JPH085797B2 - 細胞増殖刺激剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般的はPEGF類似体の製造に関し、更に具
体的には真核生物における生物活性を有するPDGF類似体
の発現に関する。

〔従来の技術〕

ヒトの血小板由来生長因子（PDGF）は、葉間由来の細
胞のための血清中の主要なマイトジェ蛋白質であること
が示されている。これは、血小板抽出物についての多く
の研究、または培養された平滑筋細胞、線維芽細胞およ
び神経膠細胞における細胞増殖あるいはDNA合成（細胞
分裂に必須）の精製したPDGFによる誘導の研究によっ
て、詳細に説明されている〔ロス（Ross）ら、PNAS、71
巻、1207頁、1974年；コーラー（Kohler）とリプトン
（Lipton）、Exp.Cell Res.、87巻、297頁、1974年；ウ
ェスターマーク（Westermark）と（Westeson）、Exp.Ce
ll Res.98巻、170頁、1976年；ヘルジン（Heldin）ら、
J.Cell Physiol.、105巻、235頁、1980年；ライネス（R
aines）とロス（Ross）、J.Biol.Chem.257巻、5154頁、
1982年〕。更に、PDGFは、マイトジェンとしてのPDGFに
反応する細胞にとって強力な化学誘引物質である〔グロ
テンドルスト（Grotendorst）ら、J.Cell Physiol.、11
3巻、261頁、1982年；セッパ（Seppa）ら、J.Cell Bio
l.92巻、584頁、1982年〕。マイトジェンが走化性剤と
しても作用する場合は一般的ではない。PDGFはそのマイ
トジェン活性により、培養されている哺乳類の細胞の生
長に対して定義された媒質の重要な成分として有用であ
り、動物細胞生物学の研究に多様な用途を有する重要な
研究試薬となっている。

生体中では、PDGFは、通常は血小板のアルファ顆粒に
保存されて循環する。動脈の内皮層が傷つけられると、
血小板が露出した結合組織に付着して、それらの顆粒を
放出する。放出されたPDGFは、線維芽細胞および平滑筋
細胞を損傷部位に走化的に引付けて、傷修復法の一部と
してそれらの集中的増殖を起こすものと考えられている
（ロス（Ross）とグロムセット（Glomset）、N.Eng.J.o
f Med.、295巻、369頁、1976年）。

損傷に対するこの反応の一部として、血小板によって
放出されたPDGFは、心筋梗塞および脳梗塞の主要な原因
の一つであるアテローム性硬化症の発生の要因となると
考えられてきた〔ロス（Ross）とグロムセット（Glomse
t）、前掲〕。従来のアテローム性硬化症の予防と治療
法は、高血圧患者の血圧を低下させ且つ高コレステロー
ル血症患者の高コレステロール水準を低下させるといっ
た、病気による危険因子を低下させることに局限されて
いた。

近年の研究によれば、PDGFとシアミン肉腫ウイルス
（SSV）の形質転換蛋白質と考えられているものからな
る２つの蛋白質鎖の少なくとも一方は、同一または緊密
に関連した細胞性遺伝子から生じたものであることが示
されている。詳細には、PDGFの部分アミノ酸配列をコン
ピューター分析したところ、これはSSVの遺伝子生成
物、p28^sisと著しく相同性が高いことが明らかになった
〔ドゥリトル（Doolittle）ら、Science、221巻、275
頁、1983年；ウォーターフィールド（Waterfield）ら、
Nature、304巻、35頁、1984年；およびジョンソン（Joh
nson）ら、EMBO J.、３巻、921頁、1984年〕。また、更
に近年の研究では、p28^sisとPDGFは、構造上の類似性と
共に抗原的類似性を示すことが明らかになっている〔ロ
ビンス（Robbins）ら、Nature、305巻、605頁、1983
年；ニーマン（NNiman）、Nature、307巻、180頁、1984
年〕。

デベアー（Devare）らによってCell、36巻、43頁、19
84年にまとめられているように、従来は、形質転換され
る微生物のｖ−sis遺伝子を発現せしめることが試みら
れてきたが、それらはマイドジェン物質を産生すること
には成功しなかった。更に近年では、融合蛋白質として
のE.コリー（E.coli）におけるp28^sisの産生について報
告されている〔ワング（Wang）ら、J.Biol.Chem.、259
巻、10645頁、1984年〕。この蛋白質は、PDGFと拮抗し
てPDGFリセプター部位へ結合する。SSVの形質転換され
た齧歯類の細胞は、PDGF様のマイトジェン活性を示すこ
とが報告されているが〔デウエル（Deuel）ら、Scienc
e、221巻、1348頁、1983年；オウエン（Owen）ら、Scie
nce、225巻、54頁、1984年〕、この活性がSSVからの遺
伝子産生物によるものであるのかどうかは明らかではな
い。更に、SSV以外の多種多様なウイルスによって形質
転換された細胞は、培地中にPDGF様マイトジェンを産生
する〔ボウエン−ポープ（Bowen−Pope）ら、PNAS、81
巻、2396頁、1984年〕。

〔発明が解決しようとする問題点〕

天然のPDGFは出発物質としてのヒト血漿または血小板
から単利されるが、出発物質の入手が限られているた
め、上記方法は複雑で費用のかかる方法である。更に、
PDGFはその極めて低い存在量及び生化学的特性のため、
他の血清成分から高収量で精製することは困難である。
更に、ヒト血液に由来する生成物の培養への使用は、例
えば肝炎ウイルス、サルトメガロウイルスまたはHIVに
よる汚染によって病気が伝染する危険性を有している。

線維芽細胞または平滑筋細胞の増殖を必要とする傷の
治療でのPDGFの臨床的応用および培養における哺乳類細
胞の生長に対して定義された培地の重要な成分としての
その価値の観点では、マイトジェン活性を有する標準的
PDGF様の蛋白質分子を有用な量で産生することは極めて
重要である。

更に、PDGFおよびPDGF類似体を比較的多量に産生する
能力は、腫瘍形成過程におけるｖ−sis蛋白質、p28^sis
の推定上の役割を評価するための有用な手段となる。

更に、動脈壁のインタマル（intamal）層における平
滑筋細胞の局部的蓄積はアテローム性硬化症の発生にと
って中心的であるので〔ロス（Ross）とグロムセット
（Glomset）、前掲〕、アテローム性硬化症の予防と治
療は平滑筋細胞の増殖を抑制することである。多量のPD
GFを製造することができれば、阻害剤の開発またはアテ
ローム性硬化症に罹っている固体のPDGFの生体内活性を
防止または妨げる特殊な方法の設計に有用である。

［問題点を解決するための手段］ 要約して言えば、本発明は、真核細胞における各種の
生物活性を有するPDGF類似体を発現させる方法を開示す
る。一般的には、本発明の方法は、生物活性を有するPD
GF類似体を真核細胞において発現させ且つ分泌させるこ
とができるDNA造成物を真核宿主細胞に導入することか
らなる。このDNA造成物は、転写プロモーターを有し、
その下流に適当なDNA配列を有している。

本発明の一つの観点では、このDMA配列は、PDGFのＡ
−鎖に実質的に相同であるポリペプチドをコードする。
本発明のもう一つの観点では、DNA配列は、PDGFのＢ−
鎖に実質的に相同なポリペプチドをコードする。本発明
の第三の観点では、DNA配列の一部はPDGFのＡ−鎖の少
なくとも一部分に実質的に相同なポリペプチドをコード
し、上記DNA配列の他の部分がPDGFのＢ−鎖の少なくと
も一部分に実質的に相同なポリペプチドをコードし、こ
れらのDNA配列の部分がPDGFと実質的に同じ生物活性を
有する蛋白質をコードする。

更にもう一つの本発明の観点では、このDNA造成物は
転写プロモーター及びその下流に存在するPDGFのＡ−鎖
に実質的に相同なポリペプチド鎖をコードするDAA配
列、並びに転写プロモーター及びその下流に存在するPD
GFのＢ−鎖に実質的に相同なポリペプチド鎖をコードす
るDNA配列を有し、これらの鎖がヘテロダイマーを形成
するようになっている。上記およびその他のDNA配列を
利用する方法によって産生される蛋白質生成物も開示さ
れる。

本発明は、真核細胞における生物活性を有するPDGF類
似体の発現及び分泌を行うことができるその他の各種DN
A造成物をも開示する。これらのDNA造成物は、転写プロ
モーター及びその下流に存在する好適なDNA配列を有す
る。上記の様に、好適なDNA造成物は、PDGFのＡ−鎖お
よびＢ−鎖に実質的に相同な蛋白質をコードするDNA配
列を有する。更に、DNA配列はPDGFのＡ−鎖の少なくと
も一部に実質的に相同なポリペプチドをコードする部
分、及びPDGFのＢ−鎖の少なくとも一部に実質的に相同
なポリペプチドをコードする部分を有していてもよい。
更に、このDNA造成物はPDGFのＡ−鎖およびＢ−鎖に実
質的に相同なポリペプチド鎖をコードするDNA配列を下
流に含む転写プロモーターを有し、これらの鎖がヘテロ
ダイマーを形成するようにすることができる。

上記のようなDNA造成物で形質転換した真核宿主細胞
も、開示される。これに関する好ましい真核宿主細胞
は、酵母細胞である。

本発明のもう一つの観点では、哺乳類の細胞の生長を
促進する方法であって、これらの細胞を上記のようなDN
A造成物で形質転換された真核宿主細胞によって発現さ
れる生物活性を有するPDGF類似体と共にインキュベート
する方法と、真核細胞から蛋白質の分泌を行わせること
ができるシグナル配列を開示する。

本発明のもう一つの観点では、２個のポリペプチド鎖
を有する蛋白質であって、上記鎖のそれぞれが実質的に
PDGFのＡ−鎖に相同であるものを開示する。これらのポ
リペプチド鎖は、PDGFのＡ−鎖に実質的に同一であって
もよい。本発明の目的では、「実質的に同一なポリペプ
チド鎖」とは、アミノ酸レベルで互に少なくとも80％相
同な鎖を意味する。本発明において、「実質的に相同
な」という用語は、互に少なくとも30％相同な配列を指
す。

更にもう一つの本発明の観点では、２個のポリペプチ
ド鎖を有する蛋白質であって、これらの鎖の一方がPDGF
のＡ−鎖またはＢ−鎖の部分に実質的に同一なアミノ酸
配列のモザイクであり、第二の鎖がPDGFのＡ−鎖または
Ｂ−鎖に実質的に相同であり、この蛋白質がPDGFと実質
的に同じ生物活性を有するものが開示される。これらの
ポリペプチド鎖は、互に実質的に同一であってもよい。
また、この蛋白質は２個のポリペプチド鎖からなり、そ
れぞれの鎖がPDGFのＡ−鎖またはＢ−鎖に実質的に同一
なアミノ酸配列のモザイクであって、この蛋白質がPDGF
と実質的に同一な生物活性を有していてもよい。

更に、PDGFのＡ−鎖およびＢ−鎖の変異体および誘導
体であるポリペプチドからなる蛋白質も開示される。こ
れらの蛋白質は、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの
両方を包含する。Ａ−鎖およびＢ−鎖に対するこれらの
改変は、基本的に２つの広範囲な種類、すなわちアミノ
酸欠失およびアミノ酸置換である。

好ましいアミノ酸置換は、選択されたシステイン残基
の他にアミノ酸による置き換え、並びに他のアミノ酸の
置換を包含し、その置換は生成分子の生物活性を破壊し
ないものである。本発明の詳細な態様では、10位にＡ−
鎖のシステイン残基または16位のＢ−鎖のシステイン残
基の置換を含む蛋白質が開示される。他の好ましいアミ
ノ酸置換はＢ−鎖のフェニルアラニン残基のチロシン残
基による置換を包含する。

アミノ酸欠失に関しては、（ａ）アミノ酸９〜アミノ
酸104、（ｂ）アミノ酸23〜アミノ酸104、（ｃ）アミノ
酸９〜アミノ酸95、（ｄ）アミノ酸23〜アミノ酸95、ま
たは（ｅ）アミノ酸１〜アミノ酸95のPDGFのＡ−鎖に実
質的に同一なポリペプチド鎖であって、Ａ−鎖自体はア
ミノ酸１〜アミノ酸104からなるものが開示される。更
に、ポリペプチド鎖であって、（ａ）アミノ酸15〜アミ
ノ酸109、（ｂ）アミノ酸29〜アミノ酸109、（ｃ）アミ
ノ酸15〜アミノ酸101、（ｄ）アミノ酸29〜アミノ酸10
1、または（ｅ）アミノ酸〜アミノ酸101のPDGFのＢ−鎖
に実質的に同一であり、Ｂ−鎖自体はアミノ酸１〜109
からなるものも開示される。本明細書に記載のアミノ−
および／またはカルボキシ−末端アミノ酸を除去する
と、生物活性を有するより小形の分子を生じ、これらの
分子はより広範な治療用途を有する。また、上記蛋白質
は、第９図のＡ−鎖アミノ酸１〜アミノ酸104のアミノ
酸配列またはＢ−鎖のアミノ酸１〜アミノ酸109のアミ
ノ酸配列を有することもできる。

本発明のもう一つの観点では、２個の実質的に同一な
ポリペプチド鎖を有する蛋白質であって、上記鎖のそれ
ぞれがPDGFのＡ−鎖に実質的に相同であるものと、生理
的に許容される担体または希釈剤とを含んでなる治療組
成物が開示される。上記のように、ポリペプチド鎖は、
PDGFのＡ−鎖に実質的に同一であってもよい。また、上
記のようなPDGFのＡ−鎖の変異体および誘導体からなる
蛋白質も、本発明の治療組成物に使用するのに好適であ
る。

更にもう一つの本発明の観点では、２個のポリペプチ
ド鎖を有する蛋白質であって、鎖の一方がPDGFのＡ−鎖
またはＢ−鎖の部分に実質的に同一なアミノ酸配列のモ
ザイクであり、上記鎖のもう一方がPDGFのＡ−鎖または
Ｂ−鎖に実質的に相同であり、この蛋白質がPDGFと実質
的に同じ生物活性を有するものと、生理的に許容される
担体または希釈剤とを含んでなる治療組成物が開示され
る。また、この蛋白質は、２個のポリペプチド鎖からな
り、鎖のそれぞれがPDGFのＡ−鎖またはＢ−鎖に実質的
に同一なアミノ酸配列のモザイクであり、この蛋白質が
PDGFと実質的に同じ生物活性を有するものであってもよ
い。上記のように、これらのポリペプチド鎖は、互に実
質的に同一であってよい。更に、上記のようなPDGFのＡ
−鎖またはＢ−鎖の変異体または誘導体からなる蛋白質
も、本発明の治療組成物に使用するのに好適である。

本発明の関連した特徴は、温血動物における傷治療過
程を促進する方法に関する。この方法は、動物に上記蛋
白質の１種以上の治療上有効量と生理的に許容される担
体または希釈剤を投与することからなる。

本発明のその他の特徴は、以下の詳細な説明と添付を
図面を参照することによって明らかになるであろう。

［具体的な説明］ 本発明を説明する前に、これ以後に使用する幾つかの
用語の定義を説明することによって、本発明の理解の一
助とする。

ポリペプチド：アミノ酸のポリマー。

リーディングフレーム：アミノ酸の連続的拡がりをコー
ドするヌクレオチドコドンの配置。mRNAの翻訳の際に、
適当なリーディングフレームが保持されなければならな
い。例えば、配列GCUGGUUGUAAGは、Ｇから開始するか、
Ｃから開始するか、Ｕから開始するかによって３種のリ
ーディングフレームまたは相で翻訳することができ、し
たがって３種の異なるペプチド生成物を生成することが
できる。鋳型の翻訳はAUGコドンで開始し、特定のアミ
ノ酸のコドンにより続き、翻訳終結コドンの一つで終了
する。

コード配列：適当なリーディングフレームが直接に蛋白
質のアミノ酸をコードするDNA配列。

相補的DNA:cDNAとも表わす。mRNA鋳型に存在する配列か
ら酵素的に合成されたDNA分子または配列、またはかか
る分子のクローン。

分泌シグナル配列：シグナルペプチドをコードする遺伝
子またはcDNAの部分。シグナルペプチドは、細胞の分泌
経路へのトランスロケーションを合図する分泌蛋白質に
おけるアミノ配列である。シグナルペプチドは、一般的
には蛋白質の発端（アミノ末端）に存在し、長さが約20
〜40個のアミノ酸であり、中心付近に約９〜10個の疎水
性アミノ酸の拡がりを有する。シグナル配列は、分泌過
程中に蛋白質分解的に蛋白質から切り離される。

細胞表面リセプター：細胞表面に接近する分子と特異的
に相互作用するまたは結合する細胞の表面における蛋白
質分子。リセプターが同族（cognate）分子と結合した
後、それは細胞の生理に特異的な変化を生じさせる。

マイトジェン：細胞の有糸分裂を促進する分子。有糸分
裂は、無性体細胞分裂であって、親細胞と同数の染色体
を有する２個の娘細胞を生じる。

形質転換：精製されたDNAの導入によって、受容細胞ま
たは微生物の遺伝子型を安定且つ遺伝的に変化させる方
法。これは、典型的には受容生物の表現型における変化
によって検出される。

転写：構造遺伝子からmRNA鋳型を産生する方法。

発現：構造遺伝子またはcDNAを用いて開始するポリペプ
チドの産生法であり、転写と翻訳との組合せである。発
現ベクターは、ベクター上に支持された遺伝子またはcD
NAの発現を可能にするように設計されたプラスミド由来
の造成物である。

プラスミド：プラスミドが宿主細胞内で複製されるよう
にした完全「レプリコン」からなる染色体外の二重鎖DN
A配列。プラスミドが単細胞生物内におかれる場合に
は、この生物の特徴はプラスミドのDNA配列の発現の結
果として変化しまたは形質転換することができる。例え
ば、テトラサイクリン耐性（tet^R）の遺伝子を有するプ
ラスミドは、テトラサイクリンに予め感受性を有するよ
うにしておいた細胞を、テトラサイクリンに耐性な細胞
にする。

