JPH08512201A

JPH08512201A - プロテアーゼ活性を有する酵素

Info

Publication number: JPH08512201A
Application number: JP7503763A
Authority: JP
Inventors: ダルベイエ，ヘンリック; クリスタウ，ステファン; アンデルセン，レネ，ノンボエ; コフォーズ，レネ，ベンケ; カウッピーネン，マークス，サカリ; ベックニールセン，ジャック; ダンブマン，クラウス
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-07-06
Filing date: 1994-07-05
Publication date: 1996-12-24
Anticipated expiration: 2022-01-17
Also published as: EP0707641A1; WO1995002044A1; CN1412310A; CN1412310B; JP3868995B2; JP2004236663A; CN1127013A; AU7068994A; AU682047B2; US5998190A; ATE242803T1; CN1105184C; KR100327865B1; DK81193D0; EP0707641B1; DE69432818D1; CA2166685A1; US6190905B1; CA2166685C; FI119435B

Abstract

(57)【要約】プロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構築体であって、このDNA配列がSEQ ID No.１もしくは２に示すDNA配列、又はSEQ ID No.１もしくは２に示すDNA配列80％以上相同であるその類似配列を含んで成る、DNA構築体。このDNA配列によりコードされるプロテアーゼは酸性の至摘pHを有する。

Description

【発明の詳細な説明】プロテアーゼ活性を有する酵素発明の分野本発明はプロテアーゼ活性を有する酵素をコードするDNA構築体、この酵素を製造する方法、プロテアーゼ活性を有する酵素及びこの酵素を含む酵素調製品に関する。発明の背景プロテアーゼはペプチド結合で切断できる酵素である。酸性プロテアーゼ（即ち、酸性の至摘pHを有するプロテアーゼ）は哺乳動物及び微生物を含む多種多様な生物により生産されることが見い出されている。例えば、微生物の酸性プロテアーゼは、細菌株、例えばバチルス（Bacillus）種の株(JP 01240184)、菌類株、例えばリゾプス（Rhizopus）種の株（EP 72978）、シタリジウム（Schytalidi um）種の株(JP 48091273)、スルホロブス(Sulpholobus)種及びサーモプラズマ（ Thermoplasma）種の株（WO/9010072）、並びにアスペルギルス(Aspergillus)種の株(JP 50121486，EP 82395)により生産されることが見い出されている。 JP 3058794はＲ．ニベウス(R．niveus)由来の酸性プロテアーゼをコードする遺伝子のクローニング及びその組換発現を開示している。クリホネクチラ・パラシチカ(Cryhonectira parasitica)に由来するアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子のクローニング及び発現がChoiら（1993）に記載されている。Ta kahashiら（1991）、Inoueら（1991）及びJP 40755586は酸性プロテアーゼ（プロテアーゼＡ）をコードするアスペルギルス・ニガー(Aspergill us niger)からの遺伝子のクローニングを開示している。 Berkaら（1990）のアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)からのアスパラギン酸プロテアーゼ、アスペルギロペプシンＡをコードする遺伝子を開示している。アスペルギルス・オリザ(A．oryzae)からのアスパラギン酸プロテアーゼ、アスペルギロペプシンＯをコードする遺伝子のクローニングがBerkaら（1 993）により述べられている。アスペルギルス・オリザからの酸性プロテアーゼ（PEPA）をコードする遺伝子のクローニングはGomiら（1993）により開示されている。酸性プロテアーゼは工業的に、例えば食品及び飼料の製造において、革産業（例えば獣皮の脱毛）において、タンパク質加水分解物の製造において、並びにワインの製造及び醸造産業において幅広く利用されている。様々な用途、特に食品及び飼料産業において、単一成分の酸性プロテアーゼの要望がある。発明の概要本発明の目的は単一成分プロテアーゼを製造することにある。従って、第一の観点において、本発明はプロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構築体に関連し、このDNA配列はSEQ ID No.１に示すDNA配列又はSEQ ID No.１に示すDNA配列と80％以上相同であるその類似配列を含んで成る。第二の観点において、本発明はプロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA 配列を含んで成るDNA構築体に関連し、このDNA配列はSEQ ID No.２に示すDNA配列又はSEQ ID No.２に示すDNA配列と80％以上相同であるその類似配列を含んで成る。 SEQ ID No.１に示すDNA配列は、以降の開示においてプロテアーゼＩと呼んでいる酵素をコードする。SEQ ID No.２に示すDNA配列によりコードされる酵素はプロテアーゼIIと呼ぶ。データーベース相同性サーチにより、SEQ ID No.１及び２に示すDNA配列は一般的に新規であることが見い出された。SEQ ID No.１に示すDNA配列の、公知のプロテアーゼ遺伝子との最大の相同性は、アスペルギルス・ニガー（A．niger）酸性プロテイナーゼＡに対する74.7％であることが見い出させ、538個のヌクレオチドの重複が認められた。プロテイナーゼIIに対する最大の相同性はアスペルギルス・オリザアスペルギロペプシンＯに対する75.5％であることが見い出され、343個のヌクレオチドの重複が認められた。更なる観点において、本発明は本発明のDNA構築体を有する発現ベクター、このDNA構築体又は発現ベクターを含んで成る細胞、及びプロテアーゼ活性を示す酵素を製造する方法に関する。この方法は、前記細胞を、この酵素の生産を可能とする条件下で培養し、そしてその培養物からこの酵素を回収することを含んで成る。更なる別の観点において、本発明はプロテアーゼ活性を示す酵素に関連し、この酵素は上記の本発明のDNA構築体によりコードされるものであるか、又は本発明の方法により製造されたものである。更なる重要な観点において、本発明はプロテアーゼ活性を有する酵素であって、7.0以下のpH及び３％以下の過酸化水素の存在下で活性である酵素に関する。本明細書において、酵素について用いている「活性」なる語は、その酵素が上述の条件、例えば本明細書の実施例５に記載の条件下で基質を加水分解できる酵素を意味することを意図している。 7.0以下のpH及び３％以下の過酸化水素の存在下で活性であり、且つ実施例５に特定する条件下でレンズから80％以上のリゾチームを除去する本発明の酵素を以下の開示において「H₂O₂・安定性プロテアーゼ」と呼ぶ。この酵素は一般に新規であると信じられている。また、本発明はプロテアーゼ活性を有する酵素であって、7.0以下のpHで活性であり、且つPhe-Val又はLys-Tyr結合に対して特異的である酵素を提供する。「特異的」なる語は、その酵素が、基質がウシのグルカゴンであるときに、これらの結合を主として切断することを意味することを意図している。本明細書に記載のプロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIは本発明の酵素の好適な例である。これらの酵素は酸性プロテアーゼ、即ち、酸性の至摘pHを有するプロテアーゼであることが見い出されている。本発明により、高純度、即ち、本明細書の材料と方法の章に記載のSDSゲル電気泳動による決定に従い純度75％以上、そしてより好ましくは純度90％以上であるプロテアーゼを提供することが可能である。最後の観点において、本発明は本発明の酵素を含んで成る酵素調製品、及びタンパク質含有物質の改変又は分解を所望する様々な目的のための酵素又は酵素調製品の利用に関する。発明の詳細な説明本発明のDNA構築体、ベクター及び方法本明細書において、本発明のDNA構築体を定義するために用いている「類似体」なる語は、プロテアーゼ活性を有する酵素をコードし、且つSEQ ID No.１又は２のそれぞれに示しているDNA配列と80％以上相同である任意のDNA配列を含むものと理解される。類似なDNA配列は、以下に記載の条件下でプロテアーゼ酵素をコードするDNAと同一のプローブにハイブリダイズするDNA配列でありうる：５ＸのSSCの中での予備浸漬及び５ＸのSSC、５ＸのDenhardt、50mMのリン酸ナトリウム、pH6.8及び50μｇの変性音波処理牛胸腺DNA溶液中での１ｈで約55℃でのプレハイブリダイジング、それに続く50μCiの32-P-dCTPラベル化プローブの添加された同一の溶液の中での18ｈで約55℃でのハイブリダイゼーション、それに続く２ＸのSSC、0.2％のSDSでの55℃で30分の３回の洗浄。類似のDNA配列はSEQ ID No.１又は２に示す配列と90％以上相同であることが好ましく、その配列と95 ％以上相同であることが好ましい。類似のDNA配列は、例えば、別の生物から単離されたものであるか、又はSEQ I D No.１もしくは２に示すDNA配列をもとに、例えば別のプロテアーゼアミノ酸配列をもたらすことはないが、このDNA構築体を導入する宿主生物のコドン用法に対応するヌクレオチド置換、又は異なるアミノ酸配列をもたらし、それ故、可能としては、天然酵素とは異なる特性を有するプロテアーゼ突然変異体をもたらしうる別のタンパク質構造をもたらすヌクレオチド置換により調製されたものであってよい。