JPH0856661A - ヘキソキナーゼの安定化 - Google Patents
ヘキソキナーゼの安定化Info
- Publication number
- JPH0856661A JPH0856661A JP22602394A JP22602394A JPH0856661A JP H0856661 A JPH0856661 A JP H0856661A JP 22602394 A JP22602394 A JP 22602394A JP 22602394 A JP22602394 A JP 22602394A JP H0856661 A JPH0856661 A JP H0856661A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hexokinase
- meth
- maleic anhydride
- allyl ether
- copolymer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ポリオキシアルキレングリコールアルキル
（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共重合体で化
学修飾することを特徴とするヘキソキナーゼ（ＨＫ）の
安定化。 【効果】 化学修飾されたＨＫは長期間に亘ってその活
性を保存維持することができる。
（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共重合体で化
学修飾することを特徴とするヘキソキナーゼ（ＨＫ）の
安定化。 【効果】 化学修飾されたＨＫは長期間に亘ってその活
性を保存維持することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヘキソキナーゼ（以
下、ＨＫということもある）の安定化方法及び安定化さ
れたＨＫに関するものである。
下、ＨＫということもある）の安定化方法及び安定化さ
れたＨＫに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ヘキソキナーゼは、動物、植物、多くの
微生物が有する普遍的な酵素であってＩ型〜IV型の４種
のアイソザイムが存在する。IV型アイソザイムはグルコ
キナーゼとも呼ばれるが、すべて下記の反応を触媒す
る。 Ｍｇ・ＡＴＰ＋Ｄ−ヘキソーズ→Ｍｇ・ＡＤＰ＋Ｄ−ヘ
キソーズ−６−リン酸
微生物が有する普遍的な酵素であってＩ型〜IV型の４種
のアイソザイムが存在する。IV型アイソザイムはグルコ
キナーゼとも呼ばれるが、すべて下記の反応を触媒す
る。 Ｍｇ・ＡＴＰ＋Ｄ−ヘキソーズ→Ｍｇ・ＡＤＰ＋Ｄ−ヘ
キソーズ−６−リン酸
【０００３】ヘキソキナーゼ（グルコキナーゼ）は、上
記反応を触媒するので、この反応を利用して、クレアチ
ンキナーゼ、グルコースの測定等各種のアッセイや生体
成分の分析、測定が行われている。
記反応を触媒するので、この反応を利用して、クレアチ
ンキナーゼ、グルコースの測定等各種のアッセイや生体
成分の分析、測定が行われている。
【０００４】例えば、クレアチンキナーゼの測定につい
ては、ＩＦＣＣ及びＪＦＣＣによる下記表１に示す勧告
法が提案されており、現在、市販されている測定キット
のほとんどは、この勧告法にしたがっている。また、グ
ルコースもこの勧告法を利用して測定が行われている。
ては、ＩＦＣＣ及びＪＦＣＣによる下記表１に示す勧告
法が提案されており、現在、市販されている測定キット
のほとんどは、この勧告法にしたがっている。また、グ
ルコースもこの勧告法を利用して測定が行われている。
【０００５】
【表１】
【０００６】クレアチンキナーゼの測定は、心筋梗塞な
どの診断、治療に重要な知見を与えるものであり、医学
上はもとより社会的にも大きな意義を有するものであ
る。また、グルコースの測定は、血中、尿中の血糖値の
測定に用いられ、糖尿病などの疾病のモニタリングに重
要な意義を有していることはいうまでもない。
どの診断、治療に重要な知見を与えるものであり、医学
上はもとより社会的にも大きな意義を有するものであ
る。また、グルコースの測定は、血中、尿中の血糖値の
測定に用いられ、糖尿病などの疾病のモニタリングに重
要な意義を有していることはいうまでもない。
【０００７】ヘキソキナーゼは、各種のアッセイに広く
利用され、特に上記２種の測定には不可欠の成分であっ
て、これらの測定キットにはＨＫは必らず包含されてい
る。しかしながら、ＨＫは生体由来の酵素であるため、
特にその活性の安定性には常に不安がつきまとってい
る。
利用され、特に上記２種の測定には不可欠の成分であっ
て、これらの測定キットにはＨＫは必らず包含されてい
る。しかしながら、ＨＫは生体由来の酵素であるため、
特にその活性の安定性には常に不安がつきまとってい
る。
【０００８】上記診断や測定に用いる試薬の安定性は、