酵母プロモーター：酵母遺伝子から上流のDNA配列であ
って、その転写を促進するもの。

生物学的活性：生物学的関連において（すなわち、生体
内または生体外模写における）分子によって行われるあ
る機能または活性の組。PDGFの場合には、これらの生物
学的活性は、特異的細胞表面リセプターにPDGFが結合し
た後の応答性細胞型の走化性の誘発および／または有糸
分裂誘発を含む。ヒト血小板PDGFの他の生物学的効果に
は、ホスホリパーゼの活性化、ホスファチジルイノシト
ールのターンオーバーおよびプロスタグランジン代謝の
増加、応答性細胞によるコラーゲンおよびコラゲナーゼ
合成の促進、PDGFリセプターを欠いている細胞の間接的
増殖応答、並びに強力な血管収縮作用がある。

PDGF類似体:PDGFのＡ−鎖またはＢ−鎖の少なくとも一
部分に実質的に相同なポリペプチドであって、本明細書
に定義した生物活性を示すもの。

上記のように、ヒト血小板由来生長因子（PDGF）は、
血清中の主要なマイトジェンであることが示されてい
る。PDGFは、血小板から単離されたときには、本発明の
新規蛋白質とは異なる分子である。PDGFは、２個のポリ
ペプチド鎖、Ａ−鎖およびＢ−鎖からなり、それらはジ
スルフィド結合によって互に固定されて、生物活性を有
するヘテロダイマー分子を形成することが知られてい
る。

この構造は免疫沈澱法により実験によって確かめられ
ている〔ハート（Hart）ら、ヘルジン（Heldin）ら、未
発表〕。これらの研究者らは、Ａ−鎖またはＢ−鎖を特
異的に攻撃するモノクローナル抗体を用いて、PDGFを免
疫沈澱した。これらの結果は、PDGFが、いずれか一方の
鎖のみを認識する抗体を用いて溶液から除去することが
できることを示している。これによって、PDGFの構造が
２つの異るポリペプチド鎖のヘテロダイマーであること
が確かめられている。更に、天然のPDGFは炭水化物を含
んでいる〔デウエル（Deuel）ら、J.Biol.Cehm.、256
巻、8896〜8899頁、1981年〕。完全な化学的還元の後、
単一のポリペプチド鎖のみでは、如何なるマイトジェン
活性も示さぜ〔レインズ（Raines）とロス（Ross）、前
掲〕、還元されたポリペプチドの再酸化によって活性を
再現する試みも成功しなかった。最近、Ｂ−鎖のアミノ
酸配列が決定され、ｖ−sis遺伝子生成物p28^sisの一部
分に実質的に相同であることが示された〔ドウリトル
（Doolittle）ら、前掲；ウォーターフィールド（Water
field）ら、前掲；およびジョンソン（Johnson）ら、前
掲〕。これらの２個の蛋白質の相同性は、それらが同じ
または極めて関連生の高い細胞遺伝子に由来することを
強く示唆している。

還元された単一のＡ−鎖またはＢ−鎖ポリペプチドは
生物活性を有せず且つ以前のE.コリー（E.coli）におけ
るｖ−sis配列を発現しようとする試みはマイトジェン
物質を生成しなかったという事実によれば、微生物にお
けるPDGF様分子をコードする配列を単に発現するだけで
は生物活性を示す分子を生じないと思われる。

しかしながら、本発明は、上記の従来の試みとは異な
り、発現された分子がPDGFの生物活性を示す態様で、PD
GFのＡ−鎖またはＢ−鎖をコードするDNA配列の発現、
Ａ−およびＢ−鎖の変異体または誘導体、並びにＡ−お
よびＢ−鎖の部分のモザイクまたはそれらの誘導体を提
供する。更に、本発明の発現系は、真核性の分泌経路を
有して遺伝子生成物を産生するように設計された。これ
によって、発現されたポリペプチド分子を適切に加工
し、正確に折り畳み、且つ生物活性を有するダイマーに
まとめることができる。実際に、本発明は、従来の効果
とは対照的に、PDGF活性について確立された分析法、す
なわち、ラジオリセプター分析法、有糸分裂誘発分析法
および走化性分析法で生物活性を有するPDGF様二量体の
分泌を生じる。

PDGFは、その生物学的活性を有する形では、28,000〜
31,000ドルトンの反応の不均一サイズ種からなる熱に安
定な蛋白質であり、それら個々の種で総てはDNA合成を
促進するのに活性である〔レインズ（Raines）とロス
（Ross）、同上；デウエル（Deuel）ら、J.Biol.Che
m.、256巻、8896頁、1981年；アントニアデス（Antonia
ds）、PNAS、78巻、7314頁、1981年〕。分子サイズが2
7,000、28,500、29,000および、31,000ドルトンの個々
の種が単離され、分析されており、それらは著しいトリ
プシン分解ペプチドの相同性をを示し、匹敵するマイト
ジェン活性とアミノ酸組成を有することが判った〔レイ
ンズ（Raines）とロス（Ross）、前掲〕。これらの種に
おけるサイズの若干の多様性は、炭水化物の組成と僅か
の蛋白質分解における差異によるものであろう。

血小板に富むヒト血漿からの高度に精製されたPDGFの
研究によって、上記のように、PDGFは２本のポリペプチ
ド鎖、Ａ−鎖（14,000ドルトン）およびＢ−鎖（16,000
ドルトン）からなり、それらは互にジスルフィド結合さ
れて、生物活性を有するダイマー分子を形成しているも
のと思われる〔レインズ（Rai!nes）とロス（Ross）；
デウエル（Deuel）ら；アントニアデス（Antoniade
s）、前掲〕。文献にみられるPDGFの命名は、一貫性が
ない〔ドウリトル（Doolittle）ら、ウォーターフィー
ルド（Waterfield）ら、レインズ（Raines）とロス（Ro
ss）；ジョンソン（Johnsson）ら、前掲〕。純粋なPDGF
に見出だされた２個のポリペプチドを「Ａ−鎖」と「Ｂ
−鎖」と呼んでいジョンソン（Johnsson）ら（前掲）の
命名法を、本明細書では採用する。Ｂ−鎖はp28^sisに相
同であり、従来は「ペプチドＩ」〔ウォーターフィール
ド（Waterfiled）ら、前掲〕または「1a」〔ドウリトル
（Doolittle）ら、前掲〕と呼ばれていた。Ａ−鎖は、
以前は「ペプチドII」〔ウォーターフィールド（Waterf
iled）ら、前掲〕または「2a」〔ドウリトル（Doolittl
e）ら、前掲〕と呼ばれていた。PDGFの部分アミノ酸配
列から得られるデーターは、これら２本のポリペプチド
鎖（Ａ−鎖およびＢ−鎖）は広い相同性を示すことを示
唆している〔ドウリトル（Doolittle）ら、同上；ウォ
ーターフィールド（Waterfiled）ら、同上；およびジョ
ンソン（Johnsson）ら、同上：アントニアデス（Antoni
ades）とフンカピラー（Hunkapiller）、Science、220
巻、963頁、1983年〕。更に具体的には、２本の鎖の間
には56％のアミノ酸の同一性であることが報告されてい
る。更に、第９図に示されるように、２本の鎖の間には
完全な相同性を有する数個のブロックがある。更に、こ
れらの鎖は共に、同一の位置に８個のシステイン残基を
含み、それぞれのポリペプチドが同様な三次元構造に折
り畳まれることを示唆している。

これらの２個のポリペプチドは、小さな群の関連性の
高い構成員であると思われる。Ａ−およびＢ−鎖の間の
完全に相同なブロックは機能に寄与することのできる蛋
白質の領域を反映し、余り相同性が高くない領域はその
機能にとってあまり重要ではない蛋白質の部分を反映し
ていると考えられる。それ故、本発明によって更に説明
されるように、Ａ−またはＢ−鎖のいずれかのある部分
を切除しまたは置換することができ、生成する蛋白質内
に生物活性を保持させることができる。

Ａ−鎖およびＢ−鎖の間の相同性は、本発明の教示に
よれば、システイン残基の一致と共に、当業者がこの相
同な群の別の好適な構成員を設計することができる。例
えば、当業者は、相同な領域の構造が保存される蛋白質
をコードするＡ−鎖およびＢ−鎖遺伝子の間の各種ハイ
ブリッドを造成することができる。本明細書にはこれら
の蛋白質が、野生型のＡ−またはＢ−鎖に類似の三次元
構造を反り且つ生物活性を保持することを期待すること
ができる。

上記のように、ｖ−sis遺伝子は、シミアン・サルコ
ーマ・ウイルス（SSV）の形質転換遺伝子である。ｖ−s
is遺伝子はクローン化されており、そのDNA配列は決定
されている〔デバール（Devare）ら、PNAS、79巻、3179
頁、1982年；デバール（Devare）ら、PNAS、80巻、731
頁、1983年〕。この配列を分析したところ、p28^sisと命
名した28,000ドルトンの蛋白質をコードすることができ
る転写リーディングフレームが明らかになった。したが
って、上記蛋白質は、SSV−感染細胞〔ニマン（Nima
n）、同上；ロビンス（Robins）、前掲〕中に免疫的に
同定された。ｖ−sis遺伝子生成物であるp28^sisの予測
されたアミノ酸配列はPDGFのＢ−鎖の一部分の実際のア
ミノ酸配列と高度の相同性を有していることが判った
〔ジョンソン（Johnsson）、前掲〕。PDGFのＢ−鎖のｖ
−sis遺伝子生成物に対する相同性は、p28^sisのアミノ
酸67のセリンで始まり、アミノ酸175のスレオニン残基
に至るまでの109個のアミノ酸で続く。p28^sisのＢ−鎖
と相同な領域の前後のアミノ酸配列は、成熟PDGFのＡ−
鎖またはＢ−鎖のいずれに対しても相同ではなく〔ジョ
ンソン（Johnsson）、前掲〕、Ｂ−鎖前駆体の部分を表
わしている。更に、PDGFとp28^sisは、抗原的に類似して
いることが示されている〔ニマン（Niman）、前掲；ロ
ビンス（Robins）、前掲〕。ｖ−sis遺伝子生成物、p28
^sisである約226個のアミノ酸からなる蛋白質はダイマー
となり、蛋白質分解的に加工され、SSV感染細胞に約20,
000ドルトンの蛋白質を生成する。この20,000ドルトン
の蛋白質はPDGFに対する抗血清を用いて免疫沈澱させる
ことができる。

ｖ−sisの成熟Ｂ−鎖と相同な領域は、ヒトＢ−鎖と
ほとんど同一な109個のアミノ酸のポリペプチドをコー
ドする。これら２種の遺伝子生成物の間の４個のアミノ
酸の違いは、６、７、91および97位に生じる。成熟した
ヒトＡ−鎖配列は、長さが104個のアミノ酸であり、56
％がＢ−鎖に相同であり、それ故、Ｂ−鎖に対する相同
性と同様のｖ−sis生成物に対してある程度の相同性を
有する。

天然のPDGFとは対照的に、本発明の一つの特徴によれ
ば、２個のＡ−鎖様ポリペプチドのジスルフィド結合し
た二量体である蛋白質生成物を開示する。PDGFのＡ−鎖
の104個のアミノ酸に完全に相同な鎖からなる一つのか
かるダイマーは、約31,000ドルトンの見掛けの分子量を
もってポリアクリルアミドゲル上で移動する。このダイ
マーを化学的に還元すると、成分鎖は104アミノ酸のポ
リペプチドと一致する位置に移動する。純粋な蛋白質の
アミノ酸組成が決定されており、その結果は、組成物が
第９図に示されたＡ−鎖の配列に実質的に同一であるこ
とを示している。酵母で発現されたこの純粋な蛋白質の
アミノ酸配列は、気相シークエネーター〔アプライド・
バイオシステムス（Applied biosystems）〕を用いて決
定した。得られたアミノ末端配列の総ては、第９図にお
けるＡ−鎖について示された配列情報によって説明する
ことができた。これらの結果は、本発明のこの見地にお
ける蛋白質が、PDGFのＡ−鎖に相同なポリペプチド鎖か
らなるホモダイマーであることを示している。酵母中で
産生されたＡ−鎖のアミノ酸配列はＮ−結合したグリコ
シル化部位を含んでいなかった。元のヒトＡ−鎖に存在
するグリコシル化部位は、この造成物から意図的に省か
れて、酵母の炭水化物を付加することを避けるようにし
た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によれば、酵母中
で発現したＡ−鎖が炭水化物を含んでいるという証拠は
ない。これらのグリコシル化されないPDGF類似体につい
て観察される生物活性は、幾つかの糖蛋白質ホルモンと
その他の生長因子に関する生物学的活性がグリコシル化
によるという観点からは幾分予想外である。

上記のように、本発明のもう一つの観点は、PDGFのＡ
−鎖またはＢ−鎖の変異体および誘導体であるポリペプ
チドからなる蛋白質を開示する。これらの変形は、基本
的には２つのクラス、すなわち以下に説明されるシステ
インおよびフェニルアラニン置換を含むアミノ酸欠失お
よびアミノ酸置換になる。

アミノ酸の欠失に関しては、PDGFのＡ−鎖およびＢ−
鎖はアミノ−およびカルボキシ−末端のいずれか一方ま
たは両方で切断してもなお、生物活性を有する分子を形
成することが判った。これらのアミノ−および／または
カルボキシ−末端アミノ酸の除去は、生物活性を有する
更に小形の分子であって、更に広範囲な治療利用性を有
する分子を生じる。生成分子の生物活性を破壊すること
なく切除することができるアミノ酸には、Ａ−鎖残基１
〜22および96〜104がある。特に好ましい切除されたＡ
−鎖類似体は、アミノ酸１〜95、９〜95、23〜95、９〜
104および23〜104からなるが、その他のポリペプチドを
構成してしかも生物活性を有する分子を提供することが
できることは当業者には明らかであろう。更に、生成す
るＢ−鎖分子の生物活性を破壊せずに切断することがで
きるアミノ酸としては、残基１〜28、および残基102〜1
09がある。特に好ましい切除されたＢ−鎖類似体はアミ
ノ酸１〜101、15〜101、29〜101、15〜109および29〜10
9からなるが、他のポリペプチドも造成することがで
き、且つ尚、生物活性を有する分子を提供することがで
きることは当業者に判明らかであろう。

更に、各種のアミノ酸置換も可能である。好ましいア
ミノ酸置換には、選択されたシステイン残基の他のアミ
ノ酸例えばセリンによる置換、および他のアミノ酸の置
換であって、その置換は生成する分子の生物活性を破壊
しないものがある。本発明の蛋白質のダイマー化は成分
鎖の間のジスルフィド結合を包含するが、システイン残
基の総てがジスルフィド結合の形成に参加するのではな
く、または生物活性にとって必要なものでもないことが
判った。Ａ−鎖の位置43、54および91のシステイン残基
は、生物活性を有する分子の形成に必須である。Cys93
も適正な構造に寄与することができる。位置10のシステ
インは、生物活性を有する分子の形成に必要ではないで
あろう。位置37、46および47の残りのシステインは、活
性ダイマーを形成するためには必要ではない。それ故、
残基10、37、46、47または93にアミノ酸置換を有する蛋
白質も本発明において使用するのに好適であり、例えば
温血動物における傷治療過程を促進する方法で使用する
のにも好適である。更に、１個以上のシステインからセ
リンへの変異を有するＡ−鎖分子も生物活性を有するこ
とができる。好ましい組合せには、位置37と46、または
位置37と47のセリン置換がある。位置37と10または93の
セリンの組合せも、本発明に好適であろう。

更に、Ｂ−鎖の位置49、60および97のシステイン残基
は、活性分子の形成に必須である。Cys99も、適正な構
造に寄与することができる。位置16のシステインも、活
性ダイマーの形成に必要とされることもある。位置43、
52および53の残りのシステインは、活性分子の形成に必
要ではない。それ故、残基16、49、52、53または99にア
ミノ酸置換を有するＢ−鎖様ポリペプチドも本発明に使
用するのに好適であることがあり、例えば温血動物にお
ける傷治療過程を促進する方法で使用するのにも好適で
ある。更に、１個以上のシステインからセリンへの変異
を有するＢ−鎖分子も生物活性を有することができる。
好ましい組合せには、位置43と52、または位置43と53の
セリン置換がある。位置43と16または99のセリンの組合
せも、本発明に好適であることがある。

その他の好ましいアミノ酸置換は、Ｂ−鎖におけるフ
ェニルアラニンのチロシン残基での置換がある。この置
換は、例えば結合および位置決定研究に使用する実験室
資格としてＢ−鎖の放射性ヨード化を促進するのに有用
である。チロシン残基を、蛋白質の生物活性を変化させ
ないような温和な条件下でヨウ素を用いて標識する。フ
ェニルアラニン置換のための好ましいチロシンはＢ−鎖
の位置23および37にある。これは、標準的な処理法の後
のオリゴヌクレオチドにより指令される変異誘発によっ
て行った。オリゴヌクレオチドZC1116（５′−AGATCTCG
TAAACTTCGG−３′）を用いて、位置23にチロシン置換を
導入した。同様な置換は、Ｂ−鎖における他のフェニル
アラニン残基に就いても行うことができる。

上記のアミノ酸置換に加えて、生成するポリペプチド
がPDGFのＡ−またはＢ−鎖に対して実質的な相同性を保
持するかぎり、ある種の他のアミノ酸置換も可能であ
る。例えば、ｖ−sis遺伝子に由来するDNA配列は、ヒト
Ｂ−鎖に相同性であるが４つの位置でヒトアミノ酸配列
とは異なる蛋白質をコードする。生物活性を有するダイ
マーは、ヒトcDNAに由来するかまたは本明細書に記載の
ｖ−sis配列を変更させることによって造成される、真
正なヒト配列またはｖ−sis配列を用いて作ることがで
きる。

