JPH08511683A

JPH08511683A - トランスジェニック顕花植物

Info

Publication number: JPH08511683A
Application number: JP7500014A
Authority: JP
Inventors: アルバートホルトン，ティモシー; 良和田中
Original assignee: インターナショナルフラワーディベロップメンツプロプライアタリーリミティド
Priority date: 1993-05-20
Filing date: 1994-05-20
Publication date: 1996-12-10
Also published as: SG45175A1; WO1994028140A1; EP0703982A1; EP0703982A4; KR100337755B1; CA2163220A1; PL311691A1; NZ266401A; CN1127015A; PL177743B1

Abstract

(57)【要約】本発明は一般的に、トランスジェニック花舟植物に関する。さらに具体的には、本発明は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼの発現が可能なように遺伝的に修飾されそれによってフラボノイド経路の中間体の操作が可能となったトランスジェニックバラ、カーネーション及びキクに向けられる。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニック顕花植物本発明は、一般に、トランスジェニック顕花植物に関する。さらに詳しくは、本発明は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼを発現できるように遺伝的に変更され、これによりフラボノイド経路における中間体の操作を可能とする、トランスジェニックのバラ、カーネーションおよびキク植物に関する。花弁の産業は、病気および病原体への耐性から改変された花序にわたる改良された特性をもつ、新しくかつ異なる品種の顕花植物を開発するために努力している。古典的な品種改良技術は多少の成功をもって使用されてきているが、このアプローチは特定の種の遺伝子プールの拘束により制限されてきた。例えば、有色の品種の完全なスペクトルを有することは、単一の種について稀である。したがって、所望の特性を示すトランスジェニック植物を発生させる試みに対して実質的な努力が払われてきた。主要な切り花の種、例えば、バラ、カーネーションおよびキクの青色の品種の開発は、切り花および観賞植物の両方のマーケットにおいて有意な機会を提供するであろう。花の色は主として２種類の色素：フラボノイド類およびカロテノイド類によっている。フラボノイド類は黄色から赤色から青色の色の範囲に寄与する。カロテノイド類はオレンジ色または黄色の色合いを付与し、そして一般に黄色またはオレンジ色の花の唯一の色素である。花の色の主要な寄与を構成するフラボノイド分子は、シアニジン、デルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジンおよびペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であるアントシアニン類であり、そして液胞の中に位置する。異なるアントシアニン類は色の顕著な差を生成することができる。花の色はまた、無色のフラボノイド類とのコピグメント化、金属との錯体形成、グリコシル化、アシル化、メチル化および液胞のpHにより影響を受ける（Forkmann，1991）。フラボノイド色素のための生合成経路（以後「フラボノイド経路」と呼ぶ）はよく確立されており、そして第１図に示す（EbelおよびHahlbrock，1988；Hahlb rockおよびGriscbach，1979；Wieringおよびde Vlaming，1984；Schramら、1984 ；Stafford，1990）。この経路において最初の行われるステップは３分子のマロニル−CoAと１分子のｐ−クマロイル−CoAとの縮合反応を含む。この反応は酵素カルコンシンターゼ（CHS）により触媒される。この反応の生成物の２′，４，４′，６′−テトラヒドロキシカルコンは、通常、酵素カルコンフロバノンイソメラーゼ（CHI）により急速に異性化されてナリンゲニンを生成する。ナリンゲニンは引き続いて中央の環の３位においてフラバノン３−ヒドロキシラーゼ（F3 H）によりヒドロキシル化されて、ジヒドロケンフェロール（DHK）を生成する。ジヒドロケンフェロールのＢ環は、３′、または３′と５′の両方の位置においてヒドロキシル化されて、それぞれ、ジヒドロケルセチン（DHQ）およびジヒドロミリセチン（DHM）を生成する。この経路に関係する２つの主要な酵素はフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼおよびフラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼである。フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼはDHKに作用してDHQを生成し、そしてナリンゲニンに作用してエリオジクチオールを生成する。フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ（以後３′，５′−ヒドロキシラーゼと呼ぶ）は、ナリンゲニンおよびDHKの３′および５′位、並びにエリオジクチオールおよびDHQの５′位のヒドロキシル化を触媒する広いスペクトルの酵素であり（StotzおよびForkmann，1982）、両方の場合において、それぞれ、ペンタヒドロキシフラバノンおよびDHMを生成する。アントシアニン類のＢ環のヒドロキシル化のパターンは花弁の色の決定において重要な役割を演ずる。前述の遺伝子プールの拘束のために、主要な切り花の多くは３′，５′−ヒドロキシラーゼを欠如し、従ってそうでなければ可能である色の範囲を表示することができない。これは特にバラ、カーネーションおよびキクの場合であり、これらは世界中の切り花のマーケットの主要な比率を構成する。したがって、植物、特にバラ、カーネーションおよびキクを変更して、３′，５′−ヒドロキシラーゼを生成し、これによりDHKの代謝、ならびに他の基質、例えば、DHQ、ナリンゲニンおよびエリオジクチオールの代謝を変更する手段を提供できるトランスジェニック植物を作出することが要求されている。このような変更はアントシアニン類のヒドロキシル化のパターンに影響を及ぼし、そしてデルフィニジンから誘導されるアントシアニン類の生産を可能とし、これにより花弁の色を変更しそして単一の種が花の色のより広いスペクトルを発現できるようにする。高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類を生産するトランスジェニック植物を作出することが特に要求されている。本発明によれば、遺伝子構成体を発生させ、そして同一種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジンおよび／またはその誘導体を発現するトランスジェニック植物をつくるために使用する。これらの高いレベルのデルフィニジンおよび関係する分子の生産は、変更された開花特性を示すある範囲の植物を作出する場合に特に有用である。したがって、本発明の１つの面は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドを生産し、そして同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類を生産する、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物またはその後代に関する。さらに詳しくは、本発明は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し、そして同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジンおよび／またはデルフィニジンの誘導体を生産する、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物またはその後代に関する。好ましくは、ポリペプチドはペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである。好ましくは、ポリペプチドはフラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼであり、そして最も好ましくはペチュニアの３′，５′−ヒドロキシラーゼである。本発明の遺伝子構成体は、３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする配列をコードする核酸分子を含みそして必要に応じて追加の配列、例えば、トランスジェニック植物中で前記分子の発現を可能とするプロモーターおよびターミネーター配列を含む。遺伝子構成体がDNAである場合、それはcDNAまたはゲノムDNAであることができる。好ましくは、DNAは植物のゲノムの中に組込まれて本発明のトランスジェニック植物を生産することができるキメラ遺伝子構成体を含んでなるバイナリーベクターの形態である。キメラ遺伝子構成体はCHSのような植物プロモーターを有することができるが、あるいは３′，５′−ヒドロキシラーゼの遺伝子配列は発現を増強しそしてデルフィニジンおよび／またはその誘導体のレベルの増加に導くように修飾することができる。CHSプロモーターは、フラボノイド経路における植物プロモーターでありそしてプロモーターの下流の遺伝配列の高いレベルの発現を指令するので、特に便利である。最も好ましいバイナリーベクターはpCGP484，pCGP485，pCGP628 ，pCGP653およびpCGP1458である。