JPH085908B2 - アルキニルアミノヌクレオチド及びその製造方法 - Google Patents

アルキニルアミノヌクレオチド及びその製造方法

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JPH085908B2 JP62166224A JP16622487A JPH085908B2 JP H085908 B2 JPH085908 B2 JP H085908B2 JP 62166224 A JP62166224 A JP 62166224A JP 16622487 A JP16622487 A JP 16622487A JP H085908 B2 JPH085908 B2 JP H085908B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アルキニルアミノヌクレオチドに係り、特
には、蛍光をベースとするDNA塩基配列決定法のための
連鎖停止基質（chain terminating substrate）として
蛍光標識されたヌクレオチドを調製するために有用なア
ルキニルアミノヌクレオチドに関する。
DNA塩基配列決定法は近代分子生物学の基礎的な分析
技術の一つである。
塩基配列決定のための信頼できる手法の開発が遺伝子
的情報の機構を理解するのに大幅に役立っており、これ
がまた遺伝子物質の取扱い（即ち遺伝子工学）を可能に
している。
現在、DNA塩基配列決定法には二つの一般的手法があ
る：一つはマクサム−ギルバート（Maxam-Gilbert）の
化学分解法（A.M.マキサム他によるMeth.in Enzym.-198
0年刊の65巻の499〜559頁）であり、もう一つはサンガ
ー（Sanger）のジデオキシ連鎖停止法（F.サンガー他の
米国学術会議−1977年刊の74巻の5463〜5467頁）であ
る。
これら二つの手法の共通点は、一組のDNA断片を作
り、これを電気泳動で分析することである。但しこれら
の断片作成の手法は異っている。
マキサム−ギルバート法では、DNA断片は、塩基配列
決定されるべきDNA片の塩基特異的化学開裂によって作
られる。塩基配列決定されるべきDNA片は先ず５′−末
端を32Pで標識され、次に、４つの部分に分けられる。
各部分は一連の異なった化学的処理をうけ、所定の塩基
（または諸塩基）に隣接した位置でDNAを開裂するよう
にする。この結果、標識された全ての小片は当初のDNA
片と同じ５′−末端と、開裂の位置で決る３′−末端を
もつことになる。この処理はゲル電気泳動による分離に
好都合な長さのDNA片を生成する条件の下で行われる。
サンガー法の場合、DNA片の作成は塩基配列決定され
るべきDNA片の部分的な酵素複製（即ち合成）による。
最も一般的な方法によれば、塩基配列決定されるべきDN
A片は、標準的な方法により、バクテリオファージM13の
ような大環状一本鎖DNA片である「配列決定ベクター（s
equencing vector）」に挿入される。これが複製過程の
鋳型になる。この挿入物のすぐ上流にある鋳型の領域に
対して相補的な配列を持つDNAの短片が合成用のプライ
マーとして役立つべく鋳型にアニールされる。４つの天
然のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（dNT
P）の存在下で、DNAポリメラーゼがプライマーを３′−
末端から伸長させて、挿入物の領域において鋳型の相補
的複製を生成させる。配列決定断片の完全な組を生成す
るために、それぞれが各塩基について１つの単一ジデオ
キシリボヌクレオシドトリホスフェート（ddNTP）とと
もに４つのdNTPを含有する４つの反応体を平行に作用さ
せる（32P標識dNTPが添加され標識断片を与える）。１
つのdNTPがポリメラーゼに組み込まれている場合、連鎖
伸長が続行し得る。対応するddNTPが選択される場合
は、連鎖は停止。dNTPに対するddNTPの比率は適切な長
さのDNA断片を作るように調整される。このようにし
て、４つの反応混合物各々が３′−末端とプライマーが
決める５′−末端に同じジデスオキシヌクレオシド残基
