はこれらの植物によりデルフィニジンの生産の証拠を検出することができなかった（表２参照；「Kan」＝カナマイシン）。実施例20 カーネーションcv．ラグナ（Laguna）＋pCGP485 プラスミドpCGP485を、実施例10に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、カーネーションの園芸品種ラグナ（Laguna）の中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子のHPLC分析を、上の実施例16に記載する手順に従い実施して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン誘導体の存在を示した。これらの３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類は外因性DNA配列、すなわち、バイナリーベクターpCG P485を使用する形質転換により導入されたHf１cDNA配列の発現の結果としてのみ生産される。実施例21 バラcv．ロイアルティ（Royalty）＋pCGP485／pCGP628 プラスミドpCGP485およびpCGP628を、実施例11に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、カーネーションの園芸品種ロイアルティ（Royalty）の中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子のHPLC分析を、上の実施例16 に記載する手順に従い実施して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン誘導体の存在を示した。これらの３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類は外因性DNA配列、すなわち、バイナリーベクターpCGP485またはpCGP628を使用する形質転換により導入されたHf１cDNA配列の発現の結果としてのみ生産される。実施例22 バラcv．カルディナール（Kardinal）＋pCGP1458 プラスミドpCGP1458を、実施例11に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、バラの園芸品種カルディナールの中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子のHPLC分析を、上の実施例16に記載する手順に従い実施して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン誘導体の存在を示した。これらの３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類は外因性DNA配列、すなわち、バイナリーベクターpCGP1458を使用する形質転換により導入されたHf１cDNA配列の発現の結果としてのみ生産される。実施例23 cv．ブルー・リッジ（BlueRidge）＋pCGP484/pCGP485/pCGP628 プラスミドpCGP484，pCGP485およびpCGP628を、実施例12に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、クリサンテナム（Chrysanthemu m）の園芸品種ブルー・リッジ（BlueRidge）の中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子のHPLC分析を、上の実施例16に記載する手順に従い実施して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン誘導体の存在を示した。これらの３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類は外因性DNA配列、すなわち、バイナリーベクターpCGP484，pCGP485またはpCGP628を使用する形質転換により導入されたHf１cDNA配列の発現の結果としてのみ生産される。実施例24 改変された花序トランスジェニック植物における導入されたフラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素活性の発現は、花の色に対する顕著な作用を有することができる。トランスジェニック植物における花の組織は、非トランスジェニック対照植物の淡いピンクおよび赤からより濃いピンク／えび茶色ないし青／紫の色の範囲に変化することができる。色は、また、ロイアル・ホーティカルチュラル・ソサイアティイズ・カラー・チャート（Royal Horticultural Society's Colour Chart ）からの番号により記載することができる。一般に、変化は色が60Ｃ／Ｄ−65Ｃ／Ｄの淡いないし中間のピンクの色相から、70と85との間の色の正方形の多数であるが、すべてはないものにより表される、より濃いより青い／より紫の色相に動くように記載することができる。他の生化学的および生理学的条件は個々の結果に影響を与えそして特定の色の引用は可能な範囲を規定すると解釈すべきでないことを思い起こすべきである。前述のプラスミド構成体pCGP653を使用して生成した、受け入れ番号3655のトランスジェニックのカーネーションの花の場合において、花弁への明らかな効果が観察された。レッド・シム（Red Sim）カーネーションの園芸品種の通常オレンジ−赤の色（ロイアル・ホーティカルチュラル・ソサイアティイズ・カラー・チャート（Royal Horticultu ral Society's Colour Chart）の45Ａ／Ｂにほぼ相当する）は青／紫の色相に変化した。当業者は理解するように、ここに記載する本発明は特定的に記載したもの以外の変化および変更が可能である。本発明はすべてのこのような変化および変更を包含することを理解すべきである。本発明は、また、個々にまたは集合的に、この明細書に言及し、あるいは示したステップ、特徴、組成物および化合物のすべて、および前記ステップまたは特徴の任意の２またはそれ以上の任意のおよびすべての組み合わせを包含する。 Detailed Description of the Invention Transgenic flowering plant The present invention relates generally to transgenic flowering plants. For more details, The present invention is designed so that flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase can be expressed. Modified, allowing manipulation of intermediates in the flavonoid pathway , Transgenic rose, carnation and chrysanthemum plants. The petal industry has been improved from resistance to disease and pathogens to altered inflorescences. Endeavor to develop new and different flowering plants with different characteristics It Although classical breeding techniques have been used with some success, this Proches have been limited by the restriction of gene pools in certain species. For example, colored It is rare for a single species to have a full spectrum of varieties. But Thus, it is practical to attempt to generate transgenic plants that exhibit the desired characteristics. Efforts have been made. Major cut flower species such as roses, carnations The development of blue varieties of chrysanthemums and chrysanthemums is in the market of both cut flowers and ornamentals Will provide significant opportunities. The color of the flower depends mainly on two pigments: flavonoids and carotenoids. ing. Flavonoids contribute a range of colors from yellow to red to blue. Carote The noids impart an orange or yellow shade and are generally yellow or orange. It is the only pigment in range flowers. Flavonoids that make up the major contribution of flower color The molecules are cyanidin, delphinidin, petunidin, peonidin, malvidin. And anthocyanin, a glycosylated derivative of pelargonidin And are located in the vacuole. Different anthocyanins have significant differences in color Can be generated. The flower color is also copigumen with colorless flavonoids. Cationization, complexation with metals, glycosylation, acylation, methylation and vacuolar pH More affected (Forkmann, 1991). The biosynthetic pathway for flavonoid pigments (hereafter called the "flavonoid pathway") is Well established and shown in Figure 1 (Ebel and Hahlbrock, 1988; Hahlb rock and Griscbach, 1979; Wiering and de Vlaming, 1984; Schram et al., 1984. Stafford, 1990). The first step in this pathway is 3 molecules of malo It involves the condensation reaction of nyl-CoA with one molecule of p-coumaroyl-CoA. This reaction is an enzyme It is catalyzed by chalcone synthase (CHS). The products of this reaction 2 ', 4, 4 ', 6'-Tetrahydroxychalcone is usually the enzyme chalcone frovanone iso It is rapidly isomerized by merase (CHI) to produce naringenin. Naringe Nin is subsequently flavanone 3-hydroxylase (F3 H) is hydroxylated to produce dihydrokaempferol (DHK). The B ring of dihydrokaempferol is in the 3'or both 3'and 5'positions. Hydroxylated to give dihydroquercetin (DHQ) and dihydroxy, respectively. Produces doromyracetin (DHM). The two major enzymes involved in this pathway are Lavonoid 3'-hydroxylase and flavonoid 3 ', 5'-hydroxy Rase. Flavonoid 3'-hydroxylase acts on DHK to produce DHQ And acts on naringenin to produce eriodictythiol. Flavonoi De 3 ', 5'-hydroxylase (hereinafter referred to as 3', 5'-hydroxylase) Is the 3'and 5'positions of naringenin and DHK, and the eriodictyol and And hydroxyl at the 5'position of DHQ A broad-spectrum enzyme that catalyzes silylation (Stotz and Forkmann, 1982) , In both cases, produced pentahydroxyflavanone and DHM, respectively. To achieve. The pattern of B-ring hydroxylation of anthocyanins determines petal color Plays an important role in. Due to the restriction of the gene pool mentioned above, most of the major cut flowers have 3 ', 5'-hydrides. It lacks roxylase and can therefore display the range of colors that would otherwise be possible. I can't. This is especially the case for roses, carnations and chrysanthemums, which Make up a major proportion of the cut flower market worldwide. Therefore, plants, 3 ', 5'-Hydroxyler, especially changing roses, carnations and chrysanthemums , Which causes the metabolism of DHK, as well as other substrates such as DHQ, naringe. Transgenes that can provide a means to alter the metabolism of nin and eriodictyol It is required to create nick plants. Such changes are anthocyanins Affects Hydroxylation Patterns of Amino Acids and Derives from Delphinidin It enables the production of anthocyanins, which change the color of the petals and Allows a single species to express a broader spectrum of flower colors. High level Production of transgenic plants producing anthocyanins derived from delphinidin It is especially required to do so. According to the present invention, a gene construct is generated and a non-transgenic gene of the same species is generated. Expressing higher levels of delphinidin and / or its derivatives compared to It is used to make transgenic plants. These high level devices The production of rufinidine and related molecules has a range of altered flowering characteristics It is especially useful for producing the above plants. Accordingly, one aspect of the present invention is the flavonoid 3 ', 5'-hi. Producing a polypeptide having droxylase activity and Levels of Delphinidin-Derived Ants Compared to Non-Transgenic Plants in Japan A transformer selected from rose, carnation and chrysanthemum that produces anines Relates to a transgenic plant or its progeny. More specifically, the present invention relates to flavonoid 3 ′, 5′-hydroxylase activity. Of the same species, and the same non-transgenic gene of each species. Higher levels of delphinidin and / or delphinidin compared to A transgene selected from roses, carnations and chrysanthemums that produces derivatives Regarding the plant or its progeny. Preferably, the polypeptide is petunia, verbena, delphinium, grape , Iris, freesia, hydrangea, cyclamen, potato, tricolor violet, na Sus, Eustoma or Campanella. Preferably the polypeptide is a flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase. And most preferably petunia 3 ', 5'-hydroxylase. The gene construct of the present invention contains a sequence encoding 3 ', 5'-hydroxylase. Containing the encoding nucleic acid molecule and optionally additional sequences, such as transgenes. Promoters and terminators that enable the expression of said molecules in plants -Including sequences. If the genetic construct is DNA, it is cDNA or genomic DNA. Can be Preferably, the DNA is integrated into the genome of the plant so that the Comprises a chimeric gene construct capable of producing a transgenic plant It is in the form of a binary vector. Chimeric gene constructs are plant progenitors such as CHS. You can have a motor The gene sequence for 3 ', 5'-hydroxylase enhances expression and Can be modified to lead to increased levels of inidine and / or its derivatives it can. CHS promoter is a plant promoter in the flavonoid pathway And directs high-level expression of genetic sequences downstream of the promoter, It is convenient for The most preferred binary vectors are pCGP484, pCGP485, pCGP628 , PCGP653 and pCGP1458. As used herein, "nucleic acid molecule" refers to 3 ', 5'-hydroxyl A contiguous stretch of nucleotide bases that specifies the amino acid sequence of ze. Nucleic acid It can encode a full-length enzyme or a functional derivative thereof. What is a "derivative"? , Substitution or deletion of any single or multiple amino acids relative to a naturally occurring enzyme And / or add. In this regard, nucleic acids are 3 ', 5'-hydroxy. Includes a naturally-occurring nucleotide sequence encoding an enzyme, or Single or multiple amino acid substitutions, deletions and / or Or it can contain additions. The terms "analog" and "derivative" also refer to Extending to any functional chemical equivalent of 3 ', 5'-hydroxylase, said core The only requirement for the acid molecule is to produce transgenic plants according to the invention. When used, the transgenic plant exhibits one or more of the following properties Is that: (I) production of 3 ', 5'-hydroxylase-specific mRNA; (Ii) production of 3 ', 5'-hydroxylase protein; (Iii) production of delphinidin and / or its derivatives; and / or (Iv) Modified inflorescence. More specifically, the transgenic plant has one or more of the following properties: Indicates 2 or more: (I) increased levels of 3'above non-transgenic endogenous levels, 5'-hydroxylase specific mRNA (Ii) increased production of 3 ', 5'-hydroxylase protein; (Iii) Increased levels of Dell over non-transgenic endogenous levels Production of finidine and / or its derivatives; and / or (Iv) Modified inflorescence. The nucleic acid molecules used herein may be used alone or in combination with vector molecules. Or can be present in combination with an expression vector. Such a vector The offspring can replicate and / or be expressed in eukaryotic and / or prokaryotic cells it can. Preferably the vector molecule or part thereof is integrated into the plant genome. Can be The nucleic acid molecule further comprises sequences useful in promoting said integration. And / or a promoter capable of directing the expression of nucleic acid molecules in plant cells Can be included in the sequence. The nucleic acid molecule and the promoter can be any number of Means such as electroporation, particle gun or agrobacter Lium (Agrobacteriumu) Can be introduced into cells by mediated transfer. According to the invention, the nucleic acid molecule encoding the 3 ', 5'-hydroxylase is a valine. Transgenic selected from the list consisting of la, carnation and chrysanthemum Introduced into and expressed in a plant, which allows DHK and / or other A suitable substrate for the anthocyanins of anthocyanins, such as petunidine Can provide a means of converting into quinone, malvidin and especially delphinidin It The production of these anthocyanins is a blue or blue-like species. Can contribute to the generation of different colors, or else pelargoni From gin, cyanidin and paeonidine and their derivatives. And its derivatives can change the color of the flower. In the plant The expression of the nucleic acid sequences of can be constitutive, inducible or developmentally dependent. The expression "altered inflorescence" is naturally-occurring in view of the usual variability between petals. Means any change in flower color to flower color. Preferably a modified flower Introductory blue, purple or pink wear different from those in non-transgenic plants Includes the production of different shades of color. The present invention also increased over endogenous levels in non-transgenic plants Transgene showing high levels of delphinidin and / or its derivatives A method for producing flowering plants, said method comprising the steps of rose, carnation and chimera. Among the plant cells selected from the list consisting of A nucleic acid molecule that encodes a sequence that encodes an enzyme that enables ultimate expression of the nucleic acid molecule. The transgenic plant is regenerated from the cells by introducing it under the condition The transgenic plant with a 3 ', 5'-hydroxylase enzyme of the nucleic acid molecule Growth for a sufficient time and conditions to allow expression in The present invention also provides a transgene selected from roses, carnations and chrysanthemums. A method for producing a nick plant, in which flavonoid 3'is contained in the plant. Introduction of a gene construct containing a nucleic acid sequence encoding 5'-hydroxylase The transgenic plant comprises non-traffic plants of the same respective species. High levels of delphinidin-derived anthocyanins compared to transgenic plants It is characterized by producing. In a preferred embodiment, transgenic flowering plants are increased Exhibits altered inflorescence properties consistent with levels of delphinidin production, and The modified inflorescences are blue flowers or bluish depending on the physiological conditions of the recipient plant. It includes the generation of different colors. In certain plant species, it is possible to select a "high pH system". And is defined as a variety that has a pH higher than the average petal vacuolar pH. Be done. Origin of recombinant 3 ', 5'-hydroxylase or variants and derivatives thereof Sources are petunia, verbena, delphinium, grapes, iris and freesia. , Hydrangea, cyclamen, potato, tricolor violet, eustoma, campane Includes la and eggplant. Finally, the present invention also relates to all nucleic acid molecules representing 3 ', 5'-hydroxylase. Is a part and / or any homologues or related forms thereof. Lancegenic rose, carnation and chrysanthemum plants and especially increased 3 Increase in ′, 5′-hydroxylase-specific mRNA and / or delphinidin Extended to transgenic plants exhibiting improved production and / or altered inflorescence It Therefore, the transgenic plant should have a 3 ', 5'-hydroxylase enzyme. It contains a stably introduced nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding Book The invention has also been extended to the progeny of such transgenic plants, and Expanded to reproductive material (eg seeds). Such seeds are especially colored In this case, it may be useful as a registration marker for plants. The invention will be further described with reference to the following non-limiting figures and examples. In the drawing, Figures 1 (A) and 1 (B) show the biosynthetic pathway for flavonoid pigments. It is a schematic representation. The enzymes involved in the first part of this pathway are: PA L = phenylalanine ammonia-rear C4H = cinnamate 4-hydroxylase; 4CL = 4-coumarate; CoA Gauze; CHS = chalcone synthase; CHI = chalcone flavanone isomerase; F3 H = flavanone 3-hydroxylase; DFR = dihydroflavonol-4-reduct Tase; UFGT = UDP-glucose; flavonoid-3-O-glycosyl transfer Jerase. The next step is Petunia Hybrida (P．