JPH08512019A - Tumor targeting using L-enantiomeric oligonucleotide conjugates consisting of immunoreactive agent and chelated radionuclide - Google Patents

Tumor targeting using L-enantiomeric oligonucleotide conjugates consisting of immunoreactive agent and chelated radionuclide

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JPH08512019A
JPH08512019A JP6520313A JP52031394A JPH08512019A JP H08512019 A JPH08512019 A JP H08512019A JP 6520313 A JP6520313 A JP 6520313A JP 52031394 A JP52031394 A JP 52031394A JP H08512019 A JPH08512019 A JP H08512019A
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スノー、ロバート・アレン
ブラック、クリストファー・ダグラス・バリアント
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ザ・ウエルカム・ファウンデーション・リミテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、非放射性ターゲッティング免疫試薬であって、免疫反応性基、１以上の非自己会合性Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列、および１以上の結合基を含有するもの、並びに放射性ターゲッティング免疫試薬であって、非自己会合性のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列の１以上のフラグメントと配列において相補的であり、該フラグメントとハイブリダイズすることができるＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列、１以上のキレート剤、１以上の結合基、および１以上の放射性核種を含有したもの向けられる。本発明はまた、１以上の上記免疫試薬および薬学的に許容しうる担体を含有する薬学的組成物に向けられる。本発明は更に、患者の疾患部位の治療およびイメージングのための方法に向けられる。   (57) [Summary] The present invention provides a non-radioactive targeting immunoreagent comprising an immunoreactive group, one or more non-self-associating L-enantiomeric oligonucleotide sequences, and one or more linking groups, as well as a radiotargeting immunoreagent. And an L-enantiomeric oligonucleotide sequence that is complementary in sequence to one or more fragments of a non-self-associating L-enantiomeric oligonucleotide sequence and is capable of hybridizing to the fragment, one or more chelating agents Directed to contain one or more linking groups and one or more radionuclides. The invention is also directed to pharmaceutical compositions containing one or more of the above immunoreagents and a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention is further directed to methods for treatment and imaging of a diseased site in a patient.

Description

【発明の詳細な説明】免疫反応剤およびキレート化された放射性核種からなるＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチド複合体を用いる腫瘍 ターゲッティング 本発明の分野 本発明は、逐次ターゲッティングおよび免疫試薬組成物の輸送であって、第一 の非放射性ターゲッティング免疫試薬および第二の放射性輸送薬を具備した腫瘍 をターゲットにした逐次輸送システムによる癌の治療および診断用のイメージン グにおける利用が特に見出されるものに関する。本発明はまた、腫瘍の治療およ び診断用のイメージングのための分岐された腫瘍ターゲッティング（bifurcated tumor targeting）ベクターおよび輸送ベクターに、Ｌ−エナンチオメリックオ リゴヌクレオチド、相補的Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド、および キレート体を結合する新規な方法に関する。本発明の背景 診断用のイメージングおよびターゲッティングによる治療的な応用に使用され る現在利用しうる種々の放射性標識された免疫反応性タンパクおよび方法は、幾 つかの不利益を有している。例えば、放射性同位体を含有する免疫反応性タンパ クを含めた、現在利用しうる種々の放射性医薬を用いる放射性免疫療法および診 断用のイメージングは、これらの放射性医薬が、標的でない正常組織に結合しう るので決して最適と はなり得ない。この結合は、治療的な応用の間に正常組織に対して望まない毒性 を生じさせ、診断用のイメージングへの応用においては高いバックグラウンドシ グナルを生じさせうる。複合製剤（conjugate preparation）内のタンパクと放 射性成分の非能率的な共有結合は、放射活性な成分が放出され、この後該成分が 健康な組織に分布されうるので、他の問題となりうる。現在利用しうる放射性同 位体を含有する免疫反応性タンパクの血漿半減期が長く、体内からの放射性同位 体の排出がゆっくりであるため正常細胞の被爆が長引き、放射線の影響によるダ メージを引き起こし得、他の正常な疾患にかかっていない体内の組織、特にこれ らの組織および放射線のダメージに最も敏感な細胞、例えば骨髄の幹細胞および 胃腸管において受け入れらない毒性効果をもたらしうる。免疫反応性タンパクと 結合しうるイオン性の放射性同位体の数は、キレーションに利用しうる部位の数 によって制限されるが、該タンパクと複合体を形成したキレート剤の数を増加す ることによって達成されうる数の増加は、該タンパクの免疫反応性の減少をもた らす。これは、該タンパクに結合しうるこのようなキレート剤の数を制限しうる 。免疫反応性タンパクに結合しうるキレート剤の数は、例えばキレート剤を結合 する場合の使用に適したアミノ基のような利用しうる基の数、および該タンパク を高度に派生させた場合に、ハプテン化された宿主免疫系によって認識されうる このように修飾されたタンパクの潜在的な免疫原性によっても制限される。 本発明の目的は、現在利用しうる放射性標識された免疫反 応性タンパクの上記不利益の幾つかを克服することにある。 デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の形態での核酸は、タ ンパクと酵素を細胞合成するための遺伝情報をコードし、転写する。天然に存在 する核酸は、ＤＮＡでは、２’−デオキシアデノシン（ｄＡ）、２’−デオキシ グアノシン（ｄＧ）、２’−デオキシシチジン（ｄＣ）、およびチミジン（Ｔ） より構成され、ＲＮＡでは、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（ Ｃ）、およびウリジン（Ｕ）より構成される。２’−Ｏ−メチルリボシル基を含 有する核酸、並びにＮ4，Ｎ4−ジメチルアデニンおよびＮ7−メチルグアニジン を含有する核酸のような天然に存在する修飾された核酸は、メッセンジャーＲＮ Ａ、トランスファーＲＮＡ、およびリボソームＲＮＡないに見出される。ヌクレ オシド内ホスホジエステル結合は、ＲＮＡおよびＤＮＡ内において、それぞれ、 一方のヌクレオシドのＤ−リボースまたはＤ−デオキシリボースの糖部分の３’ −ヒドロキシル基の酸素位置で、他方のヌクレオシドのＤ−リボースまたはＤ− デオキシリボースの糖部分の５’−ヒドロキシル基の酸素にヌクレオチドを結合 する。核酸の別々の鎖は、ヌクレオシドプリンおよびピリミジン塩基の相補対間 、即ちＤＮＡではアデニンとチミジンおよびグアニンとシトシン、並びにＲＮＡ ではアデニンとウラシルおよびグアニンとシトシンで形成される水素結合を介し てお互いに相互作用する。２つの別々のオリゴヌクレオチド鎖（strands）また は一本鎖の２つの領域における塩基の配列が、お互いに相補的である場合、該相 補 的配列は、相補的な塩基対間の水素結合を介してお互いにハイブリダイズするこ とができ、Ｂ−タイプのコンホーメーションを有する右巻きの二重螺旋（right- handed double he-lix）を形成する。この螺旋の２つのホスフェート−リボース エステルバックボーンは逆平行である。 天然に存在するＤＮＡでは、各ヌクレオシドユニットは、Ｄ−エナンチオマー である。この構造は、Ｒ1がＨであり、「塩基」がアデニン、グアニン、チミン 若しくはシトシン部分を表す構造Ｉで概略図として表される１’−（ｂ）、３’ −（ａ）、および４’−（ｂ）位置で置換基を有するＤ−デオキシリボース環の キラリティーで定義される。天然に存在するＲＮＡでも、各ヌクレオシドユニッ トはＤ−エナンチオマーであり、その構造は、Ｒ1がＯＨであり、「塩基」がア デニン、グアニン、ウラシル若しくはシトシン部分を表す構造Ｉで概略図として 表される１’−（ｂ）、２’−（ａ）、 ３’−（ａ）、および４’−（ｂ）位置で置換基を有するＤ−リボース環のキラ リティーで定義される。天然に存在するＤＮＡおよびＲＮＡの両方とも、リン酸 ジエステルと塩基はキラル中心を含有しない。 P．S．Miller，Bioconjugate Chem．1990，1，187-191に記載されているよう に、天然型に合わせて形成されたＤ−エナンチオマーで構成された、合成によっ て調製されたオリゴヌクレオチドは、核酸を重合する酵素のプライマーとして、 組換えＤＮＡ技術によってタンパクを調製するための人工遺伝子を構築する場合 のシントンとして、および細胞性核酸配列を検出し、特徴づけるための診断用プ ローブとして使用されている。加えて、合成によって調製されたオリゴヌクレオ チドは、生きた細胞内での遺伝子発現の制御に使用するため、およびウイルスの 複製の阻害および癌の治療における治療薬として研究されている。これらの応用 は、合成オリゴヌクレオチドと天然のＤ−エナンチオマーオリゴヌクレオチドの 標的配列との特異的な相補的結合特性に負っている。 天然のように配列されたＤ−エナンチオマーにより構成された合成で調製され たオリゴヌクレオチドは、種々の方法で得られ、これらのうち、現在最も有効な 方法には、E.Uhlmann and A．PeymanによりChemical Reviews，1990，90，544で 開示されたような、ホスホルアミダイト中間体を経る固相合成、およびＨ−ホス ホネート中間体を経る固相合成が含まれる。ホスホルアミダイト法では、Ｄ−エ ナンチオマーの伸長されるＤＮＡオリゴマー鎖であって、これらの塩基のエキソ 環アミン基がアミド保護基を有しており、且つ該オリゴマー鎖が固相支持体に結 合されているものの５’−ヒドロキシ基が、触媒としての１Ｈ−テトラゾールの 存在下で、活性化されたＤ−ヌクレオシド５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’ −（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトと反応す る。一般に使用される保護基には、アデニンおよびシトシンのエキソ環アミノ基 の保護基としてベンゾイル基、並びにグアニンのエキソ環アミノ基のの保護基と してイソブチル基がある。反応されない何れの５’−ヒドロキシル基は、４−Ｎ ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの存在下で無水酢酸と反応することによってアセ テート基で塞がれる。次に得られたホスファイトをヨウ素で酸化し、リン酸トリ エステルを形成する。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基をジクロロ酢酸を用いる 酸性条件下で除去し、この一連の反応を、他の活性化されたＤ−ヌクレオチド５ ’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ ル）ホスホルアミダイトを用いて繰り返す。この一連の反応の終点で、オリゴヌ クレオチドのアミド保護基を除去し、水酸化アンモニウムで処理することによっ て支持体からオリゴヌクレオチドを開裂する。次にオリゴヌクレオチドを、沈殿 、電気泳動、またはクロマトグラフィーのような方法で精製または単離する。 合成によるＤ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドのin vivoでの適用の 多くは、細胞外および細胞内の両方で遭遇するヌクレアーゼによってオリゴマー が破壊されることに より制限される。J.Goodchildによって、Bioconjugate Chem.1990，1，165にお いて概説されているように、ヌクレアーゼの活性に対して耐性をを導入するため の戦略には、ヌクレオシド塩基の修飾、並びにポリマーバックボーンのホスフェ ートおよびリボース成分の修飾が含まれる。これらは全て、修飾されたオリゴヌ クレオチドの活性を維持し、天然に存在するＤ−エナンチオマーのＤＮＡまたは ＲＮＡとハイブリダイズし、あるいはＤ−エナンチオマーを唯一認識する酵素と 結合するように行われる必要がある。 構造IIで示されるα−アノマーを形成するように１’−リボース部位での変換 を通して達成されうるようなオリゴヌクレオシドキラリティー単一の修飾による Ｄ−オリゴヌクレオチドの特性の影響が、Bloch et alによってGene，1988,72,3 49で研究されている。彼らは、α−アノマーのＤＮＡが、相補的なベーターアノ マーのＲＮＡ、即ち天然に存在するエナンチオメリックオリゴマーとハイブリダ イズし、ａ：ｂ ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成し、該ハイブリッドがヌク レアーゼに耐性であることを見出した。 ThuongおよびChassingolは、Tetrahedron Letters，1988，29，5905において 、２−メトキシ−６−クロロ−９−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）アクリジ ンに５’−ホスフェートで共有結合的に結合したａ−ｄ−Ｔ、ａ−ｄ−Ｃ、およ びａ−ｄ−Ａを含有するオリゴ−ａ−デオキシヌクレオチドのシアノエチルホス ホルアミダイトシントンを用いる固相合成を報告した。アクリジン部分を持たな い類似のオリゴ−ａ−デオキシヌクレオチドが、ヌクレアーゼに耐性であること 、およびｂ−デオキシヌクレオチドとのハイブリッドよりも安定である天然のＤ −ＲＮＡとのハイブリッドを形成することが報告されている。Morvan et alは、 Nucleic Acid Research，1988，16，833において、ａ−ｄ−Ｔ、ａ−ｄ−Ｃ、ａ −ｄ−Ｇ、およびａ−ｄ−Ａを含有するオリゴ−ａ−デオキシヌクレオチド（こ れらは、二重螺旋のハイブリッド、またはパラレルおよびアンチパラレルな方向 性をそれぞれ持った相補 的なａおよびｂとの二本鎖を形成する。）の製造を報告した。これらの二本鎖は 、特異的なWatson-Crick型塩基対の特異性を保持しており、この異種二本鎖はＢ −ＤＮＡファミリーに属することが示される。これらはまた、対応する天然に存 在するｂｂ−ＤＮＡ二重螺旋と比較した場合、より高い熱安定性を示した。しか し、再度繰り返すが、標的のオリゴマーは天然に存在するＤ−オリゴマーであっ た。 構造ＩにおいてＤ−エナンチオマーの全てのキラル部位の完全な反転は、鏡像 、即ち構造IIIで表される天然に存在しないＬ−エナンチオマーを提供する。キ ラルなエナンチオマーまたはＤ−とＬ−エナンチオマーを識別しうる酵素のよう なキラルな試薬が存在しない場合は、Ｌ−エナンチオマーは、化学的な反応性に おいてＤ−エナンチオマーと同一である。Urata et alは、J．Am．Chem．Soc．1 991，113，8174において、（２−シアノエチルホスホルアミダイト法を経る）合 成と、自己相補的なＬ−ＤＮＡオリゴマーの二本鎖、Ｌ−ｄ（ＣＧＣＧＣＧ）の 特性を報告し、この特性をこれらの鏡像体、即ち天然のＤ−ｄ（ＣＧＣＧＣＧ） オリゴマーの特性と比較した。非天然の全てＬ−体の二本鎖は、ヌクレアーゼｐ −１による消化に耐性を有するが、天然の全てＤ−体の二本鎖は、その成分であ るＤ−ヌクレオチドと５’−末端デオキシシチジンに迅速に分解される。予想さ れるように、ＤＤ−およびＬＬ−二本鎖は両方とも、同一のＨＰＬＣ保持時間を 示し、これらの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、お互いに鏡像となる。０． １ＭＮａＣｌ中では、Ｄ−エナンチオマーは、 標準のＢ型のＣＤプロフィールを示すが、Ｌ−エナンチオマーは、全波長で同じ 大きさであるが反対の符号を示した。これは、左巻き（left-handed）二重螺旋 コンホーメーションを有する鏡像のＢ型螺旋が存在することを示す。４ＭＮａＣ ｌ中では、Ｄ−エナンチオマーは左巻きＺ型のプロフィールを示すが、Ｌ−エナ ンチオマーは、全波長で同じ大きさであるが反対の符号を示した。これは、右巻 き二重螺旋コンホーメーションを持った鏡像のＺ型が存在することを示す。全て のＤ−二本鎖および全てのＬ−二本鎖型の両方のスペクトルは、塩濃度の関数と して同じＢからＺへの配座遷移（反対の符号を有する。）を示し、更に低い塩濃 度および高い塩濃度の両方で、同じ温度依存性を示す。Ｄ−およびＬ−ＤＮＡは 、同じタイプで同じ強さの水素結合と塩基の積み重ね相互作用を有すること、お よびＬ−ＤＮＡの構造がＤ−ＤＮＡの構造の正確な鏡像となることが結論づけら れる。この全てのＬ−エナンチオメリックオリゴマー（これは自己相補的である ）は、異なった天然のＤ−または非天然のＬ−エナンチオマーの何れかをターゲ ッティングするために使用することはできない。 Fujimori et alは、Nucleic Acid Research，1990，22，97において、９−（ ２−デオキシ−ｂ−Ｌ−エリスロ−ペンタフラノシル）−９Ｈ−プリン−６−ア ミン、Ｌ−ｄＡ、および６量体Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−ｄ（ＡＡＡＡＡＡ）の合成を報 告した。彼らは、Ｌ−ｄ（ＡＡＡＡＡＡ）が、ウシ脾臓ホスホジエステラーゼに 耐性であるが、Ｄ−ｄ（ＡＡＡＡＡＡ）は完全に分解されることを観測した。彼 らはまた、Ｌ−ｄ（ＡＡＡＡＡＡ）が、天然のＤ−ＲＮＡエナンチオマー、Ｄ− ポリ（Ｕ）と複合体を形成し、この複合体は、エナンチオメリックな天然のＤ− ｄ（ＡＡＡＡＡＡ）およびＤ−ポリ（Ｕ）間で形成されたものよりも相対的に弱 いことを示した。非天然のＬ−ｄ（ＡＡＡＡＡＡ）と天然のＤＮＡエナンチオマ ーＤ−ポリ（Ｔ）との間では複合体は全く形成されなかった。これらの結果は、 Ｌ−エナンチオメリックＤＮＡは、ＤＮＡから相補的なＲＮＡを識別する能力を 有するが、非天然のＬ −ＤＮＡ：Ｄ−ＲＮＡ複合体は、対応する天然のＤ−ＤＮＡ：Ｄ−ＲＮＡ複合体 とほぼ同程度の強さを有しないことを示唆した。 Ｌ−ＤＮＡは、in Vitroで天然のエナンチオメリックＤ−ＲＮＡとハイブリダ イズでき、安定なヌクレアーゼ耐性を有していることが示されるが、実際には、 このような標的Ｄ−ＲＮＡとの二本鎖形成は、Ｌ−ＤＮＡが完全なＤ−ＲＮＡを 見出すために少なくとも１つの細胞膜に交差する必要があるのでin vivoでは容 易に達成できない。更に、天然のＤ−ＲＮＡは、天然に存在するヌクレアーゼ酵 素の存在下では相対的に寿命が短い。本発明の概要 本発明は、非放射性ターゲッティング免疫試薬であって、腫瘍抗原認識部位、 非自己会合性のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列を含有する１以 上のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド、および１以上の結合基（link lng groups）を含有するものに向けられる。 本発明はまた、放射性ターゲッティング免疫試薬であって、非自己会合性のＬ −エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列の１以上のフラグメントと配列に おいて相補的であり、且つ該１以上のフラグメントとハイブリダイズできるＬ− エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列を具備したＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチド、１以上のキレート剤、１以上の結合基および１以上の放射 性核種を具備したもの二 向けられる。 本発明はまた、上記１以上の免疫試薬および薬学的に許容しうる担体を含有す る薬学的組成物に向けられる。 更に本発明は、患者の、腫瘍部位のような疾患部位を治療およびイメージング するための方法に向けられる。前記方法は、効果的な量の上記非放射性ターゲッ ティング免疫試薬を患者に投与し、続いて効果的な時間間隔を置いて効果的な量 の上記放射性ターゲッティング免疫試薬を投与することを具する。 本発明は、従来のターゲッティング免疫試薬に比べて多くの利点を有する。例 えば、非放射性ターゲッティング免疫試薬はin vivoで腫瘍部位に蓄積され得る が、正常組織部位には蓄積されない。 非放射性ターゲッティング免疫試薬のin vivoでの残存半減期は、腫瘍部位で のその蓄積を可能にする程度に十分長い。 放射性ターゲッティング試薬のin vivoでの残存半減期は、非放射性ターゲッ ティング免疫試薬の残存半減期よりも短い。 非放射性ターゲッティング試薬が蓄積した腫瘍にハイブリダイズしない一部の 放射性ターゲッティング試薬は、患者から容易に排出される。放射性核種によっ て直接に標識することによって、または放射性核種を含有するキレート剤によっ てターゲッティング免疫試薬を同程度に修飾することに関しては、ターゲッティ ング免疫試薬あたりの修飾部位あたりの放射性核種の数の増加が観測されうる。 非放射性ターゲッティング免疫試薬の相補的に配列された Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの断片および放射性ターゲッティン グ試薬のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの断片がin vitroおよびin vivoでハイブリダイズされうる。 非放射性ターゲッティング免疫試薬および放射性免疫試薬の相補的に配列され たＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドは、異性体の相補的に配列された 天然に存在するＤ−エナンチオメリックオリゴマーとハイブリダイズしないであ ろう。 非放射性ターゲッティング免疫試薬および放射性ターゲッティング試薬の相補 的に配列されたＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ活 性に対して安定である。 非放射性ターゲッティング免疫試薬および放射性ターゲッティング試薬の相補 的に配列されたＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド、並びに該相補的な Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド間で形成されるハイブリッドは、異 性体のＤ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドへの結合に特異的である酵素 と結合しないであろう。 非放射性ターゲッティング免疫試薬および放射性ターゲッティング試薬の相補 的に配列されたＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド間で形成されたハイ ブリッドは、ヌクレアーゼ活性に対して安定である。 非放射性ターゲッティング免疫試薬および放射性ターゲッティング試薬の相補 的に配列されたＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズしない。 非放射性ターゲッティング免疫試薬および放射性ターゲッティング試薬は、広 範囲のスペーシング基（spacing groups）、結合基、およびキレート基、Ｌ−エ ナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列並びに放射性核種を含有しうる。 非放射性ターゲッティング免疫試薬の相補的に配列されたＬ−エナンチオメリ ックオリゴヌクレオチドは、スペーシング基によってタンデムに結合されうるＬ −エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列を包含しうる。ここで、各々のＬ −エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列は、放射性ターゲッティング試薬 の断片とハイブリダイズしうる。非放射性ターゲッティング免疫試薬の相補的に 配列されたＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドは５’−アミンまたは３ ’−アミンのような５’−若しくは３’−置換基の何れかによって抗体と結合さ れうる。 これらの試薬は、腫瘍に特異的であり、本発明に従って、広範囲の組成物が調 製されうる。 本発明の特に有利な点は、Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列の 長さとスペーシング基が、相補的な２つの放射性ターゲッティング試薬のＬ−エ ナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列を、隣接したタンデムに結合された非 放射性ターゲッティング免疫試薬のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド 配列を包含する一本のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドを含む鎖にハ イブリダイズする場合に、このような２つの放射性ターゲッティング部分の配列 の最も近い末端基がお互いに直行するように（これは、二重鎖の螺旋でこれらの 相対的な空間配置がこのように形成されるためである。）選択されうることであ る。 本発明の他の有利な特徴は、以下の好ましい態様の説明を参照することでより 容易に明らかになるであろう。好ましい態様の説明 本発明は、治療用および診断のイメージング用の組成物および方法に有用性を 有する生体複合体を開示する。本発明は更に、Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌ クレオチド配列を、キレート剤、好ましくはキレート剤を含有するターピリジン （terpyridine）に結合することによって、および該配列をタンパク、抗体、お よび受容体のような免疫反応試薬と結合することによって、生体複合体を製造す る新規な方法を開示する。 特に、本発明は、治療用および診断のイメージング用の組成物および方法に特 に有効性が見出される逐次ターゲッティングに有用であり、新規な放射性免疫試 薬組成物の輸送性を増幅させた新規な生体複合体を開示する。 より特別には、本発明は、腫瘍抗原認識部位、非自己会合性のＬ−エナンチオ メリックオリゴヌクレオチド配列を含有する１以上のＬ−エナンチオメリックオ リゴヌクレオチド、および１以上の結合基を含有するターゲッティング免疫試薬 の製造および使用を開示する。これらのターゲッティング免疫試薬は、前記非会 合性のＬ−エナンチオメリックオリゴヌ クレオチドの１以上のフラグメントに配列において相補的であり、該１以上のフ ラグメントとハイブリダイズできるＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド 、１以上の結合基、およびこれらと結合した１以上の放射性核種を含有する放射 性逐次ターゲッティング試薬と反応する。最も好ましくは、Ｌ−エナンチオメリ ックオリゴヌクレオチドは、天然のＤ−デオキシリボヌクレオチドのＬ−エナン チオマーである。 好ましい態様では、上記ターゲッティング免疫試薬は、構造IVによって表され る部分を含有する化合物を形成する。 但し、 Ｚは、免疫反応性タンパクの残基である； ＬzおよびＬQは、独立に化学結合若しくは結合基である； Ｉは、１２から約５０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットの 隣接した配列を含有するＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドであって、 前記隣接した配列が、１以上の同一の隣接した配列のファミリーのメンバーを含 み、前記ファミリーの個々の同一物が１２から約３０のＬ−エナンチオメリック ヌクレオチドユニットを含有するものであるが、前記Ｌ−エナンチオメリックオ リゴヌクレオチドの６以上の隣接した配列が、構 造IV内の何れの位置の六以上の隣接したＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユ ニットのいずれの他の隣接した配列ともハイブリダイズしないという条件がある ； ＱIは、スペーシング基である； ａは、０または１から約６までの整数である； Ｉiは、１２から約５０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニット の隣接した配列を含有するＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドであり、 その内の隣接した配列がＩの一部分を含有するものである； Ｅは、末端キャッピング基（end capping group）である； ｐは、１から約１０までの整数である。 他の好ましい態様では、上記ターゲッティング試薬は、構造Ｖで表される部分 を含有する。 但し、 ｃＩは、１２から約５０のＬ−エナンチオメリックヌ クレオチドユニットの隣接した配列であって、前記隣接した配列が、同一の隣接 した配列のファミリーの１以上のメンバーを含み、前記ファミリーの個々の同一 物が１２から約３０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットを含有する ものであり、前記同一物のＬ−エナンチオメリックヌクレオチド配列が、共に投 与されうるターゲッティング免疫試薬内の一連のＬ−エナンチオメリックオリゴ ヌクレオチドのメンバーのヌクレオチド配列に相補的であり、前記相補的なＬ− エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの６以上のＬ−エナンチオメリックヌク レオチドユニットの隣接した配列が、構造Ｖ内の何れの位置の六以上の隣接した Ｌ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットのいずれの他の隣接した配列とも ハイブリダイズしないものである； ＱcIは、スペーシング基である； Ｌ1、Ｌ2、およびＬ3は独立に化学結合若しくは結合基である； Ｗ1、Ｗ2、およびＷ3は、各々キレート基の残基である； Ｍ1、Ｍ2、およびＭ3は、＋１と等しいか、またはこれより大きい酸化状 態を有する元素を包含し、Ｍ1、Ｍ2、およびＭ3の少なくとも１つが放射性核種 である； ｘ、ｙ、およびｚは、独立にゼロまたは１であるが、ｘ、ｙ、およびｚの 少なくとも１つが１であるという条件が付く；および ｗおよびｂは独立にゼロまたは１から約４の整数である。 ここで使用されるＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットは、天然に存 在する異性体であるＤ−エナンチオマーヌクレオチドユニットの鏡像として定義 される。Ｌ−エナンチオメリックヌクレオシドは、天然に存在する異性体である Ｄ−エナンチオメリックヌクレオシドの鏡像として定義される。更に、Ｌ−エナ ンチオメリックオリゴヌクレオチド配列は、天然に存在する異性体であるＤ−エ ナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列の鏡像として定義される。 Ｌ−エナンチオメリックヌクレオシドの例を以下に説明するが、この例には限 られない。 Ｌ−エナンチオメリックヌクレオチド中間体からＬ−エナンチオメリックオリ ゴヌクレオチドを合成する方法は、異性体であるＤ−エナンチオメリックヌクレ オチド中間体から鏡像であるＤ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドを合成 する場合に使用される方法と同一である。このような方法の例には、Leroy B.To wnsendによって編集された"Chemistry of Nucleosides and Nucleotldes"，Plen um Press，N．Y.，1988に開示された方法が含まれる。このような方法によるＬ −エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの合成は、Ｌ−エナン チオメリックヌクレオシドおよびヌクレオチド誘導体のようなＬ−エナンチオメ リック試薬の使用を必要とする。種々のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドの 調製は、Robins，M．et al(1970)，J.Org.Chem.，35，p636-639；Holy，A.(1972 )，Coll．Czechoslov．Chem．Commun.，37，p4072-4087；Visser，G．et al(199 6)，Rec．Travaux Chim．Pay-Bas，105/12p528-537；Anderson，D．et al(1984) ，Nucleos1des and Nucletides，3/5，p499-512；Uhlmann，E.et al(1990)，Che m．Review,(1990)，90/4 p543-584；Smejkal，I．et al(1964)，Coll．Czechosl ov．Chem．Commun.，29，p2809-2813などに詳述されている。 オリゴヌクレオチドの合成で当分野で公知の方法のうち、本発明のＬ−エナン チオメリックオリゴヌクレオチドを合成する好ましい方法には、Ｌ−エナンチオ メリックヌクレオチドホスホルアミダイト中間体（これは、この中間体内の水酸 基に保護基を含有している。）を用いる固相合成が含有される。リボヌクレオシ ド部分およびデオキシリボヌクレオシド部分の５’−ヒドロキシル基の保護は、 好ましくは、例えばものメトキシトリチル基（これ以後しばしばＭＭＴ基と称す る。）またはジメトキシトリチル基（これ以後しばしばＤＭＴ基と称する。）の ような酸で遊離しうるトリチル基を用い、相当するトリチルクロライドを使用し て行われる。このようなトリチル保護された５’−ヒドロキシル基の脱保護は、 例えば水中の酢酸、ジクロロメタンのような溶媒中のクロロ酢酸、またはクロロ ホルム若しくはメタノールのような溶媒中 のベンゼンスルホン酸のような酸を試薬として用いて行われることが好ましい。 リボ核酸部分の２’−ヒドロキシル基の保護は、例えばｔ−ブチルジメチルシリ ルクロロシラン（これは、リボシル２’−ヒドロキシル基と反応し、ｔ−ブチル ジメチルシリルエーテルを形成する。）ようなシリルクロライドで行われること が好ましい。このようなｔ−ブチルジメチルシリルエーテルの脱保護は、例えば メタノールのような溶媒に溶解された、例えば水酸化ナトリウムで処理すること によって達成しうる。 好ましいＬ−エナンチオメリックヌクレオチドは、Ｌ−２−デオキシリボヌク レオチドであり、好ましいＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドは、オリ ゴ−Ｌ−２−デオキシリボヌクレオチドである。本発明のＬ−エナンチオメリッ クオリゴ−Ｌ−デオキシリボヌクレオチドの合成に有用なＬ−エナンチオメリッ クデオキシリボヌクレオチドの誘導体は、例えば化合物１から５の誘導体のよう なＬ−エナンチオメリックデオキシリボヌクレオシドであって、各々が、例えば ジメトキシトリチル（ＤＴＭ）基で保護された５’−ＯＨを有しており、該Ｌ− エナンチオメリックデオキシリボヌクレオシドの各々が、例えば２−シアノエチ ル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホリルクロライドと処理され、相当する３’− （２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトを生じるこ とによって、オリゴヌクレオチドのホスフェート結合形成に対して３’−ＯＨで 活性化されているものである。これらは、例えば固相自動ＤＮＡ合成機でオリゴ −Ｌ −デオキシリボヌクレオチド部分を合成するために利用される。 本発明のＬ−エナンチオメリックオリゴ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド部分 の合成に使用するのに適した、保護された２’−デオキシ−Ｌ−アデノシン３’ −Ｏ−ホスホルアミダイト誘導体Ａ１０を調製する好ましい方法を、スキーム１ に概説した。１−Ｏ−メチル−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルイル−２−デオキシ− Ｌ−エリスロ−ペントフラノース（スキーム１のＡ２）は、Smejkal，I．et al( 1964)，Coll．Czechoslov．Chem．Commun.，29，p2809-2813に開示された方法に 従って、ｐ−トルオイルクロライドとメタノールと処理することによってＬ−ア ラビナール（Ａ１）から調製される。Ａ２と２，６−ジクロロプリン（Ａ３）の 縮合によって、２，６−ジクロロ−９−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２ −デオキシ−アルフア−Ｌ−エリスロ−ペンタフラノシル）プリン（４Ａ）を得 る。Ａ４をメタノールとアンモニアで処理し、６位でプリンを選択的にアミノ化 し、同時に３’−および５’−位でアセチル化されたヒドロキシル基を脱保護す る。残りの塩素を水素化分解によって除去し、所望のＬ−ヌクレオシド、Ｌ−ｄ Ａ（Ａ６）を得る。次に、Ａ６のエキソサイクリックなアミンをベンゾイルクロ ライドを用いるジアシル化によって保護し、Ａ７（これは、保護されたアミンに 加えて、２つのベンゾエートエステルを含んでいる。）を得る。ベンゾエートエ ステルを、水酸化ナトリウム水溶液でケン化することによって除去し、Ａ８を得 る。次に、この ジオールをジメトキシトリチルクロライド（アルドリッチケミカルカンパニーよ り入手可能である。）で処理し、５’−位がＤＭＴエーテル化されたＡ９を得る 。次に、Ａ９を２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミ ダイト（アルドリッチケミカルカンパニーより入手可能である。）で処理し、Ａ １０、即ち所望の２つの位置が保護された５’−ジメトキシトリチル−２’−デ オキシ−Ｌ−アデノシン ３’−Ｏ−２−シアノエチルホスホルアミダイトを得 る。Ａ１０は、本発明の構造IVおよび構造Ｖの構成要素であるＬ−オリゴヌクレ オチド配列の合成の中間体として使用される。このような配列の製造は、異性体 であるＤ−オリゴヌクレオチドを合成および精製するために、製造者によって示 された手順を用いて、例えば自動化されたオリゴヌクレオチド合成機を用いて行 われうる。スキーム１ 保護されたＬ−デオキシアデノシンホスホルアミダイトの製造 本発明のＬ−エナンチオメリックオリゴ−Ｌ−デオキシリボヌクレオチド材料 に使用するのに適した、保護された２’−デオキシ−Ｌ−グアノシン３’−Ｏ− ホスホルアミダイト誘導体、Ｇ８を調製する好ましい方法を、スキーム２に概説 した。１−Ｏ−メチル−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルイル−２−デオキシ−Ｌ−エ リスロ−ペントフラノース（スキーム１のＡ２）を、Smejkal，I．et al(1964) ，Coll．Czechoslov．Chem．Commun.，29，p2809-2813に開示された方法に従っ て、ｐ−トルオイルクロライドとメタノールと処理することによってＬ−アラビ ナール（Ａ１）から調製する。メチルアセタール（Ａ２）を希塩酸で加水分解し 、ヘミアセタール（Ｇ２）を得る。これを無水酢酸でアセチル化し、１−アセチ ル ３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルイル−ベータ−Ｌ−エリスロ−ペント フラノース（Ｇ３）を得る。Ｇ３と２−フルオロ−６−ベンジルオキシプリン（ Ｇ４）を縮合することによって、Ｇ５を得、次いでこれをアルコール性アンモニ アで処理し、所望の生成物（Ｇ６）（これはクロマトグラフィーで精製される。 ）を得る。Ｇ６の６−ベンジル保護基を、水酸化アンモニウム中で、パラジウム −炭で水素化分解することによって除去し、２−アミノ−９−（２−デオキシ− Ｌ−エリスロ−ペントフラノシル）プリン−６−オン（Ｇ７；Ｌ−ｄＧ）を得る 。次に、Ｇ７のエキソサイクリックな２−アミノ基をイソブチリルクロライドで アセチル化することによって保護し、５’−ヒドロキシル基を、ジメトキシトリ チルクロライドを用いてＤＭＴエーテルとして保護し、３’−ヒドロキシル基を ２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトで処理し、 Ｇ８、即ち所望の２つの位置で保護された５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’ −デオキシ−Ｌ−グアノシン３’−Ｏ−２−シアノエチルホスホルアミダイトを 得る。Ｇ８は、本発明の構造IVおよび構造Ｖの構成要素であるＬ−オリゴヌクレ オチド配列の合成の中間体として使用される。このような配列の製造は、異性体 であるＤ−オリゴヌクレオチドを合成および精製するために、製造者によって示 された手順を用いて、例えば自動化されたオリゴヌクレオチド合成機を用いて行 われうる。スキーム２ 保護されたＬ−デオキシグアノシンホスホルアミダイトの製造 本発明のＬ−エナンチオメリックオリゴ−Ｌ−デオキシリボヌクレオチド材料 に使用するのに適した、保護された２’−デオキシ−Ｌ−ウリジン ３’−Ｏ− ホスホルアミダイト誘導体、Ｕ７を製造する好ましい方法を、スキーム３に概説 した。Ｌ−アラビノース（Ｕ１）をシアナミドと反応し、２’−アミノ−１，２ −オキサゾリン（Ｕ２）を得、これをメチ ルプロピオレート（Ｕ３）で処理してアンヒドロ−Ｌ−ウリジン（Ｕ４）を得る 。アンヒドロ誘導体Ｕ４を、ＨＢｒで開環し、２’−ブロモ−ヌクレオシド（Ｕ ５）を得、これを触媒水素添加し、２−デオキシ−Ｌ−ウリジン（Ｕ６）を得る 。Ｕ６の５’−ヒドロキシル基を、ジメトキシトリチルクロライドを用いてＤＭ Ｔエーテルとして保護し、３’−ヒドロキシルを２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジ イソプロピルクロロホスホルアミダイトと処理し、Ｕ７、即ち所望の、保護され た５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｌ−ウリジン ３’−Ｏ− ２−シアノエチルホスホルアミダイトを得る。Ｕ７は、本発明の構造IVおよび構 造Ｖの構成要素であるＬ−オリゴヌクレオチド配列の合成の中間体として使用さ れる。このような配列の製造は、異性体であるＤ−オリゴヌクレオチドを合成お よび精製するために、製造者によって示された手順を用いて、例えば自動化され たオリゴヌクレオチド合成機を用いて行われうる。スキーム３ 保護されたＬ−デオキシウリジンホスホルアミダイトの製造 本発明のＬ−エナンチオメリックオリゴ−Ｌ−デオキシリボヌクレオチド材料 に使用するのに適した、保護されたＬ−チミジン ３’−Ｏ−ホスホルアミダイ ト誘導体、Ｔ７を製造する好ましい方法を、スキーム４に概説した。この合成方 法は、キラルな出発物質としてＬ−アラビノースを用いる、スキーム３に開示さ れた２’−デオキシ−Ｌ−ウリジン３’−Ｏ−ホスホルアミダイト誘導体、Ｕ７ の製造に類似している。従って、Ｌ−アラビノースをシアナミドと処理し、２’ −アミノ−１，２−オキサゾリン（Ｕ２）を得る。次い で、これを加熱しながらメチルメタアクリレートと反応し、無水ヌクレオシド（ Ｔ４）を得る。Ｔ４を無水ＨＢｒで開環し、２−ブロモ−Ｌ−チミジン（Ｔ５） を得る。Ｔ５を接触水素添加してＬ−チミジン（Ｔ６）を得る。Ｔ６の５’−ヒ ドロキシル基を、ジメトキシトリチルクロライドを用いてＤＭＴエステルとして 保護し、３’−ヒドロキシル基を２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルク ロロホスホルアミダイトで処理し、Ｔ７、即ち所望の保護された５’−Ｏ−ジメ トキシトリチル−Ｌ−チミジン ３’−Ｏ−２−シアノエチルホスホルアミダイ トを得る。Ｔ７は、本発明の構造IVおよび構造Ｖの構成要素であるＬ−オリゴヌ クレオチド配列の合成の中間体として使用される。このような配列の製造は、異 性体であるＤ−オリゴヌクレオチドを合成および精製するために、製造者によっ て示された手順を用いて、例えば自動化されたオリゴヌクレオチド合成機を用い て行われうる。スキーム４ 保護されたＬ−チミジンホスホルアミダイトの製造 本発明のＬ−エナンチオメリックオリゴ−Ｌ−デオキシリボヌクレオチド材料 に使用するのに適した、保護された２’−デオキシ−Ｌ−シチジン ３’−Ｏ− ホスホルアミダイト誘導体、Ｃ７の好ましい製造方法をスキーム５に概説した。 従って、Ｌ−アラビノース、Ａ１をＨＣｌおよびトルオイルクロライドで処理し 、３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−Ｌ−リボフラノシルクロラ イド（Ｃ２）を得る。（Ｃ２）と４−クロロ−２−トリメチルシロキシピリミジ ン（Ｃ３）を縮合し、１−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ− Ｌ−リボフラノシル）−４−クロロピリミ ジン−２−オン（Ｃ４）を得る。これをメタノール中でアンモニアと処理し、２ −デオキシ−Ｌ−シチジン（Ｃ５）を得る。Ｃ５のエキソサイクリックなアミン をベンゾイルクロライドで処理することによって保護し、３’−および５’−位 のエステルをケン化して、３’−および５’−ヒドロキシル基が遊離したＣ６を 得る。Ｃ６の５’−ヒドロキシル基をジメトキシトリチルクロライドを用いてＤ ＭＴエーテルとして保護し、３’−ヒドロキシル基を２−シアノエチル Ｎ，Ｎ −ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトで処理し、Ｃ７、即ち所望の保護さ れた５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｌ−シチジン ３’−Ｏ −２−シアノエチルホスホルアミダイトを得る。Ｃ７は、本発明の構造IVおよび 構造Ｖの構成要素であるＬ−オリゴヌクレオチド配列の合成の中間体として使用 される。このような配列の製造は、異性体であるＤ−オリゴヌクレオチドを合成 および精製するために、製造者によって示された手順を用いて、例えば自動化さ れたオリゴヌクレオチド合成機を用いて行われうる。スキーム５ 保護されたＬ−デオキシシチジンホスホルアミダイトの製造 ２’−デオキシ−Ｌ−アデノシン（Ａ６）をこれ以後しばしばＬ−ｄＡと称し 、２’−デオキシ−Ｌ−グアニジン（Ｇ７）をこれ以後しばしばＬ−ｄＧと称し 、２’−デオキシ−Ｌ−ウリジン（Ｕ６）をこれ以後しばしばＬ−ｄＵと称し、 Ｌ−チミジン（Ｔ６）をこれ以後しばしばＬ−Ｔと称し、２’−デオキシ−Ｌ− シチジン（Ｃ５）をこれ以後しばしばＬｄＣと称する。本発明のＬ−エナンチオ メリックオリゴヌクレオチドの略称命名法として、例えば、２’−デオキシ−Ｌ −アデニン、Ｌ−ｄＡがリン酸ジエステル基で２’−デオキシ−Ｌ−グアノシン 、Ｌ−ｄＧに結合され、次いで該Ｌ−ｄＧがリン酸ジエステル基で２’−デオキ シ−Ｌ−ウリジン、Ｌ −ｄＵに結合され、該Ｌ−ｄＵが次にリン酸ジエステル基でＬ−チミジンＬ−Ｔ と結合され、次に、該Ｌ−Ｔがリン酸ジエステル基で２’−デオキシ−Ｌ−シチ ジン、Ｌ−ｄＣに結合されているものを含有する配列を有する無関連なＬ−エナ ンチオメリックオリゴヌクレオチドが定義され、しばしばＬ−ｄ（ＡＧＵＴＣ） と称されるであろう。このオリゴマーの５’−末端にＲ1基が結合し、このオリ ゴマーの３’−末端にＲ2が結した場合、該オリゴマーは、しばしばＲ1−５’− Ｌ−ｄ（ＡＧＵＴＣ）−３’−Ｒ2または５’−Ｒ1−Ｌ−ｄ（ＡＧＵＴＣ）−Ｒ2 −３’のように表示される。逆に、このオリゴマーの３’−末端にＲ1基が結合 し、このオリゴマーのＲ５’−末端にＲ2基が結合した場合、該オリゴマーは、 Ｒ1−３’−Ｌ−ｄ（ＡＧＵＴＣ）−５’−Ｒ2または３’−Ｒ1−Ｌ−ｄ（ＡＧ ＵＴＣ）−Ｒ2−５’のように表示される。関連物は、本発明のＬ−オリゴヌク レオチド、特にこの命名法を用いて以下に開示されるような配列を有する現在好 ましいオリゴヌクレオチドを構成する。 ここで「残基」の語は、化学的単位（chemical entity）との関連で使用され る。前記化学的単位は、例えばキレート剤、若しくは結合基、若しくはタンパク 反応性基、若しくは免疫反応性基、若しくは免疫反応性基、若しくは免疫反応性 タンパク、若しくは抗体、若しくは抗体フラグメント、若しくは異種二官能性(h eterobifunctional)交差結合剤のような交差結合剤、若しくはＬ−エナンチオメ リックオリゴヌクレオチド、若しくはスペーシング基、若しくは末端キャッピン グ基 を包含する。「残基」の語は、前記化学的単位の一部分であって、前記化学的な 単位の一部が独立の化学的単位として考慮された場合、化学的単位内の１以上の 化学結合が、１以上の他の化学的単位と１以上の共有結合を具備するように変化 され、修飾され、または置換されたとき、もっぱらそのまま残る前記化学単位と して定義される。従って、例えば一態様では、例えば構造IVのＩおよびＩｉ、ま たは構造ＶのｃＩに関連して、「Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの 残基」には、他の化学的単位の残基に少なくとも二価で結合するために修飾され たＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドが包含される。即ち、前記Ｌ−エ ナンチオメリックオリゴヌクレオチドには、少なくとも二価のＬ−エナンチオメ リックオリゴヌクレオチド配列が含有される。他の態様では、例えば、構造Ｖの Ｗ1、Ｗ2またはＷ3に関連して、「キレート基の残基」には、例えば結合基の残 基のような他の化学的単位の残基への結合を介して少なくとも１価に修飾された キレート基が包含される。 前記構造IVにおいて、Ｚは、好ましくは、腫瘍関連抗原を認識し、且つこれに 特異的である抗体若しくは抗体フラグメントである。幾つかの態様では、上記タ ンパクには、化学結合またはタンパク反応性基の残基若しくはタンパク上の反応 性基の残基から誘導される結合基を介してこれらに共有結合で結合された免疫反 応性基が含まれうる。ここで使用される「ＩＲＰ」と略称されうる「免疫反応性 タンパク」の語は、タンパク共有結合で結合されうる有機化合物、および生きた 微生物に見出されるか、または診断、治療、あるいは細胞性物質若しくは生きた 微生物の遺伝子工学に有用な有機化合物、並びに生物学的液体中に見出されうる か、あるいは腫瘍細胞のような治療されうる細胞に関連した他の成分と相互作用 する能力を有する有機化合物である。 免疫反応性基は、広範囲の天然に存在する材料または合成によって調製された 材料から選択される。これらの材料には、酵素、アミノ酸、ペプチド、ポリペプ チド、タンパク、リポタンパク、糖タンパク、脂質、リン脂質、ホルモン、成長 因子、ステロイド、ビタミン、多糖、ウイルス、原生動物、菌類、寄生生物、リ ケッチア、カビ、およびこれらの成分、血液成分、組織および器官成分、医薬、 ハプテン、レクチン、トキシン、核酸（オリゴヌクレオチドを含む）、抗体（モ ノクローナルおよびポリクローナル）、抗−抗体、抗体フラグメント、抗原性物 質（タンパクおよび糖鎖（carbohydrate）を含む）、アビジンおよびこれらの誘 導体、ビオチンおよびこれらの誘導体、並びに当業者に周知の他のものが含まれ るが、これらに限定されない。加えて、免疫反応性基は、何れかの基質であって 、免疫適格を有するホストに提供された場合に、その基質と結合することができ る特異的な抗体、または抗原−抗体反応に関与するそのように形成された抗体を 産生するものでありうる。 好ましい免疫反応性基は、Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの残基 上のここで説明されたタンパク反応性基と反応するための、またはここで説明さ れたような結合基と 反応するための少なくとも１つの反応部位を含有する限り、抗体およびこれらの 種々の免疫反応性フラグメントである。この部位は、免疫反応性種に固有である か、または、免疫反応性種の適切な化学修飾を介して導入されうる。先に概説し た技術によって産生される抗体に加えて、分子生物学の技術によって産生される 他の抗体およびタンパクを特に含有しうる。 好ましくは、免疫反応性基は、構造IV内のＬ−エナンチオメリックオリゴヌク レオチドとは結合せず、従って、該Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド の、構造Ｖの相補的に配列されたＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドと の結合が阻害される。 ここで使用される「抗体フラグメント」の語は、抗体の残基であって、抗体が 抗原との結合に対して特徴的に親和性を示すものを具備した免疫反応性物質を言 う。ここで使用される抗原との結合に対する親和性の語は、抗原結合部と抗原決 定基との間の相互作用の強さ若しくは結合の強さ、従ってこれらの間の立体化学 的な適合性の熱力学的表現を言う。それ自体では、これは、抗体−抗原相互作用 に対する平衡または結合定数の表現である。ここで使用される「親和性」の語も 、リガンドと受容体の間の相互作用の強さまたはこれらの間の結合の強さ、従っ てこれらの間の立体化学的な適合性の熱力学的表現を意味する。それ自体では、 これはリガンド−受容体相互作用に対する平衡または結合定数の表現である。 抗原と抗体との結合の親和性に関して、抗体フラグメント は、少なくとも前記抗原への結合に対する前記親和性のパーセンテージを示し、 このパーセンテージは、前記抗原への結合に対する前記抗体の相対的親和性の０ ．００１パーセントから１，０００パーセント、好ましくは０．０１パーセント から１，０００パーセント、より好ましくは０．１から１，０００パーセント、 もっとも好ましくは１．０パーセントから１００パーセントの範囲である。 抗体フラグメントは、１以上の化学結合の開裂反応を具備した化学反応によっ て、即ちアミノ酸、ペプチド、炭水化物、ここで説明した結合基、ここで説明し たスペーシング基、ここで説明したタンパク反応性基、およびここで説明したよ うに生成される抗体フラグメントを包含した群から選択される１以上の化学成分 を反応剤として使用する１以上の化学結合形成反応を具備した化学反応によって 、および分子生物学的プロセス、細菌によるプロセス、若しくは抗体遺伝子の遺 伝子工学を包含するプロセスおよび抗体遺伝子の遺伝子工学により生じるプロセ スによって抗体から産生されうる。 抗体フラグメントは１以上の以下の反応を具備する化学反応によって抗体から 誘導されうる。 （ａ）抗体が含有する１以上の化学結合の開裂。前記結合は、例えば炭素− 窒素結合、イオウ−イオウ結合、炭素−炭素結合、炭素−イオウ結合、および炭 素−酸素結合から選択され、この場合に前記開裂の方法は、以下の反応から選択 される。 （ｉ）酵素、例えばパパイン若しくはペプシン（これら は、当業者にとって、ＦａｂおよびＦａｂ’２と一般に呼ばれる抗体フラグメン トをそれぞれ生じさせることが知られている。）のような、生化学的触媒の作用 を包含する触媒化学反応。 （ii）例えば、７に等しいかまたはこれより小さいｐＨで有利に起こるヒド ロニウムイオンのような求電子的化学触媒の作用を包含する触媒化学反応。 （iii）例えば、７に等しいかまたはこれより大きいｐＨで有利に起こる水 酸イオンのような求核的触媒の作用を包含する触媒化学反応。 （iv）例えば、スルフヒドリル基（−ＳＨ基を含有する。）またはアニオン 性スルフィド基−Ｓ-Ｎａ+基のような塩の形態で−Ｓ-基を含有する。）を包含 する試薬によるジスルフィド結合のイオウ原子での置換反応のような化学量論的 な形式で消費される試薬を使用する置換反応を具備した化学反応。 （ｖ）例えば、ジスルフィド結合の還元のような還元反応を具備した化学反 応。 （vi）ヒドロキシル基の炭素−酸素結合の酸化、若しくは糖鎖部分で起こる ような隣接したジオールの炭素−炭素結合の酸化のような酸化反応を具備した化 学反応。または、 （ｂ）例えば、炭素−窒素結合（例えば、アミド結合、アミン結合、ヒドラ ゾン結合、イミン結合、およびチオ尿素結合）、ジスルフィド結合のようなイオ ウ−イオウ結合、炭素−炭素結合、炭素−イオウ結合、および炭素−酸素結合か ら選択される１以上の共有結合の形成のような１以上の試薬の間での１以上の化 学結合の形成、および前記化学結合形成の試薬として、アミノ酸、ペプチド、糖 鎖、ここで定義されたような結合基、ここで定義されたようなスペーシング基、 ここで定義されたようなタンパク反応性基、および上記（ａ）で説明したように 生成される抗体フラグメントを使用すること。または、 （ｃ）抗体フラグメントは、１以上の反応剤の間で１以上の非共有結合の形 成によって誘導されうる。このような非共有結合は、水性媒体中において、脂肪 族基および炭素環基を含む領域のような相互に接近しうる低極性領域を独立に具 備する化学種間で起こるような疎水性相互作用、およびオリゴヌクレオチドと相 補的なオリゴヌクレオチドとの結合を起こすような水素結合相互作用を包含する 。または、 （ｄ）抗体フラグメントは、分子生物学の手法の結果として、または例えば 単鎖免疫反応性基またはＦｖフラグメントの遺伝子工学における抗体遺伝子の遺 伝子工学によって製造されうる。 抗体フラグメントは、１以上の上記方法を組み合わせて、結果として製造され うる。 幾つかの態様では、免疫反応性基は、結合基ＬzによってＬ−エナンチオメリ ックオリゴヌクレオチド、Ｉ、の残基に結合するための反応性基を有する酵素で あり得る。相当する酵素には、アスパルテートアミノトランスアミナーゼ、アラ ニンアミノトランスアミナーゼ、ラクテートデヒドロゲナー ゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、アルカ リ性酸ホスファターゼ、プロスタチック酸ホスファターゼ、セイヨウワサビペル オキシダーゼ、および種々のエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない 。 所望であれば、免疫反応性基は、修飾、若しくは化学的に変化され得、当業者 に公知の技術によって、以下に説明する結合基を介してＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチドの残基への結合に使用するための反応性基を提供する。この ような技術には、オリゴヌクレオチドの修飾に向けられた、ＷＯ−Ａ−８９／０ ２９３１およびＷＯ−Ａ−８９／２９３２、および米国特許第４，７１９，１８ ２に開示された結合部分の使用および化学修飾が含まれる。 本発明の組成物の非常に好ましい２種類の使用は、腫瘍の診断用のイメージン グおよび腫瘍の放射線治療である。従って、好ましい免疫学的基には腫瘍関連抗 原に対する抗体が含まれる。抗体は、これ以後しばしばＡｂと記す。特別な、制 限を受けない抗体の例には、結腸直腸腫瘍を認識するＢ７２．３および関連抗体 （米国特許第４，５２２，９１８および４，６１２，２８２に開示されている。 ）；９．２．２７および関連抗メラノーマ抗体；結腸直腸腫瘍を認識するＤ６１ ２関連抗体；小細胞肺癌を認識するＵＪ１３Ａおよび関連抗体；ＮＲＬＵ−１０ 、ＮＲＣＯ−０２および関連抗体であって小細胞肺カルチノーマおよび結腸直腸 腫瘍（パン−カルチノーマ(Pan-carclnoma)を認識するＮＲＬＵ−１０、ＮＲＣ Ｏ−０２および関連抗体；前立腺腫瘍を認識する７Ｅ１１Ｃ５お よび関連抗体；結腸直腸腫瘍を認識するＣＣ４９および関連抗体；壊死組織を認 識するＴＮＴおよび関連抗体；結腸カルチノーマを認識するＰＲ１Ａ３および関 連抗体；国際特許出願ＷＯ−Ａ−９０／０２５６９に開示されたＩＮＧ１および 関連抗体；扁平上皮癌を認識するＢ１７４、Ｃ１７４および関連抗体；幾つかの リンパ腫および白血病と反応的であるＢ４３および関連抗体；および抗−ＨＬＢ および関連モノクローナル抗体が含まれる。特に好ましい抗体はＩＮＧ−１であ る。 再度構造IVを参照すれば、ＬzおよびＬQは、独立に化学結合であるか、または 結合基の残基である。ここで使用される「結合基の残基」の語句は、タンパク反 応性基とタンパク上の反応性部位との反応で残った部分、生じた部分、または誘 導された部分をいう。ここで使用される「タンパク反応性基」の語句は、タンパ クで典型的に見出される官能基と反応しうる何れかの基をいう。しかし、タンパ ク反応性基は、関連したタンパク以外の生物分子で典型的に見出される官能基と も反応することが特に考慮される。従って、本発明の実施に有効な結合基は、免 疫反応性基を含有する生物学的分子の何れかと反応し、該生物学的な分子がタン パクであるか否かに関わらず、免疫反応性基と以下に開示される種を含有するＬ −エナンチオメリックオリゴヌクレオチドとの間に結合基を形成しうる基から誘 導される。 好ましい結合基は以下から選択されるタンパク反応性基から誘導されるが、こ れらに限定されない。 （１）タンパクまたは生物学的分子上のアミン、アルコール、またはスルフヒド リル基と直接反応できる基であって、前記タンパクまたは生物学的分子が、免疫 反応性基、例えばハロゲン含有基（これには例えば、クロロメチルフェニル基お よびクロロアセチル［ＣｌＣＨ2（Ｃ＝Ｏ）−］基が含まれる）、２−クロロエ チルスルホニルおよび２−クロロエチルカルボニルのような活性化された２−（ 脱離基置換された）−エチルスルホニルおよびエチルカルボニル基；ビニルスル ホニル；ビニルカルボニル；エポキシ；イソシアナト；イソチオシアナト；アル デヒド；アジリジン；スクシンイミドオキシカルボニル；カルボン酸ハライドの ような活性化されたアシル基；混合酸無水物等；並びに従来の写真用のゼラチン 硬化剤に使用しうる公知の他の基を含むもの； （２）免疫反応性基を含有する修飾されたタンパクまたは生物学的分子、即ち上 記（１）で説明したような反応性基を含有するように、例えばアルデヒド若しく はカルボン酸へタンパクのヒドロキシル基のような基を酸化することによって、 修飾された免疫反応性基を含有するタンパクまたは生物学的分子と容易に反応で きる基。この場合に、「結合基」は、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ 、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、アリールヒドラジノ、カルバジド、セミカ ルバジド、チオカルバジド、チオセミカルバジド、スルフヒドリル、スルフヒド リルアルキル、スルフヒドリルアリール、ヒドロキシ、 カルボキシ、カルボキシアルキルおよびカルボキシアリールから選択されるタン パク反応性基から誘導されうる。前記結合基のアルキル部分は、１から約２０の 炭素原子を含有しうる。前記結合基のアリール部分は、約６から約２０の炭素原 子を含有しうる。 （３）免疫反応性基を含有するタンパク若しくは生物学的分子、または上記（１ ）および（２）に記載されたような修飾されたタンパクに、交差結合剤を用いる ことによって結合することができる基。例えば、同種二感応性（homobifunction al）および異種二感応性ゼラチン硬化剤、ビスエポキシド、およびビスイソシア ネートのような幾つかの有効な交差結合剤の残基は、該交差結合反応の間にタン パク−（Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドを含有した種）複合体の一 部、即ち該複合体中の結合基となりうる。しかし、他の有用な交差結合剤は、例 えば消費されうる触媒として交差結合を促進し得、最終複合体には存在しない。 このような交差結合剤の例には、米国特許第４，４２１，８４７に開示されたカ ルボジイミドおよびカルバモイルオニウム交差結合剤、並びに米国特許第４，８ ７７，７２４のエーテルがある。これらの交差結合剤では、免疫反応性基のよう に、反応剤の１つは、カルボキシル基を有していなければならず、その他のもの は、Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド含有種のように、反応性のアミ ン、アルコール、またはスルフヒドリル基を有していなければならない。 アミド結合の形成において、交差結合剤は、最初にカルボキシル基と選択的に反 応し、次いで、アミンとこのように「活性化された」カルボキシル基との反応の 間に開裂除去され、タンパクとＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド含有 種との間にアミド結合を形成し、これによって２つの部分が共有結合的に結合さ れる。このアプローチの利点は、同じような分子、例えばタンパクとタンパクま たはＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド含有種同士の交差結合を防げる ことである。これに対して、例えば同種二感応性交差結合剤の反応は非選択的で あり、望まない交差反応をした分子が得られる。 好ましい、有用な結合基は、Pierce Chemical Company Immunotechnology Cat alog‐Protein Modification Section，（1991および1992）に示されているよう な種々の異種二感応性交差結合反応剤から誘導される。 有効なこのような反応剤の例には、以下のようなものが含まれるが、これに限 定されない。 スルホ−ＳＭＣＣ スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マ レイミドメチル）シクロヘキサン−１− カルボキシレート； スルホ−ＳＩＡＢ スルホスクシンイミジル （４−ヨード アセチル）アミノベンゾエート； スルホ−ＳＭＰＢ スルホスクシンイミジル ４−（ｐ−マ レイミドフェニル）ブチレート； ２−ＩＴ ２−イミノチオラン；および ＳＡＴＡ Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチ オアセテート。 先の説明に加えて、結合基はまた、全体でもまたは部分的にもヌクレオチドお よびヌクレオチド残基（両方とも天然に存在し、修飾されている。）から誘導さ れうる。本発明のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列への、アミン およびスルフヒドリル基のような反応性の官能基を含有する修飾されたヌクレオ チド部分の取込に対して特に有用な試薬（これは特に制限されない）は、例えば Clonetech Labo-ratories Inc.（Palo Alto California）から商業的に入手可能 であり、これらの試薬には、単結合アミノ修飾剤（Uni-Link AminoModifier）（ カタログ＃５１９０）、ビオチン−オンホスホルアミダイト（Biotin-ON Phosph oramidite）（カタログ＃５１９１）、Ｎ−ＭＮＴ−Ｃ６−アミノ修飾剤（N-MNT -C6AmlnoModifier）（カタログ＃５２０２）、アミノ修飾剤II（AmlnoModifier ）（カタログ＃５２０３）、ＤＭＴ−Ｃ６−３’−アミン−オン（DTM-C6-3'-Am ine-ON）（カタログ＃５２２２）、Ｃ６−チオール修飾剤（C6-ThiolModifier） （カタログ＃５２１１）等が含まれる。一側面においては、本発明の結合基は、 上記のClontechの試薬として利用できるアミンまたはスルフヒドリル基のような 反応性の官能基の反応から誘導される。これらのうちの１以上は、例えば上記の 異種二感応性タンパク反応性基のような先に説明したタンパク反応性基の１以上 と共に、本発明のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列に組み込まれ 、これらの１以上は、例 えば本発明の免疫反応剤に取り込まれる。 再度構造IVを参照すれば、ＩおよびＩiは、独立に、１２から約５０の隣接し た配列のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドであって、前記隣接した配 列が、同族の隣接した配列のファミリーの１以上のメンバーをこれらに含有し、 前記ファミリーの個々の同族体が１２から約３０のＬ−エナンチオメリックヌク レオチドユニットからなり（配列の前記ファミリーの同族体は、両方とも独立に 、または同族の配列の組合せとして、これ以後しばしば、「配列(the Sequense) 」と称する）、６以上の隣接したＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニット の配列が、構造IV内の何れの位置の６以上の隣接したＬ−エナンチオメリックヌ クレオチドユニットの任意の他の隣接した配列とハイブリダイズしないものを具 備する。「配列」を具備する同族に隣接した配列の組のメンバーは、配列Ｉおよ び配列Ｉiの両方に見出され得、少なくとも１つのこのような配列は、Ｉおよび Ｉiに共通である。 構造IVにおけるＩおよびＩiのＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配 列は、以下に示される構造Ｖの放射性ターゲッティング部分に取り込まれる相補 的なＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列が、前記Ｌ−エナンチオメ リックオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズし、約３７℃以上の融解温度（ Melting temperature）Ｔｍを示すハイブリッドを形成する限り、Ｌ−ＤＮＡ、 Ｌ−ＲＮＡ、または、プリンおよびピリミジン塩基で修飾されたＬ−ＤＮＡおよ びＬ−ＲＮＡ、またはメチルホスホネート若しくはチオホスホ ネート或いは糖鎖で修飾されたＬ−ＤＮＡ若しくはＬ−ＲＮＡ類似体のような骨 格（backbone）が修飾されたＬ−ＤＮＡ若しくはＬ−ＲＮＡ（完全に若しくは部 分的に修飾されたもの）、またはこれらの組合せよりなりうる。好ましいＬ−エ ナンチオメリックオリゴヌクレオチドは、塩基以外が修飾されたＬ−ＤＮＡおよ びＬ−ＲＮＡ並びに骨格以外が修飾されたＬ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡであり、 より好ましくは、Ｌ−ｄＡ、Ｌ−Ｔ、Ｌ−ｄＧ、Ｌ−ｄＵおよびＬ−ｄＣＬ−エ ナンチオメリックヌクレオチドユニットを含有するＬ−ＤＮＡである。現在、最 も好ましいＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドは、Ｌ−ｄＡ、Ｌ−Ｔ、 Ｌ−ｄＧおよびＬ−ｄＣＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットを含有す るＬ−ＤＮＡである。 好ましい態様においては、該Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列 ＩおよびＩiは、二本鎖Ｌ−ＤＮＡ若しくはＬ−ＲＮＡを含有しうる。即ち、該 Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列は、二重螺旋分子を形成する相 補的Ｌ−ＤＮＡ若しくはＬ−ＲＮＡを含有しうる。Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡ から構成される放射性ターゲッティング部分に取り込まれる相補的なＬ−エナン チオメリックオリゴヌクレオチド配列は、次ぎにＩおよびＩiを含有する二本鎖 Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡの一方または他方の鎖にハイブリダイズする。この 方法では、放射性ターゲッティング部分に取り込まれる相補的Ｌ−エナンチオメ リックオリゴヌクレオチド配列は、三重（三重螺旋）のＬ−ＤＮＡハイブリッド 、 三重のＬ−ＲＮＡハイブリッドまたは三重のＬ−ＤＮＡ：Ｌ−ＲＮＡハイブリッ ドを形成するようにＩおよびＩiの二重のＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡと相互作 用する。 「配列」を包含するＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列の好まし い例（これに限定されない）は以下に示される。以下の配列は、個別にまたは何 れかの組合せを考慮した場合、「配列」としてここで定義された組を包含する同 族のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列の組を包含する。 もちろん、配列（viii）は、配列（vii）を含有し、配列（vii）は配列（vi） を含有し、配列（vi）は配列（ｖ）を含有する等々である。従って、構造IVにお いて、Ｉが例えば配列（iii）を含有し、Ｉiが、例えば配列（ｖ）を含有する場 合は、ＩおよびＩiは両方とも少なくとも配列（iii）を含有する。構造IVで他の Ｉiは（viii）を含有しうる。この場合、Ｉiは、（ｉ）から（vii）並びに（vii i）も含有しうる。この場合、３つの配 列は全て、少なくとも（iii）［並びに（ｉ）および（ii）］を含有し、２つの Ｉiは少なくとも（ｖ）［並びに（ｉ）から（ｖ）］を含有するであろう。この 点については、Ｌ−エナンチオメリックヌクレオチドの隣接した配列（この配列 は、少なくとも配列（ｉ）に相補的である）を含有するＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチドは、配列（ｉ）から（viii）までの全てにハイブリダイズし 、このことは、隣接した相補的配列の組の何れのメンバー（この組の個々のメン バーは（ｉ）から（viii）の何れかに相補的な配列よりなる）でも同様である。 このような隣接した相補的な配列の組は、以下に説明されるようなｃＩを包含す る。 「配列」を含有する好ましい同族のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチ ド配列の他の組は、以下のものである。 特に好ましい配列は、L-d(TTATGGACGGAGAAGCTAA)（配列番号８）である。 本発明の２以上のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオ チド配列は、化学結合によって、上記のような結合基によって、または下記のよ うなスペーシング基によってタンデムに結合されうる。本発明のＬ−エナンチオ メリックオリゴヌクレオチド配列におけるＬ−エナンチオメリックヌクレオチド の配列順序は、５’末端から３’末端または３’末端から５’末端でありうる。 上記の結合基を介した本発明のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列 の、上記の免疫反応性基への結合は、３’部位若しくは５’部位を介して、また はＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの３’若しくは５’部位に結合し た誘導体を介して達成されうる。 先に議諭したように、「配列」はまた、二本鎖Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡか らなりうる。即ち、「配列」は、非共有結合的に相互作用し、二本鎖Ｌ−ＤＮＡ またはＬ−ＲＮＡを形成する相補的なＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチ ドからなりうる。上記のような免疫反応性基へのこの二本鎖核酸の結合は、３’ 部位若しくは５’部位を介して、またはＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオ チドの３’または５’部位に結合した誘導体を介して達成されうる。 構造IVを再度参照すれば、ＱIは、本発明の２以上のＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチド配列を分離し結合するスペーシング基である。ＱIは、上記 のような結合基を単独で、またはＬ−エナンチオメリックヌクレオチド若しくは ２から約２０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットを含有するＬ−エ ナンチオメリックオリゴヌクレオチドと組み合わせて包含し、その配列は、自己 会合しないか、また はこれらの中の６以上のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットの隣接し た配列が構造IV内の何れの場所でも６以上の隣接したＬ−エナンチオメリックヌ クレオチドユニットの任意の他の隣接した配列とハイブリダイズしないものであ る。ＱIはまた、アミノ酸基、ペプチド基、またはポリエチレンオキシド基のよ うなポリ（アルキレンオキシド）基の残基を含有しうる。各スペーシング基は、 ２から約６のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列であって、該配列 の少なくとも２つが本発明の配列（Sequence）を含有するものと結合しうること が予期される。好ましくは、該スペーシング基は、２つのＬ−エナンチオメリッ クオリゴヌクレオチド配列の各々が本発明の配列（Sequence）を含有するものと 結合する。好ましくは該スペーシング基はＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレ オチド配列である。 好ましいスペーシング基の例（これに限定されない）は、以下の配列よりなる 。 L-d(ACT)； L-d(ACTC)； L-d(ACTCT)； L-d(CTC)； L-d(TCTC)；および L-d(CTCTC)。 特に好ましいスペーシング基は、Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド ：L-d(ACTCTC)である。 もちろん、上記の条件、即ち本発明のＬ−エナンチオメリ ックオリゴヌクレオチドが自己会合性の配列を包含しないということは、Ｌ−エ ナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列基（origonucleotide Sequence group s）と組み合わせて結合されるＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドスペ ーシング基の選択を考慮する場合にもまだ適用される。 構造IVにおいて、ａは０から約６であり、好ましくは１から約６であり、より 好ましくは１から約４であり、最も好ましくは１または２である。 構造IVにおいて、ｐは１から１０まで、好ましくは１から約６まで、より好ま しくは１から３までの整数である。構造IVで定義されたように修飾されたＺの混 合物を、このように修飾されていないＺと共に含有する免疫反応性タンパクが、 本発明で有効であることも予期される。この場合、「ｐ」個のこのような混合物 のバルク混合物の特性は、約０から約１０の機能性値を具備する。好ましくは、 バルクｐの値は、約０．１から約１０．０、好ましくは約０．２から約５．０、 より好ましくは約０．４から約３である。 構造IVにおいて、Ｅは末端キャッピング基である。