をもった断片の分布を含むことになる。
「ターミネーター」、「連鎖ターミネーター」及び
「連鎖停止基質」という用語は、本明細書を通して、鋳
型の指示した方法に従い核酸を複製する酵素によってDN
AまたはRNAの３′−末端に組み込まれ得るが、一旦、組
み込まれるとその後は連鎖伸長を妨げるところの基質を
示すために互換的に用いられている。対照的に、天然の
デオキシヌクレオシド基質は「連鎖伸長基質」と考える
ことができる。
「ヌクレオシド」という用語は、本明細書を通して、
ピリミジンあるいはプリン（あるいはその誘導体）１分
子と、１個のリボース糖（あるいはその誘導体又は機能
上の等価物）１分子とからなる複素環状塩基糖単位を意
味するのに用いられている。「ヌクレオチド」という用
語はヌクレオシドあるいはそのホスホリル化誘導体を意
味する。
サンガー法およびマキサム−ギルバート法の双方にお
いて、一般に物理的方法では直接決定できない塩基配列
情報が、決定可能な鎖長情報へと変換されている。この
決定は電気泳動分離によって達成できる。変性条件（高
温、尿素の存在等）の下では、短いDNA断片はあたかも
固い棒のように移動する。ゲルマトリックスが電気泳動
に使われる場合は、このDNA断片は大きさ別に分けられ
る。配列決定に必要な単一塩基分解は、通常、数百個ま
での塩基をもつDNA断片について得ることができる。
完全な配列を決定するために、マキサム−ギルバート
法あるいはサンガー法により作られた４組の断片が４本
の平行なレーンで電気泳動に供される。この結果、断片
はゲルの長さに沿って空間的に分解される。標識断片の
パターンは典型的にはオートラジオグラフィーにより感
光フィルムに転写される（即ち、ある一定時間ゲルとフ
ィルムとをはさみこむことにより露出が得られる）。現
像されたフィルムには、４本のレーンに配分された連続
したバンドが見られるので、これを配列決定ハシゴと呼
ぶことが多い。このハシゴは目視でフィルムを走査し
（短く、より速く動く断片から始める）、そしてハシゴ
上の各段のために次のバンドが現われているレーンを決
定することで読み取れる。各レーンは所定の塩基（又は
マキサム−ギルバート法の場合は塩基の組合わせ）と結
びついているのでレーン割当ての線状進行が直接、塩基
配列に翻訳される。
DNA塩基配列決定のためのサンガー法及びマキサム−
ギルバート法は考え方としてはエレガントであり、効果
的であるが、作業上は困難かつ時間のかかるものであ
る。これらの技術を分析すると、問題の多くが単一の放
射性同位元素レポーターの使用から生じていることがわ
かる。〔レポーターは、適切な物理的あるいは化学的な
検出システム又は手法によって容易に測定または検出が
可能な物理的あるいは化学的特性をもった化学的基と定
義づけることができる。検出の簡便性は色の変化、発
光、蛍光あるいは放射能の如き特性によって得られるも
のであり、あるいは又、在来型（例えば、色彩計、分光
光度計、蛍光計あるいは放射性の）検出手続で検出でき
る基を含む特異的リガンド−リガンド複合体を形成する
べく、リガンド認識部位として作用するレポーターの能
力によっても提供される。リガンド−リガンド複合体は
蛋白質−リガンド、酵素−基質、抗体−抗原、炭化水素
−レクチン、蛋白質−助因子、蛋白質−イフェクター、
核酸−核酸又は核酸−リガンド複合体の形態をとること
が可能である。〕 高度な特異活性に32Pのような短命の放射性同位元素
を使用することは労働環境上および健康安全上の双方の
見地から問題がある。32Pの半減期が短いので、予め数
日前に試薬の必要性を予期し、そしてこの試薬を迅速に
使用しなければならない。32P標識DNA配列決定断片が一
旦作られたら、それらは自壊を起こし易いので、直ちに
電気泳動分析に供しなければならない。単一塩基分離に
要求される大きな電気泳動ゲルは大量の汚染緩衝物質を
もたらすので、汚染物処理問題が生じる。ゲル内の標識
DNA断片を視角化するのに必要なオートラジオグラフィ
ーはゆっくりしたプロセス（一夜越しの露出が普通）を
たどり、全体の作業にかなりの時間を付加する。その
上、強力な放射性同位元素の使用に関連した健康上の危