hybrida) The smell of flowers Corresponding conversions that can occur and include the following: I = cyanidine -3-glucoside and delphinidin-3-glucoside to glycosyl residues Addition of rhamnose sugar; 2 = acylation and 5-O.glycosylation; 3 = 3 ′ methyl Methylation; 4 = 5 'methylation; 5 = 3'5' methylation. FIG. 2 shows the construction of the binary expression vector pCGP812 whose construction is described in Example 3. It is a diagram display. Gent = gentamicin resistance gene; LB = left border; RB = right border; nptII = for neomycin siphosphotransferase II Expression cassette; GUS = β-glucuronidase coding region. Chimeric gene The insert is as shown and is described in Example 3. Restriction enzyme site Is marked. FIG. 3 shows the construction of the binary expression vector pCGP485 whose construction is described in Example 4. It is a diagram display. Gent = gentamicin resistance gene; LB = left border; RB = right border; nptII = for neomycin siphosphotransferase II Expression cassette. The insert of the chimeric gene is as shown, and in Example 4 Has been described. The restriction enzyme sites are marked. FIG. 4 shows the construction of the binary expression vector pCGP628 whose construction is described in Example 5. It is a diagram display. Gent = gentamicin resistance gene; LB = left border; RB = right border; nptII = neomycin Expression cassette for siphosphotransferase II. Chimera gene inserter Are as shown and are described in Example 5. The restriction enzyme site is marked ing. FIG. 5 shows the construction of the binary expression vector pCGP653 whose construction is described in Example 6. It is a diagram display. Gent = gentamicin resistance gene; LB = left border; RB = right border; nptII = for neomycin siphosphotransferase II Expression cassette. The insert of the chimeric gene is as shown, and in Example 6 Has been described. The restriction enzyme sites are marked. FIG. 6 shows the construction of the binary expression vector pCGP484 whose construction is described in Example 7. It is a diagram display. Gent = gentamicin resistance gene; LB = left border; RB = right border; nptII = for neomycin siphosphotransferase II Expression cassette. The insert of the chimeric gene is as shown, and in Example 7 Has been described. The restriction enzyme sites are marked. FIG. 7 shows the construction of the binary expression vector pCGP1458 whose construction is described in Example 8. It is a diagram display. nptI = neomycin siphosphotransferase I resistance Sex gene; LB = left border; RB = right border; nptII = neomycin siphosphot Expression cassette for lanceurase II. The chimeric gene insert is shown And described in Example 8. The restriction enzyme sites are marked. Fig. 8 shows the distribution of royalty callus tissue transformed with pCGP628. Figure 4 shows a photograph of an autoradiographic display of hybridization. Geno DNAEcoDigested with RI, and 720 bp of Hfl cDNAEcoProbing with RV internal fragments did. Negative control (N) is royalticalus tissue transformed with pCGP293. . The positive control (H) contains 10 pg of Hfl fragment. Arrows are transformed plants 2kb expected inEcoRI fragment is shown. Figure 9: Chrysanthemum cv. Blue transformed with pCGP484. ・ Autoradiography of Southern hybridization of ridge (Blue Ridge) plants The photograph of the display of Raffy is shown. Genomic DNA was digested with XbaI, which was 2.3 kb Hfl-PL 1.8 kb released from pCGP602 containing TP fragment and containing Hfl cDNAFsp I /BspProbed with HI fragment. Negative control (N) is blue transformation without transformation It is a genomic DNA isolated from the sage plant. Positive control (P) isXbaPCG digested with I It is the plasmid DNA of P485. Arrows are expected to 2.3 in transformed plants The product of kb is shown. Example 1 material Eriodictyol and dihydroquercetin with curl ro From Carl Roth KG and Naringenin from Sigma It was Dihydromyricetin from Myricetin (Extra Synthese, France) Verc It was chemically synthesized by the method of ruysse et al. (1985). 〔³H] -naringenin (5.7 Ci / mM) and [³H] -dihydroquercetin (12.4 Ci / mM) was added to Amersham (A mersham). All Enzymes Obtained from Commercial Sources and Manufacturers It was used according to the recommendation. E. coli used (Escherichia coli) The strains were as follows: DH5αsupE 44, Δ (lacZYA-ArgF) U169, φ80lacZ ΔM15,hsdR17 (r_k-, M_k+), recAl,endAl, gyrA96,thi-1,relAl,deoR. (Hanahan, 1983 and BRL, 19 86). Disarmed Agrobacterium tumefaciens (Agroba cterium tumefaciens) Stock AGLO (Lazo et al., 1991) And LBA4404 (Hockema et al., 1983), respectively, by Dr. R Ludwig (California (University, Faculty of Biology, Santa Cruz, USA) and Calgene Incorporated (Calgone, Inc.) Obtained from California, USA. Richa armed Agrobacterium tumefaciens strain ICMP8317 Dr. rd Gardner (University of Auckland, Department of Cellular and Molecular Biology, Genetic Technology Center) Tar, New Zealand). The cloning vector pBluescrpt was obtained from Stratagene. It was The plant has a minimum light intensity of 10,000 lux in a specialized growth chamber over a 14-hour daytime length. And grown at temperatures of 22-26. Example 2 Construction of pCGP90 from pCGP602 (International Patent Application PCT / AU92 / 00334; Publication No. WO93 / 01290) pCGP293 Mac promoter in sense orientation with cDNA insert (Comai et al., 1990) The plasmid pCGP90 was constructed by cloning behind. The binary expression vector pCGP293 is the Ti binary vector pCGN1559 (McBride or And Summerfelt, 1990). Plasmid pCGN1559KpnDigest with I, The protruding 3'end was standardized with T4 DNA polymerase (Sambrook et al. , 1989). Then this vectorXbaDigest further with I, and The resulting 5'overhang was repaired with the Klenow fragment of DNA polymerase I. Then this The vector was recombined to obtain pCGP67. Mac promoter, mas terminator and 1.97 kb containing various cloning sitesPSTPCGP4 the I fragment (Comai et al., 1990) Isolated from 0 and of pCGP67P st It was inserted into the I site to obtain pCGP293. From pCGN7334BamHI−SacRemoved the GUS gene (Jefferson et al., 1987) as an I fragment BamHI-from pBluescribe M13 containing the multiple cloning siteSac The plasmid pCGP40 was constructed by substituting the I fragment. Chimera Mac-GU The fragment containing the Smas gene was cloned into pCGN7329 (Comai et al., 1990).XhoInsert in I site Plasmid pCGN7334 (Calgene, Inc., California, USA). Obtained from the state). It then contains the aforementioned cDNA insertBamHI−KpnThe I fragment was isolated from pCGP602 , And of pCGP293BamHI−KpnLigated with the I fragment. Correct insert in pCGP90 The correct insertion was confirmed by restriction analysis of DNA isolated from gentamicin-resistant transformants. Was erected. Example 3 Construction of pCGP812 The binary expression vector pCGP812 is the Ti binary vector pCGN1558 (McBride or And Summerfelt, 1990). Contains the chimeric mas-35S-GUS-ocs gene 5.2 kbXhoThe I fragment was isolated from pKIWI101 (Jannsen and Gardner, 1989) and Then pBliescript KSXhoSubcloning into I gave pCGP82. Then The 5.2 kb fragment was HindIII /KpnRecombines by digestion with I and Hi of pCGN1558ndIII /K pn Subcloning into the I site gave pCGP83. Plasmid pCGP83KpnRestriction enzyme treatment with I, and the protruding 3'end It was removed with T4 DNA polymerase according to the protocol (Sambrook et al., 1989). Next so,SmaI-BamBind the HI adapter (Pharmasia) to the blunted KpnI siteBamH I got a "sticky" end. The chimeric Mac-Hf1-mas gene from pCGP807 (described later) Contains 3.8kbBglII fragment of pCGP83BamPCGP bound to HI "sticky" ends 812 was generated (Fig. 2). 1.8 kb containing the aforementioned Hfl cDNA from pCGP602BamHI−KpnI fragment of pCGP40Ba m HI−KpnThe plasmid pCGP807 was constructed by ligating with the I-terminus. Example 4 Construction of pCGP485 The binary expression vector pCGP485 is the Ti binary vector pCGN1547 (McBride or And Summerfelt, 1990). (I) from the snapdragon CHS gene Promoter sequence; (ii) the aforementioned cDNA insert from pCGP602 from Petunia Coding region of (i) and (iii) phospholipid transferr of petunia A chimeric gene consisting of the ze protein (PLTP) terminator sequence was constructed. The CHS promoter consists of a 1.2 kb gene fragment 5'of the translation initiation site (Somm er and Saedler, 1986). The petunia cDNA insert is the cDNA clone for pCGP602. 1.6kb fromBclI /FspConsisting of I fragment (International patent application PCT / AU92 / 00334 Publication number WO93 / 01290). The PLTP terminator sequence is pCGP13ΔBam (Holton, 19 0.7 kb from 92)SmaI /XhoI fragment, which is the transcribed region of the PLTP gene. Includes a 150 bp untranslated region. Chimera CHS / cDNA insert / PLTP gene into pCGN 1547'sPSTIt was cloned into the I site to construct pCGP485. Example 5 Construction of pCGP628 Plasmid pCGP176 (International Patent Application PCT / AU92 / 00334; Publication Number WO93 / 01290 )EcoRI andSpeDigested with I. The digested DNA was digested with Klenow fragment into a standard protocol. (Sambrook et al., 1989) and filled in and self-ligated. This Obtained plasm Is displayed as pCGP627. pCGP627XbaI /KpnThe I digest produced a 1.8 kb fragment, This fragment of pCGP293XbaI /KpnIt ligated with the 14.5 kb fragment obtained by I digestion. The plasmid thus prepared was designated as pCGP628. Example 6 Construction of pCGP653 Plasmid pCGP293 (described above in Example 2)XbaDigests with I and produces 5 ′ Overfill with Klenow fragment according to standard protocols (Sambrook et al., 1989). I got in. Then itHindDigested with III. During this procedure, the Mac promoter (Comai et al., 1990). 