Ｅは、Ｌ−エナンチオメリ ックヌクレオチド基であるか、またはこれらの中のＤ−エナンチオメリックオリ ゴヌクレオチド配列に関してエキソヌクレアーゼ酵素活性の作用を低下するか若 しくは阻害するように修飾された１以上のＤ−オリゴヌクレオチド基であること が好ましい。Ｅは、１から約１０の炭素原子よりなるアルキル基のような１以上 の置換基を含有した３’−若しくは５’−ホスフェート結合したリボースであり 得る。Ｅは、アルキルエーテル、アリールエーテル、アラルキルエーテル、置換 アリールエーテルまたは置換アラルキルエーテルのようなエーテル基のような５ ’−若しくは３’−エーテル基であって、該アルキル基が１から１０の炭素原子 を含有し、該アリール基が６から１０の炭素原子を含有するものであり、更に、 該アルキル若しくはアリール基が酸素、窒素またはイオウ原子を含有するか、酸 素、窒素または硫黄原子を含有するアルキル若しくはアリール基で置換されうる ものである。Ｅは、アルキルエステル、アリールエステル、アラルキルエステル 、置換アリールエステル若しくは置換アラルキルエステルのような５’−Ｏ−ま たは３’−Ｏ−ホスフェートエステル基であって、該アルキル基が１から１０の 炭素原子を含有し、該アリール基が６から１０の炭素原子を含有するものであり 、更に、該アルキル若しくはアリール基が、酸素、窒素若しくは硫黄原子を含有 するか、または酸素、窒素若しくは硫黄原子を含有するアルキル若しくはアリー ル基で置換されうるものである。Ｅは、好ましくは５’−若しくは３’−位で、 エーテル基としてリボシル部分上のポリ（アルキレンオキシジル）基であるか、 若しくはＬ−リボシル基の５’−若しくは３’−酸素にエーテル基若しくはホス フェートエステルで結合されたポリ（アルキレンオキシジル）基でありうる。ポ リ（アルキレンオキシジル）基は、例えばポリ（エチレンオキシジル）またはポ リ（プロピレンオキシジル）またはポリ（プロピレンオキシジル−コ−エチレン オキシジル）基（poly(propylene oxidyl-co-ethylene oxidyl group)）でありうる。ここで各ポリマーは、２から約１００の繰り返しユニット を含んでいる。このような単位を含有するリン酸エステルも有用であるばかりで なく、上記のような適切な結合基の要素より成るリン酸エステルまたは修飾され たリボースも有用である。ＥはまたＺを包含するか、または上記のＬzの要素に よってＱIに結合され、環状構造を形成することができる。Ｅはまた、２つの炭 素−１つの窒素原子のヌクレオシド間結合を有する化合物を包含しうる。好まし くは、Ｅはポリ（アルキレングリコール）ホスフェートジエステルを含有する。 Ｅに関して、ポリ（アルキレングリコール）部分は、２から約１００の繰り返し 単位を有しうる。好ましくは、ポリ（アルキレングリコール）は、ポリ（エチレ ングリコール）である。現在のところ、ポリ（アルキレングリコール）ホスフェ ートジエステルは、テトラ（エチレングリコール）ホスフェートジエステルが好 ましく、これ以後しばしば「Ｔｅｇ」または「Ｔｅｇユニット」と呼ぶ。このよ うなポリ（アルキレングリコール）ホスフェートジエステルは、お互いにタンデ ムに結合され、二量体リン酸エステル配列、三量体配列、四量体配列等々を形成 しうる。１または２のこのようなユニットが好ましい。このようなユニはまた、 上記のＱI、Ｌz、ＬQ、Ｉ、Ｉi若しくはＺの残基に結合しうる。好ましい末端基 Ｅは、ＴのようなＬ−エナンチオメリックヌクレオチドに結合したリン酸エステ ルによって結合されるＴｅｇユニットを包含する。Ｌ−ＤＮＡ配列のための他の 好ましい末端キャッピングユニットは、Ｌ−ｄＡ、Ｌ−ｄＧ、Ｌ −Ｔ、Ｌ−ｄＣ、およびＬ−ｄＵの残基、またはこれらを含有するオリゴヌクレ オチド配列を包含する。 本発明の内容として、「修飾されたヌクレオチド部分」の語は、天然に存在す るＤ−エナンチオメリックヌクレオチドまたは天然に存在するＤ−エナンチオメ リックヌクレオチドの残基の１以上の部分と類似している１以上の化学基を包含 する化学的単位を意味することを意図している。「修飾されたＤ−エナンチオメ リックヌクレオチド部分」は、その化学的単位であって、１以上の化学結合（別 の場合として、前記の天然に存在するＤ−エナンチオメリックヌクレオチドが独 立の化学的単位として考慮される場合は、該ヌクレオチドが、この化学結合を含 有する。）が、１以上の他の化学的単位に１以上の共有結合を含有するように変 化され、修飾され、または置換される場合、もっぱらそのまま残されるものを包 含するか、またはある位置において、天然に存在するＤ−エナンチオメリックヌ クレオチドの一部（例えば、プリン若しくはピリミジン塩基部分、ヒドロキシル 部分、リボース部分等またはこれらの組合せのような部分）を、前記Ｌ−エナン チオメリックヌクレオチドの他の部分の前記置換と同時に除去または削除した後 にもっぱら残ったままであるその化学的部分を包含する。特に有用な修飾された Ｄ−エナンチオメリックヌクレオチド部分の例（これに制限されない）には、ア ミンおよびスルフヒドリル基のような反応性官能基が含有されるこれらは、商業 的に利用でき、Clontech Laboratories Inc.（Palo Alto,California）から入手 できる、例えばこれらの 修飾されたＤ−エナンチオメリックヌクレオチド部分およびこれらの前駆体のよ うなものがある。前記修飾されたヌクレオチド部分およびこれらに対する前駆体 には、単結合アミノ修飾剤（Uni-Link AminoModifier）（カタログ＃５１９０） 、ビオチン−オンホスホルアミダイト（Biotin-ON Phos-Phoramidite）（カタロ グ＃５１９１）、Ｎ−ＭＮＴ−Ｃ６−アミノ修飾剤（N-MNT-C6 AminoModifier） （カタログ＃５２０２）、アミノ修飾剤II（AminoModifier）（カタログ＃５２ ０３）、ＤＭＴ−Ｃ６−３’−アミン−オン（DTM-C6-3'-Amine-ON）（カタログ ＃５２２２）、Ｃ６−チオール修飾剤（C6-Thiol-Modifier）（カタログ＃５２ １１）等が含まれる。１以上の前記部分は、本発明を包含するＬ−エナンチオメ リックオリゴヌクレオチド配列に含まれうる。一側面では、本発明の結合基は、 上記のClonetechの試薬として利用しうるアミン若しくはスルフヒドリル基のよ うな反応性官能基の反応から誘導される。これらの基の１以上は、例えば異種二 感応性タンパク反応性基のような１以上の先に説明したタンパク反応性基を有す る本発明のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列に含まれ、これらの １以上は、本発明の免疫試薬に含まれる。 「修飾されたＤ−エナンチオメリックヌクレオチド部分」はＤ−エナンチオメ リックオリゴヌクレオチド配列のエキソヌクレアーゼ酵素活性の作用を低下また は阻害するように修飾されたＤ−エナンチオメリックヌクレオチド部分を包含し うる。これは、３’−若しくは５’−ホスフェート結合した リボースまたは３’−若しくは５’−ホスフェート結合した２’−デオキシリボ ース基である。これらは、１から約１０の炭素原子からなるアルキルのような１ 以上の置換基を、またはアルキルまたはアリールまたはアラルキルまたは置換さ れたアリール若しくはアラルキルエーテル（但し、アルキル基は１から約１０の 炭素原子を含有し得、このようなアルキル若しくはアリール基は、酸素、窒素若 しくは硫黄原子を含有するか、またはこれらを含有する置換基によって置換され うる。）を、またはポリ（アルキレンオキシジル）基を、好ましくは５’−若し くは３’−リボース部位でそれぞれ、または他の位置で含有する（これらの置換 基は、エキソヌクレアーゼ酵素活性の作用を低下若しくは阻害するであろう。） 。前記置換基を含有するホスフェート基を包含する「修飾されたＤ−エナンチオ メリックヌクレオチド部分」も有用であり、加えて、上記の適切な結合基の要素 を含有するリン酸エステルまたは修飾されたリボースも有効である。「修飾され たＤ−エナンチオメリックヌクレオチド部分」はまた、Ｚの残基を包含し、これ は上記Ｌzの要素によってＱIに結合され、環状構造を形成しうる。「修飾された Ｄ−エナンチオメリックヌクレオチド部分」はまた、２つの炭素原子−１つの窒 素原子のヌクレオチド間結合を有する化合物を包含しうる。 好ましくは、「修飾されたＤ−エナンチオメリックヌクレオチド部分」は、ポ リ（アルキレングリコール）ホスフェートジエステルを含有する。前記「修飾さ れたＤ−エナンチオメリックヌクレオチド部分」に関連して、ポリ（アルキレン グリコール）部分は、２から約１００の繰り返し単位を有する。好ましくはポリ （アルキレングリコール）はポリ（エチレングリコール）である。現在のところ 、好ましいポリ（アルキレングリコール）ホスフェートジエステルは、テトラ（ エチレングリコール）ホスフェートジエステルであり、これ以後しばしば「Ｔｅ ｇ」または「Ｔｅｇユニット」と呼ぶ。このようなポリ（アルキレングリコール ）ホスフェートジエステルはお互いにタンデムに結合し、二量体リン酸エステル 配列、三量体配列、四量体配列等々を形成する。１または２のこのようなユニッ トが好ましい。このようなユニットはまた、ここで説明したようなＱI、Ｌz、ＬQ 、Ｉ、ＩiまたはＺの残基と結合しうる。好ましい「修飾されたＤ−エナンチオ メリックヌクレオチド部分」は、Ｌ−ＴのようなＤ−エナンチオメリックヌクレ オチドに結合したリン酸エステルによって連結されたＴｅｇユニットを包含する 。 構造Ｖで説明された放射性ターゲッティング免疫試薬を参照して、構造IVにお けるＩの「配列」を含有するＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの組の メンバーに相補的な、好ましいＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドｃＩ の組の例は、以下のようなＬ−ＤＮＡ Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオ チドを含有するがこれに限定されない。 構造IVの「配列」に相補的な組を具備しうる好ましい同族のＬ−エナンチオメ リックオリゴヌクレオチド配列の他の組は、以下の通りである。 特に好ましい相補的配列は、以下の配列を包含する。 構造IVの先にリストされた「Ｉ」のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチ ド配列に関連した構造Ｖの上記ｃＩのＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチ ド配列の相補性は、各々の相対的な方向、即ちＩおよびｃＩの配列が、それぞれ ５’から３’または３’から５’、またはこの逆で構成され るか否かにかかわらず各々の相対的な方向に依存する。相応するＩおよびｃＩの 配列の間で形成されたハイブリダイズしたコンプレックスのＴｍが３７℃以上で あることが好ましい。 好ましい態様では、Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列ｃＩは二 本鎖Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡを包含しうる。即ち、該Ｌ−エナンチオメリッ クオリゴヌクレオチド配列は、二重螺旋分を形成する相補的Ｌ−ＤＮＡまたはＬ −ＲＮＡを含有しうる。非放射性ターゲッティング免疫試薬に取り込まれた相補 的なＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列はＬ−ＤＮＡまたはＬ−Ｒ ＮＡより構成され、次いでｃＩを含有する二本鎖になったＬ−ＤＮＡまたはＬ− ＲＮＡの一方若しくは他方の鎖にハイブリダイズする。この方法では、非放射性 ターゲッティング免疫試薬に取り込まれた相補的なＬ−エナンチオメリックオリ ゴヌクレオチド配列は、ｃＩの二重のＬ−ＤＮＡ若しくはＬ−ＲＮＡと、三重（ 三重螺旋）Ｌ−ＤＮＡ、三重Ｌ−ＲＮＡ、または三重Ｌ−ＤＮＡ：Ｌ−ＲＮＡハ イブリッドを形成するように相互作用する。 構造Ｖにおいて、ＱcIはスペーシング基である。ＱcIは、構造IVで説明したＱcI から選択されうる。好ましくは、ＱcIは２から約３０のＬ−エナンチオメリッ クヌクレオチドのＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの隣接した配列を 含有する。この場合、この配列は、自己会合性でなく、６以上のＬ−エナンチオ メリックヌクレオチドユニットの隣接した配列が、構造Ｖ内の何れの位置の６以 上の隣接したＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットの他の何れの隣接 した配列ともハイブリダイズしない。ＱcIはまた、Ｌ−エナンチオメリックオリ ゴヌクレオチド、好ましくは上記（xxvii）から（xxxii）までのような配列であ って、構造IV内の「配列」に相補的であるもので構成されうる。好ましくはＱcI は、１または２のこのような配列を含有する。 構造Ｖにおいて、Ｌ1、Ｌ2、およびＬ3は、独立に化学結合、好ましくはリン 酸エステル結合、または上記構造ＶでＬzおよびＬQとして定義された結合基であ る。Ｌ1、Ｌ2、およびＬ3はまた、独立にＱcIの成分を含有しうる。 構造Ｖにおいて、Ｗ1、Ｗ2、およびＷ3はキレート基の残基である。本発明の キレート基は、これらと結合しうる放射性核種を有しうる１以上の広範囲のキレ ート剤を包含しうる。よく知られているように、キレート剤は、金属と配位結合 することによって結合し、キレーションコンプレックス（chelation complex） またはキレートと呼ばれる環状構造を形成することができる供与原子を含有する 化合物である。これに分類される化合物は、Kirk-Othmer Encyclopedia of Chem ical Technology，vol．5，339-368に開示されている。 適切なキレート剤の残基は、以下のものから独立に選択される：トリポリリン 酸ナトリウムおよびヘキサメタリン酸のようなポリホスフェート；エチレンジア ミンテトラ酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレン−ジアミントリ酢酸、 ニトリロトリ酢酸、Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシン、エチレンビ ス（ヒドロキシフェニルグリシン）およびジエチレントリアミンペンタ酢酸のよ うなアミノカルボン 酸；アセチルアセトン、トリフルオロアセチルアセトン、およびチエノイルトリ フルオロアセトンのような１，３−ジケトン；酒石酸、クエン酸、グルコン酸お よび５−スルホサリチル酸のようなヒドロキシカルボン酸；エチレンジアミン、 ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、およびトリアミノトリエチル アミンのようなポリアミン；トリエタノールアミンおよびＮ−（２−ヒドロキシ エチル）エチレンジアミンのようなアミノアルコール；２，２’−ジピリジル、 ２，２’−ジイミダゾール、ジピコリンアミンおよび１，１０−フェナントロリ ンのような芳香族複素環塩基；サリチルアルデヒド、ジスルホピロカテコール、 およびクロモトロープ酸のようなフェノール；８−ヒドロキシキノリンおよびオ キシムスルホン酸のようなアミノフェノール；ジメチルグリオキシムおよびサリ チルアルドキシムのようなオキシム；ポリシステイン、ポリヒスチジン、ポリア スパラギン酸、ポリグルタミン酸、またはこのようなアミノ酸の組合せのような 基部にキレートする機能性を有するペプチド；ジサリチルアルデヒド １，２− プロピレンジイミンのようなシッフ塩基；テトラフェニルポルフィンおよびフタ ロシアニンのようなテトラピロール；トルエンジチオール、メソ−２，３−ジメ ルカプト琥珀酸、ジメルカプトプロパノール、チオグリコール酸、カリウムエチ ルキサンテート、ナトリウムジエチルジチオカルバメート、ジチゾン、ジエチル ジチオリン酸、およびチオ尿素のような硫黄化合物；ジベンゾ［１８］クラウン −６、（ＣＨ3）6−［１４］−４，１１−ジエンＮ４、お よび（２．２．２−クリプテート）のような大員環化合物；並びにニトリロトリ メチレン−ホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、およ びヒドロキシエチリデンホスホン酸のようなホスホン酸、または上記試薬の２以 上の組合せのようなホスホン酸。 キレート剤の好ましい残基には、ポリカルボン酸基が含有され、エチレンジア ミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＤＴＡ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”− ジエチレン−トリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；１，４，７，１０−テトラアザシ クロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−四酢酸（ＤＯＴＡ）；１，４，７，１０ −テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（ＤＯ３Ａ）；１−オキ サ−４，７−１０−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（ＯＴＴ Ａ）；トランス（１，２）−シクロヘキサノジエチレントリアミン五酢酸（ＣＤ ＴＰＡ）が含まれる。 キレート剤の好ましい残基は、ポリカルボン酸基を含有し、以下のものが含ま れる。 一側面では、キレート剤の他の適切な残基は、米国特許第５，０７８，９８５ に開示されている（この開示は参照文献として本明細書に含まれる。）テクネチ ウムおよびレニウムのような金属をキレートするために修飾されたタンパクを含 有する。 他の側面では、キレート剤の適切な残基は、例えば米国特許第４，４４４，６ ９０；４，６７０，５４５；４，６７３，５６２；４，８９７，２５５；４，９ ６５，３９２；４，９８０，１４７；４，９８８，４９６；５，０２１，５５６ および５，０７５，０９９に開示されているような化合物を含有するＮ3Ｓおよ びＮ2Ｓ2から誘導される。 キレート剤の他の適切な残基は、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８２５３に開示されて いる。この開示は参照文献として本明細書に含まれる。上記構造Ｖにおいて、Ｗ1 、Ｗ2、およびＷ3が多数のキレート剤の残基を含有する場合、このような試薬 は構造IVで先に説明したような結合基によってお互いに結合されうる。 構造Ｖのキレート剤Ｗ1、Ｗ2、およびＷ3の残基は、化学結合または結合基、 即ち上記構造ＶのＬ1、Ｌ2、およびＬ3を介して相補的Ｌ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチド部分ｃＩまたはスペーシング基ＱcIに独立に結合される。好 ましい結合基には以下のものが含まれる：アミノ、イミド、ニトリロ、およびイ ミノ基のような、基内の窒素原子；メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン およびヘキシレンのような、好ましくは１から１８の炭素を含有するアルキレン であって、このようなアルキレンが、酸素、窒素および硫黄のような１以上のヘ テロ原子またはヘテロ原子を含有する基を任意に骨格内に有する（interrupt） もの； カルボニル； スルホニル； スルフィニル； エーテル； チオエーテル； エステル、即ちカルボニルオキシおよびオキシカルボニル； チオエステル、即ちカルボニルチオ、チオカルボニル、チオカルボニルオキシ、 およびオキシチオカルボニル； アミド、即ちイミノカルボニルおよびカルボニルイミノ； チオアミド、即ちイミノチオカルボニルおよびチオカルボニルイミノ； チオ； ジチオ； ホスフェート； ホスホネート； ウリレン（urelene）； チオウリレン（thiourelene）； ウレタン、即ちイミノカルボニルオキシ、およびオキシカルボニルイミノ； チオウレタン、即ちイミノチオカルボミルオキシおよびオキシチオカルボニルイ ミノ； アミノ酸結合、即ち以下の基、 但し、ｋ＝１であり、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は独立にＨ、１から１８、好ましくは １から６の炭素原子を含有するアル キル（例えばメチル、エチル、およびプロピル）であって、該アルキルが任意に １以上のヘテロ原子（例えば酸素、窒素および硫黄）を内部に含むもの、６から １８、好ましくは６から１０の炭素原子を有する置換若しくは無置換アリール（ 例えば、フェニル、ヒドロキシヨードフェニル、ヒドロキシフェニル、フルオロ フェニルおよびナフチル）、好ましくは７から１２の炭素原子を含有するアラル キル（例えばベンジル）、好ましくは５から７の核炭素およびＳ，Ｎ、Ｐまたは Ｏのような１以上のヘテロ原子を含有するヘテロ環（heterocyclyl）（好ましい 該ヘテロ環基の例はピリジル、キノリル、イミダゾリル、およびチエニル）；ヘ テロ環アルキル（hetero-cyclylalkyl）であって、該ヘテロ環およびアルキル部 分が好ましくは先に説明されたもの； またはペプチド結合、即ち以下の基、 但し、ｋ＞１であり、各Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3は、独立に上記のＸ1、Ｘ2、Ｘ3で説 明した基を表す。例えば、アルキレンイミノおよびイミノアルキレンのような２ 以上の結合基を使用しうる。構造IVのＬzまたはＬQに対して先に説明したタンパ クの異種二感応性および同種二感応性複合（conjugation）化学および交差結合 化学で一般に使用される結合基のような他の結合基が、ここでの使用に適 していることが予期できる。 特に好ましい結合基には、アミノ基を含有する無置換または置換リン酸エステ ル基であって、キレート剤上のイソチオシアネート基を介してキレート剤の残基 に結合されたときにチオ尿素基を形成するものが含まれる。 該結合基は、キレートＷ1、Ｗ2、若しくはＷ3およびＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチドｃＩ若しくはスペーシング基との間のカップリング反応を妨 害しない種々の置換基を含有しうる。該結合基はまた、他の場合では、このよう な反応を妨害しうるが、該カップリング反応の間に、当分野で一般に知られた適 切な保護基を用いてそのような妨害を防ぎ、且つ該置換基がカップリング反応の 後に適切な脱保護によって再生される置換基を含有する。該結合基はまた、カッ プリング反応の後に導入される置換基を含む。例えば、該結合基は、ハロゲン（ 例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）のような置換基；エステル基；アミド基；好 ましくは１から約１８、より好ましくは１から４の炭素原子を含有するアルキル （例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル等）；好ましくは ６から約２０より好ましくは６から１０の炭素原子を含有する置換または無置換 アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ヒドロキシフェニル、ヨードフェニル 、ヒドロキシヨードフェニル、フルオロフェニルおよびメトキシフェニル）；好 ましくは７から約１２の炭素原子を含有する置換若しくは無置換アラルキル（例 えば、ベンジルおよびフェニルエチル）；アルコキシであって、アルキル部分が 、 上記アルキルで説明したような１から約１８の炭素原子を含有するもの；エトキ シベンジルのようなアルコキシアラルキル；好ましくは５から７の核炭素および Ｓ、Ｎ、Ｐ若しくはＯのようなヘテロ原子を含有する飽和若しくは不飽和ヘテロ 環（heterocyclyl）（好ましいヘテロ環基は、ピリジル、キノリル、イミダゾリ ルおよびチエニルである）；カルボキシル基；カルボキシアルキル基であって、 好ましくは、該基のアルキル部分が１から８の炭素原子を含有するもの；または キレート基の残基でありうる。 構造Ｖにおいて、Ｍ1、Ｍ2およびＭ3は、＋１に等しいかまたはこれより大き い酸化状態を取る元素であって、該元素の少なくとも１つが放射性核種であるも のを包含する。好ましくはＭ1、Ｍ2およびＭ3の各々は、金属アイソトープ、好 ましくは放射性金属アイソトープ（ここではしばしば金属ラジオアイソトープと 呼ぶ）を包含し、該ラジオアイソトープは、治療的なまたは診断用のイメージン グへの応用に有効である。好ましい金属ラジオアイソトープは、例えばＳｃ，Ｆ ｅ，Ｐｂ，Ｇａ，Ｙ，Ｂｉ，Ｍｎ，Ｃｕ，Ｃｒ，Ｚｎ，Ｇｅ，Ｍｏ，Ｔｃ，Ｒｕ ，Ｉｎ，Ｓｎ，Ｒｅ，Ｓｒ，Ｓｍ，Ｌｕ，Ｅｕ，Ｒｕ，Ｄｙ，Ｓｂ，Ｗ，Ｒｅ， Ｐｏ，ＴａおよびＴｌから選択される。このようなラジオアイソトープからの有 用な放射は、自発的なアルファ放射、ベータ放射、ガンマ放射、Ｘ−線放射、ポ ジトロン放射、および電子捕獲および内部変換の過程で誘導されるような放射を 含有する。前記放射は、純粋なアルファ、純粋なベータ、純粋なガンマ等のよう な純 粋に１種類であるか、またはベータとガンマ放射等のような核放射の組合せであ る得る。 例えば、アルファ放射線またはベータ放射線より成る放射を有するラジオアイ ソトープは治療への応用、特に癌の治療に有効である。治療への応用に有用なア イソトープには、例えば207Ｐｂ，211Ｐｂ，208Ｐｂ，212ｐｂ，212Ｂｉ，207Ｔ ｉ，および223Ｒａのような、アルファ放射線を放射するアイソトープ；例えば4 7 Ｓｃ，66Ｇａ，67Ｃｕ，77Ａｓ，90Ｙ，105Ｒｈ，109Ｐｄ，111Ａｇ，121Ｓｎ ，127Ｔｅ，143Ｐｒ，149Ｐｍ，153Ｓｍ，161Ｔｂ，166Ｈｏ，169Ｅｒ，177Ｌｕ ，188Ｒｅ，186Ｒｅ，191Ｏｓおよび199Ａｕのようなベータ放射線を放射するア イソトープ；並びに例えば97Ｒｕ，177mＳｎ，199Ｓｂ，128Ｂａおよび197Ｈｇ のような電子捕獲および内部変換の過程の結果として放射線が放出されるアイソ トープが含まれる。治療への応用に特に好ましいラジオアイソトープには212Ｐ ｂ，212Ｂｉ，90Ｙ，177Ｌｕ，186Ｒｅ，および188Ｒｅが含まれる。最も好まし くは90Ｙである。 例えばガンマ放射線またはポジトロン放射線を含有する放射を有するラジオア イソトープは、診断用イメージングへの応用、特に癌の診断用イメージングに有 用である。診断用イメージングへの応用に有用なアイソトープには、47Ｓｃ，51 Ｃｒ，67Ｃｕ，67Ｇａ，97Ｒｕ，99mＴｃ，111Ｉｎ，117mＳｎ，141Ｃｅ，167Ｔ ｍ，199Ａｕ，87Ｙおよび203Ｐｂのようなガンマ放射線を放射するアイソトープ ；および44 Ｓｃ，48Ｖ，64Ｃｕ，66Ｇａ，69Ｇｅ，72Ａｓ，86Ｙおよび89Ｚｒのようなポ ジトロン放射線を放出するアイソトープが含まれる。診断用イメージングへの応 用に有用なアイソトープには、64Ｃｕ，99mＴｃ，111Ｉｎおよび87Ｙが含まれる 。現在、最も好ましくは99mＴｃおよび111Ｉｎである。 他の側面では、他の適切な放射性核種は、例えば共有結合によってＱcIに取り 込まれ得、これらには、ヨウ素の放射性アイソトープ（例えば123Ｉ，124Ｉ、12 5 Ｉおよび131Ｉ）並びに211Ａｔのようなアスタチンの放射性アイソトープが含 まれる。 例えば哺乳動物の癌の診断用イメージングに有用な画像を生じさせる方法は、 本発明の組成物および方法に使用されるラジオアイソトープからイメージ毎の放 射を検出することを具備する。前記のイメージを生成する方法は、例えば放射性 標識免疫シンチグラフィー（ＲＩＳ）に一般的に使用されるガンマカメラのよう な照準を合わせたカメラ検出器の使用、および陽電子放射撮影法（ＰＥＴ）およ びシングルフォトン放射トポグラフィー（ＳＰＥＴ）に一般に使用されるリンク されたＸ−線検出器（linked X-ray detectors）を具備する。 構造Ｖにおいて、ｘ、ｙ、およびｚは、独立にゼロまたは１であるが、ｘ、ｙ 、またはｚの少なくとも１つが１であり； ｗおよびｂは、ゼロまたは１から約４までの整数である。 好ましい組成物は以下のスキームに概略を示したように調製されうる。 スキーム６ 異種二感応性結合試薬ＳＭＣＣ、２−ＩＴ、またはＳＡＴＡを用いた抗体アミン 基の派生（derivatization） スキーム６において、タンパク（ＩＮＧのような抗体、抗体フラグメント、酵 素、受容体）は、チオール化されたＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド （Ａｂ−Ｍ）またはマレイミド基を含有するＬ−エナンチオメリックオリゴヌク レオチド（Ａｂ−ＳＨ）と共有結合的なカップリングで化学的に修飾される。化 学修飾は、二感応性の交差結合剤、好ましくはタンパク官能基（例えばＡｂ−ア ミン中のアミン）と反応しうる基を両方に有し得、更にチオール基と反応しうる 基も更に有しうる異種二感応性交差結合剤を用いて行われる。 後者は、ハロアセチル、ハロ−アセトアミジル、マレイミド、および活性ジスル フィド機能性基から選択される。 マレイミドおよびチオアルキル基は、異種二感応性リンカー、即ちスルホスク シンイミド−４−（Ｍ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ レート（スルホ−ＳＭＣＣ）、２−イミノチオラン（２−ＩＴ）、またはスクシ ンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を用いて抗体に導入され る。抗体を含むサンプルと結合基との反応は、サンプル中の抗体分子一つ当たり 平均して約０．５〜３の結合剤分子を導入するのに十分な時間行われる。派生さ れた抗体（derivatized antibody）は、ゲル濾過カラム、より好ましくはSehade x-G-25カラムを用いて精製される。 調製される好ましいタンパク複合体の例（これに限定されない）を以下に示す 。 ＩＮＧ−１−ＮＨ−ＣＯ−シクロヘキサン−ＣＨ2−マレイミド； ＩＮＧ−１−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ2）3−ＳＨ ＩＮＧ−１−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＳＨ ＩＮＧ−１は好ましくは、Ａｂ−アミンで表されるリジンアミンのようなアミ ン基を含有するタンパクである。 スキーム７ 異種二感応性結合試薬ＳＡＴＡおよびＳＭＣＣを用いるアミン基を経るＬ−エナ ンチオメリックオリゴヌクレオチド「Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）」の派生（derｉva tization） スキーム８ 異種二感応性結合試薬を用いるためのアミン基およびスルフヒドリル基を有する Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド「Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）」の派生 （derivatization） スキーム９ 異種二感応性結合試薬を用いるためのビオチンを用いるＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチド「５’−ＴｒＳ−Ｉ−ＱI−Ｉ−３’−ＮＨ2の派生（deriva tization） スキーム１０ 異種二感応性結合試薬を用いるためのビオチン化されたホスホルアミダイト試薬 を用いる「５’−ＨＳ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）３’−ビオチン」の製造 Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドおよび修飾されたＬ−エナンチオ メリックオリゴヌクレオチドは、Ｄ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの ための当分野で周知の固相合成のような標準的な方法に従って合成される。Ｌ− エナンチオメリックオリゴヌクレオチドＬ−ｄ（Ｉ−ＱI− Ｉ）を誘導体に派生すること（derivatizations）は、５’−ＴＥＧ−Ｌ−エナ ンチオメリックオリゴマー−ＮＨ2−３’とＳＡＴＡ若しくはＳＭＣＣとの反応 を用い、Ｌ−エナンチオメリックオリゴマー−３’−ＳＨまたはＬ−エナンチオ メリックオリゴマー−３’−Ｍ（スキーム７参照）を得ることによって達成され る。 以下のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドが好ましい。 これらのＬ−エナンチオメリックオリゴマーはまた、二感応化されたＬ−エナ ンチオメリックオリゴマー：５’−ＨＳ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−ＮＨ2−３’ を、スキーム８に示されるように５’−および３’−位で二感応性試薬を導入す ることによって得られる。３’−位でのビオチンの導入はまた、スキーム９に示 されるように５’−ＨＳ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−ＮＨ2−３’とビオチン−イ ミドカルボキシレートとの反応によって達成される。 末端に保護されたアミン、チオール、またはカルボキシを有し、他方でホスホ ルアミダイトを有する有効なスペーサー がある（スキーム１０参照）。 これらのスペーサーの適用は、以下の反応で示される。 スキーム１１ Ａｂ−Ｍ＋Ｌ−ｄ（オリゴ）−５’−ＳＨの組立 スキーム１２ Ａｂ−ＳＨ＋Ｌ−ｄ（オリゴ）−３’−Ｍの組立 スキーム１１に示されるように、修飾されたマレイミド抗体（Ａｂ−Ｍ、スキ ーム６）およびチオール化されたＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド（ ５’−ＨＳ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）ＮＨ2−３’）が組み立てられ、修飾された 抗体−Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド複合体（Ａｂ−Ｍ−５’−Ｓ −スクシンイミド−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−ＮＨ2−３’）を得る。同様にＡｂ −Ｓ−Ｍ−３’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−ＴＥＧ−５’は、スキーム１３に示 されるようにＡｂ−ＳＨと５’−ＴＥＧ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−マレイミド −３’から調製される。 スキーム１３ 相補的Ｌ−オリゴヌクレオチド「５’−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−３’ 」 このスキームにおいて、Ｌ−ｄ（オリゴ）は、Ｌ−デオキシリボヌクレオチド 、Ｌ−ｄ（Ｉ）のようなＬ−エナンチオメリックオリゴデオキシリボヌクレオチ ドを表し；ｄ（ｃＩ）は、相補的なＬ−エナンチオメリックオリゴデオキシリボ ヌクレオチド配列を表し；Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）はＬ−エナンチオメリックオ リゴデオキシリボヌクレオチドであり；ＴＭＴは、ターピリジン（terpyridine ）キレートの組のメンバー、好ましくは上記のものを表す。好ましいＴＭＴは、 ４’−（３−イソチオシアナト−４−メトキシフェニル）−６，６”−ビス［Ｎ ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）−アミノメチ ル］−２，２’：６’，２”−ターピリジン、ＴＭＴ−ＮＣＳである。 スキーム１３に示されるように、５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＮＨ2−３’ と２モルのＴＭＴ−ＮＣＳとの反応で所望の５’−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−Ｔ ＭＴ−３’を得る。 保護されたアミン、チオール、またはカルボキシル基を一方の末端に有し、他 方にホスホルアミダイトを有する他の有効な結合剤がある。これらの試薬の適用 は例に示されている。 好ましい態様では、薬学的に許容しうる媒体中の上記放射性ターゲッティング 試薬の効果的な投与量は、放射性金属アイソトープを含有する組成物に、上記の オリゴデオキシリボヌクレオチドのような１以上のキレート基を含有する相補的 なＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列を含有した組成物を、前記放 射性核種の金属アイソトープのモル量が前記キレート基のモル量より少なくなる ようにさらすことによって調製される。この曝露は、前記キレート剤への前記金 属アイソトープの取込が起こるのに効果的な時間持続する。 好ましい態様では、薬学的に許容しうる媒体中の上記非放射性ターゲッティン グ免疫試薬の効果的投与量が患者に投与され、前記非放射性ターゲッティング免 疫試薬が前記患者の腫瘍部位のような標的部位に蓄積される。引き続き、薬学的 に許容しうる媒体中の前記放射性ターゲッティング試薬の効果的な投与量を前記 患者に投与し、前記放射性ターゲッティング試薬が標的部位（この標的部位は、 前記患者内の前記主要部位で蓄積された非放射性ターゲッティング免疫試薬が存 在している。）で蓄積される。 本発明には、非経口的な注入のため、固体若しくは液体形態での経口投与のた め、直腸若しくは局所投与等のための１以上の非毒性の生理学的に許容しうる担 体、アジュバントまたはビヒクル(vehicles)（ここでは、まとめて担体と呼ぶ。 ）と共に、組成物中に製剤化された１以上の本発明の免疫試薬が含まれる。 該組成物は、ヒトおよび動物に、経口的、直腸的、非経口的（静脈内、筋肉内 または皮下的）、槽内的、膣内的、腹腔内的、膀胱内、局所的（粉末、軟膏若し くはドロップの形態）またはバッカル若しくは鼻内噴霧としての何れかで投与さ れうる。 非経口的な注入に適した組成物は、生理学的に許容しうる無菌の水溶液若しく は非水溶液、分散物、懸濁物若しくはエマルジョン、および無菌の注射しうる溶 液若しくは分散物に再構成できる無菌の粉末を包含する。適切な水性および非水 性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール（ プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、これらの 適切な混合物、植物油（例えばオリーブオイルのようなもの）およびオレイン酸 エチルのような注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性が、例えばレ クチンのようなコーティング剤を使用することによって、分散物の場合には必要 な粒子サイズを保持することによって、更には表面活性剤を使用することによっ て維持されうる。 これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のようなアジ ュバントも含有しうる。微生物の作用を阻害することは、例えばパラベン、クロ ロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の種々の抗細菌剤および抗菌剤によっ て保証される。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含有することも望ましい 。注射可能な薬学的形態の吸収を延ばすことは、吸収を遅らせる薬剤、例えばモ ノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって行われうる 。 経口投与のための固体投与量形態には、カプセル、錠剤、ピル、粉末および顆 粒が含まれる。このような固体投与量形態では、該活性化合物は、クエン酸ナト リウムまたはリン酸ジカルシウムのような少なくとも１種の通常の不活性な賦形 剤（または担体）、または（ａ）例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グル コース、マンニトール、および珪酸のようなフィラーまたは増量剤、（ｂ）例え ば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート（alignates）、ゼラチン、ポ リビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア（acacia）のような結合剤、（ ｃ）例えば、グリセロールのような湿潤剤（humectants）、（ｄ）例えば、寒天 −寒天（agar-agar）、炭酸カルシウム、ジャガイモ若しくはタピオカ澱粉、ア ルギン酸、幾つかのシリケートコンプレックス、および炭酸ナトリウムのような 崩壊剤、（ｅ）例えば、パラフィンのような溶液凝固遅延剤、（ｆ）例えば、４ 級アンモニウム化合物のような吸収促進剤、（ｇ）例えば、セチルアルコール、 およびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤、（ｈ）例 えば、カオリンおよびベントナイトのような吸着剤、並びに（ｉ）例えば、タル ク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレング リコール、ラウリル硫酸ナトリウムのような潤滑剤またはこれらの混合物と混合 される。カプセル、錠剤およびピルの場合には、投与量形態には緩衝剤も含有さ れる。 同様のタイプの固体組成物も、ラクトース若しくは乳糖並びに高分子量ポリエ チレングリコール等のような賦形剤を用いて、軟質および硬質の充填されたゼラ チンカプセル内のフイラーとして使用されうる。 錠剤、糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒のような固体投与量形態は、腸溶性 のコーティング剤および他の当分野で周知のもののようなコーティング剤および 外皮（shells）を用いて調製されうる。これらは、混濁剤を含有し得、これらが 腸管路の幾つかの部分において遅らされた方法で、活性な１以上の化合物を放出 するような組成物でもありうる。使用されうる包埋組成物の例は、ポリマー材料 およびワックスである。 活性化合物はまた、適切であれば、１以上の上記賦形剤を有するマイクロカプ セル化された形態でもありうる。 経口投与のための液体投与量形態は、薬学的に許容しうるエマルジョン、溶液 、懸濁液、シロップおよびエリキシールが含まれる。活性化合物に加えて、液体 投与量形態には、水若しくは他の溶媒のような当分野で一般に使用される無菌の 希釈剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、 エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾ エート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルム アミド、オイル、特に綿実油、落花生油、コーン胚油（corn germ oil）、オリ ーブオイル、ひまし油、およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリル アルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、また はこれらの材料の混合物等のような溶解剤および乳化剤を含有しうる。 このような不活性希釈剤に加えて、組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁 剤、甘味料、香味剤、並びに香料のようなアジュバントを含有しうる。活性化合 物に加えて、懸濁物には、例えば、エトキシル化されたイソステアリルアルコー ル、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セル ロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天−寒天およびトラ ガガント、またはこれらの物質の混合物等のような懸濁剤を含有しうる。 直腸投与のための組成物は、好ましくは坐薬である。該坐薬は、本発明の化合 物と、ココアバター、ポリエチレングリコール若しくは坐薬用ワックスのような 適切な非刺激性の賦形剤若しくは担体であって、通常の温度で固体であるが、体 温で液体であるもの、従って直腸または膣口内で溶け、活性成分を放出するもの とを混合することによって調製されうる。 本発明の化合物の局所投与のための投与量形態には、軟膏、粉末、スプレイお よび吸入剤が含まれる。該活性成分は、無菌条件下で、要求されうる生理学的に 許容しうる担体および 何れかの防腐剤、バッファー、若しくは噴射剤と混合される。眼用の製剤、眼の 軟膏、粉末および溶液はまた、本発明の範囲内であるとして考慮される。 本発明の組成物内の活性成分の実際の投与量レベルは、個々の組成物および投 与の方法に対して所望の治療の応答を得るのに効果的な量の活性成分を提供する ように変化しうる。従って、選択される投与量レベルは、所望の治療効果、投与 の経路、所望の治療の継続および他の因子に依存する。 一回または分割された投与量で、ホストに投与される本発明の化合物の治療の ための１日当たりの総投与量は、例えば１キログラム体重当たり約１００ピコモ ルから約５マイクロモルの量でありうる。投与量単位の組成物には、１日の投与 量となるように使用されうるこのような量を複数回に分けた（submultiples）量 が含まれる。しかし、個別の任意の患者に対する特別の投与量レベルは、体重、 一般的な健康状態、性別、食事、投与の回数および経路、吸収および排泄の速度 、他の薬剤との組合せ、並びに治療される個々の疾患の重篤度を含む種々の因子 に依存することが理解されるであろう。 他の態様では、本発明は、診断の方法であって、このような診断が必要である 哺乳動物に治療用のイメージングをするのに効果的な量の本発明の組成物を投与 することを具備した方法に向けられる。本発明に従った医療手順に使用するため の治療用のイメージングの方法は、治療用の画像が必要な試験対象の体に、治療 用の画像を生成するのに効果的な量の上記組成物を投与することを具備する。こ の方法では、薬学的 に許容しうる媒体内の、治療用画像を生成するのに効果的な量の上記非放射性タ ーゲッティング免疫試薬が患者に投与され、前記非放射性ターゲッティング免疫 試薬が前記患者内の腫瘍部位のような標的部位で蓄積される。引き続き、薬学的 に許容しうる媒体内の診断用のイメージングに効果的な投与量の上記放射性ター ゲッティング試薬を前記患者に投与し、前記放射性ターゲッティング試薬が該標 的部位（この標的部位は、前記患者内の前記腫瘍部位で蓄積された前記非放射性 ターゲッティング免疫試薬が存在する。）に蓄積される。次ぎに、画像パターン を視覚化する。 一回または分割された投与量で、ホストに投与される本発明の化合物の診断用 のイメージングのための総投与量は、例えば１キログラム体重当たり約１ピコモ ルから約０．５マイクロモルの量でありうる。投与量単位の組成物には、効果的 な診断をするためのイメージングの投与量となるように使用されうるこのような 量を複数回に分けた（submultiples）量が含まれる。しかし、個別の任意の患者 に対する特別の投与量レベルは、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与の 回数および経路、吸収および排泄の速度、他の薬剤との組合せ、並びに治療され る個々の疾患の重篤度を含む種々の因子に依存することが理解されるであろう。 人患者に加えて、試験対象には、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタ、 ウマ、ウシ科の動物等のような動物種が含まれうる。 本発明の組成物の投与の後、対象動物は、投与された組成 物が対象全体に分布し、動物の組織に入り込むのに十分な時間維持される。非放 射性ターゲッティング免疫試薬のための十分な時間は、一般に約１時間から約２ 週間以上、好ましくは約２時間から約１週間である。好ましい90Ｙのような放射 性ターゲッティング試薬のための十分な時間は、一般に、照射性格種の半減期に よって測定され、このような時間は、約１から約１０半減期以上、好ましくは約 ２時間から約６半減期までの範囲である。 以下の例は本発明を更に例示するが、何れの方法においても本明細書およびク レームを制限するものと解釈してはならない。本発明の特別な態様を以下の例で 示す。 例 例１ Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの設計 抗体Ｚ、連結基Ｌz及び基ＬQ、並びにＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオ チド配列Ｉ、スペーシング基ＱI、第２配列Ｉi、及び末端キャッピング基Ｅを具 備した構造IVに示された本発明のターゲッティング免疫試薬を以下のように設計 した。この場合、所望のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの類似の物 理的特性のモデルとして鏡像異性体であるＤ−エナンチオメリックオリゴヌクレ オチドの相補的対合間の予想された相補的結合特性を利用した。 サンプルの鏡像体、即ち以下の配列（ここでは配列番号３２と称する。）をも つ天然に存在するＤ−エナンチオメリックオリゴデオキシリボヌクレオチドは、 構造IVについて以前に示された基準に従って適合性を分析した。その構造IVにお いて、基Ｌz，Ｉ，ＱI，Ｉi，及びＬQとＥは、Ｄ−エナンチオマーとして以下の ように表わされる： Ｄ−エナンチオマーに対して設計された”オリゴ”コンピューターソフトウェ アー（National Biosciences）を用いたこ のＤ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列の分析により、それには自己 相補性の領域が５つ含まれていることが明らかにされた。そのような領域は全て 、異なった程度のオーバーラップを有するヘアピンループであった。これらの自 己相補性領域に対する負の自由エネルギー変化（ΔＧ's）の合計は−２８．３kc al/モルであった。そのことから、このＤ−エナンチオメリックオリゴヌクレオ チドについて、１．０モルの塩中で融解温度は８６℃となることが予測された。 最も安定な自己相補性領域（△Ｇ＝−１５Kcal/モル）には８塩基対が含まれて おり、そのほとんどはＢＡＭ−１制限部位のパリンドロームに相当するものであ った。これらの自己相補性領域の存在下で、この配列に相補的なＤ−エナンチオ メリックオリゴヌクレオチドの配列はその完全な長さまでのハイブリダイズを成 し遂げることができない。推論によって、これと同じ配列の鏡像体Ｌ−エナンチ オメリックオリゴヌクレオチド配列およびＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレ オチド配列に相補的なＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列も、自己 相補的な鏡像体領域の存在下でその完全な長さのハイブリダイズを成し遂げるこ とができない。次いで、過剰の塩基が対をなすことが反復分析で除外されるよう に、Ｄ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列の修飾（更には、鏡像体で あるＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの相当する修飾）によって自己 相補性領域内で選択された塩基を置換することが、構造IVに対して概説した基準 に従って行われた。また、らせん状のコンホーメーションにおい ては、２つの相当する相補的配列の末端基、Ｄ−ｃＩおよびＬ−ｃＩが、２つの Ｄ−エナンチオマー配列Ｉと配列ＩＩおよび２つのＬ−エナンチオマー配列にそ れぞれハイブリダイズする際、お互いに直角となることを保証するために、つい かのＤ−エナンチオメリックヌクレオチドおよび追加のＬ−エナンチオメリック ヌクレオチドも相当するスペーサー配列に挿入された。 このような方法で、以下の配列をもつ新規なＤ−エナンチオメリックオリゴヌ クレオチド（配列番号３３）が設計され、次いで合成された。鏡像体であるＬ− エナンチオマー（配列番号３４）を合成し、Ｌ−エナンチオマーは免疫反応性分 子（即ち、ＩＮＧ−１のような抗体に対して）と複合体を形成させた： このＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド（配列番号３４）は、６つの Ｌ−エナンチオメリックヌクレオチドスペーサー［ＱI＝L-d(ACTCTC)］を介して 連結された２つの同じＬ−エナンチオメリックヌクレオチド配列（即ち、Ｉ＝Ｉi ＝L-d(TTATGGACGGAGAAGCTAA)；配列番号８）のコピーから構成されている。５ ’及び３’末端のＬz基とＬQE基はＸ及びＹ基を含有している。ＸおよびＹは各 々独立にアミンを含む基（例えばClontech Ind-ustriesから入手可能なもの。こ れらのアミンを含有する基は、これ以後しばしば簡略化して「ＮＨ2」もしくは 「アミン」と表す。）であるか、またはＸおよびＹの一方がアミンを含有する基 から選択され、他方が先に示された１以上のＴＥＧ基から構成され得る。加えて 、望ましくは、ＸおよびＹの一方はまた、末端ヒドロキシル基（この場合におい て、上記配列内の３’−ＹＴは、固相支持体から除去されたときデオキシリボシ ル−ＯＨとなり、より好ましくは、Ｘは、水酸化アンモニウムでアミン基を脱保 護する前に、合成の経路の最後で酸によりＤＭＴ基を除去することによって得ら れる５’ＯＨ基である。）でありうるか、またはＸおよびＹの一方はまた、末端 リン酸エステル基（この場合において、３’−ＴＹまたは５’−Ｘは−ＯＰＯ3 Ｈ2基若しくはこれらのナトリウム塩のようなイオン化された塩となる。）であ り得る。このようなホスフェート末端基は、合成の最後で、５’−ＯＨ末端基を ２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと処理することによって得ら れる。引き続き水酸化アンモニウムと反応し、酸化することによって、Ｘで末端 ホスフェート基を得る。３’−ホスフェート基は、オリゴマーを合成し、これを 固体支持体から除去した後に、３’−ヒドロキシル基をリン酸無水物で処理し、 次いで水で加水分解することによって導入されうる。 従って、一態様において、簡略化して５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ） −３’−アミンと表されるこのＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドは以 下のものである： −ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’アミン。 他の態様では、５’−アミン−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’Ｔｅｇと簡略化 して表されるこのＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドは以下のものであ る： 他の態様では、５’−アミン−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’ＯＨと簡略化し て表されるこのＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチドは以下のものである： −ＱI−Ｉ）−３’−ＯＨ。 他の態様では、５’−アミン−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’ＯＰＯ3Ｈ2と簡 略化して表されるこのＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドは以下のもの である： 例２ （２ａ）Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）；５’−Ｌ−ｄ（Ｔｅｇ−Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’ −ＮＨ2（配列番号３１）の合成 このＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドを、元来、天然に存在するＤ −エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの合成に使用されるように製造者によ ってデザインされたアプライドバイオシステムオリゴヌクレオチド合成機（Appl ied Biosystems oligonucleotide synthesizer）により調製した。天然に存在す るＤ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの合成のためのトリチルあり（tr ityl-on）のプロトコールに適用しうる方法を、装置の製造者によって指示され るように使用したが、Ｄ−エナンチオマー以外、上述のように調製されたＬ−２ −デオキシヌクレオチドホスホルアミダイト試薬の前駆体（５’−ジメトキシト リチル Ｌ− シチジン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイト、５’−ジメトキシトリチル Ｌ−ア デノシン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイト、５’−ジメトキシトリチル Ｌ−グ アノシン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイト、および５’−ジメトキシトリチルＬ −チミジン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイト）を代わりに用いるように修飾した 。３’−アミン基に対する前駆体としてClonetechの単結合アミノ修飾剤（uni-l ink Amino Modifier）を用いた。ＴＥＧ基、即ち５’−ジメトキシトリチルＬ− チミジン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトに結合されたリン酸エステルによって 本発明において連結されたテトラ（エチレングリコール）リン酸ジエステルを、 鎖の５’末端で用いた［ここで、５’−ジメトキシトリチル Ｌ−チミジン−３ ’−Ｏ−ホスホルアミダイトは、ＷＯ／９２／０２５３４に開示されたＬ−エナ ンチオマー（鏡像体）である。また、ＷＯ／９２／０２５３４は、５’−ジメト キシトリチルＤ−チミジン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトに結合されたリン酸 エステルに連結された（テトラ（エチレングリコール）リン酸ジエステルに関連 する。］。Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド全体の合成に続いて、塩 基の保護基と固体支持体を水酸化アンモニウムを用いて取り除き、得られた５’ 保護基を３％トリクロロ酢酸を用いて取り除いた。このＬ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチドを脱塩し、脱イオン水を用いてＯＰＥＣカートリッジ（Clon etech）に通して溶出することによりさらに精製した。Ｌ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチドをさらに精製するために、１ ２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動を用いた。Ｌ−ＤＮＡバンドを紫外 線投影により視覚化した。これを切り出し、細かく切り刻み、ｐＨ７．５、４℃ で１０mMトリス塩酸、１mMＥＤＴＡを含有する緩衝液を用いて２４時間抽出した 。次いで、ゲルの断片を遠心分離により除き、Ｌ−ＤＮＡをセファデックスＧ− ２５のスパンカラムに通して精製した。Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオ チドの濃度を２６０nmでの吸光度を用いて評価した。 （２ｂ）５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇ（配列番号３５） の合成 Ｌ−２−デオキシヌクレオチドホスホルアミダイト試薬の前駆体（即ち、上記 のような５’−ジメトキシトリチル Ｌ−シチジン−３’−Ｏ−ホスホルアミダ イト、５’−ジメトキシトリチル Ｌ−アデノシン−３’−Ｏ−ホスホルアミダ イト、５’−ジメトキシトリチル Ｌ−グアノシン−３’−Ｏ−ホスホルアミダ イト、および５’−ジメトキシトリチルＬ−チミジン−３’−Ｏ−ホスホルアミ ダイト）を用いて修飾したが、他の点では装置の製造元で指示されたようなＤ− エナンチオマーに対して使用されるトリチルなし（trityl-off）の手法によって アプライドバイオシステムオリゴヌクレオチド合成機によりＬ−エナンチオメリ ックオリゴヌクレオチドを調製した。５’−アミン基の前駆体としてClonetech の６炭素のモノメトキシトリチルアミノ修飾剤（N-MMT-C6-AminoModifier）を用 いた。３’末端で末端基と してＴＥＧ基を用いた。塩基の保護基と固体支持体を水酸化アンモニウムを用い て取り除き、Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミド ゲル電気泳動によりさらに精製した。 （２ｃ）５’−トリチル−Ｓ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ2の合成 Ｔｅｇ基がない例２ａのＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列を、 アプライドバイオシステムオリゴヌクレオチド合成機により、Ｌ−２−デオキシ ヌクレオチドホスホルアミダイト試薬の前駆体（上述のような５’−ジメトキシ トリチル Ｌ−シチジン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイト、５’−ジメトキシト リチル Ｌ−アデノシン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイト、５’−ジメトキシト リチル Ｌ−グアノシン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイト、および５’−ジメト キシトリチル Ｌ−チミジン−３’−Ｏ−ホスホルアミダイト）を用いて、装置 の製造元の指示のとおりトリチルあり（trityl-on）の手法によって調製した。 ３’−アミン基に対する前駆体としてClonetechの単結合アミノ修飾剤（uni-lin k Amino Modifier）を用いた。例２ａのＴｅｇの代わりに配列に加えられた５’ −チオール基（ここでは簡略化して５−Ｓと表されている。）に対する前駆体と して、ClonetechのＣ６−チオ修飾剤（ThioModifier）を用いた。完全なＬ−エ ナンチオメリックオリゴヌクレオチドの合成に引き続き、塩基の保護基と固体支 持体を水酸化アンモニウム を用いて取り除いた。このＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドを脱塩し 、脱イオン水を用いてＯＰＥＣカートリッジ（Clonetech）に通して溶出するこ とによりさらに精製した。オリゴヌクレオチドの濃度は２６０nmでの吸光度を使 用して評価した。 （２ｄ）蛍光性５’Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ−Ｃｙ５．１ ８の調製 例２ａに従って調製された５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｎ Ｈ2の試料（３０ｎモル）を乾燥するまでエバポレートし、５００mLの０．１Ｍ 重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９中でボルテックス混合することにより再溶解した。その 後、この試料を、乾燥させた色素Ｃｙ５．１８のスクシンイミジルエステル（Bi ological Detection Systems；Pitts-burg PA）を含むバイアルに添加した。完 全に混合した後、反応を室温で１時間、しばしば混合しながら進行させた。生成 物、５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ−Ｃｙ５．１８を脱イ オン水を用いてセファデックスＧ−２５カラムから溶出させることにより精製し た。 例３ （３ａ）ｃＩジアミン、５’−ＮＨ2−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’−ＮＨ2の合成 Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドＩに相補的なＬ−エナンチオメリ ックヌクレオチド配列5'X-L-d(TTAGCTT CTCCGTCCATAAYT)-3'（配列番号３８）を含んでいるＬ−エナンチオメリックオリ ゴヌクレオチドＬ−ｄ（ｃＩ）を、例２ａでしたようにしてアプライドバイオシ ステムオリゴヌクレオチド合成機により調製した。３’−アミン基の前駆体とし て単結合アミノ修飾剤（Clonetech）を、５’−アミン基の前駆体としてClonete chの６炭素のモノメトキシトリチルアミノ修飾剤（AminoModifier）（N-MMT-C6- AminoModifier：カタログ＃5202）を用いて、装置の製造元の指示どおりに３’ （Ｙ）と５’（Ｘ）にアミンを含む基を組み込んた。最後の脱ブロック（debloc king）及び固体支持体からの切り出しの後、保護基をアンモア水を用いて取り除 き、アミンで機能化されたＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドを脱イオ ン水を用いてＯＰＥＣカートリッジ（Clonetech）に通して溶出することにより 精製した。このＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミ ドゲル電気泳動もしくは逆相−ＨＰＬＣによりさらに精製した。Ｌ−エナンチオ メリックオリゴヌクレオチドの濃度は２６０nmでの吸光度を使用して評価した。 （３ｂ）Ｉジアミン、５’−ＮＨ2−Ｌ−ｄ（Ｉ）−３’−ＮＨ2の合成 Ｌ−エナンチオメリックヌクレオチド配列5'X-L-d(TTATGGACGGAGAAGCTAAYT)-3 '（配列番号３９）を含んでいるＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドＩ を、例３ａで概説し たように、アプライドバイオシステムオリゴヌクレオチド合成機により調製した 。３’−アミン基の前駆体として単結合アミノ修飾剤（uni-link Amino Modifie r）（Clonetech）を、５’−アミン基の前駆体としてClonetechの６炭素のモノ メトキシトリチルアミノ修飾剤（AminoModifier）（N-MMT-C6-AminoModifier： カタログ＃5202）を用い、装置の製造元の指示どおりに３’（Ｙ）と５’（Ｘ） にアミンを含んでいる基を組み込んた。最後の脱ブロック及び固体支持体からの 切り出しの後、保護基をアンモア水を用いて取り除き、アミンで機能化されたＬ −エナンチオメリックオリゴヌクレオチドを脱イオン水を用いてＯＰＥＣカート リッジ（Clonetech）に通して溶出することにより精製した。このＬ−エナンチ オメリックオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動もしくは逆相 −ＨＰＬＣによりさらに精製した。Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド の濃度を２６０nmでの吸光度を使用して評価した。 （３ｃ）Ｌ−ｄ（ｃＩ）の合成 （Ｉ）に相補的なヌクレオチド配列5'-L-d(TTAGCTTCTCCGTCCATAA)-3'（配列番 号２３）を含んでいるＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドｃＩを、例２ ａに概説したようにしてアプライドバイオシステムオリゴヌクレオチド合成機に より調製した。最後の脱ブロック及び固体支持体からの切り出しの後、保護基を アンモア水を用いて取り除いた。Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドを 脱イオン水を用い てＯＰＥＣカートリッジ（Clonetech）に通して溶出することにより精製した。 このＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気 泳動によりさらに精製した。Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの濃度 は２６０nmでの吸光度を使用して評価した。 （３ｄ）Ｌ−ｄ（Ｉ）の合成 Ｌ−エナンチオメリックヌクレオチド配列5'-L-d(TTATGGACGGAGAAGCTAA)-3'（ 配列番号８）を含んでいるＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドＩを、例 ３ｃに概説したようにしてアプライドバイオシステムオリゴヌクレオチド合成機 により調製した。最後の脱ブロック及び固体支持体からの切り出しの後、保護基 をアンモア水を用いて取り除き、Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドを 脱イオン水を用いてＯＰＥＣカートリッジ（Clonetech）に通して溶出すること により精製した。このＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドをポリアクリ ルアミドゲル電気泳動によりさらに精製した。Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌ クレオチドの濃度は２６０nmでの吸光度を使用して評価した。 （３ｅ）蛍光性ｃＩジアミン５’−ＮＨ2−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’−ＮＨ2、及び 蛍光性Ｉジアミン、Ｌ−ｄ（Ｉ）の調製 例３ａに従って調製された５’−ＮＨ2−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’−ＮＨ2の試料 （３０ｎモル）を乾燥するまでエバポ レートし、５００mLの０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液中に、ｐＨ９でボルテックスする ことにより再溶解した。次いで、この試料を乾燥させた色素Ｃｙ５．１８（Biol ogical Detection Systems；pittsburg PA）のスクシンイミジルエステルを含む バイアルに添加した。完全にぼるテックスした後、反応を室温で１時間、しばし ば混合しながら進行させた。Ｃｙ５．１８で標識された５’−ＮＨ2−Ｌ−ｄ（ ｃＩ）−３’−ＮＨ2を脱イオン水を用いてセファデックスＧ−２５カラムから 溶出することにより精製した。例３ｂのＣｙ５．１８で標識されたＩジアミン、 ５’−ＮＨ2−Ｌ−ｄ（Ｉ）−３’−ＮＨ2の試料を同様の方法で調製した。 例４ （４ａ）５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３−ＮＨ2に対するＬ−ｄ（ｃ Ｉ）のアニーリング 例２ａに従って調製された５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３−ＮＨ2 の試料（２mmoles）を、６ＳＳＣ緩衝液中において、例３ｃの方法に従って調製 されたＬ−ｄ（ｃＩ）を増加する量で含有するアリコート［１００：５から１０ ０：２００のＬ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）：Ｌ−ｄ（ｃＩ）］で室温にて混合した。 混合物を試料キュベットに導入し、キュベットの温度を３０℃から９０℃まで上 げ、次いで３０℃まで下げる間にキャリー１３装置（Cary 13 instrument）内で ＵＶ光（２６０nm）にて分析した。５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３ −ＮＨ2に関して等モル以下のＬ− ｄ（ｃＩ）の濃度では、２成分のコンプレックス（binary complex）（Ｌ−ｄ（ ｃＩ）：５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３−ＮＨ2および／または５’ −Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３−ＮＨ2：Ｌ−ｄ（ｃＩ））の存在が明ら かにされた。より高いＬ−ｄ（ｃＩ）濃度では、３成分のコンプレックス（tern ary complex）（Ｌ−ｄ（ｃＩ）：５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３− ＮＨ2：Ｌ−ｄ（ｃＩ））が観測されうる。 （４ｂ）Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）へのＴＭＴ−ｃＩ−ＴＭＴのハイブリダイゼー ション Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ（以下の例６ａ参照）を用いた同様の実験により、５ ’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３−ＮＨ2に対するＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ ）−ＴＭＴのアニーリングが示された。３成分のコンプレックスが形成された。 例５ 35Ｓで標識されたＴＭＴ−ＮＣＳの調製 約４０ミリモルのＴＭＴアミン（PCT US91/08253）の６５０mLメタノール懸濁 液を室温にて撹拌し、溶液が透明な薄黄色を呈するまで脱イオン水を滴下した（ 約７０mL）。この溶液を氷浴で１０℃まで冷やし、約６０ミリモルの35Ｓ−チオ ホスゲンを約３分間にわたって滴下した。ＴＭＴイソチオシアネートの沈殿が形 成され、この溶液を、さらに２．５時間連続的に撹拌した。溶液と沈殿を室温、 減圧下（１５ mmHg）にてロートバップ（rotovap）でほとんど乾燥するまで濃縮した。ほとん ど乾燥した固形物をさらに約５００−７５０mLのメタノールで希釈し、固形物が 見かけ上均質化するまで撹拌した。次いで、固体のＴＭＴイソチオシアネートを 濾過によって集め、メタノールで繰り返し軽く洗浄した。この生成物をバッキュ ームチャンバー（vaccum chamber）内で一晩乾燥した。 例６ （６ａ）キレート剤ＴＭＴ−ＮＣＳと複合体を形成し、５’−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ ｃＩ）−３’−ＴＭＴを形成する５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’−ＮＨ2の 調製、およびキレート剤ＴＭＴ−ＮＣＳと複合体を形成し、５’−ＴＭＴ−Ｌ− ｄ（Ｉ）−３’−ＴＭＴを形成する５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（Ｉ）−３’−ＮＨ2の 調製 １．０Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液５００マイクロＬ、ｐＨ９．０中において、 ３００ｎモルのＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの１つ、即ち例３ａ の５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’−ＮＨ2溶液若しくは例３ｂの５’−Ｈ2 Ｎ−Ｌ−ｄ（Ｉ）−３’−ＮＨ2溶液に１２mgのＴＭＴイソチオシアネート（Ｐ ＣＴ ＵＳ９１／０８２５３）を添加した。反応混合物をボルテックス混合し、 ３７℃で２時間、室温で一晩保持した。生じた反応混合物をエタノールアミン（ １５マイクロＭ）を用いて反応を停止し、生成物を、脱イオン水を溶出液として セファーデックスＧ−２５カラムクロ マトグラフィーにより精製した。 Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドジアミン１分子あたりのＴＭＴの 数は、ＴＭＴにキレート化されたユーロピウム金属の時間分解蛍光を用いた分析 によって定量した。 （６ｂ）蛍光性の金属を用いたＩｎｇ−１−ＴＭＴ及び５’−ＴＭＴ−ｌ−ｄ（ ｃＩ）−３’−ＴＭＴ及び５’−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（Ｉ）−３’−ＴＭＴ複合体の 標識のための一般的な手法 配位結合領域（co-ordination sphere）に密に保持された芳香族部分を有する キレート剤に、ユーロピウム（３+）のようなランタン系列元素を結合させるこ とにより、「増感された（sensitized）」蛍光発光が誘導される。この場合、光 は芳香族系を通して吸収され、エネルギーが金属に移動される。その後金属は、 非常に大きなストークシフトと数秒までの蛍光の寿命により特徴づけられる放出 を起こす。３４０nmでの励起パルスの後、４００マイクロ秒遅れて６１５nmで蛍 光発光が測定された。寿命の短いバックグラウンド蛍光は効果的に除去されるの で、この遅れは高感度測定に利用され、通常のＥｕ−蛍光発光の１５００倍まで の感度の増強が達成される。 この方法において、既知量のＩｎｇ−１−ＴＭＴもしくは５’−ＴＭＴ−Ｌ− ｄ（ｃＩ）−３’−ＴＭＴ、または５’−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（Ｉ）−３’−ＴＭＴ 複合体（conju-gate）を、ＥｕＣｌ3の添加量を増やしながらバッファー水 溶性中で滴定した。例えば、１から３０ピコモルの複合体を含む１マイクロリッ トルの溶液を、前もって算定された量のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）が入っ ているコスターＥＩＡ／ＲＩＡの９６穴プレート（Costar EIA/RIA 96-wellplat e）の穴に２連ずつ加えた。緩衝液の容積は、９９からＥｕＣｌ3水溶液のマイク ロリットルにおける容積を差し引くことにより導いた（典型的な例として、トリ ス塩酸緩衝液中で１０-4Ｍから１０-6Ｍ）。これにより各穴の総体積は１００マ イクロリットルに固定される。その後、ＥｕＣｌ3水溶液を、複合体の緩衝され た溶液に加えた。その後、プレートにふたをし、１時間低速で振蘯した。時間分 解蛍光をデルフィア１２３２時間分解蛍光計（Delfia 1232 time-resolved fluo rimeter）（Wallac Inc.）を用いて測定し、データを分析した。複合体を形成し た各ＴＭＴ分子は１つのユーロピウムイオンをキレートし、５’−ＴＭＴ−Ｌ− ｄ（ｃＩ）−３’−ＴＭＴ及び５’−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（Ｉ）−３’−ＴＭＴ複合 体は、複合体分子あたり２つのユーロピウムイオンに結合することが見出された 。 （６ｃ）５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’−ＮＨ2及び35Ｓで標識されたＴＭ Ｔ−ＮＣＳからの５’−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’−ＴＭＴの調製 例６ａの方法において、１２mgのＴＭＴイソチオシアネート（ＰＣＴ ＵＳ９ １／０８２５３）を、35Ｓで標識されたＴＭＴ−ＮＣＳ（例５のようにして調製 された）に置き 換え、反応を上記のようにして行った。５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’− ＮＨ2１分子あたりのＴＭＴ数を、35Ｓを検出するために最適化された液体シン チレーション計測装置（liquid scintillation counter）でＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃ Ｉ）−ＴＭＴ生成物を計測することにより定量した。派生された（derivatized ）５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’−ＮＨ2の濃度と35Ｓチオホスゲンの比活 性に関する知見から、５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−３’−ＮＨ2ジアミンあた りのＴＭＴ分子数を計算してもよい。 例７ （７ａ）イットリウム（90Ｙ）で放射性標識されたＬ−エナンチオメリックオリ ゴヌクレオチド、90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−90Ｙおよび90Ｙ−Ｔ ＭＴ−Ｌ−ｄ（Ｉ）−ＴＭＴ−90Ｙの調製 Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドＴＭＴ複合体（conjugate）、即 ち例６ａで得た（ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ）または例６ａで得たＴＭＴ −Ｌ−ｄ（Ｉ）−ＴＭＴの脱イオン化水溶液を、90ＹＣｌ3の、ｐＨ６．