可能な改変のその他の例は、その配列への１もしくは複数個のヌクレオチドの挿入、その配列のいづれかの末端への１もしくは複数個のヌクレオチドの付加、又はその配列のいづれかの末端もしくは配列内での１もしくは複数個のヌクレオチドの欠失である。更に、類似のDNA配列によりコードされるプロテアーゼはSEQ ID No.１もしくは２に示すDNA配列によりコードされる精製プロテアーゼに対して生起した抗体と免疫学的に交差反応性である。 SEQ ID No.１に示すDNA配列の類似体がハイブリダイズすることのできうるヌクレオチドプローブは、例えば以下の任意のDNA配列又は任意のそれらの組合せをもとに調製できうる：これらの配列はSEQ ID No.１に示すDNA配列又はかかる配列の類似体の部分配列を構成する。 SEQ ID No.２に示すDNA配列の類似体とハイブリダイズすることのできるヌクレオチドプローブは、例えば任意の以下のDNA配列又は任意のそれらの組合せをもとに調製できうる：これらの配列はSEQ ID No.２に示すDNA配列又はかかる配列の類似体の部分配列を構成する。本発明のDNA配列は以下を包括する一般方法により単離されうる： −適当なベクターの中で、アスペルギルス・アキュレアトゥス（A．aculeatus）由来のDNAライブラリーをクローニングする、 −このベクターで適当な酵母宿主細胞を形質転換させる、 −この宿主細胞を、このDNAライブラリー中のクローンによりコードされる任意の課題の酵素を発現させる適当な条件下で培養する、そして −かかるクローンにより生産される酵素の任意のプロテアーゼ活性を決定することにより、陽性クローンをスクリーニングする。このスクリーニング法のより詳細な説明は以下の実施例１及びその内容を引用することで本明細書に組入れるWO93/11249に示す。酵素をコードするDNA配列は例えば、アスペルギルス・アキュレアトゥス、例えばCentraalbureau voor Schimmelcutures，Delft，NLより公共的に入手できる株CBS 101.43のcDNAライブラリーをスクリーニングし、そして適度な酵素活性（即ち、タンパク質及びペプチドにおけるペプチド結合を加水分解する酵素の能力により規定されるプロテアーゼ活性）を示すクローンを選別することにより単離されうる。適切なDNA配列は標準の手順、例えば実施例１に記載の通りにして、クローンから単離されうる。同族酵素をコードするDNA配列、即ち、類似のDNA配列は、別の微生物、詳しくは菌類、例えば別のアスペルギルス種の株、特にＡ．アキュレアトゥスもしくはＡ．ニガーの株、トリコデルマ(Trichoderma)種の株、特にＴ．ハージアヌム（T ．harzianum）もしくはＴ．リージー(T．reesie)の株、フサリウム（Fusarium）種の株、特にＦ．オキシスポルム（F．oxysporum）の株、リゾプス（Rhizopus）種の株、例えばＲ．ニベウス(R．niveus)の株、シリタリジウム種の株、又はヒュミコラ（Humicola）種の株のcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることにより誘導できうるものと予測される。他方、本発明のDNA配列は、公知の手順に従って、本明細書に開示するDNA配列をもとに調製した合成オリゴヌクレオチドプローブの利用により、適当な生物由来のDNAから簡単に単離できうる。例えば、適切なオリゴヌクレオチドプローブは任意の上記の部分ヌクレオチド配列をもとに調製できうる。このDNA配列を次に組換発現ベクターの中に挿入できる。これは組換えDNA手順に簡単にかけることのできうる任意のベクターであってよく、そしてベクターの選択は往々にしてそれを導入する宿主細胞に依存するであろう。即ち、このベクターは自己複製式ベクター、即ち、染色体外質として存在し、その複製は染色体の複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであってよい。他方、このベクターは、宿主細胞の中に導入したときに、その宿主細胞ゲノムの中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製されるものであってよい。ベクターにおいて、このプロテアーゼをコードするDNA配列は適当なプロモーター及びターミネーター配列に作動連結されているべきである。このプロモーターは選択した宿主細胞の中で転写活性を示す任意のDNA配列であってよく、そしてその宿主細胞にとって内性又は外性のいづれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。このプロテアーゼをコードするDNA配列、プロモーター及びターミネーターをそれぞれライゲーションするのに用いる手順並びにそれらを適当なベクターの中に挿入するのに用いる手順は当業者に公知である（例えば、 Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor， NY，1989を参照のこと）。本発明の酵素をコードするDNA配列により形質転換させる宿主細胞は真核細胞、特に菌類細胞、例えば酵母又は糸状菌細胞であることが好ましい。特に、この細胞のアスペルギルスの種に属し、最も好ましくはアスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガーである。菌類細胞は、公知の方法での、プロトプラストの形式、及びそのプロトプラストの形質転換、それに続くその細胞壁の再生を包括する方法により形質転換されうる。宿主微生物としてのアスペルギルス・オリザの利用はEP 238,023(Novo Noridisk A/S)に記載され、その内容は引用することで本明細書に組入れる。この宿主細胞は酵母細胞、例えばサッカロマイセス(S accharomyces)の株、特にサッカロマイセス・セレビジエ(S．cerevisiae)、サッカロマイセス・クルイベリ(S．kluyveri)もしくはサッカロマイセス・ウバルム( S．uvarum)、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)種の株、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.ポンベ）、ハンセヌラ(Hansenula)種、ピチア（P ichia）種、ヤロイア（Yarrowia）種の株、例えばヤロイア・リポリチカ(Y．lip olytica)、又はクルイベロマイセス(Kluyveromyces)種、例えばクルイベロマイセス・ラクチス(K．lactis)であってもよい。更なる観点において、本発明はプロテアーゼ活性を有する酵素を製造する方法に関連し、その方法においてはこの酵素をコードする本発明のDNA構築体により形質転換された適当な宿主細胞を、この酵素の生産を可能とする条件下で培養し、そして得られる酵素をその培養物から回収する。この形質転換宿主細胞を培養するのに用いる培地は注目の宿主細胞を増殖するのに適当な適当な任意の慣用の培地であってよい。発現したプロテアーゼは好都合には培養培地に分泌され、そしてそれから、遠心又は濾過によりその培地から細胞を分離させ、硫酸アンモニウムの如くの塩によりその培地のタンパク質性成分を沈殿させ、次いでイオンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の如くのクロマトグラフィー手順を行うことを含む公知の手順により、回収できうる。本発明の酵素好ましくは、本発明のプロテアーゼ（例えばH₂O₂安定性又はLys- TyrもしくはPhe-Val特異的プロテアーゼ）は２〜７の範囲のpH、例えば6.0以下のpH、例えば２〜６の範囲のpH、そして最も好ましくは４〜６のpH範囲において活性である。この両酸性プロテアーゼは0.01〜５％の過酸化水素、例えば0.1〜５％，0.5〜４％，１〜４％、又は２〜３％の過酸化水素の存在下で活性であり、そしてコンタクトレンズの洗浄に適用できることが理解されるであろう。本発明のH₂O₂−安定プロテアーゼの好適な例は、SEQ ID No.１に示すDNA配列又はこのDNA配列と80％以上相同である上記したその類似体によりコードされる酵素である。本発明のLys-Tyr又はPhe-Val特異的プロテアーゼの好適な例はSEQ ID No.２に示すDNA配列又はこのDNA配列と80％以上相同である上記したその類似体によりコードされる酵素である。本発明の酵素のアスペルギルス・アキュレアトゥスCBS 101.43に由来する精製酵素に対して生起させた抗体と免疫学的に反応性であることが好ましく、そして SEQ ID No.１又は２に示すDNA配列によりコードされる。本明細書において、「由来する」なる語は株CBS101.43により生産されるプロテアーゼを意味するだけでなく、株CBS 101.43から単離され、且つ前記DNA配列により形質転換された宿主生物において生産されたDNA配列によりコードされるプロテアーゼも意味する。本発明のH₂O₂安定プロテアーゼ及びLys-Tyr又はPhe-Val特異的プロテアーゼは共に菌類種アスペルギルス・アキュレアトゥスの株から獲得できるが、かかる酵素は同様にその他の生物、特に微生物からも獲得できると考えられる。即ち、本発明の酵素は好ましくは細菌又は菌類、例えばアスペルギルス、リゾプス、トリコデルマ、例えばＴ．リージー又はＴ．ハージアヌム、ペニシリウム(Penicillium)、フサリウム、シタリシウム又はヒュミコラ、例えばＨ．インソレンスもしくはＨ．ラヌギノーザ(H．lanuginosa)の株、あるいはバチルスの株から獲得できる。アスペルギルス種の例には、Ａ．ニガー、Ａ・オリザ又はＡ．アキュレアトゥス、例えばＡ．アキュレアトゥスCBS 101.43が含まれる。更なる別の観点において、本発明はプロテアーゼ含有材料の分解又は改変にとって有用な酵素調製品に関連し、この調製品は上記のプロテアーゼ活性を示す酵素に富んでいる。