JPH08512128A

JPH08512128A - 金属陽イオン検出用ｍｃａアッセイ／キット

Info

Publication number: JPH08512128A
Application number: JP7502846A
Authority: JP
Inventors: カールソン，ランドール・エイ; スタウト，ジェイ・エス; ウィリー，ドウェイン・イー; ワグナー，フレッド・ダブリュー; リッデル，マルコム
Original assignee: バイオネブラスカ，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-06-22
Filing date: 1994-06-02
Publication date: 1996-12-17
Also published as: ATE184108T1; AU7098194A; EP0706655A1; DE69420413D1; US5620856A; CA2165970A1; DE69420413T2; US5532136A; WO1995000845A1; EP0706655B1; AU675724B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、体液試料中の金属陽イオン検出のための方法およびキットを提供するものである。好ましい方法およびキットは、異なる特異性を有する少なくとも２種類のタイプの抗体の使用を含む。好ましい方法では、体液試料を、金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的なカプチャー抗体の有効量と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成することができる。第一抗原−抗体複合体に、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体または金属陽イオンに対して特異的な抗体の有効量を添加して、第二抗原−抗体複合体を形成する。体液試料中の金属陽イオンの量は、第二抗原−抗体複合体の量を検出することによって測定される。

Description

【発明の詳細な説明】金属陽イオン検出用ＭＣＡアッセイ／キット発明の背景鉛および他の金属陽イオンへの被曝が社会および個人に負わせる重荷は、金属陽イオン誘発性の精神的および身体的疾病を発現する人に対する健康管理のために必要とされる金額およびこれらの個人が他の点でなす生産的貢献の損失を考えると、膨大である。例えば、鉛被曝は、ヒトが被曝する鉛の量および被曝時間に依存して、急性または慢性発現を生じることがある。鉛への急性被曝は、非常にしばしば、腸疝痛を誘発するが、一方、慢性被曝は、知能低下および行動障害などの、脳障害から心理的欠損症までの範囲の種々の神経的症状を生じることがある。水銀およびカドミウムなどの他の金属陽イオンは、神経系、生殖系および免疫系に有害な影響を及ぼすこともある。この状況における真の悲劇の１つは、大体は、この状況が予防可能であるということである。好都合で、安価で、かつ信頼性のあるスクリーニング方法が存在するならば、それらは、回復不能の健康的影響が生じる前、危険な状態の個体を同定するために、ならびに、鉛および他の金属陽イオンの環境的供給源を突きとめるために適用することができる。原子吸光分光測定法およびアノードストリッピングボルタンメトリー（anodic stripping voltametry）などの方法のほとんどは、血液中の、鉛を含む金属の検出に対して向けられた。しかしながら、これらの方法は、適正な操作のための非常に訓練された人員を必要とする高価で特別な装置を利用し、かくして、不可能でなければ、広範囲なスクリーニングプログラムにおけるそれらの使用を困難にする。別法としては、血液陽イオン汚染の信頼性のある指標として供し得る他のパラメーターが要求された。鉛について同定されるものとしては、赤血球プロトポルフィリンの増加［エス・ピオメーレ（S.Piomelle）、ロウ・レベル・リード・イクスポウジャー（Low Level Lead Exposure）、エイチ・ニードルマン（H．Ne edleman）、編集者、レイヴァン・ラス（Raven Russure）、ニューヨーク、第６７−７４頁（１９８０）］、δ−アミノレブリン酸無水物（ＡＬＡＤ）酵素活性の低下［エス・ハーンバーグ（S.Hernberg）ら、ランセット（Lancet）、Ｉ：６３−６６（１９７０）］、およびヘムシンセターゼ活性の低下［オー・ワダ（O. Wada）ら、Ind.Health、１０：８４−９２（１９７２）］が挙げられる。これらのうち、赤血球プロトポルフィリン（ＥＰ）の増加だけは、血液中の鉛の存在を検出するためのスクリーニング方法として活用されてきた。この系による大きな問題点は、ＥＰの測定が、血中の鉛の「安全な」レベルとしてＣＤＣによって最近定義された限界の２.５倍である２５μg／dl未満の血液鉛濃度の正確な相互関係については充分には感度が高くないことである［エル・アレッシオ（L.Alessi o）ら、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・インダストリーアル・メディスン（British J．Ind.Med.）、３８：２６２−２６７（１９８１）］。ＡＬＡＤは、亜鉛含有酵素であり、その酵素活性の阻害は、鉛を含む金属陽イオンによる亜鉛の置換から生じると思われる［イー・ジャフィ（E．Jaffe）ら、バイオロジカル・トレース・エレメント・リサーチ（Biol.Trace Element Res. ）、２８：２２３−２３２（１９９１）］。ＡＬＡＤ活性の低下は、鉛汚染の第１の測定可能な影響であり、鉛毒性の最も感度の高い測定であると思われる［ハーンバーグら、前記文献］。ＡＬＡＤの低下は、鉛中毒の病原に関係しており、かくして、鉛または他の重金属に被曝した患者の臨床状態の信頼性のある指標として供することもできる。アストリン（Astrin）ら、アナルズ・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ann Ny.Acad.Sci.）、５１４：２３（１９８７）。血液鉛についての実用的なアッセイの開発のためのこのパラメーターを使用することに伴う困難さは、一般的に、酵素アッセイが広範囲のスクリーニングプログラムのために使用するために充分には好都合かつ迅速ではないということである。かくして、動物および環境中の鉛または他の金属陽イオンの存在についての、信頼性がありかつ迅速なスクリーニングおよび／または診断アッセイが必要とされている。さらに、血中の鉛および鉛−ＡＬＡＤの定量的検出のためのイムノアッセイが必要とされている。また、ヒト、動物または環境から誘導された流体中の金属陽イオン濃度測定用キットにおける迅速なスクリーニングアッセイも必要とされている。発明の概要本発明は、動物の体液試料中の金属陽イオンの検出方法および該検出用キットを提供するものである。好ましい方法およびキットは、異なる特異性を有する少なくとも２つの抗体の使用を含む。これらの抗体は、いくつかのサブタイプを含む第二抗体を用いて２つの一般的なタイプに分類される。第一には、本発明の方法は、体液試料を、金属陽イオンを結合して第一抗原−抗体複合体を形成することができる天然ポリペプチドに対して特異的である第一タイプの抗体の有効量と接触させることによって行うことができる。このタイプにおける第一抗体は、カプチャー抗体として機能している。第二タイプの抗体の有効量を第一抗原−抗体複合体に添加して第二抗原−抗体複合体を形成する。第二抗体は、（１）金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体上のエピトープに対して特異的であり、天然ポリペプチドのみと実質的に交差反応しないか、または、（２）金属陽イオンに対して特異的であるか、または、（３）金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体における錯形成金属陽イオンとその配位位置との組合せに対して特異的である。体液試料中の金属陽イオンは、第二抗原−抗体複合体の量を測定することによって検出される。本発明のこの第一の方法は、第一タイプおよび第二タイプの抗体を逆の順序で使用することによって変更することもできる。この変更において、第二抗体は、カプチャー抗体として機能して、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体を捕獲する。第二には、本発明の方法は、体液試料を、前記第二タイプの抗体のサブタイプの１つと接触させることによって行うことができる。この段階の第二抗体は、カプチャー抗体として機能する。次いで、第二タイプの抗体の同一または別のサブタイプを第一抗原−抗体複合体に添加して第二抗原−抗体複合体を形成する。同一のサブタイプを使用すると、複合体は、同一構造の複数のエピトープを含有して複数の抗体結合を可能にするであろう。複合体がかかるエピトープを含有しない場合、第二抗体の異なるサブタイプが使用されるであろう。体液試料中の金属陽イオンは、第二抗原−抗体複合体の量を測定することよって検出される。体液中の金属陽イオンを検出ためのアッセイは、１つのタイプの抗体の使用も含み得る。１つのタイプの抗体は、少なくとも２つの金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドのエピトープに対する特異性を有する。該アッセイのこのバージョンでは、体液試料を、（１）エピトープ、または、（２）錯形成した金属陽イオンと、少なくとも２つの金属陽イオンを結合する金属陽イオン／天然ポリペプチド錯体のその錯形成位置との組合せに対して特異的な第一抗体の有効量と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成する。第一抗体と同一のタイプであるが、必ずしも同一のものであるとは限らない第二抗体の有効量を添加して、第二抗原 −抗体複合体を形成する。該試料中の金属陽イオンは、第二抗原−抗体複合体の量を測定することによって検出される。第一および第二抗体は、同一または異なるエピトープに対して特異的であり得る。別のバージョンでは、体液試料中の金属陽イオンの検出方法は、抗体結合アッセイを酵素アッセイと組み合わせる。この方法では、金属陽イオンを含有する体液試料を、金属陽イオン／酵素錯体のエピトープまたは天然ポリペプチドのエピトープに対して特異的な抗体の有効量と接触させて、抗原−抗体複合体を形成する。次いで、好ましくは、キレーターを用いてストリッピングすることによって、または、別の金属陽イオンで置換することによって、抗原−抗体複合体から金属陽イオンを除去する。酵素活性は、金属陽イオンの除去により、好ましくは、金属陽イオンを酵素の自然補因子などの別の金属陽イオンと置換することによって回復する。該試料中の金属陽イオンは、回復した酵素活性をアッセイすることによって検出される。本発明の別の方法は、動物が金属陽イオンに急性的にまたは慢性的に被曝したかを決定するために提供される。該方法の段階は、第一天然ポリペプチドに結合した金属陽イオンの量を検出すること、１つ以上、好ましくは、２つまたは３つの他の天然ポリペプチドに結合された金属陽イオンの量を検出し、次いで、第一ポリペプチドに結合した抗体の量を、他のポリペプチドのものと比較して、被曝が急性であるかまたは慢性であるかを決定することを含む。好ましい検出方法は、以下に記載する。金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドに対して特異的な抗体（第一タイプの抗体）は、体液試料からの天然ポリペプチドを捕獲するために供することができるか、または、別のバージョンでは、カプチャー抗体が第二タイプの抗体である場合に検出抗体として供することもできる。好ましくは、該抗体は、モノクローナル抗体であり、１種以上の金属陽イオンと錯形成しようとしまいと、天然ポリペプチドを認識し、該天然ポリペプチドに結合する。好ましくは、モノクローナル抗体もまた、約１０分以内に、解離定数約１０^-4〜１０^-13で、体液中の天然ポリペプチドに結合する。最も好ましい抗体は、ＡＬＡＤに対して特異的なモノクローナル抗体である。（１）金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な、または、（２）金属陽イオンに対して特異的な、または、（３）錯形成金属陽イオンと金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体におけるその配位位置との組合せに対して特異的な抗体（第二タイプの抗体）は、体液試料中に存在する金属陽イオンの量を検出せしめるように機能するか、または、別のバージョンでは、カプチャー抗体として供することもある。抗体は、金属陽イオンに部分、または、天然ポリペプチド部分、または、金属陽イオンと金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のポリペプチド金属錯形成位置との組合せに対して特異的であってもよい。抗体が天然ポリペプチド部分に対して特異的である場合、金属陽イオン（例えば、単独で）と錯体を形成しない天然ポリペプチドのエピトープと実質的には交差反応しない。抗体が金属陽イオンに対して特異的である場合、それは、天然ポリペプチドと錯形成しようとしまいと、金属陽イオンを結合する。該抗体が該組合せに対して特異的である場合、それは、金属配位位置で錯体を結合するだけである。好ましい抗体は、金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体である。特に好ましい抗体は、鉛、水銀、カドミウムおよびガリウムなどの有毒な金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体である。該方法は、好ましくは、基質に固定化された抗体の１つおよび検出可能な薬剤で標識された別の抗体を用いて行われる。抗体は、公知の方法によって種々の固体基質に固定化することができる。好適な固体基質としては、棒、カップ、フラットパック（flat pack）または他の固体支持体によって支持されたか、または、これに付着された膜またはコーティングを有する物質が挙げられる。他の固体基質としては、細胞培養プレート、ＥＬＩＳＡプレート、チューブ、および高分子膜が挙げられる。好ましい固体基質は、高分子膜で被覆された棒である。検出可能な薬剤は、第二抗原−抗体複合体を検出せしめるように機能し、フルオロクロム、放射性標識、ビオチンおよび酵素が挙げられる。好ましい検出可能な薬剤は、酵素であり、特に好ましい検出可能な薬剤は、ホースラディッシュペルオキシダーゼである。検出された第二抗原−抗体複合体の量は、好ましくは、体液試料中に存在する金属陽イオンの量に比例する。体液試料中に存在する金属陽イオンの量は、試料中の検出された第二抗原−抗体複合体の量を金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の標準量について検出された量と相互に関連させることによって測定することができる。金属陽イオンを結合する同量の精製天然ポリペプチドの標準溶液を０ .５μg／dl〜５０μg／dlの範囲の異なる濃度の金属陽イオンと混合する。得られた標準曲線を使用して、試料中の金属陽イオンの量を定量化することができる。別法としては、標準溶液を使用して、抗体の解離定数を測定することができる。本発明は、体液試料中の金属陽イオンを検出するための、２つのタイプの抗体または１種以上の第二タイプの抗体のいずれかを含有する好ましいキットを提供するものでもある。該キットは、好ましくは、第一タイプの抗体および第二タイプの抗体を含有する。別法としては、該キットは、共に少なくとも２つの金属陽イオンを結合する金属陽イオン／天然ポリペプチドのエピトープに対して特異的である第一抗体および第二抗体を含有することもできる。キットは、金属陽イオンを結合する天然酵素に対して特異的な抗体または金属陽イオン酵素錯体に対して特異的な抗体および酵素活性測定用基質を含有することもできる。キット中の抗体の１つは、好ましくは、固定化され、別の抗体は、検出可能な薬剤で標識化される。検出可能な薬剤が酵素である場合、検出可能な薬剤を検出するための手段が該キットに供給される。好ましい検出可能な薬剤の検出手段は、酵素との接触により色を変える酵素基質である。該キットは、所望により、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の標準量および／または金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の標準量に対応する着色生成物の量の視覚表現によるチャートを含んでもよく、および／または、分光光度測定により定量化することができる。キットは、動物の、金属陽イオン、特に有毒金属陽イオンによる汚染を測定するための迅速な診断および／またはスクリーニング法を提供する。