JPH0851981A - 癌転移阻害活性を有する新規なタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】これまで化学的合成方法および結合方法を組み
合わせてのみ作製可能であった癌転移阻害タンパク質
を、遺伝子組換え手法により直接的にしかも高効率で生
産し得るために、合成遺伝子およびそれを用いて製造さ
れた癌転移阻害タンパク質を提供する。 【構成】血清アルブミンタンパク質のカルボキシル末端
（Ｃ末端）に癌転移阻害活性を有するペプチドを結合し
てなる新規なタンパク質、および特に分裂酵母シゾサッ
カロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）菌
体内で多頻度で使用されるコドンを用いて設計、合成さ
れた上記タンパク質をコードする遺伝子、並びに、該遺
伝子を用いて上記タンパク質を遺伝子組換え手法によっ
て製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な癌転移阻害活性
を有する新規なタンパク質（以下、単に「癌転移阻害タ
ンパク質」と略記）およびこれをコードする遺伝子、該
遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターに
よって形質転換された宿主細胞の形質転換体並びに該形
質転換体を用いる癌転移阻害タンパク質の製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】癌の治療には主として外科的療法、放射
線療法および化学療法が行われているが、癌の再発や転
移の防止という点ではいまだ満足すべき治療効果が挙げ
られていない。

【０００３】現在用いられている多くの制癌剤は、核酸
あるいはタンパク質の生合成系を阻害し、癌細胞を死に
至らしめるものである。しかしながらこれらの制癌剤で
は、癌細胞と正常細胞との区別が困難なため、その効果
には、特に副作用の面で大きな問題が内在している。ま
たこれらの制癌剤は原発巣を縮小させることによって治
療するものであるが、癌の治療で常に問題になるのは癌
細胞が原発巣から離れ、他の臓器に転移し、そこで増殖
し致命的な結果を招くことである。したがって癌の根本
的治療のためには、癌細胞の増殖抑制とともに、転移に
対して有効な抑制効果を示す制癌剤の開発が望まれてい
る。

【０００４】癌転移の機構の解明には多くの研究がなさ
れ、転移の抑制に関する物質の検索も広く行なわれてき
た。癌細胞は原発巣から遊離した後、血管中に侵入す
る。そして血管壁に接着後、血管内皮細胞層の下に潜り
込み細胞外基質を破壊し、標的臓器の実質中に浸潤侵入
する。このような各ステップを経て癌細胞は他の臓器に
転移すると考えられている（L.A. Liotta et al.: Lab.
Invest., 49, 636-649(1983)）。よって癌転移阻害剤
開発のためには、上記の各ステップのいずれかを抑制す
るものが開発されればよいと考えられる。例えば、癌細
胞が細胞外基質と接着するのを阻害するもの（例えば、
N.J. Humphries et al.: Science, 223, 467-470 (198
6) ）、中皮細胞層や血管内皮細胞層などの下層への浸
潤を阻害する物質（例えば、A. Isoai et al.: Jpn. J.
Cancer Res., 81, 909-914 (1990)）、細胞外基質の分
解を阻害する物質（例えば、R.M. Schultz et al.: Can
cer Res., 48, 5539-5545 (1988)）等が挙げられる。

【０００５】本発明者らは従前に、癌転移阻害活性を有
するペプチドと生体高分子との複合体（タンパク質）を
化学的結合法により作製している。すなわち、配列表の
配列番号８のアミノ酸配列で表される癌阻害活性を有す
るペプチド（特開平３−３４９９３号公報、A. Isoai e
t al.: Jpn. J. Cancer Res., 81, 909-914 (1990)およ
び A. Isoai et al.: Cancer Res., 52, 1422-1426 (19
92) ）と、血清アルブミンなどの生体高分子とを水溶性
カルボジイミドで結合させた形態において、優れた癌細
胞浸潤阻害活性並びに癌転移抑制活性をもつということ
を確認している（特開平４−２５４０００号、同４−３
００８９９号、同４−３００９００号公報および A. Is
oai et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 192, 7
ー14 (1993)）。

【０００６】このように有用な癌転移阻害活性を有する
タンパク質は、通常化学的タンパク質結合法によって作
製される。しかしながらその方法はステップ数が多く、
また不純物である不完全合成産物の分離を行なわなけれ
ばならない。通常これらの方法は煩雑であり、また効率
よく大量生産することが難しく、特に６０９アミノ酸残
基を有する該タンパク質では、化学的タンパク質結合法
によることは、コスト的にも設備的にも必ずしも満足で
きるものではなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる事情に
鑑みてなされたもので、配列番号８のアミノ酸配列で表
されるペプチド（癌転移阻害ペプチド）と血清アルブミ
ン等の生体高分子との複合体を、従来の化学的タンパク
質結合法に代えて、遺伝子組換え技術を用いて、より効
率的な遺伝子発現並びに癌転移阻害タンパク質の生産を
なし得るための技術を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を重ね、遺伝子組換え技術を用
いて癌転移阻害タンパク質を生産する新規な系を創出
し、該タンパク質を生産することに成功した。具体的に
は、癌転移阻害タンパク質をコードする遺伝子を作製
し、すでに確立されている異種タンパク質生産用のベク
ターに該遺伝子を組み込み、得られた組換えベクターを
宿主細胞に導入し、形質転換体を作製することにより、
癌転移阻害タンパク質の生産を達成し得るというもので
ある。