本発明の酵素に富む酵素調製品は例えば複数種の酵素活性体を含んで成る酵素調製品、特に複数種の植物細胞壁分解酵素を含んで成る酵素調製品、例えばPect inase（商標）、Pectinex Ultra SP(商標)、ガマナーゼ、セルクラストもしくはセルザイム、又はプロテアーゼ及び／もしくはエキソペプチダーゼ含有酵素調製品、例えばNeutrase（商標）、Alcalase（商標）もしくはFlavourzyme(商標)(全てNovo Nordisk A/Sより入手可能)でありうる。本明細書において、「富む」なる語は、この酵素調製品のプロテアーゼ活性が上記の方法により調製される本発明の酵素の添加により、例えば少なくとも1.1倍の富化係数により高められていることを意味することを意図している。他方、プロテアーゼ活性を示す酵素に富むこの酵素調製品は、主要酵素成分として本発明の酵素を含んで成るもの、例えば単一成分酵素調製品であってよい。この酵素調製品は当業界に公知の方法に従って調製でき、そして液体又はドライ調製品の形態であってもよい。例えば、この酵素調製品は顆粒又は微顆粒の形態であってよい。この調製品に含ませるべき酵素は当業界に公知の方法に従って安定化されうる。本発明に係る酵素調製品は植物の細胞壁の分解又は改変のための試薬として使用されうる。エクステンシンの如くの一部のタンパク質は植物細胞壁の成分である。従って、プロテアーゼは植物細胞壁の分解又は改変を促進するであろう。かかるプロテアーゼを含む植物細胞壁分解用酵素調製品は、オリーブ及びナタネの如くの植物源からの油の抽出又はリンゴ、ナシ及びかんきつ類の如くの様々な果実からの果汁の生産の如くの多種多様な用途のために利用されうる。この酵素調製品は更に１又は複数種のその他の植物細胞壁分解酵素、例えばペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、エンドグルカナーゼ、アラビナナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンアセチルエストラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、エキソペプチダーゼ又はペクチンメチルエステラーゼを含みうる。この調製品は更に上記のエンド酵素と同じ基質に対してエクソ活性を示す１又は複数種の酵素を含みうる。本発明に係るプロテアーゼは数多くのその他の細胞壁分解酵素と同じpH及び温度条件で働き、そしてそれ故かかる用途に極めてよく適合する。更なる酵素はアスペルギルス属に属する微生物、好ましくはアスペルギルス・アキュレアトゥス、アスペルギルス・アワモリもしくはアスペルギルス・オリザ、又はトリコデルマにより生産されうる。本発明に係る酵素調製品はワイン産業においても、濁りを防止するため又は濁りを溶かすために利用でき、なぜなら往々にしてタンパク質が望ましくない濁りの形成に関与しているからである。本発明に係るプロテアーゼはワインの発酵及び熟成下の条件下で活性であり、それ故この用途にとって極めて有用である。本発明の酵素又は酵素調製品は、いわゆるハード・フラワーの軟化を獲得するためにフラワーのグルテン成分を虚弱化させる等のため、ベーキングにおいて利用されうる。ウイーク（虚弱）フラワーの利用は、非常に伸長であり、且つ弾性でないものでなければならない練り製品の製造、例えば押出ベークド製品、ビスケット及びその他の製品であって輸送及びベーキングの際にそのもとの形態が保たれていなければならない製品の製造にとって重要である。本発明のプロテアーゼはフラワーの虚弱化のために慣用的に使用されている剤、例えばメタ亜硫酸ナトリウム(SMS)に対する所望の代替品を成す。SMSの利用は潜在的な健康に対する危険性を理由に望ましくないと考えられている。このプロテアーゼ調製品はタンパク質の消化性を高めるために食品及び飼料産業においても利用できうる。例えば、この酵素又は酵素調製品は動物飼料に加えるか、又は動物飼料を加工するのに用いられうる（特に、家豚又は家禽）。これにより、飼料の成分の消化性は高まり、動物の成長率及び飼料利用率の向上がもたらされる。Brenesら（1993）を参照のこと。更に、本発明の酵素又は酵素調製品は例えば植物タンパク質、例えばダイズ(s oy)、エンドウマメ(pea)、ハウチワマメ(lupin)及びナタネ（rape）の種子タンパク質、乳製品、例えばカゼイン、食肉タンパク質又は魚類タンパク質由来のタンパク質加水分解物を作るのに有用でありうる。このプロテアーゼは、食品、飼料又はデジカル製品を作るために、溶解度、粘稠度、味又は発酵性を高めるため、抗原性を下げるため、又はその他の目的のために、タンパク質加水分解物に利用されうる。このプロテアーゼは単独で、又はその他のプロテアーゼと共に、もしくはエキソペプチダーゼの如くのその他の酵素と共に利用できうる。本発明のプロテアーゼの、エキソペプチダーゼに富む酵素調製品との一緒での利用はタンパク質加水分解物の味をよくするであろう。このプロテアーゼ調製品はタンパク質を改変するため、例えばタンパク質に原因する又はある程度原因する粘性の低下のためにも利用できうる。かかる粘性の問題はダイズ及びエンドウマメの如くの様々なタンパク質含有植物材料の加工において公知である。更に、この酵素又は酵素調製品は魚類又は肉類の加工において、例えば歯ごたえ及び／又は粘性を変えるために用いられうる。このプロテアーゼ調製品は発酵プロセス、例えば大麦、麦芽及びその他のビールの如くの製品のための原材料の酵母発酵を促進するのにも利用できうる。更に、本発明の酵素又は酵素調製品は革産業において、例えば獣皮からの脱毛において有用でありうる。このプロテアーゼの低い至摘pHは有利であり、なぜならその後の獣皮のなめし作業は酸性の条件で行われるからである。このプロテアーゼ調製品はタンパク質からのペプチドの製造にとって有用であり、この場合、その他のタンパク質分解活性物を本質的に含まないクローニングされた酵素を利用することが好都合である。更に、このプロテアーゼ調製品は様々な製品の精製を助長するもしくは品質を向上するために、例えばガム、例えばグアーガム、キサンタンガムの精製を助長するもしくは品質を向上するため、絹の脱ガムのため、又は羊毛の品質向上のために、タンパク質を分解するのに使用されうる。過酸化水素に対する安定性のため、本発明の両プロテアーゼはコンタクトレンズの洗浄、及びタンパク質含有材料を除去するため過酸化水素の利用を包括するその他の用途のために極めて有用である。以上の用途のため、本発明の酵素調製品の用量及びこの調製品を使用するためのその他の条件は当業界に公知の方法に基づいて決定されうる。本発明を添付図面で更に説明する。図１はプロテアーゼＩ及びIIそれぞれのpH活性プロフィールを示す；図２はプロテアーゼＩ及びIIそれぞれの温度活性プロフィールを示す；図３及び４はプロテアーゼＩ及びIIそれぞれのpH安定性を示す；図５及び６はプロテアーゼＩ及びIIそれぞれの温度安定性を示す；図７はコンタクトレンズの洗浄における様々なプロテアーゼの性能である；図８は本発明の酵素のグルテン伸長作用である。本発明を以下の実施例において更に詳しく説明し、ここでこれらは本発明の範囲を限定するものではない。材料と方法ドナー生物：mRNAは、ダイズ含有発酵培地の中で、十分な通気を保証するための撹拌を伴って増殖させたアスペルギルス・アキュレアトゥスCBS 101.43から単離した。菌糸を３〜５日間の増殖後に回収し、液体窒素の中で急速凍結し、そして −80℃で保存した。酵母株：使用したサッカロマイセス・セビジエ株はyNG231（MATアルファ、leu2 ，ura3-52，his4-539，pep4−デルタ１、cir＋）又はJG169（MATα；ura3-52；l eu2-3，112；his3-D200；pep4-113；prcl::HIS3；prbl::LEU2；cir＋）とした。プラスミド：酵母TPIプロモーターを含む発現プラスミドpYHD17は市販のプラスミドpYESII（Invitrogen）から調製した。プラスミド及びその構築は、その内容を引用することで本明細書に組入れるWO93/11249に更に説明してある。アスペルギルス発現ベクターpHD414はプラスミドｐ775（EP 238023に記載）の誘導体である。pHD414の構築はWO93/11249に更に説明してある。pHD414はＡ．ニガーグルコアミラーゼターミネーター及びＡ．オリザTAKAアミラーゼプロモーターを含む。全RNAの抽出：全RNAは、Chirgwinら1979及びWO93/11249に本質的に記載の通りの、グアニジニウムチオシアネートによる抽出、それに続く5.7Ｍのクッションによる超遠心により調製した。ポリ（Ａ）⁺ RNAの単離：ポリ（Ａ）⁺ RNAはオリゴ（dT）セルロースアフィニティークロマトグラフィー（Aviv & Leder，1972）により単離した。一般には、0. 2ｇのオリゴ（dT）セルロース(Boehringer Mannheim)を10mlの１Ｘのカラム装填バッファー(20mMのトリス−Cl、pH7.6、0.5ＭのNaCl、１mMのEDTA、0.1％のSDS) の中で予備膨潤させ、DEPC処理した栓付きプラスチックカラム（Poly Prep Chro matography Calumn，Bio Rad）に載せ、次いで20mlの１Ｘの装填バッファーで平衡化させた。全RNAを65℃で８min加熱し、氷の上で５min急冷し、そして１volの２Ｘのカラム装填バッファーをRNAサンプルに加えた後、カラムの上に載せた。その溶出液を回収し、そして各装填の前にそのサンプルを上記の通りに加熱し、次いで氷の上で急冷して、２〜３回再装填した。このオリゴ（dT）カラムを10vo lの１Ｘの装填バッファー、次いで３volのメディウム塩バッファー(20mMのトリス−Cl、pH7.6、0.1ＭのNaCl、１mMのEDTA、0.1％のSDS)で洗い、次いで65℃に予備加熱しておいた３volの溶出バッファー(10mMのトリス−Cl、pH7.6、１mMのE DTA、0.05％のSDS)によりポリ（Ａ）⁺ RNAを500μｌづつの画分を回収しながら溶出させた。