0.8kb petunia from pCGP669 (discussed below) CHS-A promoter of blunt-ended into the backboneEcoRI /HindIII fragment Combined as. This plasmid product was designated as pCGP672. of pCGP807 (described in Example 3 above)XbaI /Asp718 digestionHflContains cDNA Generates a 1.8 kb fragment, which is the 16.2 kb fragment from pCGP672.XbaI /Asp718 fragment and bond It matched. The plasmid thus prepared was designated as pCGP653. Using the CHS-A gene promoter fragment as a primer by PCR, Leotide CHSA-782 and CHSA + 34 (see sequence below) and PE as template. Amplification was performed using Pctunia hybrida V30 genomic DNA. The PCR product was cloned into the ddT tail pBluescript (Holton and Graham, 1991). The orientation of the gene fragments was evaluated by restriction map. Thus The constructed plasmid was designated as pCGP669. The oligonucleotide primer is , Designed against the published sequence of the CHS-A promoter in Petunia (Koes, 1988). Example 7 Construction of pCGP484 Construction of pCGP484 is similar to that for pCGP485 outlined above in Example 4. Identical except that pCGP484 has a 3.5 kbPSTI fragment (chimeric gene CHS-Hf1-PLTP In the opposite direction. Example 8 Construction of pCGP1458 Plasmid pCGP1458 is a 10 kb binary vector pBIN19 as a backbone. (Bevan, 1984). Plasmid pBIN19EcoDigested with RI and then The resulting overhanging 5'end was labeled according to standard protocols (Sambrook et al., 1989). Filled in using the Klenow fragment. Plasmid pCGP485PSTDigested with I Then, the chimeric CHS / cDNA insert / PLTP gene was removed as a 3.5 kb fragment.Ps t The 3'overhang resulting from I was removed with T4 DNA polymerase and this fragment was then added. Mid-filled in pBIN19EcoIt was bound in the RI site. Example 9 Transformation of E. coli and Agrobacterium tumefaciens Vector pCGP812, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653, pCGP484 or pCGP1 E. coli using one or the other of 458 (Escherichia coli) Strain DH5α-fine Transformation of cells with standard protocols (Sambrook et al., 1989) or Inoue et al., (1 990). Inoculate 50 ml of MG / L (Garfinkel and Nester, 1980) culture. The mixture was prepared by growing it at 28 ° C with shaking for 16 hours. To 100 μl of Tentagogrobacterium tumefaciens cells, 5 μg of By adding Sumi DNA, plasmids pCGP8I2, pCGP90, pCGP485, pCG P628, pCGP653, pCGP484 or pCGP1458 is a suitable Agrobacterium tumefa Introduced into Ciens strain. The cells were then pelleted and 0.5 ml of 85% (v / V) 100 mM CaCl₂/ 15% (v / v) glycerol. DNA-a Add the Globacterium mixture to liquid N₂By incubating for 2 minutes in Frozen by thawing and then thawed by incubating at 37 ° C for 5 minutes. I let you. The DNA / cell mixture was then placed on ice for an additional 10 minutes. Then fine Mix the cells with 1 ml of MG / L medium and incubate for 16 hours at 28 ° C with shaking. Was added. pCGP812, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653 or pCGP484 Agrobacterium tumefaciens cells containing 100 μg / ml genta Selection was done on MG / L agar plates containing mycin. Aggro with pCGP1458 Bacterium tumefaciens cells containing 100 μg / ml kanamycin Selected on MG / L agar plates. Presence of plasmid is gentamicin resistant Confirmed by Southern analysis of DNA isolated from transformants. Example 10 The Anthus Calliofils (Dianthus caryophyllus) Transformation a. Plant material The Anthus Calliofils (Dianthus caryophyllus) (Cv. Crowley Sim. , Red Sim, Laguna) cuttings by Van Wick and Sun Flower Sup Rye (Van Wyk and Son Flower Supply), Victoria, Australia, Obtained from. Remove outer leaves And cut the cuttings briefly for 70% (v / v) ethanol, then 1.25% (w / v) Sterilize in sodium chlorite (including Tween 20) for 6 minutes and with sterile water. Rinsed 3 times. Place all visible leaves and axillary buds under a dissecting microscope before co-culturing Removed. b. Agrobacterium and Gianthus (Dianthus) Co-culture of tissues Contains one of the binary vectors pCGP90, pCGP812, pCGP485 or pCGP653 Agrobacterium tumefaciens strain AGLO (Lazo et al., 1991) at 100 mg / MG / L (Garfinkel and Nester, 1980) agar containing 1 gentamicin It was maintained above ground at 4 ° C. Single colonies were grown overnight in liquid MG / L medium. 5x10 in the mouth immediately before inoculation⁸Diluted to cells / ml. 3% (w / v) Sucrose, 5 mg / l α-naphthalene acetic acid (NAA), 20 μM acetosyringo And 0.8% Difco Bacto Agar (pH 5.7) On supplemented Murashige and Skoog (1962) medium (MS) And the Anthus (Dianthus) Tissues were co-cultured with Agrobacterium. c. Transgenic Gianthus (Dianthus) Plant regeneration 1 mg / l benzylaminopurine (BAP), 0.1 mg / l NAA, 150 mg / l kana Mycin, 500 mg / l ticarcillin and 0.8% Difco Bact agar ( Transfer co-cultured tissue to MS medium supplemented with Difco Bacto Agar (selection medium) It was After 3 weeks, explants were transferred to fresh selective medium and at this stage stem explants Care was taken to remove the axillary shoots from. Healthy after 6-8 weeks on selective medium Adventitious shoots with 3% sucrose, 150 mg / l kanamycin, 500 mg / l ticarsi Phosphorus, a holder containing 0.8% Difco Bacto Agar Transferred to Mon-free MS medium. This stage GUS histochemical assay (Jefferson, 1987) and / or NPT II dot at Identification of transgenic shoots using a blot assay (McDonnell et al., 1987) did. Transgenic shoots with 3% sucrose, 500 mg / l ticarcillin And 0.4% (w / v) Gelrite Gellan Gum (Sch Weizerhall) was transferred to MS-containing medium for root induction. All cultures It was maintained at 23 ± 2 ° C. under a 16-hour photoperiod (120 μE cold white fluorescent light). Planting When the plants form roots and reach a height of 4-6 cm, the plants are acclimated under the mist. did. High ratios of soaked water in hydroponic mixture (Kandreck and Black, 1984). Light mixture (75% or more) was used for acclimatization, Typically lasted 4-5 weeks. Plants were exposed to a 14-hour photoperiod (200 μE halogen Acclimatization at 23 ° C under a mercury vapor lamp). Example 11 Rosa Hybrida (Rosa hybrida) Transformation 1. Rosa Hybrida (Rosa hybrida) Cv Royalty The plant tissue of the rose cultivar Loyalty, PCT91 / 04412, publication number Transformation was performed according to the method disclosed in WO92 / 00371. 2. Rosa Hybrida (Rosa hybrida) Cv Kardinal a. Plant material Shoot Kardinal shoots with Ban Wik & Sun Flawa Supply (Van Wyk and Son Flower Supply), Victor Australia Obtained from Ria. Remove the leaves and remove the remaining shoots (5-6 cm) by 1.25% ( w / v) sodium hypochlorite Sterilized for 5 minutes in a glass (including Tween 20), then rinsed 3 times with sterile water. Immerse the isolated shoot tips in sterile water for 1 hour, and before co-cultivation, add 3% Sucrose, 0.1 mg / l BAP, 0.1 mg / l kinetin, 0.2 mg / l gibberelli Acid, 0.5% (w / v) polyvinylpyrrolidone and 0.2% gellite gellan Pre-cultured for 2 days on MS medium containing gum (Gelrite Gellan Gum). b. Agrobacterium and Rosa (Rosa) Simultaneous culture of shoot tissue Agrobacterium tumefaciae containing the binary vector pCGP812 Ns ICMP 8317 (Janssen and Gardner, 1989) and AGLO at 100 mg / l Maintained at 4 ° C on MG / L agar plates containing tamycin. Each agro Single colonies from bacterium strains were grown overnight in liquid MG / L medium. 5 × 10⁸A final concentration of cells / ml was prepared the day before dilution in liquid MG / L medium. Prior to inoculation, the two Agrobacterium cultures were mixed in a ratio of 10: 1. (AGLO / pCGP812: 8317 / pCGP812). Cut longitudinally through shoot shoot tips and mix 2 μl aliquots of Agrobacterium culture were placed as drops on shoot shoot tips . Shoot shoot apexes were co-cultured for 5 days on the same medium used for pre-culture. Agrobacterium tumefaciae containing the binary vector pCGP1458 4 mg on a MG / L agar plate containing 100 mg / l kanamycin. Maintained at. Single colony from each Agrobacterium strain in liquid MG / L Grow overnight in medium. 