診断結果の信頼性を高めるために常に大きな問題とされ
ている。したがって、ＨＫの安定性の向上は、それを用
いた体外診断薬や測定試薬の保存安定性の向上にきわめ
て重要であり、更には、得られた診断結果や測定結果の
信頼性の向上にとっても非常に重要である。また、測定
キットの生産者からすれば、ＨＫの安定性の向上は、保
存期間やシェルフライフの延長につながり、コストの大
幅低下が期待される。
診断結果の信頼性を高めるために常に大きな問題とされ
ている。したがって、ＨＫの安定性の向上は、それを用
いた体外診断薬や測定試薬の保存安定性の向上にきわめ
て重要であり、更には、得られた診断結果や測定結果の
信頼性の向上にとっても非常に重要である。また、測定
キットの生産者からすれば、ＨＫの安定性の向上は、保
存期間やシェルフライフの延長につながり、コストの大
幅低下が期待される。
【０００９】本発明は、特定の共重合体を用いてＨＫを
化学的に修飾することにより該酵素を安定化させること
を基本的技術思想とするものである。
化学的に修飾することにより該酵素を安定化させること
を基本的技術思想とするものである。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、ＨＫの安定化技術の確立という当業界
における要望に応える目的でなされたものである。
術の現状に鑑み、ＨＫの安定化技術の確立という当業界
における要望に応える目的でなされたものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであり、各方面から検討した
けれどもＨＫには酵母などの微生物から抽出、精製した
もののほか、遺伝子工学によって調製されたもの等各種
の起源のものがあり、そのうえ、アイソザイムも存在し
ているため、これらすべてのＨＫに対して有効な安定化
方法を開発するには至らなかった。
成するためになされたものであり、各方面から検討した
けれどもＨＫには酵母などの微生物から抽出、精製した
もののほか、遺伝子工学によって調製されたもの等各種
の起源のものがあり、そのうえ、アイソザイムも存在し
ているため、これらすべてのＨＫに対して有効な安定化
方法を開発するには至らなかった。
【００１２】そこで発想の転換を図る必要にせまられ、
従来からＨＫの安定化に用いられてる方法とは全く別の
方法について各種検討したところ、全く予期せざること
に、酵素の安定化とは全く関係のない免疫の分野におい
て、免疫反応の防止剤として知られているポリオキシア
ルキレングリコールアルキル（メタ）アリルエーテル・
無水マレイン酸共重合体を修飾剤として使用したとこ
ろ、ＨＫの保存安定性が大幅に向上することを発見し
た。
従来からＨＫの安定化に用いられてる方法とは全く別の
方法について各種検討したところ、全く予期せざること
に、酵素の安定化とは全く関係のない免疫の分野におい
て、免疫反応の防止剤として知られているポリオキシア
ルキレングリコールアルキル（メタ）アリルエーテル・
無水マレイン酸共重合体を修飾剤として使用したとこ
ろ、ＨＫの保存安定性が大幅に向上することを発見し
た。
【００１３】本発明は、この新知見に基き、更に研究の
結果、遂に完成されたものである。以下、本発明につい
て詳しく説明する。
結果、遂に完成されたものである。以下、本発明につい
て詳しく説明する。
【００１４】本発明にしたがってＨＫを化学的に修飾す
るには、修飾剤とＨＫとを反応させればよい。本発明に
おいて、修飾剤としては、ポリオキシアルキレングリコ
ールアルキル（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸
共重合体が使用される。本共重合体であればすべてのタ
イプのものが使用できるが、例えば、下記化２で示され
る一般式（Ｉ）を有する共重合体も有利に使用できる。
るには、修飾剤とＨＫとを反応させればよい。本発明に
おいて、修飾剤としては、ポリオキシアルキレングリコ
ールアルキル（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸
共重合体が使用される。本共重合体であればすべてのタ
イプのものが使用できるが、例えば、下記化２で示され
る一般式（Ｉ）を有する共重合体も有利に使用できる。
【００１５】
【化２】
【００１６】一般式（Ｉ）で示される共重合体であれ
ば、すべてのタイプのものが使用でき、非限定例として
は、Ｒが低級アルキル基、ｎが８〜２０、平均分子量７
０００〜１００００の共重合体が例示される。
ば、すべてのタイプのものが使用でき、非限定例として
は、Ｒが低級アルキル基、ｎが８〜２０、平均分子量７
０００〜１００００の共重合体が例示される。
【００１７】ポリオキシアルキレングリコールアルキル
（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共重合体とヘ