０；０ ．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液の溶液（＞５００Ci/mg:アマーシャム社（Amersham Corp.）より）で比活性が０．１Ci/ｐモルになるまで室温で１時間処理した。 サンプル１マイクロリットルを取り出し、それをゲルマンＩＴＬＣ−ＳＧ紙片（ Gelman ITLC-SG strip）上にスポットすることにより標識効率を決定した。該紙 片を、０．１Ｍクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ６．０を含むガラスビーカー内で数分間、溶媒の先端が紙の先端に対し て四分の三に至るまで展開した。その後紙片を、90Ｙに対して最適化され、コン パック３８６／２０ｅコンピューター（Compaq 386/20e computer）によって制 御されたシステム２００イメージスキャナー（Bioscan）に挿入した。この系で は、未結合の90Ｙは溶媒先端に移動した。Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレ オチドＴＭＴ複合体のＴＭＴは、添加された放射活性体の９８％以上とキレート を作った。 （７ｂ）放射標識された90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−90Ｙ又は90Ｙ −ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（Ｉ）−ＴＭＴ−90Ｙの５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ ）−３’−ＮＨ2へのハイブリダイズ 例７（ａ）から得た90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−90Ｙの５ｐモル のサンプルを、例２ａで得られた増加する量（０．３７５から１２ｐモル）の５ ’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−ＮＨ2のＰＢＳ溶液と３７℃で１時間混合 した。これらのハイブリダイズしたものの各々からの５mLアリコートをＳＤＳを 含むバッファーと混合し、１２％ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけた。ゲルのオ ートラジオグラフは、５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ2が２ モルのｃＩを結合することができることを示した。 例７（ａ）で得られた非相補的な90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ （Ｉ）−ＴＭＴ−90Ｙを用いた同様の手順では、５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI −Ｉ）−３’−ＮＨ2へのはいぶりダイスは見られなかった。 （７ｃ）ヌードマウスへの90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−90Ｙの投与 ２８mCi/２８mgの比活性になるまで90Ｙで標識されたＴＭＴ−ｃＩ−ＴＭＴを 、右の横腹内に皮下腫瘍をもつ２５ｇのヌードマウスに注射した。注射後所定の 時間間隔をもって、血液試料を尾から採取し、液体シンチレーション計測装置で90 Ｙ放射活性を計測した。その結果より、注射で投与された量の９５％以上の90 Ｙが注射後の最初の３０分以内に血流から除かれることが示された。注射後２時 間で、血液中の放射活性は横ばいになり、ほんの一部（注射された投与量の０． ０１％未満）はその後２２時間目まで循環し続けた。これらのデータにより、Ｌ −ｄ（ｃＩ）配列を認識するハイブリダイズ部位が存在しない場合、放射性標識 されたＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴは循環から速やかに失われることが確か められた。 例８ （８ａ）スルホ-ＳＭＣＣ及びＩＮＧ−１を用いる抗体−マレイミド（ＩＮＧ− １−マレイミド）の調製 リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のスルホ−ＳＭＣＣ溶液（１０８ｎモル） を、ホスフェートバッファー（ｐＨ７） 中のキメラ抗体（ＩＮＧ−１；１８ｎモル）の溶液の試料に加えた。得られた混 合物を時折混合しながら室温にて３０分間放置した。反応を６０ｎモルの塩基性 トリス緩衝液を用いて停止した。反応混合物を、リン酸緩衝生理食塩水を用いて 希釈し、前洗浄したＰＤ−１０カラムに加え、ＰＢＳを用いて溶出し、ＩＮＧ− １−マレイミドを得た。この物質を使用するまで氷上に保存した。 （８ｂ）ＩＮＧ−１及び２−イミノチオランからのメルカプトアルキル−抗体（ Ａｂ−ＳＨ）の調製；（ＩＮＧ−１−ＳＨ） ０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．８）中のキメラ抗体（ＩＮＧ−１；５ｎモル ）溶液の試料を２００ｎモルの２−イミノチオレン水溶液と混合した。得られた 混合物を時折混合しながら室温にて３０分間放置した。反応混合物をリン酸緩衝 生理食塩水を用いて希釈し、前洗浄されたＰＤ−１０カラム（pharmacia）に加 え、ＰＢＳを用いて溶出し、メルカプトアルキル−ＩＮＧ−１を得た。この物質 を使用するまで氷上に保存した。 例９ （９ａ）２−イミノチオレンを用いたメルカプトアルキル−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI− Ｉ）の調製；５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＳＨ ５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ2 （３０ｎモル）水溶液の試料を１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９）と混合し、８９０mM の最終緩衝液濃度を得た。１２ｍモルの２−イミノチオラン塩酸塩の水溶液を緩 衝されたＬ−ＤＮＡに添加した。これらの反応物をボルテックス混合し、３７℃ に３０分間維持した。反応混合物を、１２ｍモルのエタノールアミンを添加する ことにより停止し、リン酸緩衝生理食塩水で希釈し、前洗浄したＮＡＰ−２５カ ラム（pharma-cia）に加え、ＰＢＳを用いて溶出し、５’Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ− ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ−Ｃ（Ｎ＝Ｈ2 +）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ（塩酸塩、Ｃｌ- として）を得た。マレイミドの導入された抗体（maleimode-derivatized antibo dy）（Ａｂ−Ｍ）との複合体形成に使用するため、生成物をカラムから直接抗体 溶液へ溶出させた。一方、メルカプトアルキル−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）を使用 するまで氷上に保存した。 （９ｂ）２−イミノチオランを用いたメルカプトアルキル−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI− Ｉ）の調製；５’−ＨＳ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇ ５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇ（３０ｎモル）を例９ａ のように処理し、５’−ＨＳ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＨＮ−Ｌ−ｄ （Ｉ−ＱI−Ｉ）−Ｔｅｇ−３’（Ｃｌ-）を得た。 （９ｃ）スルホ−ＳＭＣＣを用いたＬ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−マレイミドの調製 ；５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI −Ｉ）−３’−マレイミド ２０ｎモルの５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ2（例２ａの ようにして調製された）を含む水溶液を、リン酸緩衝生理食塩水に希釈した。ス ルホ−ＳＭＣＣ（１００ｎモル）のＰＢＳ溶液を添加し、得られた混合物を時折 混合しながら室温にて３０分間そのまま放置した。反応混合物をリン酸緩衝生理 食塩水を用いて希釈し、前洗浄されたＰＤ−１０カラムに加え、ＰＢＳを用いて 溶出し、５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−マレイミドを得た。こ の物質を使用するまで氷上に保存した。 （９ｄ）Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−マレイミドの調製；５’−マレイミド−Ｌ− ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇ ５’−Ｈ2Ｎ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇを９ｃの５’−Ｔｅｇ− −３’−ＮＨ2と同様の方法でスルホ−ＳＭＣＣと反応し、５’−マレイミド− Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’Ｔｅｇを得た。 （９ｅ）ＳＡＴＡを用いる３’−メルカプト−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）の調製 ５０ｎモルの５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ2（例２ａの ようにして調製された）を含む水溶液をＰＢＳに希釈し、５００ｎモルのＳＡＴ Ａ（ＤＭＳＯ中）を添加した。混合し、室温で６０分間放置した後、反応 混合物をＰＢＳを用いて希釈し、ＰＢＳを用いてＮＡＰ−１０カラムから溶出し 、５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ−ＣＯ− ＣＨ3を得た。アセチルチオアセチル化されたＬ−エナンチオメリックオリゴヌ クレオチドを１００mMリン酸ナトリウム、２５mM ＥＤＴＡ、５００mM ＮＨ2Ｏ Ｈを含むｐＨ７．５の溶液を３０μｌ添加することにより脱アシル化した。反応 を室温で２時間続けた後、該物質を、溶出液としてＰＢＳを用いて溶出すること によりＮＡＰ−５カラムに通した。生成物、５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI− Ｉ）−３’ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＳＨは、酸化的な二量化を防ぐためにすぐに使 用した。 （９ｆ）ＳＡＴＡを用いる５’メルカプト−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）の調製 Ｈ2Ｎ−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇを、例９ｅの５’−Ｔｅ ｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ2と同様の方法でＳＡＴＡと反応し、５ ’−ＨＳ−ＣＨ2−ＯＣ−ＮＨ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇを得た。 例１０ （１０ａ）Ａｂ−Ｍと５’Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ−Ｃ（ ＝ＮＨ2 +）ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨの複合体形成；ＩＮＧ−１−マレイミド−３’ −Ｓ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇ ５’−Ｔｅｇ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ2 +）ＣＨ2Ｃ Ｈ2ＣＨ2ＳＨ（例９ａに従って調製された）の試料（１０８ｎモル）を、例８ａ から得られたＡｂ−Ｍ（マレイミドの導入されたＩＮＧ−１；１８ｎモル）の溶 液中にＮＡＰ−２５カラムからＰＢＳを用いて直接溶出した。混合後、反応を４ ℃にて２０時間進行させた。その後、 （Amicon）へ導入し、１０００ｇで２５分間遠心分離した。試料を新しいＰＢＳ 中に再懸濁し、２６０nmと２８０nmでの光学密度（optical densities）の比率 が一定になるまで遠心分離による限外濾過濃縮をさらに３度繰り返した。最終生 成物はＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−３’ −Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇである。 （１０ｂ）抗体−マレイミドと５’−ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2（ＮＨ2＝）Ｃ−ＮＨ −Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−Ｔｅｇ−３’の複合体形成；ＩＮＧ−１−マレイミ ド−５’−Ｓ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−Ｔｅｇ−３’ 例９ｂに従って調製された５’−ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2（ＮＨ2 +＝）Ｃ−ＮＨ −Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−Ｔｅｇの試料（１０８ｎモル）を、例８ａのように してマレイミドの導入された１８ｎモルのＩＮＧ−１と複合体を形成させ、ＩＮ Ｇ−１−マレイミド−５’−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）ＮＨ−Ｌ−ｄ（Ｉ −ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇを得た。 （１０ｃ）ＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）複合体の分析 例１０（ａ）及び（１０ｂ）のＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ （＝ＮＨ）ＮＨ−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）試料の各光学密度を２６０nmと２８０n mにおいて分光光度計で測定した。これらの２つの波長での光学密度の比を計算 し、これらの波長のそれぞれにおける抗体およびＬ−エナンチオメリックオリゴ ヌクレオチド（分子量約１６５００）に対する既知の消光係数（extinction coe fficients）を用いることにより、Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレチド分 子、Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）の数を、抗体あたり１から２の間のＬ−ｄ（Ｉ−ＱI −Ｉ）であると見積った。 複合体溶液内でのＩＮＧ−１の濃度を、標準タンパクとしてウシ免疫グロブリ ンを用いてバイオラドタンパク質分析（BioRad protein assay）により決定した 。複合体を形成させたＬ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）に起因する吸光度に対して複合体 の光学密度を補正すると、これらのデータは、２８０nmでの複合体の光学密度を 測定することにより決定された抗体濃度とよく一致した。抗体−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI −Ｉ）複合体を酸消化とアミノ酸分析にかけることにより、これらの２組のデ ータをさらに確認した。 抗体−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）複合体を、ヒト腫瘍細胞系（この細胞系に対し て抗体を生じさせる。）の表面上の抗原に結合するこれらの能力に対して試験し た。複合体の免疫反 応性を、フローサイトメトリー（flow cytometry）により、修飾及びＬ−ｄ（Ｉ −ＱI−Ｉ）への複合体形成を受ける前の抗体の標準調製物と比較した。標的の ＨＴ２９細胞（ヒト腺癌細胞系:ATTC）を、組織培養フラスコ内で１０％胎児ウ シ血清を添加したＭｃＣｏｙの培地を用いて細胞培養フラスコ内で群集的（conf luency）に成長させた。細胞を、細胞スクレイパー（cell scraper）を用いてフ ラスコ壁からかき落として回収した。多くの別々のフラスコから細胞を集め、ペ レットになるまで遠心分離し、０．１％ウシ血清アルブミン（Sigma）と０．０ ２％アジ化ナトリウムを添加した１５０mM塩化ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４（Ｐ ＢＳ）（フロー緩衝液）を有する氷冷５０mMリン酸ナトリウム溶液内で５×１０5 /mLで再懸濁した。細胞を、同じ緩衝液中で洗浄し、次いで計数した。抗体の標 準曲線を、関連性のない（非結合性の）アイソタイプに適合した対照抗体（ヒト ＩｇＧ1）を用いてＩＮＧ−１の保存溶液を希釈することによって構築し、ＩＮ Ｇ−１の含量が１０％から１００％までの範囲にある多くの試料を得た。標準曲 線を、それぞれの試料が１mLあたり１．０mgの抗体タンパク質を含むようにフロ ー緩衝液中で作製した。その後、標準曲線より得た試料および未知試料を５×１ ０5のＨＴ２９細胞を用いて４℃で１時間インキュベートした。未結合の抗体を 除くために入念に洗浄した後、細胞を１００μｌのフロー緩衝液に再懸濁し、蛍 光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いて標識されたヤギ−抗−ヒト抗体と ４℃で１時間インキュベートした。フロー緩衝液で さらに洗浄した後、試料をコールターＥＰＩＣＳ７５３フローサイトメーター（ Coulter EPICS 753 flow cytometer）でフローサイトメトリーにより分析した。 蛍光性イソシアナイトからの蛍光（ＦＩＴＣ）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）か らの蛍光をアルゴンレーザーの４８８nmの発光線（emiss-ion line）を用いて励 起した。出力を光調節モードにおいて５００mWにセットした。単一の細胞を９０ °及び前方の角度の光散乱により同定した。集合体や細胞残骸から単一の細胞を 分離するために分析ウインドウ（analysis windows）をこれらのパラメーターに 適用した。ＦＩＴＣとプロピジウム（propidium）に起因する蛍光を、５５０nm ロングパス二色性フィルター（long pass dichroic filter）を用いて分離し、 ５３０nmバンドパスフィルター（band pass filter）（ＦＩＴＣに対して）と６ ３５nmバンドパスフィルター（ＰＩに対して）を通して集めた。光散乱パラメー ターは積算されたパルス（integrated pulses）として集められ、蛍光は対数積 算されたパルス（log integrated pulses）として集められた。死細胞はＰＩの 取り込みに対して陰性の細胞に分析ウインドウを据えることにより分析から除外 された。試料あたりの平均蛍光（２５００細胞からの加重平均）を、それぞれの ヒストグラムに対して算出した。ＦＩＴＣの目盛り用ビーズ（calibration bead s）をそれぞれの実験において分析し、蛍光標準曲線を確立した。次いで、それ ぞれの試料に対する平均蛍光強度を細胞あたりの平均ＦＩＴＣ等量として示した 。免疫反応性を、未知の試料の平均蛍光強度と標 準曲線からの値とを比較することにより算出した。免疫反応性分析から、ＩＮＧ −１−マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−３’Ｌ−ｄ（Ｉ− ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇは、ＩＮＧ−１標準と同程度の約２／３の免疫反応性 があり、ＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−５ ’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇは約４／５の免疫反応性を示した。 別の一連の実験において、ＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）（３’複合体） とＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）（５’複合体）の免疫反応性を決定した 。これらの複合体の試料はまた、それらの見かけの分子量及び調製物の不均一性 を評価するために、ＳＤＳ緩衝液を用いてノベクス（Novex）６％ポリアクリル アミドゲル上で電気泳動にかけられた。同じゲル上で泳動された既知の分子量を もつ標準を用いて、移動した距離（Ｒf）と分子量の対数との間で標準曲線を作 製した。この標準曲線から、それぞれの複合体調製物に関連したバンドの相対分 子量を決定した。ＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）及びＩＮＧ−１抗体のＳ ＤＳ ＰＡＧＥゲルにより、ＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）複合体の分子 量は抗体のみのそれよりも大きいことが示された。 （１０ｄ）メルカプトアルキル−抗体とＴｅｇ−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ） −３’−マレイミドの複合体形成 ２０ｎモルのＴｅｇ−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−マレイミド（例 ９ｃからのもの）をＰＢＳｐＨ７中で ５ｎモルのメルカプトアルキル−ＩＮＧ−１（例８ｂからのもの）と反応させた 。混合後、反応を４℃で１６時間続け、ＩＮＧ−１−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ− マレイミド−３’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇを得た。反応混合物 続いて１０００ｇで２５分間遠心分離した。試料を新鮮なＰＢＳに再懸濁し、２ ６０nmと２８０nmでの光学密度の比が一定になるまでこの一連の遠心分離による 濃縮をさらに３回繰り返した。 同様の方法でマレイミド−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇをメ ルカプトアルキル−ＩＮＧ−１と反応させ、ＩＮＧ−１−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2− Ｓ−マレイミド−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇを得た。 （１０ｅ）抗体−マレイミドとＴｅｇ−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’− ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＳＨの複合体形成 ＰＢＳ中の６ｎモルのＩＮＧ−１−マレイミド（例８ａからのもの）試料を４ ０ｎモルのＴｅｇ−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2− ＳＨ（例９ｅからのもの）と４℃で１６時間反応させた。反応物をＰＢＳを用い て希釈し、ＰＤ−１０カラムからＰＢＳ中に溶出させ、ＩＮＧ−１−マレイミド −Ｓ−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−３’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’Ｔｅｇを 得た。生成物 の遠心分離で濃縮した。試料を新しいＰＢＳに再懸濁し、２６０nmと２８０nmで の光学密度の比が一定になるまでこの手順ををさらに３回繰り返した。 同様の方法で、ＨＳ−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ ）−３’−ＴｅｇをＩＮＧ−１−マレイミドと反応させ、ＩＮＧ−１−マレイミ ド−Ｓ−ＣＨ2−（Ｏ＝）Ｃ−ＮＨ−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅ ｇを得た。これらの試料の光学密度を２６０nmと２８０nmにて分光光度計で測定 した。次に、これらの２つの波長の光学密度の比を算出した。これらの波長のそ れぞれで、抗体とＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド（分子量約１６５ ００）についての既知の消光係数を用いることにより、抗体あたりのＬ−エナン チオメリックオリゴヌクレオチド分子の数を評価した。 （１０ｆ）抗体−マレイミド、Ａｂ−Ｍと５’−トリチル−（Ｓ）−Ｌ−ｄ（Ｉ −ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ2の複合体形成 例２ｃから得た５’−トリチル（Ｓ）−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−ＮＨ2 の試料（１０ｎモル）をＰＢＳに希釈し、硝酸銀水溶液を最終濃度８５mMになる まで加えた。ボルテックスの後、反応を３０分間室温で進行させた。遠心分離に より、沈殿をチューブの底に形成させた。５’末端にチオール基をもち、５’ト リチル基をもたないＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド（ＨＳ−５’− Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI −Ｉ）−３’−ＮＨ2）を含有する透明な上清液を、使用するまで４℃に維持し た。 ＰＢＳ中の６ｎモルのＩＮＧ−１−マレイミド（例８ａから）の試料を４０ｎ モルのＨＳ−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇと４℃にて１６時間 反応させた。反応物をＰＢＳで希釈し、前洗浄したエコノパック（Econopac）１ ０６−ＤＧカラム（BioRad）から４mLで溶出し、ＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ− ５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇを得た。生成物を１０００ｇ、２ ５分間の遠心 を新しいＰＢＳに再懸濁し、２６０nmと２８０nmでの光学密度の比が一定になる まで遠心分離による濃縮をさらに３回繰り返した。 これらの試料の光学密度を２６０nmと２８０nmで分光光度計で測定した。これ らの２つの波長の光学密度の比を算出し、抗体とＬ−エナンチオメリックオリゴ ヌクレオチド（分子量約１６５００）に対する既知の消光係数を用いることによ り、これらの波長のおのおのにおける抗体あたりのオリゴヌクレオチド分子の数 を評価した。 例１１ （１１ａ）ＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）に対するＬ−ｄ（ｃＩ）のアニ ーリング 例１０ａに従って調製されたＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（ ＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−３’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇ（２４ピコモ ル）の試料と、例１０ｄに従って調製されたＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（Ｃ Ｈ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−５’Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−３’−Ｔｅｇ（ ２５ピコモル）の試料を、１．０ｍＭＥＤＴＡおよび１００ｍＭＮａＣｌを含む ５０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．２中、室温にて、例３ｃで得た１６倍過剰のＬ−ｄ（ ｃＩ）とセパレートキュベット中で混合した。キュベットを２０℃に冷却して、 キャリー１３装置に入れ、キュベット温度を２０℃から８０℃まで上昇させ、次 いで０．５℃／分の速度で２０℃に戻される間中、ＵＶ光（２６０ｎｍ）によっ て吸光度を分析した。データの分析は、ｃＩが３’および５’複合体の両方にハ イブリダイズでき、各々と３三成分のコンプレックスを形成しうることを示して いた。ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ（例６から）を使用した同様の実験によ り、ＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−３’− Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇに対するＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭ Ｔのアニーリングが示された。 （１１ｂ）リン酸バッファーおよびヒト血清中での、90Ｙ− ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−90Ｙまたは90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（Ｉ）−Ｔ ＭＴ−90Ｙの何れかへのＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）のハイブリダイゼ イション ＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−３’−Ｌ −ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇ（４ｕｌ；１mg抗体／ml）溶液（例１０ａ から）および例９ａから得た５０マイクロＬの90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）− ＴＭＴ−90Ｙ溶液を、新たに調製されたヒト血清（２００mL）あるいはＰＢＳ（ ２００mL；ｐＨ７．２）と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで 、アリコートを８から１６％ゲル上でＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動にかけた。ゲル をオートラジオグラフィーおよびフォスフォイメージシステムの両方を使って検 査し、90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−90Ｙが、ヒト血清、並びにリン 酸バッファー溶液（ｐＨ７．２）中でＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）とハ イブリダイズできることが示された。試料をＰＢＳ中および血清中で１４日間室 温にて放置し、８から１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより、相互におよび ３７℃で２時間インキュベートされたゲルに対して同様のパターンを得た。この ことは、複合体が２週間まで血清中で安定であったことを示している。例９で得 られた90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（Ｉ）−ＴＭＴ−90Ｙは予測されたようにいずれの 時においてもＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）ハイブリダイゼイションを示 すことはなかった。 （１１ｃ）ＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）に対する90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ （ｃＩ）−ＴＭＴ−90Ｙのハイブリダイゼイション ＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−３’Ｌ− ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇ（４ｕｌ；１mg／ml；例１０ａから）および ５０μｌの90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−90Ｙ（例９ａから）の溶液 をＰＢＳ（２００ｕｌ；ｐＨ７．２）中で混合し、６０分間３７℃でインキュベ ートした。次いで、これらの混合物のアリコートを８から１６％ゲルでＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動にかけた。該ゲルをフォスフォイメージャーシステムでオート ラジオグラフィーを行い、90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−90ＹをＩＮ Ｇ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）とハイブリダイズできることが示された。 （１１ｄ）ＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）とハイブリダイズしたＴＭＴ− ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ上のＴＭＴを検出するためのウエスタンブロッティング 例２ａで得られたＬ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）あるいは例１０ａで得られたＩＮＧ −１−マレイミド−３’−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−Ｌ−ｄ（I −ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇのサンプルを、例６で得られたＬ−エナンチオメリ ックオリゴヌクレオチドＴＭＴ複合体、ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴと混合 した。各反応混合物を１０分間氷上に保持し た。これらの反応混合物のアリコートをＳＤＳバッファーと混合し、２枚の同一 の８から１６％ポリアクリルアミドゲルに導入した。ゲルを２時間定電圧で電気 泳動にかけた。１枚のゲルを、製造者のプロトコール（Hoefer セミドライ 転 写法）に従って２０分間ＣＡＰＳバッファーを用いてニトロセルロース紙上に電 気ブロットした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、ゲ ルを１時間室温で、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロックした。続いてＴｗｅｅｎ ／ＰＢＳでさらに洗浄し、ゲルをネズミ抗−ＴＭＴ抗体溶液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅ ｎ中に１０mg/ml）でオーバーレイし（overlaid）、室温で一晩放置した。ウエ スタンブロットを、西洋わさびペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗−マウスＩ ｇＧ抗体（バイオラド ウェスタンブロットキット）およびパーオキシダーゼ基 質を使って行った。ブロットにより、ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴがＬ−ｄ （Ｉ−ＱI−Ｉ）あるいはＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）のいずれかを含む バンドにハイブリダイズされたＴＭＴを介して検出できることが示された。 ２枚目のゲルを、エチジウムブロマイド（蒸留水中に５mg/ml）で染色した。 ＵＶ光の下で、染色されたゲルを試験することにより、再びハイブリゼイション が示された。 例１２ 直接の複合体形成（ＩＮＧ−１／ＴＭＴ）によるＡｂ−ＴＭＴの調製 ＴＭＴ−ＮＣＳ（あるいはそれらの適切な誘導体）は、抗体分子と複合体を形 成でき、抗体可変領域によって認識される標的抗原に結合する能力を示す抗体− ＴＭＴ複合体分子が生じる。この様な複合体分子は、この様な免疫複合体によっ て標的とされる病巣に局在化および／またはこれを治療するために、ＴＭＴ部分 によってキレートされる金属イオンを運ぶために使うことができる。一つの好ま しい態様では、該抗体が、腫瘍細胞上で発現される抗体分子と広い反応性を持つ ように選択され、これによって治療あるいは診断をするという目的のために、腫 瘍に金属を運ぶことができる抗体−ＴＭＴ複合体が提供せれる。キメラ抗体、Ｉ ＮＧ−１は、（国際特許公開ＷＯ ９０／０２５６９）ネズミ可変領域およびヒ ト免疫グロブリン不変領域からなる。抗体は、上記参照文献に開示されているよ うに、キメラ抗体を基本的に発現するネズミミエローマ細胞系を培養することに よって生産される。精製後、ＩＮＧ−１は５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１５０ mM塩化ナトリウムバッファー、ｐＨ５．６中で５．０mg/mLの濃度で使用される 。 ＴＭＴ−ＮＣＳとＩＮＧ−１との複合体形成は、抗体溶液がｐＨ９．０に達す るまで、ＩＮＧ−１に１．０Ｍ炭酸塩、１５０mM塩化ナトリウムバッファーｐＨ ９．３を最初に添加することにより達成される。次いで、５mgのタンパクを含ん でいるＩＮＧ−１溶液の試料を、酸で洗浄した円錐形（conical）のガラス反応 バイアル中にピペットで加えた。ＴＭＴ−ＮＣＳ溶液を、１０mLの１．０Ｍ炭酸 塩、１５０mM 塩化ナトリウムバッファー、ｐＨ９．０中に、１００ｍｇ溶解することによって 調製した。複合体形成反応は、抗体に９６．５mLのＴＭＴ−ＮＣＳ溶液を添加し 、ＩＮＧ−１に対し４倍モル過剰のＴＭＴ−ＮＣＳを供給することによって開始 した。この溶液を手短に撹拌して反応物を混合し、次いで室温で暗所に放置した 。１６時間後、１５０mM塩化ナトリウムバッファー、ｐＨ５．６中において５０ mM酢酸ナトリウムで予備洗浄され、平衡化されているＰＤ１０クロマトグラフィ ーカラムを反応混合液に適用することによって、複合体を形成していないＴＭＴ からＩＮＧ−１／ＴＭＴ複合体を分離した。純粋な複合体は同様のバッファー２ ．５mLを用いカラムから溶出される。 例１３ ＩＮＧ−１／ＴＭＴ複合体の分析試験 （１５ａ）抗体に対するキレーター（chelator）比の分析 複合体溶液中のＩＮＧ−１のタンパク濃度を、標準タンパクとしてウシ免疫グ ロブリンを用いたバイオラドタンパク測定法によって決定した。 抗体あたりの機能性ＴＭＴ分子の数を計算するために、ＴＭＴの金属を結合す る容量が飽和するまで、塩化ユーロピウム溶液を反応させた。０．０５Ｍトリス ＨＣｌバッファーｐＨ７．５中において２．５mlのＩＮＧ−１／ＴＭＴの０．３ ７５mgアリコートを、５mlの水晶キュベット中にピペットで取り出した。０．０ ５ＭトリスＨＣｌバッファーｐＨ７． ５中で２０mM塩化ユーロピウム（塩化ユーロピウム６水和物、アルドリッチ）溶 液を調製した。この塩化ユーロピウム溶液のアリコート（５０mL）をＩＮＧ−１ ／ＴＭＴを含んでいるキュベットに添加し、得られた液体を、キュベット中に置 かれた小さな磁気撹拌棒を用いて、１０分間室温で磁気撹拌器でゆっくりと撹拌 した。金属−ＩＮＧ−１／ＴＭＴコンプレックスの蛍光を、３４０nmの励起波長 を用いてパーキンエルマーＬＳ５０蛍光光度計で決定した（１０nmスリット幅） 。蛍光発光を、１０nmスリット幅で４３０nm除去フィルターを用いて６１８nmで モニターした。上記の方法を繰り返し、蛍光の読取りを各々の添加の後行った。 塩化ユーロピウムのアリコートを、蛍光強度の増加が前の読取り値の５％以下に なるまで添加した。試験溶液の容量の変化を補正するために、希釈の補正を各々 のモル比で測定された蛍光強度に対して行った。ＩＮＧ−１／ＴＭＴ複合体上の 各々のキレート部位は１つのユーロピウムイオンに結合するため、およびユーロ ピウムイオンは蛍光が発生するキレート部位に存在しなければならないため、こ の方法により機能的なキレート部位の数を定量化できる。 この方法を使用すると、抗体分子あたりのＴＭＴ分子比は０．３：１から２： １の範囲である。 （１３ｂ）ＥＬＩＳＡによるＩＮＧ−１／ＴＭＴ免疫反応性測定 抗体、ＩＮＧ−１が結合する抗原を、細胞スクレーパーで 培養フラスコの壁から、集密した単層の細胞を集めることによってＬＳ１７４Ｔ あるいはＨＴ２９細胞（アメリカン タイプ ティッシュ コレクション、ＡＴ ＴＣから入手）から調製した。多数のフラスコの細胞を一緒にし、サンプルを取 り出し、計数して、集めた細胞の総数を決定した。このあいだ中、細胞を氷上に 保存した。続いて４℃で１０分間１５００rpmで細胞を遠心し、該細胞を氷冷し た１５０mM塩化ナトリウムを添加した氷冷の５０mMリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．４（ＰＢＳ）の２５mLで一度洗浄し、同様の条件下でペレット化し、氷 冷したガラスモルタルへ１０mLＰＢＳで移した。細胞をモーター駆動ペッスルを 使用して４℃でホモジナイズし、次いで５分間３０００×ｇで遠心した。抗原が 豊富な上清を、他の細胞破砕物から除去し、４℃で一時間１００，０００×ｇで さらに遠心した。この最終段階からのペレット（抗原分画）を、集められた１０ ０万細胞ごとにＰＢＳ１００mL中に懸濁した。続いてタンパク濃度を評価し（標 準タンパクとしてウシ免疫グロブリンを使用するバイオラドＢＣＡタンパク測定 法）、抗原を使用するまで−２０℃で保管した。９６ウェルコースターミクロタ イタープレートの各々のウェルを、上述したように調整された１００mL／ウェル の細胞溶解物（１０mg/ml）を添加することによって抗原でコートした。ミクロ タイタープレートを３７℃のインキュベーターで一晩乾燥した。０．０５％Ｔｗ ｅｅｎ２０（シグマ）でプレートを５回洗浄した後、それらをブロッティングし て乾燥した。各々のプレートのウェルをＰＢＳ中の１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマＡ−７９０６）溶液の１２５mL／ウェルを 添加することによってブロックし、室温で１時間インキュベートした。プレート を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。ＩＮＧ−１／ＴＭＴ複合体試料 （同じものを２つ、５０mL／ウェル）および標準ＩＮＧ−１抗体溶液を１％ＢＳ ＡのＰＢＳ中で所定の濃度範囲で調製した。ビオチン化したＩＮＧ−１（０．１ ％ＢＳＡ中で１．０mg/mL）を各々のウェル（５０mL／ウェル）に添加し、次い でプレートを室温で２時間インキュベートした。続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ２ ０で５回洗浄し、該プレートをブロッティングして乾燥し、希釈された（０．１ ％ＢＳＡ中で１：２０００）ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（ ターゴ；＃６５６７）を用いて１時間室温でインキュベートした。さらに５回洗 浄した後、ホスファターゼ基質試薬（シグマ）を一ウェルあたり１００mL添加す ることによって各々のウェルで発色させた。室温にて一時間後、色をタイターテ ックマルチスキャン ミクロプレート リーダーで４０５nmフイルターを用いて 記録した。 この方法によって試験したとき、ＴＭＴとＩＮＧ−１の免疫複合体は本来のＩ ＮＧ−１と比較して免疫反応性を持つことが見出された。 （１３ｃ）フローサイトメトリーによるＩＮＧ−１／ＴＭＴ免疫反応性測定 標的ＨＴ２９細胞を１０％胎児ウシ血清を添加されたマッ コイの培地を用いて組織培養フラスコ中で集密するまで育成した。該細胞を細胞 スクレーパーでフラスコ壁をこすることによって集めた。多数の別々のフラスコ から細胞を集め、ペレット化するまで遠心し、０．１％ウシ血清アルブミン（シ グマ）および０．０２％アジ化ナトリウム（フローバッファー）を添加した１５ ０ｍＭ塩化ナトリウムを有する５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７． ４（ＰＢＳ）の氷冷溶液に５×１０5／mLで再懸濁した。該細胞をこれと同じバ ッファーで洗浄し、次いで計数した。抗体標準曲線を、無関係な（非結合）、ア イソタイプが一致した対照抗体（ヒトＩｇＧ1）でＩＮＧ−１を希釈することに より作製し、ＩＮＧ−１含有量が１０％から１００％の範囲である沢山の試料を 得た。標準曲線は、各々の試料が１mLあたり１．０mgを含むようにフローバッフ ァー中で作成される。次いで、標準曲線および未知の試料を、１時間４℃で５× １０5のＨＴ２９細胞とインキュベートした。未結合の抗体を除くため念入りに 洗浄した後、該細胞を１００mLフローバッファーに再懸濁し、蛍光性イソチオシ アネート（ＦＩＴＣ）でラベルしたヤギ−抗−ヒト抗体で１時間４℃でインキュ ベートした。フローバッファーで更に洗浄した後、試料をコールターＥＰＩＣＳ ７５３フローサイトメーターを用いフローサイトメトリーによって分析した。蛍 光性ＦＩＴＣおよびプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）をアルゴンレーザーの４ ８８nmの発光線を用いて励起した。出力を明調節（light regulation）モードの ５００mWにセットした。単一の細胞を９０度および前方の 角度の光散乱によって同定した。凝集および細胞破砕物から単一の細胞を分離す るために、これらのパラメーターに分析ウインドウを適用した。ＦＩＴＣおよび プロピジウムからの蛍光を５５０nmロングパス２色性フィルターで分離し、５３ ０nmバンドパスフィルター（ＦＩＴＣ）および６３５nmバンドパスフィルター（ ＰＩ）を通して集めた。ライトスキャッターパラメーターを積算された信号とし て集め、蛍光を対数積算された信号として集めた。死んだ細胞をＰＩ取り込み陰 性細胞に対する分析ウインドウをおくことによって測定から除いた。試料あたり の平均蛍光を（２５００細胞からの加重平均）各々のヒストグラムから計算した 。ＦＩＴＣの目盛り用ビーズを各々の実験で分析し、標準曲線を確立した。次に 、各々の試料に対する平均螢光強度を細胞あたりの平均ＦＩＴＣ等量として表し た。免疫反応性は、未知試料の平均蛍光強度と標準曲線からの値を比較すること によって計算される。ＩＮＧ−１／ＴＭＴの試料はこの方法によって本来のＩＮ Ｇ−１抗体と比較しうる免疫反応性の値を有する。 （１３ｄ）分子ふるいＨＰＬＣによる凝集形成の決定 同じ材料のガードカラムを備えた３０cm×７．５mmのＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ 分子ふるい（size-exclusion）ＨＰＬＣカラム（スペルコ）を、４００〜６００ ＰＳＩで１分あたり１．０mlの流速で、ウォータース６００Ｅ ＨＰＬＣ系を用 い１５０mM塩化ナトリウムを添加した１０mMリン酸ナトリウムバッファーにより １２倍のカラム容量で平衡化した。 バイオラド ゲル濾過タンパク標準の試料（２５mL）をカラム上に注入した。各 々の標準の保持時間を２８０nmにセットされたウォータース４９０ＵＶ検出器に よってモニターした。続いてカラムから最後の標準を回収し、カラムを１５０mM 塩化ナトリウムを添加した１０mMリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．０の１０ 倍容量でさらに洗浄した。２００mg/mLの、本来のＩＮＧ−１抗体あるいはＩＮ Ｇ−１／ＴＭＴの試料（５０mL）をカラムに注入し、保持時間を記録した。保持 ピークの面積および保持時間から、ＩＮＧ−１／ＴＭＴ試料中の凝集物質の量が 計算された。 この方法によると、本来のＩＮＧ−１抗体は９．１分の保持時間である。ＩＮ Ｇ−１／ＴＭＴは、９．１分での主要ピークも持っているが、凝集に起因するマ イナーなピークが、７．３分にも時々観察される。ピーク面積の比較によって、 該凝集ピークは全体の５％以下である。 （１３ｅ）90ＹによるＩＮＧ−１／ＴＭＴの放射ラベル化 放射性塩化イットリウムの所定容量を（比活性＞５００Ci/mgで０．０４Ｍ塩 化水素酸中90Ｙ）、２倍容量の０．５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６．０を用いて中和 した。該中和した90Ｙ（１．０mCi）を、１５０mM塩化ナトリウムを含む５０mM 酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．６中のＩＮＧ−１／ＴＭＴ（１mg/mL）１． ０mLに添加した。標識化を一時間行ない、次いで反応混物を、１５０mM塩化ナト リウムを有する５０mMリン酸ナトリウムｐＨ７．４（ＰＢＳ）を含むバッファ ーで予備洗浄され、平衡化されたＰＤ−１０クロマトグラフィーカラムに導入し た。該試料を１．５mLのＰＢＳでカラムから溶出した。放射性標識されたＩＮＧ −１／ＴＭＴの分画を（０．５mL）集め、放射活性を測定し、貯蔵した。１．０ mLの試料を取り、ゲルマンＩＴＬＣ−ＳＧ紙片上にそれをスポットすることによ って標識化効率を決定した。紙片は０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ６．０を含 むガラスビーカー中で、数分間、溶媒の先端が紙の先端に対して四分の三に達す るまで展開された。紙片を90Ｙに対して最適化され、コンパック３８６／２０ｅ コンピューターによってコントロールされているシステム２００イメージスキャ ナー（バイオスキャン）中に挿入した。この系では遊離の90Ｙは溶媒の先頭に移 動し、一方ＩＮＧ−１／ＴＭＴ（90Ｙ）は原点に残っている。 この系の使用によって、全90Ｙ放射活性の９８％以上が原点で、ＩＮＧ−１／ ＴＭＴと関係していることが通常見出される。 （１３ｆ）蛍光性金属によるＩＮＧ−１／ＴＭＴのラベル化 配位領域に接近して保持された芳香族部分を含有するキレート剤にユーロピウ ム（３+）のようなランタニドを結合することによって「増感された」蛍光がも たらされる。この場合、光が、芳香族系を介して吸収され、このエネルギーが金 属に移動する。次いで該金属は、非常に大きいストークスシフトおよび数秒まで の蛍光寿命によって特徴付けられる発光を起こす。０．０５ＭトリスＨＣｌバッ ファーｐＨ７．５中 の２．５mLのＩＮＧ−１／ＴＭＴの０．５mgアリコートを、小さな撹拌棒を含む ４mlの円錐型反応バイアル中にピペットで加えた。０．０５ＭトリスＨＣｌバッ ファーｐＨ７．５中の２５０mM塩化ユーロピウム（塩化ユーロピウム６水和物： アルドリッチ）溶液を調製した。この塩化ユーロピウム溶液のアリコート（５０ mL）を、ＩＮＧ−１／ＴＭＴを含む反応バイアルに添加し、得られた溶液を室温 でマグネチックスターラーで非常にゆっくりと攪拌した。標識化を１時間実施し 、次いで反応混合物を、１０mMリン酸ナトリウムおよび１５０mM塩化ナトリウム ｐＨ６．０（ＰＢＳ）を含むバッファーで予備洗浄され、平衡化されたＰＤ−１ ０クロマトグラフィーカラムに導入した。試料を３．５mLＰＢＳでカラムから溶 出した。金属−ＩＮＧ−１／ＴＭＴコンプレックスの５０mL試料の蛍光を、３４ ０nmの励起波長（１０nmスリット幅）を用いてパーキンエルマーＬＳ５０蛍光光 度計で決定した。蛍光発光を１０nmスリット幅および４３０nm除去フィルターを 用いた６１８nmで記録した。ＩＮＧ−１／ＴＭＴ複合体上の各機能性キレート部 位が１つのユーロピウムイオンと結合した。この方法を使って、０．１から３の 間の蛍光ユーロピウムイオンが抗体１分子あたりに結合された。 例１４ （１４ａ）ＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）で処理された細胞への蛍光Ｌ− ｄ（ｃＩ）の結合のフローサイトメトリー ＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−３’−Ｌ −ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’Ｔｅｇを例１０ａのように調製した。ＩＮＧ−１− マレイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−５’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI −Ｉ）−３’−Ｔｅｇを例１０ｂのように調製した。蛍光標識されたＣＹ５．１ ８−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）を例２ｄのように調製した。蛍光標識されたＣＹ５ ．１８−Ｌ−ｄ（ｃＩ）およびはＣＹ５．１８−Ｌ−ｄ（Ｉ）を例３ｅのように 調製した。蛍光色素ＣＹ５．１８をＦＩＴＣに置き換えて使用した以外は、フロ ーサイトメトリーを、本質的に１２ｃに記載したように行った。ＨＴ−２９細胞 を（０．５×１０6）ＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）試料の各々１mgと共に ３０分間氷上でインキュベートした。細胞をフローバッファーで２回洗浄し、洗 浄する間に１４００ｒｐｍ×５分でペレット化した。次に、各々の試料中の細胞 を、５mgＣＹ５．１８−Ｌ−ｄ（ｃＩ）あるいはＣＹ５．１８−Ｌ−ｄ（Ｉ）を 用いて３時間氷上でインキュベートした。いくつかの細胞をＣＹ５．１８−Ｌ− ｄ（ｃＩ）およびＣＹ５．１８−Ｌ−ｄ（Ｉ）単独でインキュベートした。フロ ーバッファーで丹念に洗浄した後、細胞を蛍光活性化セルソーターで分析にかけ た。ＣＹ５−１８の目盛り用ビーズ（calibration beads）を分析し、相対的な 蛍光強度に対するＣＹ５−１８の標準曲線を確立した。試料当りの平均蛍光（２ ５００細胞からの加重平均）を各々のヒストグラムに対して計算した。次に、各 々の試料に対する平均蛍光強度を、細胞当りの平均ＣＹ５−１８等量と して表わした。フローバッファーの変わりに１００％胎児ウシ血清を成分とする 培地を、細胞をインキュベートするために使用して同様な実験を行った。 予備実験により、ＨＴ−２９細胞の表面でのＩＮＧ−１−マレイミド−Ｓ−（ ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−３’Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）−５’−Ｔｅｇ に対するＣＹ５−１８Ｌ−ｄ（ｃＩ）のハイブリダイゼイションを最大にするた めの時間は約３時間である。各々の調製物におけるハイブリダゼイションの程度 には、フローバッファーと１００％ＦＣＳの間には差がなく、このことは、末端 がキャッピングされたＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド鎖がヌクレア ーゼ消化に対して安定であることを示唆している。多量のＣＹ５．１８−Ｌ−ｄ （ｃＩ）は、細胞表面に結合された両方の複合体にハイブリダイズできる。蛍光 性Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドそれ自身によるか、または複合体 に対するＣＹ５−１８−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）のハイブリダイゼイションによ る該細胞への非特異的結合は相対的に小さかった。 （１４ｂ）ＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）で処理されたＨＴ−２９細胞へ の90Ｙ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−90Ｙの結合 ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴを例７に開示されたように０．１mCi／ｐモ ルの比活性に標識化した。ＩＮＧ−１−ＴＭＴ−90Ｙを例１３ｅのように調製し た。ＩＮＧ−１−マ レイミド−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｃ（＝ＮＨ2 +）−ＮＨ−３’−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI− Ｉ）−５’−Ｔｅｇを例１０ａのように調製した。１０％胎児ウシ血清を添加し たＤＭＥＭ培地中に、各々１×１０5ＨＴ−２９細胞を含む３つのチューブを調 製し、全体に渡って４℃で保管した。添加された抗体の量が等しくなることを保 証するために、すべてのチューブに一致したタンパク濃度を使用し、チューブを 以下の表１に示されるように処理した。 試料１および試料３は、細胞ペレットに関係した放射活性が、試料２（直接に 標識されたＩＮＧ−１−ＴＭＴ90Ｙ）よりも高いことを示し、このことは２つの 別々の成分からなる輸送システムが、直接に標識化された抗体よりも、多く放射 活性を運ぶことができることを示唆している。 （１４ｃ）ＨＴ−２９細胞およびＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ− ＱI−Ｉ）で処理されたＨＴ−２９細胞へのユーロピウムで標識されたＩＮＧ− １／ＴＭＴおよびＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴのそれぞれの結合 ＴＭＴ−Ｌ−（ｃＩ）−ＴＭＴ複合体を例６ａで説明したようにユーロピウム イオンで標識し、ＩＮＧ−１／ＴＭＴを例１３ｆで説明したようにユーロピウム イオンで標識した。標準曲線を、１００ピコモル／１００マイクロＬから６フェ ムトモル／１００マイクロＬの濃度範囲で両方の複合体に対して作成した。ＨＴ −２９細胞を、１０％ＦＣＳおよび５０マイクログラム／mlのゲンタマイシンを 含むマッコイ培地中で集密するまで成育した。該細胞をリン酸緩衝生理食塩水で 洗浄し、５mlトリプシンベルセン（Trypsin Versene）を添加した。次いで、Ｈ Ｔ−２９細胞を１５分間５％ＣＯ2中で３７℃にてインキュベートし、完全培地 （５ml）を添加し、細胞を除去し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＨＴ−２９細胞 を、３０分間４℃にて１０6細胞当たり１０マイクログラムの切断されたサケ精 子（天然のＤ−エナンチオマー）ＤＮＡでブロックし、ＰＢＳで洗浄し、以下の ようなハイブリダイゼイション測定に使用した。５×１０5のＨＴ−２９細胞を 、Ｉｎｇ−１／ＴＭＴあるいはＩｎｇ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）の１００マ イクロＬワーキング希釈に添加し、混合物を氷上で３０分間インキュベートした 。細胞を５分間１４００ＲＰＭで洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０ ．０１％ＮａＮ3）２mlで２回洗浄した。次いで、ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−Ｔ ＭＴのワーキング希釈（１００マイクロＬ） を適切なチューブに加え、反応混物を３時間氷上でインキュベートし、続いて５ 分間１４００ＲＰＭにおいて２mlの洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋ ０．０１％ＮａＮ3）で２回洗浄した。 各々の結合実験を３回行った。上述の結合およびハイブリダイゼイションの後 、細胞懸濁物を使用するまで試験管内で４℃にて保管した（１０分から１時間） 。ボルテックスにかけた後、コースターＥＩＡ／ＲＩＡ９６ウェルプレートの別 々のウェルの４か所に各チューブから１００マイクロＬアリコートを取ることに よって、ユーロピウムの蛍光を、デルフィア１２３２時間解析フルオロメーター で測定した。この結果を例１５ｆに示したように加工した。Ｅｕ−ＴＭＴ−Ｌ− ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−Ｅｕで処理した細胞の１秒当りの計数（ｃｐｓ）をバック グラウンドとして考慮し、ハイブリダイゼイション実験からのｃｐｓデータから 差し引いた（Ｅｕ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−Ｅｕ／Ｉｎｇ−１−Ｌ− ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ））。この結果およびＩｎｇ−１／ＴＭＴ−Ｅｕ結合実験から のｃｐｓデータを、独立に作成された個々の標準曲線からの細胞当りのピコモル の結合ＴＭＴ分子として解釈した。 結果は１秒当りの蛍光計数（ｃｐｓ）あるいは１０5細胞当りのピコモルの数 （＃）として示されている。５×１０5細胞当り、ＩＮＧ−１／ＴＭＴ−Ｅｕお よびＩＮＧ−複合体：０．２５マイクログラムまたは１．６５ピコモル；Ｅｕ− ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−Ｅｕ：１００ｎｇある いは１５ピコモル。ＩＮＧ−１−ＴＭＴおよびＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI− Ｉ）をそれぞれ形成するためのＴＭＴ、およびＬ−ｄ（Ｉ−ＱI−Ｉ）によるＩ ＮＧ−１の同程度の修飾をするために、後者においては、Ｅｕが添加され、ＩＮ Ｇ−１／ＴＭＴからＩＮＧ−１／ＴＭＴ−Ｅｕを形成した場合、これに対して、 Ｅｕ−ＴＭＴ−Ｌ−ｄ（ｃＩ）−ＴＭＴ−ＥｕがＩＮＧ−１−Ｌ−ｄ（Ｉ−ＱI −Ｉ）に添加され、ハイブリッドを形成した場合のぞれぞれで、蛍光の増加若し くは増幅がみられた。 本発明を、その幾つかの好ましい態様に特に関連させて詳細に説明した。しか し、本発明の意図および展望の範囲内で変更および修飾を行いうることが理解さ れるであろう。 Detailed Description of the InventionL-Enantiomer consisting of immunoreactive agent and chelated radionuclide Tumor with oligonucleotide complex                         Targeting Field of the invention   The present invention is directed to sequential targeting and delivery of immunoreagent compositions comprising the steps of: With a non-radioactive targeting immunoreagent and a second radiotransport drug Imager for treating and diagnosing cancer with a sequential delivery system targeting cancer It relates to what is particularly found to be used in The present invention also provides tumor treatment and treatment. And bifurcated tumor targeting for diagnostic and diagnostic imaging  tumor targeting) vector and transport vector, L-enantiomeric A ligonucleotide, a complementary L-enantiomeric oligonucleotide, and It relates to a novel method for attaching a chelate.Background of the invention   Used in diagnostic imaging and therapeutic applications with targeting The various radiolabeled immunoreactive proteins and methods currently available are It has some disadvantages. For example, an immunoreactive tamper containing a radioisotope. Radioimmunotherapy and diagnosis using various radiopharmaceuticals currently available, including Abnormal imaging shows that these radiopharmaceuticals bind to non-targeted normal tissue So it's never the best Cannot be This binding results in unwanted toxicity to normal tissue during therapeutic applications. And high background background in diagnostic imaging applications. Can cause gnul. Protein and release in the conjugate preparation Inefficient covalent attachment of the radioactive component results in the release of the radioactive component, which is then As it can be distributed to healthy tissues, it can be another problem. Currently available radioactivity The immunoreactive protein containing ligands has a long plasma half-life Due to the slow body discharge, normal cells are exposed to radiation for a long time, which is affected by radiation. Tissue in the body that can cause mage and is free of other normal disorders, especially this Cells that are most sensitive to tissue and radiation damage, such as bone marrow stem cells and It can lead to unacceptable toxic effects in the gastrointestinal tract. With immunoreactive proteins The number of ionic radioisotopes that can be bound is the number of sites available for chelation. Increase the number of chelating agents complexed with the protein, An increase in the number that can be achieved by reducing the immunoreactivity of the protein. Russ. This can limit the number of such chelating agents that can bind to the protein . The number of chelating agents that can bind to immunoreactive protein is The number of available groups such as amino groups suitable for use in the case of Can be recognized by a haptenized host immune system when highly derived It is also limited by the potential immunogenicity of proteins so modified.   The purpose of the present invention is to identify the currently available radiolabeled immune response. It is to overcome some of the above disadvantages of responsive proteins.   Nucleic acid in the form of deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) is It encodes and transcribes genetic information for cellular synthesis of proteins and enzymes. Present in nature The nucleic acid used in DNA is 2'-deoxyadenosine (dA), 2'-deoxy Guanosine (dG), 2'-deoxycytidine (dC), and thymidine (T) In RNA, adenosine (A), guanosine (G), cytidine ( C) and uridine (U). Containing a 2'-O-methylribosyl group Nucleic acid having, and NFour, NFour-Dimethyladenine and N7-Methylguanidine A naturally occurring modified nucleic acid, such as a nucleic acid containing It is found in A, transfer RNA, and ribosomal RNA. Nukure Intraosidic phosphodiester bonds in RNA and DNA respectively 3'of the sugar moiety of D-ribose or D-deoxyribose of one nucleoside -At the oxygen position of the hydroxyl group, D-ribose or D-of the other nucleoside Attaching a nucleotide to the oxygen of the 5'-hydroxyl group of the sugar moiety of deoxyribose To do. Separate strands of nucleic acid are linked between complementary pairs of nucleoside purine and pyrimidine bases. That is, in DNA, adenine and thymidine, guanine and cytosine, and RNA Through hydrogen bonds formed by adenine and uracil and guanine and cytosine Interact with each other. Two separate oligonucleotide strands or Is a sequence of bases in two regions of a single strand, if the sequences are complementary to each other, Supplement Specific sequences may hybridize to each other through hydrogen bonds between complementary base pairs. And a right-handed double helix with a B-type conformation (right- form a handed double he-lix). Two phosphate-ribose of this helix The ester backbone is antiparallel.   In naturally occurring DNA, each nucleoside unit has a D-enantiomer. Is. This structure is R1Is H and "base" is adenine, guanine, thymine Alternatively, 1 '-(b), 3' represented as a schematic diagram in structure I representing a cytosine moiety. -(A), and of the D-deoxyribose ring having a substituent at the 4 '-(b) position Defined by chirality. Even with naturally occurring RNA, each nucleoside unit Is a D-enantiomer, the structure of which is R1Is OH and the "base" is As a schematic diagram in structure I representing a denine, guanine, uracil or cytosine moiety Represented by 1 '-(b), 2'-(a), Kira of D-ribose ring having substituents at 3 '-(a) and 4'-(b) positions Defined by the ritivity. Both naturally occurring DNA and RNA contain phosphate Diesters and bases do not contain chiral centers.   P. S. Miller, Bioconjugate Chem. 1990,1, 187-191 , Composed of the D-enantiomer formed to match the natural form, by synthesis The prepared oligonucleotide is a primer for an enzyme that polymerizes nucleic acid, When constructing artificial genes to prepare proteins by recombinant DNA technology As a synthon for and to detect and characterize cellular nucleic acid sequences. Used as a robe. In addition, synthetically prepared oligonucleosides Tide is used for controlling gene expression in living cells and for viral It is being studied as a therapeutic agent in inhibiting replication and treating cancer. These applications Of synthetic and natural D-enantiomer oligonucleotides It owe it to its specific complementary binding properties to the target sequence.   Prepared synthetically composed of naturally arranged D-enantiomers Oligonucleotides have been obtained in a variety of ways, of which the most effective Methods include E. Uhlmann and A. Peyman by Chemical Reviews, 1990,90544 in Solid phase synthesis via a phosphoramidite intermediate, and H-phos, as disclosed. Included is solid phase synthesis via a phonate intermediate. In the phosphoramidite method, D-E An extended DNA oligomer chain of enantiomers, the exo of these bases The cyclic amine group has an amide protecting group, and the oligomer chain is attached to the solid support. The combined 5'-hydroxy group of 1H-tetrazole as a catalyst Activated D-nucleoside 5'-O-dimethoxytrityl-3 'in the presence Reacts with-(2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite It Commonly used protecting groups include adenine and cytosine exo ring amino groups. As a protecting group for benzoyl group and a protecting group for the exo ring amino group of guanine Then there is an isobutyl group. Any unreacted 5'-hydroxyl group is 4-N By reacting with acetic anhydride in the presence of N, N-dimethylaminopyridine. Closed with Tate. Next, the obtained phosphite is oxidized with iodine to obtain triphosphoric acid. Form an ester. 5'-O-dimethoxytrityl group is used with dichloroacetic acid Removed under acidic conditions, this series of reactions is replaced by another activated D-nucleotide 5 '-O-dimethoxytrityl-3- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylpropionate L) Repeat with phosphoramidite. At the end of this series of reactions, By removing the amide protecting group of cleotide and treating with ammonium hydroxide. Cleave the oligonucleotide from the support. Next, precipitate the oligonucleotide Purify or isolate by methods such as electrophoresis, electrophoresis, or chromatography.   