「核酸分子」とは、ここにおいて使用するとき、３′，５′−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列を特定するヌクレオチド塩基の隣接する列を意味する。核酸は全長の酵素またはその機能的誘導体をコードすることができる。「誘導体」とは、天然に存在する酵素に対して、任意の単一または複数のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を意味する。これに関して、核酸は３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする天然に存在するヌクレオチド配列を包含するか、あるいは前記天然に存在する配列に対する単一または複数のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を含有することができる。用語「類似体」および「誘導体」はまた、３′，５′−ヒドロキシラーゼの任意の機能的化学的同等体に拡張され、前記核酸分子の唯一の要件は、本発明に従いトランスジェニック植物を生産するために使用するとき、前記トランスジェニック植物が次の性質の１または２以上を示すことである：（ｉ）３′，５′−ヒドロキシラーゼ特異的mRNAの生産；（ii）３′，５′−ヒドロキシラーゼタンパク質の生産；（iii）デルフィニジンおよび／またはその誘導体の生産；および／または（iv）改変された花序。さらに詳しくは、前記トランスジェニック植物は次の性質の１または２以上を示す：（ｉ）非トランスジェニックの内因性レベルを超えた増加したレベルの３′，５′−ヒドロキシラーゼ特異的mRNA （ii）３′，５′−ヒドロキシラーゼのタンパク質の増加した生産；（iii）非トランスジェニックの内因性レベルを超えた増加したレベルのデルフィニジンおよび／またはその誘導体の生産；および／または（iv）改変された花序。ここにおいて使用する核酸分子は単独で、あるいはベクター分子および好ましくは発現ベクターと組み合わせて存在することができる。このようなベクター分子は真核細胞および／または原核細胞の中で複製および／または発現することができる。好ましくは、ベクター分子またはその部分は植物ゲノムの中に組込まれることができる。核酸分子は、さらに、前記組込みを促進するときに有用な配列および／または植物細胞の中の核酸分子の発現を指令することができるプロモーター配列を含有することができる。核酸分子およびプロモーターは、任意の数の手段、例えば、エレクトロポレイション、パーティクルガンまたはアグロバクテリウム（Agrobacteriumu）仲介転移により細胞の中に導入することができる。本発明によれば、３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする核酸分子は、バラ、カーネーションおよびキクから成るリストから選択されるトランスジェニック植物の中に導入しそしてその中で発現させ、これによりDHKおよび／または他の適当な基質をアントシアニン類のアントシアニン誘導体、例えば、ペチュニジン、マルビジンおよび殊にデルフィニジンに変換する手段を提供することができる。これらのアントシアニン類の生産は青色または青色様の色の種々の色彩の生成に寄与することができるか、あるいはそうでなければペラルゴニジン、シアニジンおよびペオニジンおよびそれらの誘導体からデルフィニジンおよびその誘導体に向けることによって花の色を変更することができる。植物の中の核酸配列の発現は構成的、誘導可能または発生に依存性であることができる。「改変された花序」という表現は、花弁の間の通常の変動を考慮して天然に存在する花の色に対する花の色の任意の変更を意味する。好ましくは、改変された花序は非トランスジェニック植物におけるそれらと異なる青、紫またはピンクの着色の種々の色彩の生成を包含する。本発明は、また、非トランスジェニック植物の内因性レベルを超えた増加したレベルのデルフィニジンおよび／またはその誘導体の生産を示すトランスジェニック顕花植物を生産する方法に関し、前記方法はバラ、カーネーションおよびキクから成るリストから選択される植物の細胞の中に、３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする配列をコードする核酸分子を、前記核酸分子の究極的発現を可能とする条件下に導入し、前記細胞からトランスジェニック植物を再生し、そして前記トランスジェニック植物を核酸分子の３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素への発現を可能とするために十分な時間かつ条件下に成長させることからなる。本発明は、また、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物を生産する方法に関し、この方法は前記植物の中にフラボノイド３′ ，５′−ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列を含有する遺伝子構成体を導入することからなり、前記トランスジェニック植物は同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニンを生産することを特徴とする。好ましい態様において、トランスジェニック顕花植物は増加したレベルのデルフィニジンの生産と一致する改変された花序の性質を示し、そして改変された花序は受容体植物の生理的条件に依存して青色の花または青色がかった色彩の生成を包含する。ある種の植物の種において、「高pH系」を選択することが好ましく、これは平均の花弁の液胞pHより高いpHを有する品種として定義される。組換え３′，５′−ヒドロキシラーゼまたはその変異体および誘導体の起源は、ペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、トルコギキョウ、カンパネラおよびナスを包含する。結局、本発明は、３′，５′−ヒドロキシラーゼを表す核酸分子のすべてまたは一部分および／またはそれらの任意の相同体または関係する形態を含有するトランスジェニックのバラ、カーネーションおよびキク植物および特に増加した３ ′，５′−ヒドロキシラーゼ特異的mRNAおよび／またはデルフィニジンの増加した生産および／または改変された花序を示すトランスジェニック植物に拡張される。したがって、トランスジェニック植物は３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含む安定に導入された核酸分子を含有する。本発明は、また、このようなトランスジェニック植物の後代に拡張され、そしてまたその生殖材料（例えば、種子）に拡張される。このような種子は、殊に有色の場合、なかでも植物の登録標識として有用であろう。次の非限定的図面および実施例を参照して、本発明をさらに説明する。図面において、第１（Ａ）図および第１（Ｂ）図は、フラボノイド色素のための生合成経路の概略的表示である。この経路の最初の部分に関係する酵素は次の通りである：PA L＝フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ；C4H＝シンナメート４−ヒドロキシラーゼ；４CL＝４−クマレート；CoAリガーゼ；CHS＝カルコンシンターゼ；CHI＝カルコンフロバノンイソメラーゼ；F3 H＝フラバノン３−ヒドロキシラーゼ；DFR＝ジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ；UFGT＝UDP-グルコース；フラボノイド−３−Ｏ−グリコシルトランスフェラーゼ。後のステップはペチュニア・ハイブリダ（Ｐ．hybrida）の花において起こることができる変換に相当しそして次のものを包含する：Ｉ＝シアニジン −３−グルコシドおよびデルフィニジン−３−グルコシドのグリコシル残基へのラムノース糖の付加；２＝アシル化および５−Ｏ・グリコシル化；３＝３′メチル化；４＝５′メチル化；５＝３′５′メチル化。第２図は、その構成を実施例３に記載するバイナリー発現ベクターpCGP812のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット；GUS＝β−グルクロニダーゼコーディング領域。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例３に記載されている。制限酵素部位は印されている。第３図は、その構成を実施例４に記載するバイナリー発現ベクターpCGP485のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例４に記載されている。制限酵素部位は印されている。第４図は、その構成を実施例５に記載するバイナリー発現ベクターpCGP628のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例５に記載されている。制限酵素部位は印されている。第５図は、その構成を実施例６に記載するバイナリー発現ベクターpCGP653のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例６に記載されている。制限酵素部位は印されている。第６図は、その構成を実施例７に記載するバイナリー発現ベクターpCGP484のダイアグラム表示である。Gent＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；LB＝左ボーダー； RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例７に記載されている。制限酵素部位は印されている。第７図は、その構成を実施例８に記載するバイナリー発現ベクターpCGP1458のダイアグラム表示である。