そのOD₂₆₀を各回収画分について測定し、そしてmRNA含有画分をプールし、そして−20℃で12ｈかけてエタノール沈殿させた。ポリ（Ａ）⁺ RNAを遠心により回収し、DEPC-DIWに再懸濁し、そして５〜10μｇのアリコートとして−80℃で保存した。ノーザンブロット分析：様々な菌糸由来のポリ（Ａ）⁺ RNA(５μｇ／サンプル) を1.2アガロース−2.2Ｍホルムアルデヒドゲル（Sambrookら、1989）で電気泳動させ、次いで1OＸのSSC(Sambrookら、1989)をトランスファーバッファーとして用いてナイロン膜（Hybond-N，Amersham）にブロットした。３種のランダムプライムした(Feinberg & Vogelstein，1983)³²Ｐ−ラベル化cDNAプローブを個々のハイブリダイゼーションに用いた：１）Ａ．アキュレアトゥス由来のポリガラクツロナーゼのための1.3kbのNot Ｉ−Spe Ｉフラグメント、２）Ａ．アキュレアトゥス由来のエンドグルカナーゼＩをコードする1.3kbのNot Ｉ−Spe Ｉフラグメント、及び３）Ａ．アキュレアトゥス由来のガラクタナーゼをコードする1.2k bのEag Ｉフラグメント。ノーザンハイブリダイゼーションは５ＸのSSC(Sambroo kら、1989)、５ＸのDenhardt溶液（Sambrookら、1989）、0.5％のSDS(ｗ／ｖ)及び100μｇ／mlの変性サク精子DNAの中で、約２ng／mlのプローブ濃度で65℃で16 ｈ行い、次いで65℃で５ＸのSSC(２×15min)、２ＸのSSC、0.5％のSDS(１×30mi n)、0.2ＸのSSC、0.5％のSDS(１×30min)及び５ＸのSSC(２×15min)で洗った。 −80℃で12ｈオートラジオグラフィーにかけた後、プローブ＃１をフィルターからその製造者の仕様書に従って除去し、そしてプローブ＃２と再ハイブリダイズさせ、そして最後にプローブ＃３と再ハイブリダイズさせた。Bethesda Researc h Laboratories由来のRNAラダーをサイズマーカーとして用いた。 cDNA合成：第一鎖の合成：二本鎖cDNAを５μｇのＡ．アキュレアトゥスポリ（Ａ）⁺ RNAから、RNase H法(Gubler & Hoffman 1983，Sambrookら1989)により、ヘアーピン改良を利用して合成した。ポリ（Ａ）+ RNA(５μｌのDEPC処理中で５μｇ)を70℃ で８min加熱し、氷の上で急冷し、そして１mMづつのdNTP(Pharmacia)、40ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター(RNasin，Promega)、10μｇのオリゴ(dT)_12-18プライマー(Pharmacia)及び1000ユニットのSuper ScriptII RNase H −逆転写酵素（Bethesda Research Laboratories）を含む逆転写酵素バッファー (50mMのトリス−Cl、pH8.3、75mMのKCl、３mMのMgCl₂、10mMのDTT；Bethesda，R esearch Laboratories)により50μｌの最終容量となるように混合した。第一鎖c DNAは反応混合物を45℃で１ｈインキュベートすることにより合成した。第二鎖の合成：合成後、30μｌの10mMのトリス−Cl、pH7.5、１mMのEDTAを加え、そしてmRNA：cDNAハイブリドを、40μｇのグリコーゲン担体(Buehringer Mann heim)、0.2volの10ＭのNH₄Ac及び2.5volの96％のEtOHの添加により、−20℃で12 ｈエタノール沈殿させた。そのハイブリドを遠心に回収し、70％のEtOHで洗い、風乾し、そして100μＭづつのdNTP、44ユニットのＥ．コリ（E．coli）DNAポリメラーゼＩ（Amersham）、6.25ユニットのRNase H(Bethesda Research Laborato ries)及び10.5ユニットのＥ．コリ DNAリガーゼ(New England Biolabs)を含む25 6μｌの第二鎖バッファー（20mMのトリス−Cl、pH7.4、90mMのKCl、4.6mMのMgCl₂ 、10mMの(NH₄)₂SO₄、16μＭのβ NAD⁺）に再懸濁させた。第二鎖cDNA合成はこの反応チューブを16℃で３ｈインキュベートし、そしてその反応を20mMの最終濃度となるEDTAの添加により停止させ、次いでフェノール抽出した。マング・ビーンヌクレアーゼ処理：二本鎖（ds）cDNAを２volの96％のEtOH、0.1 volの３ＭのNaAc、pH5.2の添加により−20℃で12ｈエタノール沈殿させ、遠心により回収し、70％のEtOHで洗い、乾かし(Speed Vac)、そして36ユニットのマング・ビーンヌクレアーゼ（Bethesda Research Laboratories）を含む30μｌのマング・ビーンヌクレアーゼバッファー（30mMのNaAc、pH4.6、300mMのNaCl、１mM のZnSO₄、0.35mMのDTT、２％のグリセロール）に再懸濁した。一本鎖ヘアーピン DNAを、その反応物の30℃で30minのインキュベーション、それに続く70μｌの10 mMのトリス−Cl、pH7.5、１mMのEDTAの添加、フェノール抽出、並びに２volの96 ％のEtOH及び0.1volの３ＮのNaAc、pH5.2による−20℃で12ｈのエタノール沈殿によりクリップした。 T4 DNAポリメラーゼによる平滑末端化：ds cDNAを0.5mMづつのdNTP及び7.5ユニットのT4 DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を含む50μｌのT4 DNAポリメラーゼバッファー(20mMのトリス−アセテート、pH7.9、10mMのMgAc、50mMのKAc、１mMのD TT)の中で、その反応混合物を37℃で15minインキュベートすることにより平滑末端化した。その反応を20mMの最終濃度となるEDTAの添加により停止させ、次いでフェノール抽出及びエタノール沈殿を行った。アダプターライゲーション及びサイズ選別：フィル・イン反応の後、cDNAを非パリンドロームBstXＩアダプターに、600pmolのBstXＩアダプター及び５ユニットのＴ４リガーゼ（Invitrogen）を含む30μｌのライゲーションバッファー（50mM のトリス−Cl、pH7.8、10mMのMgCl₂、10mMのDTT、１mMのATP、25μｇ／mlの牛血清アルブミン）の中で、その反応混合物を16℃で12ｈインキュベートすることによりライゲーションした。その反応は70℃で５min加熱することにより停止させ、そしてアダプター付きcDNAをアガロースゲル電気泳動(0.8％のHSB−アガロース、FMC)によりサイズ分画して、ライゲーションしていないアダプター及び小cDNAで分離させた。このcDNAを0.7kbのカットオフ値でサイズ選別し、そしてそのcDNAをアガロースゲルから、10mMのトリス−Cl、pH7.5、１mM のEDTAの中で100ボルトで１ｈかけて電気溶離させ、フェノール抽出し、そして上記のようにして−20℃で12ｈエタノール沈殿させた。 cDNAライブラリーの構築：アダプター付きのds DNAを遠心により回収し、70％の EtOHで洗い、そし25mlのDIWに再懸濁させた。大スケールライブラリーライゲーションの前に、それぞれ１μｌのds cDNA(反応チューブ＃１−＃３)、２ユニットのＴ４リガーゼ（Invitrogen）及び50ng（チューブ＃１），100ng（チューブ＃２）及び200ng(チューブ＃３及び＃４)のBstXＩ切断酵母発現ベクターのpYES2 .0ベクター（Invitrogen）又はyHD17のいづれか、を含む10μｌのライゲーションバッファー（先と同じ）の中で４通りの試験ライゲーションを行った。ライゲーション反応は16℃で12ｈのインキュベーション、70℃で５minの加熱により行い、そして１μｌづつのライゲーションを40μｌのコンピテントＥ．コリ1061細胞（OD 600＝0.9／１リットルのLB培地；冷DIWで２回、20mlの10％のグリセロールで１回洗い、２mlの10％のグリセロールに再懸濁）にエレクトロポレーションさせた(200Ω，2.5kV，25μＦ)。各形質転換混合物に１mlのSOCを添加した後、細胞を37℃で１ｈ増殖させ、50μｌをLB＋アンピシリンプレート（100μｇ／ml ）でプレート培養し、そして37℃で12ｈ増殖させた。最適な条件を利用し、大スケールライゲーションを、９ユニットのＴ４リガーゼを含む40μｌのライゲーションバッファーの中で設定し、そしてその反応物を 16℃で12ｈインキュベートした。そのライゲーション反応を70℃で５min加熱することにより停止させ、−20℃で12ｈかけてエタノール沈殿させ、遠心により回収し、そして10μｌのDIWに再懸濁した。１μｌのアリコートをエレクロトコンピテントＥ．コリ1061細胞の中に、上記と同じエレクトロポレーション条件を利用して形質転換させ、そしてその形質転換細胞を力価検定し、そしてライブタリーを5000〜7000c.f.u.／プレートでLB＋アンピシリンプレート上でプレート培養した。各プレートに３mlの培地を加えた。細菌をかき取り、１mlのグリセロールを加え、そしてプールとして−80℃で保存した。残りの２mlをDNA単離のために用いた。DNAの量が必須の数の酵母形質転換体をもたらすのに足りないときは、大スケールDNAを50μｌの−80℃の細菌ストックで接種して一夜増殖させた500mlの培地（TB）から調製した。酵母ライブラリーの構築：酵母中の全ての細菌クローンが試験されることを保証するため、オリジナルのプール中の細菌クローン数より５倍多い数の酵母形質転換体をリミットとして用意した。個々のプール由来の１μｌのアリコートの精製プラスミドDNA（100ng／μｌ）を40μｌのコンピテントＳ．セレビジエJG169細胞(OD 600＝1.5／500mlのYPD；冷DIWで２回、冷１Ｍのソルビトールで１回洗い、0.5mlの１Ｍのソルビトールに再懸濁；Becker & Guarante，1991)にエレクトロポレーションした(200Ω，1.5k V，25μＦ)。