JPH08512406A - 肝炎ｅ型ウイルス確認アッセイ及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 検査試料中に存在し得る抗ＨＥＶ抗体の存在を検出するために有用なアッセイ、試薬及び検査キット。アッセイ方法は、（ａ）試料を、抗ＨＥＶ抗体に特異的に結合する１種類以上の合成ペプチドに、ペプチド／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で接触させ、（ｂ）前記ペプチド／抗体複合体を、抗ヒト抗体に接合したシグナル発生化合物からなる指示試薬に接触させ、ペプチド／抗体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、（ｃ）検査試料中の抗ＨＥＶ抗体の存在を示す測定可能シグナルを検出することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】 肝炎Ｅ型ウイルス確認アッセイ及び試薬発明の背景 本発明は、一般的には肝炎Ｅ型ウイルス（ＨＥＶ）に関し、より特定的には、 検査試料中のＨＥＶに対する抗体の存在を確認するために有用なアッセイに関す る。 水系伝染、流行性、又は腸伝染非Ａ非Ｂ型肝炎（ＥＴ−ＮＡＮＢＨ）といった ように様々に呼ばれるＨＥＶは世界中に分布しており、発展途上国ではウイルス 性肝炎の大半の風土性発生の原因であることが確認された。Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌ ｅｙら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４４２−４６１（１９９０）。先進国 でも、ＥＴ−ＮＡＮＢＨの散発性症例、及び旅行者によってもたらされた感染が 報告されている。Ｓ．Ｊ．Ｓｋｉｄｍｏｒｅら，Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１５４ １（１９９１）。主な伝染経路は糞便−経口であるが、ある疫学研究によれば、 限定された人−人感染経路も示唆された。Ｏ．Ｖｅｌａｓｑｕｅｚら，Ｊ．Ａｍ ｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ． ３６３：３２８１−３２８５（１９９０）。この病 気は、妊娠７ケ月〜９ケ月の妊 婦が感染した場合には死亡率が高く、約２０％であることが実証されている。Ｄ ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙら、前出文献参照。 ＨＥＶの推定病原体の分子クローニングは、ウイルスに感染する組織培養シス テムが存在しないために、これまで実現しなかった。しかしながら、入手可能な 動物モデルの使用及び新たに開発された非特異的増幅方法によって、ＨＥＶビル マ株に感染したシノモルガス（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）マカクの胆汁から得られ る固有のｃＤＮＡクローンが同定された（「ＥＴ１．１」と命名）。Ａ．Ｇ．Ａ ｎｄｊａｐａｒｉｄｚｅら，Ｖｏｐｒ．Ｖｉｒｕｓｏｌ．１：７３−８０（１９ ８６）、Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８４：６２７７−６２８１（１９８７）、及びＧ．Ｗ．Ｒｅｙｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３３５−１３３９（１９９０）。このクローンのウ イルス起源の確認の成功により、ソマリア、タシケント、ボルネオ、パキスタン 及びメキシコでのＥＴ−ＮＡＮＢＨの流行の際に採取されたヒト糞便試料中で類 似の配列が同定された。Ｇ．Ｒ．Ｒｅｙｅｓら，前出文献参照。メキシコのＥＴ −ＮＡＮＢＨの発生時に採 取されたヒト糞便試料から、ｃＤＮＡライブラリーも形成された。Ｇ．Ｒ．Ｒｅ ｙｅｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，Ｊａｐｏｎ．２６：１４２−１４７（ １９９１）。 これらのｃＤＮＡライブラリーのイムノスクリーニングの結果、ＨＥＶに特異的 なエピトープをコードする二つのｃＤＮＡクローンが同定された。Ｐ．Ｏ．Ｙａ ｒｂｏｕｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５７９０−５７９７（１９９１）。一 組の重複ｃＤＮＡクローンの単離及び配列解析の結果、この形態の肝炎は、他の 特性解析されたウイルス性肝炎病原体のいずれとも分子的に異なる新しいウイル スに起因することが判明した。Ａ．Ｗ．Ｔａｍ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５ ：１２−１３１（１９９１）。 ＨＥＶゲノムの種々の領域がクローニングされ、大腸菌内で、グルタチオン− Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現された。例え ばＳ．Ｊ．Ｓｋｉｄｍｏｒｅら，前出文献参照。これらの組換え抗原のうちの４ 個、即ちＨＥＶビルマ（Ｂ）株に由来する２個と、ＨＥＶメキシコ（Ｍ）株に由 来する２個は、以前にＨＥＶにさらされた個体に由来する抗体によって認識され る抗原部位を含むことが判明した。Ｐ．Ｏ．Ｙａｒｂｏｕｇｈら、 前出文献参照。メキシコ株由来の二つの抗原であるＭ３−２及びＭ４−２は、そ れぞれ第二読取り枠（ＯＲＦ−２）及び第三読取り枠（ＯＲＦ−３）のカルボキ シ末端のアミノ酸配列に対応する。ビルマ株由来の二つの抗原であるＢ３−２及 びＢ４−２は、それぞれＯＲＦ−２及びＯＲＦ−３のカルボキシ末端のアミノ酸 配列に対応する。Ｍ３−２及びＢ３−２組換え抗原はどちらも、ＯＲＦ−２のカ ルボキシ末端からの４２個のアミノ酸を含む。これらの４２アミノ酸配列の間の アミノ酸相同度は９０．５％である。前出文献参照。Ｍ４−２及びＢ４−２組換 え抗原はいずれも、ＯＲＦ−３のカルボキシ末端からの３３個のアミノ酸を含む 。これら二つの３３アミノ酸配列の間の相同度は７３．５％である。前出文献参 照。 Ｍ３−２、Ｍ４−２、Ｂ３−２及びＢ４−２組換え抗原は、個体の検査試料を 抗ＨＥＶ抗体に関してアッセイすることにより個体内のＨＥＶ抗体の存在を決定 するためのアッセイで使用されてきた。しかしながら、組換え技術の使用は偽陽 性の結果をもたらし得る。これは、主に二つの理由に起因し得る。第一の理由は 、所望の組換え抗原の製造方法が、これらの抗原を微生物培養、通常は細菌又は 酵母源 の培養で製造することからなるという点にある。この操作の間には、細菌又は酵 母タンパク質が組換え抗原と同時に精製される。従って、精製組換え抗原をアッ セイで捕捉相に使用したときには、同時精製された細菌又は酵母タンパク質も存 在することになる。検査試料は、組換え抗原及び同時精製細菌タンパク質のいず れか又は両方に対する抗体を有し得る。同時精製タンパク質に対する抗体を有す る検査試料を、検査試料中の所期の対象分析物に対する抗体を捕捉するために使 用される目的の組換え抗原の存在下に反応させると、検査試料中の抗体は同時精 製タンパク質の方に結合する。検査試料が同時精製細菌又は酵母タンパク質と反 応すると偽陽性反応が生起し得、所期の対象分析物に関しての「陽性」と誤認す る。第二の理由は、組換えＨＥＶ抗原がＧＳＴ中の融合タンパク質として発現さ れることにある。周知のように、個体の中にはＧＳＴに対する抗体を産生するも のがある。従って、クローニングされ、ＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌 内で発現されたＨＥＶ組換え抗原を使用するアッセイでも偽陽性反応が起こり得 る。なぜなら、ＧＳＴにだけ反応し得る個体の場合にも、組換えタンパク質を捕 捉抗原として使用した場合、ＨＥＶ 特異的対象分析物に対する抗体のアッセイで陽性反応を示し得るからである。更 に、商業的使用に必要な大量の組換え抗原の製造には特別の製造設備が必要であ り得、商業的使用に必要な厳密な規則条件が多い範囲内での組換え抗原の製造は 問題であることが多い。 ＨＩＶのような病原体ではスクリーニングアッセイの結果の存在を確認するた めの方法があるが、これらの技術はＨＥＶの存在の確認にはまだ使用できない。 例えば、ＨＥＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養及びウエスタンブロット検査のような方 法は使用できない。ＨＥＶ核酸の検出はＰＣＲの実施によって試み得るが、この 方法は手間と費用がかかり、サーモサイクラーのような特殊な装置を必要とし、 所要時間が２４時間に及ぶ。抗ＨＥＶ抗体の存在の確認には免疫電子顕微鏡法（ ＩＥＭ）が使用されてきたが、ＩＥＭの使用は日常的な確認手段としては費用の 制約がある。 