キソキナーゼとを接触せしめることにより、共重合体
は、その無水マレイン酸残基が、ＨＫのリシンのεアミ
ノ基もしくはＮ末端のαアミノ基及びシステインのＳＨ
基や水酸基と反応して、ＨＫと共有結合する。
（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共重合体とヘ
キソキナーゼとを接触せしめることにより、共重合体
は、その無水マレイン酸残基が、ＨＫのリシンのεアミ
ノ基もしくはＮ末端のαアミノ基及びシステインのＳＨ
基や水酸基と反応して、ＨＫと共有結合する。
【００１８】そのため、共重合体とＨＫとの反応は、両
者を水系溶媒、緩衝液中で行えばよいが、その際、εア
ミノ基が非解離の状態になりやすい弱アルカリ性のｐＨ
で反応を進めるのが好適である。弱アルカリ性ｐＨとし
ては、８．０〜９．０が最適であるが、ＨＫと共重合体
とが安定に結合しうる条件であれば上記範囲に限定され
ることなくいずれでも構わない。
者を水系溶媒、緩衝液中で行えばよいが、その際、εア
ミノ基が非解離の状態になりやすい弱アルカリ性のｐＨ
で反応を進めるのが好適である。弱アルカリ性ｐＨとし
ては、８．０〜９．０が最適であるが、ＨＫと共重合体
とが安定に結合しうる条件であれば上記範囲に限定され
ることなくいずれでも構わない。
【００１９】ＨＫと共重合体との反応に当り、グルコー
スを反応系に添加すれば、更に収率が増大し、化学修飾
が有効且つ効率的に行われる。グルコースの添加量は
０．０１〜１０ｍＭ程度となるように添加すればよい。
なお、ＨＫと共重合体との反応比率は、ＨＫ１部に対し
て共重合体０．５〜２０部が好適であるが、コストの面
を無視すればこの範囲に限定されるものではない。
スを反応系に添加すれば、更に収率が増大し、化学修飾
が有効且つ効率的に行われる。グルコースの添加量は
０．０１〜１０ｍＭ程度となるように添加すればよい。
なお、ＨＫと共重合体との反応比率は、ＨＫ１部に対し
て共重合体０．５〜２０部が好適であるが、コストの面
を無視すればこの範囲に限定されるものではない。
【００２０】このようにして化学修飾したＨＫは、きわ
めて高い保存安定性を示し、緩衝液中において、３７℃
で３５日間保存しても活性の低下はほとんど認められな
かった。以下、本発明の実施例について述べる。
めて高い保存安定性を示し、緩衝液中において、３７℃
で３５日間保存しても活性の低下はほとんど認められな
かった。以下、本発明の実施例について述べる。
【００２１】
【実施例１：化学修飾ＨＫの作製（１）】１００ｍｇの
酵母由来Ｐ−Ｉアイソザイムのヘキソキナーゼ（ＨＫ）
を、０．５Ｍホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）に
平衡化し、更に１ｍＭになるようにグルコースを添加し
た。その後、一般式（Ｉ）で示されるポリオキシアルキ
レングリコール（メタ）アリルエーテル・無水マレイン
酸共重合体（ｎ＝１１、Ｒ＝メチル、平均分子量＝１２
０００）を６００ｍｇ添加し、充分混合し、４℃で一夜
攪拌した。
酵母由来Ｐ−Ｉアイソザイムのヘキソキナーゼ（ＨＫ）
を、０．５Ｍホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）に
平衡化し、更に１ｍＭになるようにグルコースを添加し
た。その後、一般式（Ｉ）で示されるポリオキシアルキ
レングリコール（メタ）アリルエーテル・無水マレイン
酸共重合体（ｎ＝１１、Ｒ＝メチル、平均分子量＝１２
０００）を６００ｍｇ添加し、充分混合し、４℃で一夜
攪拌した。
【００２２】反応終了後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２Ｓ
カラムにて０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０に
平衡化した。
カラムにて０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０に
平衡化した。
【００２３】
【実施例２：化学修飾ＨＫの作製（２）】Ｐ−Ｉアイソ
ザイムにかえてＰ−IIアイソザイムのＨＫについて、実
施例１と同じ処理を行って、該共重合体で修飾したＨＫ
を作製した。
ザイムにかえてＰ−IIアイソザイムのＨＫについて、実
施例１と同じ処理を行って、該共重合体で修飾したＨＫ
を作製した。
【００２４】
【実施例３：化学修飾ＨＫの作製（３）】実施例１にお
いて、共重合体として一般式（Ｉ）においてｎ＝４５、
Ｒ＝メチル、平均分子量＝５００００の共重合体を用い
たほかは実施例１と同様の処理を行って、化学修飾した
ＨＫを作製した。
いて、共重合体として一般式（Ｉ）においてｎ＝４５、
Ｒ＝メチル、平均分子量＝５００００の共重合体を用い
たほかは実施例１と同様の処理を行って、化学修飾した