5 x 10⁸Dilute final concentration of cells / ml in liquid MG / L Prepared the day before. c. Transgenic Rosa (Rosa) Plant regeneration After co-cultivation, shoot shoot tips were transferred to selective medium. Shoot shoot apex fresh every 3-4 weeks Various selective media. Goals observed on shoot shoot tips Were excised when they reached a diameter of 6-8 mm. Shoot the isolated goal For the formation of 3% sucrose, 25 mg / l kanamycin, 250 mg / l Fotaxime and 0.25% Gelrite Gellan Gum Transferred to the containing MS medium. Isolate the regenerated shoots from the goal tissue and select Moved to the ground. Transfect using the GUS histochemical assay and callus assay. Nick shoots were identified. 3% of transgenic shoots for root induction Sucrose, 200 mg / l cefotaxime and 0.25% gelite gellan ga Maduca sexta medium containing Gelrite Gellan Gum Moved to. All cultures were exposed to 23 ± under a 16-hour photoperiod (60 μE cold white fluorescent light). Maintained at 2 ° C. Root system grows well and shoots reach 5-7 cm in length When transgenic rose plants were autoclaved in 8 cm tubes Transferred to Debco 514110/2 potted mixture. After 2-3 weeks, the plants are potted to 15 cm. Replant using the same potting mix in It was kept under photoperiod (300 μE mercury halide lamp). After 1-2 weeks, potted Move the plant to a glass room (day / night temperature: 25-28 / 14 ℃) and let it grow until flowering. Lengthened Example 12 Chrysanthenum Morifolium (Chrysanthemum morifolium) Transformation a. Plant material Chrysanthenum Morifolium (Chrysanthemum morifolium) (Cv. Blue Ridge, Pnennine Chorus) Cuttings, F & I Bagley Flower and Plan Baguley Flower and Plant Growers, Australia Obtained from Victoria, It was Remove the leaves from the cuttings, then briefly this with 70% (v / v) ethanol, then Sterilized in 1.25% (w / v) sodium hypochlorite (including Tween 20) for 3 minutes And rinsed 3 times with sterile water. Internodal stem sections were used for co-culture. b. Agrobacterium and Chrysanthenum (Chrysanthemum) Simultaneous organization culture Contains one of the binary vectors pCGP90, pCGP484, pCGP485 or pCGP628 Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 (Hoekema et al., 1983) MG / L agar containing mg / l rifampicin and 10 mg / l gentamicin Grow on plates. A single colony from each Agrobacterium Grow overnight in body medium. Glycerol was added to these liquid cultures at 10% and Then, 1 ml aliquot was transferred to a freezer (-80 ° C). Each frozen agrobacterium A 100-200 μl aliquot of Um was added to 50 mg / l rifampicin and 10 mg / l gel. Grow overnight in MG / L containing ntamycin. 5 x 10⁸Final concentration of cells / ml The degree is measured on the day before dilution in liquid MG / L containing 3% (w / v) sucrose, Prepared. Stem sections were used for LBA4404 / pCGP90, LBA4404 / pCGP484, LBA4404 / pCGP485 or Is co-cultured with Agrobacterium containing one of LBA4404 / pCGP628 The cells were co-cultured on the medium for 4 days. c. Transgenic Chrysanthenum (Chrysanthemum) Plant regeneration After co-cultivation, stem sections were transferred to selective medium. After 3-4 weeks, regenerate explants to be regenerated It was transferred to a different medium. Isolate adventitious buds that survive kanamycin selection and Induction of shoot elongation and root induction in MS medium containing isin and cefotaxime I moved it. All cultures were placed under a 16-hour photoperiod (80 μE cold white fluorescent light) for 23 hours. ± 2 ° C odor Maintained. Collect leaf samples from kanamycin-rooted plants and Transgenic plants were identified using immunoblot analysis. Transgeny Kuk Sansan (Chrysanthemum) When the plant reaches a length of 4-5 cm, Add them to an 8 cm autoclaved Debco 514110/2 potted mixture. Moved. After 2 weeks, the plants are placed again in a 15 cm pot using the same potting mixture. Planted and under a 14-hour photoperiod (300 μE mercury halide lamp) at 23 ° C Maintained. Two weeks later, potted plants were placed in a greenhouse (day / night temperature: 25-28 ℃ / 14 ℃) And grown to flowering. Example 13 Southern analysis a. The Anthus (DianthusIsolation of genomic DNA from DNA isolated from tissue essentially as described in Dellaporta et al., (1983). did. The DNA preparation was further purified by CsCl buoyancy density centrifugation (Sambrook et al., 1989). It was b. Chrysanthenam (ChrysanthemumIsolation of genomic DNA from 4.5 M guanidinium thiocyanate, 50 mM EDTA pH 8.0, 25 mM sodium citrate Thorium pH 7.0, 0.1M 2-mercaptoethanol, 2% (v / v) lauryl DNA was isolated from leaf tissue using an extraction buffer containing sarcosine. plant Liquid N₂In a fine powder, then add extraction buffer (5 ml / g set) Weave) and the solution was mixed on a rotating wheel for 16 hours. This mixture is then Extract twice with enol: chloroform: isoamyl alcohol (50: 49: 1), Then add 3 volumes of genomic DNA and 15 minutes at 10,000 rpm. Precipitated by centrifugation. c. Rosa (RosaIsolation of genomic DNA from Liquid N₂Crush with a mortar and pestle in the presence of Extraction buffer (0.14M sorbitol, 0.22M Tris-HCl [pH 8.0 ], 0.022M EDTA, 0.8M NaCl, 0.8% (w / v) CTAB, 1% N-lauric The DNA was extracted by the addition of (Lusarcosine). Chloroform (200μ 1) was added and the mixture was incubated at 65 ° C for 15 minutes. Distant After centrifugation, the supernatant was extracted with phenol-chloroform and then an equal volume of isop Add to lopanol and mix by inverting. The mixture is centrifuged and pelleted. Were washed with 95% ethanol, recentrifuged, and washed with 70% ethanol. Bae The letts were vacuum dried and resuspended in 30 μl TE buffer (pH 8.0). d. Southern blot 60 units of genomic DNA (10 μg) for 16 hoursEcoDigested with RI and TAE (40 mM Tris-acetate, 0.7% (w / v) agarose gel in 50 mM EDTA buffer Electrophoresis through the filter. Then denaturate the DNA (1.5M NaCl / 0.5M NaOH) Denaturation in 1-1.5 hours in 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5) /1.5 M NaCl Neutralize for 3 hours and then transfer the DNA to a Hybond N (Amersham) filter in 20 × SSC. It was transcribed. A putative Dianthus, Ro obtained after selection for kanamycin Southern analysis of Rosa and Chrysanthemum plants was performed on The integration of the appropriate chimeric gene into the murine was confirmed. Example 14 Northern analysis a. The Anthus (Dianthus) And Chris Santenam (Chrysanthemum) RNA Liquid N₂Frozen in and crushed into a fine powder using a mortar and pestle RNA was isolated from all tissues. 4M guanidinium isothiocyanate, 5 Extraction of 0 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM EDTA, 0.1% (v / v) sarcosyl Buffer was added to the tissue, and the mixture was allowed to run on the polytron at maximum speed. And homogenized for 1 minute. The suspension is filtered through Miracloth (Calbiochem) And centrifuged in a JA20 rotor for 10 minutes at 10,000 rpm. Collect the supernatant And 0.2 g / ml CsCl (w / v). Then sample the 38.5 ml quill. 10 ml of 5.7 M CsCl, 50 mM EDTA (pH 7.0) in a Qusier centrifuge tube (Beckman) Layered on the cushion and 1 at 23 at 42,000 rpm in a Ti-70 rotor. It was centrifuged for 2 to 16 hours. Pellet the TE / SDS (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM E) Resuspended in DTA, 0.1% (v / v) SDS) and in 10 mM EDTA (pH 7.5) Phenol saturated with: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) It was extracted with. After ethanol precipitation, the RNA pellet was resuspended in TE / SDS. 40 mM morpholinopropanesulfonic acid (pH 7.0), 5 mM sodium acetate, 0.1 Using a running buffer containing mM EDTA (pH 8.0), 2.2 M formaldehyde A sample of RNA was electrophoresed through a de / 1.2% (w / v) agarose. Made of RNA Transfer to Hybond-N filter (Amersham) as described by the manufacturer, and³² P-labeled cDNA fragment (10⁸cpm / μg, 2 × 10⁶cpm / ml). The Rehybridization (1 hour at 42 ° C) and hybridization (16 hours at 42 ° C) with 50% (v / v) formamide, 1 M NaCl, 1 % (W / v) SDS, 10% dextran sulfate. Decomposed salmon sperm D NA (100 μg / ml) for the hybridization step³²P-labeled professional Tube was added. The filters were washed in 2 x SSC / 1% (w / v) SDS at 65 ° C for 1-2 hours. And then washed in 0.2 x SSC / 1% (w / v) SDS at 65 ° C for 0.5-1 hour. Filter on Kodak XAR film using intensifying screen at -70 ° C 4 Exposed for 8 hours. Dianthus cv. Transformed with plasmid pCGP90. Red Sim ( Red sim) Northern analysis showed that 8 out of 13 plants were positive. b. Rosa (Rosa) RNA Extract total RNA from petals (buds and flowers 5 days after harvest) according to the method of Manning, 1991. I put it out. Example 15 DNA probe³²P labeling A DNA fragment (50-100 ng) was added to 50 μCi of [α-³²P] -dCTP oligo labeling kit ( Bresatec) was used for radiolabeling. Not incorporated [α-³²P] -dCTP Was removed by chromatography on a Sephadex G-50 (Fine) column. Example 16 Anthocyanidin analysis Acid hydrolysis of anthocyanin molecules present in the petal extract prior to HPLC analysis The glycosyl moiety was removed from the anthocyanidin core. Anthocyanin The pattern of the hydroxylation of the dye to the B ring is determined by the anthocyanidin core molecule HP Determined by LC analysis. The HPLC system used in this analysis was a multi-wavelength detector ( It was a Hewlett-Packerd 1050 equipped with MWD. Reverse Phase Chromatographic Separation Spherisorb S50DS2 Carriage ・ Implemented with an ID of 250 mm x 4 mm on the column. a. Extraction of anthocyanins and flavonoids Using 5 ml of methanol containing 1% (v / v) aqueous 6M hydrochloric acid, flowers Flower pigment was extracted from the valve segment (about 50 mg). Dilute the extract with water (1: 9) And filtered (Millex HV, 0.45μ) before injection into the HPLC system. b. Hydrolysis of anthocyanins The crude methanol extract (100 μl) obtained in a) above was Dry nitrogen flow at room temperature in a Pierce Reacti-Vial Was evaporated to dryness using. Dissolve the residue in 200 μl of 2M HCl and place in a vial. Cover and then heat at 100 ° C. for 30 minutes. Dilute the hydrolysis mixture with water (1: 9) And filtered (Millex HV, 0.45μ) before HPLC analysis. c. Chromatography Separation of flower pigments was performed by gradient elution using the following system: Solvent A: (triethylamine: concentrated H₃PO_Four: H₂O) (3: 2.5: 1000) Solvent B: Acetonitrile Gradient conditions: 5% B to 40% B over 20 minutes Flow rate: 1 ml / min Temperature: 35 ℃ Detection: Acquisition of simultaneous data at MWD, 280, 350 and 546 nm. The anthocyanidin peak was identified by reference to known standards. Among the petal extracts An alternative method for the analysis of anthocyanin molecules present in Brugliera et al., 1994. Found in. HPLC analysis was performed to determine plasmids pCGP90, pCGP485, pCGP484, pCGP628, pCGP6. Carnation, chrysanthemum, transformed with 53 or one of pCGP1458 or others Of Delphinidin, pelargonidin and cyanidin in red and rose samples Determine the existence of. Trang Representative of pCGP90, pCGP485 and pCGP653 in flowers of transgenic carnations The data are shown in Table 1. Example 17 Preparation of plant extracts for assaying for 3 ', 5'-hydroxylase activity 10 times volume of plant tissue ice-cold extraction buffer (100 mM potassium phosphate (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.25 M sucrose, 25 M mannitol, 0.1% (w / v) BSA , 0.1 mg / ml PMSF, 20 mM 2-merca Homogenized in putoethanol and 10 mg / ml polyclar AT) . Homogenate at 13,000 rpm in JA20 rotor (Beckman) for 10 minutes at 4 ° C. Centrifuge and aliquot a portion of the supernatant for 3 ', 5'-hydroxylase activity. Decided Assay for 3 ', 5'-hydroxylase The 3 ', 5'-hydroxylase activity was described in stotz and Forkmann (1982). It was measured by a modified method. Assay reaction mixture is typically 200 μl Assay buffer (100 mM potassium phosphate pH 8.0, 1 mM EDTA) in the final volume of And 20 mM 2-mercaptoethanol), 195 μl plant extract, 5 μl 5 0 mM NADPH, and 10^Fivedpm¹⁴C] Naringenin was contained. Overnight at 23 ° C After the incubation, the reaction mixture was extracted twice with 0.5 ml ethyl acetate. vinegar The ethyl acid phase was dried under vacuum and then resuspended in 10 μl ethyl acetate. The radiolabeled flavonoid molecules were then loaded onto a thin layer of cellulose (Me rck Art 5577, Germany) chloroform: acetic acid: water (10: 9: 1, v / v) Separated using a solvent system. After the chromatography is complete, air the TLC plate. Dry, and localize reaction products by autoradiography and Elio, a non-radioactive naringenin, developed along the product and visualized under UV light Compare with standards of dioctyl, dihydroquercetin and dihydromyricetin It was identified by Example 18 Transformation of various horticultural varieties Construct pCGP90, pCGP812, pCGP628, pCGP485, pCGP653, pCGP484 or pCGP145 Chimeric genes containing any one of 8 are described in Examples 10, 11 and 12. Using Agrobacterium-mediated gene transfer, rose, carnation And among plant varieties of chrysanthemums To introduce. Incorporation of the appropriate chimeric gene into the plant genome Confirmed by Southern analysis of plants obtained after selection and described in Example 16 above. As such, HPLC analysis is used to detect the presence of anthocyanins. Successfully transgenic and expressing a transgene according to the invention Plants capable of producing 3 ', 5'-hydroxylase activity 3 ', 5'-hydroxyl compared to a non-transgenic control containing no Level of 3 ', 5'-hydroxylase enzyme in addition to fluorinated anthocyanins It has activity (see Example 16). Example 19 Carnation cv. Crowley Sim + pCGP90 Plasmid pCGP90 was cloned into the Agrobacterium-mediated vector as described in Example 10. Carnation gardening variety Crowley Si (Crowley Si) m). Integration of the construct in the plant genome is not possible after kanamycin selection It was confirmed by Southern analysis of the plants obtained in. NptII and Hf1 in 9 plants It was examined for the presence of the gene and for the production of delphinidin. analyzed 8 out of 9 plants were positive for both nptII and Hf1, but HPL C analysis can detect evidence of delphinidin production by these plants None (see Table 2; "Kan" = kanamycin). Example 20 Carnation cv. Laguna ＋ pCGP485 Plasmid pCGP485 was mediated by Agrobacterium as described in Example 10. Introduced into carnation garden variety Laguna using gene transfer did. Incorporation of the construct in the plant genome was obtained in plants obtained after kanamycin selection. Corroborated by Southern analysis. Anthocyanin molecule present in petal extract HPLC analysis of 3 ', 5'-hydrido was performed according to the procedure described in Example 16 above. The presence of roxylated anthocyanin derivatives was shown. These 3 ', 5'-hydro The xylated anthocyanins are exogenous DNA sequences, namely the binary vector pCG. Only as a result of expression of the Hf1 cDNA sequence introduced by transformation using P485 Produced. Example 21 Rose cv. Royalty + pCGP485 / pCGP628 Plasmids pCGP485 and pCGP628 were used as described in Example 11 to Carnation using therium-mediated gene transfer It was introduced into the cultivar'Royalty '. Organization in the plant genome Somatic integration was confirmed by Southern analysis of plants obtained after kanamycin selection. It was HPLC analysis of the anthocyanin molecule present in the petal extract was performed according to Example 16 above. 3 ', 5'-hydroxylated anthocyanin derivative by performing the procedure described in 1. The presence of a conductor was indicated. These 3 ', 5'-hydroxylated anthocyanins are Exogenous DNA sequences, i.e. using the binary vector pCGP485 or pCGP628 Produced only as a result of expression of the Hf1 cDNA sequence introduced by the transformation. Example 22 Rose cv. Cardinal + pCGP1458 Plasmid pCGP1458 was mediated by Agrobacterium as described in Example 11. It was introduced into the rose garden variety Cardinal using gene transfer. Botanical Incorporation of the construct in the flesh was confirmed by Southern analysis of plants obtained after kanamycin selection. Corroborated by HPLC analysis of anthocyanin molecules present in petal extract , 3 ', 5'-hydroxylated amide, carried out according to the procedure described in Example 16 above. The presence of tocyanine derivatives was indicated. These 3 ', 5'-hydroxylated anions Tocyanins use exogenous DNA sequence, ie binary vector pCGP1458 Produced only as a result of expression of the Hf1 cDNA sequence introduced by the transformation . Example 23 cv. Blue Ridge ＋ pCGP484 / pCGP485 / pCGP628 Plasmids pCGP484, pCGP485 and pCGP628 were prepared as described in Example 12, Using Agrobacterium-mediated gene transfer, Chrysanthemu (Chrysanthemu) Introduced in the cultivar Blue Ridge (m). In the plant genome Incorporation of the construct is Kanamai Confirmed by Southern analysis of plants obtained after syn selection. Exists in petal extract An HPLC analysis of existing