【０００９】すなわち本発明によれば、配列番号１のア
ミノ酸配列で表される、新規な癌転移阻害タンパク質が
提供される。

【００１０】また本発明によれば、上記癌転移阻害タン
パク質をコードする、配列番号２の塩基配列で表される
遺伝子が提供される。

【００１１】また本発明によれば、上記癌転移阻害タン
パク質をコードする、配列番号３の塩基配列で表される
遺伝子が提供される。

【００１２】また本発明によれば、上記配列番号２また
は３の塩基配列で表される遺伝子を含有する組換えベク
ターが提供される。

【００１３】また本発明によれば、上記組換えベクター
で宿主細胞を形質転換してなる、上記癌転移阻害タンパ
ク質を産生し得る形質転換体が提供される。

【００１４】また本発明によれば、上記形質転換体を培
養し、培養物中に産生された癌転移阻害タンパク質を単
離し、所望により精製することからなる、上記癌転移阻
害タンパク質の製造方法が提供される。

【００１５】以下、本発明について詳述する。

【００１６】上述したように、配列番号８のアミノ酸配
列で表されるペプチド（癌転移阻害ペプチド）と血清ア
ルブミン等の生体高分子との結合体（複合体）が優れた
癌転移阻害活性をもつということが本発明者らによりす
でに確認されている。しかしながら、上記複合体は化学
的タンパク質結合法により作製されたものであり、また
上記癌転移阻害ペプチドと血清アルブミンとの両者の結
合関係は、水溶性カルボジイミドで結合された状態であ
るということ以外、明確でない。

【００１７】本発明者らは、癌転移阻害ペプチドと血清
アルブミンとを結合させた融合タンパク質を遺伝子工学
的に作製するにあたり、種々検討を重ねた結果、癌転移
阻害活性を十分に発揮させ得ることを考慮すると、血清
アルブミンタンパク質の表面に位置しており、かつ立体
構造を破壊することのない位置に癌転移阻害ペプチドを
結合させるのが好ましいということ、それらのなかでも
特には血清アルブミンタンパク質のカルボキシル末端
（Ｃ末端）に癌転移阻害ペプチドを結合させるのが最も
好ましいということを見出した。そして、血清アルブミ
ンタンパク質のカルボキシル末端（Ｃ末端）に上記癌転
移阻害ペプチドを結合してなる融合タンパク質を遺伝子
組換え手法を用いて作製することに成功した。

【００１８】かかる本発明による新規な融合タンパク質
（癌転移阻害タンパク質）は、配列番号１のアミノ酸配
列で表されるもので、同配列中、アミノ末端（Ｎ末端）
側から１〜５８８番目までの配列が血清アルブミン、５
８９〜６０９番目までの配列が癌転移阻害ペプチド由来
のものである。本発明による合成遺伝子は、この配列番
号１のアミノ酸配列で表される融合タンパク質をコード
する合成遺伝子であり、理論的には配列表の配列番号２
の塩基配列で表されるものが可能であり、２、１４７、
４８３、６４８通りの配列が考えられ得る。しかし、望
ましくは遺伝子組換えに用いる宿主細胞のコドン使用頻
度に合わせたものがよく、最も多頻度で使用されるコド
ンを用いて設計するのがよい。

【００１９】ここで、用いる宿主細胞としては特に限定
されるものではないが、望ましくは培養方法が容易で、
低コストで培養できる微生物がよく、例えば大腸菌（Es
cherichia coli）、各種酵母類、枯草菌、糸状菌等、当
業分野で常用されている宿主細胞等が挙げられる。原核
生物を宿主細胞として用いる方法では必ずしも全てのポ
リペプチドに対して有効ではなく、真核生物由来のタン
パク質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同じ立体構
造を再現することは必ずしも容易ではない。また特有の
エンドトキシンが存在する場合は、最終製品の夾雑物に
なる可能性があり、好ましくない。このため好ましく
は、エンドトキシンを含まず、培養方法も確立してお
り、従来より発酵並びに食品工業で用いられており、人
体に関する安全性も確立されている各種酵母類がよい。
このなかでも特に、遺伝学的並びに分子生物学的に動物
細胞に近い性質をもつとされ、より天然体に近い遺伝子
産物が得られることが期待される分裂酵母シゾサッカロ
ミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe) が最も
好ましい。このシゾサッカロミセス・ポンベの菌株とし
ては、例えば寄託番号ＡＴＣＣ３８３９９(leu-32h^-)や
ＡＴＣＣ３８４３６(ura4-294h^-)等としてアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託
されているものが挙げられ、入手可能である。