ＨＫを作製した。
【００２５】
【実施例４：化学修飾ＨＫの安定性（１）】実施例２で
作製した化学修飾ヘキソキナーゼ（Ｐ−IIアイソザイ
ム）とその修飾前のヘキソキナーゼを、それぞれ１ｕ／
ｍｌになるように以下の試薬に添加した。
作製した化学修飾ヘキソキナーゼ（Ｐ−IIアイソザイ
ム）とその修飾前のヘキソキナーゼを、それぞれ１ｕ／
ｍｌになるように以下の試薬に添加した。
【００２６】（試薬）：１００ｍＭイミダゾール緩衝液
（ｐＨ６．７）、２ｍＭ ＡＤＰ、６．３ｍＭ ＡＭ
Ｐ、２０ｍＭ ＮＡＣ、３０μＭ ＡＰＳＡ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、２０ｍＭグ
ルコース
（ｐＨ６．７）、２ｍＭ ＡＤＰ、６．３ｍＭ ＡＭ
Ｐ、２０ｍＭ ＮＡＣ、３０μＭ ＡＰＳＡ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、２０ｍＭグ
ルコース
【００２７】次いで、これらをそれぞれ３７℃に３５日
間加温保持した。その結果、修飾前のＨＫの活性は０．
４２ｕ／ｍｌに減少したのに対し、修飾されたＨＫの活
性は０．６５ｕ／ｍｌであることが確認された。
間加温保持した。その結果、修飾前のＨＫの活性は０．
４２ｕ／ｍｌに減少したのに対し、修飾されたＨＫの活
性は０．６５ｕ／ｍｌであることが確認された。
【００２８】
【実施例５：化学修飾ＨＫの安定性（２）】実施例１で
作製したＰ−Ｉアイソザイムの修飾ＨＫと非修飾Ｐ−Ｉ
アイソザイムのＨＫを２種の市販品Ａ及びＢと比較し
て、安定性試験を行った。その方法は実施例４と同様で
あった。
作製したＰ−Ｉアイソザイムの修飾ＨＫと非修飾Ｐ−Ｉ
アイソザイムのＨＫを２種の市販品Ａ及びＢと比較し
て、安定性試験を行った。その方法は実施例４と同様で
あった。
【００２９】３７℃で３５日間加温保持した結果を図１
に示した。図示した結果から明らかなように、本発明に
係る修飾ＨＫは、非修飾ＨＫはもとより、市販品Ａ（酵
母Ｐ−IIアイソザイムのリコンビナント品を更に修飾し
た製品）及び市販品Ｂ（酵母Ｐ−Ｉアイソザイムのリコ
ンビナント品を更に修飾した製品）と比較しても、安定
性に卓越しており、ほとんど１００％活性が保存されて
いた。
に示した。図示した結果から明らかなように、本発明に
係る修飾ＨＫは、非修飾ＨＫはもとより、市販品Ａ（酵
母Ｐ−IIアイソザイムのリコンビナント品を更に修飾し
た製品）及び市販品Ｂ（酵母Ｐ−Ｉアイソザイムのリコ
ンビナント品を更に修飾した製品）と比較しても、安定
性に卓越しており、ほとんど１００％活性が保存されて
いた。
【００３０】
【発明の効果】本発明により、共重合体で処理して化学
修飾することによって、ＨＫの保存安定性を大幅に高め
ることがはじめて可能となった。
修飾することによって、ＨＫの保存安定性を大幅に高め
ることがはじめて可能となった。
【図１】化学修飾ＨＫ、非修飾ＨＫ、市販品Ａ、Ｂの３
７℃での保存安定性を示す。
７℃での保存安定性を示す。
Claims (5)
- 【請求項１】 ポリオキシアルキレングリコールアルキ
ル（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共重合体で
化学修飾することを特徴とするヘキソキナーゼの安定化
方法。 - 【請求項２】 ポリオキシアルキレングリコールアルキ
ル（メタ）アリルエーテル・無水マレイン酸共重合体
が、下記化１に示される一般式（Ｉ）で表わされる共重
合体であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。 【化１】 - 【請求項３】 グルコースの存在下に化学修飾を行うこ
と、を特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 ヘキソキナーゼがＩ型〜IV型のアイソザ
イムの少なくともひとつであること、を特徴とする請求
項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記
載の方法により化学修飾され安定化されたヘキソキナー
ゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22602394A JPH0856661A (ja) | 1994-08-29 | 1994-08-29 | ヘキソキナーゼの安定化 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22602394A JPH0856661A (ja) | 1994-08-29 | 1994-08-29 | ヘキソキナーゼの安定化 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856661A true JPH0856661A (ja) | 1996-03-05 |