Application of synthetic D-enantiomeric oligonucleotides in vivo Many are oligomerized by nucleases that are encountered both extracellularly and intracellularly. To be destroyed More limited. Bioconjugate Chem. 1990, 1, 165 by J. Goodchild. To introduce resistance to the activity of nucleases as outlined in The strategy involves modification of the nucleoside base and the phosphate of the polymer backbone. And modifications of the ribose component are included. These are all modified oligonucleotides The naturally occurring D-enantiomer DNA or An enzyme that hybridizes with RNA or uniquely recognizes the D-enantiomer It has to be done to combine.   Conversion at the 1'-ribose site to form the α-anomer shown in structure II Oligonucleoside chirality as can be achieved through a single modification The effect of the properties of D-oligonucleotides has been reported by Bloch et al Gene, 1988, 72,3. Being researched in 49. They found that the α-anomeric DNA was complementary to the beta-anomer. Mer RNA, a naturally occurring enantiomeric oligomer and hybridizer To form an a: b DNA: RNA hybrid, and the hybrid is It was found to be resistant to Rhease.   Thuong and Chassingol, Tetrahedron Letters, 1988,29At 5905 , 2-methoxy-6-chloro-9- (5-hydroxypentylamino) acridi And a-d-T, a-d-C covalently attached to the amino acid with 5'-phosphate, and And an ad-A containing oligo-a-deoxynucleotide cyanoethylphos We reported solid-phase synthesis using foramidite synthon. Do not have an acridine part That similar oligo-a-deoxynucleotides are resistant to nucleases , And natural D that is more stable than hybrids with b-deoxynucleotides -It has been reported to form a hybrid with RNA. Morvan et al Nucleic Acid Research, 1988,16, 833, a-d-T, a-d-C, a Oligo-a-deoxynucleotides containing -dG and ad-A They are double-helix hybrid, or parallel and anti-parallel directions. Complementary with each sex To form a double strand with a and b. ) Production. These duplexes , Retains specific Watson-Crick type base pair specificity, and this heteroduplex has B -Indicated to belong to the DNA family. These also exist in the corresponding natural It showed higher thermal stability when compared to the existing bb-DNA double helix. Only And again, the target oligomer is a naturally occurring D-oligomer. It was   The complete inversion of all chiral sites in the D-enantiomer in structure I is a mirror image. , I.e., the non-naturally occurring L-enantiomer of structure III. Ki Enzymes that can discriminate between the chiral enantiomers or the D- and L-enantiomers In the absence of a chiral reagent, the L-enantiomer becomes chemically reactive. Is the same as the D-enantiomer. Urata et al. Am. Chem. Soc. 1 991,113, 8174 (via the 2-cyanoethyl phosphoramidite method) Of the self-complementary L-DNA oligomer double strand, Ld (CGCGCG) We report the properties of these enantiomers, namely the natural Dd (CGCGCG). Compared to the properties of the oligomer. The non-natural all-L-duplex has the nuclease p It is resistant to digestion by -1, but the naturally occurring all-D duplex is its component. It is rapidly degraded to D-nucleotides and 5'-terminal deoxycytidine. Expected As shown, both DD- and LL-duplexes have the same HPLC retention time. Shown, these circular dichroism (CD) spectra are mirror images of each other. 0. In 1M NaCl, the D-enantiomer is A standard B-type CD profile is shown, but the L-enantiomer is the same at all wavelengths. Despite the size, the opposite sign is shown. This is a left-handed double helix It is shown that there is a conformational B-shaped helix with a conformation. 4M NaC In 1, the D-enantiomer shows a left-handed Z-shaped profile, while the L-enantiomer The enantiomers showed the same size but opposite sign at all wavelengths. This is right It is shown that there is a Z-type mirror image with a double helix conformation. all Both the D-double-stranded and all L-double-stranded forms of And show the same B to Z conformational transition (with opposite sign) and a lower salt concentration. Both temperature and high salt concentration show the same temperature dependence. D- and L-DNA are , Having the same type and strength of hydrogen bonding and stacking interactions of bases, And that the L-DNA structure is an exact mirror image of the D-DNA structure. Be done. All this L-enantiomeric oligomers (which are self-complementary ) Targets different natural D- or non-natural L-enantiomers. It cannot be used for cutting.   Fujimori et al, Nucleic Acid Research, 1990,twenty two, 97, 9- ( 2-deoxy-bL-erythro-pentafuranosyl) -9H-purin-6-a Report on the synthesis of min, L-dA, and hexameric L-DNA, Ld (AAAAAA) I told you. They found that L-d (AAAAA) was converted to bovine spleen phosphodiesterase. Although resistant, it was observed that D-d (AAAAA) was completely degraded. he Ld (AAAAA) is a natural D-RNA enantiomer, D-. It forms a complex with poly (U), which is an enantiomeric natural D- Relatively weaker than that formed between d (AAAAAAA) and D-poly (U) I showed you that. Non-natural Ld (AAAAAAA) and natural DNA enantiomers No complex was formed with -D-poly (T). These results are L-enantiomeric DNA has the ability to distinguish complementary RNA from DNA. Have but non-natural L -DNA: D-RNA complex is the corresponding natural D-DNA: D-RNA complex It does not have the same level of strength as.   L-DNA hybridizes with natural enantiomeric D-RNA in vitro. It is shown that it is stable and has stable nuclease resistance. Such double-stranded formation with the target D-RNA results in the L-DNA being a complete D-RNA. In vivo, it is necessary to cross at least one cell membrane in order to find it. It can't be achieved easily. Furthermore, natural D-RNA is a naturally occurring nuclease enzyme. The life is relatively short in the presence of the element.Summary of the invention   The present invention is a non-radioactive targeting immunoreagent, comprising a tumor antigen recognition site, 1 or more containing a non-self-associating L-enantiomeric oligonucleotide sequence The above L-enantiomeric oligonucleotide and one or more linking groups (link lng groups) directed to those containing.   The present invention is also a radioactive targeting immunoreagent, which is non-self-associative. -To one or more fragments and sequences of an enantiomeric oligonucleotide sequence L-, which is complementary to and is hybridizable to the one or more fragments. L-enantiomers with enantiomeric oligonucleotide sequences Oligonucleotides, one or more chelating agents, one or more linking groups and one or more radiations Two equipped with a sex nuclide Be directed.   The invention also includes one or more immunoreagents as described above and a pharmaceutically acceptable carrier. Directed to a pharmaceutical composition.   The invention further provides for the treatment and imaging of diseased areas, such as tumor sites, in a patient. Directed to ways to do. The method provides an effective amount of the non-radioactive target. Ting immunoreagent to the patient, followed by an effective amount of time in an effective amount Administering the above radioactive targeting immunoreagent.   The present invention has many advantages over conventional targeting immunoreagents. An example For example, non-radioactive targeting immunoreagents can accumulate at tumor sites in vivo However, it does not accumulate at normal tissue sites.   The in vivo residual half-life of non-radioactive targeting immunoreagents is Long enough to allow its accumulation of.   The in vivo residual half-life of radioactive targeting reagents is determined by the non-radioactive targeting. Shorter than the remaining half-life of the Ting immunoreagent.   Some non-radioactive targeting reagents do not hybridize to accumulated tumors Radioactive targeting reagents are easily excreted from the patient. Depending on the radionuclide Directly by labeling with a chelator containing a radionuclide. Targeting immunoreagents to the same extent, targeting An increase in the number of radionuclides per modification site per N. G. immunoreagent can be observed.   Non-radioactive targeting immunoreagent complementary sequenced Fragment of L-enantiomeric oligonucleotide and radioactive targeting Fragment of the L-enantiomeric oligonucleotide of  Can be hybridized in vivo.   Non-radioactive targeting immunoreagent and radioactive immunoreagent complementary sequenced L-enantiomeric oligonucleotides were isomerically complementary sequenced Not hybridize to naturally occurring D-enantiomer oligomers Let's do it.   Complementation of non-radioactive targeting immunoreagents and radioactive targeting reagents The L-enantiomerically arranged oligonucleotides are It is stable against sex.   Complementation of non-radioactive targeting immunoreagents and radioactive targeting reagents Sequenced L-enantiomeric oligonucleotides, as well as the complementary Hybrids formed between L-enantiomeric oligonucleotides have different An enzyme that is specific for binding a sexant to a D-enantiomeric oligonucleotide Would not combine with.   Complementation of non-radioactive targeting immunoreagents and radioactive targeting reagents Of high molecules formed between randomly arranged L-enantiomeric oligonucleotides. Brids are stable to nuclease activity.   Complementation of non-radioactive targeting immunoreagents and radioactive targeting reagents Sequenced L-enantiomers Oligonucleotides do not self-hybridize.   Non-radioactive targeting immunoreagents and radioactive targeting reagents are widely available. A range of spacing groups, binding groups, and chelating groups, L-E It can contain enantiomeric oligonucleotide sequences as well as radionuclides.   Non-radioactive targeting immunoreagent complementary sequenced L-enantiomers Oligonucleotides can be linked in tandem with a spacing group L -May include an enantiomeric oligonucleotide sequence. Where each L -Enantiomeric oligonucleotide sequences are radioactive targeting reagents Can hybridize with a fragment of Complementary to non-radioactive targeting immunoreagents The sequenced L-enantiomeric oligonucleotide has a 5'-amine or 3 It is bound to the antibody by either a 5'- or 3'-substituent such as an'-amine. Can be   These reagents are tumor-specific and, according to the present invention, a wide range of compositions are prepared. Can be made.   A particular advantage of the present invention is that of the L-enantiomeric oligonucleotide sequences The length and spacing groups of the two radioactive targeting reagents L-E are complementary. The enantiomeric oligonucleotide sequence is linked to the non-adjoining tandem L-enantiomeric oligonucleotides for radioactive targeting immunoreagents The strand containing the single L-enantiomeric oligonucleotide containing the sequence is The sequence of two such radioactive targeting moieties when hybridizing So that the nearest end groups of are orthogonal to each other (this is a This is because the relative spatial arrangement is formed in this way. ) Can be selected It   Other advantageous features of the invention may be found by referring to the description of the preferred embodiments below. It will be readily apparent.Description of the preferred embodiment   The present invention finds utility in compositions and methods for therapeutic and diagnostic imaging. A bioconjugate having is disclosed. The invention further provides L-enantiomeric oligonuclides. Cletide sequence containing a chelating agent, preferably a terpyridine containing a chelating agent (Terpyridine) and by binding the sequence to proteins, antibodies, And a bioreceptor is produced by binding with an immunoreactive reagent such as a receptor. A new method is disclosed.   In particular, the invention features compositions and methods for therapeutic and diagnostic imaging. It is useful for sequential targeting that is found to be effective in Disclosed are novel bioconjugates with enhanced transport properties of pharmaceutical compositions.   More specifically, the present invention provides a tumor antigen recognition site, a non-self-associating L-enantiomer. One or more L-enantiomers containing a meronic oligonucleotide sequence Targeting immunoreagent containing lygonucleotide and one or more binding groups The manufacture and use of is disclosed. These targeting immunoreagents are compatible with Compatible L-Enantiomeric Oligonudes Is complementary in sequence to one or more fragments of Cleotide, said one or more fragments L-enantiomeric oligonucleotide capable of hybridizing with a fragment Radiation containing one or more linking groups and one or more radionuclides bound to them React with sequential targeting reagents. Most preferably, L-enantiomer Oligonucleotide is a natural D-deoxyribonucleotide L-enane. It is a thiomer.   In a preferred embodiment, the targeting immunoreagent is represented by structure IV To form a compound containing a moiety.     However,       Z is a residue of an immunoreactive protein;       LzAnd LQAre independently chemical bonds or linking groups;       I is of 12 to about 50 L-enantiomeric nucleotide units An L-enantiomeric oligonucleotide containing flanking sequences, comprising: The flanking sequences include one or more members of the same flanking sequence family. Only 12 to about 30 L-enantiomers of the same family It contains a nucleotide unit, but the L-enantiomer Six or more contiguous sequences of lygonucleotides are Six or more contiguous L-enantiomeric nucleotide units at any position within structure IV. There is a condition that it does not hybridize to any other adjacent sequence of knit. ;       QIIs a spacing group;       a is an integer from 0 or 1 to about 6;       IiIs 12 to about 50 L-enantiomeric nucleotide units Is an L-enantiomeric oligonucleotide containing adjacent sequences of Flanking sequences of which contain a portion of I;       E is an end capping group;       p is an integer from 1 to about 10.   In another preferred embodiment, the targeting reagent is a moiety represented by structure V Contains.     However,       cI is 12 to about 50 L-enantiomeric A contiguous sequence of cleotide units, said contiguous sequences being identical contiguous Containing one or more members of a family of sequences Containing 12 to about 30 L-enantiomeric nucleotide units And the L-enantiomeric nucleotide sequence of the same is A series of L-enantiomeric oligos within a targeting immunoreagent that can be given Is complementary to the nucleotide sequence of a member of nucleotides, said complementary L- 6 or more L-enantiomers of enantiomeric oligonucleotides The flanking sequences of leotide units may have 6 or more flanking sequences at any position within structure V With any other flanking sequences of the L-enantiomeric nucleotide unit It does not hybridize;       QcIIs a spacing group;       L1, L2, And L3Are independently chemical bonds or linking groups;       W1, W2, And W3Are each the residue of a chelating group;       M1, M2, And M3Is an oxidation state equal to or greater than +1 Including an element having a state, M1, M2, And M3At least one of the radionuclides Is;       x, y, and z are independently zero or 1, but of x, y, and z With the proviso that at least one is 1.       w and b are independently zero or an integer from 1 to about 4.   The L-enantiomeric nucleotide unit used here is a naturally occurring Defined as the mirror image of the existing isomer, the D-enantiomer nucleotide unit To be done. L-enantiomeric nucleoside is a naturally occurring isomer It is defined as the mirror image of the D-enantiomeric nucleoside. Furthermore, L-Ena The aminomeric oligonucleotide sequences contain the naturally occurring isomer D-E. It is defined as the mirror image of the enantiomeric oligonucleotide sequence.   Examples of L-enantiomeric nucleosides are described below, but the examples are not limited to these. I can't.   From the L-enantiomeric nucleotide intermediate to the L-enantiomeric oligonucleotide The method for synthesizing gonucleotides is the method of isomeric D-enantiomeric nucleotides. Synthesis of mirror image D-enantiomeric oligonucleotide from octide intermediate Is the same as the method used when An example of such a method is Leroy B. To "Chemistry of Nucleosides and Nucleotldes", edited by wnsend, Plen um Press, N. The method disclosed in Y., 1988 is included. L by such a method -Synthesis of enantiomeric oligonucleotides is accomplished by L-enantiomers such as thiomeric nucleoside and nucleotide derivatives Requires the use of Rick's reagent. Of various L-enantiomeric nucleotides Preparation is by Robins, M .; et al (1970), J. Org. Chem., 35, p636-639; Holy, A. (1972 ), Coll. Czechoslov. Chem. Commun., 37, p4072-4087; Visser, G .; et al (199 6), Rec. Travaux Chim. Pay-Bas, 105 / 12p528-537; Anderson, D.M. et al (1984) , Nucleos1des and Nucletides, 3/5, p499-512; Uhlmann, E. et al (1990), Che m. Review, (1990), 90/4 p543-584; Smejkal, I. et al (1964), Coll. Czechosl ov. Chem. Commun., 29, p2809-2813, etc.   Of the methods known in the art for the synthesis of oligonucleotides, the L-enane of the invention may be used. A preferred method for synthesizing thiomeric oligonucleotides is the L-enantio Meric nucleotide phosphoramidite intermediate (This is the The group contains a protecting group. ) Is included. Ribonucleus The protection of the 5'-hydroxyl group of the do moiety and the deoxyribonucleoside moiety is Preferably, for example, a methoxytrityl group (hereinafter often referred to as MMT group) It ) Or a dimethoxytrityl group (hereinafter often referred to as DMT group). With an acid-releasable trityl group, using the corresponding trityl chloride Is done. Deprotection of such a trityl protected 5'-hydroxyl group is For example, acetic acid in water, chloroacetic acid in a solvent such as dichloromethane, or chloro. In a solvent such as form or methanol It is preferable to use an acid such as benzenesulfonic acid as a reagent. Protection of the 2'-hydroxyl group of the ribonucleic acid moiety can be accomplished, for example, by t-butyldimethylsilyl. Luchlorosilane, which reacts with the ribosyl 2'-hydroxyl group to give t-butyl Form dimethylsilyl ether. ) What is done with silyl chloride Is preferred. Such deprotection of t-butyldimethylsilyl ether can be carried out, for example, by Treating with, for example, sodium hydroxide dissolved in a solvent such as methanol Can be achieved by   A preferred L-enantiomeric nucleotide is L-2-deoxyribonuc Leotide, a preferred L-enantiomeric oligonucleotide is It is Go-L-2-deoxyribonucleotide. The L-enantiomer of the present invention L-Enantiomers useful for the synthesis of qualigo-L-deoxyribonucleotides Derivatives of cudeoxyribonucleotides include, for example, derivatives of compounds 1-5. L-enantiomeric deoxyribonucleoside, each of which is, for example: It has a 5'-OH protected with a dimethoxytrityl (DTM) group, Each of the enantiomeric deoxyribonucleosides is, for example, 2-cyanoethyl Treated with ru-N, N-diisopropylphosphoryl chloride to give the corresponding 3'- This produces (2-cyanoethyl-N, N-diisopropyl) phosphoramidite. With 3'-OH for the phosphate bond formation of the oligonucleotide. It has been activated. These are, for example, solid phase automated DNA synthesizers -L -Used to synthesize the deoxyribonucleotide moiety.   L-Enantiomeric Oligo-L-deoxyribonucleoside moieties of the invention Protected 2'-deoxy-L-adenosine 3'suitable for use in the synthesis of A preferred method for preparing the -O-phosphoramidite derivative A10 is described in Scheme 1 Outlined in. 1-O-methyl-3,5-di-O-p-toluyl-2-deoxy- L-erythro-pentofuranose (A2 in Scheme 1) was synthesized by Smejkal, I .; et al ( 1964), Coll. Czechoslov. Chem. Commun., 29, p2809-2813. Therefore, by treating with p-toluoyl chloride and methanol, L-acetate Prepared from Rabinal (A1). Of A2 and 2,6-dichloropurine (A3) By condensation, 2,6-dichloro-9- (3,5-di-O-p-toluoyl-2 -Deoxy-alpha-L-erythro-pentafuranosyl) purine (4A) was obtained. It A4 is treated with methanol and ammonia to selectively aminate the purines at the 6-position. And simultaneously deprotect the acetylated hydroxyl groups at the 3'- and 5'-positions. It Residual chlorine is removed by hydrogenolysis to give the desired L-nucleoside, Ld A (A6) is obtained. Next, the exocyclic amine of A6 is benzoyl chloride Protected by diacylation with a ride to give A7 (which gives the protected amine In addition, it contains two benzoate esters. ) Get. Benzoate Stells were removed by saponification with aqueous sodium hydroxide to give A8 It Then this Dimethoxytrityl chloride (from Aldrich Chemical Company It is available from ) Treatment to give A9 DMT etherified at the 5'-position. . Next, A9 was added to 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramy A. Treated with dait (available from Aldrich Chemical Company), 10, i.e. 5'-dimethoxytrityl-2'-deprotected at the two desired positions. Oxy-L-adenosine 3'-O-2-cyanoethyl phosphoramidite was obtained. It A10 is an L-oligonucleotide that is a constituent of Structure IV and Structure V of the present invention. Used as an intermediate in the synthesis of octido sequences. The production of such sequences is Was prepared by the manufacturer to synthesize and purify a D-oligonucleotide Performed using the automated procedure, for example using an automated oligonucleotide synthesizer. Can be.Scheme 1   Preparation of protected L-deoxyadenosine phosphoramidite   L-enantiomeric oligo-L-deoxyribonucleotide material of the present invention A protected 2'-deoxy-L-guanosine 3'-O-, suitable for use in A preferred method for preparing the phosphoramidite derivative, G8, is outlined in Scheme 2. did. 1-O-methyl-3,5-di-O-p-toluyl-2-deoxy-L-E Lithro-pentofuranose (A2 in Scheme 1) was added to Smejkal, I .; et al (1964) , Coll. Czechoslov. Chem. According to the method disclosed in Commun., 29, p2809-2813. By treating with p-toluoyl chloride and methanol. Prepare from nar (A1). Hydrolyze methyl acetal (A2) with dilute hydrochloric acid , Hemiacetal (G2) is obtained. This is acetylated with acetic anhydride and 1-acetyl 3,5-di-O-p-toluyl-beta-L-erythro-pent Furanose (G3) is obtained. G3 and 2-fluoro-6-benzyloxypurine ( By condensing G4), G5 is obtained, which is then treated with an alcoholic ammonia. And the desired product (G6), which is purified by chromatography. ) Get. The 6-benzyl protecting group of G6 was treated with palladium on ammonium hydroxide. Removed by hydrogenolysis over charcoal, 2-amino-9- (2-deoxy- L-erythro-pentofuranosyl) purin-6-one (G7; L-dG) is obtained. . Next, the exocyclic 2-amino group of G7 was treated with isobutyryl chloride. Protecting by acetylation and protecting the 5'-hydroxyl group with dimethoxytril. Protected as DMT ether with tyl chloride to remove the 3'-hydroxyl group Treated with 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite, G8, 5'-O-dimethoxytrityl-2 'protected at the two desired positions -Deoxy-L-guanosine 3'-O-2-cyanoethyl phosphoramidite obtain. G8 is an L-oligonucleotide that is a constituent of Structure IV and Structure V of the present invention. Used as an intermediate in the synthesis of octido sequences. The production of such sequences is Was prepared by the manufacturer to synthesize and purify a D-oligonucleotide Performed using the automated procedure, for example using an automated oligonucleotide synthesizer. Can be.Scheme 2   Preparation of protected L-deoxyguanosine phosphoramidite   L-enantiomeric oligo-L-deoxyribonucleotide material of the present invention Protected 2'-deoxy-L-uridine 3'-O-, suitable for use in A preferred method for making the phosphoramidite derivative, U7, is outlined in Scheme 3. did. L-arabinose (U1) was reacted with cyanamide to give 2'-amino-1,2 -Oxazoline (U2) was obtained and Treatment with lepropiolate (U3) gives anhydro-L-uridine (U4) . The anhydro derivative U4 was opened with HBr to give a 2'-bromo-nucleoside (U 5) is obtained, and this is catalytically hydrogenated to obtain 2-deoxy-L-uridine (U6). . The 5'-hydroxyl group of U6 was converted to DM using dimethoxytrityl chloride. Protected as a T-ether and the 3'-hydroxyl is 2-cyanoethyl N, N-di- Treated with isopropylchlorophosphoramidite, U7, ie, desired, protected 5'-O-dimethoxytrityl-2'-deoxy-L-uridine 3'-O- 2-Cyanoethyl phosphoramidite is obtained. U7 is a structure IV and structure of the present invention. Used as an intermediate in the synthesis of L-oligonucleotide sequences that are constituents of structure V Be done. The production of such sequences involves synthesizing the isomer D-oligonucleotide. And, for example, automated, using the procedure indicated by the manufacturer for purification. Can be performed using an oligonucleotide synthesizer.Scheme 3   Preparation of protected L-deoxyuridine phosphoramidite   L-enantiomeric oligo-L-deoxyribonucleotide material of the present invention Protected L-thymidine 3'-O-phosphoramidiye suitable for use in A preferred method of making the tho derivative, T7, is outlined in Scheme 4. This synthesis method The method is disclosed in Scheme 3, using L-arabinose as the chiral starting material. 2'-deoxy-L-uridine 3'-O-phosphoramidite derivative, U7 Is similar to the manufacture of. Therefore, L-arabinose was treated with cyanamide to give 2 ' -Amino-1,2-oxazoline (U2) is obtained. Next Then, while heating this, it reacts with methylmethacrylate to produce anhydrous nucleoside ( T4) is obtained. T4 was opened with anhydrous HBr to give 2-bromo-L-thymidine (T5). Get. Catalytic hydrogenation of T5 gives L-thymidine (T6). T6 5'-hi The droxyl group was converted to a DMT ester using dimethoxytrityl chloride. Protect the 3'-hydroxyl group with 2-cyanoethyl N, N-diisopropyl Treated with lorophosphoramidite to give T7, the desired protected 5'-O-dime Toxitrityl-L-thymidine 3'-O-2-cyanoethyl phosphoramidite Get T7 is an L-oligonucleotide that is a component of Structure IV and Structure V of the present invention. Used as an intermediate in the synthesis of cleotide sequences. The manufacture of such an array is different. In order to synthesize and purify the native D-oligonucleotide, the manufacturer , Using an automated oligonucleotide synthesizer, for example. Can be done.Scheme 4   Preparation of protected L-thymidine phosphoramidite   L-enantiomeric oligo-L-deoxyribonucleotide material of the present invention A protected 2'-deoxy-L-cytidine 3'-O-, suitable for use in A preferred method for making the phosphoramidite derivative, C7, is outlined in Scheme 5. Therefore, treating L-arabinose, A1 with HCl and toluoyl chloride 3,5-di-O-p-toluoyl-2-deoxy-L-ribofuranosyl chloride Obtain the id (C2). (C2) and 4-chloro-2-trimethylsiloxypyrimidi 1- (3,5-di-O-p-toluoyl-2-deoxy- L-ribofuranosyl) -4-chloropyrimy Jin-2-one (C4) is obtained. Treat this with ammonia in methanol, -Deoxy-L-cytidine (C5) is obtained. C5 exocyclic amine Is protected by treatment with benzoyl chloride to protect the 3'- and 5'-positions. The saponified ester of C6 is converted to C6 free from the 3'- and 5'-hydroxyl groups. obtain. The 5'-hydroxyl group of C6 was converted to D using dimethoxytrityl chloride. Protected as MT ether and the 3'-hydroxyl group is 2-cyanoethyl N, N Treated with diisopropylchlorophosphoramidite to give C7, ie the desired protection 5'-O-dimethoxytrityl-2'-deoxy-L-cytidine 3'-O 2-Cyanoethyl phosphoramidite is obtained. C7 is a compound of Structure IV and Used as an intermediate in the synthesis of L-oligonucleotide sequences that are components of structure V To be done. The production of such sequences synthesizes the D-oligonucleotide which is an isomer. And to purify using, for example, automated procedures using the procedure indicated by the manufacturer. Can be carried out using a customized oligonucleotide synthesizer.Scheme 5   Preparation of protected L-deoxycytidine phosphoramidite   2'-deoxy-L-adenosine (A6) is hereinafter often referred to as L-dA. 2'-deoxy-L-guanidine (G7) is hereinafter often referred to as L-dG. 2'-deoxy-L-uridine (U6) is often hereafter referred to as L-dU, L-thymidine (T6) is hereinafter often referred to as L-T, and is referred to as 2'-deoxy-L- Cytidine (C5) is often hereafter referred to as LdC. L-Enantiomer of the present invention An abbreviation for nomenclature of merlic oligonucleotides is, for example, 2'-deoxy-L. -Adenine and L-dA are phosphodiester groups and 2'-deoxy-L-guanosine , L-dG, which is then bound to the 2'-deoxy group at the phosphodiester group. Sea-L-uridine, L -DU, which is then bound at the phosphodiester group to L-thymidine LT And then the LT is a phosphodiester group with 2'-deoxy-L-cytidine. Gin, an unrelated L-ena having a sequence containing that bound to L-dC Antigenic oligonucleotides have been defined, often Ld (AGUTC) Will be called. R at the 5'-end of this oligomer1The groups are bound and this orientation R at the 3'-end of Gommer2When the1-5'- L-d (AGUTC) -3'-R2Or 5'-R1-L-d (AGUTC) -R2 -3 'is displayed. Conversely, at the 3'-end of this oligomer, R1Group bonded At the R5'-end of this oligomer.2When a group is attached, the oligomer is R1-3'-L-d (AGUTC) -5'-R2Or 3'-R1-Ld (AG UTC) -R2It is displayed as -5 '. Related is the L-oligonucleotide of the present invention. Reotide, especially the presently preferred sequences having the sequences as disclosed below using this nomenclature Construct a better oligonucleotide.   The term "residue" is used herein in the context of a chemical entity. It The chemical unit is, for example, a chelating agent, a binding group, or a protein. Reactive group, or immunoreactive group, or immunoreactive group, or immunoreactive Protein, antibody, antibody fragment, or heterobifunctional (h eterobifunctional) cross-linking agents such as cross-linking agents, or L-enantiomers Lick oligonucleotide, or spacing group, or end capping Group Includes. The term "residue" refers to a portion of the chemical unit, When some of the units are considered as independent chemical units, one or more of the chemical units A chemical bond changes to have one or more covalent bonds with one or more other chemical units With a chemical unit that remains exclusively when modified, modified, or substituted. Is defined as Thus, for example, in one aspect, for example I and Ii of structure IV, or Or in relation to the cI of structure V, "of the L-enantiomeric oligonucleotide A "residue" is modified to bind at least divalently to the residue of another chemical unit. L-enantiomeric oligonucleotides are included. That is, the L-E The enantiomeric oligonucleotide includes at least a divalent L-enantiomer. Lick oligonucleotide sequences are included. In another aspect, for example, of structure V W1, W2Or W3In the context of, a "residue of a chelating group" is, for example, At least monovalently modified through the attachment of other chemical units such as groups to residues Chelating groups are included.   In Structure IV above, Z preferably recognizes and is associated with a tumor associated antigen. An antibody or antibody fragment that is specific. In some aspects, the above A chemical bond or a residue of a protein reactive group or a reaction on a protein Immune reaction covalently bound to them via a linking group derived from a residue of a sexual group Reactive groups can be included. As used herein, "immunoreactivity" may be abbreviated as "IRP". The term "protein" refers to organic compounds that can be bound by protein covalent bonds, and living Found in microorganisms or diagnosed, treated, or made up of cellular or living Organic compounds useful for genetic engineering of microorganisms, as well as may be found in biological fluids Or interacts with other components associated with cells that can be treated, such as tumor cells It is an organic compound having the ability to   Immunoreactive groups have been prepared by a wide range of naturally occurring materials or synthetic Selected from materials. These materials include enzymes, amino acids, peptides and polypeptides. Tide, protein, lipoprotein, glycoprotein, lipid, phospholipid, hormone, growth Factor, steroid, vitamin, polysaccharide, virus, protozoa, fungus, parasite, Ketchia, mold, and their components, blood components, tissue and organ components, medicines, Haptens, lectins, toxins, nucleic acids (including oligonucleotides), antibodies (models Noclonal and polyclonal), anti-antibodies, antibody fragments, antigenic substances Quality (including proteins and carbohydrates), avidin and their derivatives Include conductors, biotin and their derivatives, as well as others known to those of skill in the art. But is not limited to these. In addition, the immunoreactive group can be any substrate Can bind to its substrate when provided to an immunocompetent host, Specific antibody, or an antibody so formed that participates in the antigen-antibody reaction. Can be produced.   Preferred immunoreactive groups are residues of L-enantiomeric oligonucleotides. For reacting with the protein-reactive groups described here above, or as described here With a linking group like As long as it contains at least one reactive site for reacting, antibodies and these Various immunoreactive fragments. This site is unique to immunoreactive species Alternatively, it can be introduced via appropriate chemical modification of the immunoreactive species. Outlined earlier Produced by molecular biology techniques in addition to antibodies produced by Other antibodies and proteins may be included in particular.   Preferably, the immunoreactive group is an L-enantiomeric oligonucleoside in structure IV. It does not bind to reotide, and therefore the L-enantiomeric oligonucleotide A complementary sequenced L-enantiomeric oligonucleotide of structure V Binding is inhibited.   The term "antibody fragment" as used herein refers to the residues of an antibody An immunoreactive substance having a characteristic affinity for binding to an antigen U As used herein, the term affinity for binding to antigen refers to antigen binding site and antigen binding. The strength of the interaction or bond with the fixed group, and thus the stereochemistry between them. A thermodynamic expression of physical suitability. As such, this results in antibody-antigen interactions. Is a representation of the equilibrium or coupling constant for. The term "affinity" used here also , The strength of the interaction between the ligand and the receptor or the strength of the binding between them, It means a thermodynamic expression of stereochemical compatibility between them. By itself This is a representation of the equilibrium or binding constant for the ligand-receptor interaction.   Antibody fragments with regard to the affinity of binding between antigen and antibody Represents at least the percentage of said affinity for binding to said antigen, This percentage is 0 of the relative affinity of the antibody for binding to the antigen. ． 001% to 1,000%, preferably 0.01% To 1,000 percent, more preferably 0.1 to 1,000 percent, Most preferably, it is in the range of 1.0 percent to 100 percent.   Antibody fragments are prepared by a chemical reaction that comprises the cleavage reaction of one or more chemical bonds. , Amino acids, peptides, carbohydrates, linking groups described here, Spacing groups, protein-reactive groups described here, and One or more chemical components selected from the group including antibody fragments thus produced By a chemical reaction with one or more chemical bond forming reactions using , And molecular biological processes, bacterial processes, or inheritance of antibody genes. Processes involving gene engineering and the processes that result from genetic engineering of antibody genes Can be produced from an antibody.   Antibody fragments are separated from an antibody by a chemical reaction that comprises one or more of the following reactions: Can be induced.     (A) Cleavage of one or more chemical bonds contained in the antibody. The bond is, for example, carbon- Nitrogen bond, sulfur-sulfur bond, carbon-carbon bond, carbon-sulfur bond, and charcoal Element-oxygen bond, in which case the method of cleavage is selected from the following reactions: To be done.     (I) enzymes such as papain or pepsin (these are Are antibody fragments that are commonly referred to by those of ordinary skill in the art as Fab and Fab'2. It is known that each of these causes ) Like the action of biochemical catalysts Catalytic chemistry including.     (Ii) Hydrides that favorably occur at a pH of, for example, less than or equal to 7. Catalytic chemical reactions involving the action of electrophilic chemical catalysts such as rhonium ions.     (Iii) Water that advantageously occurs at a pH of, for example, greater than or equal to 7. Catalytic chemical reactions involving the action of nucleophilic catalysts such as acid ions.     (Iv) For example, a sulfhydryl group (containing a -SH group) or an anion. Sulfide group -S-Na+In the form of a salt like a group -S-Contains a group. ) Included Stoichiometry, such as the substitution reaction of sulfur atoms on disulfide bonds with different reagents Chemical reaction with displacement reaction using reagents that are consumed in various formats.     (V) For example, a chemical reaction provided with a reduction reaction such as reduction of a disulfide bond. Reply     (Vi) Occurring at the oxidation of carbon-oxygen bond of hydroxyl group or sugar chain part Such as oxidation of carbon-carbon bonds of adjacent diols Academic reaction. Or     (B) For example, carbon-nitrogen bond (eg, amide bond, amine bond, hydra, etc. Ions such as zon bonds, imine bonds, and thiourea bonds) and disulfide bonds. W-sulfur bond, carbon-carbon bond, carbon-sulfur bond, and carbon-oxygen bond One or more formations between one or more reagents, such as the formation of one or more covalent bonds selected from Amino acids, peptides, sugars as reagents for chemical bond formation and chemical bond formation A chain, a linking group as defined herein, a spacing group as defined herein, A protein reactive group as defined herein, and as described in (a) above. Using the antibody fragment produced. Or     (C) The antibody fragment is in the form of one or more non-covalent bonds between one or more reagents. Can be induced by growth. Such non-covalent bonds can be Independent inclusion of regions of low polarity accessible to each other, such as regions containing group groups and carbocyclic groups. Hydrophobic interactions, such as those that occur between the species provided, and interactions with the oligonucleotide. Includes hydrogen-bonding interactions that result in binding to complementary oligonucleotides . Or     (D) antibody fragments are the result of molecular biology techniques, or for example The legacy of antibody genes in genetic engineering of single-chain immunoreactive groups or Fv fragments It can be manufactured by gene engineering.   Antibody fragments are produced as a result of combining one or more of the above methods. sell.   In some aspects, the immunoreactive group is a linking group L.zBy L-Enantiomeri Enzyme having a reactive group for binding to the residue possible. Corresponding enzymes include aspartate aminotransaminase, ara Ninaminotransaminase, lactate dehydrogener Zea, creatine phosphokinase, gamma glutamyl transferase, alka Acid phosphatase, prostatic acid phosphatase, horseradish peroxidase Oxidases and various esterases, including but not limited to .   If desired, the immunoreactive group can be modified, or chemically altered, as is known in the art. L-enantiomers via the linking groups described below by techniques known in the art. Reactive groups are provided for use in attaching to the residue of the oligonucleotide. this Such techniques are directed to modification of oligonucleotides, WO-A-89 / 0. 2931 and WO-A-89 / 2932, and U.S. Pat. No. 4,719,18. 2 includes the use of binding moieties and chemical modifications disclosed in 2.   Two highly preferred uses of the composition according to the invention are the imagens for the diagnosis of tumors. Radiation therapy for tumors and tumors. Therefore, preferred immunological groups include tumor-associated Antibodies to the original are included. The antibody is often referred to hereafter as Ab. Special, control Non-limiting examples of antibodies include B72.3 and related antibodies that recognize colorectal tumors. (Disclosed in U.S. Pat. Nos. 4,522,918 and 4,612,282. ); 9.2.27 and related anti-melanoma antibodies; D61 recognizing colorectal tumors 2 related antibody; UJ13A recognizing small cell lung cancer and related antibody; NRLU-10 , NRCO-02 and related antibodies for small cell lung carcinoma and colorectal Tumor (NRLU-10, NRC that recognizes Pan-carclnoma) O-02 and related antibodies; 7E11C5 and prostate tumor recognizing And related antibodies; CC49 and related antibodies that recognize colorectal tumors; recognized necrotic tissue Recognizing TNT and related antibodies; recognizing colon carcinoma and PR1A3 and related antibodies Serial antibodies; ING1 disclosed in International Patent Application WO-A-90 / 02569 and Related antibodies; B174, C174 and related antibodies that recognize squamous cell carcinoma; B43 and related antibodies reactive with lymphoma and leukemia; and anti-HLB And related monoclonal antibodies. A particularly preferred antibody is ING-1 It   Referring again to Structure IV, LzAnd LQAre independently chemical bonds, or It is the residue of the linking group. As used herein, the phrase "linking group residue" refers to a protein The remaining, generated, or attracted part of the reaction between the reactive group and the reactive site on the protein. Refers to the guided part. As used herein, the phrase "protein reactive group" refers to tampering Refers to any group capable of reacting with a functional group typically found in But tampa A reactive group is a functional group typically found in biomolecules other than the protein involved. It is particularly considered that it also reacts. Therefore, a linking group effective in the practice of the present invention is Reacts with any biological molecule containing an epidemiologically reactive group, the biological molecule being L containing an immunoreactive group and a species disclosed below, whether or not Pak -Derived from a group capable of forming a linking group with the enantiomeric oligonucleotide. Be guided.   Preferred linking groups are derived from protein reactive groups selected from It is not limited to these. (1) Amine, alcohol, or sulfhydride on protein or biological molecule A group capable of reacting directly with a ril group, wherein the protein or biological molecule is Reactive groups, such as halogen-containing groups (such as chloromethylphenyl groups and And chloroacetyl [ClCH2(C = O)-] group is included), 2-chloroe Activated 2- (such as tylsulfonyl and 2-chloroethylcarbonyl (Leaving group substituted) -ethylsulfonyl and ethylcarbonyl groups; vinylsulfur Vinyl; Carbonyl; Epoxy; Isocyanato; Isothiocyanato; Al Dehydrate; aziridine; succinimidooxycarbonyl; carboxylic acid halide Activated acyl groups such as; mixed acid anhydrides, etc .; and conventional photographic gelatin Containing other known groups that can be used as curing agents; (2) modified proteins or biological molecules containing immunoreactive groups, ie In order to contain the reactive group as described in (1), for example, aldehyde or Oxidizes groups such as hydroxyl groups of proteins to carboxylic acids, Easily reacts with proteins or biological molecules containing modified immunoreactive groups Base In this case, the "linking group" is amino, alkylamino, arylamino. , Hydrazino, alkylhydrazino, arylhydrazino, carbazide, semicar Luvazide, thiocarbazide, thiosemicarbazide, sulfhydryl, sulfhydride Rylalkyl, sulfhydrylaryl, hydroxy, Tannes selected from carboxy, carboxyalkyl and carboxyaryl It can be derived from a PAK reactive group. The alkyl portion of the linking group has from 1 to about 20 It may contain carbon atoms. The aryl portion of the linking group is from about 6 to about 20 carbon atoms. May contain offspring. (3) A protein or biological molecule containing an immunoreactive group, or (1) above ) And (2) with a modified protein as described in (2) A group that can be attached by. For example, homobifunction al) and xenobiotic gelatin hardeners, bisepoxides, and bisisocyanates. Some effective cross-linking agent residues, such as One of the Pak- (L-enantiomeric oligonucleotide-containing species) complex It can be a part, ie a linking group in the complex. However, other useful cross-linking agents are It can promote cross-linking as a consumable catalyst and is not present in the final complex. Examples of such cross-linking agents include those disclosed in US Pat. No. 4,421,847. Rubodiimide and carbamoylonium crosslinkers, and US Pat. No. 4,8. There are 77,724 ethers. In these cross-linking agents, immunoreactive groups In addition, one of the reactants must have a carboxyl group and the other Is a reactive amino acid, such as an L-enantiomeric oligonucleotide-containing species. It must have an alcohol, alcohol, or sulfhydryl group. In forming the amide bond, the cross-linking agent first selectively reacts with the carboxyl group. Of the reaction of the amine with the thus "activated" carboxyl group. Cleavage and removal between, containing protein and L-enantiomeric oligonucleotide An amide bond is formed with the species that covalently joins the two moieties. Be done. The advantage of this approach is that similar molecules, such as proteins and Or prevent cross-linking between L-enantiomeric oligonucleotide-containing species That is. In contrast, for example, the reaction of homobifunctional cross-linkers is non-selective Yes, molecules with undesired cross-reactivity are obtained.   A preferred, useful linking group is the Pierce Chemical Company Immunotechnology Cat alog‐Protein Modification Section, (1991 and 1992) Are derived from various heterobifunctional cross-linking reagents.   Examples of such effective reagents include, but are not limited to: Not determined. Sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl 4- (N-ma                   Reimidomethyl) cyclohexane-1-                   Carboxylate; Sulfo-SIAB Sulfosuccinimidyl (4-iodo                   Acetyl) aminobenzoate; Sulfo-SMPB Sulfosuccinimidyl 4- (p-ma                   Reimidophenyl) butyrate; 2-IT 2-iminothiolane; and SATA N-succinimidyl S-acetylthio                   O-acetate.   In addition to the above explanations, the linking groups may also include nucleotides in whole or in part. And derived from nucleotide residues, both naturally occurring and modified. Can be Amines to the L-enantiomeric oligonucleotide sequences of the invention And modified nucleosides containing reactive functional groups such as sulfhydryl groups Reagents that are particularly useful for the incorporation of the tide moiety, which are not particularly limited, include, for example: Commercially available from Clonetech Labo-ratories Inc. (Palo Alto California) And these reagents include a single-bond amino modifier (Uni-Link AminoModifier) ( Catalog # 5190), Biotin-ON Phosphamidite oramidite) (Catalog # 5191), N-MNT-C6-amino modifier (N-MNT -C6AmlnoModifier) (Catalog # 5202), Amino Modifier II (AmlnoModifier) ) (Catalog # 5203), DMT-C6-3'-Amine-one (DTM-C6-3'-Am ine-ON) (Catalog # 5222), C6-thiol modifier (C6-ThiolModifier) (Catalog # 5211) and the like are included. In one aspect, the linking group of the invention is Such as amine or sulfhydryl groups available as Clontech's reagents above Derived from the reaction of reactive functional groups. One or more of these may be, for example, One or more of the protein-reactive groups described above, such as a heterobifunctional protein-reactive group With the L-enantiomeric oligonucleotide sequence of the present invention. , One or more of these are examples For example, it is incorporated into the immunoreactive agent of the present invention.   Referring again to Structure IV, I and IiIndependently, from 12 to about 50 contiguous L-enantiomeric oligonucleotide having a sequence of A row contains therein one or more members of a family of cognate flanking sequences, Each homologue of said family has from 12 to about 30 L-enantiomeric nuks Consists of a leotide unit (both homologues of said family of sequences are independently , Or a combination of cognate sequences, is often referred to hereafter as "the Sequense". )), 6 or more contiguous L-enantiomeric nucleotide units Sequence of 6 or more adjacent L-enantiomers at any position in structure IV One that does not hybridize to any other contiguous sequence of cleotide units. Be prepared. Members of the cognate flanking sequence set comprising the "sequence" are sequence I and And array Ii, And at least one such sequence is IiIs common to.   I and I in structure IViL-enantiomeric oligonucleotide The rows are complementary to the radioactive targeting moieties of structure V shown below. A typical L-enantiomeric oligonucleotide sequence is Lig oligonucleotide sequence and has a melting temperature of about 37 ° C or higher ( Melting temperature) As long as a hybrid showing Tm is formed, L-DNA, L-RNA or L-DNA modified with purine and pyrimidine bases and And L-RNA, or methylphosphonate or thiophospho Bone such as L-DNA or L-RNA analogues modified with nate or sugar chains Backbone-modified L-DNA or L-RNA (complete or partial (Partially modified) or a combination thereof. Preferred L-E The enantiomeric oligonucleotides include L-DNA and non-base modified L-DNA and And L-RNA and L-DNA and L-RNA modified except for the skeleton, More preferably, L-dA, LT, L-dG, L-dU and L-dCL-E. It is L-DNA containing an enantiomeric nucleotide unit. Currently Also preferred L-enantiomeric oligonucleotides are L-dA, LT, Contains L-dG and L-dCL-enantiomeric nucleotide units L-DNA.   In a preferred embodiment, the L-enantiomeric oligonucleotide sequence I and IiMay contain double-stranded L-DNA or L-RNA. That is, the The L-enantiomeric oligonucleotide sequence has a phase that forms a double helix molecule. It may contain complementary L-DNA or L-RNA. L-DNA or L-RNA Complementary L-enane incorporated into the radioactive targeting moiety The thiomeric oligonucleotide sequence then contains I and IiDouble-stranded containing It hybridizes to one or the other strand of L-DNA or L-RNA. this The method involves complementary L-enantiomers incorporated into a radioactive targeting moiety. The lick oligonucleotide sequence is a triple (triple helix) L-DNA hybrid. , Triple L-RNA hybrid or triple L-DNA: L-RNA hybrid I and I to formiWith double L-DNA or L-RNA of To use.   Preferred L-Enantiomeric Oligonucleotide Sequence Including "Sequence" Some non-limiting examples are shown below. The following arrays can be used individually or Considering any combination, the same includes the set defined here as "sequence". It includes a set of L-enantiomeric oligonucleotide sequences of the family.   Of course, sequence (viii) contains sequence (vii) and sequence (vii) is sequence (vi) , Sequence (vi) contains sequence (v), and so on. Therefore, in structure IV And I contains, for example, sequence (iii),iIs, for example, containing sequence (v) If I and IiBoth contain at least sequence (iii). Other in structure IV IiMay contain (viii). In this case, IiAre (i) to (vii) and (vii i) may also be included. In this case, three The rows all contain at least (iii) [and (i) and (ii)] and contain two IiWill contain at least (v) [as well as (i) to (v)]. this For points, the flanking sequence of the L-enantiomeric nucleotide (this sequence Is an L-enantiomer containing at least the sequence (i) The oligonucleotide hybridizes to all of the sequences (i) to (viii) , Which means that any member of the set of adjacent complementary sequences (individual members of this set) The bar is composed of a sequence complementary to any of (i) to (viii)). Such flanking complementary sequence sets include cI as described below. It   Preferred cognate L-enantiomeric oligonucleotiates containing a "sequence" Another set of code arrays is:   A particularly preferred sequence is L-d (TTATGGACGGAGAAGCTAA) (SEQ ID NO: 8).   Two or more L-enantiomeric oligonucleosides of the invention The tide sequence may be a chemical bond, a linking group as described above, or It can be tandemly attached by such spacing groups. L-Enantiomer of the present invention L-Enantiomeric nucleotide in a meliconucleotide sequence The sequence order of can be 5'to 3'or 3'to 5 '. L-Enantiomeric Oligonucleotide Sequences of the Invention Through the Linking Group Above To the above immunoreactive group via the 3'or 5'site, and Binds to the 3'or 5'site of the L-enantiomeric oligonucleotide Can be achieved via the derivative.   As discussed above, the "sequence" is also double-stranded L-DNA or L-RNA. Can be That is, the "sequence" interacts non-covalently to form a double-stranded L-DNA Or a complementary L-enantiomeric oligonucleotiate forming L-RNA Can consist of The binding of this double-stranded nucleic acid to the immunoreactive group as described above results in a 3 '. Site or 5'site, or L-enantiomeric oligonucleoside This can be accomplished via a derivative attached to the 3'or 5'site of the tide.   Referring again to Structure IV, QIIs two or more L-enantiomers of the invention. A spacing group that separates and binds oligonucleotide sequences. QIIs above Or a L-enantiomeric nucleotide or L-E containing 2 to about 20 L-enantiomeric nucleotide units Included in combination with an enantiomeric oligonucleotide, the sequence of which is Do n’t you meet Are adjacent to 6 or more of these L-enantiomeric nucleotide units. 6 or more contiguous L-enantiomers at any location in structure IV One that does not hybridize to any other flanking sequences in the cleotide unit It QIIs also an amino acid group, a peptide group, or a polyethylene oxide group. It may contain residues of such poly (alkylene oxide) groups. Each spacing group is 2 to about 6 L-enantiomeric oligonucleotide sequences, said sequence comprising: At least two of them can bind to those containing the sequence of the present invention. Is expected. Preferably, the spacing group comprises two L-enantiomers. Each of the oligonucleotide sequences contains the sequence of the present invention. Join. Preferably the spacing group is an L-enantiomeric oligonucleoside. It is an octido array.   A non-limiting example of a preferred spacing group consists of the following sequences .     L-d (ACT);     L-d (ACTC);     L-d (ACTCT);     L-d (CTC);     L-d (TCTC); and     L-d (CTCTC).   Particularly preferred spacing groups are L-enantiomeric oligonucleotides. : L-d (ACTCTC).   Of course, under the above conditions, that is, the L-enantiomer of the present invention, That the oligonucleotides do not contain self-associating sequences, it means that Enantiomeric oligonucleotide sequence group s) in combination with the L-enantiomeric oligonucleotide spe It still applies when considering the choice of sourcing groups.   In Structure IV, a is 0 to about 6, preferably 1 to about 6, and It is preferably from 1 to about 4, most preferably 1 or 2.   In Structure IV, p is from 1 to 10, preferably from 1 to about 6, more preferably It is preferably an integer from 1 to 3. A mixture of Z modified as defined in structure IV The immunoreactive protein containing the compound with Z thus unmodified, It is also expected to be useful in the present invention. In this case, "p" such mixtures Properties of the bulk mixture of are provided with functionality values from about 0 to about 10. Preferably, The value of bulk p is from about 0.1 to about 10.0, preferably from about 0.2 to about 5.0, More preferably from about 0.4 to about 3.   In Structure IV, E is a terminal capping group. E is L-enantiomer A nucleonucleotide group or D-enantiomerically Diminishes the effect of exonuclease enzyme activity on gonucleotide sequences? Preferably one or more D-oligonucleotide groups modified to inhibit Is preferred. E is one or more, such as an alkyl group of 1 to about 10 carbon atoms A 3'- or 5'-phosphate linked ribose containing a substituent of obtain. E is alkyl ether, aryl ether, aralkyl ether, substituted 5 such as an ether group such as an aryl ether or a substituted aralkyl ether A'- or 3'-ether group, wherein the alkyl group is from 1 to 10 carbon atoms And the aryl group contains 6 to 10 carbon atoms, and The alkyl or aryl group contains oxygen, nitrogen or sulfur atoms, Can be substituted with alkyl or aryl groups containing elemental, nitrogen or sulfur atoms It is a thing. E is alkyl ester, aryl ester, aralkyl ester 5'-O- or a substituted aryl ester or a substituted aralkyl ester. Or a 3'-O-phosphate ester group, wherein the alkyl group is from 1 to 10 Containing carbon atoms, the aryl group containing from 6 to 10 carbon atoms , Further, the alkyl or aryl group contains an oxygen, nitrogen or sulfur atom. Or an alkyl or aryl containing an oxygen, nitrogen or sulfur atom. It can be substituted with a phenyl group. E is preferably at the 5'- or 3'-position, Is a poly (alkyleneoxydyl) group on the ribosyl moiety as the ether group, Alternatively, at the 5'- or 3'-oxygen of the L-ribosyl group, an ether group or a phosphine is added. It can be a poly (alkyleneoxydyl) group linked by a fate ester. Po A poly (alkyleneoxydyl) group is, for example, poly (ethyleneoxydyl) or Poly (propyleneoxydyl) or poly (propyleneoxydyl-co-ethylene) Oxydyl) group (poly (propylene oxidyl-co-ethylene oxidyl group)). Where each polymer is from 2 to about 100 repeating units Is included. Phosphate esters containing such units are not only useful Without a phosphate ester or modified consisting of the elements of a suitable linking group as described above. Ribose is also useful. E also includes Z or L abovezTo the element of Therefore QITo form a cyclic structure. E is also two charcoal Elementary-Compounds having an internucleoside linkage of one nitrogen atom may be included. Preferred In other words, E contains poly (alkylene glycol) phosphate diester. With respect to E, the poly (alkylene glycol) moiety has from 2 to about 100 repeats. Can have units. Preferably, the poly (alkylene glycol) is poly (ethylene glycol). Glycol). Currently, poly (alkylene glycol) phosphate The preferred ester diester is tetra (ethylene glycol) phosphate diester. For the sake of convenience, it is often referred to as “Teg” or “Teg unit” hereinafter. This Una poly (alkylene glycol) phosphate diester is tandem with each other. To form dimeric phosphate sequences, trimer sequences, tetramer sequences, etc. You can. One or two such units are preferred. Uni like this also Q aboveI, Lz, LQ, I, IiAlternatively, it may bind to a Z residue. Preferred end groups E is a phosphate ester linked to an L-enantiomeric nucleotide such as T It includes a Teg unit linked by a chain. Others for L-DNA sequences Preferred end capping units are L-dA, L-dG, L -T, L-dC, and L-dU residues, or oligonucleotides containing these Includes octido sequences.   For the purposes of the present invention, the term "modified nucleotide moiety" is found in nature D-enantiomeric nucleotide or naturally occurring D-enantiomer Includes one or more chemical groups that are similar to one or more moieties of a lick nucleotide residue It is intended to mean a chemical unit that has "Modified D-enantiomer A "lick nucleotide moiety" is its chemical unit, which is one or more chemical bonds (separate In the case of, the naturally occurring D-enantiomeric nucleotide is When considered as a standing chemical unit, the nucleotide contains the chemical bond. Have. ) Is modified to contain one or more covalent bonds in one or more other chemical units. When it is modified, modified, or replaced, it contains only what is left intact. Containing or at some position the naturally occurring D-enantiomeric Part of a cleotide (eg purine or pyrimidine base moiety, hydroxyl Portion, ribose moiety, etc., or a combination thereof. After removal or deletion at the same time as the above-mentioned substitution of the other portion of the thiomeric nucleotide Includes only those chemical moieties that remain exclusively. Especially useful modified Examples of D-enantiomeric nucleotide moieties include (but are not limited to): These containing commercial functional groups such as min and sulfhydryl groups are commercially available. Commercially available and obtained from Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, California) Can, for example, these Modified D-enantiomeric nucleotide moieties and their precursors There is such a thing. Said modified nucleotide moieties and precursors thereto Includes a single-bond amino modifier (Uni-Link AminoModifier) (catalog # 5190). , Biotin-ON Phos-Phoramidite (catalo # 5191), N-MNT-C6-AminoModifier (Catalog # 5202), Amino Modifier II (Catalog # 52) 03), DMT-C6-3'-Amine-ON (DTM-C6-3'-Amine-ON) (Catalog # 5222), C6-Thiol-Modifier (Catalog # 52) 11) etc. are included. One or more of said moieties are L-enantiomers encompassing the present invention. Lig oligonucleotide sequences. In one aspect, the linking group of the invention is Amine or sulfhydryl group that can be used as the above Clonetech reagent It is derived from the reaction of such reactive functional groups. One or more of these groups may be, for example, two different groups. Have one or more of the above-described protein-reactive groups such as sensitive protein-reactive groups Included in the L-enantiomeric oligonucleotide sequences of the invention One or more are included in the immunoreagent of the present invention.   "Modified D-enantiomeric nucleotide moiety" means D-enantiomer Reduce the effect of exonuclease enzyme activity on lick oligonucleotide sequences Includes a D-enantiomeric nucleotide moiety modified to inhibit sell. It is 3'- or 5'-phosphate linked Ribose or 3'- or 5'-phosphate linked 2'-deoxyribo It is a base group. These are 1 such as alkyl consisting of 1 to about 10 carbon atoms. The above substituents, or alkyl or aryl or aralkyl or substituted Aryl or aralkyl ether (provided that the alkyl group is 1 to about 10 It may contain carbon atoms and such alkyl or aryl groups may contain oxygen, nitrogen or Preferably containing a sulfur atom or substituted by a substituent containing these sell. ), Or a poly (alkyleneoxydyl) group, preferably 5'- Or at the 3'-ribose site, respectively, or at other positions (these substitutions The group will reduce or inhibit the action of exonuclease enzyme activity. ) . A "modified D-enantiomer" including a phosphate group containing the above substituents. "Meric nucleotide moieties" are also useful, in addition to the elements of suitable linking groups described above. Phosphate esters containing or modified ribose are also effective. "Qualified "D-enantiomeric nucleotide moiety" also includes residues of Z, which Is L abovezBy the element ofITo form a cyclic structure. "Qualified The "D-enantiomeric nucleotide moiety" also includes two carbon atoms-1 nitrogen atom. A compound having an internucleotide bond of an elementary atom may be included.   Preferably, the "modified D-enantiomeric nucleotide moiety" is a po Contains poly (alkylene glycol) phosphate diester. The above "qualified Associated D-enantiomeric nucleotide moiety ". The glycol) moiety has 2 to about 100 repeat units. Preferably poly (Alkylene glycol) is poly (ethylene glycol). at present A preferred poly (alkylene glycol) phosphate diester is tetra ( Ethylene glycol) phosphate diester, often hereafter referred to as "Te g "or" Teg unit ". Such poly (alkylene glycol ) Phosphate diesters bind to each other in tandem to form dimeric phosphate esters Form sequences, trimer sequences, tetramer sequences, and so on. 1 or 2 such units Is preferred. Such a unit also has a Q as described here.I, Lz, LQ , I, IiAlternatively, it may bind to a residue of Z. Preferred "modified D-enantio A "meric nucleotide moiety" is a D-enantiomeric nucleotide such as LT. Include Teg Units Linked by Phosphate Ester Linked to Otide .   Referring to the radioactive targeting immunoreagent described in structure V, structure IV Of the set of L-enantiomeric oligonucleotides containing the "sequence" of I. Preferred L-enantiomeric oligonucleotides cI complementary to members An example of a set of L-DNA L-enantiomeric oligonucleosides such as It includes, but is not limited to, tide.   Preferred cognate L-enantiomers which may comprise a set complementary to the "sequence" of structure IV Other sets of lick oligonucleotide sequences are as follows.   Particularly preferred complementary sequences include the following sequences.   The L-enantiomeric oligonucleotides of "I" listed above in structure IV L-enantiomeric oligonucleotids of the above cI of structure V related to sequence The complementarity of nucleotide sequences is such that the relative orientation of each 5'to 3'or 3'to 5'or vice versa Whether or not it depends on the relative direction of each. Of the corresponding I and cI When the Tm of the hybridized complex formed between the sequences is 37 ° C or higher Preferably there is.   In a preferred embodiment, the L-enantiomeric oligonucleotide sequence cI is a dinucleotide. It may include double-stranded L-DNA or L-RNA. That is, the L-enantiomer Quoligonucleotide sequences are complementary L-DNA or L forming a double helix. -May contain RNA. Complementation incorporated into non-radioactive targeting immunoreagents A typical L-enantiomeric oligonucleotide sequence is L-DNA or LR Double-stranded L-DNA or L- that is composed of NA and then contains cI It hybridizes to one or the other strand of RNA. In this way, non-radioactive Complementary L-enantiomerically incorporated into targeting immunoreagent The gonucleotide sequence has a double L-DNA or L-RNA of cI and a triple ( Triple helix) L-DNA, triple L-RNA, or triple L-DNA: L-RNA Interact to form an ibrid.   In structure V, QcIIs a spacing group. QcIIs Q explained in Structure IVcI Can be selected from Preferably QcIIs from 2 to about 30 L-enantiomers The contiguous sequence of the L-enantiomeric oligonucleotide of the nucleotide contains. In this case, this sequence is not self-associative, and has 6 or more L-enantiomers. The flanking sequences of the melic nucleotide units are 6 or more at any position in structure V. Any other flanking of the above flanking L-enantiomeric nucleotide units It does not hybridize with the sequence. QcIIs also the L-enantiomeric ori Gonucleotides, preferably sequences such as (xxvii) to (xxxii) above Thus, it may consist of what is complementary to the "sequence" in Structure IV. Preferably QcI Contains 1 or 2 such sequences.   In structure V, L1, L2, And L3Are independently chemical bonds, preferably phosphorus. Acid ester bond, or L in the above structure VzAnd LQIs a linking group defined as It L1, L2, And L3Also independently QcIMay be included.   In structure V, W1, W2, And W3Is a residue of a chelating group. Of the present invention Chelating groups are one or more of a wide range of chelating groups that can have radionuclides that can bind to them. A coating agent may be included. As is well known, chelating agents coordinate with metals. By combining, a chelation complex Or contains a donor atom capable of forming a cyclic structure called a chelate Compound. The compounds in this category are the Kirk-Othmer Encyclopedia of Chem. ical Technology, vol. 5,339-368.   Suitable chelating agent residues are independently selected from: tripolyline Polyphosphates such as sodium phosphate and hexametaphosphoric acid; ethylenedia Mintetraacetic acid, N- (2-hydroxyethyl) ethylene-diaminetriacetic acid, Nitrilotriacetic acid, N, N-di (2-hydroxyethyl) glycine, ethylene bi Bis (hydroxyphenylglycine) and diethylenetriaminepentaacetic acid Una aminocarvone Acids; acetylacetone, trifluoroacetylacetone, and thienoyltri 1,3-diketones such as fluoroacetone; tartaric acid, citric acid, gluconic acid and And hydroxycarboxylic acids such as 5-sulfosalicylic acid; ethylenediamine, Diethylenetriamine, triethylenetetramine, and triaminotriethyl Polyamines such as amines; triethanolamine and N- (2-hydroxy Ethyl) amino alcohols such as ethylenediamine; 2,2'-dipyridyl, 2,2'-diimidazole, dipicolinamine and 1,10-phenanthroly Aromatic heterocyclic bases such as salicylaldehyde, disulfopyrocatechol, And phenols such as chromotropic acid; 8-hydroxyquinoline and o Aminophenols such as oxime sulfonic acid; dimethylglyoxime and sali Oximes such as tilaldoxime; polycysteine, polyhistidine, polya Such as sparagic acid, polyglutamic acid, or combinations of such amino acids Peptide having a chelating function at the base; disalicylic aldehyde 1,2- Schiff bases such as propylenediimine; tetraphenylporphine and lid Tetrapyrrole such as cyanine; toluenedithiol, meso-2,3-dime Lucaptosuccinic acid, dimercaptopropanol, thioglycolic acid, potassium ethyl Luxanthate, sodium diethyldithiocarbamate, dithizone, diethyl Dithiophosphoric acid, and sulfur compounds such as thiourea; Dibenzo [18] crown -6, (CH3)6-[14] -4,11-diene N4, And macrocyclic compounds such as (2.2.2-cryptate); and nitrilotri Methylene-phosphonic acid, ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid), and And a phosphonic acid such as hydroxyethylidenephosphonic acid, or two or more of the above reagents. Phosphonic acid, such as the combination above.   A preferred residue of the chelating agent contains a polycarboxylic acid group and is Min-N, N, N ', N'-tetraacetic acid (EDTA); N, N, N', N ", N"- Diethylene-triamine pentaacetic acid (DTPA); 1,4,7,10-tetraazaji Clododecane-N, N ', N ", N" -tetraacetic acid (DOTA); 1,4,7,10 -Tetraazacyclododecane-N, N ', N "-triacetic acid (DO3A); 1-Oki Sa-4,7-10-triazacyclododecane-N, N ', N "-triacetic acid (OTT A); trans (1,2) -cyclohexanodiethylenetriaminepentaacetic acid (CD TPA) is included.   Preferred residues of chelating agents contain polycarboxylic acid groups, including: Be done.   In one aspect, other suitable residues of chelating agents are described in US Pat. No. 5,078,985. Techneti, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Contains proteins modified to chelate metals such as um and rhenium. Have.   In another aspect, suitable residues of chelating agents are for example those disclosed in US Pat. No. 4,444,6. 90; 4,670,545; 4,673,562; 4,897,255; 4,9 65,392; 4,980,147; 4,988,496; 5,021,556. And N containing compounds as disclosed in 5,075,0993S and And N2S2Derived from.   Other suitable residues of chelating agents are disclosed in PCT / US91 / 08253 There is. This disclosure is incorporated herein by reference. In the above structure V, W1 , W2, And W3Such reagents contain a large number of chelating agent residues. Can be linked together by a linking group as described above in structure IV.   Chelating agent W of structure V1, W2, And W3Is a chemical bond or linking group, That is, L of the above structure V1, L2, And L3L-enantiomerically complementary via Oligonucleotide moiety cI or spacing group QcIIndependently coupled to. Good Preferred linking groups include: amino, imido, nitrilo, and i Nitrogen atoms within groups, such as mino groups; methylene, ethylene, propylene, butylene And alkylene, preferably containing 1 to 18 carbons, such as hexylene Wherein such an alkylene is one or more alkylenes such as oxygen, nitrogen and sulfur. Groups containing teloatoms or heteroatoms optionally in the skeleton (interrupted) thing; Carbonyl; Sulfonyl; Sulfinyl; ether; Thioether; Esters, namely carbonyloxy and oxycarbonyl; Thioesters, ie carbonylthio, thiocarbonyl, thiocarbonyloxy, And oxythiocarbonyl; Amides, ie iminocarbonyl and carbonylimino; Thioamides, ie iminothiocarbonyl and thiocarbonylimino; Thio; Dithio; Phosphate; Phosphonates; Urelene; Thiourelene; Urethane, ie iminocarbonyloxy, and oxycarbonylimino; Thiourethanes, i.e. iminothiocarbamyloxy and oxythiocarbonylii Mino; Amino acid bond, i.e. the group     However, k = 1 and X1, X2, X3Are independently H, 1 to 18, preferably Al containing 1 to 6 carbon atoms Kill (eg, methyl, ethyl, and propyl), where the alkyl is optionally Containing one or more heteroatoms (eg oxygen, nitrogen and sulfur) therein, 6 A substituted or unsubstituted aryl having 18 and preferably 6 to 10 carbon atoms ( For example, phenyl, hydroxyiodophenyl, hydroxyphenyl, fluoro Phenyl and naphthyl), preferably aral containing from 7 to 12 carbon atoms Kill (eg benzyl), preferably 5 to 7 nuclear carbons and S, N, P or Heterocyclyl containing one or more heteroatoms such as O (preferred Examples of said heterocyclic groups are pyridyl, quinolyl, imidazolyl, and thienyl); A hetero-cyclylalkyl, wherein said heterocycle and alkyl moiety Minutes are preferably those described above; Or a peptide bond, ie the group     However, k> 1 and each X1, X2, X3Independently of the above X1, X2, X3The theory Represents the group identified. 