従って、検査試料中のＨＥＶ抗体の存在を確認するための、正確で、迅速で費 用効率の高い方法を提供することは、有益なことであろう。発明の概要 本発明は、検査試料中の抗ＨＥＶ抗体の存在を確認する ためのアッセイを提供する。このアッセイは、（ａ）検査試料を、抗ＨＥＶ抗体 に特異的に結合する１種類以上の合成ペプチドと、ペプチド／抗体複合体の形成 に十分な時間及び条件下で接触させ、（ｂ）前記ペプチド／抗体複合体を、抗ヒ ト抗体に接合したシグナル発生化合物からなる指示試薬と接触させ、ペプチド／ 抗体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、（ｃ）検 査試料中の抗ＨＥＶの存在を示す測定可能なシグナルを検出することからなる。 本発明で使用するＨＥＶ合成ペプチドのアミノ酸配列は、Ｐ．Ｏ．Ｙａｒｂｏ ｕｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：５７９０−５７９７（１９９１）に記載の ような予測されたアミノ酸配列から得た。これらの合成ペプチドには、ＳＰＭ４ ２（配列番号１、組換え抗原Ｍ４−２に対応）、ＳＰＢ４２（配列番号２、組換 え抗原Ｂ４−２に対応）、ＳＰＢ３３（配列番号３、組換え抗原Ｂ３−２に対応 ）及びＳＰＭ３３（配列番号４、組換え抗原Ｍ３−２に対応）がある。 本発明は、抗ＨＥＶ抗体の存在について検査試料をアッセイするために有用な 本発明の合成ＨＥＶペプチドを１種 類以上含むキットも提供する。発明の詳細な説明 本発明は、肝炎Ｅ型ウイルス（ＨＥＶ）に対する抗体の検出に有用なアッセイ 、合成ペプチド及びキットを提供する。本発明の配列は合成手段で製造されるた め、ＧＳＴ中で製造された組換えタンパク質に伴う問題がなく、又は、しばしば 組換え抗原と同時精製される外来細菌もしくは酵母タンパク質も含まない。従っ て、本明細書で開示する合成ペプチドは、当業者に公知の組換え抗原と比べて、 これらの組換えタンパク質が有する交差反応性の問題がないため有利である。 合成ペプチドは、種々のアッセイで使用される以外に、ＣＮＢｒ活性化セファ ロースと類似のマトリクスに接合して、細胞培養物又は生物組織、例えば血液及 び肝臓から、ＨＥＶ抗原に特異的な抗体をアフィニティ精製するために使用する ことができる。また、本発明の合成ペプチドは、治療及び他の類似用途に使用す るためのキメラ、モノクローナル又はポリクローナル抗体の製造にも使用できる 。 本明細書で開示する本発明の合成ペプチドは、単独で又は組合わせて使用し得 る。例えば、本発明の１種類以上の ペプチドを単一固相に接合して種々のアッセイシステムで使用し得る。あるいは 、個々のペプチドを微粒子のような固相に別個に接合し、同様に処理した別の微 粒子と組合わせてアッセイで使用してもよい。こうしたアッセイでは、アッセイ のペプチド及び／又はペプチド濃度を変えることによって最適化できる。アッセ イを最適化する方法は当業者によく知られている。接合方法は当業者に幾つか知 られており、例えばコーティング及び共有結合が挙げられる。 本明細書に記載の本発明の方法によって検査できる「検査試料」としては、所 期の抗体を含む可能性があるヒト又は動物の体液、例えば全血、血清、血漿、脳 脊椎液、尿、腹水もしくは他の任意の身体構成成分又は任意の組織培養上清が挙 げられる。 本明細書で使用する「固相」という用語は、不溶性であるか又は後続の反応に よって不溶性にできる任意の物質を意味する。固相としては、捕捉試薬を引き付 け固定する能力が本来備わっているものを選択し得る。あるいは、捕捉試薬を引 き付け固定する能力を有する別の受容体を保持できる物質を固相として使用する 。別の受容体としては、捕捉試薬自体又は捕捉試薬に結合した帯電物質と逆の電 荷を 有する帯電物質が挙げられる。あるいは、受容体分子は、固相上に固定され（固 相に接合し）て、特異的結合反応を介して捕捉試薬を固定することができる任意 の特異的結合員であってもよい。受容体分子は、アッセイの実施前又はアッセイ の実施中に、捕捉試薬を固相物質に間接的に結合させる事ができる。従って固相 は、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び他 の当業者に公知の形状のプラスチック、誘導体化プラスチック、磁性もしくは非 磁性金属、ガラス又はケイ素からなる表面であり得る。 固相は、検出抗体によるアクセスに十分な多孔率と、抗原に結合するのに適し た表面親和性とを有する、任意の適当な多孔性物質からなることも考えられ、そ れも本発明の範囲内に包含される。通常はミクロ多孔質構造が好ましいが、水和 状態でゲル構造を有する物質も使用し得る。この種の有用な固体支持体としては 、天然高分子炭水化物及びこれらを合成的に改質、架橋又は置換した誘導体、例 えば寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアーゴム、セルロース エステル、特に硝酸及びカルボン酸とのエステル、混合セルロースエステル及び セルロースエーテ ル；窒素含有天然ポリマー、例えばタンパク質及び架橋もしくは改質ゼラチンを 含む誘導体；天然炭化水素ポリマー、例えばラテックス及びゴム；適度に多孔性 の構造を有するように製造し得る合成ポリマー、例えばビニルポリマー、具体例 として、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ 酢酸ビニル及びその部分加水分解誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレ ート、前記重縮合物のコポリマー及びターポリマー、例えばポリエステル、ポリ アミド及び他のポリマー、例えばポリウレタン又はポリエポキシド；多孔質無機 材料、例えばアルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩又は炭酸塩、具体例と して硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム；アルカリ金属、アルカリ 土類金属、アルミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩；アルミニウム又はケイ素 の酸化物又は水和物、例えばクレー、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト 、シリカゲル又はガラス（これらの物質は前記ポリマー物質と共にフィルターと して使用し得る）；並びに前述の物質類の混合物又はコポリマー、例えば先在す る天然ポリマーに合成ポリマーを重合せしめたグラフトコポリマーが挙げられる 。これらの物質はいずれも、フィルム、 シート又はプレートのような適当な形態で使用し得、あるいは紙、ガラス、プラ スチックフィルム又は布のような適当な不活性担体にコーティング、結合又は積 層し得る。 ニトロセルロースの多孔質構造は、モノクローナル抗体を含む広範囲の試薬に 対して優れた吸収性及び吸着性を示す。ナイロンも類似の特性を有し、やはり適 当な物質である。 前述のような多孔質固体支持体は、厚さ約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは 約０．１ｍｍのシートの形態を有するのが好ましいと考えられる。孔径は広範囲 で変化し得、好ましくは約０．０２５〜１５ミクロン、特に約０．１５〜１５ミ クロンである。この種の支持体の表面は、抗原又は抗体を支持体に共有結合させ る化学的操作によって活性化し得る。このようにすれば抗原又は抗体の不可逆的 結合が得られるが、通常は十分に解明されていない疎水性の力による多孔質物質 上への吸着によって結合する。 フロースルー・アッセイ装置用の好ましい固相材料としては、多孔性ガラス繊 維材料又は他の繊維マトリクス材料のような濾紙が挙げられる。この種の材料の 厚さは重要でなく、主にアッセイする試料又は対象分析物の特性、例え ば検査試料の流動性に応じて選択すべきものである。 固相の本来の電荷を変えるか又は増加させるために、帯電物質を前記材料に直 接コーティングするか、又は後で固相支持材料に保持されることになる微粒子に コーティングし得る。あるいは、微粒子をカラム内に保持するか又は可溶性試薬 と検査試料との混合物中に懸濁して、固相として使用することもでき、又は粒子 自体を固相支持材料によって保持し固定することもできる。「保持し固定する」 という表現は、支持材料の表面又は内部の粒子が、支持材料内の他の場所に実質 的に移動できない状態を意味する。粒子は、当業者が任意の適当な種類の粒状物 質の中から選択し得、具体例としては、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート 、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニ トリル、ポリカーボネート又は類似の物質からなるものが挙げられる。粒子の大 きさは重要でないが、粒状の平均直径は使用する支持材料の平均孔径より小さい ことが好ましい。