本発明に使用することができる各種変異体および誘導
体がある。例えば、（ａ）生物活性に著しく影響を与え
ないで特定の鎖の三次元構造を変更し、（ｂ）三次元構
造を変更して、生物活性を変更させ、または（ｃ）三次
元構造を実質的に変化させずに生物学的活性に影響を与
えるアミノ酸置換を、Ａ−鎖またはＢ−鎖において行う
ことができる。例えば、Ｂ−鎖におけるアミノ酸98をリ
ジンからロイシンへ変化させて、生物活性を示すモノマ
ーサイズ分子を得ることができる。また、ダイマーのポ
リペプチド間の鎖間ジスフルィド結合に関与するシステ
イン残基をジスルフィド結合を形成しないアミノ酸に変
化させることによって、生物学的に活性なモノマーを得
ることができる。モノマーとして生物活性を有する分子
は、更に大きな治療上の応用を行うことができる。モノ
マー類似体は、ダイマーの形成を必要とせずに更に処理
して生物活性を得ることもできる。これによって構造的
な分析が容易になり、活性なリセプター結合部位が定義
されて、更に治療用類似体を設計することができるよう
になる。

更に、１種以上のアミノ酸を切除して、生成分子の生
物活性を著しく変更させずに生成分子の構造を改変する
こともできる。これによって、更に広範囲な治療用途を
有する小形の活性分子を開発することができるようにな
る。例えば、本明細書記載のように、生物活性にとって
必要ではないアミノ末端アミノ酸を除去することができ
る。同様に、カルボキシ末端アミノ酸も、生物活性を保
持したまま、除去することができる。

更に、Ａ−またはＢ−鎖の部分のモザイクまたはそれ
らの誘導体も、本発明に用いることができる。本発明に
おいて用いられる「モザイク」という用語は、本明細書
に定義された生物活性を有する分子をコードするのに十
分なＡ−鎖およびＢ−鎖の隣接する部分を含む。モザイ
クの構成部分は野生型のＡ−鎖またはＢ−鎖およびＡ−
鎖またはＢ−鎖の変異体または誘導体から選択すること
ができる。モザイクの部分は、全体的なＡ−およびＢ−
鎖の一時構造の特徴が保持されるという条件で、長さが
１〜約75個のアミノ酸の範囲に亙っている。Ａ−および
Ｂ−鎖の共通の構造上の特徴は、（ａ）システイン残
基、（ｂ）アミノ酸荷電の領域および（ｃ）疎水性およ
び親水性の領域の相対的位置である。更に、Ａ−および
Ｂ−鎖の間の配列同一性のブロックを保持することが有
用である。

更に、生物活性を保持しながらこれらハイブリッドの
配列を変更することができる。例えば、１個以上のアミ
ノ酸変化、例えばＡ−鎖アミノ酸10番でのまたはＢ−鎖
中のアミノ酸16番での、システインからセリンへのアミ
ン酸変化は生物活性を保持している分子をもたらす。

更に、Ａ−またはＢ−鎖の組合せまたはそれらの誘導
体を、本発明に用いることができる。本発明に用いられ
る「組合せ」という用語は、２つの異なるポリペプチ
ド、例えばＡ−鎖およびＢ−鎖からなるヘテロダイマー
を包含する。ヘテロダイマーの構成ポリペプチドは野生
型のＡ−鎖もしくはＢ−鎖またはそれらの部分、および
Ａ−鎖またはＢ−鎖の変異体または誘導体から選択する
ことができる。これらのポリペプチドを発現するのに用
いられるDNA配列は、標準的な組換えDNA技術を用いて単
離し、合成し、または造成することができる。

酵母にＡ−Ｂヘテロダイマーを産生させるために、PD
GFのＡ−鎖とＢ−鎖の両方を発現する造成物を同一の酵
母細胞に導入する。この方法では、両方のポリペプチド
鎖は同時に分泌通路を通過し、且つヘテロダイマーに纒
まることができる。好ましい方法は、単一プラスミド上
にＡ−鎖およびＢ−鎖の発現造成物を配置することであ
る。この方法では２つの配列のコピー数は同じままであ
る。同じ酵母細胞に別々のプラスミドで一方はＡ−鎖を
コードし、他方はＢ−鎖をコードするものを導入して、
保持することも可能である。

本発明では、真核細胞の分泌経路を用いてPDGFのＡ−
鎖もしくはＢ−鎖またはそれらの部分に実質的に相同ま
たは実質的に同一な蛋白質を発現させることにより生物
活性を有するPDGF類似体が得られる。真核細胞からのこ
れらの遺伝子生成物の発現および分泌によって、加工お
よびまとめが可能になり、本来のそして生物学的に活性
な構造を有する分子を生成する。

真核細胞の分泌経路は、まったく同じであると思われ
る。詳細には、哺乳類細胞と酵母細胞の分泌経路は、十
分に特徴付けられておりそして相同である。発現された
ポリペプチド上に分泌シグナル配列が存在することは、
一次翻訳生成物を分泌経路へ向け、これによって適正な
加工と組み立てを行う役割のため、真核細胞には重要な
要素である。適当な転写プモーターと分泌シグナル配列
が用いられる場合には、一般的には、如何なる真核細胞
も生物活性を有する形でPDGF類似体を発現しそして分泌
することができる。

容易に操作可能で、十分に特徴付けられた真核細胞
は、酵母細胞である。これらの理由により、酵母を本発
明の適当な真核細胞のモデル例として選択した。本発明
によれば、酵母プロモーターの下流には、PDGFと実質的
に同じ生物活性を有する蛋白質をコードするDNA配列が
続いている。例えば、PDGFのＢ−鎖の109個のアミノ酸
またはＡ−鎖の104個のアミノ酸をコードするDNA配列
を、発現可能にする酵母プロモーターを含む酵母染色体
外要素中に挿入した。これらの染色体外要素を、これら
の生物活性を有するPDGF類似体の発現および分泌が可能
な酵母に形質転換した。更に、PDGFのＡ−およびＢ−鎖
の変異体および誘導体およびモザイク配列を、上記のよ
うな染色体が要素中に挿入した。

本発明で利用される遺伝子または配列を、標準的な組
換えDNA技術を用いて単離することができる。

PDGFと実質的に同じ構造および／または生物活性を有
する蛋白質をコードするDNA配列は、ｖ−sis遺伝子また
はｖ−sis遺伝子の誘導体またはそれらの部分、あるい
はPDGFのＡ−鎖もしくはＢ−鎖またはそれるの部分を含
む。

ヒトPDGFのＢ−鎖cDNAを、適当なメッセンジャーRNA
源から作ったヒトcDNAライブラリーから、ハイブリダイ
ゼーション・プローブとして好ましくはｖ−sis遺伝子
またはそのフラグメントを用いて、またはＢ−鎖DNA配
列から設計されたオリゴヌクレオチド・プローブを用い
ることによって単離する。好ましいmRAN源はヒト臍帯静
脈の内皮細胞である。これらの細胞は、試験管内で短期
間培養することができ、培養液中にPDGFを分泌し〔デコ
ルレト（DiCorleto）とボウエン−ポープ（Bowen−Pop
e）、PNAS、80巻、1919頁、1983年〕、高水準のＢ−鎖m
RNAを含むことが知られる。要約すれば、ポリアデニル
化されたRNAを、新たに培養したヒト臍帯静脈内皮細胞
から調製して、通常の技法によって二本鎖cDNAを作るの
に用いた。このcDNAをバクテリオファージλgt11でクロ
ーン化した。生成するcDNAライブラリーを、ｖ−sis遺
伝子に由来するプローブを用いてスクリーニングした。
第二の上記ライブラリーを作り、同様にしてスクリーニ
ングした。この方法で同定したクローンは、制限酵素分
析によって図表化して、それらが重複している程度を確
立した。これらのクローンのPDGFのＢ−鎖をコードする
ものとしての同一性は、DNA配列によって立証された。

ヒトPDGFのＡ−鎖cDNAを、適当なメッセンジャーRNA
源から作ったヒトcDNAライブラリーから、ハイブリダイ
ゼーション・プローブとして好ましくはｖ−sis遺伝子
またはそのフラグメントを用いて、またはＡ−鎖DNA配
列から設計されたオリゴヌクレオチド・プローブを用い
ることによって単離する〔例えば、ベショルツ（Betsho
ltz）ら、Nature、320巻、695〜699頁1986年を参照され
たい〕。好ましいmRAN源はヒトの形質転換セルライン、
例えば、U2−OSおよびＴ−24である。これらの細胞は、
試験管内で培養することができ、PDGF様活性を有する蛋
白質を分泌することが知られている〔ヘルジン（Heldi
n）ら、Nature、319巻、511〜514巻,1986年〕。このcDN
AのＡ−鎖をコードするものとして同一性はDNA配列によ
って立証された。

更に、好適なDNA配列は合成オリゴヌクレオチドを用
いて構成することができる。

PDGF様生物活性を示す蛋白質をコードする適当なDNA
配列が同定されたならば、この配列を適当なプロモータ
ー及び分泌シグナルフラグメントに連結する。酵母にお
いて用いられるプロモーターには、酵母α−ファクター
（MFα１）プロモーターおよび酵母トリオース・ホスフ
ェート・イソメラーゼ（TPI1）プロモーター〔カワサキ
（Kawasaki）、米国特許第4,599,311号明細書〕があ
る。プロモーターは、他の酵母遺伝子、例えばアルコー
ル・デヒドロゲナーゼ１（ADH1）およびアルコール・デ
ヒドロゲナーゼ２（ADH2）から得ることもできる。その
他の真核細胞種に適当なプロモーターを用いることもで
き、当業者には明らかであろう。本明細書に記載の造成
物はPDGF関連遺伝子生成物が宿主細胞から培地中に分泌
されるように設計した。酵母では、この造成は、酵母接
合フェロモン・α−ファクターのフレ・プロ分泌シグナ
ル配列〔クルヤン（Kurjan）とヘルスコビッツ（Hersko
witz）、Cell、30巻、933頁、1982年；ユリウス（Juliu
s）ら、Cell、36巻、309頁、1984年；およびブレーク
（Brake）ら、PNAS、81巻、1984年〕。を使用すること
によって達成されたが、他の分泌シグナルを用いること
もできる。mRNAの効率的な転写終結とポリアデニル化を
確実にするため、TPI1ターミネーターのような酵母ター
ミネーター配列〔アルベール（Alber）とカワサキ（Kaw
asaki）、J.Molec.Genet.Appl.、１巻、419頁、1982
年〕を加うた。DNAフラグメントの連結法は十分に記載
されており〔マニアチス（Maniatis）ら、Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual、コールド・スプリング・
ハーバー・ラブラトリー（Cold Spring Harbor Laborat
ory）、1982年〕、当業者が容易に行うことができる。
発現ユニット造成物を調製した後、これらの造成物を適
当な発現ベクター中に挿入する。

宿主細胞中に安定に保持される発現ベクターを用い
て、単位培地当たり更に生物活性を高くするのが好まし
い。これに関する好適な酵母発現ベクターとしては、プ
ラスミドpCPOTおよびpMPOT2があり、これらはグリコー
ル分解酵素トリオース・ホスフェート・イソメラーゼを
コードするシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe）遺伝子（POT1遺伝子）を含む。POT1遺
伝子を含むことにより、宿主細胞の遺伝子の欠失を補う
ことができるため、TPI遺伝子に欠失を有する適当な宿
主細胞中でプラスミドを安定に維持できる。レッジス
（Reggs）（Nature、275巻、104〜109頁、1978年）によ
って記載されたleu2選択系のような他の選択系を用いる
こともできる。

適当なベクター中にプロモーター、α−ファクター分
泌シグナル配列、PDGF様生物活性を有する分子をコード
する適当なDNA配列およびTPIターミネーターを含有する
DNA造成物を調製した後、この造成物をTPI欠失を有する
酵母宿主に形質転換する。酵母を形質転換する処理法
は、文献に公知である〔例えば、ベッグス（Beggs）、
同上およびヒンネン（Hinnen）ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.、75巻、1929〜1933頁、1978年を参照された
い〕。

形質転換された酵母細胞は、pCPOTまたはpMPOT2ベク
ターを用いるときには、グルコースを含む通常の複合培
地上で増殖させることによって選択することができる。
YEPD（１リットル当たり20gグルコース、20gバクトーペ
プトン、10g酵母エキス）のような通常の培地を用いる
ことができる。一端、選択したなら、適当な発現造成物
を含む形質転換体を通常の複合培地上に定常期にまで増
殖せしめ、細胞を遠心分離または過によって除去し、
そして培養液を濃縮する。真正なヒトPDGFはカチオン性
が高く且つ疎水性の蛋白質である〔レインズ（Raines）
とロス（Ross）、前掲；アントニアデス（Antoniade
s）、前掲；デウエル（Deuel）ら、1981年、前掲〕こと
に注目し、酵母中で発現したPDGF関連の生成物は同様な
特徴を有することが予期されたので、それらの精製には
イオン交換クロマトグラフィを用いることができる。

各種の分析法を用いて、PDGF類似体を発現する酵母培
養物からのスペント培養液は真正なヒトPDGFと実質的に
同一の生物活性を有することを示すことができる。

酵母以外の真核細胞中での生物活性を有するPDGF類似
体の発現は、適当な発現／調節シグナルを用いて当業者
が行うことができる。これらの配列の発現を指令するこ
とができる転写プロモーターを選択して、特定の真核細
胞型における効率的な、そして／または調節された発現
を得ることができる。ウイルス性（例えば、SV40および
アデノウイルス）プロモーターおよび細胞性（例えば、
メタロチオネイン遺伝子−カリン、米国特許第4,601,97
8号明細書）プロモーターのような各種のプロモーター
を利用することができる。遺伝子生成物を細胞の分泌経
路に向けることができるシグナル配列を選択して、適当
な細胞型において機能させることができる。転写終結シ
グナル、ポリアデニル化シグナルおよび転写エンハンサ
ー配列のような他の有用な調節シグナルを選択して適当
な細胞型において機能させることができ、その選択は当
業者には明らかであろう。哺乳類の細胞を形質転換し
て、クローン化したDNA配列を発現する方法は、カウフ
マン（Kaufman）とシャープ（Sharp）（J.Mol.Biol.、1
59巻、601〜621頁、1982年）、サウザン（Southern）と
ベルク（Berg）（J.Mol.Appl.Genet.、１巻、327〜341
頁、1982年）およびノウマン（Noumann）ら、（EMBO
J.、１巻、841〜845頁、1982年）に記載されている。

本発明によれば、実質的に同一なポリペプチド鎖のホ
モダイマーまたはヘテロダイマーである組換えPDGF様分
子を製造することが可能である。ヘテロダイマーを製造
するには、同一の細胞に２個の異なる発現ユニットを導
入し、ヘテロダイマーを生物活性を有する生成物中で同
定する。発現ユニットは、異なる選択マーカーを有する
異なる発現ベクター上にあってもよく、または好ましく
は、単一の発現ベクター上にあってもよい。第二の方法
は２つの発現ユニットの等しいコピー数を提供するとい
う利点がある。

細胞の培養法は、過去数年間に、培地中で増殖する哺
乳類細胞種数の数および多様性に関しかなり進歩してき
た。これらの進歩の中心は、培養細胞の栄養要求（すな
わち、ホルモンおよび生長因子）についての理解の向上
である〔サルネス（Sarnes）とサトー（Sato）、Cell、
22巻、649頁、1980年〕。培地で増殖することができる
細胞のタイプは、正常型と形質転換型との２つの群に大
きく分類することができる。いわゆる「正常」細胞は一
般的には培地中で不死ではなく、動物に注射したとき腫
瘍を形成せず、それらは正常の二倍体の核型を保持す
る。正常細胞は、培養においてそれらの分化した特徴の
多くを保持することもできる。正常細胞の範疇では、培
養において限定された世代数だけ増殖するものを「細胞
株」または「一次培養物」と呼ぶ。幾つかの正常セルラ
インは、形質転換の総ての条件には当てはまらないが、
培養において無制限に増殖することができる。形質転換
された細胞は培養における増殖が無限になり、典型的に
は、分化した表現型を失い、核型異常を起こす。それら
は、増殖の停止からも独立になり、適当な宿主動物に注
射すると腫瘍を誘発する。試験管内で増殖しPDGFリセプ
ターを有するこれらの範疇における細胞は、本発明のPD
GF類似体に対して応答性になる。

上記のように、本明細書記載の蛋白質は、温血動物の
傷の治療過程を促進する治療組成物において使用するの
に好適である。温血動物における通常の傷治癒過程は化
学誘引物質、生長因子および各種の特殊化された細胞型
の相互作用を包含する一連の事象によって進行する。こ
の過程は、これらの多数の特殊化された細胞型の指示さ
れた移動と、ある場合には、傷空間中への増殖を含み、
各種の生物活性因子の複雑な相互作用からなっている。
この工程は、ハント（Hunt）らの監修による、Soft and
Hard Tissue Repair;Biological and Clinical Aspect
s、プレグナー・パブリッシャーズ（Praegner Publishe
rs）、ニューヨーク、1984年に詳細に説明されているの
で、参照されたい。簡単に説明すれば、組織が傷を受け
ると、特定の細胞型を引き付ける走化性因子が放出さ
れ、追加のおよび／または他の化学誘引物質またはマイ
トジェン因子が放出される。これらの因子は、また追加
の特殊化された細胞に影響を与え、傷を受けた組織を最
終的に修復する。更に、この過程が進行する速度は、通
常は、傷のある部位で化学誘引物質と生長因子の水準に
よって制限され、これらの薬剤の添加によって促進され
るという証拠がある〔グロテンドルスト（Grotendors
t）ら、J.Clin.Invest.76巻、2323〜2329頁、1985年を
参照されたい〕。

真皮における傷治癒過程は、傷口に流入する血液から
クロットが形成することから始まる。これは、傷と互に
結合するフィブリン分子の交差した網目を生じる。この
過程中に、血小板は傷を受けた組織に付着して、活性化
され、α顆粒の内容物を放出する。皮膚組織の開裂、血
液の凝固反応および血小板の活性化は総て傷口に新たな
一連の細胞の移動を引き起こし、これによって修復過程
が開始する。