【００２０】したがって本発明においては、配列番号１
のアミノ酸配列で表される癌転移阻害タンパク質をコー
ドする遺伝子は、シゾサッカロミセス・ポンベでの高発
現に至適なコドンを用いて設計し、合成するのが最も好
ましい。シゾサッカロミセス・ポンベの最適コドン使用
頻度は、例えば A. Nasim et al: Molecular Biology
of the Fission Yeast p263, Academic Press (1989)
等から知ることができる。本発明者らは種々研究を重ね
た結果、配列番号３の塩基配列で表される遺伝子が最も
好適であるとの結論を得、設計、合成した。この配列番
号３の配列は、５’末端側から１〜１７５８番目までの
塩基配列が血清アルブミンをコードし、１７６５〜１８
３０番目の塩基配列が癌転移阻害ペプチドをコードする
もので、１８２８〜１８３０番目として翻訳終了シグナ
ル（ＴＡＡ）が付加されている。なお遺伝子の作製（合
成）は、トリエステル法（Nuc. Acid. Res. 10, p.655
3,(1982))やホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters
22, p.1859, (1981)) などの種々の方法がすでに開発
されており、いずれの方法を用いてもよい。またＤＮＡ
合成機器（ＤＮＡシンセサイザー）等が市販されている
ので、それらを用いてもよい。

【００２１】次に、このようにして合成した遺伝子をベ
クターに組み込んで組換えベクターを作製する。用いる
ベクターは特に限定されるものではないが、宿主細胞内
で自律的に複製可能であって、合成遺伝子（外来遺伝
子）を組み込み得る挿入部位をもち、さらにこの組み込
んだ合成遺伝子を宿主細胞内で発現せしめることを可能
とする領域を有する必要がある。このようなベクターと
して、例えば本発明者らがすでに創出に成功しているシ
ゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする外来遺伝子発現
ベクターｐＴＬ２Ｍ（特願平５−２４９３１０号明細
書）等を有利に用いることができ、これらのベクターに
上記合成遺伝子を容易に組み込み得る。

【００２２】次いで上記組換えベクターを宿主細胞内に
導入し、形質転換体を得る。組換えベクターの宿主細胞
内への導入法は、従来慣用的に用いられている方法によ
り行うことができ、コンピテント細胞法、プロトプラス
ト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーショ
ン法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合
法、パーティクル・ガン法等、種々のものが挙げられる
が、用いる宿主に応じてそれぞれ任意の方法を取り得
る。シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする場合は、
例えば酢酸リチウム法（K. Okazaki et al., Nucleic A
cids Res.,18, 6485-6489(1990) ）等によって効率よく
形質転換体を得ることができる。

【００２３】このようにして得られた形質転換体を培養
することにより、培養物中に癌転移阻害タンパク質が産
生される。これを公知の方法で単離し、場合により精製
することにより、目的とする癌転移阻害タンパク質が得
られる。

【００２４】形質転換体を培養するための培地は公知で
あり、ＹＰＤ培地などの栄養培地（M. D. Rose et al.,
"Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor L
abolatory Press(1990) ）や、ＭＢ培地などの最小培地
（K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res.,18, 6485-6
489(1990) ）等を用いることができる。形質転換体の培
養は、通常１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、
８〜１６８時間、好ましくは２４〜７２時間行う。振盪
培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて
攪拌や通気を加えてもよい。

【００２５】培養物中に産生したタンパク質の単離・精
製法としては、公知の塩析または溶媒沈殿法等の溶解度
の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳
動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマ
トグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニテ
ィークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を
利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用
する方法等が挙げられる。

【００２６】単離・精製したタンパク質の確認方法とし
ては、公知のウエスタンブロッティング法や活性測定法
等が挙げられる。また、精製されたタンパク質は、アミ
ノ酸分析、アミノ末端（Ｎ末端）分析、一次構造解析な
どによりその構造を明らかにすることができる。

【００２７】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技
術範囲が限定されるものではない。また実施例中の各操
作については、特に記載したもの以外は、当業分野で常
用されている方法（例えばJ. Sambrook et al.: Molecu
lar Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
ew York, USA, 1989.）に従った。