険が存在し得る。
４つの塩基の位置分析を行うための単一レポーターの
使用は、プロセス全体において著しい作業的複雑性をも
たらしている。薬品／酵素の段階は別個の容器で行わね
ばならず、電気泳動分析も４本の平行レーンで行わねば
ならない。移動性に生じた熱による歪みは標識DNA断片
の像をゆがんだものにし（例えば、微笑効果）、その結
果、４つのレーンの比較を困難なものにする。これらの
歪みが原因で単一のゲル上で読みとれる塩基の数がしば
しば制限される。
４つの平行レーンを使用することが必要性であるとと
もにオートラジオグラフィーには長い時間がかかるの
で、視覚化の為にスナップ写真方式を取らざるを得な
い。多数のバンドを同時に空間分解する必要があるの
で、非常に大きなゲルが使用されなければならない。こ
れが更に問題をもたらす。即ち大きなゲルは取扱い難
く、動きが鈍く、このため全体の処理に更に時間がかか
ることになる。
最後に、取扱説明書の解釈問題がある。配列決定ハシ
ゴを塩基配列に変換するには、高度に熟練した科学者の
全面的な注意を必要とする時間集中的且つエラーが起こ
り易いプロセスなのである。この読みとりを自動化しよ
うとした数多くの試みが行われてきたし、いくつかの機
械的な補助装置もあるにはあるが、配列決定ゲルの解釈
プロセスでも苦労がありかつ時間のかかるものである。
こういう問題を取扱う為に、32Pオートラジオグラフ
ィーを代替方式すなわち、非放射性同位元素のレポータ
ー／検出システムが検討されてきた。そのような検出シ
ステムは、32Pに匹敵する感度を達成するのに極度に敏
感でなければならない。即ち、配列決定ゲル上の各バン
ドが10-16モルのオーダーのDNAを含有することである。
このレベルの感度に到達できる検出方法の１つは蛍光で
ある。DNA断片は１つないしはそれ以上の蛍光標識（蛍
光色素）をつけることができる。適当な光源による励起
により、標識からの特徴ある発光が得られ、こうしてバ
ンドを同定することができる。
放射性同位元素標識の代わりに蛍光標識を使用する
と、検出システムをこのような特定方法に合わせるのが
より簡単になる。例えば、いくつかの発光特性（例え
ば、スペクトル分布、寿命、偏光）に基づく区別しやす
い４つの異なる蛍光標識の使用により、所定の塩基に関
連する配列決定断片に所定の標識を独特に結合すること
ができる。この結合を行えば、これら断片は単一のレー
ンで合体したり、分割したりすることができ、この塩基
の割当は選択された発光特性にもとづいて直接行うこと
ができる。
これまでは、蛍光を基にしたDNA塩基配列決定システ
ムを開発しようとする２つの試みが記述された。最初の
システムはカリフォルニア工科大学で開発され、K.M.ス
ミスにより1984年西独特許出願DE3446635A1;L.E.フード
他により1985年西独特許出願DE3501306A1;L.M.スミス他
により「核酸研究」（1985年）13巻2399〜2412頁及びL.
M.スミス他により（1986年）「ネイチャー」321巻674〜
679頁に発表された。このシステムは考え方として前記
の問題を取扱っているが、実施の明細には、部分的にの
み成功したスミスのアプローチが記載されている。例え
ば、このシステムに使われている蛍光標識DNA塩基配列
決定断片の最大発光の大きな波長域が４つのすべての色
素を単一の白黒源で有効に励起させることを困難なもの
にしている。更に重要なことは、異なった総電荷をもつ
色素から起こる電気泳動運動の著しい異なった摂動変化
のため、このシステムに使用される色素の組による単一
レーンの配列決定を遂行することが困難又は不可能にな
っている。これらの困難性はスミス他によって明白に指
摘されている。
一般に、蛍光標識配列決定断片をつくるために使用さ
れる方法論には困難がつきまとう。マキサム−ギルバー
ト法の配列決定法では、５′−標識オリゴヌクレオチド
が制限開裂で作られる「粘着性末端をもつ」２本鎖DNA
断片に酵素的に結さつされる。これは、この形態で作ら
れる断片の配列決定に制限することになる。サンガーの
配列決定法においては、５′−標識オリゴヌクレオチド