nptI＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼＩ耐性遺伝子；LB＝左ボーダー；RB＝右ボーダー；nptII＝ネオマイシンシホスホトランスフェラーゼIIのための発現カセット。キメラ遺伝子のインサートは示す通りであり、そして実施例８に記載されている。制限酵素部位は印されている。第８図は、pCGP628で形質転換したロイアルティ（Royalty）カルス組織のサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの表示の写真を示す。ゲノムDNAをEcoRIで消化し、そしてHflcDNAの720bpのEcoRV内部断片でプロービングした。陰性対照（Ｎ）はpCGP293で形質転換したロイアルティカルス組織である。陽性対照（Ｈ）は10pgのHfl断片を含有する。矢印は形質転換された植物において期待される２kbのEcoRI断片を示す。第９図はpCGP484で形質転換したクリサンテナム（Chrysanthemum）cv.ブルー・リッジ（Blue Ridge）植物のサザンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーの表示の写真を示す。ゲノムDNAをXbaIで消化し、これは2.3kbのHfl-PL TP断片を解放し、そしてHflcDNAを含有する、pCGP602から解放された1.8kbのFsp I／BspHI断片でプロービングした。陰性対照（Ｎ）は形質転換しないブルー・リッジ植物から単離されたゲノムDNAである。陽性対照（Ｐ）はXbaIで消化したpCG P485のプラスミドDNAである。矢印は形質転換された植物において期待される2.3 kbの生成物を示す。実施例１材料エリオジクチオール（Eriodictyol）およびジヒドロケルセチンをカール・ロス（Carl Roth）KGから入手しそしてナリンゲニンをシグマ（Sigma）から入手した。ジヒドロミリセチンをミリセチン（Extra Synthese、フランス国）からVerc ruysseら（1985）の方法により化学的に合成した。〔³Ｈ〕−ナリンゲニン（5.7 Ci／mM）および〔³Ｈ〕−ジヒドロケルセチン（12.4Ci／mM）をアマーシャム（A mersham）から入手した。すべての酵素は商業的源から入手し、そして製造業者の推奨に従い使用した。使用した大腸菌（Escherichia coli）株は次の通りであった：DH５α supE 44，Δ（lacZYA-ArgF）Ｕ169，φ80 lacZ ΔＭ15，hsdＲ17（ｒ_k−，ｍ_k＋）， recAl、endAl，gyrA96，thi−１，relAl，deoR。（Hanahan，1983およびBRL，19 86）。ディスアームド（disarmed）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agroba cterium tumefaciens）株AGLO（Lazoら、1991）およびLBA4404（Hockemaら、1983）を、それぞれ、R Ludwig博士（カリフォルニア大学、生物学部、米国サンタクルズ）およびカルジーン・インコーポレーテッド（Calgone，Inc.）カリフォルニア州、米国、から入手した。アームド（armed）アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ICMP8317をRicha rd Gardner博士（オークランド大学、細胞および分子生物学部、遺伝子技術センター、ニュージーランド国）から入手した。クローニングベクターpBluescrptはストラタジーン（Stratagene）から入手した。植物を特殊化成長室の中で14時間の昼間の長さで10,000ルックスの最小光強度および22〜26の温度において成長させた。実施例２ pCGP90の構築 pCGP602（国際特許出願PCT／AU92／00334号；公開番号WO93／01290号）からの cDNAインサートをセンスの向きでpCGP293のMacプロモーター（Comaiら、1990）の背後でクローニングすることによって、プラスミドpCGP90を構築した。バイナリー発現ベクターpCGP293はTiバイナリーベクターpCGN1559（McBrideおよびSummerfelt，1990）から誘導した。プラスミドpCGN1559をKpnIで消化し、そして突出した３′末端をT4DNAポリメラーゼで標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従い除去した。次いで、このベクターをXbaIでさらに消化し、そして生ずる５′突出をDNAポリメラーゼＩのクレノー断片で修復した。次いでこのベクターを再結合してpCGP67を得た。Macプロモーター、masターミネーターおよび種々のクローニング部位を含有する1.97kbのPstI断片（Comaiら、1990）をpCGP4 0から単離し、そしてpCGP67のP st I部位に挿入してpCGP293を得た。 pCGN7334からBamHI−SacI断片としてGUS遺伝子（Jeffersonら、1987）を除去し、そしてそれをマルチクローニング部位を含むpBluescribe M13からのBamHI−Sac I断片と置換することによって、プラスミドpCGP40を構成した。キメラMac-GU Smas遺伝子を含有する断片をpCGN7329（Comaiら、1990）のXhoI部位の中に挿入することによって、プラスミドpCGN7334（Calgene，Inc.，米国カリフォルニア州、から入手し）を構築した。次いで、前述cDNAインサートを含有するBamHI−KpnI断片をpCGP602から単離し、そしてpCGP293のBamHI−KpnI断片と結合した。pCGP90の中のインサートの正しい挿入は、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離したDNAの制限分析により確立された。実施例３ pCGP812の構築バイナリー発現ベクターpCGP812はTiバイナリーベクターpCGN1558（McBrideおよびSummerfelt，1990）から誘導した。キメラmas-35S-GUS-ocs遺伝子を含有する5.2kbのXhoI断片をpKIWI101（JannsenおよびGardner，1989）から単離し、そしてpBliescript KSのXhoIの中にサブクローニングしてpCGP82を得た。次いで、 5.2kbの断片をHindIII／KpnI消化により再結合し、そしてpCGN1558のHindIII／K pn I部位の中にサブクローニングしてpCGP83を得た。プラスミドpCGP83をKpnIで制限酵素処理し、そして突出した３′末端を標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従いT4DNAポリメラーゼで除去した。次いで、SmaI−BamHIアダプター（Pharmasia）を平滑化したKpnI部位に結合してBamH I「粘着」末端を得た。pCGP807（後述する）からのキメラMac-Hf1-mas遺伝子を含有する3.8kbのBglII断片をpCGP83のBamHI「粘着」末端と結合してpCGP 812を生成した（第２図）。 pCGP602からの前述のHflcDNAを含有する1.8kbのBamHI−KpnI断片をpCGP40のBa m HI−KpnI末端と結合することによって、プラスミドpCGP807を構築した。実施例４ pCGP485の構築バイナリー発現ベクターpCGP485はTiバイナリーベクターpCGN1547（McBrideおよびSummerfelt，1990）から誘導した。（ｉ）キンギョソウのCHS遺伝子からのプロモーター配列；（ii）ペチュニアからのpCGP602からの前述のcDNAインサートのコーディング領域、および（iii）ペチュニアのリン脂質トランスフェラーゼのタンパク質（PLTP）ターミネーター配列から成るキメラ遺伝子を構成した。 CHSプロモーターは、翻訳開始の部位の５′の1.2kbの遺伝子断片から成る（Somm erおよびSaedler，1986）。ペチュニアのcDNAインサートは、pCGP602のcDNAクローンからの1.6kbのBclI／FspI断片から成る（国際特許出願PCT／AU92／00334号；公開番号WO93／01290）。PLTPターミネーター配列はpCGP13ΔBam（Holton，19 92）からの0.7kbのSmaI／XhoI断片から成り、これはPLTP遺伝子の転写された領域の150bpの未翻訳範囲を含む。キメラCHS／cDNAインサート／PLTP遺伝子をpCGN 1547のPstI部位の中にクローニングしてpCGP485を構築した。実施例５ pCGP628の構築プラスミドpCGP176（国際特許出願PCT／AU92／00334号；公開番号WO93／01290 ）をEcoRIおよびSpeIで消化した。消化したDNAをクレノー断片で標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従いフィルインし、そして自己連結した。これにより得られたプラスミドをpCGP627と表示した。pCGP627のXbaI／KpnI消化物は1.8kbの断片を生成し、この断片をpCGP293のXbaI／KpnI消化により得られた14.5kbの断片と結合した。こうしてつくられたプラスミドをpCGP628と表示した。実施例６ pCGP653の構築プラスミドpCGP293（実施例２に前述した）をXbaIで消化し、そして生ずる５ ′突出を標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従いクレノー断片でフィルインした。次いでそれをHindIIIで消化した。この手順の間に、Macプロモーター（Comaiら、1990）を欠失した。