１mlの１Ｍの冷ソルビトールの添加後、250〜400c.f.u／プレートとなるように80μｌのアリコートをSC＋グルコース−ウラシル上でプレート培養し、そして30℃で３〜５回インキュベートした。アスペルギルスにおける発現のためのcDNA遺伝子の単離：１又は複数種のプロテアーゼ生産性コロニーを50mlのガラス試験管中の20mlの YNB-1培地に接種せしめた。このチューブを30℃で２日振盪した。その細胞を10min，3000rpmでの遠心により回収した。細胞を１mlの0.9Ｍのソルビトール、0.1ＭのEDTA、pH7.5に再懸濁させた。そのペレットをエッペンドルフチューブに入れ、そして全速で30秒遠心した。細胞を0.4mlの0.9Ｍのソルビトール、0.1ＭのEDTA、14mMのβ−メルカプトエタノールに再懸濁した。100μｌの２mg／mlのZymolaseを加え、そしてその懸濁物を37 ℃で30分インキュベートし、そして30秒遠心した。そのペレット（スフェロプラスト）を0.4mlのTEに再懸濁した。1.5mlの0.05ＭのEDTA、pH8.0、0.6mlの２Ｍのトリス−Cl、pH8.0、0.6mlの10％のSDSのうちの90μｌを加え、そしてその懸濁物を65℃で30分インキュベートした。80μｌの５ＭのKOAcを加え、そしてその懸濁物を氷の上で60分以上インキュベートし、そして15分全速で遠心した。その上清液を、EtOHで満たした新鮮なチューブ（室温）に移し、完全ではあるが緩やかに混合し、そして30秒遠心した。そのペレットを冷70％EtOHで洗い、30秒遠心し、そして室温で風乾した。そのペレットを50μｌのTEに再懸濁し、そして15分遠心した。その上清液を新鮮なチューブに移した。2.5μｌの10mg／mlのRNaseを加え、37℃で30分インキュベートし、そして500μｌのイソプロパノールを緩やかに混合しながら加えた。その混合物を30秒遠心し、そしてその上清液を除去した。そのペレットを冷96％EtOHですすぎ、そして室温で風乾した。そのDNAを50μ ｌの水に約100μｌ／mlの最終濃度となるように溶かした。アスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガーの形質転換（一般手順） 100mlのYPD（Shermanら、Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor L aboratory，1981）にＡ．オリザ又はＡ．ニガーの胞子を接種し、そして37℃で約２日間振盪させながらインキュベートした。菌糸をミラクロスによる濾過により回収し、そして200mlの0.6ＭのMgSO₄ で洗った。その菌糸を15mlの1.2ＭのMgSO₄、10mMのNaH₂PO₄、pH＝5.8に懸濁した。その懸濁物を氷で冷やし、そして120mgのNovozym(商標)234バッチ1687を含む１mlのバッファーを加えた。５分後、１mlの12mg／mlのBSA(Sigma type H25)を加え、そして大量のプロトプラストがそのサンプルを顕微鏡で観察したときに見えるようになるまで37℃で1.5〜2.5時間緩やかに撹拌しながらインキュベートした。その懸濁物をミラクロスで濾過し、濾液を滅菌チューブに移し、そして５mlの 0.6Ｍのソルビトール、100mMのトリス−HCl、pH＝7.0をかぶせる。遠心を100ｇで15分行い、そしてプロトプラストをMgSO₄クッションの頂部から集めた。２容量のSTC(1.2Ｍのソルビトール、10mMのトリス−HCl、pH7.5、10mMのCaCl₂)をプロトプラスト懸濁物に加え、そしてその混合物を1000ｇで５分遠心した。そのプロトプラストペレットを３mlのSTCに再懸濁し、そして再びペレット化した。これを繰り返した。最後に、プロトプラストを0.2〜１mlのSTCに再懸濁した。 100μｌのプロトプラスト懸濁物を10μｌのSTC中の５〜25μｇの適当なDNAと混合した。プロトプラストをp3SR2(プラスミドを有するＡ．ニドゥランスamdS遺伝子)と混合した。この混合物を室温で25分放置した。0.2mlの60％のPEG 4000(B DH 29576)、10mMのCaCl₂及び10mMのトリス−HCl、pH＝7.5を加え、そして慎重に混合し（２回）、そして最後0.85mlの同じ溶液を加え、そして慎重に混合した。この混合物を室温で25分放置し、2500ｇで15分遠心し、そしてそのペレットと２ mlの1.2Ｍのソルビトールに再懸濁した。もう１回の沈降化の後、プロトプラストを適当なプレート上にまいた。プロトプラストを1.0Ｍのスクロース、pH7.0、 10mMのアセトアミド（窒素源）及び20mMのCsCl（バックグランド増殖のため）を含む最少プレート(Cove Biochem．Biophys．Acta 113（1966）51-56)上にまいた。37℃で４〜７日間インキュベート後、胞子をひろい、そして単一コロニーのためにまいた。この手順を繰り返し、そして第二回目の再単離を経た単一コロニーの胞子を特定の形質転換体として保存した。免疫学的交差反応性：免疫学的交差反応性を決定するのに用いる抗体は精製プロテアーゼの利用により調製できうる。より詳しくは、本発明のプロテアーゼに対する抗血清は、N．Axelsenらの：A Manual of quantitative Immunoelectrophor esis ，Blackwell Scientific Publications，1973，Chapter 23又はA．Johnston e and R．ThorpeのImmunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publi cations，1982(より詳しくはpp．27-31)に記載の手順に従い、ウサギ（又はその他のゲッ歯類）を免疫することにより生起させることができうる。精製したイムノグロブリンは抗血清から、例えば塩沈殿((NH₄)₂SO₄)、それに続く透析及びイオン交換クロマトグラフィー（例えばDEAE−Sephadexでの）により得られうる。タンパク質免疫化学的特性決定はOutcher lony二重拡散分析(O．Ouchterlonyの：Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir，Ed.)，Blackwell Scientif ic Publications，1967，pp．655-706)、交差免疫電気泳動により（N．Axelsen ら、前掲、Chapters３及び４）又はロケット免疫電気泳動（N．Axelsenら、Chap ter２）により行うことができる。培地： YPD：10ｇの酵母抽出物、20ｇのペプトン、810mlに至るまでのH₂O。オートクレーブにかけ、90mlの20％のグルコース（滅菌濾過）を添加。 10ＸのBasal塩：66.8ｇの酵母窒素ベース、100ｇのコハク酸、60ｇのNaOH、1000 mlに至るまでのH₂O。滅菌濾過 SC-URA：90mlの10ＸのBasal塩、22.5mlの20％のカスアミノ酸、９mlの１％のトリプトファン、806mlに至るまでのH₂O。オートクレーブにかけ、3.6mlの５％のスレオニン及び90mlの20％のグルコース又は20％のガラクトースを添加。 SC-Hブロス：アミノ酸抜きの7.5ｇ／ｌの酵母窒素ベース、11.3ｇ／ｌのコハク酸、6.8ｇ／ｌのNaOH、ビタミン抜きの5.6ｇ／ｌのカスアミノ酸、0.1ｇ／ｌのトリプトファン。121℃で20minのオートクレーブにかける。オートクレーブにかけた後、10mlの30％のガラクトース溶液、５mlの30％のグルコース溶液及び0.4m lの５％のスレオニン溶液を1000mlの培地当りに加える。 SC-Hアガー：アミノ酸抜きの7.5ｇ／ｌの酵母窒素ベース、11.3ｇ／ｌのコハク酸、6.8ｇ／ｌのNaOH、ビタミン抜きの5.6ｇ／ｌのカスアミノ酸、0.1ｇ／ｌのトリプトファン及び20ｇ／ｌのアガー(Bacto)。121℃で20minオートクレーブにかける。オートクレーブにかけた後、55mlの22％のガラクトース溶液及び1.8ml の５％のスレオニン溶液を450mlのアガー当りに加える。 YNB-1アガー：3.3ｇ／ｌのKH₂PO₄、16.7ｇ／ｌのアガー、pHを７に調整。121℃ で20minオートクレーブにかける。オートクレーブにかけた後、アミノ酸抜きの2 5mlの13.6％の酵母窒素ベース、25mlの40％のグルコース溶液、1.5mlの１％Ｌ− ロイシン溶液及び1.5mlの１％のヒスチジン溶液を450mlのアガー当りに加える。 YNB-1ブロス：組成はYNB-1アガーと同じであるが、ただしアガー抜きとする。 FG-4アガー：35ｇ／ｌのアガー、30ｇ／ｌのダイズマメミール、15ｇ／ｌのマルトデキストリン（Glucidex６）、５ｇ／ｌのBactoペプトン、pH７。121℃で40minオートクレーブにかける。 FG-4培地：30ｇ／ｌのダイズマメミール、15ｇ／ｌのマルトデキストリン（Gluc idex６）、５ｇ／ｌのBactoペプトン。121℃で40minオートクレーブにかける。 MDU-2培地：45ｇ／ｌのマルトース、１ｇ／ｌのMgSO₄・７H₂O、１ｇ／ｌのNaCl 、２ｇ／ｌのK₂SO₄、12ｇ／ｌのKH₂PO₄、0.1ml／ｌのPluronic 61Ｌ、0.5ml／ｌの微量金属溶液。pH5.0。121℃で20minオートクレーブにかける。15ml／ｌの50 ％の滅菌濾過尿素をオートクレーブの後に加えた。カゼイン上層ゲル：１％のアガロース、pH5.5のバッファー中の0.5％のカゼイン。ゲルを煮沸し、次いでその上層をアガプレート上に注ぐ前に55％にまで冷却しておく。供給バッチ式発酵Ａ．オリザによるプロテアーゼＩ又はIIの供給バッチ式発酵のために用いる培地は、炭素源としてのマルトデキストリン、窒素源としての尿素及び酵母抽出物を含んで成る。供給バッチ式発酵は、課題のＡ．オリザ宿主細胞の振盪フラスコ培養物を、3. 5％の炭素源及び0.5％の窒素源を含んで成る培地に接種せしめることにより行った。