このように、他の種々の固相を使用する具体例も考えられ、本 発明の範囲内に包含される。例えば、欧州特許公開第０３２６１００号に対応す る同時係属米国特許出願第１５０，２７８号及び米国特許 出願第３７５，０２９号（欧州特許公開第０４０６４７３号）に記載されている 、負電荷ポリマーとの固定化可能反応複合体を固定するためのイオン捕捉操作を 本発明で使用して、高速溶液相免疫化学反応を実施することができる。固定化可 能な免疫複合体を、負電荷のポリアニオン／免疫複合体と、予め処理した正電荷 の多孔質マトリクスとの間のイオン交換によって反応混合物の残部から分離し、 前述のシグナル発生システム、例えば欧州特許公開第０，２７３，１１５号に対 応する同時係属米国特許出願第９２１，９７９号に記載の化学発光シグナル測定 を用いて検出する。 本発明の方法は、微粒子技術を用いるシステム、例えば固相が微粒子からなる 自動化及び半自動化システムでの使用に適合させることもできる。この種のシス テムとしては、公開欧州特許出願第０４２５６３３号及び第０４２４６３４号に それぞれ対応する係属米国特許出願第４２５，６５１号及び米国特許第５，０８ ９，４２４号、並びに米国特許第５，００６，３０９号に記載のものが挙げられ る。 「指示試薬」は、抗ＨＥＶ抗体用の特異的結合員に接合していて、外部手段に よって検出できる測定可能シグナル を発生するシグナル発生化合物（標識）を含み得る。本明細書で使用する「特異 的結合員」という用語は、特異的結合対、即ち、一方の分子が化学的又は物理的 手段を介して他方の分子に特異的に結合する二つの異なる分子のうちの一員を意 味する。指示試薬は、抗ＨＥＶ抗体用の特異的結合対の抗体又は抗体フラグメン トからなる結合員である外に、ハプテン−抗ハプテン系、例えばビオチン又は抗 ビオチン、アビジン又はビオチン、炭水化物又はレクチン、相補的ヌクレオチド 配列、エフェクター又は受容体分子、補酵素又は酵素、並びに酵素阻害剤又は酵 素等のいずれかを含む任意の特異的結合対の一員であり得る。 使用可能な種々のシグナル発生化合物（標識）としては、発色体；触媒、例え ばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー ゼ等のような酵素；発光化合物、例えばフルオレセン及びローダミン、化学発光 化合物、例えばアクリジニウム、フェナントリジニウム、ジオキセタン、ルミノ ール等；放射性元素；及び直接可視標識が挙げられる。いずれの標識を選択する かは重要でないが、それ自体で、又は１種類以上の別の物質と協働してシグナル を発生できるものがよい。 本発明の合成ペプチドは、抗ＨＥＶ抗体の定性検査で事前に反応性（又は「陽 性」）であるとされた検査試料中の、抗ＨＥＶ抗体の存在を確認するための種々 のアッセイシステムで使用できる。これらのペプチドは、組換え抗原Ｍ４−２に 対応する配列番号１、組換え抗原Ｂ４−２に対応する配列番号２、組換え抗原Ｂ ３−２に対応する配列番号３、及び組換え抗原Ｍ３−２に対応する配列番号４と して同定されている。第一の実施態様で、本発明は、（ａ）検査試料を１種類以 上のＨＥＶ合成ペプチドと接触させ、得られた混合物を、ペプチド／抗体複合体 の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートするステップと、（ｂ）前記ペ プチド／抗体複合体を、検出できる測定可能シグナルを発生することができるシ グナル発生化合物に接合した抗ヒト抗体又はそのフラグメントからなる指示試薬 と接触させ、この第二の混合物を、ペプチド／抗体／指示試薬複合体の形成に十 分な時間及び条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）検査試料中の抗Ｈ ＥＶの存在を示すものとしてシグナル発生化合物から発生した測定可能シグナル を検出するステップとを含むアッセイを提供する。好ましくは、捕捉ペプチドを 、アッセイで使用する前に固相に結合する。 固相を使用する場合は、シグナル発生化合物の検出の前に液相から固相を分離し 得る。また、ステップ（ａ）及び（ｂ）は同時に実施できる。本発明では、いず れのアッセイ実施態様でも検査試料を希釈することができ、本明細書に記載の全 てのアッセイ手順のステップの合間に洗浄を実施し又は実施し得る。 あるいは、事前に抗ＨＥＶ抗体に対して反応性を示した検査試料を、抗ＨＥＶ 抗体に特異的に結合するＨＥＶ抗原（免疫応答［例えば抗体産生」を誘発する、 ＨＥＶでコードされたアミノ酸の配列）からなる溶液相捕捉試薬と接触させ、抗 体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートする。次いで抗 体／抗原複合体を、最初のステップで使用したＨＥＶ抗原内に存在するアミノ酸 を含む合成ＨＥＶペプチドからなる固相捕捉試薬と接触させる。複合体及び固相 を、ペプチド／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートする 。次いで、固相を溶液から分離し、測定可能シグナルを発生することができるシ グナル発生化合物に接合したモノクローナルもしくはポリクローナル抗ヒト抗体 又はそのフラグメントからなる指示試薬と接触させて混合物を形成する。この混 合物を、ペ プチド／抗体／指示試薬複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベート する。固定した抗体の存在は、発生した測定可能シグナルの検出によって決定さ れる。発生したシグナルの量が最初のスクリーニングと比べて減少していれば、 検査試料中に抗ＨＥＶ抗体が存在していることになる。 別の実施態様では、少なくとも一つのＨＥＶ合成ペプチドをニトロセルロース 膜上に固定する。このペプチドをニトロセルロース膜上に固定する前に、このペ プチドに別のペプチドを結合もしくは架橋するか、又はこのペプチドを種々の担 体タンパク質、例えばＢＳＡ、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブ ミン等に結合もしくは架橋することもできる。検査試料を、ペプチド／抗体複合 体の形成に十分な時間及び条件下で、膜上でインキュベートする。非結合タンパ ク質を除去した後、膜をシグナル発生化合物で標識した抗ヒト抗体からなる指示 試薬と共にインキュベートする。検査試料の抗ＨＥＶ抗体の存在及び／又は量は 、測定可能シグナルの検出によって決定される。シグナルの量は、検査試料中に 存在する抗ＨＥＶ抗体の量に依存する。 他の種々の固相を使用する別の実施態様も考えられ、本 発明の範囲内に包含される。例えば、いずれも本出願人によるもので本明細書に 参考として包含される、欧州特許公開第０３２６１００号に対応する同時係属米 国特許出願第１５０，２７８号及び米国特許出願第３７５，０２９号（欧州特許 公開第０４０６４７３号）に記載されている、負電荷のポリマーで固定化可能反 応複合体を固定するためのイオン捕捉方法を本発明で使用して、高速溶液相免疫 化学反応を行うことができる。固定化可能免疫複合体を、負電荷のポリアニオン ／免疫複合体と予備処理した正電荷の多孔質マトリクスとの間のイオン交換によ って反応混合物の残部から分離し、前述の種々のシグナル発生システム、例えば 本明細書に参考として包含される本出願人の欧州特許公開第０２７３１１５号に 対応する同時係属米国特許出願第９２１，９７９号に記載の化学発光シグナル測 定を用いて検出する。 本発明の方法は、微粒子技術を用いるシステム、例えば固相が微粒子からなる 自動化及び半自動化システムでの使用に適合させることもできる。この種のシス テムとしては、公開欧州特許出願第０４２５６３３号及び第０４２４６３４号に それぞれ対応する係属米国特許出願第４２６，６５ １号及び第４２６，６４３号に記載のものが挙げられる。これらの先行特許出願 は本明細書に参考として包含される。 イムノアッセイ用の走査型プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）の使用も、本発明の合 成ペプチドに容易に適用できる方法である。走査型プローブ顕微鏡法、特に原子 力顕微鏡法では、捕捉相、例えば本発明の合成ペプチドのうちの一つ以上を固相 に付着し、固相表面に存在し得る抗原／抗体複合体を走査型プローブ顕微鏡で検 出する。走査型トンネル顕微鏡法を使用すれば、抗原／抗体複合体を検出するた めに多くのイムノアッセイシステムで通常使用しなければならない標識の必要が なくなる。この種のシステムは、本明細書に参考として包含される本出願人の係 属米国特許出願第６６２，１４７号に記載されている。 特異的結合反応をモニターするためのＳＰＭの使用は様々に実施し得る。ある 実施態様では、特異的結合相手（本発明の合成ペプチドである抗体特異性物質） の一結合員を、走査に適した表面に接合する。