pCGP669（後述する）からの0.8kbのペチュニアのCHS-Ａプロモーターをバックボーンの中に平滑末端化したEcoRI／HindIII断片として結合した。このプラスミド生成物をpCGP672と表示した。 pCGP807（上の実施例３に記載する）のXbaI／Asp718消化はHflcDNAを含有する 1.8kbの断片を生成し、この断片をpCGP672からの16.2kbのXbaI／Asp718断片と結合した。こうしてつくったプラスミドをpCGP653と表示した。 CHS-Ａ遺伝子のプロモーター断片をPCRにより、プライマーとしてオリゴヌクレオチドCHSA-782およびCHSA＋34（下の配列を参照のこと）および鋳型としてペチュニア・ハイブリダ（Pctunia hybrida）Ｖ30ゲノムDNAを使用して増幅した。 PCR生成物をddTテイルドpBluescript（HoltonおよびGraham，1991）の中にクローニングし、そして遺伝子断片の向きを制限酵素地図により評価した。こうしてつくったプラスミドをpCGP669と表示した。オリゴヌクレオチドのプライマーは、ペチュニアのCHS-Ａプロモーターの発表された配列に対して設計した（Koes， 1988）。実施例７ pCGP484の構築 pCGP484の構築は、実施例４において上に概説した、pCGP485についての構築と同一であったが、ただしpCGP484は3.5kbのPstI断片（キメラ遺伝子CHS-Hf1-PLTP を含む）を反対方向に含有した。実施例８ pCGP1458の構築プラスミドpCGP1458は、バックボーンとして10kbのバイナリーベクターpBIN19 （Bevan，1984）を使用して構成した。プラスミドpBIN19をEcoRIで消化し、そして生ずる突出した５′末端を、標準のプロトコール（Sambrookら、1989）に従い、クレノー断片を使用してフィルインした。プラスミドpCGP485をPstIで消化して、キメラCHS／cDNAインサート／PLTP遺伝子を3.5kbの断片として除去した。Ps t Iから生ずる３′突出をT4DNAポリメラーゼで除去し、次いでこの断片をプラスミドpBIN19のフィルインしたEcoRI部位の中に結合した。実施例９大腸菌（E．coli）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換ベクターpCGP812，pCGP90，pCGP485，pCGP628，pCGP653，pCGP484またはpCGP1 458の１つまたは他のものを使用する大腸菌（Escherichia coli）株DH５α−細胞の形質転換を、標準のプロトコール（Sambrookら、1989）またはInoueら、（1 990）に従い実施した。 50mlのMG／Ｌ（GarfinkelおよびNester，1980）培養物を接種しそして16時間震盪しながら28℃において増殖させることによって調製した、コンピテントアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞の100μｌに、５μｇのプラスミドDNAを添加することによって、プラスミドpCGP8I2，pCGP90，pCGP485，pCG P628，pCGP653，pCGP484またはpCGP1458を適当なアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の中に導入した。次いで、細胞を沈降させ、そして0.5mlの85％（ｖ／ｖ）100mMのCaCl₂／15％（ｖ／ｖ）グリセロールの中に再懸濁させた。DNA-アグロバクテリウム混合物を液体Ｎ₂の中で２分間インキュベートすることによって凍結させ、次いで37℃において５分間インキュベートすることによって融解させた。次いで、このDNA／細胞混合物を氷上にさらに10分間配置した。次いで細胞を１mlのMG／Ｌ培地と混合し、そして震盪しながら16時間28℃においてインキュベートした。pCGP812，pCGP90，pCGP485，pCGP628，pCGP653またはpCGP484を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞を、100μｇ／mlのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で選択した。pCGP1458を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞を、100μｇ／mlのカナマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で選択した。プラスミドの存在はゲンタマイシン耐性形質転換体から単離したDNAのサザン分析により確証された。実施例10 ジアンサス・カリオフィルス（Dianthus caryophyllus）の形質転換ａ．植物の材料ジアンサス・カリオフィルス（Dianthus caryophyllus）（cv．Crowley Sim. ，Red Sim，Laguna）の挿木を、バン・ウィク・アンド・サン・フラワー・サプライ（Van Wyk and Son Flower Supply）、オーストラリア国ヴィクトリア州、から入手した。外側の葉を除去し、そして挿木を短時間70％（ｖ／ｖ）エタノール、次いで1.25％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム（ツイーン２０を含む）中で６分間滅菌し、そして無菌の水で３回すすいだ。すべての見える葉および腋芽を同時培養の前に解剖顕微鏡下に除去した。ｂ．アグロバクテリウムおよびジアンサス（Dianthus）組織の同時培養バイナリーベクターpCGP90，pCGP812，pCGP485またはpCGP653の１つを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGLO（Lazoら、1991）を、100mg／ｌのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ（GarfinkelおよびNester，1980）寒天培地上で４℃において維持した。単一のコロニーを液体MG／Ｌ培地中で一夜成長させ、そして接種のすぐ前の口に５×10⁸細胞／mlに希釈した。３％（ｗ／ｖ）のスクロース、５mg／ｌのα−ナフタレン酢酸（NAA）、20μＭのアセトシリンゴンおよび0.8％のディフ・コ・バクト・アガー（Difco Bacto Agar）（pH5.7）を補充したムラシゲ（Murashige）およびスクーグ（Skoog）（1962）培地（MS）上で、ジアンサス（Dianthus）組織をアグロバクテリウムと同時培養した。ｃ．トランスジェニック・ジアンサス（Dianthus）植物の再生１mg／ｌのベンジルアミノプリン（BAP）、0.1mg／ｌのNAA、150mg／ｌのカナマイシン、500mg／ｌのチカルシリンおよび0.8％のディフコ・バクト・アガー（ Difco Bacto Agar）（選択培地）を補充したMS培地に、同時培養した組織を移した。３週後、外植体を新鮮な選択培地に移し、そしてこの段階において茎外植体からの腋生苗条を除去するように注意を払った。選択培地上で６〜８週後、健康な不定芽を３％のスクロース、150mg／ｌのカナマイシン、500mg／ｌのチカルシリン、0.8％のディフコ・バクト・アガー（Difco Bacto Agar）を含有するホルモン不含MS培地に移した。この段階において、GUS組織化学的検定（Jefferson，1987）および／またはNPT IIドットブロット検定（McDonnellら、1987）を使用してトランスジェニック苗条を同定した。トランスジェニック苗条を３％のスクロース、500mg／ｌのチカルシリンおよび0.4％（ｗ／ｖ）のゲライト・ゲラン・グム（Gelrite Gellan Gum）（Sch weizerhall）を補充した含MS培地に根の誘導のために移した。すべての培養物は 16時間の光周期（120μＥの冷白色螢光灯）下に23±２℃において維持した。植物が根を形成し、そして４〜６cmの高さに到達したとき、植物をミスト下に順化した。養液栽培混合物（KandreckおよびBlack，1984）中で液浸した高い比のパーライト（75％またはそれより大きい）を含有する混合物を順化に使用し、これは典型的には４〜５週持続させた。植物を14時間の光周期（200μＥのハロゲン化水銀灯）下に23℃において順化した。実施例11 ロサ・ハイブリダ（Rosa hybrida）の形質転換１．ロサ・ハイブリダ（Rosa hybrida）cvロイアルティ（Royalty）バラ園芸品種ロイアルティ（Royalty）の植物組織を、PCT91/04412、公開番号 WO92/00371に開示されている方法に従い形質転換した。２．ロサ・ハイブリダ（Rosa hybrida）cvカルディナール（Kardinal）ａ．植物材料カルディナール（Kardinal）の苗条を、バン・ウィク・アンド・サン・フラワー・サプライ（Van Wyk and Son Flower Supply）、オーストラリア国ヴィクトリア州、から入手した。葉を除去し、そして残りの苗条（５〜６cm）を1.25％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム（ツイーン２０を含む）中で５分間滅菌し、次いで無菌の水で３回すすいだ。単離した苗条の先端を無菌の水中で１時間液浸し、そして同時培養の前に、３％のスクロース、0.1mg／ｌのBAP、0.1mg／ｌのカイネチン、0.2mg／ｌのジベレリン酸、0.5％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンおよび0.2％のゲライト・ゲラン・ガム（Gelrite Gellan Gum）を含有するMS培地上で２日間前培養した。ｂ．