pH5.0及び34℃で24時間の培養後、炭素源及び窒素源の連続供給を開始した。炭素源を規定因子として保ち、そして酸素が過剰に存在していることを確実とした。供給バッチ式培養を４日間続け、その後酵素が回収できた。酵素の特性決定タンパク質分解活性１ヘモグロビンプロテアーゼユニット(hpu)は以下の標準条件下で１分当り１m moleの第一アミノ基を遊離せしめる酵素量と規定する（セリン標準品との比較により決定）：２％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン溶液（牛；Sigmaより供給）を、5.5のpHに調整したBritton and RobinsonのJ．Chem．Soc.，1931，p.1451に記載の万能バッファーにより調製した。２mlの基質溶液を水浴の中で25℃で10minプレインキュベートした。0.2〜0.3hpu／mlの万能バッファー(pH5.5)に相当するｂｇ／mlの酵素調製品を含む１mlの酵素溶液を加えた。25℃で30minのインキュベーション後、反応をクエンチング剤（17.9ｇのトリクロロ酢酸、29.9ｇの酢酸ナトリウム及び 19.8ｇの酢酸を含み、脱イオン水で500mlとした溶液５ml）の添加により停止させた。ブランクを試験溶液と同じようにして調製したが、ただし酵素溶液の添加前にクエンチング剤を加えておいた。その反応混合物を水浴の中に20min保ち、その後Whatman 42濾紙で濾過した。第一アミノ基は以下の通りＯ−フタルジアルデヒド(OPA)の発色により決定した：7.62ｇの四硼酸二ナトリウム・10水和物及び2.0ｇのドデシル硫酸ナトリウムを150mlの水に溶かした。４mlのメタノールに溶かした160mgのOPAを400μｌの β−メルカプトエタノールと共に加え、その後その溶液を水で200mlにした。３m lのOPA試薬に上記で得た400μｌの濾液を混合しながら加えた。340nmでの光学密度（OD）を約５min後に測定した。OPA試薬は、100mlの万能バッファー(pH5.5)中の10mgのセリンを含むセリン標準品についても行った。バッファー単独をブランクとして用いた。プロテアーゼ活性を以下の式により、OD測定値から計算した。式中、OD_t，OD_b，OD_ser及びOD_Bは、試験溶液、ブランク、セリン標準品及びバッファーのそれぞれの光学密度であり、Ｃ_serは標準品中のセリンの濃度（mg／ml）であり（この場合、0.1mg／ml）、そしてMW_s _er はセリンの分子量である（105.09）。Ｑは酵素溶液の希釈系数（この場合８）であり、そしてｔ_iは分でのインキュベーション時間である（この場合３０分）。阻害以下のインヒビターを試験した：ペプスタチン（アスパラギン酸インヒビター）（１mM） PMSF（セリンプロテアーゼインヒビター）（0.1％） PEFABLOC（セリンプロテアーゼインヒビター）（0.1％） EDTA（金属プロテアーゼインヒビター）（0.1Ｍ） PEFABLOCはPentapharm，Basel、スイス国より入手、それ以外はSigmaより入手した。残留活性はpH5.5でHPU／ｌとして決定した。 pH活性プロフィールは様々なpH値（４〜８）でHPU／ｌとして決定した。 pH安定性は酵素溶液（0.3HPU／ｌ）を50℃及び様々なpH値（４−５−６−７− ８）で30，60及び120分放置し、そして放置前後のタンパク質分解活性を測定することにより決定した。温度活性プロフィールは様々な温度（15〜70℃）でHPU／ｌとして決定した。温度安定性は酵素溶液（0.3HPU／ｌ）をpH５及び様々な温度（20−40−50−60 ℃）で30，60及び120分放置し、そして放置前後のタンパク質分解活性を測定することにより決定した。 SDSゲル電気泳動及び等密点電気泳動はPharmaciaのPhast-Systemで、その製造者の仕様書に従い、勾酸８〜25及びIEF３〜９を利用して行った。特異性本発明のプロテアーゼの特異性は下記のようにして決定した：万能バッファーpH5.5(前述)中の0.5mlの１mg／mlのヒトインスリン又はウシグルカゴン並びに同じバッファー中の75μｌのプロテアーゼＩ及びIIそれぞれ（0. 6hpu／ｌ）を37℃で120minインキュベートした。反応は50μｌの１Ｎの塩酸の添加により停止させた。インスリン又はグルカゴン分子はいくつかのペプチドフラグメントに切断された。これらを、適切なＣ−18カラム（Hibar LiChrosorb RP-18；５μｍ粒子；Me rck AG，Darmstadt，FRGより供給）を用いる逆相HPLCにより単離した。そのフラグメントを以下の溶媒：Ａ．0.2Ｍの硫酸ナトリウム及び0.1Ｍのリン酸、pH2.5；Ｂ．アセトニトリル／水、50％；を用い、90％のＡ／10％のＢから80％のＡ／20％のＢに至る０〜５分間の線形勾配、それに続く80％のＡ／20％のＢにより50分かけて溶出させた。単離したフラグメントを、L．Thimら、「Secretion of human insulin by a transformed yea st cell」TEBS Letters 212(2)，1987，p307に記載の通りにして、Applied Bios ystems（Foster City，CA，USA）モデル470Ａガス相シーケンサーを用いる自動エドマン分解、並びにフェニルチオヒンダントイン（PTH-）アミノ酸の高性能液体クロマトグラフィーによる分析によってアミノ酸配列決定にかけ、これによりインスリン又はグルカゴン分子中の切断部位を同定した。実施例１ 150のプールにおいて約1.5×10⁶の個別クローンより成るＡ．アキュレアトゥス由来のクローンを構築した。 DNAをこのライブラリー由来の20の個別のクローンから単離し、そしてcDNA挿入についての分析にかけた。挿入頻度は＞90％として認められ、そして平均インサートサイズは約1400bpであった。いくつかのプール由来のDNAを酵母に形質転換し、そして200〜500の酵母コロニーを含む50〜100枚のプレートが各プールから得られた。３〜５日の増殖後、アガープレートを数セットのアガープレートにレプリカプレートした。１セットのプレートを30℃で２〜４日間インキュベートし、そしてプロテアーゼ活性の検出のためにカゼイン上層ゲルをかぶせた。30℃で一夜のインキュベーション後、プロテアーゼ陽性コロニーは、白色の輪光（ハロ）により囲まれたコロニーとして同定した。酵素陽性コロニー由来の細胞を単一コロニー単離のためにアガー上にまき、そして同定したプロテアーゼ生産性コロニーそれぞれについて酵素生産性単一コロニーを選別した。単一コロニーとして陽性コロニーを獲得し、cDNAインサートをビオチニル化ポリリンカープライマーを用いて酵母コロニーから直接増幅し、磁性ビーズ(Dynab ead M-280，Dynal)システムにより精製し、そして個別に連鎖停止法（Sangerら1 977）及びSequenaseシステム(United States Biochemical)を用い、各cDNAクローンの５′末端の配列決定により特性決定した。２つの酵素遺伝子のDNA配列はそれぞれSEQ ID No.１及び２に示す。次いで、このプロテアーゼをコードするcDNAを上記の通りにして、アスペルギルスの中での発現のために単離し、そして標準の手順を利用してＥ．コリに形質転換させた。２つのＥ．コリのコロニーを各形質転換体から単離し、そしてDNA インサートを切り出す制限酵素HindIII及びXba Ｉにより分析した。これらのクローンのうちの１つ由来のDNAを酵母株JG169に再形質転換した。いくつかの陽性クローンのDNA配列を決定した。プロテアーゼをコードする２つのDNA配列をそれぞれSEQ ID No.１及び２に示す。実施例２アスペルギルスにおいて遺伝子を発現させるため、cDNAを各ファミリーの１又は複数の代表体から、上記の手順を利用し、Hind III／Xba Ｉ又はその他の適当な制限酵素による消化、ゲル上でのサイズ分画及び精製により単離し、その後の pHD 414へのライゲーションによりプラスミドpA1P1及びpA1P2を得た。Ｅ．コリでの増幅後、プラスミドをＡ．オリザ又はＡ．ニガーに、上記の一般手順に従って、形質転換させた。Ａ．オリザ形質転換体の試験各形質転換体をTG-4アガーを有するペトリ皿の中央に接種した。30℃で５日間のインキュベーション後、直径４mmのプラグをコークスクリューによりそのコロニーの中央から取り出した。そのプラグを、pH5.5のバッファーに0.5％のカゼイン及び１％のアガロースを含むカゼイン上層ゲルに埋め込み、そして40℃で一夜インキュベートした。プロテアーゼ活性は上記のようにして決定した。形質転換体の一部は輪光を有し、それはアスペルギルス・オリザバックグランドよりも有意に大きかった。このことは、アスペルギルス・オリザにおけるプロテアーゼの有効な発現を実証する。最大のプロテアーゼ活性を有する８つの形質転換体を選別し、そしてYPG−アガー上で保持した。選択した８つの形質転換体それぞれをYPG−アガースラントからFG-4及びMDU-2 培地を有する500mlの振盪フラスコ上に接種した。良好な通気を確実なものとするための十分な撹拌を伴う３〜５日間の発酵の後、培養液を2000ｇで10分遠心し、そして上清液を分析した。各上清液15μｌを、カゼイン上層ゲル（直径13cmのペトリ皿中25ml）の中にあけられた直径４mmの穴の中に加えた。プロテアーゼ活性はインキュベーションによる白色輪光の形成により同定した。供給バッチ式発酵次に、プロテアーゼＩ及びIIのそれぞれを、上記の手順を用い、酵素を発現するＡ．オリザの供給バッチ式発酵により製造した。実施例３プロテアーゼＩ及びIIの特性決定上記の供給バッチ式発酵により得られる上清液を、上記の材料と方法に記載の通りに実施する特性決定のために用いた。タンパク質分解活性は上記の手順を利用してpH5.5でHPU／ｌとして測定した。阻害試験は以下の結果を示す：ペプスタチンによるプロテアーゼIIの阻害は、それがペプシン型のアスパラギン酸プロテアーゼであることを示す。