該キットは、本明細書に記載するように、それらは、金属イオン汚染について多量の体液試料を測定するための簡単かつ安価な方法を提供するので、特に優れている。該キットは、本明細書に記載するように、該キットが、定量的もしくは定性的に、または、現場もしくは研究室での使用のために設計され得るという点で非常に用途の広いものでもある。図面の詳細な説明第１図は、ｍＡｂ４Ａ１０およびｍＡｂ１Ｆ１０の、可溶性塩化水銀による固定化ＢＳＡ−グルタチオン−ＨgＣlへの結合の阻害を示す。第２図は、ＥＬＩＳＡによるＥＰＡ品質管理試料中の水銀の検出を示す。第３図は、ＥＬＩＳＡおよび原子吸光度による水銀検出の比較を示す。第４図は、ｍＡｂ１Ｃ３およびｍＡｂ１４Ｆ１１の、可溶性酢酸鉛によって固定化ＢＳＡ−グルタチオンＰｂ⁺²への結合の阻害を示す。第５図は、金属汚染された赤血球溶解物のウエスターンブロットを示す。金属含有タンパクは、鉛陽イオンに対して特異的な抗体を用いて検出した。ヘモグロビンは、矢印で示した。レーン１は、分子量標準を示す；レーン２：鉛の減損した赤血球溶解物；レーン３：鉛５５μg／dlを有する赤血球溶解物；レーン４：鉛２０μg／dlを有する赤血球溶解物；レーン５：鉛５μg／dlを有する赤血球溶解物。発明の詳細な説明本発明において提供される方法およびキットは、体液試料中の金属陽イオンを検出せしめる。好ましい方法およびキットは、異なる特異性を有する少なくとも２つの抗体の使用、すなわち、２つのタイプの抗体からの選択を含む。１つのタイプの抗体は、体液中に存在する金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドに対して特異的である。別のタイプの抗体は、異なる特異性を有する３つのサブタイプからなる。第一サブタイプは、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体上のエピトープに対して特異的である。第二サブタイプは、金属陽イオンに対して特異的である。第三サブタイプは、錯形成金属陽イオンと金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体におけるその錯形成位置との組合せに対して特異的である。金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体に対して特異的な抗体は、錯体の金属陽イオン部分または天然ポリペプチド部分のいずれに対して特異的であってもよい。これらの２つの抗体は、体液中に存在する天然ポリペプチドに結合した金属陽イオンの量を測定することによって、体液中の金属陽イオンを検出せしめる好ましい方法において組み合わされる。Ａ．金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対する抗体金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対する特異性を有する抗体は、本発明の方法およびキットにおいて有用である。好ましくは、該抗体は、哺乳動物ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体であり、より好ましくは、該抗体は、モノクローナル抗体である。天然ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は、好ましくは、約１０^-5〜１０^-10の解離定数を有する。解離定数は、フリゲット（Friguet）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J ．Immunol.Methods ）、７７：３０５（１９８５）の方法によって開示されているように、平衡混合物中にある全ての生成物の濃度の増幅産生物に対する全ての反応物の濃度の増幅産生物の比である。動物において見られる多くの天然ポリペプチドは、１種以上の金属陽イオンを結合する能力を有する。これらの天然ポリペプチドは、金属タンパクとしても知られている。金属陽イオンは、典型的には、天然ポリペプチドの活性のために必須の補因子として供される。該天然ポリペプチドは、血液などの体液中の金属陽イオンの存在および量のインジケーターとして機能することができる。いくつかの金属陽イオンの場合、天然ポリペプチドは、血清の液体部分から金属陽イオンを濃縮するのに役立つことができる。さらに、いくつかの金属陽イオンのポリペプチドへの結合は、該ポリペプチドの機能を不活化することができる。不活性天然タンパクは、金属陽イオンによる被爆に関連した病因に寄与し、動物の臨床状態の指示として役立つこともできる。天然ポリペプチドは、動物によって形成されるものであり、通常、体液中で検出されるのに充分な濃度で存在する。天然ポリペプチドは、少なくとも１種類、好ましくは、１種類以上の金属陽イオンを結合して金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体を形成する能力がある。天然ポリペプチドは、通常、異なる金属陽イオンに結合させることによって置換することができる金属陽イオン補因子を含有することができる。例えば、天然ポリペプチドは、天然補因子としてＺn⁺²陽イオンを有することができるが、Ｚn⁺²陽イオンを置換する鉛、水銀およびカドミウム陽イオンに結合することもできる。天然補因子金属陽イオンの、別の金属陽イオンとの置換は、ポリペプチドの機能を不活化せしめることができる。例えば、ＡＬＡＤ中のＺn⁺²のＰb⁺²による置換の結果、ＡＬＡＤ酵素活性が不活化する。好ましくは、天然ポリペプチドは、体液試料中の金属陽イオンの量に比例する量の金属陽イオンを結合することができる。天然ポリペプチドは、該ポリペプチドが緩衝溶液で数回洗浄される場合でさえ、金属陽イオンがポリペプチドによって保持されるように充分な強度で金属陽イオンを配位結合させるか、または結合する。好ましくは、天然ポリペプチドおよび金属陽イオンは、配位結合を形成した。天然ポリペプチドは、好ましくは、約１０^-5〜１０^-10の解離定数で、金属陽イオンと結合または配位結合する。天然ポリペプチドによって結合または配位結合される金属陽イオンとしては、アルカリ金属、遷移金属、すなわち、ｄ"軌道に最外電子を有する周期表中のこれらの元素、IIIａ族金属／メタロイド（Ｂ、Ａl、Ｇa、ＩnおよびＴl）、IVａ族金属／メタロイド（Ｓi、Ｇe、ＳおよびＰb）、Ｖａ族金属／メタロイド（Ａs 、ＳbおよびＢi）の陽イオンが挙げられる。金属陽イオンは、一価であっても多価であってもよいが、好ましくは、二価であり、別の有機部分、例えば、メチル水銀に結合することもできる。より好ましくは、金属陽イオンは、ハンドブック・オン・ザ・トキシコロジー・オブ・メタルズ（Handbook on the Toxicology of Metals ）、第２版、フライバーグ（Friberg）、ノードバーグ（Nordberg）、ボウク（Vouk）、エルセバイヤー（Elsevier）、アムステイダム（Amsterdam）編（１９８６）に開示されているように、ヒトおよび他の動物への毒性効果を有することが知られている有毒な金属陽イオンである。有毒な金属陽イオンとしては、限定されないが、鉛、水銀、カドミウム、銅、メチル水銀を含む、スルフヒドリル含有ポリペプチドに結合するものならびにスルフヒドリル基を結合しないものが挙げられる。天然ポリペプチドは、好ましくは、鉛、水銀、メチル水銀、カドミウムおよび／またはガリウム陽イオンとの結合能または配位結合能を有する。金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドの好適な例としては、α−アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヘモグロビン［バルトロップ（Baltrop ）ら、イクスペリエンティア（Experientia）、２８：７６（１９７２）］、ヘムシンターゼ［エリクソン（Erikson）、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド・ラボラトリー・インベスティゲイション（Scan.J.Clinc .Lab.Investigations ）、４：５５−６２（１９５２）］、コプロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ［ゴールドバーグ（Goldberg）ら、ブラッド（Blood ）、１１：８２１（１９５６）］、ＡＬＡ−シンセターゼ［ドルッセル（Drusse l）ら、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.J.）、６３：７２（１９５６）］、ヒト血清アルブミン、グルタチオン、ピリミジン５'ヌクレオチダーゼ、プロテインキナーゼＣ、およびメタロチオネイン［エム・カリン（M.Karin）、セル（Cell）、４１：９（１９８５）］が挙げられる。金属陽イオンを結合する好ましい天然ポリペプチドは、α−アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）である。金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドは、ヒト、ウシ、魚類および他の脊椎動物を含む動物種から単離することができる。天然ポリペプチドは、単離され、精製され、免疫原として使用されて、抗体を形成する。体液からの金属陽イオンを結合するポリペプチドについての精製方法は、硫酸アンモニウム沈殿法、ならびに、イオン交換、親和性およびＨＰＬＣクロマトグラフィー法などのクロマトグラフィー法を含む標準的な方法である。金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドは、免疫原として使用されて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を形成する。免疫原は、単一のポリペプチド、または、赤血球溶解物もしくは血清中に見られるような複数のポリペプチドを含有する。免疫原は、１つ以上ま金属陽イオンと錯形成された天然ポリペプチドであってもよい。典型的には、天然ポリペプチドが単離されるものとは別の種である動物を精製ポリペプチドで免疫化する。該免疫原は、非経口投与され、しばしば、アジュバント中で皮下または腹腔内投与される。該免疫原の投与は、周期的に、好ましくは、少なくとも４回の注射の間、反復される。免疫化を反復した後、動物からポリクローナル血清を収穫することができる。モノクローナル抗体の調製は、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）、ハーロウ・アンド・レーン（Harlo w & Lane）；コールド・スプリング・ハーバー（１９８８）に開示されているように、標準的な技術によって行われる。すなわち、前記のように免疫原で免疫化された動物から脾臓を収穫する。脾臓を分離し、ポリエチレングリコールを使用して不死化骨髄腫細胞と融合される。該融合ハイブリドーマ細胞を選択し、イン・ビトロで培養する。ハイブリドーマ細胞培養液を、ある特異性を有するハイブリドーマ抗体の存在について試験する。適切な第一タイプのモノクローナル抗体を同定するための選択技術は、本発明により望まれる免疫特異性を測定するための重要な態様である。ハイブリドーマ細胞培養液を、標準的な方法によって行われるＥＬＩＳＡを用いて天然ポリペプチドに対して特異的な抗体の存在について試験する。別のスクリーニング法を使用して、所望の特異性を有するモノクローナル抗体をさらに選択してもよい。これらのスクリーニング法の１種以上を使用して、固有の特異性を有するモノクローナル抗体を選択することができる。これらのさらなるスクリーニング法としては、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の一部である場合、天然ポリペプチドに結合することもできるモノクローナル抗体についてのスクリーニングが挙げられる。別の好ましいモノクローナル抗体は、１つ以上の金属陽イオンと錯形成していてもいなくても、天然ポリペプチドを認識して結合する。さらに、ハイブリドーマ細胞培養液を、天然ポリペプチドの生物活性形について特異的であるモノクローナル抗体について選択することもできる。別に所望により、金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を、数種類の動物種からの天然ポリペプチドに対する特異性についてスクリーニングすることができる。天然ポリペプチドの生物活性形に対して特異的なモノクローナル抗体についての選択は、モノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ細胞培養液を、抗原− 抗体複合体を形成するための天然ポリペプチドと接触させ、該抗原−抗体複合体を分離し、次いで、機能的活性について該抗原−抗体複合体をアッセイすることによって行うことができる。例えば、天然ポリペプチドが酵素である場合、該抗原−抗体複合体は、酵素活性についてアッセイすることができる。好適なモノクローナル抗体は、ＡＬＡＤ、ヘモグロビン、グルタチオン、ヒト血清アルブミンおよびメタロチオネインに対して特異的なものである。好ましいモノクローナル抗体は、ＡＬＡＤに対して特異的である。好適なポリクローナル抗体は、ヒト血清に対するものである。これらの抗体のうちには市販されているものもある。好ましいバージョンでは、天然ポリペプチドＡＬＡＤに対するモノクローナル抗体が形成される。ＡＬＡＤは、天然金属陽イオン補因子としてＺn⁺²陽イオンを結合することが知られている酵素であるが、しかしながら、該酵素は、鉛、水銀、カドミウムまたは銅と結合または配位結合することも知られてる。バド・アンド・ロウェリィズ（Bernard & Lauwerys）、アナルズ・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ann.NY.Acad.Sci.）、５１：４１−４７（１９８７）。フジタ（Fujita）ら、ビオシミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（Bi ochem.Biophys.Acta）、６７８：３９−５０（１９８１）の方法によって開示されているとおり、硫酸アンモニウム沈殿法および加熱処理、次いで、ＤＥＡＥおよびウルトラゲルＡＣＡ３４クロマトグラフィー法を使用して、ウシＡＬＡＤを赤血球溶解物から精製する。精製されたウシ肝ＡＬＡＤの有効量をアジュバントと一緒にマウスに注射する。この時点でマウスからポリクローナル血清を収穫することができ、ＥＬＩＳＡによって、ＡＬＡＤ特異的抗体の存在がモニターされる。脾臓を融合させて、ハイブリドーマ細胞系を形成する。ＡＬＡＤに対して特異的なモノクローナル抗体は、鉛と錯形成していてもいなくても、選択される。さらに、ツコモト（Tsukomoto）ら［ビオシミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（Biochem.Biophys.ＡＣＴＡ）、５７０：１６７−１７８（１９７９）の方法によってＡＬＡＤ酵素活性についてＡＬＡＤモノクローナル抗体をアッセイすることによってＡＬＡＤの生物活性形に対する特異性についてモノクローナル抗体を選択する。ウシＡＬＡＤに対して特異的な好ましいモノクローナル抗体は、また、ヒトＡＬＡＤを認識し結合する。本発明は、体液中に存在する金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドを同定するための方法を提供するものでもある。該方法は、金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体を用いるウエスターンブロットアッセイを使用することを含む。動物からの体液試料は、体液中のいずれの細胞も溶解するように処理される。次いで、体液の試料は、種々の濃度の金属陽イオン、好ましくは、０.５μg／dl〜５０μg／dlの濃度の範囲の金属陽イオンと一緒にインキュベートされるか、または、金属陽イオンの量を変化させつつ実験的に投与された動物から得ることかできる。次いで、金属陽イオン処理試料を電気泳動に付す。電気泳動によって分離されたタンパクをニトロセルロース膜に移動させる。次いで、ニトロセルロース膜上の分離されたタンパクを、検出可能な薬剤で標識化された、初期溶液に添加された金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。検出可能な薬剤を検出することによって、金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体に結合している分離されたタンパクを同定する。金属陽イオンを結合したポリペプチドを分子量によって同定し、並行して電気泳動ゲルランから溶離することができる。金属陽イオンを結合するポリペプチドを、該ポリペプチドを同定せしめるために金属陽イオンを結合する公知のポリペプチドのパネルとの比較によって同定することができる。