がプライマーとして使用される。４つの特別のプライマ
ーが必要となる。１つの新しいベクター系を使用するに
は４つの新しい色素標識プライマーを合成し精製する複
雑なプロセスを経なければならない。特別なプライマー
が必要なときはいつでも同じ問題が生じる。
標識プライマーの使用は他の面からも不利を伴う。重
合反応はやはり別個の容器で進められねばならない。マ
キサム−ギルバートとサンガーの塩基配列決定システム
におけると同様、標識プライマーから誘導される実効的
にすべての断片は蛍光標識されるであろう。このよう
に、結果としての配列決定パターンは共通のアーチファ
クト（例えば、偽又は影のバンド、パイルアップ）のほ
とんどを維持し、連鎖ターミネーターの組込み以外のプ
ロセスで酵素的連鎖伸長が中断される時にこれが起る。
第２のアプローチにおいては、W.アンソーグ（Ansorg
e）他（J.Biochem.Biophys.Methods,vol.13.315-323（1
986年）は非放射性アイソトープによるDNA塩基配列決定
技術を明らかにしており、それによれば、単一の５′−
テトラメチルローダミン蛍光標識が17塩基オリゴヌクレ
オチドプライマーの５′−末端に共有結合されるのであ
る。このプライマーは酵素で複製される異なる長さの一
連のDNA断片を作り出すために標準ジデオキシヌクレオ
チド配列決定化学手法を通じて、酵素的に４つの容器中
で連鎖伸長される。４つの容器それぞれが、４つのゲル
レーンにおける従来の電気泳動分離からの末端塩基の割
当を可能にする４つのDNA塩基の１つに対応するジデオ
キシヌクレオチド連鎖ターミネーターを含んでいる。こ
の５′−テトラメチルローダミン蛍光標識は全ゲル幅を
通過するアルゴンイオンレザービームによって励起され
る。このシステムは放射能レポーターの代わりに蛍光レ
ポーターを使用するという利点があるが、従来の配列決
定および標識プライマーの調製にかかわる不利点の全て
がそのまま存在する。
これまでのところ、蛍光検出の利点とターミネーター
標識の利点とを組合せたDNA塩基配列決定システムを作
った人はいない。もし適切な蛍光標識連鎖ターミネータ
ーが作り出されれば、標識配列決定断片は標識連鎖ター
ミネーターが酵素により配列決定断片中に組込まれる時
に限り、生成されることになろう。この場合、他の標識
方法に付随する多くのアーチファクトは除去される。も
しDNA塩基配列決定に要する４つの連鎖ターミネーター
のそれぞれが仮にそれぞれ異なる区別できる蛍光レポー
ターに共有結合しているとすれば、原則的に、単一のプ
ライマー伸長反応を通じ４つのターミネーター全てを組
込むこと、次いでその結果できる配列決定断片を単一の
ゲルレーン中で分析することが可能になるはずである。
このような蛍光標識ターミネーターが作り出されるとす
れば、これら化合物は多分、他のタイプの核酸の酵素標
識にとっても有用であろう。特に、蛍光標識連鎖ターミ
ネーターの類似体は他の非蛍光レポーターを用いるため
に設計されうる。又それらは鋳型で決められる形態（例
えば、逆転写酵素、RNAポリトラーゼ又はDNAポリメラー
ゼ）において核酸と複製する酵素のための鎖増伸長基質
としても利用することもできる。レポーターをDNA中に
配列決定に有利な形で導入することは核酸標識化の問題
中最大の難関である。DNA塩基配列決定のために開発さ
れた化合物ないし戦略は又多くの他の標識問題にも適用
できそうである。
蛍光を使うDNA配列のための連鎖停止基質として役に
立つためには、その基質に蛍光標識が含まれていなけれ
ばならないと共に、DNA塩基配列決定に有益な酵素によ
って受容されるものでなければならない。このような基
質として適当と考えられるものは、天然のヌクレオチド
の誘導体又は類似体である。蛍光標識とヌクレオチドと
が同時に１つの複製酵素の活性部位中にフィットしない
であろうと予想されるため、適切に設計された基質には
蛍光標識をこの酵素の活性部位から引離して位置付ける
に十分な長さと適当な形状を持つ結合基によってヌクレ
オチドから分離された蛍光標識が含まれなければならな
い。結合基の種類は使われる標識と酵素とによって変わ