抗体特異性物質の接合は、当業者 の公知の方法に従い、プラスチック又は金属面からなる固相を含む試験片への吸 着によって行い得る。あるい は、誘導体化プラスチック、金属、ケイ素又はガラスの固相を含む試験片への特 異的結合相手（抗体特異性物質）の共有結合を使用してもよい。共有結合の方法 は当業者に公知であり、例えば試験片に特異的結合相手を不可逆的に結合する様 々な手段がある。試験片がケイ素又はガラスの場合は、特異的結合相手を結合す る前に表面を活性化しなければならない。アミノ、ビニル及びチオールのような 反応基を導入するためには、それぞれトリエトキシアミノプロピルシラン（Ｓｉ ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている）、 トリエトキシビニルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，Ｍｉｌｗａ ｕｋｅｅ，ＷＩ）及び（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（Ｓｉｇ ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）のような活性化シラン化合物を使用し得る。このよ うな活性化表面は結合相手を直接結合するために使用でき（アミノ又はチオール の場合）、又は活性化表面を更にグルタルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル ）スベレート、ＳＰＰＤ９（スクシンイミジル３−［２−ピリミジルジチ］プロ ピオネート）、ＳＭＣＣ（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１− カルボン酸スクシンイミジル）、Ｓ ＩＡＢ（［４−ヨードアセチルアミノ］安息香酸スクシンイミジル）及びＳＭＰ Ｂ（４−［１−マレイミドフェニル］酪酸スクシンイミジル）のようなリンカー と反応させて、表面から結合相手を分離し得る。ビニル基は、共有結合手段を得 るために酸化し得る。この基は、ポリアクリル酸のような種々のポリマーの重合 のためのアンカーとして使用することもできる。その場合は、特異的結合相手の ための複数の結合点を得ることができる。アミノ面は、異なる大きさ及び能力の 親水性リンカーを得るために、種々の分子量の酸化デキストランと反応させ得る 。酸化可能デキストランの具体例としては、デキストランＴ−４０（分子量４万 ダルトン）、デキストランＴ−１１０（分子量１１万ダルトン）、デキストラン Ｔ−５００（分子量５０万ダルトン）、デキストランＴ−２Ｍ（分子量２百万ダ ルトン）（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから市販 されている）、又はＦｉｃｏｌｌ（分子量７万ダルトン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ社，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている））が挙げられる。ま た、１９８８年１月２９日出願の係属米国特許出願第１５０，２７８号及び１９ ８９年７月７日出願の第３７５，０ ２９号に記載の方法及び化学手段を用いて、高分子電解質相互作用により特異的 結合相手を試験片表面に固定してもよい。前記特許出願はいずれも本出願人によ るもので、本明細書に参考として包含される。好ましい接合方法は共有接合であ る。特異的結合相手の接合に次いで、非特異的接合を最小にするために、表面を 血清、タンパク質又は他の阻止剤のような物質で更に処理してもよい。表面はま た、アッセイの目的に対する適性を確認するために、製造場所又は使用場所で走 査し得る。走査プロセスが試験片の特異的結合特性を変えることはないと考えら れる。 本発明は固相の使用が好ましいことを明らかにするが、本発明のペプチドは非 固相アッセイシステムでも使用できる。これらのアッセイシステムは当業者に公 知であり、本発明の範囲内に含まれるとみなされる。 アッセイに使用する試薬は、アッセイで使用するペプチド又はペプチド混合物 のような別個の試薬を入れたバイアル又はビンのような容器を一つ以上含むキッ トの形態で提供できると考えられる。これらのキットは、アッセイの実施に必要 な別の試薬、例えば洗浄試薬、処理試薬及び指示試薬のバイアル又は容器も含み 得る。 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を 明らかにするものであって、限定するものではない。 実施例１ 合成ペプチドの合成 Ａ． ＳＰＢ４２（配列番号２）の合成 完全に保護したペプチド樹脂を、Ｇ．Ｂａｒａｎｙ及びＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆ ｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，（Ｅ．Ｇｒｏｓｓ及びＴ．Ｍｅｉｎｈｏ ｅｆｆｅｒ編）２，１−２８４（１９８０），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹの方法に従い、段階的固相合成（カルボキシル末端残基 から始める）によって下記のようにフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂 上に組み立てた。Ｃ末端アミノ酸アルギニン（Ａｒｇ）をオキシメチルフェニル アセトアミドメチル（ＯＭＰＡ）結合を介して固体支持体に結合し、トリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）での長時間の処理に対しても安定性の高いＰＡＭ樹脂を得た。 ＢＯＣ−Ａｒｇ（ＴＯＳ）−ＯＣＨ₂−ＰＡＭ−樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、 ０．１６１４８ｇ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（ＡＢＩ）ペ プチド合成器モ デル４３０Ａ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから市販されている）の 反応容器に移した。カルボキシル末端からＮ末端までの後続アミノ酸の総てを、 キャッピングを含むＡＢＩの０．１ｍｍｏｌ小規模高速サイクル手順（ＡＢＩ、 製品番号［Ｐ／Ｎ］６０１７８１、バージョン１．４０）を用いて段階的に結合 した。保護アミノ酸を、予め形成した対称性無水物化学を用いて結合した。但し 、アスパラギン、グルタミン、アルギニン及びヒスチジンは、Ｎ，Ｎ’−ジシク ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｈ ＯＢＴ）化学を用いて二重結合した。最初の結合では、ジメチルホルムアミド（ ＤＭＦ）中に溶解した無水酢酸を用いて保護アミノ酸を結合した。個々のアミノ 酸の酢酸との無水物を塩化メチレン中で形成し、次いで溶剤をＤＭＦと交換し、 その後ペプチド合成器の反応容器に移した。対称性無水物による第二の結合はＤ ＭＦ中で実施した。使用した総てのアミノ酸のＮ−アミノ基をｔ−ブチルオキシ カルボニル（ｔ−ＢＯＣ）結合によって保護した。種々のアミノ酸の側鎖官能基 を下記の基で保護した： Ｓｅｒ−Ｂｚｌ（ベンジル） Ａｓｐ，Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（Ｏ−ベンジル） Ｈｉｓ−ＤＮＰ（ジニトロフェノール） Ａｒｇ−Ｔｏｓ（トシレート） 完全に保護したペプチド樹脂（０．３３８ｇ）を塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃｌ₂） 中で５分間膨潤させた。このペプチド樹脂を手動反応容器に移し、ＤＭＦ中５％ チオフェノールで２０分間の処理を２回実施し、各処理後に１分間のＣＨ₂Ｃｌ₂ 洗浄を６回行い、次いで合成器の反応容器に移した。次いで、製造業者指定手順 （ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従い、ＣＨ₂Ｃｌ₂中６０％ＴＦＡ を用いてｔ−ＢＯＣ保護基を除去し、部分的に脱保護したペプチド樹脂を、実験 室真空下、室温で一晩乾燥した。 次いで、部分的に脱保護したペプチド樹脂を無水フッ化水素（ＨＦ、９ｍｌ） 中のｐ−クレゾール（１ｍｌ）で０℃で２時間処理して、樹脂支持体からペプチ ドを開裂した。ＨＦ／ＤＭＳ及び他の揮発物質を真空下０℃で留去した。開裂ペ プチド及び樹脂を１５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、開裂ペプチド を１０ｍｌずつの４０％酢酸水溶液及び１６％酢酸水溶液でそれぞれ３回洗浄し て抽出した。水性抽出物をまとめて、１５ｍｌずつのジエチルエ ーテルで３回洗浄し、次いで凍結乾燥して未精製ペプチドを得た。 未精製ペプチドの純度を、Ｃ４、４．