血小板によって放出されるα顆粒の内容物中にはPDGF
がある。更に、α顆粒の他の内容物および凝固反応の副
生成物は、マクロファージの出現を誘発する。マクロフ
ァージは、傷口におけるPDGFの第二の重要な発生源であ
る。PDGFが傷の部位に沈着すると、走化性的に線維芽細
胞を刺激して傷口の空間に入る様にし、線維芽細胞にマ
イトジェン刺激を与えて、その中で増殖させることによ
って、修復過程に参加する。線維芽細胞の重要な役割
は、傷の部位に結合組織を再生することである。線維芽
細胞は傷の中で増殖し、コラーゲンＩおよびIIおよび結
合組織マトリックスに対する細胞外蛋白質を沈着する。
新たな線維芽細胞とそれらの蛋白質生成物の存在によ
り、皮膚の構造を再構成し、再度上皮形成して、傷を治
癒させることができる。

同様に、結合組織の修復に関する傷治療過程でも、線
維芽細胞の浸潤と増殖およびその後にコラーゲンの沈着
を必要とする。

本発明の蛋白質は、真正なPDGFと実質的に同じ生物活
性を有することが示されている。PDGFの基本的な生物活
性、詳細には、（線維芽細胞と平滑筋細胞を含む）応答
正細胞型における走化性および有糸分裂誘発は、この蛋
白質の組織修復の役割を含む多くの生理的役割の基礎と
なっている。

PDGFの走行性およびマイトジェン特性は、傷治癒過程
における役割の中心的ものであるので、本発明の生物活
性を有する蛋白質は同様な治療用途を有する。それ故、
これらの生物活性蛋白質は、治癒には線維芽細胞の移動
および／または増殖を必要とする傷の地量における臨床
的応用性を有することが期待される。更に、PDGFは平滑
筋細胞に対して走化性およびマイトジェン薬剤として作
用し、その増殖はある種の傷の治癒に寄与することがで
きる。平滑筋細胞は、線維芽細胞について上記したのと
同様にPDGFによって影響を受けるので、この治癒過程に
貢献する。

通常の治癒能力を有する個体では、PDGFの生物活性を
有する外来性の蛋白質は、傷における線維芽細胞の出現
速度とそれらの引き続いての増殖速度を増進させる。更
に、傷治癒能力が実質的に損なわれた個体も数多くあ
り、したがって傷の治癒過程に必要な外来性の成長因子
を傷の部位に提供する能力を欠いている。これらの個体
では、PDGFの生物活性を有する外来性蛋白質を添加する
ことによって、傷の治癒を通常の方法で進行させること
ができる。

本発明の蛋白質は、広範囲な傷の状態における治癒過
程を促進することが期待される。本発明の目的のため、
「傷」または「傷の状態」とは、皮膚における皮膚層の
如何なる分裂をも包含する。皮膚層の分裂の例には、
（様々な原因による）慢性の非治癒性皮膚潰瘍、表面の
傷および裂傷、擦過傷、外傷、およびある種の火傷があ
る。更に、傷は、結合組織に損傷を与えることもあるの
で、その修復は線維芽細胞増殖とコラーゲンの沈着を含
む。本発明の蛋白質はこれらの傷の総ての治癒過程を促
進するのに有用であり、治癒には線維芽細胞の移動およ
び／またはぞうしゅくを必要とするその他の傷の治療に
も有用である。更に、通常の傷治癒は、加齢、糖尿病、
癌および抗炎症剤または抗凝血薬による治療のような多
数のファクターによって遅くなることがあるが、本明細
書記載の蛋白質を用いると、かかる治療による傷治癒の
遅延効果は相殺することができる。ローレンス〔Lawren
ce）ら（Ann.Surgery、203巻、142〜147頁、1986年〕
は、PDGFが糖尿病ラットにおいて傷治癒過程が正常にま
で修復することを示している。ナイトン（Knighton）ら
（Ann.Surgery、204巻、322〜330頁、1986年）は、PDGF
を有す混合成長因子製剤を慢性の非治癒性皮膚障害を有
するヒト患者に用いて、極めて顕著な結果を観察した。
それらの結果はそれらの製剤における活性のある物はPD
GFによるものであり、PDGFは動物実験においてと同様に
ヒトにおいても速やかな治癒に寄与することを示してい
る。PDGFは製剤中のその他の成分と相乗的に作用する。

本明細書記載の用途に治療用に使用するため、本発明
の蛋白質は、典型的には、生理的に受容可能な担体また
は希釈剤と組合せて投与するのが好ましい。更に、実質
的に純粋な蛋白質の製剤、すなわち、一般的には治療に
使用するのを妨げるような不純物または混入物のないも
のを使用するのが好ましい。毒性、抗原性、炎症性また
はその他の有害な物質を含まない製剤で、純度が80％よ
りも大きいものが特に好ましい。典型的には、本発明の
所望なタンパク質は、総容積の約１〜50μg/mlの濃度で
あるが、10μg/ml〜100μg/mlの範囲の濃度を使用する
ことができる。しかしながら、50μg/mlを変える濃度で
は、治療効果が低下することに留意しなければならな
い。傷空間における新たな線維芽細胞の出現およびその
数の増加速度を増進させこれらの線維芽細胞によるDNA
合成とコラーゲンの沈着を促進するのに十分な治療上有
効な量は、製剤１〜5mlの範囲であり、傷の特徴によっ
て変化する。

本発明の治療組成物は、本明細書記載のタンパク質
を、好適な担体およびアジュバント、希釈剤または安定
剤と組合わせてなる。好適なアジュパントにはコラーゲ
ンまたはヒアルロン酸酸製剤、フイブロネクチン、ファ
クターXIIIまたは活性名治療成分を安定化するかまたは
増進する様に設計されたその他のタンパク質または物質
がある。希釈剤には、アルブミン、食塩水、滅菌水など
がある。その他の安定剤、参加防止剤、またはプロテア
ーゼ阻害剤も加えることができる。または、タンパク質
を、水性溶液のような傷用ドレッシングに応用してもよ
い。本発明の治療組成物は、完全に治癒するまで１日〜
数日間の感覚をおいて再適用してもよい。

更に、本発明の治癒組成物は、他の薬学的に活性な成
分、齢えば、熱傷の治癒を促進することが見出されたヘ
パリンを含有することができる。又、TGF−α、TGF−
β、EGF、FGF、血小板第４因子、インシュリンあるいは
ソマメジン〔「クロテンドルスト（Crotendorst）等、1
985」参照〕及び血管形成促進因子などの他の成長因子
もここに記載されているPDGF類似体と相乗的に作用する
場合がある。傷が感染しないようにしておくために、抗
生物質を含有せしめてもよい。

〔実施例〕

次に示す例の概要を以下に述べる。例１は、後にpVSI
S/Pstと命名される大腸菌複製プラスミドpUC13中でのpS
SU−11のｖ−sisサブクローンの造成を示す。例２は、M
Fα１プロモーター及び分泌シグナル配列へのｖ−sisの
連結を含むプラスミドpVSαの造成を示す。例３では、
一本鎖バクテリオファージM13を用いる方法により、ｖ
−sis遺伝子の最初の195の塩基対のオリゴヌクレオチド
に関する欠失突然変異誘発を行い、PDGFのＢ−鎖とは相
同性のないｖ−sis遺伝子生成物p28^sisの最初の66のア
ミノ酸を除去する。その結果得られる正しく欠失したフ
ァージは、m11VS2αと命名された。例４は、発現ベクタ
ーpVSBmの造成を示す。例５は、酵母宿主細胞の形質転
換を示す。例６は、pSB1の造成を示す。例７は、Ｂ−鎖
の変異体及び誘導体の造成を示す。例８は、Ａ−鎖の変
異体及び誘導体の造成を示す。例９は、Ａ−鎖及びＢ−
鎖の変異体及び誘導体用の発現ベクターの造成を示す。
例10は、酵母中でＡ−Ｂヘテロダイマーを製造する方法
示す。例11は、形質転換培養からのスペント酵母増殖培
地の濃縮及びその後のPDGF様物質の分析を示す。その結
果、ここに述べるPDGF類似体を含有する酵母培地が、真
のヒトPDGFと実質的に同じ生物学的活性を有することが
明確に示される。例12は、蛋白質の発現を最適化する方
法を示す。

以下、例により本発明を説明するが、本発明はこれら
の例により限定されるものではない。

例1.pSSV−11由来ｖ−sisのサブクローニング SSVをゲノムに組み込んだ、非生産的にSSV−11に感染
した正常ラット腎臓（NRK）細胞からSSVレトロウイルス
ゲノムをクローニングした〔デバレ（Devare）等、1982
年、同書〕。SSVのDNAを5.8キロベース（kb）のEcoR I
断片として単離し、それをプラスミドpBR322に挿入して
クローンpSSV−11を得た。このクローンをエス・アーロ
ンソン（S.Aaronson）〔米国メリーランド州のベセスダ
にあるナショナル・インスティチューツ・オブ・ヘルス
（National institutes of health）〕より入手した。

第1A図は、SSVの5.8キロベースプロウィルスゲノムの
概略の制限地図である。図には、本発明に関係のある制
限部位のみを示してある。空白の囲みは、ｖ−sis遺伝
子のp28^sisをコードしている部分を示す。

第1B図は、ｖ−sis遺伝子のヌクレオチド配列、及び
フランキングSSV配列の一部分である。このｖ−sis遺伝
子は、SSVのエンベロープ（env）遺伝子の推定ATG開始
コドンの３′側19ヌクレオチドの位置に挿入されている
〔デバレ（Devare）等、1982年、同書〕。ｖ−sis配列
の転写及び翻訳は、SSV配列により指示され、融合蛋白
質を生じる。第1B図に示すヌクレオチド配列は、デバレ
（Devare）等、1982年、（同書）により発表されたもの
から修復することができる。この修復は、デバレ（Deva
re）等、1983年、（同書）によりなされたもの及びここ
において本発明者等によりなされたものを含む。Devare
等（1982年、同書）の原文の番号は、参照を容易にする
ために本発明に適用される。第1A図の制限部位について
いる番号は、第1B図からのものである。

ｖ−sis違伝子の一部分をを含有するpSSV−11のサブ
クローン（第２図）を、大腸菌複製プラスミドpUC13
〔ビュイラ及びメシング（Vieira and Messing），ジィ
ーン（Gene），19,259,1982;及びメシング（Messin
g），メソズ・イン・エンザイモロジー（Meth.in Enzym
ology）,101,20,1983）〕中において造成した。５μｇ
のpSSV−11を製限エンドヌクレアーゼPst Iで消化し、4
54−1679と番号が付されている配列を含有する1.2kb断
片（第１図）をアガロースゲル電気泳動（0.9％）で精
製し、そのゲルからセチルトリメチルアンモニウムブロ
マイド（CTAB）とブタノールを用いて抽出した〔ラング
リッジ（Langridge）等，同書〕。２μｇのPUC13も、Ps
t Iで消化し、フェノール／クロロホルム（CHCl₃）で抽
出し、エタノール（EtOH）で沈殿させた。40ngの1.2kb
v−sis断片とPst Iで切断したpUC13の50ngを40単位
（ｖ）のT₄DNAリガーゼを用いて室温で連結した。この
連結混合物を用いて、大腸菌Ｋ−12株JM83〔メシング
（Messing）,DNA・テクニカル・ブリテン（DNA Technic
al Bulletin）,NIH発行番号第79−009号,2,No.2,43−4
8,1979〕を５−ブロモ−１−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−gal）及びイソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）の存在下で形質転換し
た。アンピシリン耐性白色コロニーから調製したプラス
ミドDNAをPst Iで消化し、挿入部が存在することを確認
した。得られたプラスミドをpVSIS/Pstと命名した。

実施例2.プラスミドpVSαの造成 A. MFα１への融合用ｖ−sisの調製 600μｇのプラスミドpSSV−11（第２図）を、200μ
の50mM NaCl,10mM MgCl₂,10mMトリス（pH7.5）（中間塩
緩衝液）及び100μg/ml牛血清アルブミン（BSA）中で37
℃の温度で一晩、制限エドヌクレアーゼBamH I及びPvu
IIで消化した。消化生成物を1.1％アガロースゲルで電
気泳動し、その後、1100塩基対（bp）BamH I−Pvu II断
片（第２図）を切取り、抽出後エタノールで沈殿させ
た。DNAペレットを、20μの1mg/ml BSA及び５μのH
ph Iを添加したHph I緩衝液に溶解した。37℃で一晩消
化後、混合物を1.25％アガロースゲルで電気泳動し、39
6塩基対のHph I…Pvu II断片をゲルから単離し、その
後、エタノールで沈殿させた。DNAペレットを30μの
クレノー緩衝液（6mM Tris pH7.5,6mM MgCl₂,60mM NaC
l）に溶解し、Hph I切断部位の３′突出ヌクレオチド
を、５単位のクレノーポリメラーゼを用いて37℃で５分
間処理して除去した。４種全てのデオキシリボヌクレオ
チド各1mMを含有している混合物１μを添加し、反応
混合物を更に10分間インキュベートした。フェノール/C
HCl₃/エーテル（Et₂O）で抽出し、エタノールで沈殿さ
せた後、DNAペレットを30μの中間塩緩衝液に溶解
し、５単位のBgI IIを用いて、37℃で３時間消化した。
その後、DNAを1.25％アガロースゲルで電気泳動し、269
塩基対のHph I…Bgl II断片を抽出後、エタノールで沈
殿させた。このクレノー平滑断片のHph I切断端は、 （第２図）のトリヌクレオチド配列から開始している。

B. MFα１プロモーター及び分泌リーダー断片 プラスミドp192（第３図）は、細菌プラスミドpUC13
〔ヴィーラ及びメシング（Vieira and Messing），同
書；及びメシング（Messing），メソズ・イン・エンザ
イモロジィー（Meth.in Enzymology），101:20,1983〕
中でクローニングされた酵母接合フェロモンα−ファク
ター（MFα１遺伝子）の遺伝子の一部分からなってい
る。ゲノムライブラリーからのMFα１遺伝子のクローニ
ングについては、クォージャン（Kurjan）及びヘルスコ
ヴィッツ（Herskowitz）（前掲）により記載されてい
る。この遺伝子を、Yep13〔ナスミス及びタッチェル（N
asmyth ad Tatchell），セル（Cell），19:753,1980〕
のBamH I部位にクローニングした部分Sau3A断片の酵母
ゲロムライブラリーを出発材料として用い、本研究所に
おいて同様の方法で単離した。このタイブラリーから、
matα２−34変異〔マネィ（Manney）等、ジェィ・セル
・バイオル（J.Cell Biol）,96:1592,1983〕に関して酵
母ホモ接合体の二倍体株中でα−ファクターを発現する
プラスミドを単離した。このクローンは、クォージャン
及びヘルスコヴィッツ〔Kurjan and Herskowitz（同
書）〕により特徴付けられたMFα１遺伝子とオーバーラ
ップする挿入部を含有していた。pZA2（第３図）として
知られているこのプラスミドをEcoR Iで切断し、MFα１
遺伝子を含んでなる1700塩基対の断片を精製した。その
後、この断片をpUC13のEcoR I部位にサブクローニング
しプラスミドp192を製造した。

15μｇのプラスミドp192を20単位のHind IIIで、中間
塩緩衝液30μ中において、37℃で一晩消化した。反応
混合物をクレノー緩衝液で60μに希釈し、その後４種
のデオキシリボヌクレオチドを各々最終濃度が50μＭと
なるように添加した。10単位のクレノーポリメラーゼを
氷で冷却した混合物を添加し、15℃で12分間インキュベ
ートした。フェノール/CHCl₃/エチルエーテルでの抽出
後、水相を凍結乾燥により10μになるまで濃縮し、そ
の後、20単位のEcoR Iにより37℃で70分間消化した。生
成物を0.9％アガロースゲルで電気透析し、1.2キロベー
スのEcoR I−Hind III（平滑末端にした）MFα１断片を
抽出し、その後、エタノールで沈殿させた。このDNA断
片は、MFα１の転写プロモーター及び分泌シグナル配列
を含んでいた。

C. ｖ−sisの３′側配列及びクローニングベクターpUC
12の製造；断片の連結 20μｇのプラスミドpVSIS/Pstを、40μの中間塩緩
衝液中でBal II及びXba Iにより消化した。その後、１
％アガロースゲルでの電気透析、DNAの抽出及びエタノ
ールで沈殿により、精製されたｖ−sis756塩基対Bgl II
…Xba I断片を得た（第２図）。次に、大腸菌複製プラ
スミドpUC12（５μｇ）をEcoR I及びXba Iで消化し、そ
の後、前記した方法によりゲル精製した（第２図）。

第２図において、10ngの296塩基対のHph I…Bgl II v
−sis断片に合わせた上記の４種のDNA断片を等モルづ
つ、15μのリガーゼ緩衝液（6mM T_ris,pH7.6,6.6mM M
gCl₂,0.4mM ATP,2mMスペルミジン,20mM DTT及び100μg/
ml BSA）中で混合し、40単位のT₄リガーゼを用いて14℃
で一晩凍結させた。反応混合物を室温まで冷却し、更に
150単位のT₄リガーゼを添加し、その後、更に10時間イ
ンキュベートした。７μの凍結混合物を用いて、大腸
菌Ｋ−12株RRl〔ATCC寄託番号＃31343;ボリバー（Boliv
ar）等、ジィーン（Gene），２:95,1977〕を形質転換
し、その後、アンピシリン耐性の形質転換体を選択し
た。プラスミドDNAを12個のこのような細菌コロニーか
ら製造し、Xba Iで消化した。二個のクローンが、適当
な断片整列により推測される2.2キロベースのバンドを
生じた。更に、これらをBal II…Xba Iでの制限地図を
作製して分析したところ、MFα1/v−sis融合体の場合に
約1.5キロベース及びBal II…Xba I v−sis断片の場合7
60塩基対のバンドを生じた。DNA配列の解析により、MF
α1/v−sis接合部において所望のヌクレオチド配列とな
っていることが確認された。得られたプラスミドをPVS
αと命名した。

実施例3m11VS2αの造成 ｖ−sis蛋白質p28^sisとPDGFとの相同性は、p28^sisの6
7番目のアミノ酸、即ち、PDGFのＢ−鎖〔ジョンソン（J
ohnsson），前掲〕のNH₂末端残基に相当するセリン残基
から始まる。