比較方法としては、ウエスターンブロット、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、他のクロマトグラフィーを挙げることができる。金属陽イオンに結合すると同定された新規ポリペプチドは、さらに、アミノ酸分析および酵素活性のための標準的な方法によって特徴付けられる。該方法は、金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドを同定および特徴付けせしめ、非常に低濃度で存在する金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドを同定せしめる。Ｂ．金属陽イオンの存在を検出することができる抗体第二タイプの抗体は、本発明の方法およびキットにおいて有用である。該抗体は、好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの哺乳動物抗体であり、より好ましくは、モノクローナル抗体である。このタイプの抗体の１つのバージョンは、金属陽イオン部分として、または、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体としてのエピトープについて特異的である。金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体上のエピトープは、（１）金属陽イオンまたは（２）ペプチドエピトープまたは（３）天然ポリペプチドが金属陽イオンと錯形成する場合にのみ認識される金属陽イオン−天然ペプチド配位エピトープであってもよい。該抗体は、天然ポリペプチドに結合してもしなくても金属陽イオンに対して特異的であり得る。好ましいモノクローナル抗体は、金属陽イオンに対して特異的であり、より好ましくは、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の金属陽イオン部分に結合するかまたは該部分を認識する。モノクローナル抗体は、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体上にのみ見られるエピトープに対して特異的である。すなわち、モノクローナル抗体は、金属陽イオンと錯形成しない天然ポリペプチド（すなわち、単独）と実質的には交差反応しない。金属陽イオンまたは金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体に対して特異的なモノクローナル抗体は、好ましくは、他の金属陽イオンまたは他の金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体と実質的には交差反応しない。モノクローナル抗体は、実質的には、標準的なＥＬＩＳＡ反応でバックグラウンドレベルを超える抗原と有意に反応しない場合に他の抗原と非交差反応的である。好ましくは、非交差反応抗原は、１０^-4以下の解離定数で抗体に結合する。本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは約１０^-4〜１０^-13、好ましくは約１０^-7〜１０^-11の解離定数を有する。金属陽イオンまたは金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体に対するモノクローナル抗体を使用して、体液試料中に存在する金属陽イオンの量を検出することができるか、または、カプチャー抗体として使用して、体液試料から金属陽イオン含有天然ポリペプチドを除去することができる。好ましいモノクローナル抗体は、１μg／dl（１０ppb）程度の低い濃度の金属陽イオンを有する体液試料中の金属陽イオンを検出する能力を有する。金属陽イオンとしては、アルカリ土類金属、遷移金属、すなわち、ｄ"軌道に最外電子を有する周期表中のこれらの元素、IIIａ族金属／メタロイド（Ｂ、Ａl 、Ｇa、ＩnおよびＴl）、IVａ族金属／メタロイド（Ｓi、Ｇe、ＳおよびＰb）、Ｖa族金属／メタロイド（Ａs、ＳbおよびＢi）の陽イオンが挙げられる。金属陽イオンは、一価であっても多価であってもよいが、好ましくは、二価であり、別の有機部分、例えば、メチル水銀に結合することもできる。より好ましくは、金属陽イオンは、ハンドブック・オン・ザ・トキシコロジー・オブ・メタルズ（前出の文献）に開示されているように、ヒトおよび他の動物に有害であることが知られている有毒な金属陽イオンである。典型的には、有毒な金属陽イオンとしては、鉛、水銀、カドミウム、銅およびメチル水銀を含む、スルフヒドリル含有ポリペプチドに結合するものである。好ましい金属陽イオンは、鉛、水銀、カドミウムおよびガリウムである。金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体の好適な例としては、水銀に対して特異的なモノクローナル抗体４Ａ１０が挙げられる。このモノクローナル抗体は、ＨgＣl₂について２.３×１０^-9Ｍの解離定数を有する。このモノクローナル抗体は、実質的には、塩化バリウム、塩化カドミウム、塩化クロム、塩化銅、硫酸第二鉄、塩化金、塩化ニッケル、酸化セレニウム、塩化銀および塩化亜鉛と交差反応しない。鉛に対するモノクロール抗体もまた、生じた。好ましいモノクローナル抗体は、Ｐbに対して特異的であるが、他の同様に構築された金属イオンとは交差反応しなかった。鉛および水銀陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体は、１９９０年３月１３日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Cu lture Collection）（ＡＴＣＣ）に寄託された。モノクローナル抗体ＢＮＮｏ．４Ａ１０Ｂ４、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０３８１は、約１０^-9未満の水銀陽イオンに対する解離定数を有するが、カドミウム、銅、亜鉛、鉛、ニッケルおよびコバルト陽イオンを測定できる程度には結合しない。本発明の抗体は、ＡＬＡＤと錯形成されるＰbなどの陽イオン天然ポリペプチド錯体のエピトープに結合することもできる。好ましくは、該抗体は、実質的には、ＡＬＡＤと錯形成されたＺnなどの他の金属陽イオン天然ポリペプチド錯体と交差反応しない。所望により、該抗体は、非錯形成金属陽イオンに結合する能力も有する。この抗体は、実質的には、Ｐbを有しないＡＬＡＤなどの金属陽イオンと錯形成していない天然ポリペプチドと非交差反応性である。金属陽イオンと錯形成された天然ポリペプチドは、金属陽イオン酵素錯体を認識することができる。好ましいモノクローナル抗体は、ＡＬＡＤと錯形成された鉛に対して特異的なモノクローナル抗体である。鉛−ＡＬＡＤに対する特異性を有し、１４Ｆ１１と称される抗体は、１９９３年４月１６日にメリーランド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号ＨＢ１１３３０が付与された。金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体は、金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドを金属陽イオンと一緒にインキュベートすることによって形成することができるか、イン・ビボで動物を金属陽イオンに被曝させることによって形成することができる。金属陽イオンを結合することが知られている天然ポリペプチドは、該動物から単離され、精製され得るか、または、金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドは、本発明の方法によって同定され得る。天然ポリペプチドは、天然金属陽イオン補因子を有することができ、天然金属陽イオン補因子を置換する別の金属陽イオンに結合することができる。天然ポリペプチドは、錯体が数回の洗浄に耐えるのに充分な強度を有する金属陽イオンに結合する。好ましくは、天然ポリペプチドは、１０^-4〜１０^-13の解離定数を有する金属陽イオンに結合するか、または、該金属陽イオンと配位結合する。金属陽イオンに結合する天然ポリペプチドの好適な例としては、δ−アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヘモグロビン、ヘムシンセターゼ、コプロポルフィリンゲン、デカルボキシラーゼ、ＡＬＡシンセターゼ、ヒト血清アルブミン、グルタチオン、ピリミジン５'ヌクレオチダーゼ、プロテインキナーゼＣ、およびメタロチオネインが挙げられる。好ましい金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体は、鉛−ＡＬＡＤである。裸または非錯形成金属陽イオンとの免疫反応性を有するモノクローナル抗体を形成するためのストラテジーは、１９８９年３月１４日に出願されたコペンディング出願Ｕ.Ｓ.出願番号第３２４,３９２号に開示されているものである。金属陽イオンに対するモノクローナル抗体は、免疫系の細胞と反応するのに利用可能であるように、金属陽イオンを、実質的に被曝した状態のままにさせるという特徴を有する免疫原に応じて形成される。金属陽イオンに対するモノクローナル抗体の特異的な免疫原性の発生のための免疫原化合物は、ハプテン−担体概念に基づいている。本発明においては、ハプテンは、担体に共有結合されたスペーサーアームの末端で配位結合される。該スペーサーアームは、半硬質であるように、および、担体に対して被曝位置で金属陽イオンを保持するように適合させられる。この配置は、実質的な被曝状態で金属陽イオンを維持するようにも適合させられる。これらの因子は、実質的に、スペーサーおよび／または担体による金属陽イオンのキレート化、非転換、または、混入を回避するように結合する。前記のように特徴付けられたスペーサーアームは、オリゴペプチド、脂肪族化合物、または脂肪族フラグメントである。後者の２つの場合、脂肪族化合物またはフラグメントは、アルデヒド基とのシッフ塩基反応；カルボジイミド、酸塩化物などのペプチド活性化因子を使用するアミノまたはカルボン酸基とのアミド反応；およびショッテン−バウマン（Shotten-Bauman）反応または酸性触媒反応を使用するヒドロキシルまたはカルボン酸基とのエステル反応；スルフィド結合剤を使用するスルフィド反応またはタンパクに有機分子を結合させるための他の公知のカップリング反応によって担体に共有結合される。例えば、イー・エイ・カバット（E.A.Kabat）、ストラクチュラル・コンセプツ・イン・ニムノロジー・アンド・イケノケミストリー（Structural Concepts in Immunology and Im munochemistry ）、第２版、ホルト，ライナー・アンド・ウィンストン（Holt，R heiner & Winston）ニューヨーク（１９７６）（かかる方法のリビューテキスト）；およびジェイム・エイツァガイアー（Jaime Eyzaguirre）、ケミカル・モディフィケーション・オブ・エンザイムズ：アクティブ・サイト・スタディーズ（Chemical Modification of Enzymes：Active Site Studies ）、イギリス国ウエストサセックス、チチェスター、ハルステッド・プレス（Halsted Press）（１９８７）を参照。オリゴペプチド、脂肪族化合物またはフラグメントは、スペーサーアームに半硬質性を与える骨格基を含有するであろう。この半硬質性を発現させるための好ましい基としては、ペプチド結合、オレフィン結合、オレフィンコンジュゲート系、エステル基およびエノン基が挙げられる。所望により、１個以上の芳香環をスペーサーアーム中に取り込んで、免疫応答の発現を刺激することもできる。一般に、オリゴペプチドスペーサーアームは、下記式： −Ｘ−(Ｒ)−Ｙ［式中、Ｘは、担体に結合する結合基であり、Ｒは、１個以上のアミノ酸残基であり、Ｙは、金属陽イオン配位のためのルイス酸または塩基の基である］で示される。一般に、脂肪族化合物またはフラグメントスペーサーアームは、下記式： −Ｘ(Ｑ)−Ｚ［式中、Ｘは、担体に結合する結合基であり、Ｑは、エステルアミドケト、オリフィンまたは芳香族基などを含有する半硬質性脂肪族部分であり、Ｚは、金属陽イオン配位結合のためのルイス酸または塩基の基である］で示される。好ましくは、オリゴペプチドまたは脂肪族化合物は、金属陽イオンのためのスペーサーアームとして使用される。この場合、ペンダントルイス塩基の基は、好ましくは、スペーサーアームに、および、担体から遠隔に位置する。これらのルイス塩基の基は、金属陽イオンについての配位位置として機能する。ルイス塩基の基および金属陽イオンの電子殻の形状の異常さは、ほぼ同様であるのが好ましい。したがって、硫黄の基は、金属陽イオンが遷移金属または不活性遷移元素である場合、ルイス塩基の基として作用することができる。窒素含有基は、好ましくは、アルミニウム、リチウム、ホウ素、ストロンチウム、およびマグネシウムが金属陽イオンである場合、ルイス塩基の基として使用される。担体分子は、典型的には、担体スペーサーアーム金属陽イオン錯体を濃縮するように機能することができる高分子タンパクである。好適な担体分子としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの酵素的に活性ではないタンパクが挙げられる。形成されると、担体スペーサーアームは、金属陽イオンと一緒にインキュベートして、免疫原を形成する。免疫原は、アジュバントと一緒に動物に非経口、しばしば、皮下または腹腔内投与される。免疫原の投与は、少なくとも４回は繰り返される。免疫化を繰り返した後、ポリクローナル血清を収穫することができる。モノクローナル抗体は、前記のように標準的な方法によって形成される。すなわち、免疫化動物からの脾臓を収穫し、脾臓細胞を分離する。脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。ハイブリドーマ細胞を選択し、イン・ビボでインキュベートする。ハイブリドーマ細胞培養培地中の金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体の存在は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされる。ハイブリドーマ分泌モノクローナル抗体を金属陽イオンに対する特異性について選択する。モノクローナル抗体は、１つ以上の選択技術によって選択することができる。１つの選択技術は、モノクローナル抗体の金属陽イオンと免疫反応するが担体スペーサーアームコンジュゲートとは実質的に交差反応しない能力について選択する。該モノクローナル抗体は、他の金属陽イオンと実質的には交差反応しないように選択されてもよい。モノクローナル抗体は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて有意にバックグラウンドレベル以上の抗原と反応しない場合、実質的には、抗体と交差反応性ではない。好ましくは、該モノクローナル抗体は、非交差反応性抗原に１０^-4以下の解離定数で結合する。該モノクローナル抗体は、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の金属陽イオン部分に結合するように選択されてもよい。好ましいモノクローナル抗体は、金属陽イオンに対して特異的であるが、担体スペーサーアームまたは他の金属陽イオンと実質的には交差反応せず、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の金属陽イオン部分に結合する。好ましい適用は、水銀陽イオンまたは他の有毒な重金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体の製造を予期する。重金属陽イオンは、前記免疫原化合物に化合され、水性媒質中に懸濁させられる。この場合の免疫原化合物に対する好ましいタンパク担体は、キーホールリンペットヘモシアニンである。この場合の好ましいスペーサーアームは、重金属陽イオンと配位結合する能力を有するスルフヒドリル基を有するオリゴペプチドである。グルタチオンは、該スペーサーアームとして特に好ましい。免疫原化合物の懸濁液は、前記に概略記載した技術に従って、マウスなどの宿主動物を免疫化するために使用される。ＢＡＬＢ／ｃと称されるマウスの実験株が特に好ましい。免疫化宿主脾臓の抗体産生性細胞を回収し、懸濁液にする。これらの脾臓細胞を不死化細胞と融合する。好ましくは、免疫化宿主と同一の動物主の骨髄腫細胞は、融合相手として使用される。典型的には、ポリエチレングリコールなどの細胞融合プロモーターを使用して、ハイブリドーマ細胞を形成させる。該ハイブリドーマ細胞を希釈し、非融合細胞を増殖させない培地中で培養する。ハイブリドーマによって産生および分泌されたモノクローナル抗体は、その後、免疫化に使用される重金属陽イオンと特異的に結合する能力についてアッセイされる。それらは、さらに、担体および担体スペーサーアームとの交差反応性の欠如についてアッセイされる。