anthocyanin molecules was performed according to the procedure described in Example 16 above. Upon application, the presence of 3 ', 5'-hydroxylated anthocyanin derivative was demonstrated. This These 3 ', 5'-hydroxylated anthocyanins are exogenous DNA sequences, ie Then, for transformation using the binary vector pCGP484, pCGP485 or pCGP628 Produced only as a result of expression of the more introduced Hf1 cDNA sequence. Example 24 Modified inflorescence Introduced flavonoid 3 ', 5'-hydro in transgenic plants Expression of xylase enzyme activity can have a significant effect on flower color . Floral tissues in transgenic plants are non-transgenic control plants From pale pink and red to darker pink / maroon to blue / purple colors Can change. The colors are also Royal Horticultural Social Royal Horticultural Society's Color Chart ). Generally, the color changes are 60C / D-65C From a pale to medium pink hue of / D, with a large number of squares of colors between 70 and 85 Darker, bluer / purple hues represented by what is, but not all Can be described as moving. Other biochemical and physiological conditions are individual consequences. Affecting fruits and citations of a particular color should not be construed as defining the possible range. You should remember that. Accession number 3655 generated using the plasmid construct pCGP653 described above. Clear effect on petals in case of transgenic carnation flowers Was observed. Red Sim Carnation garden varieties usually me Red-red color (Royal Ho ー Cultural Society Color Chart (Royal Horticultu 45A / B of the ral Society's Color Chart) corresponds to blue / purple hue Turned into Those skilled in the art will appreciate that the invention described herein is not specifically described. Can be changed and changed. The present invention makes all such changes and modifications. It should be understood to include. The present invention also includes, individually or collectively. All of the steps, features, compositions and compounds referred to or shown in the specification of And any two or more of any of the above steps or features All combinations are included.

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月２９日【補正内容】【図１】【図１】【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年７月４日【補正内容】明細書翻訳文第３頁第２１行目〜第５頁第７行目の記載「本発明によれば…pCGP 1458である。」を次の通りに補正する。『本発明によれば、遺伝子構成体を発生させ、そして同一種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジンおよび／またはその誘導体を発現するトランスジェニック植物をつくるために使用する。本発明によれば、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼに操作可能に連鎖されたフラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からのプロモーターを含んでなる遺伝子構成体は高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類の発現を指令することができることが決定された。これらの高いレベルのデルフィニジンおよび関係する分子の生産は、改変された花序特性を示すある範囲の植物を発生させるとき特に有用である。したがって、本発明の１つの面は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子に操作可能に連鎖されたフラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からのプロモーターを含んで成る遺伝子を有し、同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類を生産する、バラ、カーネーションおよびキクもしくはそれらの後代、または顕花部分から選択されるトランスジェニック植物に関する。好ましくは、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼはペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである。最も好ましくは、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼはペチュニア起源のものである。本発明の遺伝子構成体は、３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする配列をコードする核酸分子を含みそして必要に応じて追加の配列、例えば、トランスジェニック植物の中で前記分子の発現を可能とするプロモーターおよびターミネーターの配列を含む。遺伝子構成体がDNAである場合、それはcDNAまたはゲノムDNAであることができる。好ましくは、DNAは植物のゲノムの中に組込まれて本発明のトランスジェニック植物を生産することができるキメラ遺伝子構成体を含んでなるバイナリーベクターの形態である。キメラ遺伝子構成体は、フラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からの植物プロモーターを有する。好ましいプロモーターはカルコンシンターゼ（CHS）をコードする遺伝子からのものであり、そして「CHSプロモーター」と呼ぶ。CHSプロモーターは、その下流に操作可能に連鎖された遺伝配列の高いレベルの発現を指令するので、特に好ましい。最も好ましいバイナリーベクターはpCGP484，pCGP485，pCGP653およびpCGP1 458である。』請求の範囲１．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子に作用可能に連結されたフラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からのプロモーターを含んでなる遺伝子構成体を有し、同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類を生産する、バラ、カーネーションおよびキクもしくはそれらの後代、またはそれらの花序から選択されるトランスジェニック植物。２．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである請求項１記載のトランスジェニック植物。３．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニア起源のものである請求項２記載のトランスジェニック植物。４．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがトルコギキョウ起源のものである請求項２記載のトランスジェニック植物。５．プロモーターがカルコンシンターゼ（CHS）をコードする遺伝子からのものである請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック植物。６．遺伝子構成体がpCGP484，pCGP485，pCGP653およびpCGP1458から選択されるプラスミドの中に含有されている請求項５記載のトランスジェニック植物。７．前記植物がバラである請求項３ないし６記載のトランスジェニック植物。８．前記植物がカーネーションである請求項３ないし６記載のトランスジェニック植物。９．前記植物がキクである請求項３ないし６記載のトランスジェニック植物。 10．改変された花序を示す請求項１記載のトランスジェニック植物。 11．改変された花序を示す請求項７記載のトランスジェニック植物。 12．改変された花序を示す請求項８記載のトランスジェニック植物。 13．改変された花序を示す請求項９記載のトランスジェニック植物。 14．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に作用可能に連結されたフラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からのプロモーターを含んでなる遺伝子構成体をバラ、カーネーションおよびキクの中に導入することを含んでなり、該トランスジェニック植物が同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類のアントシアニン誘導体を生産することを特徴とする、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物を作出する方法。 15．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである請求項14記載の方法。 16．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニア起源のものである請求項15記載の方法。 17．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがトルコギキョウ起源のものである請求項15記載の方法。 18．プロモーターがカルコンシンターゼ（CHS）をコードする遺伝子からのものである請求項14〜17のいずれかに記載の方法。 19．遺伝子構成体がpCGP484，pCGP485，pCGP653およびpCGP1458から選択されるプラスミドの中に含有されている請求項15記載の方法。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年７月１１日【補正内容】 20．前記植物がバラである請求項16ないし19記載の方法。 21．前記植物がカーネーションである請求項16ないし19記載の方法。 22．前記植物がキクである請求項16ないし19記載の方法。 23．前記トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求項14記載の方法。 24．前記トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求項20記載の方法。 25．前記トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求項21記載の方法。 26．前記トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求項22記載の方法。 27．植物のゲノムの中に組込まれて請求項１記載のトランスジェニック植物を作出することができる遺伝子構成体を含んでなるバイナリーベクター。 28．遺伝子構成体がキメラ遺伝子構成体である請求項27記載のバイナリーベクター。 29．プロモーターがCHS遺伝子のプロモーターである請求項28記載のバイナリーベクター。[Procedure amendment] Patent Law Article 184-8 [Submission date] June 29, 1995 [Amendment content] [Figure 1] FIG. [Procedure Amendment] Article 184-8 of the Patent Act [Date of submission] July 4, 1995 [Amendment] Translation of the description Page 3, line 21 to page 5, line 7 "The present invention According to ... pCGP 1458. ""According to the invention, it is used to generate genetic constructs and to produce transgenic plants which express higher levels of delphinidin and / or its derivatives compared to non-transgenic plants of the same species. In accordance with the present invention, a genetic construct comprising a promoter from a gene encoding an enzyme of the flavonoid pathway operably linked to a flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase provides a high level of expression of delphinidin-derived anthocyanins. It has been decided that can be ordered. The production of these high levels of delphinidin and related molecules is particularly useful when developing a range of plants that exhibit altered inflorescence properties. Accordingly, one aspect of the invention has a gene comprising a promoter from a gene encoding a flavonoid pathway enzyme operably linked to a gene encoding a flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase, It relates to a transgenic plant selected from rose, carnation and chrysanthemum or their progeny, or flowering part, which produces higher levels of delphinidin-derived anthocyanins than non-transgenic plants of the same respective species. Preferably, the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase is of petunia, verbena, delphinium, grape, iris, freesia, hydrangea, cyclamen, potato, tricolor violet, eggplant, eustoma or campanella origin. Most preferably, the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase is of petunia origin. The genetic construct of the present invention comprises a nucleic acid molecule encoding a sequence encoding a 3 ', 5'-hydroxylase and optionally allows the expression of said sequence in transgenic plants, eg additional molecules. And promoter and terminator sequences. If the genetic construct is DNA, it can be cDNA or genomic DNA. Preferably, the DNA is in the form of a binary vector that comprises a chimeric gene construct that can integrate into the plant genome to produce the transgenic plant of the present invention. The chimeric gene construct has a plant promoter from a gene that encodes an enzyme of the flavonoid pathway. The preferred promoter is from the gene encoding chalcone synthase (CHS) and is referred to as the "CHS promoter". The CHS promoter is particularly preferred as it directs the high level expression of genetic sequences operably linked downstream thereof. The most preferred binary vectors are pCGP484, pCGP485, pCGP653 and pCGP1458. ] Claims 1. Having a gene construct comprising a promoter from a gene encoding an enzyme of the flavonoid pathway operably linked to a gene encoding flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase, the same non-trans of each species A transgenic plant selected from rose, carnation and chrysanthemum or their progeny, or their inflorescences, which produces higher levels of delphinidin-derived anthocyanins compared to the transgenic plant. 