MFα１の１次翻訳生成物の蛋白質加水分解プロセシン
グはイニシエータであるメチオニンから85個のアミノ酸
のLrys−Arg分解ジグナルの所で生じる〔クオージャン
及びヘルスコヴィッツ（Kurjan and Herskowitz），前
掲）〕。p28^sisの最初の66コドンを除去し、ｖ−sisの6
7番目のセリン残基が直接にMFα１のLys−Argプロセシ
ングシグナルに続くようにして、ｖ−sis誘導体を造成
した。

第４図に関して以下説明する。約40ngのpVSαのゲル
精製2.2キロベースXba I断片を、Xba Iで消化し且つア
ルカリ性ホスファターゼで処理したM13mp1DNA〔メシン
グ（Messing），メス・イン・エンザイモノジー（Meth.
in Enzymology），前掲〕40ngと連結させた。連結混合
物を使用して、Ｘ−gal及びIPTGの存在下において、大
腸菌Ｋ−12株（JM101（ACC寄託番号第33876号）を形質
転換した。単離した白色プラークを取り上げ、それを用
いて、対数増殖期増殖JM101細胞の培養物3mlに感染させ
た。複製型（RF）DNAを調製し、一本鎖成熟ファージの
正（＋）の鎖型と同方向に挿入断片を担持したクローン
を確認した。一本鎖ファージDNAをこのようなクローン
のひとつから調製し、m11VSαと命名した。

ｖ−sisの１〜66番目のコドンを正確に除去するため
に、ゾラー（Zoller）等の２プライマー法〔マニュアル
・フォー・アドバンスト・テクニークス・イン・モレキ
ュラー・クローニング・コース（Manual for Advanced
Techniques in Molecular Cloning Course），コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory）,1983年〕と実質的に同様の方法
で、ヌクレオチドに関する突然変異誘発を行った。オリ
ゴヌクレオチドZC1303′AGAAACCTATTTTCCTCGGACCCA5′
をアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystem
s）380−A DNA合成装置で合成した。50ピコモルのZC130
を、10μのキナーゼ緩衝液（BRL）中で、４単位のT₄
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて37℃で45分間キナー
ゼ処理した。その後、65℃で10分間加熱して控訴を不活
化した。

アニーリング混合物を、まず65℃で10分間加熱し、そ
の後37℃に昇温して10分間加熱後、氷で急冷する以外
は、ゾラー（Zoller）等（前掲）に記載の条件を用い
て、1/2ピコモルのm11VSαを、１ピコモルのキナーゼ処
理したZC130及び1.5ピコモルのユニバール・シーケンシ
ングプライマー（BRL）とアニールせしめた。アニーリ
ング混合物を、ゾラー（Zoller）等（前掲）により記載
されている方法により、クレノーポリメラーゼで処理し
て環状デュプレックスDNAを調製した。伸長混合物の一
部分を使用して、大腸菌K12株JM101細胞を形質転換し
た。その結果得られるファージプラークを、ニトロセル
ロースフィルター上に移し次に³²Pでリン酸化したZC130
と65℃でハイブリダイゼーションを行うことにより、適
切な欠失に関してスクリーニングした。正しく並列した
配列は、用いられるストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション温度において、放射性プローブと共に安定なデ
ュプレックスを形成した。スクリーニングにより得た形
質転換体の約１％は、オートラジオグラフィーにより正
のシグナルを生じた。10個のクローンをプラーク精製
し、RF DNAを調製して制限酵素解析を行った。その結
果、５個の単離物が、予想通り195塩基対の減少を生
じ、1450塩基対Hind III…Bgl II断片を示した（第４
図）。２個の単離物のDNA配列を解析したところ、正し
く融合接続がなされ、従って、翻訳リーディングフレー
ムが適切に維持されていることが確認された。

実施例4.pVSBmの造成 A. プラスミドYEpVSα及びYEpVS2αの造成 酵母複製ベクターYEp13〔ブローチ（Broach）等，ジ
ィーン（Gene），８:121,1979〕を、実施例２及び３に
記載したｖ−sis由来造成物用の発現ビヒクルとして用
いた。YEp13は、２ミクロン複製開始点と酵母LEU2遺伝
子を含有するマルチコピー染色体外プラスミドである。
このため、ロイシン欠乏合成培地で増殖させる場合、欠
損した染色体LEU２遺伝子を所有する酵母菌株中のプラ
スミドを選択することが可能である。酵母中で発現した
外来遺伝子に酵母ターミネーターを付加することによ
り、効率的に転写を停止させ且つmRNAのポリアデニル化
を確実に行うことができる。ｖ−sis発現ユニットVSα
及びVS2αを、あらかじめYEp13（下記参照）にクローン
化したTPIターミネーターに隣接して配置した。

プラスミドp270（第５図参照のこと）は、酵母トリオ
ースフオスフェートイソメラーゼ（TPI）遺伝子の転写
ターミネーター領域を含有している。これは次のように
して造成された。即ち、酵母TPIターミネーター断片
を、プラスミドpFG1〔アルバート及び川崎（Albert and
Kawasaki），前掲〕から得た。これは、TPI遺伝子の後
から２番目のアミノ酸コドンから約700塩基対下流のEco
R I部位までを包含している。pFGlのこのユニークEcoR
I部位をBamH I部位で次の方法により置換した。即ち、
まずプラスミドをEcoR Iで切断し、末端をDNAポリメラ
ーゼＩ（クレノー断片）で平滑化し、合成BamH Iリンカ
ー（CGGATCCA）を添加して再連結しプラスミドp136を調
製した。次に、TPIターミネーターを、Xba I…BamH I断
片としてp136から切除した。Xba I及びBamH Iで線状に
したYEp13〔ブローチ（Broach）等、前掲〕にこの断片
を連結した。その結果得られるプラスミドはp213と呼ば
れているものである。このプラスミドをHind IIIで消化
し、その結果生じる末端をDNAポリメラーゼ（クレノー
断片）で平滑化し、その後、T₄DNAリガーゼを用いて線
状分子を再環状化することにより、p213のTPIターミネ
ーター領域からHind III部位を除去した。得られたプラ
スミドがp270である。

又、p270は、プラスミドpM220（下記を参照のこと）
をXba 及びBamH Iで消化し、TPIターミネーター断片
（−700塩基対）を精製し、この断片をXba I及びBamH I
で消化したYEp13に挿入することによっても造成するこ
とができる 以下、第６図について説明する。プラスミドp270DNA
をXba1で消化で消化後、小牛アルカリ性ホスファターゼ
で処理し、相補ベクター末端の再連結を防止する。ｖ−
sis発現ユニットであるVSα及びVS2αを、それぞれpVS
α及びm11VS2αをXba Iで消化後アガロースゲルで精製
することにより調製した。単離した断片の各々を、40単
位のT₄DNAリガーゼの存在下において、ほぼ等モル量の
ホスファターゼ処理したp270ベクターと連結した。その
後、この連結混合を用いて、大腸菌Ｋ−12株RRIを形質
転換した。プラスミドDNAをアンピシリン耐性コロニー
から調製し、その後、制限酵素解析を行い、ｖ−sis配
列の３′に隣接してTPIターミネーターを有するクロー
ンを確認した。ゲル電気泳動後、3.3キロベースあるい
は3.1キロベースBgl II断片の存在が確認され、YEpVSα
及びYEpVS2αそれぞれの方向が正しかったことがわかっ
た。

B. プラスミドpVS13の造成 pVS2αによりコードされている生成物は実際のヒトPD
GF B−鎖より大きく、且つ生成物が小さいほど形質転換
された酵母宿主細胞における発現レベルが高くなるの
で、３′末端に切断したpVSDαのｖ−sis配列からなる
ベクターを造成した。この配列によりコードされたポリ
ペプチドは、p28^sisのアミノ酸67〜17からなりPDGFのＢ
−鎖と相同である。pVS2α発現ユニットの要素をp28^sis
のアミノ酸158〜175をコードしている合成二本鎖DNA断
片及び部分ｖ−sis遺伝子と結合して、この「Ｂ−鎖」
配列を含む発現ベクターを造成した。この合成断片は、
13個のｖ−sisコドンの多くを好ましい酵母コドンに置
換し、且つコード配列の末端に停止コドンを入れるよう
に設計された。このベクターの造成を第７図及び第８図
に示す。

プラスミドYEpVS2αをpst I及びBamH Iで消化し、そ
の後、部分MFα１、ｖ−sis及びTPIターミネーター配列
からなる1.8キロベース断片をアガロースゲル電気透析
により精製した。pUC19〔ノランダー（Norrander）等、
ジィーン（Gene），26:101−106,1983〕のHind III部位
に挿入した下記のチャート１を示したポリリンカーから
なるプラスミドpIC19R〔マーシュ（Marsh）等、ジィー
ン（Gene），32:481−486,1984〕を、Pst I及びBamH I
で消化した。得られるベクター断片をゲル精製し、pVS2
αから得た1.8キロベース断片の連結してプラスミドpVS
2αＴを調製した。

サッカロミセス・セレビシエー（S.cerevisiae）TPI
プロモーターを使用して、酵母発現ベクターにおけるVS
2α配列の発現を制御した。プラスミドpM220はMFα１シ
グナル配列に融合したTPIプロモーターを含有してい
る。pM220で形質転換した大腸菌株RRIを、寄託番号第39
853号の下にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（American Type Culture Collectin）に寄託し
た。

プラスミドpM220をBgl II及びPst1で消化した（第７
図）。その後、TPIプロモーター及びMFα１の５′側部
分からなる約１キロベースの断片を単離し、Bgl II及び
Pst Iで消化したpIC19Rにクローニングした。得られた
プラスミドをCla I及びPst Iで消化し、その後、TPIプ
ロモーター…MFα１断片をゲル精製した。その後、プラ
スミドPVS2αＴをCla I及びPst Iで切断し、それをTPI
プロモーター…MFα１断片に連結した。造成が正しくな
されたことが、2.6キロベースCla I…BamH I断片の存在
によって確認された。得られたプラスミドをpTVS2αＴ
と命名した。

10μｇのプラスミドpVSαをXma I及びSph I（第８
図）で完全に消化した。その結果得られるｖ−sis配列
のほとんどからなる約4.9キロベースベクター断片を、
アガロースゲル電気泳動、DNAの抽出及びエタノール沈
殿により精製した。

ｖ−sis配列に新しい３′末端を提供するために、ア
プライド・バイオシステムズ（applied Biosystems）38
0−Ａ型DNA合成装置で合成したオリゴヌクレオチドから
二本鎖DNA断片を造成した。0.7ピコモルのオリゴヌクレ
オチドから二本鎖DNA断片を造成した。0.7ピコモルのオ
リゴヌクレオチドZC299（表１）を等モル量のオリゴヌ
クレオチドZC300とともに、40mM NaClを含有する10μ
の容量で、65℃で５分間加熱した。

この混合物を、37℃で５分間インキュベートし後、室
温迄冷却した。0.2ピコモルの4.9キロベース精製断片を
添加し、混合物を12℃で18時間連結した。連結混合物を
用いて、大腸菌株HB101（ATCC寄託番号第33694号）を形
質転し、アンピシリン耐性コロニーを得た。DNAをアン
ピシリン耐性コロニーから調製し、Bgl II及びXba Iで
消化した。アガロースゲル電気泳動の後、750塩基対Bgl
II…xba I断片が喪失していることと約500塩基対と260
塩基対の２つの小さな断片が出現したことから、所望の
クローン（pVSαＢと呼ばれる）が得られたことが確認
された。

約８μｇのプラスミドpTVS2αＴ（第８図）を10μ
の容積でXba Iにより完全消化した。Bg1 II緩衝液を添
加し、40μまで容積を増加させ後、６単位のBgl IIを
添加した。得られた混合物を37℃でインキュベートし
た。10μのアリコートを、それぞれ15分及び30分後に
50mMEDATを含有する停止緩衝液に添加し、残りの20μ
については45分後に停止した。その結果得られる混合物
を0.7％アガロースゲルで電気泳動して分離した。約4.6
キロベースのBgl II…xba Iベクター断片を切り取り、
ゲルから抽出し、その後、エタノールで沈殿させた。プ
ラスミドpVSαＢをBal II及びXba1で消化した。その
後、合成３′末端及び停止コドンを含有する約260塩基
対断片をアガロースゲル電気泳動、続いてゲルからの抽
出及びエタノールでの沈殿により単離した。

pTVS2αＴから得た4.6キロベースBgl II…Xba Iベク
ター断片及びpVSαＢから得た260塩基対Bgl II…xba I
断片をT₄DNAリガーゼの存在下において、室温で７時間
連結させた。反応混合物を使用して、大腸菌株HB101を
形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。形質転換体か
らDNAを調製し、所望の挿入物が存在することをアガロ
ースゲルによる550塩基対Pst1…xba Iバンドのスクリー
ニングにより確認された。正確な配置を有するプラスミ
ドをpVSBと命名した。

プラスミドpVSBを造成するには、他のいくつかの方法
がある。pVSBの必須要素として、例えば、プラスミドpM
220から得ることができるTPIプロモーター／α−ファク
ター融合体、広く入手可能なｖ−sis遺伝子のＢ−鎖コ
ード配列（第1B図の塩基551〜877）及びプラスミドp270
から得ることができるTPIターミネーターが挙げられ
る。当業者は、これらの要素を用いて、pVSBに到達する
ためのいくつかの方法を開発することができるであろ
う。

C. pMPOT2の造成 酵母培養からの最大の蛋白質生産量を達成するため
に、宿主細胞内において非常に安定に存在し続けること
のできる発現ビヒクルを使用することが望ましい。プラ
スミドpCPOTは、そのような好ましい発現ビヒクルであ
る。

pCPOTで形質転換した大腸菌株HB101は寄託番号第3968
5号の下にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）に寄託され
ている。プラスミドpCPOTは、２ミクロン環状ゲノム
〔ハートリー及びドネルソン（Hartley and Donelso
n）、ネーチャー（Nature）、286:860,1980〕、大腸菌
プラスミドpBR322複製及び選択配列、並びに解糖系酵素
トリオースホスフェートイソメラーゼ（POT１）をコー
ドしているシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe）遺伝子を含んで成る。pCPOT中にPOT１
遺伝子が存在しているために、炭素源としてグルコース
を用いた非選択的培地での増殖の間適当な宿主ドックグ
ラウンド中でのプラスミドの安定な維持が保証される。

酵母中でｖ−sis誘導体を発現させるために、酵母の
２ミクロンDNAから得たREP1,REP2,REP3及びDNA複製起点
（ori）配列、並びにシゾサッカロミセス・ポンベ（Sch
izosaccharomyces pombe）トリオースホスフェートイソ
メラーゼ（POT1）遺伝子からなる安定な発現ベクターを
造成した。POT1遺伝子により、宿種がトリオースホスフ
ェートイソメラーゼを欠損している場合、複合培地中で
増殖する酵母宿主の形質転換体中にプラスミドを保持す
ることができる。

POT1遺伝子をプラスミドpFATPOTから得た。pFATPOTで
形質転換したS.セレビシエー（S.cerevisiae）株E18は
寄託番号第20699号の下にATCCに寄託されている。この
プラスミドは、従来の方法で宿主細胞から精製すること
ができる。このプラスミドをSal1及びBamH Iで消化し、
pFATPOTからPOT1配列を除去した。Sal I及びBamH Iで消
化して線状としたpIC19Rに、この1600塩基対断片を連結
した。その結果得られるプラスミドのBamH I、Pst I及
びSal I部位を２工程で破壊し、プラスミドpICPOT^＊を
調製した。Pst I及びSal I部位を、Pst I及びSal Iで切
断して除去した。その後、Pst I3′側オーバーハング
（overhang）をDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）で
消化し、且つSal I5′側オーバーハング（overhang）を
クレノー断片で埋めることにより末端を平滑にした。次
に、平滑末端を連結した。このプラスミドをBamH Iで切
断し、末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）でフ
ィルインレ、その平滑末端を再連することにより、BamH
I部位を除去した。

プラスミドYEp13〔ブローチ（Broach）等、ジィーン
（Gene）、８:121〜133,1979〕及びC1/1から2u配列を得
た。EcoR Iでによる部分消化及びEcoR I切断pBR322によ
る置換によりpJDB248〔ベグズ（Beggs）、ネーチャー
（Nature）、275:104〜109,1978〕のpMB9配列を除去し
てC1/1を造成した。

Pst I及びxba Iで消化後ゲル精製を行い、YEp13からR
EP3及びDNA複製起点（ori）配列を取った。C1/1をxba I
及びSph Iで消化後ゲル精製を行うことにより、C1/1か
らREP2を得た。この２つの断片を、Pst I及びSph Iで線
状化したpUC18〔ノーランダー（Norrander）等、ジィー
ン（Gnee）、26:101−106,1983〕に連結してプラスミド
pUCREP2,3を調製した。C1/1をEcoR I及びxba Iで消化
後、1704塩基対断片をゲル精製することにより、C1/1か
らREP1を得た。EcoR I及びXba断片を、EcoR I及びXba I
で線状化したpUC13にクローニングした。その結果得ら
れたプラスミドをpUC13＋REP1と命名した。このpUC13＋
REP1プラスミドを、Hind IIで切断後、EcoR Iリンカー
〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリィーズ（Bethesda R
esearch Laloratories）より入手した〕の存在下で連結
した。次に、REP1遺伝子を約1720塩基対のEcoR I断片と
して取り出した。EcoR I及びxba Iで線状化したpIC7
〔マーシュ（Marsh）等、同書）にこのEcoR I断片をク
ローニングした。その結果得られたプラスミドをpICREP
1＃９と命名した。

最終的な発現ベクターpMPOT2（第８図）を造成するた
めに、pICPOT^＊をHind IIIで部分消化した後Sst Iで完
全消化して線状化した。プラスミドpUCREP2,3をHind II
I及びSst I切断した。REP2,REP3及びDNA複製起点（or
i）配列からなる断片をゲル精製の後、線状化したpICPO
T^＊に連結した。その結果得られた、REP2,REP3,DNA複製
起点（ori）、POT1及びampr配列からなるプラスミドをp
MPOT1と命名した。その後、REP1をBgl II…Nar I断片と
してpICREP1から取り出し、Bgl II及びNar Iで分解した
pICREP1から取り出し、Bgl II及びNar Iで分解したpMPO
T1に連結した。この連結生成物をpMPOT2（ATCCに寄託；
寄託番号第20744）と命名した。プラスミドpMPOT2をCla
I及びBamH Iで消化後、ベクター断片を上述の方法で精
製した。