る。しかし合成の便宜上、又標識ないし酵素条件の変化
に対する適応性という観点から、この結合基をヌクレオ
チドと蛍光標識とに結合させたリンカーから成るものと
考えるのがもっとも好都合である。
DNA塩基配列決定のための蛍光標識直鎖ターミネータ
ーを設計するには、リンカーはいくつかの条件を満足し
なければならない： １）同じあるいは機能上同等のリンカーをDNA中に見
出される４つの塩基すべてに結びつけることができなけ
ればならない。
２）リンカーは、標識ヌクレオチドがDNA塩基配列決
定に有用な酵素のための連鎖停止基質として有効に使わ
れるのを妨げてはならない。
３）リンカー（それと任意的なスペーサーおよび標
識）はそれが結合している塩基に対してとは独立の仕方
で結合（リンカーが）しているオリゴヌクレオチドの電
気泳動を妨げなければならない。
４）塩基およびスペーサー又は標識へのリンカーの結
合は単一の、よく明確化されたヌクレオチド基質を生み
出すため立体選択的または位置選択的でなければならな
い。
５）最後に、リンカーは標識との結合のため１級また
は２級アミンを含んでいることが望ましい。
標識をヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（下を
参照）に結合させるのに５つの異るタイプのアミンリン
カーが開示されているにもかかわらず、その内いずれの
リンカーもDNA塩基配列決定にとっても有用な連鎖停止
基質に使われる上記の５つの条件をすべて満足するもの
ではない。
バーグストローム他（J.AM.Chem.Soc.,vol.99,1587
（1976））はアルケン−アミノとアクリレート側鎖を５
−マーキュリオーウリジンのオレフィンへのPd（II）接
触媒結合によりヌクレオチドに結合させる方法を開示し
ている。ルース（PCT/US84/00279）は上記の側鎖をリン
カーとして用いて、レポーターを触媒によらずに合成し
たオリゴヌクレオチドと結合させた。ランガー他（Pro
c.Nat.Acad.Sci.,USA,vol.78,6633（1981））はレポー
ターをヌクレオチドに結合させるのにアリルアミノリン
カーを用いる方法を開示している。これらリンカーの不
利な点は位置選択的に適当な水銀性ヌクレオチド前駆体
を作ることの困難さ、これらヌクレオチド／オレフィン
連結反応のいずれかによる生成物の混合物を分離するこ
との難しさ、それとビニルで置換されたヌクレオシドの
潜在的不安定さにある。クレヴァン他（WO86/02929）は
リンカーをシチジンのN4位置、またアデノジンのN6位置
に結合する方法を開示している。この方法の不利な点
は、ウリジンとグアノシンにこれと同様なリンカーを結
合する部位がないということである。
上記の５つの要件を満すかも知れない他のリンカーと
しては、一つはアルキニルアミノリンカーが考えられ
る。ここでは三重結合の一端がヌクレオシドに、また他
端が１級または２級アミンを含む基に結合している。化
学的安定を達成するには、アミンを三重結合に直接結合
させるべきではない。アルキン基をヌクレオシドに結合
させるいくつかの方法が開示されている（以下を参
照）。
バー他（J.Chem.Soc.,Perkins Trans.1,1263-1267（1
978））は５−エチニルウリジン、２′−デオキシ−５
−エチニルウリジン、５−エチニルシトシン、５−エチ
ニルシチジン、２′−デオキシ−５−エチニルシトシ
ン、および２′−デオキシリボヌクレオシドのα−アノ
マーの合成を開示している。２′−デオキシリボヌクレ
オシドは、複素環化合物を構築し、官能化された２−デ
オキシ糖（sugar）と連結させ、アノマー混合物を分離
し、及び糖上の保護基を除去することによって調製され
た。
バーグストローム他（J.Am.Chem.Soc.,vol.100,8106
（1978））はアルケンとウラシルヌクレオシドの５−マ
ーキュリ誘導体または５−ヨード誘導体とのパラジウム
触媒による結合を開示している。この方法はアルキンを
同じようにウラシルヌクレオシド誘導体と反応させるこ
とには失敗したと報告されている。
ヴィンセント他（テトラヘドロン・レターズ,Vol.22,