これに関連して好ましいアッセイ方法は、エンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイである。得られたモノクローナル抗体は、有毒重金属陽イオンに対して特異的であり、スペーサーアームの存在下における重金属陽イオン、スペーサーアーム担体組成物および他の同様に構築された陽イオンに対する強い解離定数を示す。好ましいモノクローナル抗体は、水銀、鉛、カドミウム、ストロンチウム、ニッケル、コバルト、金、またはヒ素の陽イオンと選択に免疫反応性である。金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体に対して特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、前記のような、金属陽イオンと錯形成された天然ポリペプチドで動物を免疫化することによって形成することができる。形成および選択された抗体は、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の金属陽イオン部分または金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の天然ポリペプチド部分のペプチドエピトープに対して特異的であり得る。該錯体の天然ポリペプチド部分のエンザイム− リンクドイムノソルベントアッセイに対して特異的なモノクローナル抗体は、実質的に、金属陽イオンと錯形成されない天然ポリペプチドのエピトープと交差反応しない。好ましいモノクローナル抗体は、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体にはあり、別の金属陽イオンと錯形成された天然ポリペプチドにはないエピトープに対する特異性について選択される。該モノクローナル抗体は、さらに、他の金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体と実質的に交差反応しないように選択される。特に好ましいモノクローナル抗体は、鉛−ＡＬＡＤ錯体に対して特異的であり、実質的にはＡＬＡＤとは交差反応しないモノクローナル抗体である。Ｃ．体液中の金属陽イオンの検出方法本発明は、２種類の抗体を使用する体液試料中の金属陽イオンを検出するための好ましい方法を提供する。該方法は、第一抗原−抗体錯体を形成するための金属陽イオンを含有する懸濁化された体液試料と第一のタイプのカプチャー抗体の有効量とを接触させることを含む。この工程は、体液からの金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドを捕獲するように機能する。次いで、第一抗原−抗体複合体に第二のタイプの抗体の有効量を添加して、第二抗原−抗体複合体を形成する。この抗体は、前記の３つの特異的なサブタイプのいずれであってもよい。該抗体は、スペーサーアーム−担体コンジュゲート免疫原に結合される金属陽イオンに応じて形成されるエピトープに対して特異的であってもよい。第二抗原−抗体複合体は、第一のタイプの抗体、天然ポリペプチド、金属陽イオンおよび第二のタイプの抗体を含む。体液試料中の金属陽イオンの量は、第二抗原−抗体複合体の量を検出することによって測定される。第二抗原−抗体複合体の量は、好ましくは、試料中の金属陽イオンの量に比例する。金属陽イオンを含有する懸濁化された体液試料は、動物種から得られる。全ての動物種は、金属陽イオン、特に、有毒な金属陽イオンを含有することができる。好適な体液は、金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドを含有することがあるいずれの体液も含む。好ましい体液は、動物から容易に得ることができるものであり、血液、尿、唾液、および脳脊髄液が挙げられる。好ましくは、体液試料は、体液中に存在する細胞を溶解するための溶解剤で処理される。体液試料中の細胞は、金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドを含有することもできる。好適な溶解剤としては、トゥイーン（Tween）８０、ノニデット（Nonidet）ｐ４０、トリトン（Triton）Ｘ−１００などの界面活性剤が挙げられる。第一のタイプの抗体は、体液試料中の天然ポリペプチドに選択的に結合して、試料中の存在する他のタンパクおよびポリペプチドから天然ポリペプチドを単離する。該抗体は、１種類以上の金属陽イオンと錯形成してもしなくても、天然ポリペプチドを結合するのが好ましい。赤血球タンパクまたは血清タンパクに対するポリクローナル抗血清は、金属陽イオンを結合する全てのポリペプチドを実質的に有効に捕獲するために使用することができ、体液の金属陽イオン汚染の選択的検出について与える。好ましくは、該抗体は、モノクローナル抗体であり、より好ましくは、多くの動物種からの天然ポリペプチドによって共有されるエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体である。特に好ましいモノクローナル抗体は、ＡＬＡＤに対して特異的である。該抗体の有効量は、体液試料からの天然ポリペプチドの全てを実質的に結合するのに充分である抗体の量である。該抗体の有効量は、標準的な方法によって体液試料中の全タンパクレベルを測定することによって測定することができる。第二タイプの抗体を第一抗原−抗体複合体に添加し、試料中に存在する金属陽イオンの量を測定する。該抗体は、金属−天然ポリペプチド錯体の、金属陽イオン部分に対してまたは天然ポリペプチド部分に対してまたは金属陽イオンと配位結合ポリペプチド部分との組合せに対して特異的である。該抗体は、天然ポリペプチドと錯体を形成しない金属陽イオンに対して特異的であってもよい。該抗体が金属−天然ポリペプチド錯体の天然ポリペプチド部分または組合せに対して特異的である場合、金属陽イオンと錯形成しない（すなわち、単独の）天然ポリペプチドと実質的には交差反応しない。好ましい抗体は、金属陽イオンに対するモノクローナル抗体である。特に好ましい抗体は、鉛、カドミウム、水銀、およびガリウムなどの有毒な金属陽イオンに対するモノクローナル抗体である。金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体の有効量は、第一抗原−抗体複合体の全てを実質的に結合するのに充分な量である。本発明の好ましい方法は、逆の順序で行われてもよい。まず、天然ポリペプチドに結合される金属陽イオンを含有する体液試料を第二のタイプのカプチャー抗体と接触させて、第一抗原−抗体錯体を形成することができる。例えば、鉛に対して特異的なモノクローナル抗体を使用して、体液試料中の鉛および天然ポリペプチドと錯形成した鉛に結合させることができる。次いで、第一のタイプの抗体を添加して、第二抗原−抗体複合体を形成することができる。体液試料中の金属陽イオンの量は、第二抗原−抗体複合体の量を検出することによって測定される。第二抗原−抗体錯体の量は、好ましくは、体液試料中に存在する金属陽イオンの量に比例する。本発明の好ましい方法は、カプチャーおよび検出抗体の両方として第二のタイプの抗体の使用を介して行うこともできる。同一構造の複数のエピトープが金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体に出現する場合、第二抗体の同一のサブタイプを２回使用することもできる。出現しない場合は、異なるサブタイプが使用されるであろう。カプチャーおよび検出方法は、本発明の方法の前記バージョンについての記載に従って行われる。最初に体液試料を接触させるために使用される抗体は、固体基質に固定化するのが好ましい。該抗体は、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（前出の文献）に開示されているように、種々の方法によって固体基質に固定化することができる。好適な固体基質としては、棒、合成ガラス、アガロースビーズ、カップ、フラットパック、または他の固体支持体によって支持されるか、または、これらに結合される膜またはコーティングを有する物質が挙げられる。他の固体基質としては、細胞培養プレート、ＥＬＩＳＡプレート、チューブ、および高分子膜が挙げられる。好ましい固体基質は、高分子膜で被覆された棒である。第二抗原−抗体複合体を形成するために第一抗原−抗体複合体に添加される抗体は、好ましくは、第二抗原−抗体複合体を容易に検出することができるように検出可能な薬剤で標識化される。該抗体は、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル、第３１９頁〜第３５８頁（前出の文献）に開示されているように、標準的な方法によって検出可能な薬剤で標識化することができる。検出可能な薬剤による抗体の標識化方法は、検出可能な薬剤のタイプに依存し、抗体の標識化が抗体の抗原結合能を妨害しないように行われる。好適な検出可能な薬剤としては、酵素、放射性標識、フルオロクロム、およびビオチンが挙げられる。好ましい検出可能な薬剤は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシターゼなどの酵素である。第二抗原−抗体複合体を検出ための手段は、抗体に結合した検出可能な薬剤に依存する。検出可能な薬剤がＩ¹²⁵またはＳ³⁵などの放射性標識である場合、第二抗原−抗体複合体は、シンチレーションカウンターで放射性壊変を測定することによって検出される。検出可能な薬剤がフルオロクロムである場合、第二抗原 −抗体複合体は、分光光学的に蛍光エネルギー放出を測定することによって検出される。検出可能な薬剤が酵素である場合、第二抗原−抗体複合体は、基質の酵素的転換によって検出される。好ましいバージョンでは、検出可能な薬剤は、酵素であり、該検出可能な薬剤の検出方法は、該酵素に対する基質である。該基質は、好ましくは、酵素活性の結果として色が変化する化合物である。充分な量の基質を添加して、転換された基質の量が試料中に存在する第二抗原−抗体複合体の量に比例することを確実にする。液体試料中に存在する金属陽イオンは、第二抗原−抗体複合体の量を測定し、第二抗原−抗体複合体の量を既知の濃度の金属陽イオンと相互に関係させる標準曲線とそれを比較することによって検出することができる。前記のようなイムノアッセイは、精製され、約０.５μg／dl未満〜５０μg／dlの範囲の種々の濃度の金属陽イオンと混合された天然ポリペプチドの標準的な量で行うことができる。例えば、同一の量の精製ＡＬＡＤを含有する標準溶液は、約０.５μg／dl〜５０μ／dlの範囲の種々の濃度の鉛陽イオンと混合することができる。次いで、これらの標準溶液をＡＬＡＤに対して特異的な抗体と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成することができる。次いで、ホースラディッシュペオキシダーゼで標識化された鉛に対して特異的な抗体を第一抗原−抗体複合体に添加して、第二抗原−抗体複合体を形成する。第二抗原−抗体複合体の量は、ホースラディッシュペオキシダーゼ、２,２'−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンゾチアゾリンスルホネート(６)］（ＡＢＴＳ）に対する基質の転換によって測定される。ＡＢＴＳは、４０５ナノメーターで分光光学的に測定される有色生成物に転換される。標準曲線は、転換された基質の量に対する初期試料に添加された鉛陽イオンの量をプロットすることによって作成される。好ましいバージョンは、該方法は、ヒト血液中に存在する鉛陽イオンの量を検出する。血液試料を採取し、トリトンＸ−１００で処理して、赤血球を溶解する。次いで、該試料を、ＥＬＩＳＡプレートに固定化されたＡＬＡＤに対して特異的な抗体と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成する。次いで、該プレートを洗浄して、非錯形成タンパクを除去し、該第一抗原−抗体複合体に、鉛に対して特異的なおよびホースラディッシュペオキシダーゼで標識化された抗体を添加する。インキュベーションおよび洗浄後、ホースラディッシュペオキシダーゼ、ＡＢＴＳに対する基質を添加する。該基質の生成物への転換は、４０５ナノメーターで分光光学的に測定される。血液試料中の鉛陽イオンの量は、標準曲線への対照によって測定される。この方法を使用して、体液中の複数の異なる金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体を検出することができる。例えば、イムノアッセイは、金属陽イオンに結合する異なる天然ポリペプチドに対して特異的な幾種類かの抗体を使用して同時に行うことができる。例えば、イムノアッセイは、ＡＬＡＤ、グルタチオン、および／またはメタロチオネインに対して特異的な抗体を用いて行うことができる。血液試料中のこれらのポリペプチドの各々と錯形成した、鉛などの金属陽イオンの量を比較し、これを使用して、金属陽イオン被曝の量および期間を測定することができる。本発明の方法は、動物が金属陽イオンに急性的にまたは慢性的に被曝したかを測定するために与えることができる。如何なる場合も本発明を限定するものではないが、ＡＬＡＤのようないくつかの天然ポリペプチドは、短い被曝時間（例えば、３時間以下）以内で金属陽イオンに結合し、他の天然ポリペプチドは、長期被曝（例えば、少なくとも２４時間）に至るまで、金属陽イオンを結合しないと思われる。これらの２種類のタイプのポリペプチドによって結合された金属陽イオンの量の比較は、被曝が急性であるかまたは慢性であるかを示すことができる。急性的な結合タンパクによって結合する金属陽イオンおよび２種類以上の慢性的な結合タンパクの比較は、最近の急性的な被曝および慢性的な被曝があるかを示すことができる。例えば、実質的に、ＡＬＡＤなどの、短い被曝時間内で金属陽イオンを結合するポリペプチドに結合された金属陽イオンの全てが検出される場合、動物が急性的に被曝したと思われる。実質的に金属陽イオンの全ての結合は、両方のタイプのポリペプチドに結合する検出される全金属陽イオンの約８０〜１００％、好ましくは、約９０〜１００％の結合を意味する。短期および長期の被曝後に金属陽イオンに結合するこれらのポリペプチドを含むいくつかの天然ポリペプチドに結合された金属陽イオンが検出される場合、該動物は、金属陽イオンに慢性的に被曝してきたと思われる。慢性的な被曝について、好ましくは、第一のタイプの天然ポリペプチドへの結合は、約１０〜６０％であり、第二のタイプの天然ポリペプチドへの結合は、両方のポリペプチドに結合した全金属陽イオンの約２０〜７０％である。当該方法の工程は、第一のタイプの天然ポリペプチドに結合した金属陽イオンの量を検出し、１種類以上の第二のタイプの天然ポリペプチドに結合した金属陽イオンの量を検出し、第一タイプのポリペプチドによって結合された金属陽イオンの量を他のポリペプチドと比較することを含む。好ましくは、第一タイプのポリペプチドは、被曝後、短時間以内に、好ましくは、約３〜２４時間以内に金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドである。短い被曝時間後に金属陽イオンを結合する好ましいポリペプチドは、ＡＬＡＤである。第二タイプのポリペプチドは、長期間後、好ましくは、少なくとも約２４時間後、より好ましくは、約２４〜７２時間後、金属陽イオンを結合するポリペプチドであるのが好ましい。長期被曝後に金属陽イオンを結合する好ましいポリペプチドは、ヘモグロビンである。急性被曝後に天然ポリペプチド（すなわち、第一タイプ）によって結合される金属陽イオンの量を、慢性被曝後の金属陽イオンに結合する１種類以上の天然ポリペプチド（すなわち、第二タイプ）によって結合される金属陽イオンの量と比較することができる。好ましいバージョンでは、ＡＬＡＤなどの第一タイプのポリペプチドに結合された金属陽イオンの量は、ヘモグロビンなどの第二タイプのポリペプチドに結合される金属陽イオンの量と比較される。該ポリペプチドに結合される金属陽イオンの量は、本発明のイムノアッセイ法によって検出することができる。例えば、第一タイプの天然ポリペプチドに結合した鉛などの金属陽イオンの量は、カプチャー抗体としてＡＬＡＤに対して特異的な抗体および鉛陽イオンに対して特異的な抗体を使用するイムノアッセイによって測定して、ＡＬＡＤ鉛錯体の量を検出することができる。ＡＬＡＤに結合した鉛の量は、前記のように、公知の標準試料を使用して作成された標準曲線との比較によって検出することができる。ヘモグロビンなどの１種類以上の他の天然ポリペプチドに結合した鉛などの金属陽イオンの量は、この場合のカプチャー抗体が抗ヘモグロビン抗体であること以外は、同様の方法で測定することができる。結合した金属陽イオンの量は、好ましくは、ポリペプチドの各々に結合する検出される金属陽イオンの全量のパーセンテージとして測定される。本発明のイムノアッセイ法は、所望により、使用される抗体の特異性に依存して、多くの種々の変形で行うことができる。これらの別の具体例のいくつかを以下に記載する。