2 such as alkyleneimino and iminoalkylene The above linking groups may be used. L of structure IVzOr LQTampa explained above against Heterogeneous and homogeneous bisensitive conjugation chemistry and cross-linking Other linking groups, such as those commonly used in chemistry, are suitable for use herein. You can expect to be doing.   Particularly preferred linking groups include unsubstituted or substituted phosphate ester containing amino groups. Of the chelating agent via the isothiocyanate group on the chelating agent Those which form a thiourea group when attached to.   The binding group is a chelate W1, W2, Or W3And L-enantiomeric Prevents coupling reactions between oligonucleotides cI or spacing groups It may contain various substituents which do not harm. The linking group may also, in other cases, be However, during the coupling reaction, the reaction that is generally known in the art may be prevented. A protective protecting group is used to prevent such interference and the substituent is not It contains substituents that are later regenerated by appropriate deprotection. The linking group is also a It contains a substituent introduced after the pulling reaction. For example, the linking group may be halogen ( Substituents such as F, Cl, Br, or I); ester groups; amide groups; Preferably an alkyl containing from 1 to about 18, more preferably from 1 to 4 carbon atoms. (Eg, methyl, ethyl, propyl, i-propyl, butyl, etc.); preferably Substituted or unsubstituted containing from 6 to about 20, more preferably from 6 to 10 carbon atoms Aryl (eg phenyl, naphthyl, hydroxyphenyl, iodophenyl , Hydroxyiodophenyl, fluorophenyl and methoxyphenyl); Preferably a substituted or unsubstituted aralkyl containing from 7 to about 12 carbon atoms (eg Benzyl and phenylethyl); alkoxy, where the alkyl moiety is , Containing 1 to about 18 carbon atoms as described for alkyl above; An alkoxyaralkyl such as cibenzyl; preferably 5 to 7 nuclear carbons and Saturated or unsaturated hetero containing hetero atoms such as S, N, P or O Heterocyclyl (preferred heterocyclic groups are pyridyl, quinolyl, imidazoli A carboxy group; a carboxyalkyl group, Preferably, the alkyl portion of the group contains from 1 to 8 carbon atoms; or It may be the residue of a chelating group.   In structure V, M1, M2And M3Is greater than or equal to +1 An element having a different oxidation state, at least one of which is a radionuclide Including. Preferably M1, M2And M3Each is a metal isotope, Radioactive metal isotopes (here often referred to as metal radioisotopes The radioisotope is a therapeutic or diagnostic imager. It is effective for application to mobile phones. Preferred metal radioisotopes are, for example, Sc, F e, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr, Zn, Ge, Mo, Tc, Ru , In, Sn, Re, Sr, Sm, Lu, Eu, Ru, Dy, Sb, W, Re, It is selected from Po, Ta and Tl. Existence from such radioisotopes Useful radiations include spontaneous alpha, beta, gamma, x-ray, and po Ditron radiation, and radiation that is induced during the process of electron capture and internal conversion contains. The radiation can be pure alpha, pure beta, pure gamma, etc. Najun One kind or a combination of nuclear radiation such as beta and gamma radiation etc. Get   For example, a radio eye having radiation consisting of alpha radiation or beta radiation Sotopes are useful in therapeutic applications, especially in the treatment of cancer. Useful for therapeutic applications For isotopes, for example,207Pb,211Pb,208Pb,212pb,212Bi,207T i, and223Isotopes that emit alpha radiation, such as Ra;Four 7 Sc,66Ga,67Cu,77As,90Y,105Rh,109Pd,111Ag,121Sn ,127Te,143Pr,149Pm,153Sm,161Tb,166Ho,169Er,177Lu ,188Re,186Re,191Os and199A that emits beta radiation such as Au Isotopes; and for example97Ru,177mSn,199Sb,128Ba and197Hg Isotopes that emit radiation as a result of electron capture and internal conversion processes such as Includes a taupe. Particularly preferred radioisotopes for therapeutic applications212P b,212Bi,90Y,177Lu,186Re, and188Re is included. Most preferred Kuha90It is Y.   Radiographs having radiation containing, for example, gamma radiation or positron radiation Isotopes have applications in diagnostic imaging, especially in cancer diagnostic imaging. It is for. Isotopes useful for diagnostic imaging applications include:47Sc,51 Cr,67Cu,67Ga,97Ru,99mTc,111In,117 mSn,141Ce,167T m,199Au,87Y and203Isotope that emits gamma radiation such as Pb ;and44 Sc,48V,64Cu,66Ga,69Ge,72As,86Y and89Zr-like po Included are isotopes that emit ditron radiation. Response to diagnostic imaging Useful isotopes for64Cu,99mTc,111In and87Y is included . Currently most preferably99mTc and111In.   In another aspect, other suitable radionuclides are Q, for example by covalent bonding.cITake Can be incorporated into these, including radioactive isotopes of iodine (eg,one two ThreeI,124I,12 Five I and131I) and211Includes radioactive isotopes of astatine such as At Get caught   For example, a method of producing an image useful for diagnostic imaging of mammalian cancer, The radioisotope used in the compositions and methods of the present invention releases image by image. Detecting a shot. The method of generating said image is for example radioactive Like a gamma camera commonly used for labeled immunoscintigraphy (RIS) The use of well-pointed camera detectors, and positron emission radiography (PET) and And links commonly used for single photon emission topography (SPET) Equipped with linked X-ray detectors.   In Structure V, x, y, and z are independently zero or 1, but x, y , Or at least one of z is 1;   w and b are zero or integers from 1 to about 4.   Preferred compositions can be prepared as outlined in the scheme below.                           Scheme 6 Antibody amines using heterobifunctional binding reagents SMCC, 2-IT, or SATA Derivation of radicals   In Scheme 6, proteins (antibodies such as ING, antibody fragments, yeast Is a thiolated L-enantiomeric oligonucleotide. (Ab-M) or a maleimide group-containing L-enantiomeric oligonuclec It is chemically modified by covalent coupling with leotide (Ab-SH). Conversion The biological modification may be a bifunctional cross-linking agent, preferably a protein functional group (eg Ab-A). May have a group capable of reacting with the amine in the amine) and may further react with a thiol group It is carried out using a heterobifunctional cross-linking agent which may also have groups. The latter includes haloacetyl, halo-acetamidyl, maleimide, and active disulfur. Selected from fido functional groups.   The maleimido and thioalkyl groups are linked to a heterobifunctional linker, a sulfoskelton. Cinimide-4- (M-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxy Rate (sulfo-SMCC), 2-iminothiolane (2-IT), or succinate Nimidyl-S-acetylthioacetate (SATA) It The reaction between the antibody-containing sample and the linking group is It is performed for a time sufficient to introduce on average about 0.5 to 3 binder molecules. Derived The derivatized antibody is a gel filtration column, more preferably Sehade Purified using x-G-25 column.   Non-limiting examples of preferred protein complexes prepared are shown below. .     ING-1-NH-CO-cyclohexane-CH2-Maleimide;     ING-1-NH-C (= NH)-(CH2)3-SH     ING-1-NH-CO-CH2-SH   ING-1 is preferably an amino acid such as lysine amine represented by Ab-amine. It is a protein containing an amino acid group.                           Scheme 7 L-Energy via amine groups using heterobifunctional coupling reagents SATA and SMCC Non-meric oligonucleotide "Ld (I-QI-I) ”(deriva tization)                           Scheme 8 Having an amine group and a sulfhydryl group for using a heterobifunctional binding reagent L-enantiomeric oligonucleotide "L-d (I-QI-I) " (Derivatization)                           Scheme 9 L-Enantiomers with biotin for using heterobifunctional binding reagents Oligonucleotide "5'-TrS-I-QI-I-3'-NH2Derivation of (deriva tization)                           Scheme 10 Biotinylated phosphoramidite reagent for using heterobifunctional binding reagents "5'-HS-L-d (I-QI-I) 3'-biotin "   L-enantiomeric oligonucleotides and modified L-enantiomers Meric oligonucleotides are those of D-enantiomeric oligonucleotides. Are synthesized according to standard methods such as solid phase synthesis well known in the art for. L- Enantiomeric oligonucleotide Ld (I-QI− Derivatization of I) into derivatives is 5'-TEG-L-energy. Antimeric oligomer-NH2Reaction of -3 'with SATA or SMCC L-enantiomer oligomer-3'-SH or L-enantiomer Achieved by obtaining a melic oligomer-3'-M (see Scheme 7) It   The following L-enantiomeric oligonucleotides are preferred.   These L-enantiomeric oligomers also contain sensitized L-enantiomers. Antimeric oligomer: 5'-HS-L-d (I-QI-I) -NH2-3 ' To introduce a bisensitive reagent at the 5'- and 3'-positions as shown in Scheme 8. It is obtained by The introduction of biotin at the 3'-position is also shown in Scheme 9. 5'-HS-L-d (I-QI-I) -NH2-3 'and biotin-i This is accomplished by reaction with the midocarboxylate.   It has a protected amine, thiol, or carboxy at the end, while the phospho has Effective spacer with luamidite (See Scheme 10).   Application of these spacers is shown in the following reactions.                           Scheme 11     Assembly of Ab-M + L-d (oligo) -5'-SH                           Scheme 12     Assembly of Ab-SH + L-d (oligo) -3'-M   As shown in Scheme 11, a modified maleimide antibody (Ab-M, 6) and a thiolated L-enantiomeric oligonucleotide ( 5'-HS-L-d (I-QI-I) NH2-3 ') was assembled and modified Antibody-L-enantiomeric oligonucleotide complex (Ab-M-5'-S -Succinimide-Ld (I-QI-I) -NH2-3 '). Similarly Ab -SM-3'-Ld (I-QI-I) -TEG-5 'is shown in Scheme 13. Ab-SH and 5'-TEG-L-d (I-QI-I) -maleimide -3 '.                           Scheme 13 Complementary L-oligonucleotide "5'-TMT-L-d (cI) -TMT-3 '. "   In this scheme, L-d (oligo) is L-deoxyribonucleotide , L-enantiomeric oligodeoxyribonucleotides such as Ld (I) D (cI) is a complementary L-enantiomeric oligodeoxyribo Represents a nucleotide sequence; L-d (I-QI-I) is L-enantiomeric Rigodeoxyribonucleotide; TMT is terpyridine ) Represents a member of the chelate set, preferably those described above. The preferred TMT is 4 '-(3-isothiocyanato-4-methoxyphenyl) -6,6 "-bis [N , N-di (carboxymethyl) -aminometh ]]-2,2 ': 6', 2 "-terpyridine, TMT-NCS.   As shown in Scheme 13, 5'-H2N-L-d (cI) -NH2-3 ' And the desired 5'-TMT-L-d (cI) -T by reaction with 2 mol of TMT-NCS. Obtain MT-3 '.   Having a protected amine, thiol, or carboxyl group at one end On the other side there are other effective binders with phosphoramidites. Application of these reagents Is shown in the example.   In a preferred embodiment said radioactive targeting in a pharmaceutically acceptable medium. Effective dosages of reagents are those described above for compositions containing radioactive metal isotopes. Complementary containing one or more chelating groups such as oligodeoxyribonucleotides A composition containing a unique L-enantiomeric oligonucleotide sequence, The molar amount of metal isotope of the radionuclide is less than that of the chelating group Prepared by exposing as. This exposure is dependent on the gold to the chelating agent. Uptake of the genus isotope lasts for an effective time to occur.   In a preferred embodiment, the non-radioactive targeting agent in a pharmaceutically acceptable medium. A non-radioactive targeting immunity is administered to the patient at an effective dose of Epidemiological reagents accumulate at a target site, such as the tumor site of the patient. Continued pharmaceutical Effective dose of the radioactive targeting reagent in a vehicle acceptable to The radioactive targeting reagent is administered to a patient and a target site (the target site is There is non-radioactive targeting immunoreagent accumulated at the major site in the patient. Existence ) Is accumulated.   The present invention provides for oral administration in solid or liquid form for parenteral injection. Therefore, one or more non-toxic physiologically acceptable carriers for rectal or topical administration etc. The body, adjuvants or vehicles (collectively referred to herein as carriers. ) Together with one or more immunological reagents of the invention formulated in a composition.   The composition can be administered orally, rectally, parenterally (intravenously, intramuscularly) to humans and animals. Or subcutaneously), intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, intravesically, topically (powder, ointment or Or as a buccal or nasal spray. Can be   Compositions suitable for parenteral injection are sterile physiologically acceptable aqueous solutions and Are non-aqueous solutions, dispersions, suspensions or emulsions, and sterile injectable solutions. Includes sterile powders that can be reconstituted into liquids or dispersions. Suitable aqueous and non-aqueous Examples of organic carriers, diluents, solvents or vehicles include water, ethanol, polyol ( Propylene glycol, polyethylene glycol, glycerol etc.) Suitable mixtures, vegetable oils (such as olive oil) and oleic acid Injectable organic esters such as ethyl are included. Appropriate liquidity is Required in the case of dispersions by using a coating agent such as cutin By maintaining different particle sizes, and by using surfactants Can be maintained.   These compositions also contain additives such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents, and dispersing agents. It may also contain tubant. Inhibiting the action of microorganisms includes, for example, paraben, By using various antibacterial and antibacterial agents such as robutanol, phenol and sorbic acid. Guaranteed. It may also be desirable to include isotonic agents, for example sugars, sodium chloride and the like. . Prolonging absorption of an injectable pharmaceutical form may be accompanied by agents that delay absorption such as moth. Can be done by using aluminum stearate and gelatin .   Solid dosage forms for oral administration include capsules, tablets, pills, powders and condyles Contains grains. In such solid dosage forms, the active compound is sodium citrate. At least one conventional inert excipient such as strontium or dicalcium phosphate Agent (or carrier), or (a) eg starch, lactose, sucrose, glucose Fillers or extenders such as course, mannitol and silicic acid, (b) eg For example, carboxymethyl cellulose, alginates, gelatin, po Binders such as Rivinylpyrrolidone, Sucrose and Acacia, ( c) humectants, eg glycerol, (d) eg agar -Agar-agar, calcium carbonate, potato or tapioca starch, Like ruginic acid, some silicate complexes, and sodium carbonate A disintegrant, (e) a solution set retarder such as paraffin, (f) eg 4 Absorption enhancers such as quaternary ammonium compounds, (g) cetyl alcohol, And wetting agents such as glycerol monostearate, (h) examples Adsorbents such as kaolin and bentonite, and (i) eg tar C, calcium stearate, magnesium stearate, solid polyethylene Mix with lubricants such as recall, sodium lauryl sulphate or mixtures thereof To be done. In the case of capsules, tablets and pills, the dosage form also contains buffer Be done.   Similar types of solid compositions also include lactose or lactose as well as high molecular weight polyesters. Soft and hard filled gelatin with excipients such as ethylene glycol It can be used as a filler in a tin capsule.   Solid dosage forms such as tablets, dragees, capsules, pills and granules are enteric-coated. Coatings such as and other known in the art and It can be prepared using shells. These may contain opacifying agents, which Release of one or more active compounds in a delayed manner in some parts of the intestinal tract Such a composition can also be used. Examples of embedding compositions that can be used are polymeric materials. And wax.   The active compounds can also be microcapsules, if appropriate with one or more of the above-mentioned excipients. It may also be in the form of cells.   Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions , Suspensions, syrups and elixirs. Liquid in addition to active compound Dosage forms include sterile materials commonly used in the art, such as water or other solvents. Diluents such as ethyl alcohol, isopropyl alcohol, Ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzo Ate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylform Amides, oils, especially cottonseed oil, peanut oil, corn germ oil, ori Oil, castor oil, and sesame oil, glycerol, tetrahydrofurfuryl Fatty acid esters of alcohol, polyethylene glycol and sorbitan, May contain solubilizers and emulsifiers such as mixtures of these materials and the like.   In addition to such inert diluents, the compositions also include wetting agents, emulsifying agents and suspending agents. Adjuvants such as agents, sweeteners, flavoring agents, and flavoring agents may be included. Activation In addition to the suspension, the suspension may contain, for example, ethoxylated isostearyl alcohol. , Polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cells Loin, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tiger Suspending agents such as Gagant, or mixtures of these substances and the like may be included.   Compositions for rectal administration are preferably suppositories. The suppository is a compound of the present invention. Objects such as cocoa butter, polyethylene glycol or suppository wax A suitable non-irritating excipient or carrier which is solid at normal temperatures but Those that are warm and liquid, and therefore dissolve in the rectal or vaginal opening and release the active ingredient Can be prepared by mixing and.   Dosage forms for topical administration of a compound of this invention include ointments, powders and sprays. And inhalants. The active ingredient may be physiologically as required under sterile conditions. Acceptable carrier and Mixed with any preservative, buffer, or propellant. Ophthalmic formulation, ocular Ointments, powders and solutions are also contemplated as being within the scope of this invention.   The actual dosage level of active ingredient in the compositions of the invention will depend on the particular composition and dosage. Provides an effective amount of the active ingredient to obtain the desired therapeutic response to a given method Can change. Therefore, the selected dose level will depend on the desired therapeutic effect, Route, the desired duration of treatment and other factors.   For the treatment of a compound of this invention administered to a host in single or divided doses. The total daily dose for administration is, for example, about 100 picomoles per kilogram body weight. From about 5 micromolar. Dosage unit composition includes daily dosing Submultiples of such an amount that can be used to make the amount Is included. However, the particular dose level for any individual patient is: General health status, sex, diet, frequency and route of administration, rate of absorption and excretion Factors, including combination with other drugs, as well as the severity of the individual disease being treated It will be understood that it depends on   In another aspect, the invention is a method of diagnosis, wherein such diagnosis is required. Administering to a mammal an amount of a composition of the invention effective for therapeutic imaging Directed to a method comprising: For use in medical procedures according to the invention The method of imaging for treatment is to treat the body of the test subject in need of therapeutic images. Administering an amount of the composition described above that is effective to produce an image for use. This The method of pharmacy An amount of the non-radioactive tag in a non-radioactive medium effective to produce a therapeutic image The targeting immunoreagent is administered to the patient, and the non-radioactive targeting immunity is Reagents accumulate at target sites within the patient, such as tumor sites. Continued pharmaceutical A dose of the radioactive target effective for diagnostic imaging in a vehicle acceptable to A targeting reagent is administered to the patient and the radioactive targeting reagent is Site (this target site is the non-radioactive site accumulated at the tumor site in the patient) Targeting immunoreagent is present. ) Is accumulated in. Next, the image pattern To visualize.   Diagnostic of compounds of the invention administered to a host in single or divided doses The total dose for the imaging of, for example, about 1 picomole per kilogram body weight. From about 0.5 micromolar. Effective in dosage unit compositions Such as can be used to be the dosage of imaging to make a diagnosis Included are quantities that are submultiples of the quantity. But any individual patient Dosage levels specific to: weight, general health, sex, diet, Frequency and route, rate of absorption and excretion, combination with other drugs, and treatment It will be appreciated that it will depend on a variety of factors, including the severity of the particular disorder being treated.   In addition to human patients, the subjects tested were rabbits, dogs, cats, monkeys, sheep, pigs, Animal species such as horses, bovines and the like may be included.   Following administration of the composition of the invention, the subject animal is administered the composition Objects are distributed throughout the subject and maintained for a time sufficient to penetrate animal tissue. Non-release Sufficient time for the radio-targeted immunoreagent is generally from about 1 hour to about 2 It is a week or longer, preferably about 2 hours to about 1 week. preferable90Radiation like Y Sufficient time for the oxidative targeting reagent is generally in the half-life of the irradiating species. Thus, such times are measured from about 1 to about 10 half-lives or more, preferably about It ranges from 2 hours to about 6 half-lives.   The following examples further exemplify the invention, but in any method It should not be construed as limiting the ram. Specific embodiments of the invention are described in the examples below. Show.                               An example     Example 1   Design of L-enantiomeric oligonucleotides   Antibody Z, linking group LzAnd the group LQ, And L-enantiomeric oligonucleosides Cide sequence I, spacing group QI, The second sequence Ii, And end capping group E The targeting immunoreagent of the present invention shown in Structure IV provided was designed as follows. did. In this case, analogs of the desired L-enantiomeric oligonucleotide As a model of physical properties, the enantiomer D-enantiomeric oligonucleoside is used. Expected complementary binding properties between complementary pairs of otide were utilized.   The sample enantiomer, ie, the following sequence (herein referred to as SEQ ID NO: 32) is also included. One naturally occurring D-enantiomeric oligodeoxyribonucleotide is The suitability was analyzed according to the criteria previously shown for structure IV. In its structure IV And group Lz, I, QI, Ii, And LQAnd E are the following as D-enantiomers: Represented as:   "Oligo" computer software designed for D-enantiomers A (National Biosciences) Analysis of the D-enantiomeric oligonucleotide sequence of It was revealed that five complementary regions were included. All such areas , Hairpin loops with different degrees of overlap. These self The total negative free energy change (ΔG's) for self-complementary region is -28.3kc It was al / mol. Therefore, this D-enantiomeric oligonucleoside The melting temperature was predicted to be 86 ° C. in 1.0 molar salt for tide. The most stable self-complementary region (△ G = -15Kcal / mol) contains 8 base pairs. And most of them correspond to the palindrome of the BAM-1 restriction site. It was. In the presence of these self-complementary regions, the D-enantiomer complementary to this sequence The sequence of a meliconucleotide hybridizes to its full length. I can't do it. By inference, an enantiomer of this same sequence L-enanti Omeric oligonucleotide sequence and L-enantiomeric oligonucleotide The L-enantiomeric oligonucleotide sequence complementary to the otide sequence also It is capable of achieving its full-length hybridization in the presence of complementary enantiomeric regions. I can't. Then iterative analysis excludes excess base pairing To modify the D-enantiomeric oligonucleotide sequence (and By the corresponding modification of certain L-enantiomeric oligonucleotides) Substitution of selected bases within the complementarity region is a criterion outlined for Structure IV. Made according to. It also has a spiral conformation. Of the two corresponding complementary sequence end groups, D-cI and L-cI The D-enantiomer sequences I and II and the two L-enantiomer sequences are To ensure that they will be at right angles to each other when hybridizing, D-enantiomer nucleotide and additional L-enantiomer Nucleotides were also inserted into the corresponding spacer sequences.   In this way, a novel D-enantiomeric oligonucleic acid having the sequence Cleotide (SEQ ID NO: 33) was designed and then synthesized. L- which is a mirror image The enantiomer (SEQ ID NO: 34) was synthesized and the L-enantiomer was immunoreactive. Complexed with the offspring (ie to antibodies such as ING-1):   This L-enantiomeric oligonucleotide (SEQ ID NO: 34) contains 6 L-enantiomeric nucleotide spacer [QI= L-d (ACTCTC)] Two identical L-enantiomeric nucleotide sequences linked together (ie, I = Ii = L-d (TTATGGACGGAGAAGCTAA); SEQ ID NO: 8). 5 L at the 3'and 3'endszRadical and LQEThe group contains X and Y groups. X and Y are each Groups independently containing amines (for example, those available from Clontech Ind-ustries. The groups containing these amines will often be referred to as "NH2Or Represented as "amine". ) Or one of X and Y contains an amine May be composed of one or more TEG groups shown above. in addition Desirably, one of X and Y also has a terminal hydroxyl group (in this case Thus, the 3'-YT within the above sequence is deoxyribosylated when removed from the solid support. OH, more preferably X is ammonium hydroxide to deprotect the amine group. It was obtained by removing the DMT group with an acid at the end of the synthetic route before protection. 5'OH group. ) Or one of X and Y is also Phosphate ester group (in this case, 3'-TY or 5'-X is -OPO3 H2The groups or ionized salts such as their sodium salts. ) Can be Such a phosphate end group will have a 5'-OH end group at the end of the synthesis. 2-cyanoethyl Obtained by treatment with N, N-diisopropylchlorophosphoramidite Be done. Subsequent reaction with ammonium hydroxide and oxidation leads to a terminal at X Obtain a phosphate group. The 3'-phosphate group synthesizes an oligomer, which After removal from the solid support, treating the 3'-hydroxyl group with phosphoric anhydride, It can then be introduced by hydrolysis with water.   Therefore, in one aspect, 5'-Teg-L-d (I-Q is simplified for simplicity.I-I) This L-enantiomeric oligonucleotide, designated -3'-amine, is Below is: -D (I-QI-I) -3 'amine.   In another aspect, 5'-amine-L-d (I-QI-I) -3'Teg and simplified This L-enantiomeric oligonucleotide represented by RU:   In another aspect, 5'-amine-L-d (I-QI-I) -3'OH This L-enantiomer represented as The oligonucleotides are: -QI-I) -3'-OH.   In another aspect, 5'-amine-L-d (I-QI-I) -3'OPO3H2And simple This L-enantiomeric oligonucleotide, represented in abbreviated form, is Is:     Example 2 (2a) Ld (I-QI-I); 5'-L-d (Teg-I-QI-I) -3 ' -NH2Synthesis of (SEQ ID NO: 31)   This L-enantiomeric oligonucleotide was originally synthesized as a naturally occurring D -Provided by the manufacturer to be used for the synthesis of enantiomeric oligonucleotides The Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer (Appl ied Biosystems oligonucleotide synthesizer). Exist in nature Trityl for the synthesis of D-enantiomeric oligonucleotides (tr The method applicable to the ityl-on) protocol is instructed by the device manufacturer. L-2 prepared as above except for the D-enantiomer. -Deoxynucleotide phosphoramidite reagent precursor (5'-dimethoxide Richil L- Cytidine-3'-O-phosphoramidite, 5'-dimethoxytrityl L-a Denosine-3'-O-phosphoramidite, 5'-dimethoxytrityl L-g Anosine-3'-O-phosphoramidite, and 5'-dimethoxytrityl L -Thymidine-3'-O-phosphoramidite) modified to be used instead . Clonetech's single bond amino modifier (uni-l as a precursor to the 3'-amine group. ink Amino Modifier) was used. TEG group, ie 5'-dimethoxytrityl L- By a phosphoric acid ester linked to thymidine-3'-O-phosphoramidite The tetra (ethylene glycol) phosphate diester linked in the present invention is Used at the 5'end of the chain [where 5'-dimethoxytrityl L-thymidine-3 The'-O-phosphoramidite is the L-enzyme disclosed in WO / 92/02534. It is an enantiomer (enantiomer). Also, WO / 92/02534 describes 5'-dimeth. Phosphate bound to xytrityl D-thymidine-3'-O-phosphoramidite Ester linked (related to tetra (ethylene glycol) phosphate diester To do. ]. Synthesis of the entire L-enantiomeric oligonucleotide followed by salt The protecting group of the group and the solid support were removed using ammonium hydroxide and the resulting 5 ' The protecting groups were removed with 3% trichloroacetic acid. This L-enantiomeric The oligonucleotide is desalted and OPEC cartridge (Clon Further purification by elution through etech). L-enantiomeric To further purify the oligonucleotide, 1 Electrophoresis on a 2% polyacrylamide gel was used. UV of L-DNA band Visualization by line projection. This is cut out, finely chopped, pH 7.5, 4 ℃ Was extracted with a buffer containing 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA for 24 hours. . The gel fragments were then removed by centrifugation and the L-DNA was separated by Sephadex G- Purified by passing through a 25 span column. L-enantiomeric oligonucleoside The concentration of Tide was evaluated using the absorbance at 260 nm. (2b) 5'-H2N-L-d (I-QI-I) -3'-Teg (SEQ ID NO: 35) Synthesis of   L-2-deoxynucleotide phosphoramidite reagent precursor (ie, 5'-dimethoxytrityl L-cytidine-3'-O-phosphoramida such as Ito, 5'-dimethoxytrityl L-adenosine-3'-O-phosphoramida Ito, 5'-dimethoxytrityl L-guanosine-3'-O-phosphoramida And 5'-dimethoxytrityl L-thymidine-3'-O-phosphoramie Dite) but modified with D- as otherwise specified by the device manufacturer. By the trityl-off technique used for enantiomers L-Enantiomer by Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer Mic oligonucleotide was prepared. Clonetech as 5'-amine group precursor Use the 6-carbon monomethoxytritylamino modifier (N-MMT-C6-AminoModifier) I was there. At the 3'end with the end group The TEG group was used. Ammonium hydroxide as base protecting group and solid support The L-enantiomeric oligonucleotide with polyacrylamide. Further purification by gel electrophoresis. (2c) 5'-trityl-SL-d (I-QI-I) -3'-NH2Synthesis of   The L-enantiomeric oligonucleotide sequence of Example 2a without the Teg group is L-2-deoxy by Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer A precursor of a nucleotide phosphoramidite reagent (5'-dimethoxy as described above). Trityl L-Cytidine-3'-O-phosphoramidite, 5'-dimethoxytate Lytyl L-adenosine-3'-O-phosphoramidite, 5'-dimethoxytate Lytyl L-guanosine-3'-O-phosphoramidite, and 5'-dimeth Xytrityl L-thymidine-3'-O-phosphoramidite) Prepared by the trityl-on procedure according to the manufacturer's instructions. Clonetech's single bond amino modifier (uni-lin) as a precursor to the 3'-amine group. k Amino Modifier) was used. 5'added to the sequence instead of the Teg of Example 2a A precursor to a thiol group (herein abbreviated as 5-S) Then Clonetech's C6-thio modifier was used. Complete L-D Subsequent to the synthesis of the enantiomeric oligonucleotide, base protecting groups and solid support Ammonium hydroxide It was removed using. Desalt the L-enantiomeric oligonucleotide , Deionized water can be eluted through an OPEC cartridge (Clonetech). It was further purified by. Use the absorbance at 260 nm for the oligonucleotide concentration. It evaluated using. (2d) Fluorescent 5'Teg-L-d (I-QI-I) -3'-NH-Cy5.1 Preparation of 8   5'-Teg-L-d (I-Q prepared according to Example 2aI-I) -3'-N H2Sample (30 nmol) was evaporated to dryness and 500 mL of 0.1 M Redissolved by vortexing in bicarbonate buffer, pH 9. That This sample is then taken to the dried succinimidyl ester of the dye Cy5.18 (Bi ological Detection Systems; Pitts-burg PA) was added to the vial containing. Complete After thorough mixing, the reaction was allowed to proceed at room temperature for 1 hour, often with mixing. Generate Thing, 5'-Teg-L-d (I-QI-I) Remove 3'-NH-Cy5.18 Purified by eluting from a Sephadex G-25 column with on water. It was     Example 3 (3a) cI diamine, 5'-NH2-Ld (cI) -3'-NH2Synthesis of   L-Enantiomers Complementary to L-Enantiomeric Oligonucleotide I Sequence 5'X-L-d (TTAGCTT CTCCGTCCATAAYT) -3 '(SEQ ID NO: 38) containing L-enantiomeric ori Gonucleotide L-d (cI) was applied as described in Example 2a in Applied Biosystems. It was prepared by a stem oligonucleotide synthesizer. As a precursor of 3'-amine group Single bond amino modifier (Clonetech) as a precursor of the 5'-amine group. ch 6-carbon monomethoxytritylamino modifier (AminoModifier) (N-MMT-C6- AminoModifier: Catalog # 5202) 3'as per equipment manufacturer's instructions A group containing an amine was incorporated into (Y) and 5 '(X). The last deblock (debloc king) and after cutting from the solid support, the protecting groups are removed with Ammore water. Deionization of the amine-functionalized L-enantiomeric oligonucleotide. Elution through OPEC cartridge (Clonetech) with water Purified. This L-enantiomeric oligonucleotide is Further purification by Dogel electrophoresis or reverse phase-HPLC. L-enantio The concentration of the melicoligonucleotide was evaluated using the absorbance at 260 nm. (3b) I diamine, 5'-NH2-Ld (I) -3'-NH2Synthesis of   L-enantiomeric nucleotide sequence 5'X-L-d (TTATGGACGGAGAAGCTAAYT) -3 '(SEQ ID NO: 39) containing L-enantiomeric oligonucleotide I Are outlined in Example 3a As prepared by Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer . Single bond amino modifier (uni-link Amino Modifie as a precursor of 3'-amine group) r) (Clonetech) as the 6'-amine group precursor of Clonetech Methoxytritylamino modifier (AminoModifier) (N-MMT-C6-AminoModifier: Catalog # 5202) and use 3 '(Y) and 5' (X) as directed by the equipment manufacturer. A group containing an amine was incorporated into. Final deblocking and from solid support After cutting out, the protecting group was removed with ammo water, and the amine-functionalized L was removed. -OPEC cart with enantiomeric oligonucleotides using deionized water Purified by eluting through a ridge (Clonetech). This L-Enanti Omeric oligonucleotides on polyacrylamide gel electrophoresis or reverse phase -Further purified by HPLC. L-enantiomeric oligonucleotide Was evaluated using the absorbance at 260 nm. (3c) Synthesis of Ld (cI)   Nucleotide sequence complementary to (I) 5'-L-d (TTAGCTTCTCCGTCCATAA) -3 '(SEQ ID NO: No. 23), an L-enantiomeric oligonucleotide cI containing Apply to the Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer as outlined in a. Prepared from. After the final deblocking and cleaving from the solid support, protecting groups were removed. Removed with Ammore water. L-enantiomeric oligonucleotide With deionized water And purified by elution through an OPEC cartridge (Clonetech). This L-enantiomeric oligonucleotide was electrophoresed on a polyacrylamide gel. Further purification by electrophoresis. Concentration of L-enantiomeric oligonucleotide Was evaluated using the absorbance at 260 nm. (3d) Synthesis of Ld (I)   L-enantiomeric nucleotide sequence 5'-L-d (TTATGGACGGAGAAGCTAA) -3 '( Examples of L-enantiomeric oligonucleotides I containing SEQ ID NO: 8) Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer as outlined in 3c. Was prepared by. After the final deblocking and cleavage from the solid support, the protecting group Was removed with Ammore water to remove the L-enantiomeric oligonucleotide. Elute through an OPEC cartridge (Clonetech) with deionized water Purified by. This L-enantiomeric oligonucleotide was It was further purified by luamide gel electrophoresis. L-enantiomeric oligonuclear The concentration of cleotide was evaluated using the absorbance at 260 nm. (3e) Fluorescent cI diamine 5'-NH2-Ld (cI) -3'-NH2,as well as Preparation of fluorescent I diamine, Ld (I)   5'-NH prepared according to Example 3a2-Ld (cI) -3'-NH2Sample of Evaporate (30 nmol) until dry And vortex at pH 9 in 500 mL of 0.1 M bicarbonate buffer. This resulted in redissolution. The sample was then dried with the dried dye Cy5.18 (Biol ogical Detection Systems; pittsburgh PA) containing succinimidyl ester Added to vial. After thoroughly vortexing, allow the reaction to sit at room temperature for 1 hour, then briefly If it was mixed, proceeded. 