Family
ID=16838580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22602394A Pending JPH0856661A (ja) | 1994-08-29 | 1994-08-29 | ヘキソキナーゼの安定化 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0856661A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113528499A (zh) * | 2021-05-29 | 2021-10-22 | 北京华宇亿康生物工程技术有限公司 | 一种可以稳定保存己糖激酶（hk）的缓冲体系 |
-
1994
- 1994-08-29 JP JP22602394A patent/JPH0856661A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113528499A (zh) * | 2021-05-29 | 2021-10-22 | 北京华宇亿康生物工程技术有限公司 | 一种可以稳定保存己糖激酶（hk）的缓冲体系 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101469344B (zh) | 一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂及其应用 | |
| EP0049475B1 (en) | Soluble stabilized enzymes | |
| IE49039B1 (en) | A reagent for the determination of lipase | |
| JP2539225B2 (ja) | グルコ−ス定量用安定化液体酵素組成物、それを用いる試薬キット及び定量方法 | |
| US3791931A (en) | Reagent and method for determination of lactate dehydrogenase | |
| EP0043181B1 (en) | Measuring composition containing enzymes | |
| NL8200587A (nl) | Werkwijze voor een immunochemische enzymbepaling. | |
| JPH0670798A (ja) | 尿酸測定用試薬組成物 | |
| JPH01108997A (ja) | 血液又は血液から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定する方法及び試薬、及び非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去する方法 | |
| JP2711721B2 (ja) | グルコースを含有する試料中の１，５―アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JP3696267B2 (ja) | 生理活性蛋白質の安定化方法 | |
| CN106093386A (zh) | 一种测定肌酸激酶同工酶（ck‑mb）的试剂盒 | |
| EP0513914A1 (en) | Stabilization of the enzyme urate oxidase in liquid form | |
| JPH0391494A (ja) | 分析対象濃度の酵素的測定方法 | |
| EP0104780B1 (en) | Measurement of alpha-amylase activity | |
| JPS6017347A (ja) | 一種以上の酵素を利用する検定方法 | |
| JP2818696B2 (ja) | Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 | |
| EP0387697A2 (en) | Determination of aminotranferases | |
| JP4639757B2 (ja) | 電解質測定用組成物 | |
| JPS58216700A (ja) | レシチン：コレステロールアシルトランスフエラーゼを用いる全コレステロール分析 | |
| JPH0155880B2 (ja) | ||
| JP7446875B2 (ja) | Ｌ－カルニチン測定方法及びｌ－カルニチン測定キット | |
| JP3614962B2 (ja) | アンモニウムイオンを消去する方法及び試料中の特定成分を測定する方法 | |
| JPS59159798A (ja) | 生体体液成分の測定法 | |
| JPS59166084A (ja) | 安定な酵素試薬の製造法 |