本発明の方法の全ての具体例がコトナル特異性を有する２種類の抗体を必要とするものではない。例えば、本発明の方法は、カプチャー抗体として供するために天然ポリペプチドまたは金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体に対して特異的な単一の抗体を使用することを含む。該カプチャー抗体は、体液試料からの金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドを結合する。この場合の該天然ポリペプチドは、活性が金属陽イオンの結合によって阻害される酵素である。金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドがカプチャー抗体によって固定化された後、酵素活性が測定される。酵素活性は、酵素活性を阻害する金属陽イオンの除去によって回復することができる。金属陽イオンの除去は、金属陽イオンを結合するためのキレート化剤を使用することによって、または、過剰の天然補因子を使用することによって、または、両方の処理の組合せを使用することによって、行うことができる。酵素活性を阻害する金属陽イオンの除去後、回復された酵素活性を測定する。回復された酵素活性の量は、酵素に結合した阻害性金属陽イオンの量のインジケーターである。典型的には、金属陽イオンに結合する酵素およびそれらの活性についてのアッセイは、当業者に知られている。例えば、ＡＬＡＤは、鉛陽イオンに結合し、天然補因子Ｚn⁺²の代わりに鉛陽イオンを結合させることによって活性が阻害される酵素である。ツカモト（Tsukamoto）ら、ビオシミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（Biochem.Biophys.ＡＣＴＡ）、５７０：１６７（１９７９）。ＡＬＡＤまたは鉛−ＡＬＡＤに対して特異的な抗体を使用して、体液からのＡＬＡＤ−Ｐ b錯体を捕獲することができる。Ｐb-ＡＬＡＤ錯体中のＡＬＡＤの酵素活性は、マウゼラール（Mauzerall）およびグラニック（Granick）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、２１９：４３５（１９５６）に開示された標準的な方法によって測定することができる。鉛陽イオンの除去は、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤の存在下、鉛−ＡＬＡＤ、次いで、過剰のＺn⁺²イオンをインキュベートすることによって行うことができる。鉛陽イオンの除去後、回復された酵素活性は、再度測定することができる。回復された酵素活性の量を使用して、ＡＬＡＤに結合した鉛陽イオンの量を測定することができる。別のバージョンでは、本発明の方法は、ポリペプチド当たり少なくとも２つの金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドに対して特異的な単一の抗体を使用することができる。少なくとも２つの金属陽イオンに結合する天然ポリペプチドに対して特異的な抗体は、まず、カプチャー抗体として使用されて、体液試料からの天然ポリペプチドを固定化する。次いで、同一の抗体を使用して、固定化された金属陽イオンの少なくとも２つを結合する天然ポリペプチドの量を検出することができる。好ましくは、該抗体は、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の、（１）金属陽イオンまたは（２）金属陽イオン部分または（３）金属陽イオンと配位結合ポリペプチド部分との組合せに対して特異的である。例えば、鉛陽イオンに対して特異的な抗体を使用して、ＡＬＡＤなどのポリペプチド当たり少なくとも２つの鉛陽イオンを結合する天然ポリペプチドを捕獲することができる。如何なる場合も本発明を限定するものではないが、ポリペプチドに結合された他の鉛陽イオンを検出することができると思われる。ポリペプチド当たり金属陽イオンの少なくとも２つを結合する天然ポリペプチドを捕獲または固定化した後、結合された鉛陽イオンの量は、前記のように、検出可能な薬剤で標識化された、鉛陽イオンに対して特異的な同一の抗体を使用して検出することができる。本発明のイムノアッセイ法のこれらの別の具体例は、体液試料中の金属陽イオン汚染の迅速なローコスト検出法について提供することもできる。Ｄ．体液試料中の金属陽イオンの量の測定用イムノアッセイキット本発明は、また、体液試料中の１種類以上の金属陽イオンの検出用キットを提供するものでもある。好ましいキットは、異なる特異性を有する少なくとも２種類の抗体を含有する。抗体の１つは、第一タイプ抗体であってもよく、一方、他の抗体は、第二タイプ抗体であってもよい。別法としては、両方の抗体は、前記の第二タイプのものであってもよい。該キット中の抗体の１つは、好ましくは、基質に固定化されており、他のタイプの抗体は、好ましくは、検出可能な薬剤で標識されている。基質に固定化された抗体は、好ましくは、検出可能な薬剤で標識化されない。基質に固定化されない該抗体は、好ましくは、検出可能な薬剤で標識化される。該抗体は、体液試料中で金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドの全てに実質的に結合し、それを検出するのに有効な量でキット中に存在する。金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的な好ましい抗体は、約１０分以下のうちに体液試料からの天然ポリペプチドの実質的に全てを結合するする能力を有する。金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドに対して特異的な特に好ましい抗体は、ＡＬＡＤに対して特異的な抗体である。金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープ（ポリペプチドまたは組合せ）または金属陽イオンに対して特異的な抗体は、少なくとも約１μg／dlの金属陽イオンを含有する体液試料中の金属陽イオンの濃度を検出する能力を有する。特に好ましい抗体は、鉛陽イオンに対して特異的な抗体である。該キットは、抗体の種々のタイプおよびサブタイプのかなり多数の組合せを含有する。例えば、該キットは、金属陽イオンに対して特異的な抗体および金属陽イオンを結合することができる種々の天然ポリペプチドに対して特異的な数種類の抗体を含有する。別法としては、該キットは、種々の金属陽イオンに対して特異的な数種類の抗体および金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的な１つの抗体を含有することができる。別法としては、該キットは、金属陽イオンに対して特異的な多数の抗体および金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的な多数の抗体を含有することができる。該キットは、好ましくは検出可能な薬剤で標識化された、抗−ＩgＧ、抗 −ＩgＭまたは抗−ＩgＡである第三タイプの抗−イムノグロブリン抗体を含有することもできる。好ましいキットは、金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドに対して特異的な１つのモノクローナル抗体および金属陽イオンに対して特異的な１つのモノクローナル抗体を含有する。別法としては、該キットは、単一のタイプの抗体を含有することができる。例えば、該キットは、前記のように、ポリペプチド当たり少なくとも２つの金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドによって結合された鉛陽イオンの量を検出するために使用することができる金属陽イオンに対して特異的な抗体を含有することができる。所望により、該キットは、前記のように、金属陽イオンによって阻害される酵素に対して特異的なカプチャー抗体および酵素活性を測定するための成分を含有することもできる。例えば、該キットは、ＡＬＡＤに対する抗体、ＥＤＴＡおよび／またはＺn⁺²イオンを含有する溶液などの酵素活性を回復するための試薬およびδ−アミノレブリン酸などのＡＬＡＤ酵素活性を測定するために必要とされる試薬を提供することができる。このタイプの抗体の１つは、好ましくは、固体基質に固定化される。抗体は、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（前出の文献）に開示されているような標準的な方法よって固体基質に固定化され得る。好適な固体基質としては、棒、カップ、フラットパック、または他の固体支持体によって支持されるかまたはそれに結合された膜またはコーティングを有する物質が挙げられる。他の固体基質としては、細胞培養プレート、ＥＬＩＳＡプレート、チューブおよび高分子膜が挙げられる。好ましい固体基質は、高分子膜で被覆された棒である。このタイプの抗体の１つは、好ましくは、検出可能な薬剤で標識化されており、典型的には、該抗体は、基質に固定化されている。抗体は、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル、第３１９頁〜第３５８頁（前出の文献）に開示されているような標準的な方法よって検出可能な薬剤で標識化することができる。好適な検出可能な薬剤としては、酵素、放射性標識、フルオロクロムおよびビオチンが挙げられる。該キット用の好ましい検出可能な薬剤は、酵素であり、より好ましくは、基質を肉眼で検出することができる着色生成物に転換する酵素である。該キットは、所望により、検出可能な薬剤を検出するための手段を含有する。抗体が放射性標識またはフルオロクロムで標識化される場合、好ましくは、該試薬を検出するための手段は、該キットにおいて与えられない。典型的には、消費者は、これらの検出可能な薬剤を検出するために使用することができる分光光度計、シンチレーションカウンター、および顕微鏡を有するであろう。堅守試薬がビオチンまたは酵素である場合、検出可能な薬剤の検出手段は、キットに供給することができる。検出可能な薬剤の検出手段の例としては、酵素に対する基質またはアビジンが挙げられる。検出可能な薬剤の検出手段は、第二抗原−抗体複合体の全てを実質的に検出するのに充分な濃度で存在する。好ましくは、該酵素に対する基質は、キット中に存在する酵素で標識化された抗体の量と約２：１〜１００：１の割合で提供される。検出可能な薬剤の好ましい検出手段は、酵素によって有色生成物に転換される基質である。検出可能な薬剤と検出可能な薬剤の検出手段との好ましい組合せは、ホースラディッシュペルオキシダーゼと２,２'−アジノ−ジ−［３−エチル− ベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）である。キットは、また、所望により、体液試料中に存在する細胞を溶解するように機能する溶解剤を含有してもよい。好適な溶解剤としては、トゥイーン（Tween） −８０、ノニデット（Nonidet）Ｐ４０、およびトリトン（Triton）Ｘ−１００などの界面活性剤が挙げられる。好ましくは、溶解剤は、抗体の１つと一緒に固体基質に固定化される。該キットは、工程間での基質の洗浄のための緩衝溶液を含有することもできる。緩衝溶液は、リン酸緩衝液、生理食塩水、クエン酸緩衝液またはトリス（Tris ）緩衝液などの生理学的溶液である。該キットは、種々の濃度の金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体を含有する標準試薬を含むこともできる。標準試薬は、０.５μg／dl〜５０μg／dlの範囲の種々の濃度の金属陽イオンを、金属陽イオンを結合する単一の濃度の天然ポリペプチドと混合することによって製造することができる。次いで、種々の量の金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体を含有する溶液を形成し、本発明のイムノアッセイ法を行う。好ましいバージョンにおいて、標準的な溶液の各々を、第一のタイプの抗体と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成する。次いで、検出可能な薬剤で標識化された第二タイプの抗体を添加して、第二抗原−抗体複合体を形成する。検出可能な薬剤の量を測定することによって、第二抗原−抗体複合体の量を測定する。標準溶液の各々について第二抗原−抗体複合体の量を測定し、次いで、標準溶液の各々に最初に添加された金属陽イオンの濃度に対してプロットする。さらに、第二抗原−抗体複合体に存在する金属陽イオンの量は、原子吸光分光分析法によって測定することができ、天然ポリペプチドに結合された金属陽イオンの吸光量を、最初に添加された金属陽イオンの量と、および、検出可能な薬剤を検出することによって測定される第二抗原−抗体複合体の量と、比較することができる。所望により、種々の濃度の金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のを含有する１種類以上の標準試薬を固体基質の一部に固定化することができる。好ましくは、３種類の標準試薬を、各々、固体基質の異なる部分において、固定化することができる。例えば、１、５および１０μg／dlと混合した天然ポリペプチドを含有する標準試薬は、天然ポリペプチドに対して特異的な固定化抗体に結合することによって固体基質に固定化することができる。固定化固体基質の一部は、体液試験試料の結合のために利用可能である。イムノアッセイが酵素基質を有色生成物に転換させることによって行われた後、すぐに、体液試験試料によって生成された有色生成物の量は、標準量の各々について生成された有色生成物の量と比較することができる。所望により、該キットは、既知濃度の金属陽イオンと混合された天然ポリペプチドを含有する個々の量の標準試薬によって生成された有色生成物の量の視覚表示を有するカードを含むことができる。好ましくは、該カードは、種々の量の標準濃度の金属陽イオンと会合した有色生成物の異なる強度の多数の異なる視覚表示を含有する。このカードは、消費者によって使用されて、有色生成物の量を体液試験試料と比較することができ、これによって、体液試料中に存在する金属陽イオンの量を定量化することができる。好ましいキットにおいて、ＡＬＡＤに対して特異的な抗体は、棒に結合した膜からなるディップスティクの一部に固定化される。ＡＬＡＤに対して特異的な抗体は、約１０分以下で、試料中に存在するＡＬＡＤの全てを実質的に結合する能力を有する。該ディップスティクは、ＡＬＡＤに対して特異的な抗体と一緒に固定化される溶解剤、好ましくは、トリトンＸ−１００を有してもよい。好ましいキットは、リン酸緩衝溶液およびホースラディッシュペルオキシダーゼで標識化された鉛陽イオンに対して特異的な抗体を含有する。鉛陽イオンに対して特異的な抗体は、好ましくは、約１μg／dl程度の鉛陽イオンを含有する体液試料中の金属陽イオンを検出することができる抗体である。好ましいキットは、ホースラディッシュペルオキシダーゼに対する基質、好ましくは、ＡＢＴＳをも含有する。好ましいキットは、また、種々の標準量の金属陽イオンを含有する試料に対するホースラディッシュペルオキシダーゼによるＡＢＴＳの転換によって形成された種々の量の有色生成物の多数の視覚表示を有するカードをも含有する。実施例Ｉ金属陽イオン水銀に結合するモノクローナル抗体の製造金属陽イオン特異性抗体の誘発および選択のためのストラテジーは、金属イオンが単座配位子として結合され得る錯体を製造することであった。配位数は、錯体において中心金属原子に結合した配位子の数を示し、３〜１０の数が開示されているが［ディ・クレイグ（D.Craig）ら、キレーティング・エイジェンツ・アンド・メタル・キーレイツ（Chelating Agents and Metal Chelates）、エフ・ドゥイヤー（F.Dwyer）およびディ・マロン（D.Mullon）編、第５１頁〜第９３頁、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９６６）］、ほとんどの金属の配位数は、一般に４〜６である。これらの実験で使用された錯体では、塩化水銀がＬ−γ−グルタミル−システイニルグリシンのトリペプチドであるグルタチオン（ＧＳＨ）に添加された。スルフヒドリル基に結合した水銀イオンの解離定数は、１０^-42Ｍという高さであると報告された。かくして、相互作用は、水銀とシステインのスルフヒドリル基のみとの相互作用によって、他の２つのアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基の関係を必要とせずに安定な錯体を形成することができるほど充分に強い［ビー・フーア（B.Fuhr）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（J.Am.Chem.Soc.）、９５：６９４４（１９７３）］。