D. pMPOT2へのVSB発現ユニットの挿入 プラスミドpVSBをCla I及びBamH Iで消化後、「Ｂ−
鎖」発現ユニットを含有する2.2キロベース断片をアガ
ロースゲル電気泳動及びエタノール沈殿により精製し
た。又、プラスミドpMPOT2もCla I及びBamH Iで消化し
た。得られる断片をT₄DNAリガーゼの存在下で室温にお
いて一晩連結させた。この反応混合物を用いて、大腸菌
株HB101を形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。形
質転換体からDNAを調製し、これをCla I及びBamH Iで消
化後アガロースゲル電気泳動にかけて挿入物が存在する
ことを確認した。その結果得られた発現ベクターをpVSB
m（第８図）と命名した。

実施例５ 酵母の形質転換 プラスミドpVSBm及びpMPOT2を用いて、従来の方法に
よりS.セレビシエー（S.cerevisiae）株E18＃９を形質
転換した。菌株E18＃９は、株菌E11−3c（ATCC寄託番号
第20727号）（Δtpi::LEU2 pep4 leu2 MATa）とΔtpi29
（Δtpi::LEU2 pep4 leu2 his MATa）とを交雑すること
により調製した二倍体である。Δtpi29は、ロートシュ
タイン（Rothstein）〔メソズ・イン・エンザイモロジ
ィー（Meth.in Enzymology），101:202−210,1983〕に
より述べられている方法に実質的に準じて、菌株E2−7b
（ATCC寄託番号第20689号）のトリオースホスフェート
イソメラーゼ遺伝子を破壊することにより調製される。

実施例６ pSBlの造成 Ｂ−鎖コード配列をpVSBベクター中のＡ−鎖配列で置
換するのを開始するために、使いやすいSst1制限エンド
ヌクレアーゼ部位を、α−ファクターとプレプローＢ−
鎖との境界（第８図）近くに設けた。このことは、確立
された公知の方法により、一本鎖pVSB鋳型でオリゴヌク
レオチドに指令される突然変異優異誘発〔ゾラー及びス
ミス（Zoller and Smith）,DNA,３:479−488,1984〕を
行うことにより達成された。使用される突然変異誘発用
のオリゴヌクレオチドはZC506と呼ばれる表２に示すよ
うな配列からなっている。

ZC505 GAACCCAGGCTTGCAGCTGGCAAAGATACCCC ZC506 GGCTCCTTTTGAGCTCAGATACCCCT ZC545 GATCTCGTAGATAACGGTACGCGTCTTACAAACAGCTCTCTTG
AGCT ZC546 CAAGAGAGCTGTTTGTAAGACGCGTACCGTTATCTACGA ZC547 CAAGAGATCTATCGAAGAAGCGGTACCAGCCGTTTGTAAGACG
CGTGA ZC548 GATCTCACGCGTCTTACAAACGGCTGGTACCGCTTCTTCGATA
GATCTCTTGAGCT ZC671 CGCGTCTTAGAAACAGCTG ZC672 GTACCAGCTGTTTCTAAGA ZC675 CAAGTGTGAAACCGTTGCTGCTGCTAGACCAGTTACCTAAT ZC676 CTAGATTAGGTAACTGGTCTAGCAGCAGCAACGGTTTCACACT
TGCATG ZC685 CAAGAGATCCTTGGGTTCTTTGACCATCGCTGAA ZC686 AGCTGGTTCAGCGATGGTCAAAGAACCCAAGGATCTCTTGAGC
T ZC687 CCAGCTATGATGCCTGAATGTAAGACCAGAACCGAAGTTTTCG
A ZC688 GATCTCGAAAACTTCGGTTCTGGTCTTACATTCAGCGATCAT ZC692 GATCCCAAGATCCCAAGTTGACCCAACCTCTGCCAACTTC ZC693 TTGGCAGAGGTTGGGTCAACTTGGGATCTTGG ZC746 TTGATTTGGCCACCATGTGTTGAAGTTAAGAGATGTACTGGGT
GT ZC747 CAGTACATCTCTTAACTTCAACACATGGTGGCCAAATCAAGAA
G ZC748 TGTCAAACCTCGAGTGTTAAGTGTCAACCATCCAGAGT ZC749 GATGGTTGACACTTAACACTCGAGGTTTGACAACACC ZC750 TCACCACAGATCCGTTAAGGTTGCCAAGGTTGAATACGTTAGA
AAGAAGCCAA ZC751 AGCTTTGGCTTCTTTCTAACGTATTCAACCTTGGCAACCTTAA
CGGATCTGTGGTGAACTCTG ZC752 AGCTTAAGGAAGTTCAAGTTAGATTGGAAGAACACTTGGAATG
TGCATGCGCTACCACCTCTTTGAACCCAGACTACAGAGAATAAT ZC753 CTAGATTATTCTCTGTAGTCTGGGTTCAAAGAGGTGGTAGCGC
ATGCACATTCCAAGTGTTCTTCCAATCTAACTTGAACTTCCTTA ZC ABA−１ CGCTTGTGCTACCACCTCTTTGAACCCAGACTACAGAG
AATAAT ZC ABA−２ CTAGATTATTCTCTGTACTCTGGGTTCAAAGAGGTGGT
AGCACAAGCGCATG pVSBのPst…xba断片（第８図）をM13ファージベクタ
ーmp19にサブクローニングした。一本鎖鋳型DNAを、こ
の組換えファージで感染された大腸菌株JM107培養から
調製し、次のような突然変異誘発反応に用いた。５μ
のM13鋳型DNA（0.5ピコモル）を2mlのオリゴヌクレオチ
ドZC506（1.8ピコモル）及び2.5μの水並びに1.5μ
の10Xアニーリング緩衝液Ａ〔0.2M Tris−HCl,0.0M MgC
l₂,0.01MDTT pH7.5;ゾラー及びスミス（Zoller and Smi
th）,DNA,３:479〜488,1984〕と混合した。この混合物
を70℃で５分間加熱し、室温までゆっくりと冷却した後
氷上に置いてアニーリングを行った。このアニル混合物
に、1.5μの10X伸長緩衝液Ｂ〔0.2M Tris−HCl,0.1M
MgCl₂,0.1M DTT pH7.5;ゾラー及びスミス（Zoller and
Smith），前掲〕,6μのデオキシヌクレオチドトリホ
スフェート（各dNTP2.5mM）,1μのT₄DNAリガーゼ、１
μのDNAポリメラーゼクレノー断片、１μのTAP（10
mM）及び５μの水を添加した。この混合物を18℃で16
時間インキュベートした。反応混合物を水で２倍に希釈
後、得られた希釈混合物を用いて、大腸菌株JM107細胞
を形質転換した。その結果生じたファージプラークをベ
ントン及びディビス（Benton and Davis）（サイエン
ス,196:180,1977）に記載の方法によりニトロセルロー
スデイスに移した後、標準的な条件でT₄ポリヌクレオチ
ドキナーゼで標識した32P標識ZC506を用いてスクリーニ
ングした。32p−ZC506のフィルター内容物へのハイブリ
ダイゼーションを、6XSSC（0.9M NaCl,0.09Mクエン酸ナ
トリウム、pH7.2）、100μg/mlのキャリアーDNA及び0.0
5％ピロリン酸ナトリウム中において37℃で行った。ハ
ブリダイゼーショにに続いて、フィルター内容物を6XSS
C,0.1％SDS中で54℃において洗浄した。強力なオートラ
ジオグラフシグナルを生じるファージプラークを選び出
し、RF−DNAを調製後解析し、新しいSst I制限エンドヌ
クレアーゼ部位の存在を確認した。Sst I部位周囲の配
列もDNA配列解析により確認した。この時点でSat I部位
を含有しているPst I−Xba IサブクローンをPst I−xba
で消化したpVSBに連結し、得られたプラスミドをpSB1と
命名した。プラスミドpSB1は、Lys−Argのすぐ上流に位
置しているα−ファクターリーダーにおける２つのアミ
ノ酸変化（LeuからGlu及びAspからLeu）をコードしてい
る。得られる連結部の配列は次の通りである： α−ファクター…Glu Leu Lys Agr Ser…Ｂ−鎖。従
って、Ｂ−鎖をコードしているpSB1の配列は、５′末端
でSst I部位により、そして３′未満ではxba部位により
挾まれている。

実施例７ Ｂ−鎖の変異体及び誘導体の造成 A. ヒトＢ−鎖発現ユニットの造成 上記の実施例４に述べたＢ−鎖造成物pVSBは、ｖ−si
s遺伝子由来のサルＢ−鎖アミノ酸配列をコードしてい
る。このＢ−鎖アミノ酸配列は次の４箇所の位置におい
て、ヒトＢ−鎖アミノ酸とは異なっている:6,7,101及び
107。これらのアミノ酸の差異は非常に小さいものであ
り、従って、Ｂ−鎖の生物学的活性には影響しそうには
思われない。

真のヒトＢ−鎖を発現させるために、ヒトアミノ酸を
コードしている合成ヌクレオチド二本鎖をpVSB造成物に
組み込むことにより、サルに特異的なアミノ酸をヒトア
ミノ酸配列に変更した。この場合において、好ましい出
発ベクターは、α−ファクター/B−鎖連結部に導入れた
Sst I部位を有する上述したpSB1であった。このSst I部
位とアミノ酸＃24（第９図）でのBal II部位との間のDN
A配列を置換して、位置６及び７でヒトアミノ酸トレオ
ニン及びイソロイシンをコードするようにした。ZC685,
ZC686,ZC687及びZC688（表２）の４種のオリゴヌクレオ
チドはSst IとBgl IIとの間のpSB1配列を置換するよう
に設計された。ZC685及びZC686をアニーリングして一つ
の二本鎖を形成後、ZC687とZC688をアニールして別の二
本鎖形成した。これらの二つのアニーリングした二本鎖
を、Sst I−Bgl IIで消化したpSB Iベクターに連結し
た。得られたプラスミドをDNA塩基配列決定法により確
認し、pSB11と命名した。

Ｂ−鎖カルボキシル末端でのアミノ酸の変更を同様の
方法で行った。プラスミドpSB11をSph I及びXba Iで消
化後、この領域における配列を、位置101でヒトアミノ
酸トレオニン及び位置107でヒトアミノ酸プロリンをコ
ードするように設計された合成DNA二本鎖で置換した。
標準的な条件下において、オリゴヌクレオチドZC675及
びZC676をアニーリングした後、Sph I−Xba Iで消化し
たpSB11に連結した。造成物をDNA塩基酸列決定法により
確認し、pB12と命名した。このプラスミドは、真のヒト
Ｂ−鎖アミノ酸配列をコードしている。

又、pVSBプラスミドについて部位に特異的な突然変異
誘発を行い、当該の４個のアミノ酸を変更するか、ある
いはヒトＢ−鎖cDNA配列を発現させることによっても、
ヒトＢ−鎖アミノ酸配列を発現させることができた。

B. モノマーサイズのＢ−鎖突然変異体 血小板あるいは培養液中における形質転換細胞から単
離される生物学的に活性なPDGFはジスルフィド結合した
ダイマーである。このダイマー分子を化学的に還元する
と、その生物学的活性が損われる。しかしながら、驚く
べきことに、鎖間ジスルフィド結合に関与するＢ−鎖シ
スェイン残基を他のアミノ酸に変更するか、あるいはこ
れらのシスティン残基に近接するアミノ酸を変更するこ
とにより、Ｂ−鎖ポリペプチドが正確に折り重なるが、
鎖間ジスルフィド結合が生じないことが見い出された。
このことにより、PDGF細胞の表面に存在する受容体への
結合を可能にする配置を有する折り重なったモノマーＢ
−鎖を生ずる。例えば、β−鎖アミノ酸リジン98をロイ
シンに変更することにより、モノマーとして活性な分子
を生じた。この分子は、下記のようにして調製される。

プラスミドpVSB（第８図）をSph I及びXba Iで消化
後、これらの制限部位間のDNA配列を合成オリゴヌクレ
オチド二本鎖で置換する。この二本鎖は、ZC299及びZC3
00と類似するがあるが、位置98において、リジンコドン
の代わりにロイシンコドンを含有しているオリゴヌクレ
オチドをアニーリングすることにより形成する。この領
域における他の全てのコドンはそのまま保存され−鎖ア
ミノ酸配列をコードしている。アニーリングした二本鎖
は５′側にSph I接着末端を有し、一方、３′側にXba I
接着末端を有し、Sph I−Xba Iで消化したpVSBに連結さ
れる。このＢ−鎖突然変異体をpSB6と命名する。

この造成物を、pMPOT2プラスミドにクローニング（pS
B6mと命名する）後、これにより酵母を形質転換する
と、マイトジェン活性のある物質を生ずる。更に、発現
したマイトジェン性物質をポリアクリルアミドゲルで分
画後、ゲル切片から溶出させると、モノマーサイズの範
囲のゲルにおいて、マイトジェン活性を有する物質が見
い出される。このことは、システィン残基を変更する
か、あるいはそれらの周囲の環境を変更することによ
り、生物学的に活性なPDGFモノマーを生成できることを
示している。従って、分子中の他のシスティン残基の突
然変異誘発を行っても同様の結果を生ずることが期待で
きる。

C. 切断（truntaled）アミノ末端Ｂ−鎖突然変異体 酵母発現系におけるＢ−鎖の生合成中で、塩基性ジペ
プチドであるLys−Argの箇所でのタンパク質加水分解に
より、α−ファクタープレプロポリペプチドが、Ｂ−鎖
から除去される。別の塩基性ジペプチドであるArg−Arg
は、Ｂ−鎖中の27アミノ酸だけ下流に存在する（第９
図）。酵素プロセシング機構が、この内部部位でＢ−鎖
を切断でき、しかも活性タンパク質を生ずるかどうかを
確認することは、非常に興味深いところである。内部Ar
g−Arg部位で生ずるようにタンパク質加水分解プロセシ
ングを行うために、オリゴヌクレオチド指令突然変異誘
発により、α−ファクターとＢ−鎖との境界でのLys−A
rgを除去した。

前記においてpSB1のpSB1の造成に関して述べた方法に
実質的に準じて突然変異誘発を行った。pVSBのPst I…X
ba I断片（第８図）をM13ファージベクターmp19にブク
ローニングし、そして一本鎖鋳型DNAを分離した。この
場合において、使用された突然変異誘発用オリゴヌクレ
オチドであるZC505（表２）をα−ファクターLys−Arg
残基をGly−Leuに変更するように設計し、新しいPvu II
制限部位を導入した。突然変異誘発反応をpSB1に関して
上述した方法で行い、得られた突然変異誘導体を新しい
Pvu II部位に関してスクリーニングを行った後、DNA配
列の解析により確認した。突然変異誘発されたPst I−X
ba I断片をＢ−鎖発現ユニット（pVSB）にサブクローニ
ングしてもどし、得られた新しいプラスミドをpSB3と命
名した。

実施例８ Ａ−鎖の変異体及び誘導体の造成 A. Ａ−鎖アミノ末端の合成及びＡ−Ｂハイブリッド融
合体の造成 公知のＡ−鎖アミノ酸配列〔ジョンソン等（Johnson
et al）、エンボ・ジェイ（EMBO J.），３:921〜928,19
84〕をコードするように設計した短い合成オリゴヌクレ
オチド二本鎖として、Ａ−鎖コード配列をpSB Iベクタ
ーに挿入した。ZC545とZC546（表２）とをアニーリング
し、５′Sst I接着末端、ユニークMlu I制限部位、及び
３′Bal II相補末端を有する短い二本鎖DNA断片を調製
した。この二本鎖をSst I及びBgl IIで消化したpSB1に
クローニングした。１μのpSB1ベクター（1.15ピコモ
ル）を１μのZC546（〜1.6ピコモル）及び0.6μのZ
C545（〜1.5ピコモル）、更に0.25μの0.3M NaCl（ア
ニーリング反応における最終NaCl濃度は30mM）である）
と混合した。この混合物を、60℃で５分間加熱した。加
熱後、混合物を室温にし、その後氷上に置いた。次に、
0.5μの10Xリガーゼ緩衝液（0.5M Tris−HCl,0.1M Mg
Cl₂,2M DTT,0.01M ATP,pH7.8）,0.1μのT₄DNAリガー
ゼ〔ニュー・イングランド・バイオラブズ（New Englan
d biolabs）〕及び2.5μの水を添加した。この混合物
を希釈し、大腸菌株101細胞を形質転換した。アンピシ
リン耐性プラスミド担持コロニーを選び出し、増殖さ
せ、イシ・ホロヴィッツ及びバーク（Ish−Horowicz an
d Burke）〔ヌクレイックアシッド・リサーチ・（Nuc.A
cid Res）,9:2989−2998,1981〕の「ミニプレプ（minip
rep）」法によりプラスミドDNAを単離した。プラスミド
を分析し、Sst I−Bgl II挿入部及び新しいMlu I制限部
位の存在を確認し、且つDNA配列の解析によって確認し
た。ZC545−546二本鎖は、Ａ−鎖アミノ酸アラニン８〜
チロシン17（第９図）をコードしていた。得られたプラ
スミドをpA1と命名した。

ZC547とZC548（表２）とをアニーリングし、Ａ−鎖ア
ミノ酸セリン１〜アルギニン13（第９図）をコードし、
且つMlu1制限部位を含む、第２の短いSst I−Bgl II断
片を調製した。ZC547−548二本鎖をSst I及びBgl IIで
消化したpSB1に別々にクローニングした。Sst I及びBgl
IIで消化したpSB1（1.5ピコモル）の１μを２μの
ZC547（１ピコモル）及び２μのZC548（１ピコモ
ル）、更に0.25μの0.3M NaClと混合した。その混合
物を50℃で５分間加熱した。加熱後、このアニーリング
混合物を室温にし、その後、氷上に置いた。次に、0.6
μの10Xリガーゼ緩衝液及び0.1μのT₄DNAリガーゼ
〔ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England
Biolabs）〕を添加し、12℃で一晩反応させた。この連
結反応混合物のアリコートを希釈し、それを用いて大腸
菌株HB101細胞を形質転換した。得られたプラスミドを
スクリーニングし、pA1に関して前記した方法に準じて
分析した。得られたプラスミドをpA2と命名した。