【００２８】［実施例１］癌転移阻害タンパク質をコー
ドする配列番号３の塩基配列で表される遺伝子の作製 配列番号１のアミノ酸配列をもとに、シゾサッカロミセ
ス・ポンベのコドン使用頻度（Nasim, A. et al: Molec
ular Biology of the Fission Yeast, Academic Press,
1989, p263.）に合せて、配列番号４および５の塩基配
列で表される２本の一本鎖オリゴＤＮＡを、ＤＮＡ自動
合成装置（Applied Biosystems）を用いて合成した。な
お、配列番号４の塩基配列は、５’末端に制限酵素Ｂａ
ｍＨＩへの挿入部位と開始コドンＡＴＧを、３’末端に
終始コドンＴＡＡと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩへの挿入部
位を導入した遺伝子のセンス鎖であり、配列番号５の塩
基配列はそのアンチセンス鎖である。脱保護、精製後、
これら２本を７０℃でアニーリングした。

【００２９】一方、これとは別にプラスミドｐＵＣ１９
（宝酒造（株）製）を、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造
（株）製）およびＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造（株）製）で
二重消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱による精
製の後、アガロースゲル電気泳動し、約２６００塩基対
に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰ（旭硝子
（株）製）を用いたガラスビーズ法で精製した。

【００３０】これら両者の断片を、ＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションし
た。これを大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）に導
入して形質転換した後、アンピシリン耐性を持ち、かつ
X-gal プレート上で白コロニーを提示するポジティブ
クローンをスクリーニングし、目的のプラスミドすなわ
ち制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ二重消化時
に約７０塩基対の切断断片を示すｐＩ２Ａを得た。アル
カリ−ＳＤＳ法に従ってｐＩ２Ａを大量調製し、制限酵
素地図の作製および塩基配列決定によって、配列番号３
の塩基配列を持ったプラスミドであることを確認した。

【００３１】［実施例２］癌転移阻害タンパク質遺伝子
を含有する発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩの作製 実施例１で作製したプラスミドｐＩ２Ａを制限酵素Ｎｃ
ｏＩ（宝酒造（株）製）およびＨｉｎｄＩＩＩで二重消
化して末端を調節し、アクリルアミドゲル電気泳動によ
り約７０塩基対に相当するバンドを切出し、ゲルから溶
出して、癌転移阻害タンパク質をコードする遺伝子挿入
断片とした。

【００３２】一方、これとは別に、遺伝子導入用のリン
カー断片を作製した。すなわち、ヒト肝臓ｃＤＮＡライ
ブラリーよりプラスミドｐＵＣ１９上にクローニングし
たヒト血清アルブミンｃＤＮＡを鋳型として、配列番号
６の塩基配列で表されるＤＮＡを５’末端側プライマー
とし、配列番号７の塩基配列で表されるＤＮＡを３’末
端側プライマーとしてＰＣＲ増幅を行ない、次いで制限
酵素ＮｃｏＩおよびＡｆｌＩＩＩ（New England Biolab
s ）によって末端調節（部分消化）を行なった。フェノ
ール抽出、エタノール沈澱による精製の後、アガロース
ゲル電気泳動し、約１８００塩基対に相当するバンドを
切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精
製し、リンカー断片とした。

【００３３】さらにこれとは別に、シゾサッカロミセス
・ポンベ発現ベクターｐＴＬ２Ｍを用意した。このベク
ターｐＴＬ２Ｍは、本願発明者らがすでに構築したもの
である（特願平５−２４９３１０号明細書）。以下にそ
の作製方法を述べる。

【００３４】［ベクターｐＲＬ２Ｍの作製］まず、公知
の方法で調製されたｐｃＤ４ＣＡＴをＢａｍＨＩで切断
し、ＣＡＴ遺伝子を除去後ライゲーションし、ｐｃＤ４
を作製した。ｐｃＤ４をＢａｍＨＩで部分切断し、平滑
末端化した後ライゲーションしてｐｃＤ４Ｂを作製した
（特開平５−１５３８０号公報）。

【００３５】このプラスミドｐｃＤ４Ｂを制限酵素Ｓａ
ｃＩで消化後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化
し、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、フェノー
ル抽出およびエタノール沈殿によって精製した。さらに
アガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によって約
４５００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。

【００３６】一方、これとは別に、ヒト線維芽細胞由来
の岡山−バーグｃＤＮＡライブラリー（ｐｃＤベクタ
ー）を公知の方法により調製した。さらに、既に知られ
ているヒトリポコルチンＩの遺伝子配列（Nature, 320,
77,(1986)）のうち、タンパク質のＮ末端側アミノ酸配
列をコードする５０塩基の遺伝子配列をＤＮＡプローブ
として上述のライブラリーからリポコルチンＩの遺伝子
をコロニーハイブリダイゼーション法により取得し、塩
基配列を決定することにより、リポコルチンＩタンパク
質全長をコードするものであることを確認した。取得し
たクローンをｐｃＤｌｉｐｏＩと名づけた。（特開平５
−１５３８０号公報）。そしてこのヒトリポコルチンＩ
遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターｐｃＤｌｉｐｏＩを
制限酵素ＸｍｎＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、フェ
ノール抽出およびエタノール沈殿によって精製した。さ
らにアガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によっ
て約１３００塩基対に相当するＤＮＡを精製した。