免疫原は、担体タンパクキーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートしたＧＳＨ−ＨgＣlからなっていた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、注射当たりタンパク５０μgの合計量で、フロインドアジュバント中に乳化されたＨgＣl−ＧＳＨ −キーホールリンペットヘモシアニンをマルチプル腹腔内注射した。５回目の注射後に該マウスから採血し、それらの血清を、水銀特異性抗体の証拠のために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＧＳＨおよびＢＳＡ−ＧＳＨ−ＨgＣlに対してＥＬＩＳＡによって分析した。結果を下記第１表に示す。血清中の水銀特異性抗体の存在についての最初のスクリーニングは、単に、水銀を含有する免疫原との方が水銀を含有しない免疫原とよりも高い反応性であった。いくつかのマウス（例えば、番号２、４、５、６および７）は、この条件を満たした。マウス番号６にブースター注射を行い、３日後にその脾臓を融合のために使用した。ハイブリドーマ培養液をスクリーンするために使用したＥＬＩＳＡ法は、第１表の説明に記載したものと同一であった。得られたハイブリドーマ１３４個のうち７個は、免疫原のＧＳＨ−ＨgＣl成分のある部分に対する特異性と一致した反応性を示した（第２表）。ＭＡｂ１Ｈ１１、２Ａ９、３Ａ１２および３Ｈ９は、ＨgＣl₂が存在してもしなくてもＧＳＨと反応したので、ＧＳＨ−特異性と一致するパターンを示した。他方、ＭＡｂ１Ｆ１０、３Ｅ８および４Ａ１０は、ＢＳＡ−ＧＳＨ−ＨgＣlを用いてアッセイした場合、バックグラウンドよりも２〜３倍高かった。バックグラウンドは、それらのジニトロフェノール特異性モノクローナル抗体との反応性を測定することによって、ＢＳＡ−ＧＳＨおよびＢＳＡ−ＧＳＨ−ＨgＣlの両方について確立した。これらの結果は、後者の３つの抗体（１Ｆ１０、３Ｅ８および４Ａ１０）が単独の水銀イオンに対して、または、ＧＳＨおよびＨgＣl₂の両方からなるエピトープに対して特異的であることを示した。Ｍab ４Ａ１０（ＢＮＮｏ．４Ａ１０Ｂ４、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０３８１）および１Ｆ１０をサブクローン化し、分析して、さらに、それらが単独で塩化水銀と反応するかを測定した。それを行うために、１０^-2Ｍ〜１０^-11ＭのＨgＣl₂の１０倍希釈液を使用して、マイクロタイタープレートに吸着したＢＳＡ−ＧＳＨ−ＨgＣlに結合する抗体を阻害する阻害アッセイを行った。該阻害アッセイは、以下のように行った。各濃度の塩化水銀５０μlおよび所定の抗体を含有する希釈された腹水５０μlを、吸着したＢＳＡ−グルタチオン −ＨgＣlを含有するマイクロタイタープレートのウエル中、室温で３０分間インキュベートした。次いで、該プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗−マウス血清を添加した。前記のようなインキュベーションおよび洗浄の後、ＡＢＴＳ基質を添加し、１５分後、Ａ₄₀₅を測定した。各ポイントは、三重測定の平均値を表す。パーセント阻害は、下記式に従って算出した：パーセント阻害＝（１−｛［exp.のＡ４０５−neg.のＡ４０５］÷［pos.のＡ４０５−neg.のＡ４０５］｝）×１００。結果を第１図に示す。両方の抗体の吸着した抗原への結合は、可溶性ＨgＣl₂によって阻害され、各々について１０^-9Ｍ〜１０^-10ＭＨgＣl₂で５０％阻害であった。阻害の特異性は、同一濃度の塩化水銀がアスパラギンシンセターゼ特異性モノクローナル抗体（ＭＡｂ３Ｄ１１）のアスパラギンシンセターゼへの結合を阻害する能力を有しないことによって示された。これらのデータにより、両方の抗体のＨgＣl₂との反応性は、ＧＳＨまたはＫＬＨの存在に無関係であることが判明した。実施例II モノクローナル抗体の水銀への結合特性の特徴付け明確に、可溶性塩化水銀と反応する能力を有する抗体を同定した。次に、抗体の水銀イオンに対する親和性を測定すること、および、それらが結合する他の金属を同定することが関心事であった。これらの分析に使用した他の金属塩としては、塩化バリウム、塩化カドミウム、塩化クロム、塩化銅、硫酸鉄、塩化金、酢酸水銀、塩化ニッケル、酸化セレン、塩化銀、および塩化亜鉛が挙げられた。抗体の種々の金属に対する親和性を測定するために使用した方法は、フリゲット（ Friguet）ら［ジャーナル・イムノロジカル・メソッズ（J．Immunol．Methods）、７７：３０５（１９８５）、出典明示により明細書の一部とする］によって開示された競合ＥＬＩＳＡ法であった。該結果から、ＨgＣl₂についてのＭＡｂ４Ａ１０の解離定数が２.３±０.８× １０^-9Ｍであり、ＭＡｂ１Ｆ１０の解離定数が３.７±１.５×１０^-9Ｍであることが判明した。いずれの抗体も、検出可能な程度にはいずれの他の金属をも結合しなかった。しかしながら、両方の抗体は、酢酸水銀に対する同様の親和性を有した。該親和性は、４Ａ１０および１Ｆ１０について、各々、４.１±０.１× １０^-9Ｍおよび８.２±２.５×１０^-9Ｍであった。これらの結果から、抗体反応性についてアッセイされる水銀含有化合物中に最初に存在した対イオンとは無関係に、水銀イオン自体がこれらの抗体によって認識された主エピトープであったことが判明した。これらのモノクローナル抗体の錯形成していないグルタチオンとの平衡透析を行い、グルタチオンについての解離定数が１０^-5Ｍ未満であることを測定した。このデータは、さらに、これらの抗体が裸金属陽イオンとの免疫反応性を有するという見解を支持する。該抗体の特異性は、さらに、他の金属の存在下であっても、それらの、ppb範囲の濃度の水銀を検出する能力によって説明された。これは、以下の金属：Ｈg⁺⁺０.２mg／Ｌ、Ｂa⁺⁺１００mg／Ｌ、Ｃd⁺⁺１mg／Ｌ、Ｃr⁺⁺⁺５mg／Ｌ、Ｐb⁺ ⁺ ５mg／ＬおよびＡg⁺５mg／Ｌの混合物を含有するＥＰＡ品質管理（ＱＣ）試料を用いて示された。該試料を既知のＨg⁺⁺濃度に希釈し、次いで、ＥＬＩＳＡ法によってアッセイし、既知濃度の塩化水銀からなる標準試薬を用いて得られた結果と比較した。すなわち、ＥＬＩＳＡ法は、以下のとおり行った。ＱＣ試料およびＨgＣl₂を水中で０.５〜２００ppbの範囲の水銀濃度に希釈し、次いで、ＥＬＩＳＡによって分析した。水銀を除いてはＱＣ試料と同一の濃度の全ての他の金属を含有する試料も含まれた。添加された水銀を有しない水および水銀を有しないＥＰＡ試料の両方の分析において得られた吸光度は、０.２６３であった。各ポイントは、各試料の四重分析から得られた平均吸光度を表す。第２図を参照。第２図における結果から、水銀２ppbでＥＰＡ試料および水銀標準の両方で有意な反応性が得られ、両方の試料についての吸光度が水銀２０ppbまで直線であることが判明した。ＥＰＡ試料におけると同一の濃度で水銀以外の金属の全てを含有する試料が水銀を含有しない水と同一の吸光度を与えるので、反応性は、水銀の存在のためであり、他の金属のうちの１つの認識のためではなかった。第２図における結果から、明らかに、ＥＬＩＳＡが水中の水銀イオンを高感度かつ再現可能に検出する能力を有することが判明したが、それらは、ＥＬＩＳＡが原子吸光度とどの程度よく関連しているかを明らかにしなかった。現在、コールド−ベイパー（cold-vapor）原子吸光分光分析法が水銀測定のための特選方法であるので、これは、重要な研究である。２つの方法から得られた結果を関連付けるため、原子吸光分光分析法水銀参照標準を０.１ＭＨＥＰＥＳ（pＨ６.８）中で１００ppbの水銀濃度に希釈した。この時点で、２つのアリコットを取り出し、ＨＥＰＥＳ中でイムノアッセイのために、または、１０％硝酸中で原子吸光分光分析法のために適切な濃度に希釈した。次いで、両方の方法によって、水銀０、２、４、５、１０および１５ppbを含有する試料を分析した。示された数値は、イムノアッセイによる四重分析および原子吸光分光分析法による三重分析の平均および標準偏差を表す。（第３図を参照）。第３図に示すとおり、２つの方法から得られた結果は、相関関係係数＞０.９９によって示されるように、精密に一致している。さらに、ほとんどの水銀濃度でのイムノアッセイの標準偏差は、原子吸光分光分析法によって得られると同一またはそれ以下であった。これらの結果から、このアッセイ条件下で、ＥＬＩＳＡによる水銀の定量化がコールド−ベイパー原子吸光分光分析法と同様に精密であることが判明した。実施例III 鉛陽イオンに対するモノクローナル抗体の製造金属陽イオン−スペーサーアーム担体によるマウスの免疫化を使用して水銀特異性抗体の製造のために使用された同一のストラテジーを、鉛に対して特異的な抗体の発生のために適用した。最初に、鉛が存在する場合にのみ担体タンパクと反応した７個の抗体を同定した。これらの抗体をスクリーニングすることにより得られたＥＬＩＳＡ結果を以下に示す。これらの抗体のうちいくつかを、オボアルブミンのような他の球状タンパク、またはポリ−Ｌ−リシンのような合成ポリペプチドなどの他の担体に結合した鉛の検出のためにアッセイした。鉛陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体は、１０^-9Ｍ未満の鉛陽イオンについての解離定数を有することができ、カドミウム、銅、亜鉛、水銀、ニッケルおよびコバルトの陽イオンに適切な程度には結合しない。これらの抗体のいずれが溶液中の鉛を結合するかを測定するために、実施例Ｉに記載の競合アッセイにおいて、ｍＡｂ１Ｃ３および１４Ｆ１１（実施例IVの記載に従って製造した）を使用して、溶液中の硝酸鉛がいずれのｍＡｂの固相に吸着したＢＳＡ−ＧＳＨ−Ｐb⁺⁺への結合を阻害するかを示した。すなわち、各濃度の酢酸鉛５０μlおよび所定の抗体を含有する希釈した腹水５０μlを、吸着したＢＳＡ−グルタチオン−酢酸鉛を含有するマイクロタイタープレートのウエル中、室温で３０分間インキュベートした。次いで、該プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗−マウス血清を添加した。前記のようなインキュベーションおよび洗浄の後、ＡＢＴＳ基質を添加し、１５分後、Ａ₄₀₅を測定した。各ポイントは、四重測定の平均を表す。パーセント阻害は、第１図に対する説明中の式に従って測定した。結果を第４図に示す。１Ｃ３および１４Ｆ１１の両方の結合は、１０〜１００ppmの範囲の濃度の可溶性酢酸鉛によって阻害され、ｍＡｂ１Ｃ３および１４Ｆ１１について各々約２０ppmおよび１５０ppmで５０％阻害である。かくして、これらの２つの抗体は、担体に結合した鉛との反応に加えて、溶液中の鉛とも反応した。実施例IV Ｐb−ＡＬＡＤに対して特異的なモノクローナル抗体の製造Ｐb−ＡＬＡＤに対して特異的なモノクローナル抗体を標準的な方法によって製造した。Ｐbと錯形成したＡＬＡＤの量は、鉛汚染の毒性の高感度インジケーターである。ＡＬＡＤは、活性が鉛汚染によって阻害される天然酵素であり、この阻害は、鉛汚染の毒性効果の１つを表す。血液試料中に存在するＰb−ＡＬＡＤの量は、患者の鉛汚染に関連する毒性レベルの良好なインジケーターである。実施例Ｉの記載に従って、Ｐb−ＡＬＡＤに対するモノクローナル抗体を製造した。得られたハイブリドーマをＰb−ＡＬＡＤおよびＡＬＡＤとの免疫反応性についてスクリーンした。１４Ｆ１１と称されるモノクローナル抗体は、Ｐb-ＡＬＡＤの注射によって産生された。この抗体および抗体ＩＣ３（実施例IIIの記載に従って製造した）をＡＬＡＤ−Ｐbおよび単独のＡＬＡＤを用いて試験した場合のＥＬＩＳＡ結果を以下に示す：これらの抗体は、ＡＬＡＤ−鉛錯体のエピトープに対して特異的であり、単独のＡＬＡＤのエピトープと反応しない。前記の結果から、明らかに、水銀について見いだされた同一の条件が鉛についても存在すること、すなわち、鉛が溶液中に存在しているかまたは担体に結合している場合に鉛を認識する抗体を産生することができることが判明する。モノクローナル抗体１４Ｆ１１は、１０ppmの溶液中の鉛を検出することができ、１Ｃ３は、１ppmの鉛を検出することができた。鉛に結合したＡＬＡＤとの反応性を有し、単独のＡＬＡＤとの非交差反応性を有するモノクローナル抗体をアッセイにおいて使用して、血液試料中に存在する鉛の量を検出することができる。モノクローナル抗体１４Ｆ１１および１Ｃ３の、他の金属陽イオンに錯形成したウシＡＬＡＤとの免疫反応性も試験した。ウシＡＬＡＤを１mＭの金属陽イオン（Ｐb、Ｚn、Ｃu、Ｃd、ＮiおよびＨgが挙げられる）と一緒に６０分間インキュベートした。次いで、ウシ−ＡＬＡＤ金属錯体をＥＬＩＳＡウエル中に置き、モノクローナル抗体１４Ｆ１１および１Ｃ３を結合する能力についてアッセイした。結果を以下に示す。実施例ＶＡＬＡＤに対して特異的なハイブリドーマ抗体の産生ＡＬＡＤは、鉛への被曝の最も早くて最も感度が高いインジケーターの１つであるので、個々において負荷された鉛の測定のための論理上の標的である。ＡＬＡＤは、大きな多量体タンパクであり、そこで、高親和性の特異的なモノクローナル抗体の形成を誘発するであろう。ＡＬＡＤ特異性抗体を使用して、それに結合した鉛のその後の検出のために体液試料からの酵素を捕獲することができる。ＡＬＡＤに対して特異的な抗体の産生のための注射方針は、以下のとおりであった。ウシ肝臓ＡＬＡＤをアジュバントと混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射した。各マウスに注射当たりＡＬＡＤ５０μgを３回注射した。室温で２時間インキュベートすることによって９６ウエルポリスチレンマイクロタイタープレートのウエルに５μg／mlの濃度のＡＬＡＤ２００μlを吸着させるＥＬＩＳＡ法によって、ＡＬＡＤ特異性抗体の存在をモニターした。ＰＢＳ中１％ポリビニルアルコール２００μlを各ウエルに添加し、室温で１時間インキュベートして、非特異的タンパク結合部位をブロックした。各血清試料の４倍希釈液を調製し、各々１００μlをマイクロタイタープレートのウエル２つずつに添加した。室温で６０分間インキュベートした後、該プレートをＥＬＩＳＡ洗浄液（０.１％ノニデットＰ−４０を有するＰＢＳ）で３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗−マウス血清１００μlを添加し、該プレートをインキュベートし、前記のように洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ）を添加し、室温で１５分間インキュベートした後、４０５nmで各ウエルの吸光度を測定した。対照は、ＡＬＡＤの代わりにウシ血清アルブミンに対する各血清希釈液をアッセイして、それらの非特異的反応性を測定し、ＡＬＡＤに対して非注射マウスからの血清をアッセイすることからなる。前記のように注射した３匹のマウスは、ＡＬＡＤに対して＞１０,０００、ＢＳＡに対して＜１,０００のＥＬＩＳＡ力価を示す。ジェイ・リッデル（J.Liddell）ら［ア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モノクローナル・アンチボディーズ（A Practical Guide to Monoclonal Antibodi es ）、第６７頁〜第８８頁（１９９２）］による開示に従って、標準的な方法に従って、ハイブリドーマの産生のためのＳＰ２／０骨髄腫細胞との融合のために、これらのマウスの１匹からの脾臓を使用した。該融合により４つのモノクローナル抗体を得た。ＡＬＡＤおよびＢＳＡ−ＧＳＨに対するこれらの抗体の最初のスクリーニングから得られたＥＬＩＳＡ結果を以下に示す。多反応性抗体を同定するためにＢＳＡ−ＧＳＨを含んだ。前記の結果から、これらの４個の抗体は、特異的な抗原（ＡＬＡＤ）との、非特異的な抗原（ＢＳＡ−ＧＳＨ）よりも優先的なそれらの反応性によって示されるように、ＡＬＡＤに対して特異的であったことが判明する。しかしながら、ＡＬＡＤ特異性抗体は、ウシ肝臓ＡＬＡＤの注射によって誘発され、マイクロタイタープレートのウエルに吸着した同一の免疫原との反応性によって同定された。次いで、該抗体は、ＡＬＡＤがマイクロタイタープレートに吸着した場合にのみ、影響を受け易い種特異性エピトープに対して特異的であったという可能性があった。タンパクの固体支持体への吸着は、変性を生じることがあり、その結果、このアッセイで検出されたいずれのモノクローナル抗体も、変性したエピトープに対して特異的であり、天然酵素と反応しないであろう。赤血球溶解物中で天然ＡＬＡＤを認識することに加えて、ＡＬＡＤ特異性抗体は、好ましくは、２つのさらなる要求を満たした；第１に、抗体と反応する能力が鉛の存在によって影響されないＡＬＡＤエピトープを認識しなければならない；第２に、いずれの結合した鉛をも免疫学的に検出せしめるのに充分な量のＡＬＡＤを結合しなければならない。これらの要求を満たすための前記で示されたＡＬＡＤ特異性抗体の各々の能力を試験した。いずれの抗体が結合した鉛を有するＡＬＡＤを結合するかを測定するために、ウエルにＡＬＡＤを吸着させ、次いで、いくつかのウエルにＰbを添加するが、他のウエルには添加しない。次いで、鉛の存在下および不在下でＡＬＡＤとの反応性について、ＭＡｂ１１Ｂ１２を試験した。