重り合うpA1とpA2とのＡ−鎖コード領域を、ユニーク
Mlu I部位で従来法により連結した。プラスミドpA2をMl
u I及びBamH I消化後、〜1.4キロベス−ベクター（pUC
含有）断片をアガロースゲル電気泳動で単離し、その
後、CTABによりアガロースから抽出した〔ラングリッジ
（Langridge）等、アナル・バイオケム（Anal.Bioche
m），103:264−271,1980〕。プラスミドpA1をMlu I及び
BamH Iで消化し、その後、Ｂ−鎖アミノ酸24〜109（そ
のあとにTPIターミネーターが続く）に融合したＡ−鎖
アミノ酸13〜17をコードしている約800塩基対を、前記
と同様の方法により単離し、そして抽出した。これらの
２つの断片を等モルづつ用いて、標準的な条件下におい
て連結した。生成物のアリコートを用いて、大腸菌HB10
1細胞を形質転換した。アンピシリン耐性コロニーから
得たプラスミドを、制限酵素での消化により分析し正確
な断片を得、DNA塩基配列決定法により確認した。この
ようにして得られたプラスミドをpA3と命名した。pA3は
Ａ−鎖アミノ酸１〜17から始まりフレーム内にＢ−鎖ア
ミノ酸24〜109が続くハイブリッドタンパク質をコード
していた。発現ユニット全体を含有しているpA3のCla I
…BamH I断片をpMPOT2にクローニングした。その結果得
られたプラスミドpA3mを酵母に形質転換した。

同様にして、Ａ−鎖アミノ酸をＡ−Ｂハイブリッドに
さらに付加した。プラスミドpA3をまずＡ−鎖配列のプ
ロリンコドン７の部分で一度プラスミドを切断するAsp7
18で消化し、次にBamH Iで消化した。ハイブリッドアミ
ノ酸をコードしている断片をpUC118にサブクローニング
した。このサブクローンをpA3Nと命名し、続いてBgl II
及びBst XIで消化した。Bgl IIはハイブリッドにおける
Ａ−鎖及びＢ−鎖配列の境界で切断し、一方、Bst XI
は、Ｂ−鎖中の約40塩基対下流を切断する。この消化物
から、ベクター断片（pUC含有）をアガロースゲル電気
泳動で単離し、その後CTAGで抽出した。オリゴヌクレオ
チドZC692及びZC693（表２）の各１ピコモルづつをアニ
ーリングして、５′側Bgl II末端及び３′側Bst XI末端
を有する短い二本鎖DNAを形成した。この二本鎖DNAは、
Ａ−鎖グルタミン酸18〜フェニルアラニン31をコードし
ていた。この二本鎖DNAを、0.1ピコモルのBgl II−Bst
XIで消化したpA3Nと連結した。この連結反応を一晩行
い、連結生成物を大腸菌株MV1193細胞に形質転換した。
得られたプラスミドをpA6Nと命名した。このプラスミド
は、Ａ−鎖アミノ酸配列をアミノ酸A31のBst XI部位ま
で伸張しており、これにＢ−鎖アミノ酸B38〜B109が続
いている。

プラスミドpA6Nを次に、Asp718及びBamH Iで消化後、
Ａ−Ｂハイブリッド断片を、Asp718−BamH Iで消化した
pA3mにクローニングしてもどした。この新しいＡ−Ｂハ
イブリッドプラスミドをpA6mと命名した。pA6mでは、Bs
t XI部位がＡ−鎖及びＢ−鎖間の相同性の高い領域の開
始点にあるため、アミノ酸40までのＡ−鎖アミノ酸配列
をコードしている。

B. Ａ−Ｂ−Ａハイブリッド融合体の造成 PDGFのＡ−鎖及びＢ−鎖は、構造及び作用において非
常に相同性があるので、これら２つによりいくつかの生
化学的に活性な分子が調製することができると思われ
る。上記において、後にＢ−鎖アミノ酸が続くアミノ末
端Ａ−鎖配列を含有する多数の例を述べた。これに関す
る他の例としては、アミノ及びカルボキシル末端にＡ−
鎖アミノ酸配列を含有し、且つ中央にＢ−鎖配列を含有
するハイブリッド蛋白質を造成することが挙げられるで
あろう。

好ましい態様としては、ハイブリッドタンパク質A1−
17及びB24−109をコードしているプラスミドpA6を使用
し、且つカルボキシル端においてＢ−鎖アミノ酸をＡ鎖
と交換することが挙げられる。この場合に、Ｂ−鎖コド
ン96及び97において切断する（第９図）制限エンドヌク
レアーゼSph1によりＢ−鎖コード領域が消化される。こ
のプラスミドpA6を、翻訳終了コドンのすぐ３′側を切
断するXba Iで再び切断する。その後、アニーリングす
ると５′側及び３′側にSph I及びXba I接着末端を有す
る二本鎖を形成する２つのオリゴヌクレオチドで、この
配列を置換する。これらの２つのオリゴヌクレオチドZC
ABA−１及びZCABA−２を表２に示す。これらの２つオリ
ゴヌクレオチドを65℃に加熱しその前記の方法でゆっく
り冷却することによりアニーリングする。アガロースゲ
ル電気泳動により単離したSph I−Xba Iで消化したpA6
プラスミドに、アニーリングした二本鎖を連結する。連
結生成物を大腸菌株MV1193細胞に形質転換後、アンピシ
リンプレート上で形質転換コニーを得る。この場合、新
しいＡ−鎖二本鎖により何ら新しい制限部位が導入され
ないので、DNA配列を解析することにより造成が確認さ
れる。

C. Ａ−鎖システィン突然変異体の造成 第９図から明らかなように、PDGFのＡ−鎖及びＢ−鎖
の両方がジスルフィド結合を形成することのできる８個
のシスティン残基を含有している。又、第９図からは、
これらのシスティン残基は、２つのポリペプチド中の類
似の位置に存在し、従って、鎖中又はこの２つの鎖出、
あるいは２つの異なった鎖（Ａ及びＢ）の間でさえ、同
様なジスルフィド配置を形成する。ジスルフィド結合し
たPDGFダイマーを化学的に還元して単量体にすると、そ
の生物学的活性が損われることが、ここ数年の間に知ら
れるようになった。当該のどのシスティン残基が分子内
及び分子間のジスルフィド結合にかかわっているかを確
認することは興味深いことである。これに関して、各シ
スティンの役割がＡ−鎖及びＢ−鎖の両方において類似
していることが高い確率で言える。

Ａ−鎖における最初のシスティン残基が、Ｂ−鎖の＃
16（第９図）に類似する位置＃10に存在する。Ａ−Ｂハ
イブリッドpA3（上述の）はＡ−鎖アミノ酸１〜17をコ
ードしており、この後にＢ−鎖が続く。pA3を造成する
ための合成計画においては、残基A10のシスティンを挾
むユニーク制限部位を組み込む。Asp718及びMlu I制限
部位をA10システィンコドンに対してそれぞれ５′側及
び３′側に、約20塩基対離して配置した。二種のオリゴ
ヌクレオチド（ZC671及びZC672;表２）を合成後、アニ
ーリングして、５′側Asp718接着端及び３′側Mlu I接
着端を有する短い二本鎖DNAを形成した。この二本鎖DNA
は、システィンA10の代りにセリン残基をコードいてい
る。プラスミドpA3をAsp718及びMlu Iで消化後、大きな
ベクター（PUC含有）フラグメントをアガロースゲル電
気泳動により単離した。等モル等のベクターとZC671−6
72二本鎖を上述の方法により、標準的な条件下で連結
後、それを大腸菌株MV1193細胞中に形質転換した。プラ
スミド（ミニプレプ）DNAを得られた形質転換体から調
製し、その後、ZC671−672二本鎖に存在する新しいPvu
II部位に関してスクリーニングを行った。その後、プラ
スミドの二本鎖領域をDNA配列の解析により確認した。p
A5と命名した得られたプラスミドは、アミノ末端にＡ−
鎖アミノ酸１〜17を有するが、残基10がシスティンの代
わりにセリンであるＡ−Ｂハイブリッドタンパク質をコ
ードしている。pA5ハイブッドの残りのアミノ酸は、通
常のＢ−鎖残基（Glu24〜Thr109）である。

D. Ａ−鎖遺伝子の完全合成 Ａ−鎖遺伝子の残部を、オリゴヌクレトチドを用い、
上記と非常に類似した方法において合成した。この課題
を達成するために多くの方法が立案された。このような
方法の一例を下記に述べる。この方法において使用され
るオリゴヌクレオチドを表２に示す。そこには、サッカ
ロミセス・セレビシエー（Saccraromyces cerevisiae）
に関する最適なコドンの使用が示されている。この方法
においては、Ａ−鎖遺伝子の残部を、サブクローニング
及び合成オリゴヌクレオチド配列の決定を容易にするた
めにユニーク制限部位を導入して合成した。全てのヌク
レオチドは、アプライド・バイオシステムズ（Applied
Biosistems）380−Ａ型DNA合成装置により合成した。各
々87量体であるオリゴヌクレオチドZC752及びZC753をア
ニーリング後、Ａ−鎖アミノ酸77〜104をコードするHin
d III…Xba I断片としてサブクローニングした。ZC752
及びZC753（各1.25ピコモル）を40mM NaCl5μ中で65
℃で15分間加熱し、混合物を室温し、その後、氷上に置
く。このアニーリングした二本鎖の1/10（0.0125ピコモ
ル）をあらかじめHind III及びXba Iで消化したPUC118
（0.07ピコモル）及びM13mp18（0.02ピコモル）に連結
した。この連結混合物を適当な大腸菌宿主株（M13mp18
の場合JM107及びPUC118の場合MV1193）に形質転換し
た。得られたプラスミド又はRF DNAを制限エンドヌクレ
アーゼでの消化及びDNAの塩基配列決定により分析し
た。

オリゴヌクレオチドZC746＋747,748＋749及び750＋75
1は、接合した場合、A31のBst XI部位とA77のHind III
部位間の配列を構成する接着末端を有する短い二本鎖を
生じるように設計された。オリゴヌクレオチドを、標準
的な条件下32p及びT₄ポリヌクレオチドキナーゼでリン
酸化した。ZC746＋ZC747,ZC748＋ZC749及びZC750＋ZC75
1の各対を、各オリゴヌクレオチドの2.5ピコモルを５μ
の40mM NaClに入れ、65℃で15分間加熱し、室温に温
度を低下させた後氷上に置くことによりそれぞれアニー
ルせしめた。３つのアニーリング混合物を混合し（この
状態で15μ）、その後、最終容積20μ中で連結し
た。連結生成物をTBE緩衝液（90mM Tris,90mM硼酸,2mM
EDTA＝ナトリウム塩）中で４％NuSieveアガロースゲル
〔エフ・エム・シー・コーポレーション（FMC Corporat
ion）〕で電気泳動し、続いてオートラジオグラフィー
を行った。正確に連結され３つの連結二本鎖に相当する
140塩基対をゲルから切取り、CTABで抽出した。あらか
じめクローニングしたHind III−xba I断片とともにこ
の断片を、Bst XI−xba Iで消化したpA6Nベクターに連
結した。得られたプラスミドをpA6N⁺と命名した。その
後、プラスミドpA6N⁺をAsp718及びXbaで消化後、Ａ−鎖
をコードした断片をpA3にクローニングしてもどした。
このプラスミドpA7は完全成熟Ａ−鎖をコードしてい
る。

酵母発現の目的の場合、好ましい態様としては、オリ
ゴヌクレオチドZC748及びZC749を用いることが挙げられ
る。これらは、位置Ａ−48において、アスパラギンの代
わりにグルタミンをコードしている。この変更により、
酵母中においてグリコシル化されることのできるＮ−結
合グリコシル化部位を突然変異的に損う。Ｎ−結合グリ
コシル化部位を保存するように設計されたオリゴヌクレ
オチドも使用可能である。

Ａ−鎖のアミノ酸配列は公知であり、且つコドンの使
用は酵母に関して最適化されることができるので、上述
の事柄において、全体的な観点から遺伝子合成を用いる
方法が望ましい。一方、好ましい発現ベクターにcDNAを
適当に組み入れることを条件に、Ａ−鎖cDNA配列が酵母
あるいは他の真核性細胞中で発現することができた。Ａ
−鎖cDNAは、従来の方法〔ベトホルツ（Betoholtz）
等、ネーチャー（Nature），320,695−699,1986〕によ
り、種々の哺乳動物のセルラインから得ることができ
た。

E. Ａ−鎖アミノ末端切断（truncated）突然変異体 酵母発現系におけるＡ−鎖蛋白質の生合成の間に、α
−ファクタープレプロペプチドが、塩基性ペプチドLys
−Arg,α−ファクターアミノ酸残基＃84及び＃85の位置
で、蛋白質加水分解プロセシングにより、Ａ−鎖から除
去される。この蛋白質加水分解プロセシングを内部Ａ−
鎖部位で起すようにするために、α−ファクターとＡ−
鎖との境界に存在するLys−Argを除去し、且つオリゴヌ
クレオチド指令突然変異誘発により内部Arg−Argを生成
させる。

Lys−Arg除去に関する突然変異誘発は、pSB Iの造成
に関して上述した方法と実質的に同様に行った。pVSBの
Pst I…xba I断片（第８図）をM13ファージベクターmp1
9にサブクローニングL,その後，一本鎖鋳型DNAを調製す
る。この場合において、突然変異誘発用オリゴヌクレオ
チドが、α−ファクターLys−Arg残基をGly−Leuに変更
し、且つ新しいPvu II制限部位を導入するように設計し
た。突然変異誘発反応を、pSB1に関して上述した方法と
実質的に同様にして行う。得られる突然変異体を、新し
いPvu II部位に関してスクリーニングし、その後、DNA
配列解析により確認する。突然変異誘発されたPst I…x
ba I断片を、Ａ−鎖発現ユニット（pA7と命名する）に
サブクローニングしてもどす。

二塩基性ペプチド部位を、Ａ鎖コード配列に導入する
ために、上記した方法によりオリゴヌクレオチド指令突
然変異誘発を行う。Ａ−鎖中におけるアミノ酸残基＃22
はセリンであり、一方、＃21はArgである。この場合に
おいて、Ser＃22をArgに変更し、位置＃21及び＃22で配
列Arg−Argを生成するように、突然変異誘発用オリゴヌ
クレオチドを設計する。Ａ−鎖における新しい二塩基性
部位は、通常Ｂ−鎖（第９図）に存在する位置に正確に
類似する箇所に生ずる。この突然変異体造成物を二塩基
性プロセシング部位の欠乏しているα−ファクターリー
ダー（leader）から発現することにより、生ずるＡ−鎖
分子は、新しいArg−Argの箇所で内部的にプロセシング
され、切断ポリペプチドとして分泌される。

実施例９ pMPOT2への発現単位造成物の挿入 Sst I部位を用いる場合には、実施例６〜８において
造成した分子の各々を塩基性発現ユニットpVSB又はpSB1
に挿入してもどした。その後、各分子は最終的に酵母プ
ラスミドpMPOT2（実施例４）にクローニングした。各場
合において、Cla I−BamH I消化により、pVSB又はpSB1
から発現ユニットを単一断片として取り出してクローニ
ングを行った。各Cla I…BamH I断片をアガロースゲル
電気泳動により単離後、Cla I及びBamH Iで消化したpMP
OT2にクローニングした。ここで得られたプラスミドの
名前を、小文字の“m"が付くように、例えば、pA2の場
合はpA2mに変える。

その後、mPOT造成物の各々を酵母株E18−＃９（実施
例６）に形質転換した。

実施例10. Ａ−Ｂヘテロダイマー発現の造成 PDGFはジスルフィド結合を有するダイマーであり、そ
して血小板から分離する場合、２種類のアミノ酸鎖,A鎖
及びＢ鎖から構成されている。この物質はＡ−Ｂヘテロ
ダイマーの形をしていると推定される。現在、Ａ鎖ある
いはＢ鎖のいずれかから構成されるPDGFホモダイマーの
例が数多く存在する（Kelly等、EMBO J.４:3399−3405,
1985;Stroobant及びWaterfield,EMBO J.３:2963,1984;
及びHeldin等、Nature 319:511,1985）。血小板PDGFは
ヘテロダイマーであると依然として考えられているとい
うものの、これらのデータから、それは実際にはＡ−Ａ
ホモダイマー及びＢ−Ｂホモダイマーの混合物であり得
るという可能性がでてくる。

PDGFの生物学的に活性なＡ及びＢ形を酵母発現系にお
いて発現せしめたとすると、Ａ鎖及びＢ鎖発現ユニット
の両方を同一の酵母細胞中に導入し、そして生物学的に
活性な物質のなかでＡ−Ｂヘテロダイマーを同定するこ
とが可能である。このことは、できれば異る選択マーカ
ーを有する異るプラスミド上で各発現ユニットを酵母細
胞中に導入することによって行うことができる。この手
法を使用すると、２種類のプラスミドの相対的なコピー
数を調整することが困難になり得、また、これによっ
て、不つり合いな量のＡ鎖及びＢ鎖ポリペプチドが細胞
内において生成する可能性がある。好ましい手法では、
Ａ鎖及びＢ鎖発現ユニットの両方が同一のプラスミド上
に置かれるであろう。この方法では、それらのコピー数
は常に等しくなるであろう。