【００３７】両ＤＮＡをライゲーションした後、これを
大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）に導入して形質転換
した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的
とするベクターｐＲＬ２Ｌ（図５）を持った形質転換体
をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限
酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認し
た。

【００３８】このリポコルチンＩ発現ベクターｐＲＬ２
Ｌを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後、アガロース
ゲル電気泳動により約５０００塩基対に相当するバンド
を切り出し、ガラスビーズ法で精製した。これとは別
に、公知のプラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り約６０塩基対に相当するバンドを切り出し、ゲルから
抽出精製した。

【００３９】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベクターｐＲ
Ｌ２Ｍ（図６）をスクリーニングした。部分塩基配列の
確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであ
ることを確認した。

【００４０】［ベクターｐＴＬ２Ｍの作製］上記ｐＲＬ
２Ｍを鋳型とし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-
TTGACTAGTTATTAATAGTA-3' およびオリゴデオキシリボヌ
クレオチド 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-
3' を合成プライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用
いたＰＣＲによって目的断片を増幅した。制限酵素Ｓｐ
ｅＩおよびＥｃｏＲＩで末端調節し、フェノール抽出、
エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動により約
６００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビー
ズ法で精製した。

【００４１】一方、これとは別に、ｐＲＬ２Ｍを制限酵
素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約４５００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラ
スビーズ法で精製した。これら両者の断片をライゲーシ
ョンの後、大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベ
クターｐＴＬ２Ｍ（図７）をスクリーニングした。部分
塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベ
クターであることを確認した。

【００４２】このようにして作製したｐＴＬ２Ｍを制限
酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、
約５０００塩基対に相当するバンドを切出した。

【００４３】そして、上記遺伝子挿入断片、リンカー断
片およびベクターｐＴＬ２Ｍの二重消化物の計３本を、
ＤＮＡライゲーションキットを用いてライゲーションし
た。これを大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）に導入し
て形質転換した後、図１に示すような、目的のプラスミ
ドｐＴＬ２ＢｍＩを得た。アルカリ−ＳＤＳ法に従って
ｐＴＬ２ＢｍＩを大量調製し、制限酵素地図の作製およ
び塩基配列決定によって、配列番号３の塩基配列を持っ
たプラスミドであることを確認した。

【００４４】［実施例３］発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩ
を用いたシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換 シゾサッカロミセス・ポンベのロイシン要求性株、ｈ^-
ｌｅｕ１−３２（ＡＴＣＣ３８３９９）をロイシン含有
最少培地ＭＢ−ｌｅｕで１０⁷ 細胞数／ｍｌになるまで
生育させた。遠心集菌、水による洗菌後１０⁹ 細胞数／
ｍｌになるように１００ｍＭ酢酸リチウム（ｐＨ５．
０）に懸濁し、３０℃で６０分間インキュベートした。
その後、上記懸濁液１００μｌに、制限酵素ＰｓｔＩで
消化したｐＡＬ７（K. Okazaki et al.: Nucl. Acids R
es. 18, 6485-6489 (1990)）１μｇおよび２μｇの発現
ベクターｐＴＬ２ＢｍＩを１０μｌのＴＥバッファーに
溶かした溶液を加え、５０％ＰＥＧ４０００を２９０μ
ｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０分間、４３℃で
１５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。
次いで遠心分離によりＰＥＧ４０００を除去した後、１
ｍｌの培養液１／２ＹＥＬ−Ｌｅｕに懸濁した。

【００４５】この懸濁液から１００μｌを分取し、さら
に９００μｌの培養液１／２ＹＥＬ−Ｌｅｕで希釈し
て、３２℃３０分間インキュベートした後、３００μｌ
を最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドした。３２℃で３日
間インキュベートし、得られた形質転換体をＧ４１８を
２５μｇ／ｍｌ含むＹＥＡ培地に移し、さらに３２℃で
５日間培養し、得られたクローンを目的とする各形質転
換体とした。

【００４６】一方、これとは別に、癌転移阻害ペプチド
遺伝子を持たないプラスミドｐＴＬ２Ｍ（既述）および
ｐＴＬ２Ｂｍ（特願平５−２４９３１０号明細書）につ
いても、同じ方法で形質転換体を作製し、ネガティブコ
ントロールとした。なお、プラスミドｐＴＬ２Ｂｍは以
下のようにして作製した。