945-947（1981））は、Ｏ−３′,5′−ビス（トリメチ
ルシリル）デオキシウリジンとアルキニル亜鉛反応剤と
を、パラジウムまたはニッケル触媒〔ジクロロ−ビス
（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（II）、ジク
ロロ−ビス（ベンゾニトリル）パラジウム（II）または
ジクロロ（エチレン−（ビス（ジフェニルホスフィ
ン））ニッケル（II）〕の存在下で反応させることによ
る５−アルキニル−２′−デオキシンウリジンの合成を
開示している。
ロビンス他（J.Org.Chem.Vol.48,1854-1862（198
3））は、末端アルキンHC≡CR（Ｒ＝Ｈ、アルキル、フ
ェニール、トリアルキルシリル、ヒドロキシアルキルま
たは保護されたヒドロキシアルキル）を、ビス（トリフ
ェニルホスフィン）−パラジウム（II）クロライドおよ
びヨウ化銅（Ｉ）の存在下、温かいトリエチルアミン中
で、５−ヨード−１−メチルウラシルと５−ヨードウラ
シルヌクレオシド（それらのｐ−トルイルエステルとし
て保護されている）とに連結させる方法を開示してい
る。３′−５′−ジ−Ｏ−アセチル−５−ヨード−２′
−デオキシウリジンをヘキシン、４−（ｐ−トルイルオ
キシ）ブチン、４−（テトラヒドロピラニルオキシ）ま
たは４−（トリチルオキシ）ブチンと反応させたとき、
主な生成物は所望のアルキニルウリジンよりもむしろ、
環化したフラノ〔2,3−ｄ〕ピリミジン−２−オン類で
あった。
上記文献はいずれもアルキニルアミノリンカーをヌク
レオシドに結合させる方法は開示していない。バーグス
トロームの方法は失敗し、バー（Barr）のそれは直接に
は適用できない。ロビンス他およびヴィンセント他の用
いた触媒はアルキンが一つのアミノ基を含む場合に幾多
の望ましからざる副反応を引き起こすものである（例え
ば環化またはアミンのアルキンへの分子間求核付加）。
結合反応が報告されているのは、電子欠乏ウラシル塩基
を含むヨードヌクレオシドについてのみである。Pdを触
媒とする結合反応が一般に電子欠乏アリールヨウ化物と
もっともよく進行するのであるから、アルキン類を他の
３つの塩基（いずれもウラシルより電子を多く含む）の
内、１つに連結しようとすることには問題が予期され
る。
したがって、アルキニルアミノヌクレオチドおよびそ
の製造方法についての要求がなお存在するのである。
本発明の化合物は次の構造をもつアルキニルアミノ−
ヌクレオチドである。
Nuc−Ｃ≡Ｃ−R1−NR2R3 （Ｉ） ここでR1は１〜20原子をもつ置換された、または置換
されていないジラジカル基である。R1は直鎖アルキレン
C1〜C20でありえ、この鎖中に二重結合、三重結合、ア
リール基またはＮ、ＯないしＳのようなヘテロ原子を場
合に応じて含むことができる。ヘテロ原子はエーテル、
チオエーテル、エステル、アミンまたはアミドなどのよ
うな官能基の部分をなし得る。R1は直鎖アルキレンC1〜
C10であることが望ましい。より望ましいR1は−CH2−で
ある。R1上の置換基にはC1〜C6アルキル、アリール、エ
ステル、エーテル、アミン、アミドまたはクロロ基があ
る。
R2とR3はそれぞれ独立にH,C1〜C4アルキル、またはア
シル、アルコキシカルボニルもしくはスルホニルのよう
な保護基である。好ましくは、R2がＨ、R3がＨまたはト
リフルオロアセチルであるのがよい。
Nuc（ヌクレオチド）は以下のR4−Het（複素環塩基）
である： ＺはＨまたはNH2であり、 R4は糖（sugar）または糖状基： である。R5はＨ、PO3H2、P2O6H3、P3O9H4またはその塩
であり、R7＝R8＝Ｈであれば、R6＝Ｈ、OH、Ｆ、N3また
はNH2である。あるいはR7＝Ｈで、さらにR8＝OHの時
は、R6＝ＨまたはOHであり、またはR7＝OHでR8＝Ｈの時
はR6＝OHである。
本発明の標識アルキニルアミノ−ヌクレオチドは構造
ＩであってR3がレポーター（標識）であるものである。
塩基特異的にDNA塩基配列決定断片中にレポーターを
組み込むために用いられる戦略は、すべてのDNA塩基配