アグロバクテリウムおよびロサ（Rosa）苗条組織の同時培養バイナリーベクターpCGP812を含有する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスICMP8317（JanssenおよびGardner，1989）およびAGLOを、100mg／ｌのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で４℃において維持した。各アグロバクテリウム株からの単一のコロニーを液体MG／Ｌ培地中で一夜増殖させた。５ ×10⁸細胞／mlの最終濃度を、液体MG／Ｌ培地中の希釈の前の日に、調製した。接種前に、２つのアグロバクテリウム培養物を10：１の比で混合した。（AGLO／ pCGP812：8317／pCGP812）。苗条の茎頂を通して縦方向に切断し、そして混合したアグロバクテリウム培養物の２μｌの分注物を苗条の茎頂に滴として配置した。苗条の茎頂を前培養に使用したのと同一の培地上で５日間同時培養した。バイナリーベクターpCGP1458を含有する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスAGLOを、100mg／ｌのカナマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で４℃ において維持した。各アグロバクテリウム株からの単一のコロニーを液体MG／Ｌ培地中で一夜増殖させた。５×10⁸細胞／mlの最終濃度を、液体MG／Ｌ中の希釈の前の日に、調製した。ｃ．トランスジェニック・ロサ（Rosa）植物の再生同時培養後、苗条の茎頂を選択培地に移した。苗条の茎頂を３〜４週毎に新鮮な選択培地に移した。苗条の茎頂に観察されたゴールを、それらが直径６〜８mmに到達したとき、切除した。単離したゴールを、苗条の形成のために、３％のスクロース、25mg／ｌのカナマイシン、250mg／ｌのセフォタキシムおよび0.25％のゲライト・ゲラン・ガム（Gelrite Gellan Gum）を含有するMS培地に移した。ゴール組織から再生した苗条を単離し、そして選択培地に移した。GUS組織化学的検定およびカルスの検定を使用して、トランスジェニック苗条を同定した。トランスジェニック苗条を、根の誘導のために、３％のスクロース、200mg／ｌのセフォタキシムおよび0.25％のゲライト・ゲラン・ガム（Gelrite Gellan Gum）を含有するマンヅカ・セクスタ（Maduca sexta）培地に移した。すべての培養物を16時間の光周期（60μＥの冷白色蛍光灯）下に23± ２℃において維持した。根系をよく発育させそして苗条が５〜７cmの長さに到達したとき、トランスジェニックバラ植物を８cmの管中のオートクレーブ処理したデブコ（Debco）514110/2鉢植混合物に移した。２〜３週後、植物を15cmのポットの中に同一の鉢植え混合物を使用して再び植え、そして23℃において14時間の光周期（300μＥのハロゲン化水銀灯）下に維持した。１〜２週後、鉢植えした植物をガラス室（日中／夜の温度：25〜28／14℃）に動かし、そして開花まで成長させた。実施例12 クリサンテナム・モリフォリウム（Chrysanthemum morifolium）の形質転換ａ．植物材料クリサンテナム・モリフォリウム（Chrysanthemum morifolium）（cv．Blue Ridge，Pnennine Chorus）挿木を、Ｆ＆Ｉバグレイ・フラワー・アンド・プラント・グロウワーズ（Baguley Flower and Plant Growers）、オーストラリア国ヴィクトリア州、から入手した。葉を挿木から除去し、次いでこれを短時間70％（ｖ／ｖ）エタノール、次いで1.25％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム（ツイーン20を含む）中で３分間滅菌し、そして無菌の水で３回すすいだ。節間茎切片を同時培養のために使用した。ｂ．アグロバクテリウムおよびクリサンテナム（Chrysanthemum）組織の同時培養バイナリーベクターpCGP90，pCGP484，pCGP485またはpCGP628の１つを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株LBA4404（Hoekemaら、1983）を、50 mg／ｌリファンピシンンおよび10mg／ｌのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で成長させた。各アグロバクテリウムからの単一のコロニーを同一液体培地中で一夜成長させた。これらの液体培養物にグリセロールを10％加え、そして１mlの分注物をフリーザー（−80℃）に移した。各凍結したアグロバクテリウムの100〜200μｌの分注物を50mg／ｌのリファンピシンンおよび10mg／ｌのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ中で一夜成長させた。５×10⁸細胞／mlの最終濃度を、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含有する液体MG／Ｌ中の希釈の前の日に、調製した。茎切片を、LBA4404/pCGP90，LBA4404/pCGP484，LBA4404/pCGP485またはLBA4404/pCGP628のいずれか１つを含有するアグロバクテリウムと、同時培養培地上で４日間同時培養した。ｃ．トランスジェニック・クリサンテナム（Chrysanthemum）植物の再生同時培養後、茎切片を選択培地に移した。３〜４週後、再生する外植体を新鮮な培地に移した。カナマイシンの選択に生き残る不定芽を単離し、そしてカナマイシンおよびセフォタキシムを含有するMS培地に苗条の伸長および根の誘導のために移した。すべての培養物を16時間の光周期（80μＥの冷白色蛍光灯）下に23 ±２℃において維持した。カナマイシンで根を形成した植物から葉の試料を集め、そしてサザンブロット分析を使用してトランスジェニック植物を同定した。トランスジェニッククリサンテナム（Chrysanthemum）植物が４〜５cmの長さに到達したとき、それらを８cmのオートクレーブ処理したデブコ（Debco）514110/2鉢植混合物に移した。２週後、植物を15cmのポットの中に同一の鉢植え混合物を使用して再び植え、そして23℃において14時間の光周期（300μＥのハロゲン化水銀灯）下に維持した。２週後、鉢植えした植物を温室（日中／夜の温度：25〜28℃／14℃）に動かし、そして開花まで成長させた。実施例13 サザン分析ａ．ジアンサス（Dianthus）からのゲノムDNAの単離 DNAを組織から本質的にDellaportaら、（1983）に記載されているように単離した。DNA調製物をCsCl浮力密度遠心（Sambrookら、1989）によりさらに精製した。ｂ．クリサンテナム（Chrysanthemum）からのゲノムDNAの単離 4.5Ｍのグアニジウムチオシアネート、50mMのEDTA pH8.0、25mMのクエン酸ナトリウムpH7.0、0.1Ｍの２−メルカプトエタノール、２％（ｖ／ｖ）のラウリルサルコシンを含有する抽出緩衝液を使用して、DNAを葉組織から単離した。植物組織を液体Ｎ₂中で微粉末に粉砕し、次いで抽出緩衝液を添加し（５ml／ｇの組織）そしてこの溶液を回転ホイール上で16時間混合した。次いでこの混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（50：49：１）で２回抽出し、そしてゲノムDNAを３体積のエタノールの添加および10,000rpmにおける15分間の遠心により沈澱させた。ｃ．ロサ（Rosa）からのゲノムDNAの単離組織を液体Ｎ₂の存在下に乳鉢と乳棒で粉砕し、そして１mlの65 ℃に加熱した抽出緩衝液（0.14Ｍのソルビトール、0.22Ｍのトリス−HCl〔pH8.0 〕、0.022ＭのEDTA、0.8ＭのNaCl、0.8％（ｗ／ｖ）のCTAB、１％のＮ−ラウリルサルコシン）を添加することによって、DNAを抽出した。クロロホルム（200μ ｌ）を添加し、そしてこの混合物を65℃において15分間インキュベートした。遠心後、上澄液をフェノール−クロロホルムで抽出し、次いで等しい体積のイソプロパノールに添加し、倒立させて混合した。この混合物を遠心し、そしてペレットを95％エタノールで洗浄し、再遠心し、そして70％エタノールで洗浄した。ペレットを真空乾燥し、そして30μｌのTE緩衝液（pH8.0）の中に再懸濁させた。ｄ．サザンブロットゲノムDNA（10μｇ）を16時間60単位のEcoR Ｉで消化し、そしてTAE（40mMのトリス−アセテート、50mMのEDTA）緩衝液中で0.7％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルを通して電気泳動させた。次いでDNAを変性溶液（1.5ＭのNaCl/0.5ＭのNaOH）中で１〜1.5時間変性し、0.5Ｍのトリス−HCl（pH7.5）／1.5ＭのNaCl中で２〜３時間中和し、次いでDNAをハイボンドＮ（Amersham）フィルターに20×SSC中で転写した。カナマイシンに対する選択後に得られた推定上のジアンサス（Dianthus）、ロサ（Rosa）およびクリサンテナム（Chrysanthemum）植物のサザン分析は、ゲノムの中への適当なキメラ遺伝子の組込みを確証した。実施例14 ノザン分析ａ．ジアンサス（Dianthus）およびクリサンテナム（Chrysanthemum）のRNA 液体Ｎ₂中で凍結しそして乳鉢と乳棒を使用して微粉末に粉砕した組織から、全体のRNAを単離した。４Ｍのグアニジウムイソチオシアネート、5 0mMのトリス−HCl（pH8.0）、20mMのEDTA、0.1％（ｖ／ｖ）のサルコシルの抽出緩衝液を組織に添加し、そしてこの混合物をポリトロン（polytron）を最大速度で使用して１分間均質化した。