2. The transgenic plant according to claim 1, wherein the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase is of petunia, verbena, delphinium, grape, iris, freesia, hydrangea, cyclamen, potato, tricolor violet, eggplant, eustoma or campanella origin. . 3. The transgenic plant according to claim 2, wherein the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase is of petunia origin. 4. The transgenic plant according to claim 2, wherein the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase originates from Eustoma grandiflorum. 5. The transgenic plant according to claim 1, wherein the promoter is from a gene encoding chalcone synthase (CHS). 6. The transgenic plant according to claim 5, wherein the gene construct is contained in a plasmid selected from pCGP484, pCGP485, pCGP653 and pCGP1458. 7. 7. The transgenic plant according to claim 3, wherein the plant is rose. 8. 7. The transgenic plant according to claim 3, wherein the plant is carnation. 9. 7. The transgenic plant according to claim 3, wherein the plant is chrysanthemum. Ten. The transgenic plant according to claim 1, which exhibits a modified inflorescence. 11. The transgenic plant according to claim 7, which exhibits a modified inflorescence. 12. The transgenic plant according to claim 8, which exhibits a modified inflorescence. 13. The transgenic plant according to claim 9, which exhibits a modified inflorescence. 14. Introducing into a rose, carnation and chrysanthemum a genetic construct comprising a promoter from a gene encoding an enzyme of the flavonoid pathway operably linked to a nucleic acid sequence encoding a flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase. Selected from roses, carnations and chrysanthemums, characterized in that the transgenic plant produces higher levels of anthocyanin derivatives of the delphinidin-derived anthocyanins compared to non-transgenic plants of the same respective species. A method for producing a transgenic plant. 15. 15. The method according to claim 14, wherein the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase is of petunia, verbena, delphinium, grape, iris, freesia, hydrangea, cyclamen, potato, tricolor violet, eggplant, eustoma or campanella origin. 16． 16. The method according to claim 15, wherein the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase is of petunia origin. 17. 16. The method according to claim 15, wherein the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase originates from Eustoma grandiflorum. 18. 18. The method according to any of claims 14 to 17, wherein the promoter is from a gene encoding chalcone synthase (CHS). 19. The method according to claim 15, wherein the gene construct is contained in a plasmid selected from pCGP484, pCGP485, pCGP653 and pCGP1458. [Procedure amendment] Patent Law Article 184-8 [Submission date] July 11, 1995 [Amendment content] 20. 20. The method according to claim 16 to 19, wherein the plant is rose. twenty one. 20. The method according to claim 16 to 19, wherein the plant is carnation. twenty two. 20. The method according to claim 16 to 19, wherein the plant is chrysanthemum. twenty three. 15. The method of claim 14, wherein the transgenic plant exhibits a modified inflorescence. twenty four. 21. The method of claim 20, wherein the transgenic plant exhibits a modified inflorescence. twenty five. 22. The method of claim 21, wherein the transgenic plant exhibits a modified inflorescence. 26. 23. The method of claim 22, wherein the transgenic plant exhibits a modified inflorescence. 27. A binary vector comprising a genetic construct capable of being integrated into the genome of a plant to produce the transgenic plant of claim 1. 28. 28. The binary vector according to claim 27, wherein the gene construct is a chimeric gene construct. 29. 29. The binary vector according to claim 28, wherein the promoter is a promoter of CHS gene.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, G B, GE, HU, JP, KG, KP, KR, KZ, LK , LU, LV, MD, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, S K, TJ, TT, UA, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. A polypeptide having flavonoid 3 ′, 5′-hydroxylase activity Produced and higher than non-transgenic plants of the same respective species. Roses and carnations that produce anthocyanins derived from bell delphinidin And a transgenic plant or progeny selected from chrysanthemums. 2. The polypeptide is petunia, verbena, delphinium, grape, airi Su, freesia, hydrangea, cyclamen, potato, three-color violet, eggplant, tor The transgenesis according to claim 1, which is originated from Kogyo or Campanella. Black plant. 3. The polypeptide is a 3 ', 5'-hydroxylase of petunia origin. Transgenic plants in range 2 of interest. 4. The polypeptide is a 3 ', 5'-hydroxylase derived from Eustoma grandiflorum. The transgenic plant according to claim 2. 5. Polypeptides from pCGP484, pCGP485, pCGP628, pCGP653 and pCGP1458 3 ', 5' encoded by the genetic sequence contained in the selected plasmid -The transgenic plant of claim 3 which is a hydroxylase. 6. Transgenic according to claim 3 or 4 or 5, wherein the plant is a rose. Black plant. 7. The tran of claim 3, 4 or 5 wherein the plant is carnation. Sgenic plant. 8. The transgenic plant according to claim 3, 4 or 5, wherein the plant is chrysanthemum. Black plant. 9. The transgenic plant according to claim 1, which exhibits a modified inflorescence. Ten. The transgenic plant according to claim 6, which exhibits a modified inflorescence. 11. The transgenic plant according to claim 7, which exhibits a modified inflorescence. 12. The transgenic plant according to claim 8, which exhibits a modified inflorescence. 13. Contains flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase-encoding nucleic acid sequences To introduce the gene construct to the rose, carnation and chrysanthemum. Non-transgenic plant of each species with the same transgenic plant Of anthocyanins derived from delphinidin at higher levels than Selected from roses, carnations and chrysanthemums, characterized by producing conductors A method for producing a transgenic plant. 14.3 ', 5'-Hydroxylase is petunia, verbena, delphinium , Grape, iris, freesia, hydrangea, cyclamen, potato, tricolor Claim 13 of millet, eggplant, eustoma or Campanella origin Method. 15. The 15.3 ', 5'-hydroxylase of petunia according to claim 14 Method. 16. The 16.3 ', 5'-hydroxylase of Eustoma grandiflorum. 14 ways. 17.3 ', 5'-hydroxylase is pCGP484, pCGP485, pCGP628, pCGP653 And encoded by the genetic sequence contained in a plasmid selected from pCGP1458 16. The method according to claim 15, which is a 3 ', 5'-hydroxylase. 18. 18. The method of claim 15 or 16 or 17 wherein the plant is rose. 19. 18. The method of claim 15 or 16 or 17 wherein the plant is carnation. 20. 18. The method of claim 15 or 16 or 17 wherein said plant is chrysanthemum. twenty one. 14. The method of claim 13, wherein the transgenic plant exhibits a modified inflorescence. twenty two. 19. The method of claim 18, wherein the transgenic plant exhibits a modified inflorescence. twenty three. 20. The method of claim 19, wherein the transgenic plant exhibits a modified inflorescence. twenty four. 21. The method of claim 20, wherein the transgenic plant exhibits a modified inflorescence. twenty five. A transgenic plant according to claim 1 which is incorporated into the genome of a plant. A binary vector comprising a gene construct that can be produced. 26. The binary vector according to claim 25, wherein the gene construct is a chimeric gene construct. Tar. 27. The binary of claim 25, wherein the genetic construct comprises a plant promoter. vector. 28. Claim 27 selected from pCGP484, pCGP485, pCGP653 and pCGP1458 27 Binary vector. 29. Claim 25 or 26 binary vector wherein the vector is pCGP628.