【００４７】［プラスミドｐＴＬ２Ｂｍの作製］国立予
防衛生研究所遺伝子バンクより供与を受けた、ヒト血清
アルブミンｃＤＮＡを含むベクターｐＩＬＭＡＬＢ５を
鋳型とし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-AGACCA
TGGATGCACACACAAGAGTGAGGT-3' およびオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド 5'-CAGGAAACAGCTATGACCAT-3' を合成プ
ライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲに
よって目的断片を増幅した。制限酵素ＮｃｏＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで末端調節し、フェノール抽出、エタノー
ル沈殿の後、アガロースゲル電気泳動により約１８００
塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラスビーズ法で
精製した。

【００４８】これとは別に、ｐＴＬ２Ｍを制限酵素Ａｆ
ｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約５０００塩基対に相当するバンドを切り出し、ガラ
スビーズ法で精製した。

【００４９】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５株を形質転換して目的とするベクターｐＴ
Ｌ２Ｂｍ（図８）をスクリーニングした。部分塩基配列
の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターで
あることを確認した。

【００５０】［実施例４］形質転換体の培養および無細
胞抽出液の調製 抗生物質Ｇ４１８（GIBCO BRL ）を２００μｇ／ｍｌの
濃度で含む５０ｍｌのＹＰＤ培地［（２％グルコース
（和光純薬（株）製）、１％バクトイーストエキス（Di
fco ）、２％バクトペプトン（Difco ）］に、実施例３
で作製した形質転換体を植菌し、３２℃で５日間培養し
た。その培養液から１０⁸ 個の菌体を集菌し、洗菌後、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５) で懸濁し、超
音波破砕を行った。終濃度が１％になるように１０％Ｓ
ＤＳ溶液を加え、８０℃で１５分間加熱した。遠心分離
によって無細胞抽出液（上清）を得た。

【００５１】これとは別に、癌転移阻害タンパク質遺伝
子を持たない上記ｐＴＬ２ＭおよびｐＴＬ２Ｂｍを導入
した形質転換体についても、同様の方法で無細胞抽出液
を作製し、ネガティブコントロールとした。

【００５２】［実施例５］ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による癌転移阻害タンパク質の発現解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、実施例４で作製した各形質
転換体由来の無細胞抽出液について発現解析を行なっ
た。結果を図２に示す。同図から明らかなように、ｐＴ
Ｌ２ｍＢＩによる形質転換体では、コントロールである
ｐＴＬ２Ｂｍによる形質転換体に比較して、分子量６
９，０００のバンド（同図中、＊で示す）が、癌転移阻
害タンパク質を産生していることによって分子量７１，
０００の位置（同図中、＊＊で示す）に移動しているこ
とが検出できた。デンシトメータによって測定したとこ
ろ、癌転移阻害タンパク質の産生量は、全菌体タンパク
質の３０％程度であった。

【００５３】［実施例６］ウエスタンブロッティングに
よる癌転移阻害タンパク質の確認 実施例４で作製した各形質転換体由来の無細胞抽出液に
ついて実施例５と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なっ
た。得られたゲルをＰＶＤＦ膜（Bio-Rad ）に転写し、
癌転移阻害タンパク質に特異的な抗体（A. Isoai et a
l.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 7-14 (199
3)）を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＥＣＬ
（アマシャム（株）製）によって検出した。結果を図３
に示す。同図から明らかなように、癌転移阻害タンパク
質を含む配列に相当する分子量７１, ０００附近の位置
に唯一の明瞭なバンドが得られたことから、該タンパク
質に特異的なアミノ酸配列が含まれているタンパク質が
産生していることが確認された。

【００５４】［実施例７］癌転移阻害タンパク質の精製 ｐＴＬ２ＢｍＩにより形質転換された形質転換体を、Ｇ
４１８を２５μｇ／ｍｌの濃度で含む５０ｍｌのＹＰＤ
培地で３２℃、１日間前培養した後、Ｇ４１８を２００
μｇ／ｍｌ含む１リットルのＹＰＤ培地に１×１０⁸ ／
ｍｌの割合で植菌してさらに４日間培養した。集菌後の
菌体の４倍量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）［１２μＭのＡＰＭＳＦ（和光純薬（株）製）、２
５μＭロイペプチン（和光純薬（株）製）、２ｍＭのＥ
ＤＴＡを含む］に懸濁し等量のガラスビーズ（ビードビ
ーター）を用いて０℃で破砕した。１２，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した沈澱を同じ緩衝液で洗浄した
後、６Ｍグアニジン塩酸と１０ｍＭのジチオスレイトー
ルを含んだ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て５０℃１時間で可溶化した後、１２，０００rpm 、２
０分間遠心分離した上清を０．１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２ｍＭ酸化型
グルタチオンを含んだ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で１００倍（ｖ／ｖ）に４℃で徐々に希釈し
た。１晩４℃で放置後、限外濾過膜（アミコン）にて濃
縮しスーパーロース１２カラムにてゲル濾過し、各画分
についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析し分子量７１，００
０の位置に唯一のバンドが見られた画分を集め精製癌転
移阻害タンパク質とした。