懸濁液をミラクロス（Calbiochem）を通して濾過し、そしてJA20ローター中で10分間10,000rpmにおいて遠心した。上澄み液を集め、そして0.2ｇ／mlのCsCl（ｗ／ｖ）とした。次いで、試料を38.5mlのクイック−シール遠心管（Beckman）中で5.7ＭのCsCl、50mMのEDTA（pH7.0）の10mlのクッションの上に層状にし、そしてTi−70ローター中で42,000rpmで23において1 2〜16時間遠心した。ペレットをTE/SDS（10mMのトリス−HCl（pH7.5）、１mMのE DTA、0.1％（ｖ／ｖ）のSDS）の中に再懸濁させ、そして10mMのEDTA（pH7.5）中で飽和させたフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１）で抽出した。エタノール沈澱後、RNAペレットをTE/SDSの中に再懸濁させた。 40mMのモルホリノプロパンスルホン酸（pH7.0）、５mMの酢酸ナトリウム、0.1 mMのEDTA（pH8.0）を含有する泳動用緩衝液を使用して、2.2Ｍのホルムアルデヒド／1.2％（ｗ／ｖ）アガロースを通してRNAの試料を電気泳動させた。RNAを製造業者が記載するようにハイボンド−Ｎフィルター（Amersham）に移し、そして³² Ｐ標識化cDNA断片（10⁸cpm／μｇ，２×10⁶cpm／ml）でプロービングした。プレハイブリダイゼーション（42℃において１時間）およびハイブリダイゼーション（42℃において16時間）を、50％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、１ＭのNaCl、１％（ｗ／ｖ）のSDS、10％の硫酸デキストラン中で実施した。分解したサケ精子D NA（100μｇ／ml）をハイブリダイゼーションステップのために³²Ｐ標識化プローブとともに添加した。フィルターを２×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS中で65℃において１〜２時間洗浄し、次いで0.2×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS中で65℃において0.5〜１時間洗浄した。フィルターをコダックXARフィルムに増感スクリーンを使用して−70℃において4 8時間感光した。プラスミドpCGP90で形質転換したジアンツス（Dianthus）cv．レッド・シム（ Red sim）のノザン分析は、13植物のうちの８個体が陽性であることを示した。ｂ．ロサ（Rosa）のRNA Manning，1991の方法に従い花弁（収穫後５日の芽および花）から、全RNAを抽出した。実施例15 DNAプローブの³²Ｐ標識化 DNA断片（50〜100ng）を50μCiの〔α−³²Ｐ〕−dCTPでオリゴ標識化キット（ Bresatec）を使用して放射線標識化した。組込まれなかった〔α−³²Ｐ〕−dCTP をセファデックスＧ−50（Fine）カラムのクロマトグラフィーにより除去した。実施例16 アントシアニジンの分析 HPLC分析の前に、花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子を酸加水分解して、アントシアニジンのコアからグリコシル部分を除去した。アントシアニン色素のＢ環へのヒドロキシル化のパターンを、アントシアニジンのコア分子のHP LC分析により決定した。この分析において使用したHPLC系は、多波長の検出器（ MWD）を装備したヘウレット−パッカード（Hewlett-Packerd）1050であった。逆相クロマトグラフィーの分離をスフェリソーブ（Spherisorb）S50DS2キャリッジ・カラム、250mm×４mmのIDで実施した。ａ．アントシアニンおよびフラボノイド類の抽出１％（ｖ／ｖ）の水性６Ｍの塩酸を含有する５mlのメタノールを使用して、花弁セグメント（約50mg）から花の色素を抽出した。抽出液を水（１：９）で希釈し、そしてHPLC系の中に注入の前に、濾過（Millex HV，0.45μ）した。ｂ．アントシアニン類の加水分解上のａにおいて得られた粗製のメタノール抽出液（100μｌ）を、ピアース・レアクチ−バイアル（Pierce Reacti-Vial）中で、室温において乾燥窒素の流れを使用して蒸発乾固した。残留物を200μｌの２ＭのHCl中に溶解し、バイアルに蓋をし、次いで100℃で30分間加熱した。加水分解混合物を水（１：９）で希釈し、そして、HPLC分析前に、濾過（Millex HV，0.45μ）した。ｃ．クロマトグラフィー花の色素の分離は、次の系を使用する勾配溶離により実施した：溶媒Ａ：（トリエチルアミン：濃H₃PO₄：H₂O）（３：2.5：1000）溶媒Ｂ：アセトニトリル勾配条件：20分にわたって５％Ｂ〜40％Ｂ流速：１ml／分温度：35℃ 検出：MWD，280，350および546nmにおける同時のデータの獲得。アントシアニジンのピークを既知の標準を参照して同定した。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子の分析のための別の方法は、Bruglieraら、1994 の中に見出される。 HPLC分析を実施して、プラスミドpCGP90，pCGP485，pCGP484，pCGP628，pCGP6 53又はpCGP1458の１つまたは他のもので形質転換されたカーネーション、キクおよびバラの試料の中のデルフィニジン、ペラルゴニジンおよびシアニジンの色素の存在を決定する。トランスジェニックカーネーションの花中のpCGP90，pCGP485およびpCGP653の代表的なデータを表１に示す。実施例17 ３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性について検定のための植物抽出物の調製植物組織を10倍体積の氷冷抽出用緩衝液（100mMのリン酸カリウム（pH7.5）、１mMのEDTA、0.25Ｍのスクロース、25Ｍのマンニトール、0.1％（ｗ／ｖ）のBSA 、0.1mg／mlのPMSF、20mMの２−メルカプトエタノールおよび10mg／mlのポリクラール（polyclar）AT）中で均質化した。ホモジネートを13,000rpmでJA20ローター（Beckman）中で４℃において10分間遠心し、そして上澄み液の一部を３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性について検定した。３′，５′−ヒドロキシラーゼの検定３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性をstotzおよびForkmann（1982）に記載されている方法の変法により測定した。検定反応混合物は、典型的には、200μｌの最終体積において検定緩衝液（100mMのリン酸カリウム（pH8.0）、１mMのEDTA および20mMの２−メルカプトエタノール）中に195μｌの植物抽出物、５μｌの5 0mMのNADPH、および10⁵dpm〔¹⁴Ｃ〕ナリンゲニンを含有した。23℃において一夜のインキュベーション後、反応混合物を0.5mlの酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル相を真空下に乾燥し、次いで10μｌの酢酸エチルの中に再懸濁させた。次いで、放射線標識化したフラボノイド分子を、セルロースの薄層プレート（Me rck Art 5577、ドイツ国）上でクロロホルム：酢酸：水（10：９：１，ｖ／ｖ）溶媒系を使用して分離した。クロマトグラフィーの完結後、TLCプレートを空気乾燥し、そして反応生成物をオートラジオグラフィーで局在化し、そして反応生成物に沿って展開しそして紫外線下に可視化した非放射性ナリンゲニン、エリオジクチオール、ジヒドロケルセチンおよびジヒドロミリセチンの標準と比較することによって同定した。実施例18 種々の園芸品種の形質転換構成体pCGP90，pCGP812，pCGP628，pCGP485，pCGP653，pCGP484またはpCGP145 8のいずれか１つを含有するキメラ遺伝子を、実施例10，11および12に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、バラ、カーネーションおよびキクの植物変種の中に導入する。植物ゲノムの中への適当なキメラ遺伝子の組込みはカナマイシンの選択後に得られた植物のサザン分析により確証され、そして上の実施例16に記載するように、HPLC分析を使用してアントシアニン類の存在を検出する。首尾よくトランスジェニックとされそして本発明に従い転移遺伝子を発現することができる植物は、３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性の生成に必要な遺伝子を含有しない非トランスジェニック対照と比較して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類に加えて有意なレベルの３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する（実施例16参照）。実施例19 カーネーションcv．クロウレイ・シム（Crowley Sim）＋pCGP90 プラスミドpCGP90を、実施例10に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、カーネーションの園芸品種クロウレイ・シム（Crowley Si m）の中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。９つの植物をnptIIおよびHf１遺伝子の存在についてそしてデルフィニジンの生産について検査した。分析した９つの植物のうちの８つはnptIIおよびHf１の両方について陽性であったが、HPL C分析はこれらの植物によりデルフィニジンの生産の証拠を検出することができなかった（表２参照；「Kan」＝カナマイシン）。