5'-NH labeled with Cy5.182-L-d ( cI) -3'-NH2From a Sephadex G-25 column with deionized water Purified by elution. Cy 5.18 labeled I diamine of Example 3b, 5'-NH2-Ld (I) -3'-NH2Samples were prepared in a similar manner.     Example 4 (4a) 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3-NH2For L-d (c I) Annealing   5'-Teg-L-d (I-Q prepared according to Example 2aI-I) -3-NH2 (2 mmoles) prepared in 6 SSC buffer according to the method of Example 3c Aliquots containing increasing amounts of L-d (cI) [100: 5 to 10 0: 200 Ld (I-QI-I): Ld (cI)] at room temperature. Introduce the mixture into the sample cuvette and raise the cuvette temperature from 30 ° C to 90 ° C. And then in the Cary 13 instrument while cooling to 30 ° C. It was analyzed by UV light (260 nm). 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3 -NH2With respect to equimolar or less L- At a concentration of d (cI), a binary complex (L-d ( cI): 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3-NH2And / or 5 ' -Teg-L-d (I-QI-I) -3-NH2: Ld (cI)) is revealed. I was caught. At higher L-d (cI) concentrations, the three-component complex (tern ary complex) (L-d (cI): 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3- NH2: L-d (cI)) can be observed. (4b) Ld (I-QI-I) to TMT-cI-TMT hybridization Option   A similar experiment with Ld (cI) -TMT (see Example 6a below) gave 5 '-Teg-L-d (I-QI-I) -3-NH2To TMT-L-d (cI ) -Annealing of TMT was shown. A three component complex was formed.     Example 5   35Preparation of S-labeled TMT-NCS   Approximately 40 mmol of TMT amine (PCT US91 / 08253) suspended in 650 mL of methanol The solution was stirred at room temperature and deionized water was added dropwise until the solution became a clear pale yellow color ( About 70 mL). The solution was cooled to 10 ° C. in an ice bath and about 60 mmol of35S-thio Phosgene was added dropwise over about 3 minutes. Precipitation of TMT isothiocyanate The solution was made and the solution was continuously stirred for an additional 2.5 hours. Solution and precipitate at room temperature, Under reduced pressure (15 mmHg) and concentrated to almost dryness on a rotovap. Really The dried solid was further diluted with about 500-750 mL of methanol to give a solid. Stir until apparent homogenization. Then solid TMT isothiocyanate Collected by filtration and repeatedly washed lightly with methanol. This product is Dry overnight in a vaccum chamber.     Example 6 (6a) forms a complex with the chelating agent TMT-NCS and forms 5'-TMT-L-d ( 5'-H forming cI) -3'-TMT2N-L-d (cI) -3'-NH2of Preparation and complex with the chelating agent TMT-NCS to form 5'-TMT-L- 5'-H forming d (I) -3'-TMT2N-L-d (I) -3'-NH2of Preparation   In 500 microliters of 1.0 M carbonate / bicarbonate buffer, pH 9.0, One of 300 nmoles of L-enantiomeric oligonucleotide, ie Example 3a 5'-H2N-L-d (cI) -3'-NH2Solution or 5'-H of Example 3b2 N-L-d (I) -3'-NH212 mg of TMT isothiocyanate (P CT US 91/08253) was added. Vortex the reaction mixture, It was kept at 37 ° C. for 2 hours and at room temperature overnight. The resulting reaction mixture was treated with ethanolamine ( Reaction was stopped using 15 microM) and the product was deionized water as eluent. Sephadex G-25 Column Black Purified by matography.   Of TMT per molecule of L-enantiomeric oligonucleotide diamine Number is the time-resolved fluorescence analysis of europium metal chelated to TMT Quantified by (6b) Ing-1-TMT and 5'-TMT-ld (using fluorescent metal) of the cI) -3'-TMT and 5'-TMT-Ld (I) -3'-TMT complexes. Common techniques for signs   Has an aromatic moiety that is tightly retained in the co-ordination sphere As a chelating agent, europium (3+). Induces "sensitized" fluorescence emission. In this case, the light Is absorbed through the aromatic system and energy is transferred to the metal. Then the metal Emissions characterized by very large Stokes shifts and lifetimes of fluorescence up to a few seconds Cause After an excitation pulse at 340 nm, a 400 microsecond delay was used to fire at 615 nm. Light emission was measured. The short-lived background fluorescence is effectively removed This delay is used for high-sensitivity measurement, and is up to 1500 times that of normal Eu-fluorescence emission. An increase in the sensitivity of is achieved.   In this method, a known amount of Ing-1-TMT or 5'-TMT-L- d (cI) -3'-TMT or 5'-TMT-L-d (I) -3'-TMT EuCl for the complex (conju-gate)3Buffer water while increasing the addition amount of Titrated in solubility. For example, 1 microliter containing 1 to 30 picomoles of complex. Tol's solution containing a pre-calculated amount of Tris-HCl buffer (pH 7.4) Costar EIA / RIA 96-well plate Duplicates were added to the holes in e). The buffer volume is 99 to EuCl3Aqueous microphone It was derived by subtracting the volume in liters (typically 10 in hydrochloric acid buffer-FourM to 10-6M). This makes the total volume of each hole 100 Fixed to black liter. After that, EuCl3Aqueous solution, complex buffer Was added to the solution. The plate was then covered and shaken at low speed for 1 hour. Time minutes Delfia 1232 time-resolved fluo rimeter) (Wallac Inc.) was used to analyze the data. Forming a complex Each TMT molecule chelates one europium ion, and 5'-TMT-L- d (cI) -3'-TMT and 5'-TMT-L-d (I) -3'-TMT complex The body was found to bind two europium ions per complex molecule . (6c) 5'-H2N-L-d (cI) -3'-NH2as well as35TM labeled with S Preparation of 5'-TMT-L-d (cI) -3'-TMT from T-NCS   In the method of Example 6a, 12 mg of TMT isothiocyanate (PCT US9 1/08253),35S-labeled TMT-NCS (prepared as in Example 5 Placed) Instead, the reaction was performed as described above. 5'-H2N-L-d (cI) -3'- NH2The number of TMT per molecule is35Liquid syn optimized for detecting S Tilting counter (liquid scintillation counter) TMT-L-d (c I) -TMT product was quantified by counting. Derived (derivatized ) 5'-H2N-L-d (cI) -3'-NH2The concentration of35Specific activity of S-thiophosgene From the knowledge of sex, 5'-H2N-L-d (cI) -3'-NH2Diamine Alternatively, the number of TMT molecules may be calculated.     Example 7 (7a) Yttrium (90Y) radiolabeled with L-enantiomerically Gonucleotide,90Y-TMT-L-d (cI) -TMT-90Y and90Y-T MT-L-d (I) -TMT-90Preparation of Y   L-enantiomeric oligonucleotide TMT conjugate, immediate (TMT-Ld (cI) -TMT) obtained in Example 6a or TMT obtained in Example 6a A deionized aqueous solution of -Ld (I) -TMT,90YCl3PH 6.0; 0 ． 5 M sodium acetate buffer solution (> 500 Ci / mg: Amersham)  Corp.)) and the specific activity was 0.1 Ci / pmol at room temperature for 1 hour. Take 1 microliter of sample and put it in Germanman ITLC-SG paper strip ( Labeling efficiency was determined by spotting on Gelman ITLC-SG strip). The paper Remove the pieces from 0.1M sodium citrate. The solvent tip against the paper tip for a few minutes in a glass beaker containing pH 6.0. It has expanded to three quarters. After that,90Optimized for Y, Controlled by Pak 386 / 20e computer Control System 200 Image Scanner (Bioscan). In this system Is unbound90Y moved to the solvent tip. L-enantiomeric oligonucleoside The TMT of the Otide TMT complex chelate with 98% or more of the added radioactive substance. made. (7b) radiolabeled90Y-TMT-L-d (cI) -TMT-90Y or90Y -TMT-L-d (I) -TMT-905'-Teg-L-d (I-Q of YI-I ) -3'-NH2Hybridize to   Obtained from Example 7 (a)90Y-TMT-L-d (cI) -TMT-905 pmol of Y Of the sample of Example 2a in an increasing amount (0.375 to 12 pmol) of 5 '-Teg-L-d (I-QI-I) -NH2Mix with PBS solution at 37 ℃ for 1 hour did. Aliquot 5 mL aliquots of each of these hybridized SDS Mixed with buffer containing and electrophoresed on a 12% PAGE gel. Gel o Radiograph is 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3'-NH2Is 2 It was shown that a molar cI could be bound.   Non-complementary obtained in Example 7 (a)90Y-TMT-L-d (I) -TMT-90In a similar procedure using Y, 5'-Teg-L-d (I-QI -I) -3'-NH2I didn't see any die for the first time. (7c) To nude mouse90Y-TMT-L-d (cI) -TMT-90Administration of Y   Until specific activity of 28 mCi / 28 mg90TMT-cI-TMT labeled with Y , 25 g nude mouse with subcutaneous tumor in the right flank. Prescribed after injection A blood sample is taken from the tail at timed intervals and a liquid scintillation counter is used.90 The Y radioactivity was measured. From the results, 95% or more of the dose given by injection was90 It was shown that Y was cleared from the bloodstream within the first 30 minutes after injection. 2:00 after injection In the meantime, the radioactivity in the blood leveled off and only a small fraction (0. <01%) continued to circulate until the 22nd hour thereafter. With these data, L If there is no hybridizing site that recognizes the -d (cI) sequence, a radiolabel is given. It is certain that the TMT-Ld (cI) -TMT that was removed is rapidly lost from the circulation. Was called.     Example 8 (8a) Antibody-maleimide (ING- using sulfo-SMCC and ING-1 Preparation of 1-maleimide)   Sulfo-SMCC solution (108 nmol) in phosphate buffered saline (PBS) In phosphate buffer (pH 7) Chimeric antibody (ING-1; 18 nmol) in a sample of solution. The resulting mixture The mixture was left at room temperature for 30 minutes with occasional mixing. The reaction is 60 nmol basic Stopped with Tris buffer. The reaction mixture was treated with phosphate buffered saline. Add to diluted, pre-washed PD-10 column, elute with PBS, ING- 1-maleimide was obtained. This material was stored on ice until use. (8b) Mercaptoalkyl-antibodies from ING-1 and 2-iminothiolane ( Ab-SH); (ING-1-SH)   Chimeric antibody (ING-1; 5 nmol) in 0.1 M carbonate buffer (pH 8.8) ) A sample of the solution was mixed with 200 nmole of 2-iminothiolene in water. Got The mixture was left at room temperature for 30 minutes with occasional mixing. Phosphate buffer the reaction mixture Dilute with saline and add to pre-washed PD-10 column (pharmacia). Then, it was eluted with PBS to obtain mercaptoalkyl-ING-1. This substance Was stored on ice until use.     Example 9 (9a) Mercaptoalkyl-Ld (I-Q with 2-iminothioleneI− Preparation of I); 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3'-SH   5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3'-NH2 A sample of (30 nmole) aqueous solution was mixed with 1M carbonate buffer (pH 9) to give 890 mM A final buffer concentration of was obtained. A solution of 12 mmol of 2-iminothiolane hydrochloride is slowly added. Added to the impacted L-DNA. Vortex mix these reactants at 37 ° C. For 30 minutes. To the reaction mixture is added 12 mmol ethanolamine Stop, and dilute with phosphate buffered saline and pre-wash NAP-25. In addition to rum (pharma-cia), PBS was used for elution, and 5'Teg-L-d (I- QI-I) -3'-NH-C (N = H2 +) CH2CH2CH2SH (hydrochloride, Cl- As). Antibodies with maleimide (maleimode-derivatized antibodies dy) (Ab-M) for use in complex formation with the product directly from the column Elute into solution. On the other hand, mercaptoalkyl-Ld (I-QI-I) is used It was stored on ice until. (9b) Mercaptoalkyl-Ld (I-Q with 2-iminothiolaneI− Preparation of I); 5'-HS-L-d (I-QI-I) -3'-Teg   5'-H2N-L-d (I-QI-I) -3'-Teg (30 nmol) was used in Example 9a 5'-HS-CH2CH2CH2C (= NH2 +) -HN-L-d (I-QI-I) -Teg-3 '(Cl-) Got. (9c) Ld (I-Q) using sulfo-SMCCI-I) -Preparation of maleimide 5'-Teg-L-d (I-QI -I) -3'-maleimide   20 nmole of 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3'-NH2(Of example 2a An aqueous solution containing (prepared in this way) was diluted in phosphate buffered saline. Su Lufo-SMCC (100 nmol) in PBS was added and the resulting mixture was occasionally The mixture was left at room temperature for 30 minutes while mixing. Phosphate buffered physiology of reaction mixture Dilute with saline and add to pre-washed PD-10 column with PBS Elute, 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3'-maleimide was obtained. This The material was stored on ice until used. (9d) Ld (I-QIPreparation of -I) -maleimide; 5'-maleimido-L- d (I-QI-I) -3'-Teg   5'-H2N-L-d (I-QI-I) -3'-Teg to 9c 5'-Teg- -3'-NH2Was reacted with sulfo-SMCC in the same manner as in 5'-maleimido- L-d (I-QI-I) -3'Teg was obtained. (9e) 3'-mercapto-Ld (I-Q with SATAI-I) Preparation   50 nmol of 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3'-NH2(Of example 2a Of the SAT was prepared by diluting an aqueous solution containing A (in DMSO) was added. Mix and leave at room temperature for 60 minutes before reacting The mixture was diluted with PBS and eluted from the NAP-10 column with PBS. 5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3'NH-CO-CH2-S-CO- CH3Got Acetylthioacetylated L-enantiomeric oligonuclear Cleotide is 100 mM sodium phosphate, 25 mM EDTA, 500 mM NH2O Deacylation was carried out by adding 30 μl of a solution of H containing pH 7.5. reaction After 2 hours at room temperature, elute the material with PBS as the eluent. Through a NAP-5 column. Product, 5'-Teg-L-d (I-QI− I) -3'NH-CO-CH2-SH is used immediately to prevent oxidative dimerization. I used it. (9f) 5'mercapto-Ld (I-Q) using SATAI-I) Preparation   H2N-5'-L-d (I-QI-I) -3'-Teg was added to 5'-Te of Example 9e. g-L-d (I-QI-I) -3'-NH2Reacts with SATA in the same manner as ’-HS-CH2-OC-NH-L-d (I-QI-I) -3'-Teg was obtained.     Example 10 (10a) Ab-M and 5'Teg-L-d (I-QI-I) -3'-NH-C ( = NH2 +) CH2CH2CH2Complex formation of SH; ING-1-maleimido-3 ' -S-L-d (I-QI-I) -5'-Teg   5'-Teg-L-d (I-QI-I) -3'-NH-C (= NH2 +) CH2C H2CH2A sample (108 nmol) of SH (prepared according to Example 9a) was prepared as in Example 8a. Of Ab-M (ING-1 with maleimide introduced; 18 nmol) obtained from The solution was directly eluted from the NAP-25 column with PBS using PBS. After mixing, react 4 It was allowed to proceed for 20 hours at ° C. afterwards, (Amicon) and centrifuged at 1000 g for 25 minutes. Sample with new PBS Resuspended in and the ratio of optical densities at 260 nm and 280 nm The ultrafiltration concentration by centrifugation was repeated three more times until Final life The product is ING-1-maleimido-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-3 ' -Ld (I-QI-I) -5'-Teg. (10b) Antibody-maleimide and 5'-HSCH2CH2CH2(NH2=) C-NH -Ld (I-QI-I) -Teg-3 'complex formation; ING-1-maleimi Do-5'-S-L-d (I-QI-I) -Teg-3 '   5'-HSCH prepared according to Example 9b2CH2CH2(NH2 +=) C-NH -Ld (I-QIA sample of -I) -Teg (108 nmoles) was prepared as in Example 8a. To form a complex with 18 nmole of ING-1 into which maleimide was introduced. G-1-maleimido-5'-S- (CH2)3-C (= NH2 +) NH-L-d (I -QI-I) -3'-Teg was obtained. (10c) ING-1-maleimido-S-L-d (I-QI-I) Analysis of complex   ING-1-maleimido-S- (CH of Examples 10 (a) and (10b)2)3-C (= NH) NH-L-d (I-QI-I) The optical densities of the sample are 260 nm and 280 n. Measured with a spectrophotometer at m. Calculate the ratio of optical densities at these two wavelengths And the antibody and L-enantiomeric oligo at each of these wavelengths. A known extinction coefficient (extinction coe) for nucleotides (molecular weight about 16500) fficients), the L-enantiomeric oligonucleotid Child, Ld (I-QI-I) with the number of Ld (I-Q) between 1 and 2 per antibody.I -I).   The concentration of ING-1 in the complex solution was used as a standard protein for bovine immunoglobulin. Determined by the BioRad protein assay . Complexed Ld (I-QI-I) complex for absorbance due to Corrected for the optical density of, these data reflect the optical density of the complex at 280 nm. It was in good agreement with the antibody concentration determined by measurement. Antibody-Ld (I-QI -I) By subjecting the complex to acid digestion and amino acid analysis, these two sets of I checked the data further.   Antibody-Ld (I-QI-I) complex was added to a human tumor cell line (for this cell line Produce antibodies. ) For their ability to bind to antigens on the surface of It was Immune anti-complex The responsiveness was modified and Ld (I -QI-I) compared to a standard preparation of antibody before undergoing complex formation. Target HT29 cells (human adenocarcinoma cell line: ATTC) were cultured in a tissue culture flask with 10% fetal mouse cells. In a cell culture flask using McCoy's medium supplemented with serum luency). The cells are scraped using a cell scraper. It was scraped off the Rusco wall and collected. Collect cells from many separate flasks and Centrifuge to pellet and add 0.1% bovine serum albumin (Sigma) to 0.0 150 mM sodium chloride buffer pH 7.4 (P with 2% sodium azide) 5x10 in ice-cold 50 mM sodium phosphate solution with BS) (flow buffer)Five Resuspended at / mL. Cells were washed in the same buffer and then counted. Antibody mark The control curve (human) that matched the sub-curve to an irrelevant (non-binding) isotype IgG1) Was prepared by diluting a stock solution of ING-1 with Many samples were obtained with a G-1 content ranging from 10% to 100%. Standard song Trace the lines so that each sample contains 1.0 mg antibody protein per mL. -Prepared in buffer. Then, the sample obtained from the standard curve and the unknown sample are 5 × 1 0FiveHT29 cells were incubated at 4 ° C. for 1 hour. Unbound antibody After extensive washing to remove, cells are resuspended in 100 μl flow buffer and Goat-anti-human antibody labeled with photo-isothiocyanate (FITC) Incubated at 4 ° C for 1 hour. In flow buffer After further washing, the sample was Coulter EPICS 753 flow cytometer ( Coulter EPICS 753 flow cytometer) was used for analysis by flow cytometry. Fluorescence from fluorescent isocyanite (FITC) and propidium iodide (PI) Excitation of the fluorescence from the above using the 488 nm emission line (emiss-ion line) of an argon laser. Raised. The output was set to 500 mW in light regulation mode. 90 single cells Identified by light scattering at ° and forward angle. Single cells from aggregates and cell debris The analysis windows to these parameters for separation Applied Fluorescence caused by FITC and propidium at 550 nm Separation using a long pass dichroic filter, 530nm band pass filter (for FITC) and 6 Collected through a 35 nm bandpass filter (relative to PI). Light scattering parameters Are collected as integrated pulses, and the fluorescence is the logarithmic product. Collected as log integrated pulses. Dead cells are PI Exclude from analysis by placing analysis window on cells negative for uptake Was done. The average fluorescence per sample (weighted average from 2500 cells) was calculated for each Calculated against the histogram. FITC calibration beads s) was analyzed in each experiment to establish a fluorescence standard curve. Then it The average fluorescence intensity for each sample is shown as the average FITC equivalent per cell. . Immunoreactivity is measured by the mean fluorescence intensity of unknown samples. It was calculated by comparing the value from the quasi-curve. From immunoreactivity analysis, ING -1-Maleimide-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-3'L-d (I- QI-I) -5'-Teg has about 2/3 immunoreactivity comparable to the ING-1 standard. , ING-1-maleimido-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-5 '-L-d (I-QI-I) -3'-Teg showed an immunoreactivity of about 4/5. In another series of experiments, ING-1-Ld (I-QI-I) (3 'complex) And ING-1-L-d (I-QI-I) (5 'complex) immunoreactivity was determined . Samples of these complexes also show their apparent molecular weight and preparation heterogeneity. Novex 6% polyacryl using SDS buffer to evaluate It was electrophoresed on an amide gel. The known molecular weight run on the same gel Using the standard thatf) And the logarithm of the molecular weight to create a standard curve. Made. From this standard curve, the relative content of the bands associated with each complex preparation was The offspring was determined. ING-1-L-d (I-QI-I) and S of ING-1 antibody By DS PAGE gel, ING-1-L-d (I-QI-I) Complex molecule The amount was shown to be greater than that of the antibody alone. (10d) Mercaptoalkyl-antibody and Teg-5'-Ld (I-QI-I) -3'-maleimide complex formation   20 nmoles of Teg-5'-L-d (I-QI-I) -3'-maleimide (eg From 9c) in PBS pH7 Reacted with 5 nmoles of mercaptoalkyl-ING-1 (from Example 8b) . After mixing, the reaction was continued at 4 ° C. for 16 hours, and ING-1-NH—CO—CH2-S- Maleimide-3'-L-d (I-QI-I) -5'-Teg was obtained. Reaction mixture Subsequently, it was centrifuged at 1000 g for 25 minutes. Resuspend sample in fresh PBS, 2 By this series of centrifugation until the ratio of the optical density at 60 nm and 280 nm becomes constant The concentration was repeated 3 more times.   In a similar manner, maleimide-5'-L-d (I-QI-I) -3'-Teg React with rucaptoalkyl-ING-1, ING-1-NH-CO-CH2− S-maleimide-5'-L-d (I-QI-I) -3'-Teg was obtained. (10e) Antibody-maleimide and Teg-5'-Ld (I-QI-I) -3'- NH-C (= O) -CH2-SH complex formation   Four 6 nmol samples of ING-1-maleimide (from Example 8a) in PBS were used. 0 nmole of Teg-5'-L-d (I-QI-I) -3'-NH-CO-CH2− Reacted with SH (from Example 9e) at 4 ° C. for 16 hours. The reaction product is PBS Diluted from the PD-10 column into PBS and eluted with ING-1-maleimide. -S-CH2-C (= O) -NH-3'-L-d (I-QI-I) -5'Teg Obtained. Product It was concentrated by centrifugation. Resuspend the sample in fresh PBS at 260 nm and 280 nm This procedure was repeated 3 more times until the ratio of the optical densities of 1 was constant.   In the same way, HS-CH2-C (= O) -NH-5'-L-d (I-QI-I ) -3'-Teg is reacted with ING-1-maleimide to give ING-1-maleimi Do-S-CH2-(O =) C-NH-5'-L-d (I-QI-I) -3'-Te g was obtained. Measure the optical density of these samples with a spectrophotometer at 260 nm and 280 nm did. Next, the ratio of the optical densities of these two wavelengths was calculated. These wavelengths In each case, the antibody and the L-enantiomeric oligonucleotide (molecular weight about 165 00) by using the known extinction coefficient. The number of thiomeric oligonucleotide molecules was evaluated. (10f) Antibody-maleimide, Ab-M and 5'-trityl- (S) -Ld (I -QI-I) -3'-NH2Complex formation   5'-Trityl (S) -Ld (I-Q obtained from Example 2c)I-I) -3'-NH2 Sample (10 nmol) is diluted with PBS to give a final concentration of 85 mM silver nitrate aqueous solution. Added. After vortexing, the reaction was allowed to proceed for 30 minutes at room temperature. For centrifugation More precipitate formed at the bottom of the tube. It has a thiol group at the 5'end and L-enantiomeric oligonucleotide having no lytyl group (HS-5'- L-d (I-QI -I) -3'-NH2) Containing the clear supernatant solution at 4 ° C until use It was   40n of a sample of 6nmol ING-1-maleimide (from Example 8a) in PBS. Molar HS-5'-Ld (I-QI-I) -3'-Teg for 16 hours at 4 ° C It was made to react. The reaction was diluted with PBS and pre-washed with Econopac 1 Elution from a 06-DG column (BioRad) with 4 mL, ING-1-maleimido-S- 5'-L-d (I-QI-I) -3'-Teg was obtained. 1000 g of product, 2 5 minutes centrifugation Is resuspended in fresh PBS and the ratio of optical density at 260 nm and 280 nm becomes constant The concentration by centrifugation was repeated three more times.   The optical densities of these samples were measured with a spectrophotometer at 260 nm and 280 nm. this The ratio of the optical densities of the two wavelengths was calculated and the antibody and L-enantiomer oligo By using the known extinction coefficient for nucleotides (molecular weight about 16500) And the number of oligonucleotide molecules per antibody at each of these wavelengths. Was evaluated.     Example 11 (11a) ING-1-Ld (I-QI-I) to L-d (cI) Ring   ING-1-maleimido-S- (CH prepared according to Example 10a2)3-C ( = NH2 +) -NH-3'-L-d (I-QI-I) -5'-Teg (24 picomo ) And a sample of ING-1-maleimido-S- (C prepared according to Example 10d. H2)3-C (= NH2 +) -NH-5'L-d (I-QI-I) -3'-Teg ( 25 pmol sample containing 1.0 mM EDTA and 100 mM NaCl A 16-fold excess of Ld (obtained in Example 3c) in 50 mM PBS, pH 7.2 at room temperature. cI) in a separate cuvette. Cool the cuvette to 20 ° C, Place in a carry 13 device, raise the cuvette temperature from 20 ° C to 80 ° C, then Then, while being returned to 20 ° C. at a rate of 0.5 ° C./minute, UV light (260 nm) The absorbance was analyzed. Analysis of the data showed that the cI was in both the 3'and 5'complexes. Show that it can be hybridized and can form a three-component complex with each I was there. Similar experiments using TMT-L-d (cI) -TMT (from Example 6). ING-1-maleimido-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-3'- L-d (I-QI-I) -5'-Teg to TMT-L-d (cI) -TM Annealing of T was shown. (11b) in phosphate buffer and human serum,90Y- TMT-L-d (cI) -TMT-90Y or90Y-TMT-L-d (I) -T MT-90ING-1-Ld (I-Q to any of YI-I) hybridise Option   ING-1-maleimido-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-3'-L -D (I-QI-I) -5'-Teg (4 ul; 1 mg antibody / ml) solution (Example 10a) Of 50 microliters obtained from90Y-TMT-L-d (cI)- TMT-90Y solution was added to freshly prepared human serum (200 mL) or PBS ( 200 mL; pH 7.2) and mixed at 37 ° C. for 2 hours. Then , Aliquots were subjected to SDS PAGE electrophoresis on 8-16% gels. gel With both autoradiography and phosphoimage systems. Check90Y-TMT-L-d (cI) -TMT-90Y is human serum and phosphorus ING-1-Ld (I-Q) in acid buffer solution (pH 7.2)I-I) and Ha It was shown that it can be hybridized. Samples in PBS and in serum for 14 days By leaving it at a high temperature and performing 8 to 16% SDS-PAGE, A similar pattern was obtained for gels incubated at 37 ° C for 2 hours. this This indicates that the complex was stable in serum for up to 2 weeks. Obtained in example 9 Was90Y-TMT-L-d (I) -TMT-90Y is any as expected ING-1-Ld (I-QI-I) indicates hybridization There was nothing to do. (11c) ING-1-Ld (I-QI-I)90Y-TMT-L-d (CI) -TMT-90Hybridization of Y   ING-1-maleimido-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-3'L- d (I-QI-I) -5'-Teg (4 ul; 1 mg / ml; from Example 10a) and 50 μl90Y-TMT-L-d (cI) -TMT-90Solution of Y (from Example 9a) In PBS (200ul; pH 7.2) and incubate at 37 ° C for 60 minutes. I started. Aliquots of these mixtures were then SDS on an 8-16% gel. It was subjected to PAGE electrophoresis. Automate the gel with a phosphor imager system Radiography,90Y-TMT-L-d (cI) -TMT-90Y for IN G-1-L-d (I-QI-I) was shown to be hybridizable. (11d) ING-1-Ld (I-QI-I) hybridized with TMT- Western blotting to detect TMT on d (cI) -TMT   Ld (I-Q obtained in Example 2a)I-I) or the ING obtained in Example 10a -1-maleimido-3'-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-L-d (I -QIA sample of -I) -5'-Teg was prepared from the L-enantiomer obtained in Example 6. Oligonucleotide TMT complex, mixed with TMT-Ld (cI) -TMT did. Keep each reaction mixture on ice for 10 minutes It was Aliquots of these reaction mixtures were mixed with SDS buffer and two identical 8 to 16% polyacrylamide gel. Electricize gel for 2 hours at constant voltage It was subjected to electrophoresis. One gel was transferred to the manufacturer's protocol (Hoefer semi-dry transfer). Electrophoresis on nitrocellulose paper using CAPS buffer for 20 min. Air blotted. After washing with 0.05% Tween 20 in PBS three times, The cells were blocked with 3% BSA in PBS for 1 hour at room temperature. Then Tween / PBS, and the gel was washed with a murine anti-TMT antibody solution (PBS / Tweee). 10 mg / ml) in n and left overnight at room temperature. Well Stan blots of goat anti-mouse I conjugated to horseradish peroxidase gG antibody (BioRad Western Blot Kit) and peroxidase group Went with quality. By blot, TMT-Ld (cI) -TMT was Ld (I-QI-I) or ING-1-L-d (I-QI-I) is included It was shown that detection was possible via TMT hybridized to the band.   The second gel was stained with ethidium bromide (5 mg / ml in distilled water). Rehybridization by examining the stained gel under UV light It has been shown.     Example 12   Preparation of Ab-TMT by direct complex formation (ING-1 / TMT)   TMT-NCS (or a suitable derivative thereof) forms a complex with an antibody molecule. An antibody capable of binding to a target antigen recognized by an antibody variable region- The TMT complex molecule is generated. Such a complex molecule is bound by such an immune complex. TMT moieties to localize and / or treat localized targeting lesions Can be used to carry metal ions that are chelated by. One preferred In a preferred embodiment, the antibody has broad reactivity with antibody molecules expressed on tumor cells. Tumors for the purpose of treatment or diagnosis. An antibody-TMT complex capable of carrying metal to the ulcer is provided. Chimeric antibody, I NG-1 is (International Patent Publication WO 90/02569) murine variable region and human G immunoglobulin constant region. Antibodies are disclosed in the above references. As such, in culturing a murine myeloma cell line that basically expresses a chimeric antibody. Therefore, it is produced. After purification, ING-1 contains 50 mM sodium acetate and 150 mM. Used at a concentration of 5.0 mg / mL in mM sodium chloride buffer, pH 5.6 .   Complex formation between TMT-NCS and ING-1 results in antibody solution reaching pH 9.0 Until ING-1 1.0M carbonate, 150mM sodium chloride buffer pH Achieved by adding 9.3 first. Then contains 5 mg of protein Conical glass reaction of acid-washed sample of ING-1 solution Pipetted into vial. Add TmL-NCS solution to 10 mL of 1.0 M carbonate Salt, 150 mM By dissolving 100 mg in sodium chloride buffer, pH 9.0 Prepared. For the complex formation reaction, 96.5 mL of TMT-NCS solution was added to the antibody. , By supplying a 4-fold molar excess of TMT-NCS to ING-1 did. This solution was briefly stirred to mix the reactants and then left at room temperature in the dark. . After 16 hours, 50 in 150 mM sodium chloride buffer, pH 5.6 PD10 chromatography pre-washed and equilibrated with mM sodium acetate -By applying the column to the reaction mixture, uncomplexed TMT Was separated from the ING-1 / TMT complex. Pure complex has similar buffer 2 ． Elute from the column with 5 mL.     Example 13   Analytical test of ING-1 / TMT complex (15a) Analysis of chelator ratio for antibody   The protein concentration of ING-1 in the complex solution was used as the standard protein for bovine immunization. Determined by the bio-rad protein assay using lobulin.   To bind the metal of TMT to calculate the number of functional TMT molecules per antibody The europium chloride solution was reacted until the volume was saturated. 0.05M Tris 2.5 ml of ING-1 / TMT 0.3 in HCl buffer pH 7.5 A 75 mg aliquot was pipetted into a 5 ml quartz cuvette. 0.0 5M Tris HCl buffer pH 7. 20 mM europium chloride (Europium chloride hexahydrate, Aldrich) dissolved in 5 A liquid was prepared. An aliquot (50 mL) of this europium chloride solution was added to ING-1. Add to the cuvette containing / TMT and place the resulting liquid in the cuvette. Slowly stir with a magnetic stirrer for 10 minutes at room temperature using a small magnetic stir bar did. Fluorescence of the metal-ING-1 / TMT complex with an excitation wavelength of 340 nm With a Perkin Elmer LS50 Fluorometer (10 nm slit width) . Fluorescence emission at 618 nm with 10 nm slit width and 430 nm removal filter I monitored. The above method was repeated and fluorescence readings were taken after each addition. Eliminate europium chloride aliquots to less than 5% of previous readings with increased fluorescence intensity Was added until. Each of the dilution corrections was used to correct for changes in test solution volume. The fluorescence intensity was measured at a molar ratio of. On the ING-1 / TMT complex Each chelating site binds to one europium ion, and Pium ion must exist at the chelate site where fluorescence is generated, so Can quantify the number of functional chelating sites.   Using this method, the ratio of TMT molecules per antibody molecule is 0.3: 1 to 2: 2. The range is 1. (13b) ING-1 / TMT immunoreactivity measurement by ELISA   Antigen to which antibody, ING-1 binds, with a cell scraper LS174T by collecting confluent monolayers of cells from the wall of the culture flask Or HT29 cells (American type tissue collection, AT (Obtained from TC). Combine cells in multiple flasks and take samples. The total number of cells harvested was determined by counting out and counting. In the meantime, put the cells on ice saved. The cells are then centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes at 4 ° C and the cells are cooled on ice. Ice-cold 50 mM sodium phosphate buffer supplemented with 150 mM sodium chloride Wash once with 25 mL of pH 7.4 (PBS), pellet under similar conditions, and Transfer to cold glass mortar with 10 mL PBS. Motor driven pestle Use homogenize at 4 ° C. and then centrifuge for 5 minutes at 3000 × g. Antigen The abundant supernatant was removed from other cell debris, 100,000 xg for 1 hour at 4 ° C. It was further centrifuged. The pellet (antigen fraction) from this final step was collected 10 Every 0,000 cells were suspended in 100 mL of PBS. Subsequently, the protein concentration is evaluated (standard Bio-Rad BCA protein assay using bovine immunoglobulin as a quasi-protein Method), the antigen was stored at −20 ° C. until use. 96-well coaster Microta Each well of the iter plate, 100 mL / well, prepared as described above Were coated with antigen by adding 10 ng of cell lysate (10 mg / ml). micro The titer plate was dried in a 37 ° C. incubator overnight. 0.05% Tw After washing the plates 5 times with een20 (Sigma), blotting them And dried. Add 1% of the wells of each plate to PBS. Add 125 mL / well of BSA (bovine serum albumin, Sigma A-7906) solution Blocked by addition and incubated for 1 hour at room temperature. plate Was washed 5 times with 0.05% Tween20. ING-1 / TMT complex sample (2 same, 50 mL / well) and standard ING-1 antibody solution in 1% BS It was prepared in the PBS of A in a predetermined concentration range. Biotinylated ING-1 (0.1 1.0 mg / mL in% BSA) to each well (50 mL / well), then The plates were incubated at room temperature for 2 hours. Then 0.05% Tween2 Wash 5 times with 0, blot the plate to dryness and dilute (0.1 % 2000 in BSA streptavidin-alkaline phosphatase ( Incubated for 1 hour at room temperature with Targo; # 6567). Wash 5 more times After cleaning, add 100 mL of phosphatase substrate reagent (Sigma) per well To develop color in each well. After 1 hour at room temperature, color Multi-scan microplate reader with a 405 nm filter Recorded.   