６×３０ｍｍカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｔｈ ｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）での逆相 高性能液体クロマトグラフィーを使用し、流速１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡ水 溶液（Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）を溶媒系として用いて分析した。 このペプチド分析に使用した好ましい溶媒勾配は、２０％Ｂ溶媒から始めた。カ ラムを２０％Ｂに５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で５０％Ｂま で増加させ、１分間維持した。最後に、カラムを２分間で２０％Ｂに戻した。流 出液中のペプチドの存在を２２５ｎｍ及び２５４ｎｍで同時に監視した。精製ペ プチドの組成を酸加水分解によって測定した。酸を除去した後、加水分解物をＢ ｅｃｋｍａｎ ６３００アミノ酸分析計で分析した。 精製ポリペプチドを大量に得たい場合には、半分離用逆相高性能液体クロマト グラフィーを、Ｃ１８、１０×１００ｍｍカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｔｈｅ Ｓｅｐ ａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて、 前記と同じ０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００アセトニトリル（Ｂ）溶媒系 を使用して、類似の方法で実施した。半分離操作の好ましい溶媒勾配は２１％Ｂ で開始し、３ｍｌ／分で５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で４０ ％Ｂまで増加させた。濃度を４０％Ｂに１分間維持し、次いで１分間で２１％Ｂ に低下させた。 Ｂ． ＳＰＢ３３（配列番号３）の合成 完全に保護したペプチド樹脂を、前出のＢａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌ ｄの一般的方法に従い段階的固相合成（カルボキシル末端残基から始める）でフ ェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂上に組み立てた。Ｃ末端アミノ酸アル ギニン（Ａｒｇ）をオキシメチルフェニルアセトアミドメチル（ＯＭＰＡ）結合 を介して固体支持体に結合し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での長時間の処理に 対しても安定性の高いＰＡＭ樹脂を得た。ＢＯＣ−Ａｒｇ（ＴＯＳ）−ＯＣＨ₂ −ＰＡＭ−樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、０．１７１９５ｇ）を、ＡＢＩペプチ ド合成器モデル４３０Ａの反応容器に移した。カルボキシル末端からＮ末端まで の後続アミノ酸の総てを、キャッピングを含むＡＢＩの０．１ｍｍｏｌ小規模高 速サイクル手順（ＡＢＩ、Ｆｒｏ ｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｐ／Ｎ ６０１７８１、バージョン１．４０）を用 いて段階的に結合した。保護アミノ酸を、予め形成した対称性無水物化学を用い て結合した。但し、アスパラギン、グルタミン、アルギニン及びヒスチジンは、 Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾ トリアゾール（ＨＯＢＴ）化学を用いて二重結合した。最初の結合では、ジメチ ルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した無水酢酸を用いて保護アミノ酸を結合し た。個々のアミノ酸の酢酸との無水物を塩化メチレン中で形成し、次いで溶剤を ＤＭＦと交換し、その後ペプチド合成器の反応容器に移した。対称性無水物によ る第二の結合はＤＭＦ中で実施した。使用した総てのアミノ酸のＮ−アミノ基を ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）結合によって保護した。種々のアミ ノ酸の側鎖官能基を下記の基で保護した： Ｔｈｒ，Ｓｅｒ−Ｂｚｌ（ベンジル） Ａｓｐ−Ｏｃｈｘｌ（Ｏ−クシロヘキシル） Ｈｉｓ−ｐＢｏｍ（ｐ−ベンジルオキシメチル） Ａｒｇ−Ｔｏｓ（トシル） 樹脂を合成器の反応容器に移す前に、完全に保護したペ プチド樹脂（０．２５５２７ｇ）を塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）中で５分間膨潤 させた。次いで、製造業者指定手順に従い、６０％ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂を使用し てｔ−ＢＯＣ保護基を除去し、部分的に脱保護したペプチド樹脂を、実験室真空 下、室温で一晩乾燥した。 次いで、部分的に脱保護したペプチド樹脂を無水ＨＦ（９ｍｌ）中のｐ−クレ ゾール（１ｍｌ）で０℃で１時間４５分処理して、樹脂支持体からペプチドを開 裂した。ＨＦ／ＤＭＳ及び他の揮発物質を真空下０℃で留去した。開裂ペプチド 及び樹脂を１５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、開裂ペプチドを１０ ｍｌずつの４０％酢酸水溶液及び１５％酢酸水溶液でそれぞれ３回洗浄して抽出 した。水性抽出物をまとめて、１５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、 次いで凍結乾燥して未精製ペプチドを得た。 未精製ペプチドの純度を、Ｃ４、４．６×３０ｍｍカラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ 、ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから市販されている）での逆相高性能 液体クロマトグラフィーを使用し、流速１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡ水溶液（ Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）を溶媒系と して用いて分析した。このペプチド分析に使用した好ましい溶媒勾配は、１２％ Ｂ溶媒から始めた。カラムを１２％Ｂに１分間維持し、次いで直線勾配を用いて ２０分間で２９％Ｂまで増加させ、１分間維持した。最後に、カラムを１分間で １２％Ｂに戻した。流出液中のペプチドの存在を２２６ｎｍ及び２６４ｎｍで同 時に監視した。精製ペプチドの組成を酸加水分解によって測定した。酸を除去し た後、加水分解物をＢｅｃｋｍａｎ ６３００アミノ酸分析計で分析した。 精製ポリペプチドを大量に得たい場合には、Ｃ４、１０×１００ｍｍカラム（ Ｖｙｄａｃ，Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ ，ＣＡ）を用使用し、前記と同じ０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００アセト ニトリル（Ｂ）溶媒系を用いて、類似の方法で半分離用逆相高性能液体クロマト グラフィーを実施した。半分離操作の好ましい溶媒勾配は１７％Ｂで開始し、３ ｍｌ／分で５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で２８％Ｂまで増加 させた。濃度を２８％Ｂに１分間維持し、次いで１分間で１７％Ｂに低下させた 。 Ｃ． ＳＰＭ３３（配列番号４）の合成 完全に保護したペプチド樹脂を、前出のＢａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌ ｄの一般的方法に従い、段階的固相合成（カルボキシル末端残基から始める）に よってフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂上に組み立てた。Ｃ末端アミ ノ酸バリン（Ｖａｌ）を、オキシメチルフェニルアセトアミドメチル（ＯＭＰＡ ）結合を介して固体支持体に結合し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での長時間の 処理に対しても安定性の高いＰＡＭ樹脂を得た。ＢＯＣ−Ｖａｌ−ＯＣＨ₂−Ｐ ＡＭ−樹脂（０．７８ｍｍｏｌ／ｇ、０．１２８６３ｇ）をＡＢＩペプチド合成 器モデル４３０Ａ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の反応容器に移し た。カルボキシル末端からＮ末端までの後続アミノ酸の総てを、キャッピングを 含むＡＢＩの０．