実施例20 カーネーションcv．ラグナ（Laguna）＋pCGP485 プラスミドpCGP485を、実施例10に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、カーネーションの園芸品種ラグナ（Laguna）の中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子のHPLC分析を、上の実施例16に記載する手順に従い実施して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン誘導体の存在を示した。これらの３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類は外因性DNA配列、すなわち、バイナリーベクターpCG P485を使用する形質転換により導入されたHf１cDNA配列の発現の結果としてのみ生産される。実施例21 バラcv．ロイアルティ（Royalty）＋pCGP485／pCGP628 プラスミドpCGP485およびpCGP628を、実施例11に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、カーネーションの園芸品種ロイアルティ（Royalty）の中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子のHPLC分析を、上の実施例16 に記載する手順に従い実施して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン誘導体の存在を示した。これらの３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類は外因性DNA配列、すなわち、バイナリーベクターpCGP485またはpCGP628を使用する形質転換により導入されたHf１cDNA配列の発現の結果としてのみ生産される。実施例22 バラcv．カルディナール（Kardinal）＋pCGP1458 プラスミドpCGP1458を、実施例11に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、バラの園芸品種カルディナールの中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子のHPLC分析を、上の実施例16に記載する手順に従い実施して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン誘導体の存在を示した。これらの３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類は外因性DNA配列、すなわち、バイナリーベクターpCGP1458を使用する形質転換により導入されたHf１cDNA配列の発現の結果としてのみ生産される。実施例23 cv．ブルー・リッジ（BlueRidge）＋pCGP484/pCGP485/pCGP628 プラスミドpCGP484，pCGP485およびpCGP628を、実施例12に記載するように、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移を使用して、クリサンテナム（Chrysanthemu m）の園芸品種ブルー・リッジ（BlueRidge）の中に導入した。植物ゲノムの中の構成体の組込みは、カナマイシン選択後に得られた植物のサザン分析により確証された。花弁抽出物の中に存在するアントシアニン分子のHPLC分析を、上の実施例16に記載する手順に従い実施して、３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン誘導体の存在を示した。これらの３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン類は外因性DNA配列、すなわち、バイナリーベクターpCGP484，pCGP485またはpCGP628を使用する形質転換により導入されたHf１cDNA配列の発現の結果としてのみ生産される。実施例24 改変された花序トランスジェニック植物における導入されたフラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素活性の発現は、花の色に対する顕著な作用を有することができる。トランスジェニック植物における花の組織は、非トランスジェニック対照植物の淡いピンクおよび赤からより濃いピンク／えび茶色ないし青／紫の色の範囲に変化することができる。色は、また、ロイアル・ホーティカルチュラル・ソサイアティイズ・カラー・チャート（Royal Horticultural Society's Colour Chart ）からの番号により記載することができる。一般に、変化は色が60Ｃ／Ｄ−65Ｃ／Ｄの淡いないし中間のピンクの色相から、70と85との間の色の正方形の多数であるが、すべてはないものにより表される、より濃いより青い／より紫の色相に動くように記載することができる。他の生化学的および生理学的条件は個々の結果に影響を与えそして特定の色の引用は可能な範囲を規定すると解釈すべきでないことを思い起こすべきである。前述のプラスミド構成体pCGP653を使用して生成した、受け入れ番号3655のトランスジェニックのカーネーションの花の場合において、花弁への明らかな効果が観察された。レッド・シム（Red Sim）カーネーションの園芸品種の通常オレンジ−赤の色（ロイアル・ホーティカルチュラル・ソサイアティイズ・カラー・チャート（Royal Horticultu ral Society's Colour Chart）の45Ａ／Ｂにほぼ相当する）は青／紫の色相に変化した。当業者は理解するように、ここに記載する本発明は特定的に記載したもの以外の変化および変更が可能である。本発明はすべてのこのような変化および変更を包含することを理解すべきである。本発明は、また、個々にまたは集合的に、この明細書に言及し、あるいは示したステップ、特徴、組成物および化合物のすべて、および前記ステップまたは特徴の任意の２またはそれ以上の任意のおよびすべての組み合わせを包含する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月２９日【補正内容】【図１】【図１】【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年７月４日【補正内容】明細書翻訳文第３頁第２１行目〜第５頁第７行目の記載「本発明によれば…pCGP 1458である。」を次の通りに補正する。『本発明によれば、遺伝子構成体を発生させ、そして同一種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジンおよび／またはその誘導体を発現するトランスジェニック植物をつくるために使用する。本発明によれば、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼに操作可能に連鎖されたフラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からのプロモーターを含んでなる遺伝子構成体は高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類の発現を指令することができることが決定された。これらの高いレベルのデルフィニジンおよび関係する分子の生産は、改変された花序特性を示すある範囲の植物を発生させるとき特に有用である。したがって、本発明の１つの面は、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子に操作可能に連鎖されたフラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からのプロモーターを含んで成る遺伝子を有し、同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類を生産する、バラ、カーネーションおよびキクもしくはそれらの後代、または顕花部分から選択されるトランスジェニック植物に関する。好ましくは、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼはペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである。最も好ましくは、フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼはペチュニア起源のものである。本発明の遺伝子構成体は、３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする配列をコードする核酸分子を含みそして必要に応じて追加の配列、例えば、トランスジェニック植物の中で前記分子の発現を可能とするプロモーターおよびターミネーターの配列を含む。遺伝子構成体がDNAである場合、それはcDNAまたはゲノムDNAであることができる。好ましくは、DNAは植物のゲノムの中に組込まれて本発明のトランスジェニック植物を生産することができるキメラ遺伝子構成体を含んでなるバイナリーベクターの形態である。キメラ遺伝子構成体は、フラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からの植物プロモーターを有する。好ましいプロモーターはカルコンシンターゼ（CHS）をコードする遺伝子からのものであり、そして「CHSプロモーター」と呼ぶ。CHSプロモーターは、その下流に操作可能に連鎖された遺伝配列の高いレベルの発現を指令するので、特に好ましい。最も好ましいバイナリーベクターはpCGP484，pCGP485，pCGP653およびpCGP1 458である。』