両方の発現ユニットを同一のプラスミド中に含ませる
ために多数の方法がある。本発明では、BamH Iを使用し
た完全消化と、それに引き続くBal IIを使用した部分消
化とによって、Ｂ鎖発現ユニットをプラスミドpVSB（第
８図）から取り出した。発現ユニットに対応する断片
（TPIプロモーターMFα１−Ｂ鎖ターミネータ）をアガ
ロースゲル電気泳動法によって分離し、そしてpUC18のB
amH I部位中にサブクローン化した。得られたサブクロ
ーン中の挿入部の配列を常用の制限酵素消化によって確
立した。挿入部のBgl II末端がポリリンカー中のSal I
部位に隣接するサブクローンを次の工程のために選択し
た。このサブクローンをSal I及びBamH Iで消化し、そ
して挿入断片を単離した。次いで、このＢ鎖断片を、Sa
l I及びBamH Iを用いて消化を行ったプラスミドpA7m中
に連結した。得られたプラスミドpAB2mには、Ａ鎖及び
Ｂ鎖発現ユニットの両者が尾部から尾部に配列して含ま
れる。次いで、このプラスミドを酵母菌E18−＃９に形
質転換した。

実施例11. 生物学的活性のアッセイ A. PDGFのラジオレセプターアッセイ（RRA） PDGFのためのラジオレセプタアッセイ（Bowen−Popo
及びRoss,J.Biol.Chem.257:5161,1982）は、酵母中の生
物学的に活性なPDGF様物質を検出するための特異的かつ
高感度（0.2〜2ng/ml PDGF）な方法である。このアッセ
イでは、PDGF様物質のその能力、すなわち、細胞表面の
PDGFレセプタ上の結合部位に関して、精製し放射性同位
元素で標識した¹²⁵I−PDGFと競争するその能力について
試験する。結果を、精製し標識しなかったPDGを用いて
作成した標準曲線に比較することによって解明する。そ
の他のアッセイ方法（例えばELISA）を用いて得た結果
の比較から、結合した物質の定量のほかに、レセプタ／
リガンド相互作用の強さが与えられる。このアッセイは
次のようにして実施する：ヒトの二倍体繊維芽細胞のサ
ブコンフルエント単層を、ダルベッコ（Dulbecco）の改
変イーグル培地（DMEM）であって１％ヒト血漿由来血清
（PDS）を補充したものにおいてCoaster24ウエルクラス
タートレー中の2cm²培養ウエルにつき1.5×10⁴個の細胞
をプレートすることによって調製される。培養物を氷の
トレー上に載せ、そして氷冷した結合すすぎ液（25mM H
EPESでpH7.4に緩衝しかつ0.25％BSAを補充したHam培地
Ｆ−12）で１回すすぎを行う。結合媒体中の供試物質を
ウエルごとに1ml添加し、そして培養物を冷蔵室におい
て振動プラットフォーム上で３〜４時間にわたってイン
キュベートする。次いで、トレーを氷の上に載せ、液を
吸引除去し、冷結合すすぎ液で１回のすすぎを行い、そ
して0.5ng/mlの¹²⁵I−PDGFを含有する結合媒体1ml/ウエ
ルと共に上述のように１時間にわたってインキュベート
する。結合すすぎ液を用いた４回のすすぎでラベリング
（標識付与）を完了し、そして細胞を結合した¹²⁵I−PD
GFを可溶化緩衝液での抽出によって測定する。0,0.05,
0.1,0.2,0.4及び0.8ng/mlの精製PDGFを使用して標準曲
線を得、そして供試サンプルをこれらの値と比較する。

プラスミドpVSBMm及びpMPOT2を含有する酵母形質転換
体からのCM−セファデックス（Sephadex）媒体濃縮物に
よるPDGFVセプタの結合を真正PDGFによるレセプタ結合
と比較した。CM−セファデックスへの結合及びそれから
の溶出による濃縮の後、PDGFに対するポリクロナールヤ
ギ（goat）抗体を使用するELISAにおいて、して、pVSBm
濃縮液をPDGF等量に標準化した。RRAの結果を、第10図
に示されるように、精製し標識しなかったPDGFを用いて
作成した標準曲線に比較することによって解明した。pV
SBm造成物により形質転換された培養物からの媒体は、P
DGFレセプターへの結合に関して、¹²⁵I−PDGFと競争す
ることが示された。pMPOT2で形質転換した酵母細胞から
の媒体は、レセプタ結合に関して、放射性同位元素標識
PDGFとの競争を示さない。

B. マイトジネシスアッセイ 培養中においてDNA合成及び細胞増殖を刺激するPDGF
の能力は、その定義及び発見のための基礎であった。PD
GFに対して敏感な培養された細胞のDNA中への³H−チミ
ジンの導入（Raines及びRoss,Meth.in Enzomology 10
9）は、酵母中で産生されたPDGF様分子の生物学的活性
を示すための好ましい方法である。

そのままスペント培地の試験サンプル又はスペント培
地の濃縮物もしくは10mMの酢酸中の試験サンプル（100
μまで／ウエル）を、2cm²のCostar24−ウエル培養血
中においてマウス3T3細胞（２〜３×10⁸個の細胞／ウエ
ル1ml）の静止培養物に添加する。静止試験培養物は、1
0％血清中に細胞をプレートし、そして４〜５日間、そ
の培地を消費せしめることによって得られる。その試験
サンプルを、20時間後ウエルから取り出し、そして２μ
Ci/mlの〔³H〕−チアミジン及び５％（v/v）ウシ血清を
含むウエル当り新鮮な培地0.5mlと交換する。37℃でさ
らに２時間インキュベートした後、細胞を次のようにし
て処理する：培地の吸引除去し；ウエルを氷により冷却
された５％TCA1mlにより２度洗浄し；混合しながら、0.
25NのNaOH0.8ml中に不溶性物質を溶解し；そして液体シ
ンチレーションカウンターによりアクアゾール（Aquaso
l）5ml中に、この溶液0.6mlを計数する。対照のウエル
（10mMの酢酸100μのみ）に対する増培刺激（fold st
imulation）（通常、30〜50倍の最大刺激）を決定し、
そして精製されたPDGFのポリペプチドを用いて得られた
標準曲線と比較する。

Ａ−鎖のホモダイマー及びＢ−鎖のホモダイマーを、
精製し、均質化し、アミノ酸分析により定量化し、そし
てマイトジネシスアッセイにおいて実質的に等しい比活
性を有することが見出された。

実施例12. タンパク質発現の最適化 A. 最適化されたＢ−鎖の発現の造成 酵母の最適コドンを含み、そして野生型のα−ファク
ター及び真のヒトＢ−鎖をコードするように、α−ファ
クターのリーダー配列及びPDGFのＢ−鎖をコードするDN
A配列を変形した。これは、先行する造成において変え
られたα−ファクター配列を再現し、そしてＢ−鎖発現
レベルの最適化を可能にした。

そのコドンが最適化されたα−ファクターのリーダー
配列を、インシュリン類似体、すなわちＢ（１−29）、
Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）（Markussenなど.,EP163,
529）の遺伝子を含む発現ベクターから得た。α−ファ
クター−プペープロ及びインシュリン配列を含むEcoR I
−Xba Iフラグメントを、EcoR I及びXba Iにより消化さ
れたpUC118（J.Vieria及びJ.Messing,Waksman Institut
e of Microbiology,Rutgers,Piscataway,N.J.から得ら
れた）中にクローン化し、そして一重鎖の鋳型DNAを調
製した。次に、この鋳型を、突然変異誘発用オリゴヌク
レオチドZC862（５′CGA ATC TTT TGA GCT CAG AAA CAC
C3′）を用いて２プライマー法（two−primer method
（Zoller及びSmith,DNA ３:479〜488,1984）に従って突
然変異誘発せしめた。その突然変異誘発は、α−ファク
ターのリーダー配列の３′端にSst I部位を生じさせ
た。正しく変形されたプラスミドを選択し、そしてpKP2
3と命名した。そのリーダー配列を、EcoR I及びSst Iに
よる消化によってpKP23から切り出し、そしてそのリー
ダーフラグメントを、pIC19（Marshなど.,Gene 32:481
〜486,1984）中にサブクローン化した。その得られたプ
ラスミドをpKP24と命名した。

ヒトＢ−鎖配列をプラスミドpB12（例7A）から得た。
pB12をSst I及びXba Iにより消化し、そしてそのＢ−鎖
フラグメントを回収した。EcoR I部位を欠くpBR322ベク
ター中に挿入されたpSB1（例６）のTPIプロモーター−
α−因子−VSB−TPIターミネーターを含むプラスミドpK
P10を、Sst I及びXba Iにより消化し、VSB配列を除去し
た。次に、pB12のＢ−鎖配列及びpKP24のα−ファクタ
ー配列（EcoR I−Sst I）を、pKP10の発現ユニット中に
挿入した。その得られたプラスミドをpKP26と命名し
た。

次に、pKP26の造成を促進するためにα−ファクター
のリーダー配列中に導入されたSst I部位を除去し、野
生型のコード配列を再現した。プラスミドpKP26をEcoR
I及びXba Iにより消化し、そしてα−ファクター−Ｂ−
鎖の融合配列を回収した。このフラグメントをpUC118中
にクローン化し、そして一本鎖の鋳型DNAを単離した。
その鋳型を、突然変異誘発用オリゴヌクレオチドZC1019
（５′ACC CAA GGA TCT CTT GTC CAA AGA AAC ACC TTC
TTC3′）を用いて２プライマー法により突然変異誘発せ
しめた。正しく突然変異誘発されたプラスミドをpKP32
と命名した。

次に、完全な発現ユニットを再構成した。プラスミド
pKP32をEcoR I及びXba Iにより消化し、そしてそのα−
ファクター−Ｂ−鎖のフラグメントを回収した。このフ
ラグメントを、EcoR I及びXba Iにより切断されたpKP25
中に挿入し、pKP34を造成した。プラスミドpKP34をCla
I及びBamH Iにより消化し、そしてその発現ユニットを
回収した。このフラグメントをCla I及びBamH Iにより
消化されたpMPOT2中に挿入し、pKP36を造成した。

次に、Ｂ−鎖配列のコドンを最適化した。pKP36のＢ
−鎖配列の内部Bgl II〜Sph Iフラグメントを、第４表
に示されているオリゴヌクレオチドから組み立てられた
配列と交換した。十分に最適化された発現ユニットを含
む、pMPOT2を基礎とした発現ベクターをpB170mと命名し
た。

B. 最適化されたＡ−鎖の発現の造成プラスミドpA7
（例8D）からのコドンが最適化されたＡ−鎖配列と、Ｂ
−鎖についての上記した方法に平行する一連の造成段階
においてコドンが最適化されたα−ファクターのリーダ
ー配列とを組み合せた。pKP24のα−ファクター配列
を、pA7のＡ−鎖配列、並びにEcoR I及びXba Iにより切
断されたpKP10と組み合せてpKP27を造成した。プラスミ
ドpKP27をEcoR I及びXba Iにより消化し、そしてそのα
−ファクター−Ａ−鎖のフラグメントをpUC118中にクロ
ーン化した。

オリゴヌクレオチドZC1018（５′TTC GAT AGA TCT CT
T GTC CAA AGA AAC ACC TCC TTC3′）を用いて、突然変
異誘発を上記のようにして行ない、Sst I部位を除去
し、そして野生型のα−ファクター配列を再現した。そ
の修正されたプラスミドをpKP31と命名した。

次に、コドンが最適化された発現ベクターを造成し
た。プラスミドpKP31をEcoR I及びXba Iにより消化し、
そしてα−ファクター−Ａ−鎖のフラグメントを、EcoR
I及びXba Iにより切断されたpKP24に連結した。pKP33
と命名されたその得られたベクターは、完全な発現ユニ
ットを含有していた。プラスミドpKP33をCla I及びBamH
Iにより消化し、そしてその発現ユニットのフラグメン
トを回収した。このフラグメントを、Cla I及びBamH I
により切断されたpMPOT2中に挿入し、発現ベクターpKP3
5を造成した。

C. Ａ−鎖及びＢ−鎖の発現 S.セレビシエー（S.cerevisiae）株XB13−5Bを、標準
の方法に従って、プラスミドpB170m及びpKP35により別
々に形質転換した。その形質転換体を、撹拌しながら30
℃でグルコース培地中で培養した。培養物を収穫し、細
胞を遠心分離により取り出し、そして蛋白質を下記のよ
うにして上清液から精製した。

プラスミドpB170m及びpKP35を含むS.セレビシア株XB1
3−5B形質転換体を、ATCC（Rockvill,Md.20852,U.S.A）
に寄託した。

D. 蛋白質の精製 上記のようにして調製された酵母培養物の上清液（12
）を、流速60ml/分でAmicon RA2000限外過膜により
濃縮し、350mlの体積にした。緩衝液を0.1％NaN₃を含む
25mMの酢酸ナトリウム溶液（pH5.5）と交換した。その
濃縮されたサンプルを15,000rpmで20分間、遠心分離
し、そして−20℃で貯蔵した。

凍結されたサンプルを解凍し、15,000rpmで20分間遠
心分離し、そしてＳ−セファロースカラム（Pharmaci
a）上で分画した。サンプル300mlを2ml/分の流速で30ml
のカラム上に負荷した。次に、そのカラムを0.1％NaN₃
を含む25mMの酢酸ナトリウム溶液（pH5.5）により洗浄
した。そのカラムを、次の溶出プログラムに従って、2m
l/分の流速で溶出した:0.1％NaN₃を含む20mMのリン酸ナ
トリウム溶液（pH7.3）により20分間;0.2MのNaClを含む
20mMのリン酸ナトリウム溶液（pH7.3）により30分間;0.
5MのNaClを含む20mMのリン酸ナトリウム溶液（pH7.3）
により50分間;1MのNaClを含む20mMのリン酸ナトリウム
溶液（pH7.3）により20分間。マイトジエン活性につい
て画分をアッセィし、そしてゲル電気泳動にかけた。マ
イトジエン活性を有する画分をプールし、そしてそのpH
を6.0に調整した。

最終精製を、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）
によって行なった。セファロースクロマトグラフィーか
らのプールされた画分を、1ml/分の流速でMicroPakC−1
8をカラムに通した。PDGFポリペプチドを、緩衝液Ａ
（水中0.1％TFA）中緩衝液Ｂ（CH3CN中0.1％TFA）のグ
ラジェントを用いて溶出した。その溶出のプログラムは
下記の通りであった：時間（分） ％緩衝液Ｂ 0 ０ 17.5 35 32.5 50 33.0 100 0.5mlの画分を集め、そしてマイトジェン活性につい
て検定し、そしてその活性画分をプールした。

第 ４ 表 ZC886 GGCCACCATGTGTTGAAGTTCAAAGATGCTCGGGTTGTTGTAA
CAACAGAAACGTTCAATG ZC887 TCGACATTGAACGTTTCTGTTGTTACAACAACCCGAGCATCTT
TGAACTTCAACACATG ZC888 GATCTCTAGAAGATTGATCGACAGAACCAACGCCAACTTCTTG
GTTT ZC889 GTGGCCAAACCAAGAAGTTGGCGTTGGTTCTGTCGATCAATCT
TCTAGA ZC907 CGTTAGAAAGAAGCCAATCTTCAAGAAGGCTACCGTTACCCTC
GAGGACCACTTGGCATG ZC908 TCGACCAACCCAAGTTCAATTGCGGCCGGTTCAAGTGCGCAAG
ATCGAAAT ZC909 CTAACGATTTCGATCTTGCGCACTTGAACCGGCCGCAATTGAA
CTTGGGTTGG ZC910 CCAAGTGGTCCTCGAGGGTAACGGTAGCCTTCTTGAAGATTGG
CTTCTT 以上、発明の明確な理解のために例示的に記載した
が、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。

下記の微生物がATCCに寄託されている。

サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae）E11−3C ATCC−20727（1984年10月３日寄託）； エシェリシヤ・コリ（Escherichia coli）K12XBハイブ
リド,pCPOT/HB101 ATCC−39685（1984年５月９日寄
託）； サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae）Xb13 5B/pKP35 ATCC−20862（1987年８月11日寄
託） サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae）Kb13−5B/pB170m ATCC−20863（1987年８月11日
寄託） エシェリシヤ・コリ（Escherichia coli）RR1,pM220 A
TCC−39853（1984年９月12日寄託）。

【図面の簡単な説明】

第1A図は、SSVのプロウイルス・ゲノムの模式的制限マ
ップである。 第1B図は、ヌクレオチド配列と、SSVゲノムのｖ−sis領
域によってコードされる予想アミノ配列を示す。 第２図は、MFα１プロモーターおよびｖ−sis遺伝子の
上流の分泌シグナル配列を有するプラスミドの造成を示
す。 第３図は、プラスミドp192の造成を示す。 第４図は、アミノ末端66v−sisコドンのオリゴヌクレオ
チド指令欠失変異誘発を示す。 第５図は、p270の造成を示す。 第６図は、TP11ターミネーターの上流へのｖ−sis発現
ユニットの挿入を示す。 第７図は、プラスミドpTVS2αＴの造成を示す。 第８図は、Ｂ鎖発現ユニットVSBの造成と、pMPOT2ベク
ターへのその導入を示す。 第９図は、PDGFの熟成Ａ−鎖およびＢ−鎖のアミノ酸配
列を示す。 第10図は、真正のPDGFと比較した、プラスミドpVSBm又
はpMPOT2を有する酵母形質転換体からの培養液濃縮物に
よるPDGFリセプター結合の投与量応答曲線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｈ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） 審査前置に係属中

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】血小板由来生長因子（PDGF）のＡ−鎖又は
   その修飾されたＡ−鎖の生物学的に活性なホモダイマー
   を含んで成る細胞増殖刺激剤であって、前記Ａ−鎖が次
   のアミノ酸配列（Ｉ）： を有し、前記修飾されたＡ−鎖が、前記アミノ酸配列
   （Ｉ）においてＮ−末端の１〜22アミノ酸残基の少なく
   とも１個及び／又はＣ−末端の１〜９アミノ酸残基の少
   なくとも１個が除去されており、そして／又はアミノ酸
   位置10位、37位、46位、47位及び93位のシステイン残基
   の少なくとも１個が他のアミノ酸残基により置換されて
   いるアミノ酸配列を有することを特徴とする、細胞増殖
   刺激剤。
2. 【請求項２】PDGFのＡ−鎖の生物学的に活性なホモダイ
   マーを含んで成る、請求項１に記載の細胞増殖刺激剤。