プロテアーゼＩはペプスタチンにより阻害されず、それ故アスパラギン酸プロテアーゼとしては積極的に同定されなかった。一方、pH５での至摘活性は、それが酸性プロテアーゼであることを示す。 pH活性プロフィールを図１に示す。両酵素はpH５で至摘活性を有し、そしてプロテアーゼＩはプロテアーゼIIよりも狭い範囲で活性であることが示された。即ち、プロテアーゼＩはpH４〜６の範囲で60％以上の活性を示し、一方、プロテアーゼIIはpH４〜７の範囲で60％以上の活性を示す。 SDSゲル分析により、プロテアーゼＩ及びIIのそれぞれの分子量は23,000及び37,000kDaであると推定された。IEF分析から、両酵素のpIは約４と推定された。図２は温度活性プロフィールを示す。それは両酵素についてやや似ていたが、ただし至摘温度はやや異なり、プロテアーゼＩは50℃、そしてプロテアーゼIIは 45℃であった。図３及び４はpH安定性を示す。各pHに関して、ゼロ時間活性を100％に設定し、従ってそれらの得られる絶対値は異なっている。両プロテアーゼはpH４及び５で安定であった。pH６ではプロテアーゼＩは不安定であり、一方プロテアーゼII は一定の安定性を有していた（30分、40％の残留活性）、両酵素ともpH７で不安定であった。図５及び６は温度安定性を示す。各温度に関し、ゼロ時間活性を100％に設定し、そして得られる絶対値は異なっていた。両プロテアーゼとも50℃までは安定であり、そして60℃で不安定であった。プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIによるインスリン又はグルカゴンの加水分解により得られる結果に基づいて、プロテアーゼIIはインスリンとは反応せず、一方両プロテアーゼともグルカゴンは加水分解することがわかった。プロテアーゼはやや非特異的なプロテアーゼであり、一方プロテアーゼIIはより特異的であるものと考えられうる。プロテアーゼIIはウシのグルカゴン（その配列はBromer ，Sinn，and Behrens，J．Amer．Chem．Soc.，Vol．79，p2807，1958に示されている）において見い出せるLys-Tyr及びPhe-Val結合を切断できることがわかった。実施例４粘性低下のための本発明のプロテアーゼの利用ダイズフラワー（脱脂して皮をむいたダイズマメより調製）を95℃でペレット化し、そして粉砕した。ダイズフラワーを15％のドライ物質となるように脱イオン水に懸濁した。ドライ物質のｇ当り５ mgのプロテアーゼＩ酵素タンパク質及びドライ物質のｇ当り５mgのプロテアーゼ II酵素タンパク質のそれぞれをダイズスラリーに加えた。このスラリーを40℃及びpH５〜６でインキュベートした。そのスラリー中の粘度を、１，２及び24時間のインキュベーション後に、brookfield LV DV III粘度計で、スピンドル＃31を有する小サンプルアダプターを用い、250rpmで測定した。残留粘度は下記の通りであった。実施例５コンタクトレンズの洗浄のための本発明のプロテアーゼの利用コンタクトレンズ洗浄の分野において、コンタクトレンズの効果的な消毒及び洗浄の両方を得ることが通常必須である。コンタクトレンズを消毒する最も有効な方法の一つはそれらを３％のH₂O₂を含むpH3.5の溶液に20分以上浸すことにある。レンズを目に装着する前にH₂O₂は例えばカタラーゼ又はプラチナディスクで中和する。残念ながら、このような苛酷な条件下で良好な効果を有することが示されている商業的に関心のもたれているプロテアーゼは今日までなく、従ってH₂ O₂中和の後にプロテアーゼを添加してそのコンタクトレンズ上のタンパク質付着物を取り除くめんどうな第２工程が必要とされている。ブタのペプシンは現状用いられているプロテアーゼ（スブチリシン・カールスバーグ（Subtilisin carls berg）よりは優れているが、しかし往々にして哺乳動物の生成物にはウイルスが結合しているため、問題がある。本発明のプロテアーゼＩ及びIIをそれぞれ、コンタクトレンズから変性タンパク質を除去する能力について試験した。これらを現状用いられているセリンプロテアーゼ、更にはブタのペプシンと比較した。ただし、後者は商業的観点よりはむしろ技術的観点から関心がもたれる。実験プロトコールは下記の通りにした：材料：メンドリリゾチーム、Ｌ−6878（Sigma）「Rythmic」コンタクトレンズ（Essilor）（II型レンズ、ハイ・ウォーター、非イオン性）プロテアーゼＩは上記の通りに製造プロテアーゼIIは上記の通りに製造ブタのペプシンＰ−6887（Sigma）スブチリシン・カールスバーグ（Clear-lens Pro（商標）（No vo Nordisk A/S）。標準バッファー：0.05M Na₂HPO₄，0.9% NaCl pH7.5 試薬バッファー：0.05M Na₂HPO₄，0.9% NaCl，3%H₂O₂，pH3.5 シンチレーション液、オプチフェース「HiSafe III」 Sigma由来のメンドリリゾチームを還元性メチル化により¹⁴Ｃでラベルし、そして精製した。溶液は0.05ＭのNa₂HPO₄，0.9％のNaCl及び0.2mg／mlのリゾチームpH7.5を含むように調製した。¹⁴Ｃ−ラベル化リゾチームの量は、CPM（カウント／分）が約2 00,000となるようにした。1.0mlの溶液をシンチレーションガラスに移した。コンタクトレンズを加え、そしてそのガラスを85℃の湯浴の中に30分入れておいた。次いでコンタクトレンズを３×３mlの試薬バッファーですすいだ。それを外科用メスで４等分にした。４等分したものそれぞれを、３mlの試薬バッファーを含む新鮮なシンチレーションガラスに移し入れた。様々な量の試験すべきプロテアーゼを、0.1，0.5，2.5，５，12 .5，50及び200μｇの酵素タンパク質／ml試薬バッファーの最終濃度となるように加えた。反応は25℃で４時間行った。４等分にしたレンズを２×３mlの標準バッファーですすいだ。12mlのシンチレーション液を加え、そしてCPMをPackard 2500 TR液体シンチレーションカウンターで測定した。各プロテアーゼの評価のためには４枚のレンズを必要とした：二重測定を２日間にわたり行い、そしてブラインド対照を各レンズにといて必要とした。消毒／洗浄の際にレンズから除去されたリゾチームの相対量を各４等分にしたレンズの質量バランスから計算した。図７は様々なプロテアーゼの性能のグラフ図を示す。両プロテアーゼともコンタクトレンズの洗浄の目的に非常に適していた。プロテアーゼＩは他のプロテアーゼよりも非常に優れていることがわかった。プロテアーゼIIは性能においてブタのペプシンに非常に近く、一方、現状利用されているセリンプロテアーゼは劣った性能を示した。本発明の酸性プロテアーゼの更なる利点は、涙液において見い出せる中性pHにおける低い活性である。このことはもしレンズが消毒／洗浄の後に適切にすすがれていないときの刺激の危険性を低くする。実施例６ベーキングのための本発明のプロテアーゼの利用手順： 10ｇのケーキフラワーに5.9ｇの水を加えた。この水は様々な濃度のプロテアーゼＩ、プロテアーゼII及びNeutrase（商標）(Novo Nordisk A/Sより入手可能）を含む。その練り製品をGlutamic 2200ミキサーで１分混合した。次いでそれをプラスチックバッグに入れ、そして32℃で25minインキュベートした。その後、その練り製品をGlutamicミキサーを用いて２％のNaCl（水溶液）で洗い、デンプンを取り除き、且つ練り製品にグルテンが残るようにした。次いでグルテン塊を均質となるまで手でころがし、そして高さ約0.5cm、直径2 .5cm、そして中央に穴を有するシリンダーの形にプレスした。そのグルテン塊をその形に25℃で30minプレスしておいた。次に、そのグリテンシリンダーをフックにひっかけ、そして２ｇのおもりを穴の中に入れた。全てを25℃の水に浸した。その後グルテンシリンダーの伸長を、それが破断するまで15分毎に測定した。酵素はAnson ユニットベース（AU）に基づいて投与した。最初は、Neutrase（商標）にとって最適な用量である7.5mAU／kgフラワーで試みた。（タンパク質分解活性の決定のためのAnson−ヘモグロビン法では、変性ヘモグロビンを25℃の温度でpH7.5で、10minの反応時間で消化した。未消化のヘモグロビンをトリクロロ酢酸(TCA)で沈殿させ、そしてTCA可溶性生成物の量をフェノール試薬で決定した。これはチロシン及びトリプトファンにより青色を発する。１AUは、１ミリ当量のチロシンと同じ色調をフェノール試薬で発色させるTCA可溶性生成物の量を１分当り遊離させるような一次速度でヘモグロビンを消化する酵素の量である。）図８は酵素抜きでの並びにNeutrase（商標）、プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIによるグルテンの伸長曲線を示す。これらの曲線は同じ酵素投与量での６〜７回の測定の平均である。見ての通り、３種のプロテアーゼの全ての添加が、より速いグルテンの伸長を招いた。 7.5mAU／kgフラワーの投与量のプロテアーゼＩは同じ投与量のNe utrase（商標）ほどグルテンを虚弱化させなかった。グルテンシリンダーは破断するまでより長く伸び、そして伸長速度は小さかった。この系においては可能な最大量である2.3mAU／kgフラワーのプロテアーゼIIの添加はグルテンを7.5mAU／kgのNeutrase（商標）とほぼ同じぐらいに虚弱化させた。グルテンはやや遅く破断し、そして曲線の形は同一ではなかった。このことは、プロテアーゼIIがAUベースに基づいて、グルテンの虚弱化についてNeutrase （商標）よりも約３倍の効率を有することを示す。まとめると、本発明のプロテアーゼはグルテンの虚弱化のための慣用的に利用されている化学品（幅広く利用されているその代表例はSMS(メタ亜硫酸ナトリウム)である）にとって代わる所望の代替品を成す。実施例７動物飼料のための本発明のプロテアーゼの利用粉砕した脱脂済みの飼料級ダイズを以下の条件で脱イオン水を混合した。胃及び小腸のpH条件をシュミレートするために加水分解を２段階で行った。