この抗体は、一貫して、他の抗体よりも慣用のＥＬＩＳＡにおいてＡＬＡＤと強く反応するので、この抗体を選択した。結果を以下に示す。これらの結果から、ｍＡｂ１１Ｂ１２が鉛の存在に関係なくＡＬＡＤと反応したことが判明する。ヒト赤血球ＡＬＡＤに結合する抗体についてアッセイするために、モノクローナル抗体の存在下での酵素活性の阻害を測定した。各抗体の適切な量を、固相ＥＬＩＳＡにおいて滴定によって予備測定し、マイクロタイタープレートのウエルに添加した。プレートへの抗体吸着後、洗浄したヒト赤血球からの溶解物１００ μlを添加した。該プレートを室温で３０分間インキュベートし、洗浄し、ツカモト（Tsukamoto）ら［ＢＢＡ、５７０：１６７−１６８（１９７９）］の方法の変形によってＡＬＡＤ活性を測定した。すなわち、４mＭδ−アミノレブリン酸・塩酸塩を含有するトリス−酢酸（pＨ７.１）１００μlを添加し、該プレートを３７℃で種々の時間インキュベートした。適切な時点で、エールリッヒ試薬１００μlを添加し、該反応混合物を室温で３０分間インキュベートして、発色させる。次いで、５４０nmでの吸光度を測定して、ポルホビリノーゲン合成を測定した。該反応混合物を４８時間インキュベートした後に得られた結果を以下に示す。数字は、前記反応混合物を含有する実験試料における５４０nmでの吸光度を表す。対照は、モノクローナル抗体の不在下、または酵素の不在下、または基質の不在下、同一の時間インキュベートした試料を用いて得られた５４０nmでの吸光度からなる。結果から、１１Ｂ１２がヒト赤血球溶解物において酵素的に活性なＡＬＡＤをトラップするのに適していたことが判明した。実施例IVに記載したように、鉛−ＡＬＡＤとのみ反応し、ＡＬＡＤとは反応しないモノクローナル抗体を選択することもでき、これを使用して、より高い感度のための準備をすることができる。実施例VI 体液試料中の金属陽イオンの検出のためのイムノアッセイの研究体液試料中の金属陽イオンの検出方法は、体液試料中に存在するＡＬＡＤなどの天然タンパクに結合した金属陽イオンの量を測定することによって行われた。実施例IVの記載に従って製造されたＡＬＡＤに対して特異的な抗体を使用して、キットフォーマットについて予想されるアッセイ設計において血液試料中で鉛を検出できるかを測定することができた。この実験のために使用された血液試料は、鉛に被曝したウシからのウシ血液試料であり、センター・フォー・ディジーズ・コントロール（Center for Disease Control）から入手した。前記に従って、マイクロタイタープレートのウエルにＭＡｂ１１Ｂ１２（ＡＬＡＤ特異性）を付着させた。ウシ由来の２つの血液試料からのＡＬＡＤを含有する抽出物１００μlを鉛に被曝させた。２つの試料は、８.５μg／dlの鉛を含有する方をＢＥ５９０、１５μg／dlの濃度の鉛を含有する方をＢＥ８９０と記した。ウエル中で３０分間インキュベートした後、抽出物を取り出し、プレートを洗浄し、ｍＡｂ１４Ｆ１１（鉛特異性）または１０Ｇ４（ＡＬＡＤ特異性）を含有する腹水の１：１０００希釈液１００μlを添加した。６０分間インキュベートした後、各ウエルにペルオキシダーゼ標識抗−ＩgＭ抗体を添加した。前記のようなインキュベーションおよび洗浄の後、ＡＢＴＳ１００μlを添加し、４０５nmでの吸光度を測定した。結果を以下に示す。数字は、前記に従って行ったＥＬＩＳＡにおける試料の４０５nmでの吸光度を表す。ＰＢＳと記した試料は、負の対照として供され、血液試料からの抽出物の代わりにＰＢＳのみを含有した。判明するように、本発明に従ってイムノアッセイを使用して、汚染試料中でＰbが検出された。これらの結果は、ＡＬＡＤに結合した鉛の検出について記載したアプローチが「実世界」（real world）血液試料においてそのように行うであろうということを示すので、それらは、非常に重要である。可溶性鉛への結合についてのｍＡｂ１４Ｆ１１の感度の見せかけの欠如（第４図）にかかわらず、ＡＬＡＤに結合した鉛の検出に使用するのに充分に感度が高い。前記したように、このｍＡｂは、Ｐb−ＡＬＡＤによって誘発されるので、可溶性鉛と反応するであろうが、好ましくは、ＡＬＡＤに結合した鉛と反応する。実施例VII ヘモグロビンに結合した鉛の検出鉛は、血球および血漿中に見られるタンパクの多くに結合する。赤血球の主成分であるヘモグロビンは、鉛を結合するタンパクの１つである。ゲルッケン（Ge rcken）ら、アナリティカル・ケミストリー（Anal.Chem.）、６３：２８３−２８７（１９９１）。ヘモグロビンに対する抗体および鉛に対する抗体を使用するイムノアッセイは、ヘモグロビンに結合した鉛または水銀を特異的に検出する。ヘモグロビンに対する抗体は、標準的な実験動物を使用して容易に得られ、市販品として入手可能でもある。これらの抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、微量の突然変異体に対して、または特異性サブユニットに対して、または１つの種に対して非常に特異的であっても、あるいは、あまり特異的ではなく、より交差反応性であってもよい。鉛に対する抗体は、実施例IIIの記載に従っても得られた。ヘモグロビンに結合した鉛を検出するためのイムノアッセイを行った。まず、ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体［メディックス・バイオテック・インコーポレイテッド（Medix Biotech，Inc.）から入手した］を固体基質に吸着させた。次に、非特異的吸着をブロックするための薬剤を固体基質上でインキュベートした。第３に、鉛汚染されたヒト血液からの溶解した赤血球の試料を固体基質上でインキュベートした。第４に、鉛に対して特異的なモノクローナル抗体（１４Ｆ１１）を固体基質上でインキュベートした。この後、レポーター酵素を色素産生性酵素基質とコンジュゲートさせた。最初の試料中に存在する鉛の量は、産生された色素の量と正の相関関係がある。結果から、ヘモグロビンに結合した鉛が実施例VIの記載に従って２種類の抗体を使用するイムノアッセイを使用して検出されたことが判明する。吸光度と血液−鉛値との間には良好な正の相関関係がある。かくして、ヘモグロビンに結合した鉛についてのイムノアッセイは、患者の鉛負荷の指示として使用することができる。実施例VIII 血清アルブミンに結合した鉛の検出鉛は、血球および血漿中で見られるタンパクの多くに結合する。血清の主成分である血清アルブミンは、鉛をも結合するタンパクの１つである。血清アルブミンに対する抗体および鉛に対する抗体を使用するイムノアッセイは、血清アルブミンに結合した鉛を特異的に検出することができる。血清アルブミンに対する抗体は、標準的な実験動物を使用して容易に得られ、市販品として入手可能でもある。これらの抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、例えば、微量の突然変異体に対して、または特異性エピトープに対して、または１つの種に対して非常に特異的であっても、あるいは、あまり特異的ではなく、より交差反応性であってもよい。鉛に対する抗体は、実施例IIIの記載に従って得られた。血清アルブミンに結合した鉛を検出するためのイムノアッセイを行った。まず、血清アルブミンに対するモノクローナル抗体［ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）から入手した］を固体基質に吸着させた。次に、非特異的吸着をブロックするための薬剤を固体基質上でインキュベートした。第３に、鉛汚染されたヒト血清からの試料を固体基質上でインキュベートした。第４に、鉛に対して特異的なモノクローナル抗体（１４Ｆ１１）を固体基質上でインキュベートした。この後、レポーター酵素にコンジュゲートし、次いで、色素産生性酵素基質にコンジュゲートした鉛抗体に結合する抗体レポーター酵素コンジュゲート抗体と一緒にインキュベートさせた。結果から、血清アルブミンに結合した鉛が実施例VIの記載に従って２種類の抗体を使用するイムノアッセイにおいて検出されたことが判明する。このイムノアッセイは、血液試料のＰb汚染の存在または不在について定性的にスクリーンするのに有用である。実施例IXＡＬＡＤおよびヘモグロビンに結合したＰbの検出による急性対慢性の鉛被曝の比較鉛に結合する天然タンパクは、鉛に対する急性対慢性被曝のインジケーターとして供することもできる。例えば、マウスにおいて単一被曝後にＰb⁺²とのＡＬＡＤ反応性の阻害が、３時間程度の早期に生じ、２４時間以内にピークに達し、次いで、ＡＬＡＤ活性は、被曝後２〜４日以内に正常な活性に戻ることが知られている。シュリック（Sch1ick）ら、アチーブズ・オブ・トキシコロジー（Arch. Toxicol. ）、４３：２１３（１９８０）。Ｐb⁺2のヘモグロビンへの結合は、よりゆっくりと進行し、Ｐbは、長時間、ヘモグロビンによって保持される。ＡＬＡＤおよびヘモグロビンに結合した鉛の比較を使用するイムノアッセイは、急性対慢性のＰb⁺²への被曝を診断する。ウサギは、それらの飲み水において急性および慢性Ｐb被曝させられ、ＡＬＡＤおよびヘモグロビンに結合したＰb濃度を期間中測定した。酢酸鉛は、水ボトルにおいて該動物に投与されるであろう。対照動物には、酢酸ナトリウムが供給されるであろう。処理グループは、以下のとおりである：処理１（ウサギ２〜４匹）Ｐb１０mg／kg／日で５日間処理、次いで、５週間対照処理。処理２（ウサギ２〜４匹）５週間対照処理、次いで、Ｐb１０mg／kg／日で５日間処理。処理３（ウサギ２〜４匹）ウサギをＰb１mg／kg／日で６週間処理。処理４（ウサギ２〜４匹）６週間対照処理。血液試料を処理の初日に３時間ごとに採取し、実施例VIの記載に従ってＡＬＡＤに結合したＰbについて、および、実施例VIIの記載に従ってヘモグロビンに結合したＰbについて分析するであろう。次いで、血液試料を規則的に、典型的には１週間以下に１回採取し、同様に分析するであろう。急性被曝後のヘモグロビンに結合した量と比較したＡＬＡＤに結合した検出されたＰbの量の比率は、慢性被曝後のヘモグロビンに結合した量と比較したＡＬＡＤに結合した検出されたＰbの量の比率よりも高いであろう。ＡＬＡＤに結合した鉛の量は、急性被曝後のヘモグロビンに結合した鉛の量よりも高いであろうと予想される。ＡＬＡＤに結合した鉛の量は、急性被曝と比較して慢性被曝において期間中減少するであろうと予想される。実施例Ｘ金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドの同定方法ＡＬＡＤに加えて天然ポリペプチドは、金属陽イオンに結合する能力を有し、これを使用して、体液中の金属陽イオンの存在を検出し、および／または、その量を定量化することができる。金属陽イオンに結合する他の天然ポリペプチドの同定方法、および／または、該ポリペプチドが、金属陽イオン汚染の感度が高いインジケーターであるのに低い充分な濃度の金属陽イオンを結合するかを同定するための方法としては、ウエスターンブロット法を使用することが挙げられる。ウエスターンブロット法は、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）、ハーロウ・アンド・レイン（Harlow & Lane）編、ニューヨーク州コールド・スプリングのコールド・スプリング・ハーバー、第５７１頁〜第６１０頁（１９８８）に開示されている標準的な方法に従って行われる。まず、鉛、水銀またはメチル水銀などの外因性金属陽イオンによりひどく汚染されているとは考えられない血液試料を、トリトンＸ−１００などの溶解剤で処理した。溶解剤は、血液試料中に存在する赤血球を含む細胞を溶解するように作用する。ウエスターンブロットに付された試料は、４μg／dl〜５５μg／dlの範囲のアノードストリッピングボルタンメトリー（anodic stripping voltametry ）によって測定された既知の濃度の血中鉛を有した。次いで、該試料を、トリス塩基７６.０mg、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）２g、グリセロール１０ml、 β−メルカプトエタノール５mlを含有の４Ｘ試料緩衝液と混合し、Ｈ₂Ｏで２５m lに希釈した(pＨ＝６.８)。各試料は、金属含有赤血球溶解物（可変量）、４Ｘ試料緩衝液１０μl、および蒸留Ｈ₂Ｏ４０μlを含有した。該試料を強く混合し、５分間沸騰させた。試料をトリス／グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に負荷し、該ゲルを、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（前出の文献）の記載に従って標準的な条件下で電気泳動に付した。電気泳動が完了した後、簡単な拡散、真空アシスト溶媒流、または、電気泳動溶離により、試料中のタンパクをニトロセルロース膜に移動させた。好ましい方法は、半乾燥トランスファーによる電気泳動溶離である。半乾燥トランスファー法について、ゲルニトロセルロース膜サンドイッチを、トランスファー緩衝液中に浸漬された吸収紙の間に置いた。該トランスファー緩衝液は、４８mＭトリス塩基、２Ｍグリシン、３％メタノールおよび蒸留水を含有した。ゲルトランスファー装置（アノード）の底板上で、エレクトロエリューションのためのサンドイッチは、以下のように組み立てられた：スポンジ、トランスファー緩衝液中に浸漬した吸収紙３層、Ｈ₂Ｏで湿らせたポリアクリルアミドゲル、水に浸漬されたニトロセルロース膜、およびトランスファー緩衝液中に浸漬された吸収紙３層、およびスタックの上部にある上部電極（カソード）。電極を接続し、電流を１００Ｖで４０分間流した。ニトロセルロース膜への移動後、該タンパクを特異的な抗体と反応させた。しかしながら、該膜が抗体で処理される前に、脱脂粉乳などのタンパクまたは洗浄剤溶液で膜を処理することによって、抗体の非特異的な結合をブロックした。次いで、該膜を金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。ブロッキング溶液から各膜を取り出し、ＰＢＳ中で３０分間ずつ２回洗浄した。鉛に対して特異的なモノクローナル抗体１４Ｆ１１を、浅いトレー中で、リン酸緩衝生理食塩水中の１％ポリ酢酸ビニル、５％ウシ血清、.０１％アジ化ナトリウムにおいて各膜と一緒にインキュベートした。抗体濃度は、１〜５０μg／m lであった。該膜を室温で少なくとも２時間撹拌しつつインキュベートした。インキュベーション後、膜をＰＢＳで２回、次いで、ＥＬＩＳＡ洗浄液（０.１％トリトンＸ−１００を有するＰＢＳ）で２回洗浄した。いで、膜を酵素標識第二抗体で処理した。第二抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗−マウスＩgＭ抗体である。膜および第二抗体を室温で１.５時間撹拌しつつインキュベートした。次いで、ゲルをＰＢＳで３０分間２回、次いで、ＥＬＩＳＡ洗浄液で３０分間２回洗浄した。膜をディベロープするために、膜をペルオキシダーゼ基質ＴＭＢlue［ティエスアイ,インコーポレイテッド（ＴＳＩ，Ｉnc.）］と一緒にインキュベートした。結果を第５図に示す。Ｐb５μg／dl程度の低い濃度で含有する血液試料中でレーン３、４および５に示されるようにヘモグロビンに結合した鉛を検出した。ヘモグロビンバンドは、６４,０００ダルトンで見られる。肉眼で見られる他のバンドは、炭酸脱水素酵素（２９,０００）、アルブミン（６６,０００）、トランスフェリン（７６,０００−８１,０００）、およびヘモシアニン（７０,０００）を示す。レーン２は、鉛減損赤血球溶解物試料のウエスターンブロットを表す。これらの結果は、タンパクを含有する天然金属陽イオンが本発明の金属陽イオン特異的抗体およびウエスターンブロットを使用して容易に同定することができることを示す。ウエスターンブロットによって同定されたバンドは、それらの分子量によって同定することができ、これらのバンドは、当業者に公知の方法によってさらなる特徴付けおよび同定のためにコンパニオンゲルから溶離することができる。例えば、金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドは、公知の血液ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を使用することによって同定することができる。同一条件下に付した膜は、ヒト血清アルブミンまたはヘモグロビンまたは他の公知の血液タンパクに対して特異的なモノクローナル抗体と一緒にインキュベートすることができる。種々の濃度の金属陽イオンと混合した血液試料についてウエスターンブロット結果を比較することによって、非常に低い濃度（約２５μg／dl以下）の鉛または水銀を結合するとして検出されたこれらのポリペプチドは、金属陽イオンについてのイムノアッセイにおいて使用するのに充分に感度が高いと考えることができる。ポリペプチドによる金属陽イオンの結合が試料に最初に添加された金属陽イオンの量に比例関係するかを測定することができる。