１ｍｍｏｌ小規模高速サイクル手順（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｐ／Ｎ ６０１７８１、バージョン１．４０）を用いて段階的 に結合した。保護アミノ酸を、予め形成した対称性無水物化学を用いて結合した 。但し、アスパラギン、グルタミン、アルギニン及びヒスチジンは、Ｎ，Ｎ’− ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾー ル（ＨＯＢＴ）化学を用いて二重結合 した。最初の結合では、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した無水酢酸 を用いて保護アミノ酸を結合した。個々のアミノ酸の酢酸との無水物を塩化メチ レン中で形成し、次いで溶剤をＤＭＦと交換し、その後ペプチド合成器の反応容 器に移した。対称性無水物による第二の結合はＤＭＦ中で実施した。使用した総 てのアミノ酸のＮ−アミノ基を、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）結 合によって保護した。種々のアミノ酸の側鎖官能基を下記の基で保護した： Ｔｈｒ，Ｓｅｒ−Ｂｚｌ（ベンジル） Ａｓｐ，Ｇｌｕ−ＯＢｚ（Ｏ−ベンジル） Ｈｉｓ−ｐＢｏｍ（ｐ−ベンジルオキシメチル） Ａｒｇ−Ｔｏｓ（トシル） Ｃｙｓ−４ＭｅＢｚｌ（４−メチルベンジル） Ｔｙｒ−２ＢｒＺ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル） Ｌｙｓ−２ＣｌＺ（２−クロロベンジルオキシカルボニル） 樹脂を合成器の反応容器内に配置する前に、完全に保護したペプチド樹脂（０ ．３４１３７ｇ）を塩化メチレン （ＣＨ₂Ｃｌ₂）中で５分間膨潤させた。次いで、製造業者指定手順に従い、６０ ％ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂を使用してｔ−ＢＯＣ保護基を除去し、部分的に脱保護し たペプチド樹脂を、実験室真空下、室温で一晩乾燥した。 次いで、部分的に脱保護したペプチド樹脂を無水ＨＦ（９ｍｌ）中のｐ−クレ ゾール（０．６ｍｌ）及びｐ−チオクレゾール（０．５ｇ）で０℃で１時間４５ 分処理して、樹脂支持体からペプチドを開裂した。ＨＦ／ＤＭＳ及び他の揮発物 質を真空下０℃で留去した。開裂ペプチド及び樹脂を１６ｍｌずつのジエチルエ ーテルで３回洗浄し、開裂ペプチドを１０ｍｌずつの４０％酢酸水溶液及び１６ ％酢酸水溶液でそれぞれ３回洗浄して抽出した。水性抽出物をまとめて、１６ｍ ｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、次いで凍結乾燥して未精製ペプチドを 得た。 未精製ペプチドの純度を、Ｃ４、４．６×３０ｍｍカラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ 、ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）での逆相高性能液体クロマトグラフ ィーを使用し、流速１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００％ア セトニトリル（Ｂ）を溶媒系として用いて分析した。このペプチド分析に使用し た好ましい溶媒勾配は、３３％ Ｂ溶媒で開始した。カラムを３３％Ｂに１分間維持し、次いで直線勾配を用いて ２０分間で６３％Ｂまで増加させ、１分間維持した。最後に、カラムを１分間で ３３％Ｂに戻した。流出液中のペプチドの存在を、２２６ｎｍ及び２８０ｎｍで 同時に監視した。精製ペプチドの組成を酸加水分解によって測定した。酸を除去 した後、加水分解物をＢｅｃｋｍａｎ ６３００アミノ酸分析計で分析した。 精製ポリペプチドを大量に得たい場合には、Ｃ４、１０×１００ｍｍカラム（ Ｖｙｄａｃ，Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ ，ＣＡ）を使用し、前記と同じ０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００アセトニ トリル（Ｂ）溶媒系を用いて、類似の方法で半分離用逆相高性能液体クロマトグ ラフィーを実施した。半分離操作の好ましい溶媒勾配は３０％Ｂで開始し、３ｍ ｌ／分で５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で４５％Ｂまで増加さ せた。濃度を４５％Ｂに１分間維持し、次いで１分間で３０％Ｂに低下させた。 Ｄ． ＳＰＭ４２（配列番号１）の合成 完全に保護したペプチド樹脂を、前出のＢａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌ ｄの一般的方法に従い、段階的固相 合成（カルボキシル末端残基から始める）によってフェニルアセトアミドメチル （ＰＡＭ）樹脂上に組み立てた。Ｃ末端アミノ酸バリン（Ｖａｌ）を、オキシメ チルフェニルアセトアミドメチル（ＯＭＰＡ）結合を介して固体支持体に結合し 、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での長時間の処理に対しても安定性の高いＰＡＭ 樹脂を得た。ＢＯＣ−Ｖａｌ−ＯＣＨ₂−ＰＡＭ−樹脂（０．７７ｍｍｏｌ／ｇ 、０．３１７０ｇ）をＡＢＩペプチド合成器モデル４３０Ａ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔ ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の反応容器に移した。カルボキシル末端からＮ末端まで の後続アミノ酸の総てを、キャッピングを含むＡＢＩの標準的０．５ｍｍｏｌ規 模ＨＯＢＴ／Ｎ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）化学手順（ＡＢＩ）Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｐ／Ｎ ４００６７４、バージョン１．４０）を用いて段階 的に結合した。保護したアミノ酸を、予め形成した対称性無水物化学を用いて結 合した。但し、アスパラギン、グルタミン、アルギニン及びヒスチジンはＮ，Ｎ ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリア ゾール（ＨＯＢＴ）化学を用いて二重結合した。最初の結合では、ジメチルホル ムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した無水 酢酸を用いて保護アミノ酸を結合した。個々のアミノ酸の酢酸との無水物を塩化 メチレン中で形成し、次いで溶剤をＤＭＦと交換し、その後ペプチド合成器の反 応容器に移した。対称性無水物による第二の結合もＤＭＦ中で実施した。使用し た総てのアミノ酸のＮ−アミノ基をｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ） 結合によって保護した。種々のアミノ酸の側鎖官能基を下記の基で保護した： Ｔｈｒ，Ｓｅｒ−Ｂｚｌ（ベンジル） Ａｓｐ，Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（Ｏ−ベンジル） Ｈｉｓ−ｐＢｏｍ（ｐ−ベンジルオキシメチル） Ａｒｇ−Ｔｏｓ（トシル） Ｃｙｓ−４ＭｅＢｚｌ（４−メチルベンジル） Ｔｙｒ−２ＢｒＺ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル） Ｌｙｓ−２ＣｌＺ（２−クロロベンジルオキシカルボニル） Ａｓｐ−ＯＢｚｌ（Ｏ−ベンジル） Ａｓｐ−ＯＣｈｘｌ（Ｏ−シクロヘキシル） Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（Ｏ−ベンジル） Ｇｌｕ−ＯＣｈｘｌ（Ｏ−シクロヘキシル） 樹脂を合成器の反応容器内に配置する前に、完全に保護したペプチド樹脂（０ ．４６ｇ）を塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）中で５分間膨潤させた。次いで製造業 者指定手順に従い、６０％ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂を使用してｔ−ＢＯＣ保護基を除 去し、部分的に脱保護したペプチド樹脂を実験室真空下、室温で一晩乾燥した。 次いで、部分的に脱保護したペプチド樹脂を無水ＨＦ（１０ｍｌ）中の硫化ジ メチル（ＤＭＳ、１ｍｌ）、ｐ−クレゾール（１ｍｌ）及びｐ−チオクレゾール （０．２ｇ）で０℃で２時間処理して、樹脂支持体からペプチドを開裂した。Ｈ Ｆ／ＤＭＳ及び他の揮発物質を真空下０℃で留去した。