When tested by this method, the immune complex of TMT and ING-1 is native I It was found to have immunoreactivity as compared to NG-1. (13c) ING-1 / TMT immunoreactivity measurement by flow cytometry   Target HT29 cells were mixed with 10% fetal bovine serum-supplemented map. It was grown to a confluence in a tissue culture flask using a carp medium. The cell Collected by scraping the flask wall with a scraper. A large number of separate flasks The cells were collected from the cells, centrifuged until pelleted, and 0.1% bovine serum albumin 15) and 0.02% sodium azide (flow buffer) 15 50 mM sodium phosphate buffer with 0 mM sodium chloride, pH 7. 5 x 10 in 4 (PBS) ice-cold solutionFive/ ML resuspended. Replace the cells with the same It was washed with a buffer and then counted. The antibody standard curve is analyzed for irrelevant (unbound), Isotype-matched control antibody (human IgG1) To dilute ING-1 Made from a number of samples with ING-1 content ranging from 10% to 100% Obtained. The standard curve is based on the flow buffer so that each sample contains 1.0 mg / mL. Created in the firmware. The standard curve and unknown sample were then 5 × for 1 hour at 4 ° C. 10FiveOf HT29 cells. Carefully remove unbound antibody After washing, the cells were resuspended in 100 mL flow buffer and washed with fluorescent isothiocyanate. Incubate with goat-anti-human antibody labeled with anate (FITC) for 1 hour at 4 ° C. I got it. After further washing with flow buffer, the sample is Coulter EPICS Analyzed by flow cytometry using a 753 flow cytometer. firefly Optical FITC and propidium iodide (PI) with an argon laser 4 Excitation was carried out using a 88 nm emission line. Output in light regulation mode It was set to 500 mW. Single cell 90 degrees and anterior Identified by angular light scattering. Separates single cells from aggregates and cell debris To this end, an analysis window was applied to these parameters. FITC and The fluorescence from propidium is separated by a 550 nm long-pass dichroic filter, 0nm bandpass filter (FITC) and 635nm bandpass filter ( PI). Light scatter parameters as integrated signal The fluorescence was collected as a logarithmically integrated signal. Incorporation of dead cells into PI It was excluded from the measurements by placing an analysis window for sex cells. Per sample Mean fluorescence was calculated from each histogram (weighted average from 2500 cells) . FITC calibrating beads were analyzed in each experiment to establish a standard curve. next , The average fluorescence intensity for each sample is expressed as the average FITC equivalent per cell It was Immunoreactivity is measured by comparing the mean fluorescence intensity of unknown samples with the value from the standard curve. Calculated by The ING-1 / TMT sample is the original IN It has a value of immunoreactivity comparable to that of G-1 antibody. (13d) Determination of aggregate formation by molecular sieve HPLC   30 cm x 7.5 mm TSK-G3000SW equipped with a guard column of the same material Molecular sieve (size-exclusion) HPLC column (Supelco), 400-600 Use a Waters 600E HPLC system with PSI at a flow rate of 1.0 ml per minute. 10 mM sodium phosphate buffer supplemented with 150 mM sodium chloride Equilibrated with 12 column volumes. A sample of Bio-Rad gel filtered protein standard (25 mL) was injected onto the column. each The retention time of each standard was to a Waters 490 UV detector set at 280 nm. Therefore, it was monitored. Then collect the last standard from the column and load the column to 150 mM. 10 mM sodium phosphate buffer pH 6.0 with addition of sodium chloride Further wash with double volume. 200 mg / mL of original ING-1 antibody or IN A sample of G-1 / TMT (50 mL) was injected onto the column and the retention time was recorded. Retention From the peak area and retention time, the amount of aggregated substance in the ING-1 / TMT sample was calculated. calculated.   According to this method, the original ING-1 antibody has a retention time of 9.1 minutes. IN G-1 / TMT also has a major peak at 9.1 minutes, but the Inert peaks are sometimes observed at 7.3 minutes. By comparing the peak areas, The aggregation peak is 5% or less of the whole. (13e)90Radiolabeling of ING-1 / TMT with Y   Radioactive yttrium chloride at a specified volume (specific activity> 500Ci / mg 0.04M salt In hydrofluoric acid90Y) Neutralize with 2 volumes of 0.5M sodium acetate pH 6.0 did. The neutralized90Y (1.0mCi), 50mM containing 150mM sodium chloride ING-1 / TMT (1 mg / mL) in sodium acetate buffer pH 5.6 Added to 0 mL. The labeling was carried out for 1 hour and then the reaction mixture was treated with 150 mM sodium chloride. Buffer containing 50 mM sodium phosphate pH 7.4 with PBS (PBS) Pre-washed on a column and loaded onto an equilibrated PD-10 chromatography column. It was The sample was eluted from the column with 1.5 mL PBS. Radiolabeled ING Fractions of -1 / TMT (0.5 mL) were collected, measured for radioactivity and stored. 1.0 By taking a sample of mL and spotting it on a Germanic ITLC-SG paper strip. The labeling efficiency was determined. The paper strip contains 0.1M sodium citrate pH 6.0. In a glass beaker, the solvent tip reaches three quarters of the paper tip for a few minutes. Was deployed until A piece of paper90Optimized for Y, Compaq 386 / 20e System 200 image scan controlled by computer Inserted into the hood (Bioscan). Free in this system90Y moves to the beginning of the solvent While ING-1 / TMT (90Y) remains at the origin.   By using this system,9098% or more of Y radioactivity is the origin, and ING-1 / It is usually found to be associated with TMT. (13f) Labeling of ING-1 / TMT with fluorescent metal   Europiu is a chelating agent containing aromatic moieties held in close proximity to the coordination region. Mu (3+) Sensitized fluorescence by binding lanthanides such as I will be taken. In this case, light is absorbed through the aromatic system and this energy is transferred to gold. Move to the genus. The metal then has a very large Stokes shift and up to a few seconds. Emits light that is characterized by the fluorescence lifetime of. 0.05M Tris HCl bag Fur pH 7.5 in 2.5 mg ING-1 / TMT 0.5 mg aliquot containing a small stir bar Pipetted into a 4 ml conical reaction vial. 0.05M Tris HCl bag 250 mM europium chloride in fur pH 7.5 (Europium chloride hexahydrate: Aldrich) solution was prepared. An aliquot of this europium chloride solution (50 mL) to a reaction vial containing ING-1 / TMT and the resulting solution at room temperature. And stirred very slowly with a magnetic stirrer. Label for 1 hour , Then the reaction mixture was added to 10 mM sodium phosphate and 150 mM sodium chloride. PD-1 pre-washed and equilibrated with a buffer containing pH 6.0 (PBS) 0 chromatography column. Dissolve the sample from the column with 3.5 mL PBS. I put it out. The fluorescence of a 50 mL sample of metal-ING-1 / TMT complex was Perkin-Elmer LS50 fluorescence with 0 nm excitation wavelength (10 nm slit width) It was decided by a pedometer. Fluorescence emission with 10nm slit width and 430nm removal filter Recorded at 618 nm used. Functional chelate moieties on the ING-1 / TMT complex Bonded with one europium ion in position. Using this method, from 0.1 to 3 Fluorescent europium ions between were bound per antibody molecule.     Example 14 (14a) ING-1-Ld (I-QI-Fluorescence L- to cells treated with I) Flow cytometry of d (cI) binding   ING-1-maleimido-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-3'-L -D (I-QI-I) -5'Teg was prepared as in Example 10a. ING-1- Maleimide-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-5'-L-d (I-QI -I) -3'-Teg was prepared as in Example 10b. Fluorescently labeled CY5.1 8-L-d (I-QI-I) was prepared as in Example 2d. Fluorescently labeled CY5 ． 18-L-d (cI) and CY5.18-L-d (I) as in Example 3e. Prepared. Fluorescent dye CY5.18 was replaced with FITC and used Cytometry was performed essentially as described in 12c. HT-29 cells (0.5 x 106) ING-1-L-d (I-QI-I) with each 1 mg of sample Incubated on ice for 30 minutes. Wash cells twice with flow buffer and wash Pelletized at 1400 rpm x 5 minutes during cleaning. Next, the cells in each sample 5 mg CY5.18-L-d (cI) or CY5.18-L-d (I) Incubated on ice for 3 hours. Some cells were CY5.18-L- Incubated with d (cI) and CY5.18-Ld (I) alone. Flow -After thorough washing with buffer, the cells are analyzed with a fluorescence-activated cell sorter. It was CY5-18 calibration beads were analyzed and A standard curve of CY5-18 for fluorescence intensity was established. Average fluorescence per sample (2 A weighted average from 500 cells) was calculated for each histogram. Then each The average fluorescence intensity for each sample was calculated as the average CY5-18 equivalent per cell. I expressed it. Containing 100% fetal bovine serum instead of flow buffer Similar experiments were performed using the medium to incubate the cells.   By preliminary experiments, ING-1-maleimido-S- (on the surface of HT-29 cells was CH2)3-C (= NH2 +) -NH-3'L-d (I-QI-I) -5'-Teg To maximize the hybridization of CY5-18L-d (cI) to It takes about 3 hours. The degree of hybridization in each preparation There was no difference between the flow buffer and 100% FCS, which The L-enantiomeric oligonucleotide chain capped with It is suggested that it is stable against digestion with a protease. Large amount of CY5.18-L-d (CI) can hybridize to both cell surface bound complexes. fluorescence Sex L-enantiomeric oligonucleotides per se or in complex To CY5-18-Ld (I-QI-I) by hybridization Nonspecific binding to the cells was relatively small. (14b) ING-1-Ld (I-QI-I) to HT-29 cells treated of90Y-TMT-L-d (cI) -TMT-90Y bond   TMT-Ld (cI) -TMT was added to 0.1 mCi / p model as disclosed in Example 7. To the specific activity of the protein. ING-1-TMT-90Y was prepared as in Example 13e It was ING-1-MA Reimido-S- (CH2)3-C (= NH2 +) -NH-3'-L-d (I-QI− I) -5'-Teg was prepared as in Example 10a. Add 10% fetal bovine serum 1 x 10 each in DMEM mediumFivePrepare 3 tubes containing HT-29 cells. It was manufactured and stored at 4 ° C. throughout. Make sure that the amount of antibody added is equal. To demonstrate, use a consistent protein concentration for all tubes and Processed as shown in Table 1 below.   Samples 1 and 3 show that the radioactivity associated with the cell pellet was Labeled ING-1-TMT90Y), which means that Transport systems with separate components emit more radiation than directly labeled antibodies Suggests that it can carry activity. (14c) HT-29 cells and ING-1-Ld (I- QI-ING) labeled with europium on HT-29 cells treated with I)- 1 / TMT and TMT-L-d (cI) -TMT binding respectively   The TMT-L- (cI) -TMT complex was treated with europium as described in Example 6a. Ion-labeled ING-1 / TMT with europium as described in Example 13f. Labeled with ions. Use the standard curve from 100 pmol / 100 microL to 6 It was prepared for both conjugates in the concentration range of mtmol / 100 microL. HT -29 cells with 10% FCS and 50 microgram / ml gentamicin. Growing to confluence in McCoy's medium containing. The cells in phosphate buffered saline After washing, 5 ml Trypsin Versene was added. Then H T-29 cells for 15 minutes at 5% CO2Incubate at 37 ° C in (5 ml) was added to remove cells and washed with PBS. Then HT-29 cells For 10 minutes at 4 ° C610 micrograms of cut salmon sperm per cell Offspring (natural D-enantiomer) DNA, washed with PBS, It was used for such hybridization measurement. 5 × 10FiveHT-29 cells , Ing-1 / TMT or Ing-1-Ld (I-QI-I) 100 Ikuro L was added to the working dilution and the mixture was incubated on ice for 30 minutes . Wash cells for 5 minutes at 1400 RPM with wash buffer (PBS + 0.1% BSA + 0 ． 01% NaN3) Washed twice with 2 ml. Then, TMT-L-d (cI) -T Working dilution of MT (100 microL) To a suitable tube and incubating the reaction mixture on ice for 3 hours, followed by 5 2 ml wash buffer (PBS + 0.1% BSA + 0.01% NaN3) Washed twice.   Each binding experiment was performed 3 times. After the above binding and hybridization , The cell suspension was stored in a test tube at 4 ° C until use (10 minutes to 1 hour) . After vortexing, separate the coaster EIA / RIA 96-well plate To remove 100 microL aliquots from each tube in 4 places in each well Therefore, the fluorescence of europium can be analyzed by the Fluorometer 1232 hours in Delphi. It was measured at. The results were processed as shown in Example 15f. Eu-TMT-L- Counts per second (cps) of cells treated with d (cI) -TMT-Eu Considered as the ground, from the cps data from the hybridization experiment Subtracted (Eu-TMT-L-d (cI) -TMT-Eu / Ing-1-L- d (I-QI-I)). From this result and Ing-1 / TMT-Eu binding experiment Cps data for picomoles per cell from independently generated individual standard curves As a bound TMT molecule.   Results are fluorescence counts per second (cps) or 10FiveNumber of picomoles per cell Shown as #. 5 × 10FiveING-1 / TMT-Eu per cell And ING-complex: 0.25 microgram or 1.65 pmol; Eu- TMT-L-d (cI) -TMT-Eu: 100 ng It is 15 picomoles. ING-1-TMT and ING-1-L-d (I-QI− I) to form TMT, and Ld (IQ)I-I) by I In the latter case, Eu was added to make the same modification of NG-1 and the IN When ING-1 / TMT-Eu is formed from G-1 / TMT, on the other hand, Eu-TMT-Ld (cI) -TMT-Eu is ING-1-Ld (I-Q).I -I) and increased the fluorescence in each case when forming a hybrid. There was amplification.   The present invention has been described in detail with particular reference to some preferred embodiments thereof. Only However, it is understood that changes and modifications can be made within the spirit and scope of the invention. Will be.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブラック、クリストファー・ダグラス・バ リアント アメリカ合衆国、メリーランド州 20906、 シルバー・スプリング、アクエリアス・ア ベニュー 2815─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (72) Inventor Black, Christopher Douglas Ba             Liant             Maryland, USA 20906,             Silver Spring, Aquarius A             Venue 2815

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．腫瘍抗原を認識する部分、１以上の非自己会合性Ｌ−エナンチオメリック オリゴヌクレオチド配列、および１以上の結合基を具備した非放射性ターゲッテ ィング免疫試薬。 ２．１以上のキレート剤、１以上の結合基、１以上の放射性核種、および非自 己会合性Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列の１以上のフラグメン トに、配列において相補的であり、該１以上のフラグメントとハイブリダイズで きるＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチド配列を具備した放射性ターゲッ ティング免疫試薬。 ３．下記構造IVによって表される部分を具備したターゲッティング免疫試薬。 但し、 Ｚは、免疫反応性タンパクの残基である； ＬzおよびＬQは、独立に化学結合若しくは結合基である； Ｉは、１２から約５０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットの 隣接した配列を含有するＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドであって、 前記隣接した配列が、同一の隣接した配列のファミリーの１以上の メンバーを含み、前記ファミリーの個々の同一物が１２から約３０のＬ−エナン チオメリックヌクレオチドユニットを含有するものであるが、前記Ｌ−エナンチ オメリックオリゴヌクレオチドの６以上の隣接した配列が、構造IV内の何れの位 置の六以上の隣接したＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットのいずれの 他の隣接した配列ともハイブリダイズしないという条件がある； ＱIは、スペーシング基である； ａは、０または１から約６までの整数である； Ｉiは、１２から約５０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニット の隣接した配列であって、該Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの該ユ ニット内の隣接した配列がＩの隣接した配列と同一であるものである； Ｅは、末端キャッピング基（end capping group）である； ｐは、１から約１０までの整数である。 ４．下記構造Ｖで表される部分を具備した放射性ターゲッティング試薬。 但し、 ｃＩは、１２から約５０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニット のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの隣接した配列であって、前記隣 接した配列が、同一の隣接した配列のファミリーの１以上のメンバーを含み、前 記ファミリーの個々の同一物が１２から約３０のＬ−エナンチオメリックヌクレ オチドユニットを含有するものであり、前記同一物のＬ−エナンチオメリックヌ クレオチド配列が、共に投与されうるターゲッティング免疫試薬内の一連のＬ− エナンチオメリックオリゴヌクレオチドのメンバーのＬ−エナンチオメリックヌ クレオチド配列に相補的であり、前記相補的なＬ−エナンチオメリックオリゴヌ クレオチドの６以上のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットの隣接した 配列が、構造Ｖ内の何れの位置の六以上の隣接したＬ−エナンチオメリックヌク レオチドユニットのいずれの他の隣接し た配列ともハイブリダイズしないものである； ＱcIは、スペーシング基である； Ｌ1、Ｌ2、およびＬ3は、各々独立に化学結合若しくは結合基である； Ｗ1、Ｗ2、およびＷ3は、各々独立にキレート基の残基である； Ｍ1、Ｍ2、およびＭ3は、各々＋１と等しいか、またはこれより大きい酸 化状態を有する元素を包含し、Ｍ1、Ｍ2、およびＭ3の少なくとも１つが放射性 核種である； ｘ、ｙ、およびｚは、独立にゼロまたは１であるが、ｘ、ｙ、およびｚの 少なくとも１つが１であるという条件が付く；および ｗおよびｂは独立にゼロまたは１から約４の整数である。 ５．ａが１から約６の整数である請求の範囲第３項に記載の試薬。 ６．Ｚが抗体の残基または抗体フラグメントの残基である請求の範囲第３項に 記載の試薬。 ７．請求の範囲第６項に記載の試薬であって、該抗体が、ＩＮＧ−１；Ｂ７２ ．３；９．２．２７；Ｄ６１２；ＵＪ１３Ａ；ＮＲＬＵ−１０；７Ｅ１１Ｃ５； ＣＣ４９；ＴＮＴ；ＰＲ１Ａ３；Ｂ１７４；Ｃ１７４；Ｂ４３；および抗ＨＬＢ 抗体から選択される試薬。 ８．請求の範囲第３項に記載の試薬であって、ＬzまたはＬQが、異種二感応性 交差結合試薬の残基である試薬。 ９．請求の範囲第８項に記載の試薬であって、該異種二感応性交差結合剤が、 スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１− カルボキレート、スルホスクシンイミジル （４−ヨードアセチル）アミノベン ゾエート、スルホスクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー ト、２−イミノチオラン、およびＮ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセ テートよりなる群から選択される試薬。 １０．請求の範囲第３項に記載の試薬であって、ＬzまたはＬQが反応性官能基 を具備する修飾されたヌクレオチド部分の残基である試薬。 １１．請求の範囲第１０項に記載の試薬であって、該反応性官能基がアミン基 およびスルフヒドリル基よりなる群から選択される試薬。 １２．ＩおよびＩiがＬ−エナンチオメリックＤＮＡである請求の範囲第３項 に記載の試薬。 １３．Ｉが配列番号８で示される配列を有する請求の範囲第３項に記載の試薬 。 １４．ＱIがＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの残基である請求の 範囲第３項に記載の試薬。 １５．Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドが配列L-d(ACTCTC)を有す る請求の範囲第１４項に記載の試薬。 １６．Ｅがエキソヌクレアーゼ活性に耐性な修飾されたヌクレオチド基の残基 である請求の範囲第３項に記載の試薬。 １７．該修飾されたヌクレオチドがポリ（アルキレングリ コール）ホスフェートジエステルを具備した請求の範囲第１６項に記載の試薬。 １８．請求の範囲第１７項に記載の試薬であって、該ジエステルがテトラ（エ チレングリコール）ホスフェートジエステルである試薬。 １９．ｃＩが配列番号２３で示される配列を有する請求の範囲第４項に記載の 試薬。 ２０．ＱIがＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの残基である請求の 範囲第４項に記載の試薬。 ２１．該Ｌ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドが、配列L-d(ACTCTC)を 有する請求の範囲第２０項に記載の試薬。 ２２．Ｌ1、Ｌ2またはＬ3が、異種二感応性交差結合剤の残基である請求の範 囲第４項に記載の試薬。 ２３．請求の範囲第２２項に記載の試薬であって、該異種二感応性交差結合剤 が、スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン− １−カルボキレート、スルホスクシンイミジル （４−ヨードアセチル）アミノ ベンゾエート、スルホスクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチ レート、２−イミノチオラン、およびＮ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオ アセテートよりなる群から選択される試薬。 ２４．Ｌ1、Ｌ2またはＬ3が、反応性官能基を含有する修飾されたヌクレオチ ド部分の残基である請求の範囲第４項に記載の試薬。 ２５．請求の範囲第２４項に記載の試薬であって、該反応 性官能基がアミン基およびスルフヒドリル基よりなる群から選択される試薬。 ２６．Ｗ1、Ｗ2またはＷ3が独立にポリカルボン酸基を含有する請求の範囲第 ４項に記載の試薬。 ２７．請求の範囲第４項に記載の試薬であって、Ｗ1、Ｗ2またはＷ3が、Ｂ４ Ａ、Ｐ４Ａ、ＴＭＴ、ＤＣＤＴＰＡ、ＰｈｅＭＴ、マクロＰｈｅＭＴ、およびマ クロＴＭＴよりなる群から独立に選択される試薬。 ２８．請求の範囲第４項に記載の試薬であって、該放射性核種が、44Ｓｃ、64 Ｃｕ、67Ｃｕ、111Ｉｎ、212Ｐｂ、68Ｇａ、87Ｙ、90Ｙ、153Ｓｍ、212Ｂｉ、99 m Ｔｃ、177Ｌｕ、186Ｒｅおよび188Ｒｅから選択される試薬。 ２９．下記構造の化合物を製造する方法であって、 但し、 Ｚは、免疫反応性タンパクの残基である； ＬzおよびＬQは、独立に化学結合若しくは結合基である； Ｉは、１２から約５０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットの 隣接した配列を含有するＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドであって、 前記隣接した配列が、同一の隣接した配列のファミリーの１以上の メンバーを含み、前記ファミリーの個々の同一物が１２から約３０のＬ−エナン チオメリックヌクレオチドユニットを含有するものであるが、前記Ｌ−エナンチ オメリックオリゴヌクレオチドの６以上の隣接した配列が、構造IV内の何れの位 置の六以上の隣接したＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットのいずれの 他の隣接した配列ともハイブリダイズしないという条件がある； ＱIは、スペーシング基である； ａは、１から約６までの整数である； Ｉiは、１２から約５０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニット のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドの隣接した配列であって、その内の隣接 した配列がＩの一部を含有するものである； Ｅは、末端キャッピング基である； ｐは、１から約１０までの整数である。 （ｉ）Ｌzの残基に対する前駆体を用いて、Ｚ−［Ｌz］Pの残基に対する前駆体 である共有結合性コンプレックスを形成するのに十分な条件下および時間でＺを 派生する（deriva-tizing）こと； （ii）ＬQの残基に対する前駆体を用いて、ＬQ−Ｅの残基に対する前駆体である 共有結合性コンプレックスを形成するのに十分な条件下および時間でＥの残基に 対する前駆体を派生すること； （iii）Ｉiの残基に対する前駆体を用いて、Ｉi−ＬQ−Ｅの残基に対する前駆体 である共有結合性コンプレックスを形成 するのに十分な条件下および時間でＬQ−Ｅの残基の前駆体を派生すること； （iv）ＱIの残基に対する前駆体を用いて、ＱI−Ｉi−ＬQ−Ｅの残基に対する前 駆体である共有結合性コンプレックスを形成するのに十分な条件下および時間で Ｉi−ＬQ−Ｅの残基の前駆体を派生すること； （ｖ）Ｉiの残基に対する前駆体、次いでＱIの残基に対する前駆体を用いて、［ ＱI−Ｉi］a−ＬQ−Ｅの残基に対する前駆体である共有結合性コンプレックスを 形成するのに十分な条件下および時間でＱI−Ｉi−ＬQ−Ｅの残基の前駆体を派 生すること； （vi）Ｉの残基に対する前駆体を用いて、Ｉ−［ＱI−Ｉi］a−ＬQ−Ｅの残基に 対する前駆体である共有結合性コンプレックスを形成するのに十分な条件下およ び時間で［ＱI−Ｉi］a−ＬQ−Ｅの残基の前駆体を派生すること； （vii）Ｌzの残基に対する前駆体を用いて、Ｌz−Ｉ−［ＱI−Ｉi］a−ＬQ−Ｅ の残基に対する前駆体である共有結合性コンプレックスを形成するのに十分な条 件下および時間でＩ−［ＱI−Ｉi］a−ＬQ−Ｅの残基に対する前駆体を派生する こと；および （viii）Ｚ−［Ｌz］pの残基に対する前駆体を用いて、共有結合性コンプレック スＺ−［Ｌz−Ｉ−［ＱI−Ｉi］a−ＬQ−Ｅ］pを形成するのに十分な条件下およ び時間でＬz−Ｉ−［ＱI−Ｉi］a−ＬQ−Ｅの残基に対する前駆体を派生するこ と を具備した方法。 ３０．下記構造の化合物を製造する方法であって、 但し、 ｃＩは、１２から約５０のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニット のＬ−エナンチオメリックオリゴヌクレオチドの隣接した配列であって、前記隣 接した配列が、同一の隣接した配列のファミリーの１以上のメンバーを含み、前 記ファミリーの個々の同一物が１２から約３０のＬ−エナンチオメリックヌクレ オチドユニットを含有するものであり、前記同一物のＬ−エナンチオメリックヌ クレオチド配列が、共に投与されうるターゲッティング免疫試薬内の一連のＬ− エナンチオメリックオリゴヌクレオチドのメンバーのＬ−エナンチオメリックヌ クレオチド配列に相補的であり、前記相補的なＬ−エナンチオメリックオリゴヌ クレオチドの６以上のＬ−エナンチオメリックヌクレオチドユニットの隣接した 配列が、 構造Ｖ内の何れの位置の六以上の隣接したＬ−エナンチオメリックヌクレオチド ユニットのいずれの他の隣接した配列ともハイブリダイズしないものである； ＱcIは、スペーシング基である； Ｌ1、Ｌ2、およびＬ3は、各々独立に化学結合若しくは結合基である； Ｗ1、Ｗ2、およびＷ3は、各々独立にキレート基の残基である； Ｍ1、Ｍ2、およびＭ3は、各々＋１と等しいか、またはこれより大きい酸 化状態を有する元素を包含し、Ｍ1、Ｍ2、およびＭ3の少なくとも１つが放射性 核種である； ｘ、ｙ、およびｚは、独立にゼロまたは１であるが、ｘ、ｙ、およびｚの 少なくとも１つが１であるという条件が付く；および ｗおよびｂはにゼロまたは１から約４の整数である； （１）ｃＩの残基に対する前駆体を用いて、Ｌ1−ｃＩの残基に対する前駆体で ある共有結合性コンプレックスを形成するのに十分な条件下および時間でＬ1の 残基に対する前駆体を派生（derivatizing）すること； （ii）Ｌ3の残基に対する前駆体を用いて、ＱcI−［Ｌ3］wの残基に対する前駆 体である共有結合性コンプレックスを形成するのに十分な条件下および時間でＱcI の残基に対する前駆体を派生すること； （iii）ＱcI−［Ｌ3］wの残基に対する前駆体を用いて、Ｌ1−ｃＩ−｛ＱcI−［ Ｌ3］w｝の残基に対する前駆体である共 有結合性コンプレックスを形成するのに十分な条件下および時間でＬ1−ｃＩの 残基の前駆体を派生すること； （iv）Ｌ2の残基に対する前駆体を用いて、Ｌ1−ｃＩ−｛ＱｃＩ−［Ｌ3］w−Ｌ2 ｝の残基に対する前駆体である共有結合性コンプレックスを形成するのに十分 な条件下および時間でＬ1−ｃＩ−｛ＱcI−［Ｌ3］w｝の残基の前駆体を派生す ること； （ｖ）ＱcI−［Ｌ3］wの残基に対する前駆体、次いでＬ2の残基に対する前駆体 を用いて、下式の残基に対する前駆体である共有結合性コンプレックスを形成す るのに十分な条件下および時間でＬ1−ｃＩ−｛ＱcI−［Ｌ3］w−Ｌ2｝の残基の 前駆体を派生すること； （vi）Ｗ1、Ｗ2、およびＷ3の残基に対する前駆体を用いて、下式の残基に対す る前駆体である共有結合性コンプレックス、 を形成するのに十分な条件下および時間で下式の残基の前恥体を派生すること： （vii）［Ｍ1］x、［Ｍ2］z、および［Ｍ3]yの残基に対する 前駆体を用いて、下式のコンプレックスを形成するのに十分な条件下および時間 で 下式の残基に対する前駆体を派生すること を具備した方法。 ３１．薬学的に許容しうる媒体中に溶解または分散された請求の範囲第３項に 記載の化合物を含有する薬学的組成物。 ３２．薬学的に許容しうる媒体中に溶解または分散された請求の範囲第４項に 記載の化合物を含有する薬学的組成物。 ３３．哺乳動物内の腫瘍を治療する方法であって、薬学的に許容しうる媒体中 の請求の範囲第３項に記載の非放射性ターゲッティング免疫試薬の効果的な投与 量を前記動物に投与すること、前記非放射性ターゲッティング免疫試薬が前記哺 乳動物の腫瘍部位で蓄積されるのに十分な時間待ち、引き続き、前記哺乳動物に 薬学的に許容しうる媒体中の請求の範囲第４項に記載の放射性ターゲッティング 試薬の効果的な投与 量を投与し、前記放射性ターゲッティング試薬が該標的部位（該標的部位には、 前記哺乳動物内の前記腫瘍部位で蓄積された前記非放射性ターゲッティング免疫 試薬が存在する。）で蓄積するのに十分な時間待つことを具備した方法。 ３４．哺乳動物における診断用イメージングの方法であって、イメージングに 効果的な投与量の、薬学的に許容しうる媒体中の請求の範囲第３項に記載の非放 射性ターゲッティング免疫試薬を前記動物に投与すること、前記非放射性ターゲ ッティング免疫薬が前記哺乳動物内のイメージング部位で蓄積されるのに十分な 時間待ち、引き続き前記哺乳動物に、イメージングに効果的な量の、薬学的に許 容しうる媒体中の請求の範囲第４項に記載の放射性ターゲッティング試薬を投与 し、前記放射性ターゲッティング試薬が該標的部位（前記標的部位には、前記哺 乳動物内の前記イメージング部位で蓄積された前記非放射性ターゲッティング免 疫試薬が存在する。）で蓄積するのに十分な時間待ち、前記哺乳動物のイメージ を生成させることを具備した方法。 ３５．Ｉが、二重らせんである請求の範囲第３項に記載の試薬。 ３６．ｃＩが二重らせんである請求の範囲第４項に記載の試薬。[Claims]   1. Tumor antigen recognizing moiety, one or more non-self-associating L-enantiomers Non-radioactive targeting comprising an oligonucleotide sequence and one or more linking groups Swing immunoreagent.   2.1 or more chelating agents, 1 or more binding groups, 1 or more radionuclides, and non-autologous One or more fragments of self-associating L-enantiomeric oligonucleotide sequences Is complementary in sequence and hybridizes to the one or more fragments. Radioactive targeting with an L-enantiomeric oligonucleotide sequence Ting immunoreagent.   3. A targeting immunoreagent comprising a moiety represented by Structure IV below.     However,       Z is a residue of an immunoreactive protein;       LzAnd LQAre independently chemical bonds or linking groups;       I is of 12 to about 50 L-enantiomeric nucleotide units An L-enantiomeric oligonucleotide containing flanking sequences, comprising: The flanking sequences are one or more of the same family of flanking sequences. 12 to about 30 L-enans, each of which is an individual member of the family, including members. A thimeric nucleotide unit is contained in the L-enantiomer. Six or more contiguous sequences of the omeric oligonucleotide can be located at any position in structure IV. Any of six or more adjacent L-enantiomeric nucleotide units Provided that it does not hybridize to other flanking sequences;       QIIs a spacing group;       a is an integer from 0 or 1 to about 6;       IiIs 12 to about 50 L-enantiomeric nucleotide units A flanking sequence of the L-enantiomeric oligonucleotide A flanking sequence in the knit is identical to a flanking sequence of I;       E is an end capping group;       p is an integer from 1 to about 10.   4. A radioactive targeting reagent comprising a moiety represented by the following structure V:     However,       cI is 12 to about 50 L-enantiomeric nucleotide units A contiguous sequence of L-enantiomeric oligonucleotides of The flanking sequences contain one or more members of the same contiguous sequence family, The individual identities of the above family are from 12 to about 30 L-enantiomeric nucleotides. An L-enantiomeric compound containing the same octide unit The cleotide sequence is a series of L-s within the targeting immunoreagent that can be co-administered. L-enantiomers of members of enantiomeric oligonucleotides Is complementary to the cleotide sequence and is said complementary L-enantiomeric oligonucleotide. 6 or more contiguous L-enantiomeric nucleotide units of cleotide The sequence has six or more contiguous L-enantiomers of N in any position within structure V. Any other adjacent of leotide unit Do not hybridize with       QcIIs a spacing group;       L1, L2, And L3Are each independently a chemical bond or a bonding group;       W1, W2, And W3Are each independently a residue of a chelating group;       M1, M2, And M3Are acids equal to or greater than +1 each Including an element having a conversion state, M1, M2, And M3At least one of is radioactive Is a nuclide;       x, y, and z are independently zero or 1, but of x, y, and z With the proviso that at least one is 1.       w and b are independently zero or an integer from 1 to about 4.   5. The reagent according to claim 3, wherein a is an integer of 1 to about 6.   6. Z is a residue of an antibody or a residue of an antibody fragment. Described reagents.   7. The reagent according to claim 6, wherein the antibody is ING-1; B72. ． 3; 9.2.27; D612; UJ13A; NRLU-10; 7E11C5; CC49; TNT; PR1A3; B174; C174; B43; and anti-HLB A reagent selected from antibodies.   8. The reagent according to claim 3, wherein LzOr LQBut different sensitivities A reagent that is the residue of a cross-linking reagent.   9. The reagent according to claim 8, wherein the heterobifunctional cross-linking agent is Sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1- Carbochelate, sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl) aminoben Zoate, sulfosuccinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) butyrate , 2-iminothiolane, and N-succinimidyl S-acetylthioacetate A reagent selected from the group consisting of tate.   10. The reagent according to claim 3, wherein LzOr LQIs a reactive functional group A reagent which is a residue of a modified nucleotide moiety comprising:   11. The reagent according to claim 10, wherein the reactive functional group is an amine group. And a reagent selected from the group consisting of sulfhydryl groups.   12. I and IiWherein L is an L-enantiomeric DNA. The reagent according to.   13. The reagent according to claim 3, wherein I has a sequence represented by SEQ ID NO: 8. .   14. QIIs a residue of an L-enantiomeric oligonucleotide. The reagent according to claim 3.   15. L-enantiomeric oligonucleotide has the sequence L-d (ACTCTC) The reagent according to claim 14, wherein   16. E is a residue of a modified nucleotide group resistant to exonuclease activity The reagent according to claim 3, which is   17． The modified nucleotide is poly (alkylene glycol). The reagent according to claim 16, which comprises a (chol) phosphate diester.   18. The reagent according to claim 17, wherein the diester is tetra (ene). Reagent which is a (ethylene glycol) phosphate diester.   19. The cI according to claim 4, having the sequence shown in SEQ ID NO: 23. reagent.   20. QIIs a residue of an L-enantiomeric oligonucleotide. The reagent according to claim 4.   21. The L-enantiomeric oligonucleotide has the sequence L-d (ACTCTC) The reagent according to claim 20, which has.   22. L1, L2Or L3Is a residue of a heterobifunctional cross-linking agent. The reagent according to item 4.   23. 23. The reagent according to claim 22, wherein said heterobifunctional cross-linking agent. Is sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane- 1-carbochelate, sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl) amino Benzoate, sulfosuccinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) butyrate Rate, 2-iminothiolane, and N-succinimidyl S-acetylthio A reagent selected from the group consisting of acetate.   24. L1, L2Or L3Is a modified nucleotidy containing a reactive functional group. The reagent according to claim 4, wherein the reagent is a residue of a residue.   25. The reagent according to claim 24, wherein the reaction A reagent in which the functional group is selected from the group consisting of an amine group and a sulfhydryl group.   26. W1, W2Or W3Wherein each independently contains a polycarboxylic acid group. The reagent according to item 4.   27. The reagent according to claim 4, wherein W1, W2Or W3But B4 A, P4A, TMT, DCDTPA, PheMT, macro PheMT, and macro A reagent independently selected from the group consisting of black TMT.   28. The reagent according to claim 4, wherein the radionuclide is44Sc,64 Cu,67Cu,111In,212Pb,68Ga,87Y,90Y,153Sm,212Bi,99 m Tc,177Lu,186Re and188Reagent selected from Re.   29. A method for producing a compound having the following structure,     However,       Z is a residue of an immunoreactive protein;       LzAnd LQAre independently chemical bonds or linking groups;       I is of 12 to about 50 L-enantiomeric nucleotide units An L-enantiomeric oligonucleotide containing flanking sequences, comprising: The flanking sequences are one or more of the same family of flanking sequences. 12 to about 30 L-enans, each of which is an individual member of the family, including members. A thimeric nucleotide unit is contained in the L-enantiomer. Six or more contiguous sequences of the omeric oligonucleotide can be located at any position in structure IV. Any of six or more adjacent L-enantiomeric nucleotide units Provided that it does not hybridize to other flanking sequences;       QIIs a spacing group;       a is an integer from 1 to about 6;       IiIs 12 to about 50 L-enantiomeric nucleotide units A contiguous sequence of L-enantiomeric nucleotides of The sequence that contains part of I;       E is a terminal capping group;       p is an integer from 1 to about 10. (I) LzUsing the precursor for the residue of Z- [Lz]PPrecursor to the residue of Z under conditions and for a time sufficient to form a covalent complex that is Deriva-tizing; (Ii) LQThe precursor to the residue ofQIs a precursor to the -E residue To the residue of E under conditions and for a time sufficient to form a covalent complex Derivation of a precursor to; (Iii) IiUsing a precursor to the residue ofi-LQ-A precursor to the residue of E Form a covalent complex that is L under conditions and for a time sufficient toQ-Deriving a precursor for the residue of E; (Iv) QIUsing a precursor for the residueI-Ii-LQ-Before the residue of E Under conditions and for a time sufficient to form a precursor covalent complex Ii-LQ-Deriving a precursor for the residue of E; (V) IiPrecursor to the residue of, then QIUsing the precursor for the residue of QI-Ii]a-LQThe covalent complex that is the precursor to the -E residue Q under conditions and for a time sufficient to formI-Ii-LQ-Form the precursor of the E residue To live; (Vi) Using the precursor for the residue of I, I- [QI-Ii]a-LQAt the residue of -E Conditions sufficient to form a covalent complex that is a precursor to And time [QI-Ii]a-LQ-Deriving a precursor for the residue of E; (Vii) LzThe precursor to the residue ofz-I- [QI-Ii]a-LQ-E Sufficient to form a covalent complex that is a precursor to the residue of I- [QI-Ii]a-LQ-Derivate a precursor for the E residue That; and (Viii) Z- [Lz]pUsing a precursor to the residue of Space Z- [Lz-I- [QI-Ii]a-LQ-E]pConditions sufficient to form And L in timez-I- [QI-Ii]a-LQ-Derivation of a precursor to the residue of E When A method comprising.   30. A method for producing a compound having the following structure,     However,       cI is 12 to about 50 L-enantiomeric nucleotide units A contiguous sequence of L-enantiomeric oligonucleotides of The flanking sequences contain one or more members of the same contiguous sequence family, The individual identities of the above family are from 12 to about 30 L-enantiomeric nucleotides. An L-enantiomeric compound containing the same octide unit The cleotide sequence is a series of L-s in the targeting immunoreagent that can be co-administered L-enantiomers of members of enantiomeric oligonucleotides Is complementary to the cleotide sequence and is said complementary L-enantiomeric oligonucleotide. 6 or more contiguous L-enantiomeric nucleotide units of cleotide The array is Six or more adjacent L-enantiomeric nucleotides at any position within structure V One which does not hybridize to any other flanking sequence of the unit;       QcIIs a spacing group;       L1, L2, And L3Are each independently a chemical bond or a bonding group;       W1, W2, And W3Are each independently a residue of a chelating group;       M1, M2, And M3Are acids equal to or greater than +1 each Including an element having a conversion state, M1, M2, And M3At least one of is radioactive Is a nuclide;       x, y, and z are independently zero or 1, but of x, y, and z With the proviso that at least one is 1.       w and b are zero or an integer from 1 to about 4; (1) Using a precursor for the residue of cI, L1-A precursor to the residue of cI L under conditions and for a time sufficient to form a covalent complex1of Derivatizing a precursor to a residue; (Ii) L3Using a precursor for the residuecI-[L3]wPrecursor to the residue Q under conditions and for a time sufficient to form the body covalent complexcI Deriving a precursor for the residue of (Iii) QcI-[L3]wThe precursor to the residue of1-CI- {QcI-[ L3]w} Which is a precursor to the residue L under conditions and for a time sufficient to form a bound complex1-CI Deriving a precursor for the residue; (Iv) L2The precursor to the residue of1-CI- {QcI- [L3]w-L2 } To form a covalent complex that is a precursor to the residue Under various conditions and times1-CI- {QcI-[L3]w} To derive the precursor of the residue To do; (V) QcI-[L3]wPrecursor to the residue of, then L2Precursor to the residue of To form a covalent complex that is a precursor to the residue of the formula L under conditions and time sufficient to1-CI- {QcI-[L3]w-L2} Residue Deriving a precursor; (Vi) W1, W2, And W3Using the precursor for the residue of A covalent complex that is a precursor Deriving the prepubic body of the following residues under conditions and for a time sufficient to form: (Vii) [M1]x, [M2]z, And [M3] yFor the residue of Conditions and time sufficient to form a complex of the following formula with the precursor so Derivation of a precursor to the residue of the formula A method comprising.   31. Claim 3 as dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable medium. A pharmaceutical composition containing the described compound.   32. Claim 5 as dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable medium. A pharmaceutical composition containing the described compound.   33. A method of treating a tumor in a mammal in a pharmaceutically acceptable vehicle Effective administration of the non-radioactive targeting immunoreagent according to claim 3. Administering a dose to said animal, said non-radioactive targeting immunoreagent Allow sufficient time for the tumor to accumulate at the tumor site, then Radioactive targeting according to claim 4 in a pharmaceutically acceptable medium. Effective administration of reagents An amount of the radioactive targeting reagent is administered to the target site (wherein the target site is The non-radioactive targeting immunity accumulated at the tumor site in the mammal Reagent is present. ), Waiting for a sufficient time to accumulate.   34. A method of diagnostic imaging in a mammal, comprising: Non-release of claim 3 in an effective dosage in a pharmaceutically acceptable vehicle. Administering a radioactive targeting immunoreagent to said animal, said non-radioactive target Sufficient for the immunological drug to accumulate at the imaging site in the mammal Wait for a period of time and then allow the mammal to receive a pharmaceutically acceptable amount of an imaging effective amount. Administration of the radioactive targeting reagent of claim 4 in an acceptable vehicle. However, the radioactive targeting reagent is added to the target site (the target site is The non-radioactive targeting accumulation accumulated at the imaging site in a mammal Epidemiological reagents are present. ) Wait a sufficient time to accumulate in the image of the mammal A method comprising: generating.   35. The reagent according to claim 3, wherein I is a double helix.   36. The reagent according to claim 4, wherein cI is a double helix.
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