実施例XIグルタチオンまたはグルタチオン金属陽イオン錯体に対するモノクローナル抗体の形成実施例Ｉの記載に従って免疫化工程に従って、グルタチオンまたはグルタチオン−水銀錯体に対して特異的なモノクローナル抗体を得た。第２表に示すように、グルタチオンＨgＣlおよび担体ウシ血清アルブミンに錯形成したグルタチオンの両方との反応性を有するモノクローナル抗体を単離し、ＥＬＩＳＡアッセイで同定した。モノクローナル抗体１Ｈ１１、２Ａ９は、ＢＡＳ−ＧＳＨ−ＨgＣlおよびＢＳＡ−ＧＳＨの両方に対して特異的であった。モノクローナル抗体３Ａ１２および３Ｈ９は、ＢＡＳ−ＧＳＨ−ＨgＣlよりも優先的にＢＳＡ−ＧＳＨに結合した。モノクローナル抗体は、さらに、それらがグルタチオン−水銀錯体またはグルタチオンに対して特異的であり、ＢＳＡ上のエピトープに対しては特異的ではないことを確実にするために特徴付けられることができる。モノクローナル抗体１Ｈ１１および２Ａ９、３Ａ１２および３Ｈ９は、グルタチオン単独またはグルタチオン−水銀錯体に結合する能力についてＥＬＩＳＡ法でアッセイすることができる。すなわち、グルタチオンまたはグルタチオン−水銀錯体を、グルタチオンまたはグルタチオン錯体をプレートに結合させる条件下でＥＬＩＳＡプレートのウエル中でインキュベートさせることができる。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、１Ｈ１１、２Ａ９、３ａ１２または３Ｈ９と一緒に室温で２時間インキュベートする。インキュベーション後、該プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたヤギ抗−マウス抗体と一緒にインキュベートした。インキュベーション後、パラニトロフェノールホスフェートを添加し、室温で１５〜３０分間のインキュベーション後、各ウエルのＡ４０５を測定した。グルタチオンまたはグルタチオン水銀錯体に対するこれらのモノクローナル抗体の各々の特異性を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて免疫反応性を検出することによって確認することができる。グルタチオンまたはグルタチオン水銀陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体は、金属陽イオンまたは金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体に対して特異的な抗体を結合する天然ポリペプチドに対して特異的な抗体として供することができる。該抗体がグルタチオンおよびグルタチオン水銀錯体の両方に対して特異的である場合、金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドに対して特異的な抗体として使用することができる。該抗体がグルタチオン水銀錯体に対して特異的なだけである場合、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体上のエピトープに対して特異的な抗体のために使用することができる。本明細書に記載した全ての特許および公開文献は、出典明示により明細書の一部とする。本発明は、好ましい具体例に関して記載されたが、多くの変更が当業者に容易に明白であり、本願は、その調節または変形をカバーするものであると解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウィリー，ドウェイン・イーアメリカ合衆国68516ネブラスカ州、リンカーン、ヒッコリー・クレスト・ロード 5641番 (72)発明者ワグナー，フレッド・ダブリューアメリカ合衆国68461ネブラスカ州、ウォールトン、ボックス・77ビー、ルート１（番地の表示なし) (72)発明者リッデル，マルコムアメリカ合衆国32983フロリダ州、ヴェロ・ビーチ、ドガリオン・レイン113301番

Claims

【特許請求の範囲】１．金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的なカプチャー抗体の有効量を、金属陽イオンを含有する体液試料と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成し；第一抗原−抗体複合体に、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体の有効量を添加して（ここで、該抗体は、実質的には、単独の天然ポリペプチドにおいて認められるエピトープと交差反応しない）、第二抗原−抗体複合体を形成し；次いで、第二抗原−抗体複合体の量を検出することによって体液中の金属陽イオンの量を測定することからなることを特徴とする動物の体液試料中の金属陽イオン検出方法。２．金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドまたはその官能性部分に対して特異的なカプチャー抗体の有効量を、金属陽イオンを含有する体液試料と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成し；第一抗原−抗体複合体に、金属陽イオンに対して特異的な抗体の有効量を添加して、第二抗原−抗体複合体を形成し；次いで、第二抗原−抗体複合体の量を検出することによって体液試料中の金属陽イオンの量を測定することからなることを特徴とする動物の体液試料中の金属陽イオン検出方法。３．金属陽イオンに対して特異的な抗体が、遷移金属、IIIａ族金属／メタロイド、および第IVａ族金属／メタロイドからなる群から選択される金属陽イオンに対して特異的なモノクローナル抗体である請求項２記載の方法。４．天然ポリペプチドに対して特異的な抗体が血液タンパクに対して特異的なポリクローナル抗血清である請求項１記載の方法。５．金属陽イオンが鉛である請求項３記載の方法。６．さらに、溶解剤を用いて体液試料中の細胞を溶解させて、金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドの放出のために準備することを含む請求項１記載の方法。７．体液が血液、尿、唾液、および脳脊髄液からなる群から選択される請求項１記載の方法。８．金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的な抗体がδ−アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヘモグロビン、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、グルタチオン、およびプロテインキナーゼＣに対して特異的な抗体からなる群から選択される請求項１記載の方法。９．金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体がδ−アミノレブリン酸デヒドラターゼ−鉛錯体に対して特異的なモノクローナル抗体である請求項１記載の方法。１０．金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドに対して特異的な抗体が基質に固定化される請求項１記載の方法。１１．金属陽イオンに対して特異的な抗体が実質的に他の金属陽イオンと交差反応しない請求項２記載の方法。１２．金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体が約１０^-4〜１０^-13の解離定数を有する請求項１記載の方法。１３．金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体が約１０^-7〜１０^-11の解離定数を有する請求項１２記載の方法。１４．金属陽イオンに対して特異的な抗体が約１０^-4〜１０^-13の解離定数を有する請求項２記載の方法。１５．金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体が検出可能な薬剤で標識化される請求項１記載の方法。１６．検出可能な薬剤が酵素である請求項１５記載の方法。１７．金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体が、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の天然ポリペプチド部分において認められるエピトープに対して特異的であるか、または、金属陽イオンと金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体内で該金属陽イオンに配位結合したポリペプチド部分との組合せに対して特異的であるが、単独の天然ポリペプチドでは認められない請求項１記載の方法。１８．金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体が金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の金属陽イオン部分に対して特異的である請求項１記載の方法。１９．金属陽イオンに対して特異的な抗体が酵素で標識化される請求項２記載の方法。２０．さらに、第二抗原−抗体複合体をイムノグロブリンに対して特異的な第三抗体と一緒にインキュベートして、第三抗原−抗体複合体を形成し（ここで、第三抗体は、検出可能な薬剤で標識化される）；次いで、検出可能な薬剤の量を検出することにより第三抗原−抗体複合体の量を検出することによって、金属陽イオンの量を測定することを含む請求項１記載の方法。２１．金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の第一エピトープに対して特異的なカプチャー抗体の有効量を、金属陽イオンを含有する体液試料と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成し（ここで、第一エピトープは、天然ポリペプチドとの金属陽イオン錯形成により得られる）；第一抗原−抗体複合体に、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の第二エピトープに対して特異的な抗体の有効量を添加して、第二抗原−抗体複合体を形成し；次いで、第二抗原−抗体複合体の量を検出することによって体液試料中の金属陽イオンの量を測定することからなることを特徴とする動物の体液試料中の金属陽イオン検出方法。２２．金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体の有効量を（ここで、該抗体は、天然ポリペプチド単独において認められるエピトープに対して特異的である）、金属陽イオンを含有する体液試料と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成し；第一抗原−抗体複合体に、金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的な抗体の有効量を添加して、第二抗原−抗体複合体を形成し；次いで、第二抗原−抗体複合体の量を検出することによって体液試料中の金属陽イオンの量を測定することからなることを特徴とする動物の体液試料中の金属陽イオン検出方法。２３．ポリペプチド当たり少なくとも２つの金属陽イオンを結合することができる金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体に対して特異的なカプチャー抗体の有効量を、金属陽イオンを含有する体液試料と接触させて、第一抗原−抗体複合体を形成し；ポリペプチド当たり少なくとも２つの金属陽イオンを結合することができる金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な第二抗体の有効量を添加して、第二抗原−抗体複合体を形成し；次いで、第二抗原−抗体複合体の量を測定することによって体液中の金属陽イオンを検出することからなることを特徴とする動物の体液試料中の金属陽イオン検出方法。２４．第一および第二抗体が同一のエピトープに対して特異的である請求項２３記載の方法。２５．金属陽イオンを結合することができる天然酵素のエピトープに対して特異的なカプチャー抗体の有効量を、金属陽イオンを含有する体液試料と接触させて（ここで、金属陽イオンは、酵素活性を阻害する）、第一抗原−抗体複合体を形成し；金属陽イオンを除去することによって抗原−抗体複合体における酵素活性を回復させ；次いで、回復した酵素活性をアッセイすることによって体液試料中の金属陽イオンを検出することからなることを特徴とする動物の体液試料中の金属陽イオン検出方法。２６．金属陽イオンを結合する第一タイプの天然ポリペプチドに結合する金属陽イオンの量を検出し（ここで、第一タイプの天然ポリペプチドは、金属陽イオンへの急性被曝後に金属陽イオンを結合することができる）；金属陽イオンを結合することができる１つ以上の第二タイプの天然ポリペプチドに結合した金属陽イオンの量を検出し（ここで、第二タイプの天然ポリペプチドは、金属陽イオンへの慢性被曝後に金属陽イオンを結合することができる）；次いで、第一タイプの天然ポリペプチドに結合した金属陽イオンの量を、１つ以上の第二タイプの天然ポリペプチドに結合した金属陽イオンの量と比較して、金属陽イオンへの被曝が急性であるかまたは慢性であるかを測定することからなることを特徴とする、動物が金属陽イオンに急性的または慢性的に被曝したかの測定方法。２７．第一タイプの天然ポリペプチドがＡＬＡＤであり、金属陽イオンが鉛である請求項２６記載の方法。２８．第二タイプの天然ポリペプチドがヘモグロビンであり、金属陽イオンが鉛である請求項２６記載の方法。２９．第一天然ポリペプチドに結合した金属陽イオンの量の検出工程が請求項１記載の方法によって行われる請求項２６記載の方法。３０．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１３３０の特徴を有する金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な抗体。３１．金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的な第一抗体の有効量；および金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体のエピトープに対して特異的な第二抗体の有効量（ここで、第二抗体は、単独の天然ポリペプチドでは認められないエピトープに対して特異的である）からなることを特徴とする動物からの体液試料中の金属陽イオン検出用キット。３２．金属陽イオンに結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的な第一抗体の有効量；および金属陽イオンに対して特異的な第二抗体の有効量（ここで、第二抗体は、検出可能な薬剤によって標識化される）からなることを特徴とする動物からの体液試料中の金属陽イオン検出用キット。３３．さらに、体液試料中に存在する細胞を溶解することができる溶解剤を含む請求項３１記載のキット。３４．金属陽イオンを結合する天然ポリペプチドに対して特異的な第一抗体が基質に固定化される請求項３１記載のキット。３５．さらに、基質を洗浄するための緩衝液を含む請求項３４記載のキット。３６．固体基質が固体支持体によって支持された膜またはコーティングである請求項３５記載のキット。３７．固体基質がディップスティックである請求項３５記載のキット。３８．固体基質が細胞培養プレート、ＥＬＩＳＡプレートおよびチューブからなる群から選択される請求項３５記載のキット。３９．溶解剤、および、金属陽イオンに結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的な抗体が固体基質に固定化される請求項３３記載のキット。４０．第一抗体が検出可能な薬剤で標識化される請求項３１記載のキット。４１．第二抗体が検出可能な薬剤で標識化される請求項３１記載のキット。４２．検出可能な薬剤が酵素である請求項４１記載のキット。４３．さらに、検出可能な薬剤を検出するための手段を含む請求項４２記載のキット。４４．検出可能な薬剤が酵素であり、検出可能な薬剤を検出するための手段が酵素との接触により色を変える酵素基質の水溶液である請求項４３記載のキット。４５．酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼであり、基質が２,２'−アジノ−［３−エチル−ベンザチアゾリン(６)］である請求項４４記載のキット。４６．さらに、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の標準量を含む請求項３１記載のキット。４７．さらに、金属陽イオン−天然ポリペプチド錯体の種々の標準量に対応する有色生成物の量の複数の視覚表示を有するカードを含む請求項４４記載のキット。４８．さらに、金属陽イオンを結合することができる天然ポリペプチドに対して特異的な複数の異なる抗体を含む請求項３１記載のキット。４９．さらに、金属陽イオンに対して特異的な複数の異なる抗体を含む請求項３１記載のキット。