請求の範囲１．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子に作用可能に連結されたフラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からのプロモーターを含んでなる遺伝子構成体を有し、同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類を生産する、バラ、カーネーションおよびキクもしくはそれらの後代、またはそれらの花序から選択されるトランスジェニック植物。２．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである請求項１記載のトランスジェニック植物。３．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニア起源のものである請求項２記載のトランスジェニック植物。４．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがトルコギキョウ起源のものである請求項２記載のトランスジェニック植物。５．プロモーターがカルコンシンターゼ（CHS）をコードする遺伝子からのものである請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック植物。６．遺伝子構成体がpCGP484，pCGP485，pCGP653およびpCGP1458から選択されるプラスミドの中に含有されている請求項５記載のトランスジェニック植物。７．前記植物がバラである請求項３ないし６記載のトランスジェニック植物。８．前記植物がカーネーションである請求項３ないし６記載のトランスジェニック植物。９．前記植物がキクである請求項３ないし６記載のトランスジェニック植物。 10．改変された花序を示す請求項１記載のトランスジェニック植物。 11．改変された花序を示す請求項７記載のトランスジェニック植物。 12．改変された花序を示す請求項８記載のトランスジェニック植物。 13．改変された花序を示す請求項９記載のトランスジェニック植物。 14．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列に作用可能に連結されたフラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子からのプロモーターを含んでなる遺伝子構成体をバラ、カーネーションおよびキクの中に導入することを含んでなり、該トランスジェニック植物が同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比べて高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類のアントシアニン誘導体を生産することを特徴とする、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物を作出する方法。 15．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである請求項14記載の方法。 16．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニア起源のものである請求項15記載の方法。 17．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼがトルコギキョウ起源のものである請求項15記載の方法。 18．プロモーターがカルコンシンターゼ（CHS）をコードする遺伝子からのものである請求項14〜17のいずれかに記載の方法。 19．遺伝子構成体がpCGP484，pCGP485，pCGP653およびpCGP1458から選択されるプラスミドの中に含有されている請求項15記載の方法。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年７月１１日【補正内容】 20．前記植物がバラである請求項16ないし19記載の方法。 21．前記植物がカーネーションである請求項16ないし19記載の方法。 22．前記植物がキクである請求項16ないし19記載の方法。 23．前記トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求項14記載の方法。 24．前記トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求項20記載の方法。 25．前記トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求項21記載の方法。 26．前記トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求項22記載の方法。 27．植物のゲノムの中に組込まれて請求項１記載のトランスジェニック植物を作出することができる遺伝子構成体を含んでなるバイナリーベクター。 28．遺伝子構成体がキメラ遺伝子構成体である請求項27記載のバイナリーベクター。 29．プロモーターがCHS遺伝子のプロモーターである請求項28記載のバイナリーベクター。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドを生産し、そして同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比して高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類を生産する、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物またはその後代。２．ポリペプチドがペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである請求の範囲１のトランスジェニック植物。３．ポリペプチドがペチュニア起源の３′，５′−ヒドロキシラーゼである請求の範囲２のトランスジェニック植物。４．ポリペプチドがトルコギキョウ起源の３′，５′−ヒドロキシラーゼである請求の範囲２のトランスジェニック植物。５．ポリペプチドがpCGP484，pCGP485，pCGP628，pCGP653およびpCGP1458から選択されるプラスミドの中に含有される遺伝配列によりコードされる３′，５′ −ヒドロキシラーゼである請求の範囲３のトランスジェニック植物。６．前記植物がバラである請求の範囲３または４または５のトランスジェニック植物。７．前記植物がカーネーションである請求の範囲３または４または５のトランスジェニック植物。８．前記植物がキクである請求の範囲３または４または５のトランスジェニック植物。９．改変された花序を示す請求の範囲１のトランスジェニック植物。 10．改変された花序を示す請求の範囲６のトランスジェニック植物。 11．改変された花序を示す請求の範囲７のトランスジェニック植物。 12．改変された花序を示す請求の範囲８のトランスジェニック植物。 13．フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列を含有する遺伝子構成体をバラ、カーネーションおよびキクの中に導入することからなり、トランスジェニック植物が同一のそれぞれの種の非トランスジェニック植物に比して高いレベルのデルフィニジン由来アントシアニン類のアントシアニン誘導体を生産することを特徴とする、バラ、カーネーションおよびキクから選択されるトランスジェニック植物を生産する方法。 14．３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニア、バーベナ、デルフィニウム、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ジャガイモ、三色スミレ、ナス、トルコギキョウまたはカンパネラ起源のものである請求の範囲13の方法。 15．３′，５′−ヒドロキシラーゼがペチュニアのものである請求の範囲14の方法。 16．３′，５′−ヒドロキシラーゼがトルコギキョウのものである請求の範囲 14の方法。 17．３′，５′−ヒドロキシラーゼがpCGP484，pCGP485，pCGP628，pCGP653およびpCGP1458から選択されるプラスミドの中に含有される遺伝配列によりコードされる３′，５′−ヒドロキシラーゼである請求の範囲15の方法。 18．前記植物がバラである請求の範囲15または16または17の方法。 19．前記植物がカーネーションである請求の範囲15または16または17の方法。 20．前記植物がキクである請求の範囲15または16または17の方法。 21．トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求の範囲13の方法。 22．トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求の範囲18の方法。 23．トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求の範囲19の方法。 24．トランスジェニック植物が改変された花序を示す請求の範囲20の方法。 25．植物のゲノムの中に組込まれて請求の範囲１のトランスジェニック植物を生産することができる遺伝子構成体を含んでなるバイナリーベクター。 26．遺伝子構成体がキメラ遺伝子構成体である請求の範囲25のバイナリーベクター。 27．遺伝子構成体が植物プロモーターを含んでなる請求の範囲25のバイナリーベクター。 28．pCGP484，pCGP485，pCGP653およびpCGP1458から選択される請求の範囲27 のバイナリーベクター。 29．ベクターがpCGP628である請求の範囲25または26のバイナリーベクター。