開裂ペプチド及び樹脂を １５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、開裂ペプチドを１０ｍｌずつの ４０％酢酸水溶液及び１６％酢酸水溶液でそれぞれ３回洗浄して抽出した。水性 抽出物をまとめて、１５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、次いで凍結 乾燥して未精製ペプチドを得た。 未精製ペプチドの純度を、Ｃｌｇ、４．６×３０ｍｍカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｔ ｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）での逆 相高性能液体 クロマトグラフィーを使用し、流速１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ） 及び１００％アセトニトリル（Ｂ）を溶媒系として用いて分析した。このペプチ ド分析に使用した好ましい溶媒勾配は２５％Ｂ溶媒で開始した。カラムを２５％ Ｂに５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で４５％Ｂまで増加させ、 １分間維持した。最後に、カラムを１分間で２５％Ｂに戻した。流出液中のペプ チドの存在を２２５ｎｍ及び２６４ｎｍで同時に監視した。精製ペプチドの組成 を酸加水分解によって測定した。酸を除去した後、加水分解物をＢｅｃｋｍａｎ ６３００アミノ酸分析計で分析した。 精製ポリペプチドを大量に得たい場合には、Ｃ１８、１０×１００ｍｍカラム （Ｖｙｄａｃ，Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉ ａ，ＣＡ）を使用し、前記と同じ０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００アセト ニトリル（Ｂ）溶媒系を使用して、類似の方法で半分離用逆相高性能液体クロマ トグラフィーを実施した。半分離操作の好ましい溶媒勾配は２７％Ｂで開始し、 ３ｍｌ／分で５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で４０％Ｂまで増 加させた。濃度を４０％Ｂに１分間維持 し、次いで１分間で２７％Ｂに低下させた。 実施例２ ペプチドを備えた捕捉相の製造 実施例１Ｄ（配列番号１）、実施例１Ａ（配列番号２）、実施例１Ｂ（配列番 号３）及び実施例１Ｃ（配列番号４）に記載のように製造したペプチドを、ＨＥ Ｖに対する抗体を捕捉する後続アッセイで使用するための固相として、ポリスチ レンビーズ上に別々にコーティングした。手順は下記の通りである。粉砕ポリス チレンビーズ（本出願人から市販されている）を蒸留水又はプロパノールで洗浄 した。次いでビーズを、回転、振盪又は他の動的モード下で、リン酸塩緩衝食塩 水（ＰＢＳ）溶液中０．５〜２０μｇ／ｍ１のペプチドの溶液と共に、５６℃（ 範囲：室温〜６０℃）で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ビ ーズをＰＢＳ中で洗浄した。次いで、ビーズをＰＢＳ中５％ＢＳＡで０．５〜２ 時間ブロックし、ＰＢＳ中５％スクロースで１５〜６０分間オーバーコーティン グし、その後乾燥した。 実施例３ 組換え抗原を備えた捕捉相の製造 ４種類のＨＥＶ組換え抗原Ｍ４−２、Ｍ３−２、Ｂ４−２及びＢ３−２（それ ぞれ配列番号１、配列番号４、配列番号２及び配列番号３に対応する）がクロー ニングされ、大腸菌中でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Ｇ ｅｎｅｌａｂｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃ Ａ）との融合タンパク質として発現された。これらの組換え抗原を、ＨＥＶに対 する抗体の捕捉相として後続アッセイで使用する固相として、ポリスチレンビー ズ上に別々にコーティングした。手順は下記の通りである。粉砕ポリスチレンビ ーズ（本出願人）を蒸留水又はプロパノールで洗浄した。次いでビーズを、回転 、振盪又は他の動的モード下で、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中０．５〜 ２０μｇ／ｍｌの抗原の溶液と共に、４０℃（範囲：室温〜６０℃）で２時間イ ンキュベートした。インキュベーション後、ビーズをＰＢＳ中で洗浄した。次い で、ビーズをＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で０．５〜２時間ブロ ックし、ＰＢＳ中５％スクロースで１５〜６０分間オーバーコーティングし、そ の後乾燥した。 実施例４ ＥＬＩＳＡによる抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体の検出 Ａ． ＨＥＶ合成ペプチドを用いるＥＬＩＳＡ 血清検査試料を、２０％ヤギ血清、１０％ウシ胎児血清、１％ウシ血清アルブ ミン、０．２％トリトン（登録商標）Ｘ−１００、０．１％アジ化ナトリウムを 含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）／トリス／ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８、からなる 試料希釈剤中に１：３００で希釈した。次いで、希釈試料２００μｌを、実施例 ２に記載のように製造した合成ペプチドｓｐ４２（配列番号１又は２）又はｓｐ ３３（配列番号３又は４）でコーティングした固相（ポリスチレンビーズ）と共 に、反応トレー内で、４０℃／静置又は室温／振盪下で２時間インキュベートし た。インキュベーション後、ビーズを蒸留水で十分に洗浄し、４０℃／静置又は 室温／振盪下で、１０％ヤギ血清、１０％ウシ胎児血清、０．１５％トリトン（ 登録商標）Ｘ−１００を含むトリス緩衝食塩水中に希釈したヤギ抗ヒトＨＲＰＯ （Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ及びＰｅｒｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから 市販されている）と共に６０分間インキュベートした。ビーズを十分に洗浄した 後、ＯＰＤタブレット（本出願人）をタブレット当たり５ｍｌのＯＰＤ希釈剤 （本出願人）に加えることにより新しく調製したＯＰＤ基質試薬を３００μｌ加 えた。ビーズ及びＯＰＤ基質試薬を室温で３０分間インキュベートした後、１． ０ｍｌの１Ｎ硫酸を加えて発色反応を停止させた。硫酸添加後２時間以内に４９ ２ｎｍで基質の吸光率を測定することにより、発色量を測定した。 Ｂ． ＨＥＶ組換えタンパク質を用いるＥＬＩＳＡ 実施例４Ａの記載のように、但し合成タンパク質でコーティングした固相の代 わりに実施例３の方法で製造した組換えタンパク質でコーティングした固相を使 用して、ＥＬＩＳＡを実施した。結果 このアッセイを、ウィスコンシン南東部（ＨＥＶ感染が風土病ではないとみな される地域）の３８６人の有志の血液ドナーから得た血清試料のパネルに適用し た。ＨＥＶ合成ペプチド配列番号１、２、３及び４のアミノ酸配列に対応するい ずれかのＨＥＶ組換え抗原を使用した固相捕捉試薬を用いて、試料を検査した。 組換え抗原使用アッセイを用いて、検査した３８６個の試料のうち８個が反応性 と判定された。組換え抗原に対して反応性であるとされた８個 の試料は、本発明の方法でも反応性を示した。８個の抗ＨＥＶ反応性試料から得 られたデータ、及び個々の捕捉試薬に対するこれら試料の反応性を表１に示す。 正の符号（＋）は反応性を表し、負の符号（−）は非反応性を表す。 この方法を、世界中の様々な集団の９８２の個体に由来 する血清試料にも適用した。種々の地域に由来する試料の中で、１種類以上の組 換え抗原に対して繰り返し反応性を示す試料の割合は２．３〜１６．０％であっ た。反応性試料の約半分は、合成ペプチドに対しても反応性を示した。これは、 これらの試料が真に反応性であることを裏付けるものである。確認された抗ＨＥ Ｖ抗体検出率は米国、ドイツ、日本及びニュージーランドでは低いが（１．１〜 ３．０％）、メキシコ及びタイでは高い（それぞれ７．０％及び７．６％）。こ の研究で得られたデータを表２に示す。 前述の方法を使用した別の研究では、ＨＥＶ組換え抗原及び合成ペプチドの反 応性を、ソマリアのＨＥＶ発生に由来する１５１個の試料と比較した。組換え抗 原に反応する１２５個の試料のうち１２２個が、合成ペプチドにも反応すること が明らかにされた。これは、約９８％の一致を意 味する。 より大規模な研究では、前記方法を用いて、ドイツ、ベルリンの８６２人の有 志の血液ドナーに由来するＨＥＶ組換え抗原及び合成ペプチドの反応性を比較し た。これらの試料のうち１３個（１．５１％）が１種類以上の組換え抗原と反応 し、１０個（１．２％）が１種類以上の合成ペプチドと反応した。 