【００５５】［実施例８］精製癌転移阻害タンパク質の
癌細胞浸潤阻害活性の測定 実施例７で精製した癌転移阻害タンパク質について、癌
細胞の浸潤抑制効果を調べた。評価方法は Albini らの
方法（Albini et al.: Cancer Res. 47, 3239-3245 (19
87) ）に従って行った。８μｍのポアサイズを持つポリ
カーボネートフィルターを用い、上層と下層に分けられ
たケモタキセル（クラボウ（株）製）のフィルター上面
に１０μｇのマトリゲル（コラボレーティブ（株）製）
を塗布し、室温で一晩乾燥させた。使用直前に培養液で
膨潤させ、２４穴のカルチャープレートにセットした。
癌細胞はＢ１６メラノーマ由来の高転移性クローンＢ１
６ＦＥ７を使用した。

【００５６】細胞を１．８５ｋＢｑ／ｍｌの［¹²⁵ Ｉ］
ＩＵｄＲ（アマシャム（株）製）存在下で２日間培養し
た。使用直前にトリプシン溶液で細胞を回収した後、
０．１％の牛血清アルブミンを含む培養液に懸濁し、細
胞数と、取り込まれた［¹²⁵ Ｉ］ＩＵｄＲの放射能を計
測した。ケモタキセルの下層には２０μｇ／ｍｌのヒト
フィブロネクチンを入れ、上層には５×１０⁴ 個の細胞
を種々の濃度の癌転移阻害タンパク質と共に入れ、炭酸
ガスインキュベータ中で２０時間培養した。

【００５７】培養終了後、フィルターの上面に残ってい
る細胞を綿棒でかきとり、フィルターをティッシュソル
ビライザー（アマシャム（株）製）で下面に移動した細
胞と共に溶解した後、放射能を計測した。結果を図４に
示す。同図から明らかなように、本癌転移阻害タンパク
質により、癌細胞の浸潤が有意に阻害されることが示さ
れた。

【００５８】

【発明の効果】以上詳述したように本発明によれば、こ
れまで化学的合成方法および結合方法を組合わせてのみ
作製可能であった癌転移阻害タンパク質を組換えＤＮＡ
技術を用いることによって初めて直接的に、しかも高効
率に生産することができるという効果が奏される。

【００５９】したがって本発明における形質転換体を用
いた大量培養により、目的とする癌転移阻害タンパク質
の高い生産性が得られ、工業スケールでの生産に使用す
ることが十分可能である。すなわち医薬品としての癌転
移阻害タンパク質を安定的に供給することが可能になっ
たといえる。