列決定システムのもつ臨界的特長である。本発明による
アルキニルアミノ−ヌクレオチドの使用により、レポー
ター（標識）をアルキニルアミノヌクレオチド連鎖ター
ミネーターに結合することで、サンガーの方法を大幅に
改善することができる。レポーターは非常なバラエティ
ーに富む簡単に入手、検出できる基（標識）から選ぶこ
とができるのであるが、便宜上、蛍光レポーターを使う
好ましいアプローチ方法を以下に説明する。
このアプローチは多くの実用上の利点をもたらす。一
番重要な点は、ターミネーターの標識化により結合レポ
ーターを堅固に塩基特異的停止イベントと結びつけるこ
とができることである。真の（bona fide）停止イベン
トからもたらされるDNA塩基配列決定（シーケンシン
グ）断片だけがレポーターを担う。これは従来の塩基配
列決定にみられる多くのアーチファクトを排除する。さ
らにこのアプローチでは、いかなる特別のプライマーも
介入してこないため、配列決定（シーケンシング）ベク
ターの選択に完全な柔軟性をもたせることができる。レ
ポーターが、単一の反応で選択的に導入し得る４つの低
分子量反応剤に担持されるので、自動化が容易になる。
操作上なんら本質的に不利な点はない。このアプロー
チに伴う問題はその設計段階で遭遇するものである。一
般的にDNA塩基配列決定に用いる酵素は基質に対し高度
に選択的であり、また配列決定（シーケンシング）酵素
にとって効果的な連鎖停止基質である共有結合レポータ
ーによってヌクレオシドトリホスフェートを作ることが
できるはずだと軽々しく期待する理由はどこにもない。
レポーターの基質への結合が基質の立体的および電子的
性質を大幅に変えてしまってこの基質を酵素の受入れら
れないものにするか、あるいは受け入れられるとしても
DNA鎖に組み込まれることはないということが考えられ
るかも知れない。しかしながら、本発明のアルキニルア
ミノリンカーは小サイズであること、またピリミジンヌ
クレオチドの５−位へこのリンカーが結合されうるこ
と、さらにプリンヌクレオチドの７−位に結合されうる
こと、これらによって基質の組み込みの度合または信頼
性をあまり阻害することのない標識連鎖停止基質が提供
できることがわかった。
本発明のアルキニルアミノヌクレオチドは、蛍光標識
アルキニルアミノヌクレオチド連鎖ターミネーターの記
述を通じて明らかになるであろう。蛍光を標識とするア
ルキニルアミノヌクレオチドの構造概要およびその原理
を説明するには、標識構造を次の５つの構成部分に分解
すると都合がよい： （ｉ）トリホスフェート部位、R5 （ii）「糖」、R4 （iii）複素環塩基（Het） （iv）リンカー（−Ｃ≡CR1−NR2−） （ｖ）蛍光標識、R3 （ｉ）トリホスフェート部位（R5） トリホスフェート部位またはそれに近い類似体（例え
ば、α−チオトリホスフェート）はいかなる酵素基質に
とっても恩恵的な機能（官能）基である。この官能基は
基質に大きな結合エネルギーを与え、酵素−基質反応の
現実の場を提供する。
（ii）糖（R4） 「糖」部分は天然の酵素基質中にある２′−デオキシ
リボフラノースの構造断片に対応する。この分子部分は
酵素認識に役立ち、トリホスフェート部分と複素環塩基
との間の適切な空間関係を保持する上で必須のものであ
る。DNA塩基配列決定にとって有用であるためには、
「糖」がリボフラノースである場合には３′−α−位は
後に酵素によって使われることができるヒドロキシル基
を持っていてはならない。ヒドロキシル基は、存在しな
いこと、他の基により置換されること、あるいは使用不
可能の状態に変えてしまうこと、この３つの内、１つが
必要なのである。このような糖類は連鎖停止糖というこ
ととする。多くの修飾されたフラノース断片がこの要請
に応えることが知られている。これには次のものが含ま
れる。
２′,3′−ジオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル〔(a),
F.サンガー他,Proc.Nat.Acad.Sci.USA.Vol.74,5463-546
7（1977）〕、 β−Ｄ−アラビノフラシル〔(b),F.サンガー他,Proc.