実施例７ 阻止アッセイ 実施例１Ｄ（配列番号１）、実施例１Ａ（配列番号２）、実施例１Ｂ（配列番 号３）及び実施例１Ｃ（配列番号４）に記載の方法で製造したペプチドを、実施 例４Ａに記載のように、固相捕捉体としてのポリスチレンビーズに別々にコーテ ィングした。 実施例１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び２のように製造した合成ペプチドでコーテ ィングしたポリスチレンビーズを固相抗原として使用した。血清試料を、ＨＥＶ エピトープに対する抗体が固相に結合するのを特異的に阻止するために阻止試薬 （組換え抗原Ｂ４−２又はＭ３−２のいずれか）を含むか、あるいは抗ＨＥＶが 固相に結合するのを阻止し ない対照試薬（組換えＨＣＶ抗原）を含む試料希釈剤中に希釈した。組換えＨＣ Ｖ抗原は、Ｇ．Ｊ．Ｄａｗｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２９：１４７ ９−１４８６（１９９０）に記載のものと同じであった。試料希釈剤は２５〜５ ００μｇ／ｍｌの阻止又は対照試薬を含んでいた。阻止試薬によって吸光率の値 が５０％以上減少した試料を反応性とみなした。 阻止又は対照試薬を含む試料希釈剤中に試料を希釈し（１：３００）、室温〜 ４０℃で１時間インキュベートした。次いで希釈試料２００μｌを、対応する合 成ペプチドでコーティングしたビーズと共にインキュベートし、実施例４Ａに記 載のようにＥＬＩＳＡを実施した。阻止試薬によって吸光率の値が５０％以上減 少した試料を反応性とみなした。 前述の方法を、実施例１の組換え抗原及び合成ペプチドに対して反応性である ことが判明したウィスコンシン南東部のドナーに由来する８個の試料に適用した 。本発明の種々の合成ペプチドでコーティングした固相に予め結合させた抗ＨＥ Ｖ抗体の結合は、固相上にコーティングした合成ペプチドに対応する組換え抗原 を含む希釈剤中に試料を希 釈することによって特異的に阻止できた。Ｇ．Ｊ．Ｄａｗｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒ ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ． ３８：１７５−１８６（１９９２）参照。該文献は本明 細書に参考として包含される。 実施例８ ＣＤＣパネルの反応性 種々のＥＴ−ＮＡＮＢＨから得たＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃ ｏｎｔｒｏｌの８個の試料を、実施例５及び実施例６で使用したものと類似の方 法及び材料を用いて、抗ＨＥＶ（ＩｇＧ及びＩｇＭ）について検査した。ビルマ 由来の一つの試料は総てのアッセイで陰性であった。４個の試料は、４種類の総 ての組換え抗原に対するＩｇＧクラス抗体に対して反応性を示した。８個の試料 のうち７個はＢ４−２エピトープに反応し、そのうち６個がＳＰＢ３３（配列番 号３）で確認された。別のビルマ試料はＢ４−２に対してのみ反応性を示した。 Ｂ４−２及びＳＰＢ３３アッセイの両方で反応性を示した試料は、少なくとも２ 種類の別のＨＥＶ組換え抗原にも反応することが判明した。これと比較して、Ｉ ｇＭ特異的アッセイでは、７個の急性期血清のうち６個がＢ４−２と反応し、７ 個のうち５個が Ｂ３−２及びＭ４−２と反応し、７個のうち３個がＭ３−２と反応した。Ｇ．Ｊ ．Ｄａｗｓｏｎら（１９９２）前出文献参照。 実施例９ シノモルガスマカクの検査 実験的に感染させたシノモルガスマカクから得た血清の免疫反応性を調べるた めの検査を、組換えＨＥＶタンパク質及び合成ペプチドの両方を用いて実施した 。接種した後、３匹の動物は総て１種類以上の組換え抗原又は合成ペプチドに反 応する抗体を産生した。試料の一部は組換え抗原及び合成ペプチドの両方に反応 し、別の試料はいずれか一方に反応した。Ｇ．Ｊ．Ｄａｗｓｏｎら（１９９２） 前出文献参考。 実施例１０ 交差反応性検査 種々のウイルスに対する抗体及び干渉グロブリンを有する患者及びチンパンジ ーから得た検査試料を、実施例４に記載の抗ＨＥＶ ＩｇＧ法及びＩｇＭ法の両 方で検査した。この検査方法の特異性が高いことは、表３に示すように、種々の 病気に由来する試料の間に観察される交差反応の欠 失から明らかである。 実施例１１ 限界希釈検査 ６個の血清陽性血清試料を抗ＨＥＶ欠失ヒト正常血清中に段階的に希釈し、Ｇ ＳＴ中で製造した組換えペプチド又は合成ペプチドによって、実施例４に記載の 手順で、Ｂ３ −２及びＢ４−２についてアッセイした。検査結果を下記の表４に示す。 前記データは、試料がＢ４−２に反応する場合には、合成ペプチド（ｓｐ）を 使用した時の方が、対応する組換えタンパク質（ＧＳＴ）を使用した時より終点 が大きいことを示している。しかしながら、Ｂ３−２配列に反応する５個の試料 のうち３個は、合成ペプチド（ｓｐ）より組換えタンパク質（ＧＳＴ）に対して より大きい反応性を示した。 本発明のアッセイは、アッセイ条件及び／又はインキュベーション時間を変更 し、抗原又は抗体捕捉又はプローブ試薬を様々に組合わせて使用し、当業者に公 知の別の方法、試薬及び条件を使用することによって、更に最適化できる と考えられる。これらの変更は総て本発明の範囲内に含まれるとみなされる。ま た、手動方法又は自動化分析器も本発明の範囲を逸脱せずに本発明のアッセイに 使用できるか、又は適合させ得る。従って、本発明は後述の「請求の範囲」によ ってのみ限定されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グテイーレス，ロビン・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ノース・ハント・クラブ・ロード・ 34859 (72)発明者 ポール，デボラ・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ダンハム・ロード・594 (72)発明者 ナイツジ，マーク・エフ アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イスレイク、ダーラム・ロード・820

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 検査試料中の抗ＨＥＶ抗体の存在を確認するためのアッセイであって、（ ａ）検査試料を、抗ＨＥＶ抗体に特異的に結合する１種類以上の合成ペプチドに 、ペプチド／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で接触させ、（ｂ）前記 ペプチド／抗体複合体を、抗ヒト抗体に接合したシグナル発生化合物からなる指 示試薬に接触させ、ペプチド／抗体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下 でインキュベートし、（ｃ）検査試料中の抗ＨＥＶの存在を示す測定可能なシグ ナルを検出することからなる前記アッセイ。 ２． ステップ（ａ）を実施する前にステップ（ａ）のペプチドを固相に接合し 、前記固相を微粒子、ポリスチレンビーズ及び反応トレーのウェルの中から選択 する請求項１に記載のアッセイ。 ３． ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）を同時に実施する請求項１に記載のア ッセイ。 ４． 合成ペプチドを、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の 中から選択する請求項１に記載のアッ セイ。 ５． 前記指示試薬のシグナル発生化合物を、酵素、発光化合物、放射性元素、 可視標識及び化学発光化合物の中から選択する請求項１に記載のアッセイ。 ６． 前記酵素を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びア ルカリホスファターゼの中から選択する請求項５に記載のアッセイ。 ７． 配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の中から選択される 合成ペプチド。 ８． 検査試料中のヒト抗ＨＥＶ抗体の存在を確認するためのアッセイキットで あって、固相に接合した抗ＨＥＶ抗体に特異的な合成ペプチドが１種類以上入っ ている容器を含み、前記合成ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３ 及び配列番号４の中から選択した１種類以上のペプチドからなる前記アッセイキ ット。 ９． 前記固相が、微粒子、ポリスチレンビーズ及び反応トレーのウェルの中か ら選択したものである請求項８に記載のキット。 １０． シグナル発生化合物に接合した抗ヒト抗体からなる指示試薬が入ってい る容器をも含み、前記シグナル発生 化合物が、酵素、発光化合物、放射性元素、可視標識及び化学発光化合物の中か ら選択したものである請求項９に記載のキット。