【００６０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６０９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu 20 25 30 Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr 35 40 45 Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp 50 55 60 Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr 65 70 75 80 Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu 85 90 95 Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn 100 105 110 Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe 115 120 125 His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala 130 135 140 Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys 145 150 155 160 Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala 165 170 175 Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala 180 185 190 Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly 195 200 205 Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe 210 215 220 Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr 225 230 235 240 Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp 245 250 255 Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile 260 265 270 Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser 275 280 285 His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro 290 295 300 Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr 305 310 315 320 Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala 325 330 335 Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys 340 345 350 Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His 355 360 365 Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu 370 375 380 Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Lys Gln Leu Gly 385 390 395 400 Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 405 410 415 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly 420 425 430 Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 435 440 445 Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 450 455 460 His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu 465 470 475 480 Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu 485 490 495 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 500 505 510 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 515 520 525 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 530 535 540 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 545 550 555 560 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 565 570 575 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Tyr Met Ala Glu Asp Gly 580 585 590 Asp Ala Lys Thr Asp Gln Ala Glu Lys Ala Glu Gly Ala Gly Asp Ala 595 600 605 Lys 609 配列番号：２ 配列の長さ：１８３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１８３０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA 48 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT 96 CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT 144 GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC 192 AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT 240 CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA 288 CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC 336 CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT 384 CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC 432 AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA 480 AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT 528 GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT 576 TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA 624 GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT 672 CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 720 AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT 768 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC 816 TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC 864 CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT 912 TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT 960 GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA 1008 AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG 1056 ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT 1104 GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG 1152 CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA 1200 GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA 1248 CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA 1296 AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC 1344 TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG 1392 CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG 1440 TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA 1488 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA 1536 GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT 1584 GCA CTT GTT GAG CTT GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA 1632 CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC 1680 AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT 1728 GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAC ATG GCN GAR GAY GGN 1776 GAY GCN AAR ACN GAY CAR GCN GAR AAR GCN GAR GGN GCN GGN GAY GCN 1824 AAR TAA 1830 (式中のN はA,T,G またはC を；Y はT またはC を；R
はA またはG を表す） 配列番号：３ 配列の長さ：１８３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１８３０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA 48 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT CTT 96 CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA GTA ACT 144 GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTA GCT GAT GAG TCA GCT GAA AAT TGT GAC 192 AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC ACA GTT GCA ACT 240 CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC TGT GCA AAA CAA GAA 288 CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC AAA GAT GAC AAC CCA AAC 336 CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT 384 CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC 432 AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA 480 AGG TAT AAA GCT GCT TTT ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT 528 GCC TGC CTG TTG CCA AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT 576 TCG TCT GCC AAA CAG AGA CTC AAA TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA 624 GAA AGA GCT TTC AAA GCA TGG GCA GTG GCT CGC CTG AGC CAG AGA TTT 672 CCC AAA GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 720 AAA GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT 768 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAG GAT TCG ATC 816 TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA AAA TCC 864 CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT GAC TTG CCT 912 TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT TGC AAA AAC TAT 960 GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT TTG TAT GAA TAT GCA 1008 AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG CTG CTG AGA CTT GCC AAG 1056 ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT 1104 GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG 1152 CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA AAC TGT GAG CTT TTT AAG CAG CTT GGA 1200 GAG TAC AAA TTC CAG AAT GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA 1248 CCC CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA 1296 AAA GTG GGC AGC AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC 1344 TGT GCA GAA GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG 1392 CAT GAG AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACA AAA TGC TGC ACA GAG 1440 TCC TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA 1488 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCA 1536 GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA CAA ACT 1584 GCA CTT GTT GAG CTT GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA AAA GAG CAA 1632 CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA GAG AAG TGC TGC 1680 AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG GAG GGT AAA AAA CTT 1728 GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA TAC ATG GCC GAG GAC GGT 1776 GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT GAG GGT GCC GGT GAC GCC 1824 AAG TAA 1830 配列番号：４ 配列の長さ：７３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCC ATG GCC GAG GAC GGT GAC GCC AAG ACC GAC CAA GCT GAG AAG GCT 50 GAG GGT GCC GGT GAC GCC AAG TA 73 配列番号：５ 配列の長さ：７３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 AGCTTA CTT GGC GTC ACC GGC ACC CTC AGC CTT CTC AGC TTG GTC GGT CTT 51 GGC GTC ACC GTC CTC GGC CAT G 73 配列番号：６ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGACCATGGA TGCACACAAG AGTGAGGT 28 配列番号：７ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCACATGTA TAAGCCTAAG GCAGCTTG 28 配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Glu Asp Gly Asp Ala Lys Thr Asp Gln Ala Glu Lys Ala Glu Gly 1 5 10 15 Ala Gly Asp Ala Lys 20 21

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターｐＴＬ２ＢｍＩの構成図である。

【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図である。

【図３】ウエスタンブロット観察図である。

【図４】癌細胞浸潤阻害活性測定結果を示すグラフであ
る。

【図５】発現ベクターｐＲＬ２Ｌの構成図である。

【図６】発現ベクターｐＲＬ２Ｍの構成図である。

【図７】発現ベクターｐＴＬ２Ｍの構成図である。

【図８】発現ベクターｐＴＬ２Ｂｍの構成図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 塚本 洋子 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者 礒合 敦 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内 (72)発明者 熊谷 博道 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地 旭硝子株式会社中央研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列で表される、癌
   転移阻害活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】請求項１に記載のタンパク質をコードす
   る、配列番号２の塩基配列で表される遺伝子。
3. 【請求項３】請求項１に記載のタンパク質をコードす
   る、配列番号３の塩基配列で表される遺伝子。
4. 【請求項４】請求項２または３に記載の遺伝子を含有す
   る組換えベクター。
5. 【請求項５】前記組換えベクターがプラスミドｐＴＬ２
   ＢｍＩである、請求項４に記載の組換えベクター。
6. 【請求項６】請求項４または５に記載の組換えベクター
   で宿主細胞を形質転換してなる、請求項１に記載のタン
   パク質を産生し得る形質転換体。
7. 【請求項７】宿主細胞が分裂酵母シゾサッカロミセス・
   ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）である、請求項
   ６に記載の形質転換体。
8. 【請求項８】請求項６または７に記載の形質転換体を培
   養し、培養物中に産生された癌転移阻害活性を有するタ
   ンパク質を単離し、所望により精製することからなる、
   請求項１に記載のタンパク質の製造方法。