本発明のプロテアーゼIIの性能をBio-Feed Proのそれと比較した。Bio-Feed ProはBrenes ら、1993により、ブロイラーの飼料として用いたときに向上した体重増及び飼料効率をもたらすことが実証されている。加水分解条件： Bio-Feed Pro（商標）はNovo Nordisk A/Sより入手した。プロテアーゼIIは上記の通りに獲得した。これらの酵素を開始時の０分目において加えた。加水分解中、^oBrix及び重量オスモル濃度を反応経過を追跡するために測定した。 Adler-Nissen（1986）に従うと、重量オスモル濃度の値は以下の式により加水分解度（DH）の計算のために用いることができる：ここで、Δは重量オスモル濃度mOSMの上昇、Ｓ％はタンパク質濃度、ωは浸透圧計についての較正係数、ｈ_totはタンパク質基質中のペプチド結合の総数（meq v／ｇタンパク質）、そしてｆ_osmは％をｇ／kg H₂Oに変換する係数である。更に、加水分解混合物のＮ−成分のスルホサルチル酸可溶性相の平均分子量を 90分（第１段階）、並びに0.15及び180（第２段階）の後に分析した。分子量分析は以下の方法により行った。１．原理サンプルを希釈し、濾過し、そしてグル浸透クロマトグラフィー(GPC)モードで作動させた液体クロマトグラフィー系に注入した。この分離技術は十分に規定された孔直径を有する孔をもつ多孔質粒子で充填されたカラムを介する液体フローを利用する。様々な分子サイズを有するペプチド溶液をカラムに流したとき、小ペプチドは孔の中に流入でき、一方大きなペプチドは孔から排除されるであろう。即ち、溶液中のペプチドはその分子サイズ（及び分子量）に従って分離され、大きなペプチドは小さなペプチドよりも速くカラムから溶出する。カラム出口にある検出器は溶出液を連続的に測定する。このクロマトグラフィー系は、既知の分子量を有するペプチドで較正する。２．クロマトグラフィー装置 2.1 HPLC系は高圧ポンプ WATERS M 510、流速0.7ml／min．インジェクター WATERS WISP M 710 検出器 WATERS M 440 214nmまでの波長エクステンションより成る。 2.2 GPC カラム、一式に接続された３本のTSK G 2000 SW ×Ｌ、7.8mm×300mm 、周囲温度で運転。 2.3 積分／データー処理 Waters 820 MAXIMA SIMクロマトグラフィーデーターシステム(810／820 GPCオプション付き)。３．試薬 3.1 リン酸バッファー NaH₂PO₄・2H₂O 3.2 塩化アンモニウム NH₄Cl 3.3 トリフルオロ酢酸(TFA)，CF₃COOH 3.4 アセトニトリル CH₃CN 3.5 移動相： 0.1％のTFA及び25％のアセトニトリルを含む0.05Ｍのリン酸バッファー／0.5 Ｍの塩化アンモニウム溶液４．詳細 4.1 較正クロマトグラフィー系は既知分子量を有するいく種かのペプチド標準品の注入により較正した。各標準品の分子量を、そのカラムからペプチドを溶出するのに必要な移動相の観察容積に対して半対数的にプロットした。最少二乗法計算により、最も良くフィットする三次式を導いた。この曲線は較正曲線を示す。 4.2 分析サンプルを移動相に約５mg／mlとなるように希釈／溶解した。この溶液を22μ ｍのフィルターで濾過し、そしてその20μｌをクロマトグラフィーに注入した。検出応答、対、溶出容積を記録した。記録した曲線−クロマトグラフィー図−は、サンプルの実際の分子量分布を示す。集積した重量分布及び平均分子量計算のため、クロマトグラフィー図を小タイム（及び溶出・容積）セグメントに分割した。各セグメントを溶出容積及びインターバル間のクロマトグラフィー図の面積により特性決定した。５．計算結果は重量及び数平均分子量で表わす結果 ^oBrix，mOSM及び％DH値を以下の表に示す。分子量分析の結果を以下に示す：見かけ上の分子量はpHを6.5にすると大きくなり、なぜなら未消化のダイズタンパク質はpH4.0よりもpH6.5でのほうがより可溶性であるからである。プロテアーゼIIはBio-Feed Proよりも多くのタンパク質及びペプチドを遊離させ、且つ多くのタンパク質を分解することがわかり、従ってプロテアーゼIIはBi o-Feed Proより優れているものと考えられる。本発明のプロテアーゼIIは酸性pH域において至摘活性を有するため、この酵素は動物の胃において直ちに働き、それ故若い動物のための飼料に用いたときにBi o-Feed Proに比べて飼料効率の総合的な向上が達せられる。上記の結果はこの所見を裏付けする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/62 Ｃ１２Ｒ 1:69） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アンデルセン，レネ，ノンボエデンマーク国，デーコー―3460 ビルケレーズ，リンデヘイバイ９ (72)発明者コフォーズ，レネ，ベンケデンマーク国，デーコー―4350 ウゲルレーゼ，ブローフェルデバイ８ (72)発明者カウッピーネン，マークス，サカリデンマーク国，デーコー―2200 コペンハーゲンエン，エゲガーデ 10，５ (72)発明者ニールセン，ジャックベックデンマーク国，デーコー―2900 ヘレルップ，オレオルセンスアレ 12 (72)発明者ダンブマン，クラウスデンマーク国，デーコー―2860 セーボルイ，ヘーイエグラサクセ 61，７．テーホー

Claims

【特許請求の範囲】１．プロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構築体であって、ここでこのDNA配列はSEQ ID No.１に示すDNA配列又はSEQ ID No.１に示すDNA配列と80％相同であるその類似配列を含んで成る、DNA構築体。２．プロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構築体であって、ここでこのDNA配列はSEQ ID No.２に示すDNA配列又はSEQ ID No.２に示すDNA配列と80％相同であるその類似配列を含んで成る、DNA構築体。３．タンパク質分解活性を示す酵素をコードする前記DNA配列が微生物から獲得したものである、請求項１又は２記載のDNA構築体。４．前記DNA配列が糸状菌又は酵母から獲得したものである、請求項３記載のD NA構築体。５．前記DNA配列が、アスペルギルス、リゾプス、トリコデルマ、ペニシリウス、フサリウム、シタリジウム又はヒュミコラの株から獲得したものである、請求項４記載のDNA構築体。６．前記DNA配列がアスペルギルスの株、特にアスペルギルス・アキュレアトゥス、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザの株から獲得したものである、請求項５記載のDNA構築体。７．前記DNA配列がアスペルギルス・アキュレアトゥスCBS 101.43のDNAライブラリーを基礎に単離又は製造されたものである、請求項６記載のDNA構築体。８．請求項１〜７のいづれか１項記載のDNA構築体を含んで成る組換発現ベクター。９．請求項１〜７のいづれか１項記載のDNA構築体又は請求項８記載の組換発現ベクターを含んで成る細胞。 10．真核細胞、特に菌類細胞、例えば酵母細胞又は糸状菌細胞である、請求項９記載の細胞。 11．前記細胞がアスペルギルスの株、特にアスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザの株に属する、請求項10記載の細胞。 12．タンパク質分解活性を示す酵素を製造する方法であって、請求項９〜11のいづれか１項記載の細胞をその酵素の生産が可能な条件下で培養し、そしてその培養物からこの酵素を回収することを含んで成る方法。 13．請求項１〜７のいづれか１項記載のDNA構築によりコードされる、又は請求項12記載の方法により製造される、タンパク質分解活性を示す酵素。 14．７以下のpH及び５％以下の過酸化水素の存在で活性である、プロテアーゼ活性を有する酵素。 15．ウシのグルカゴン中のPhe-Val又はLys-Tyr結合を好適に加水分解する、プロテアーゼ活性を有する酵素。 16．アスペルギルス・アキュレアトゥスCBS 101.43由来の精製プロテアーゼに対して生起された抗体と免疫学的に反応性であり、且つSEQ ID No.１又は２に示すDNA配列によりコードされる、請求項13〜15のいづれか１項記載の酵素。 17．微生物から獲得できる、請求項13〜17のいづれか１項記載の酵素。 18．細菌又は菌類から獲得できる、請求項17記載の酵素。 19．アスペルギルス、リゾプス、トリコデルマ、ペニシリウム、フサリウム、シタリジウム又はヒュミコラの株から獲得できる、請求項18記載の酵素。 20．アスペルギルス・アキュアトゥスの株から獲得できる、請求項19記載の酵素。 21．請求項13〜20のいづれか１項記載のプロテアーゼ活性を示す酵素に富む、植物細胞壁の成分の分解のために有用な酵素調製品。 22．１又は複数種のその他の植物細胞壁分解酵素、例えばペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、エンドグルカナーゼ、アラビナナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、エキソペプチダーゼ又はペクチンメチルエステラーゼを更に含んで成る、請求項21記載の調製品。 23．タンパク質含有物質の分解又は改変のための、請求項13〜20のいづれか１項記載の酵素又は請求項21もしくは22記載の酵素調製品の利用。 24．コンタクトレンズの洗浄のための、請求項13〜20のいづれか１項記載の酵素又は請求項21もしくは22記載の酵素調製品の利用。 25．ベークド製品の調製のための、請求項13〜20のいづれか１項記載の酵素又は請求項21もしくは22記載の酵素調製品の利用。 26．動物飼料の調製のための、請求項13〜20のいづれか１項記載の酵素又は請求項21もしくは22記載の酵素調製品の利用。