Nat.Acad.Sci.USA.Vol.74,5463-5467（1977）〕、 ３′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル〔(c)，ク
レメント（Klement）他,Gene Analysis Technology,vo
l.3,59-66（1986）〕、 ３′−アミノ−２′,3′−ジデオキシ−β−Ｄ−リボ
フラノシル〔(d),Z.G.チドギーバズ（Chidgeavadze）
他,Nuc.Acids Res.,Vol.12,1671-1686（1984）〕、 ２′,3′−ジデオキシ−３′−フルオロ−β−Ｄ−リ
ボフラノシル〔(e),Z.G.チドギーバズ他,FEBS Lett.,Vo
l.183,275-278（1985）〕、および ２′,3′−ジデオキシ−２′,3′−ジデヒドロ−β−
Ｄ−リボフラノシル〔(f)アトキンソン（Atokinson）
他,Biochem.,vol.8,4897-4904（1960）〕。
いわゆる糖が非環状基（例えば２−オキシエトキシメ
チル・(g)〕である非環状ヌクレオシドトリホスフェー
ト（AcyNTP）はまたサンガーの方法によるDNA塩基配列
決定における連鎖ターミネーターとして使うこともでき
る。AcyNTPを連鎖停止基質として使用することは、従来
のサンガー法の塩基配列決定（32Pレポーター）におい
てAcyNTPをもってddNTPに置換えることによって立証さ
れた。AcyNTPにより生成した配列決定ハシゴは、ddNTP
により生成したそれと本質的に同じであったが、同様な
DNA断片分布を得るために、AcyNTPの濃度を高くする
（約10倍）ことが必要であった。
AcyNTPは、DNAポリメラーゼＩ（クレノー（Klenow）
断片およびAMV逆転写酵素の双方について有効である。
従って、AcyNTPのアルキニルアミノ誘導体もやはり連鎖
停止基質として働くことが予期されるのである。
AcyNTPにはddNTPよりさらに容易に合成できるという
利点がある。ddNTPの合成は従来の塩基配列決定では大
きな問題ではないが、構造的に複雑な蛍光標識連鎖ター
ミネーターを作るときには意味を持つようになる。２−
オキシエトキシメチル基を糖として使うと反応剤合成は
大いに簡単になり、しかも受け入れられる性能は維持さ
れる。
医薬研究によってDNA塩基配列決定にとって役立つ他
の糖修飾が見い出されている。たとえば、３′−アジド
−２′,3′−ジデオキシチミジン「AZT:ミツヤ他,Proc.
Nat.Acad.Sci.USA,vol.82,7096-7100（1985）〕と９−
〔２′−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エト
キシメチル〕グアニン〔DHPG;アストン他、Biochem.Bio
phys.Res.Comm.,Vol.108,1716-1721（1982）〕は、DNA
複製の連鎖停止を生じさせるトリホスフェートに転換す
ることによって作用することが想定される２つの抗ウイ
ルス剤である。
（iii）複素環塩基（Het） 複素環塩基は核酸中で臨界的な認識要素として機能
し、特定の空間配向で水素結合アクセプターおよびドナ
ーとして作用する。複素環塩基は正確な塩基配列決定に
必要な高い忠実性をもった組込みについて必須のもので
ある。またこの構造部分はリンカーの結合部位でもあ
る。
好ましい複素環塩基としては、ウラシル(h)、シトシ
ン(i)、７−デアザアデニン(j)、７−デアザグアニン
(k)、７−デアザヒポキサンチン(l)を挙げることができ
る。天然でない７−デアザプリンは、塩基部分に総電荷
（net charge）を加えることなく、したがってグリコシ
ド結合を不安定化させながらリンカーを結合させるため
に使うことができる。さらに水素結合ドナーおよびアク
セプターとして機能的に同等な他の複素環塩基も使え
る。例えば、８−アザ−７−デアザプリンと3,7−ジデ
アザアデニンは７−デアザプリンの代わりに、また６−
アザピリミジンはピリミジンの代わりに使用できる。
（命名を簡単化するため、複素環塩基は全体を通して７
−デアザプリンとして命名し、番号を振った。） （iv）リンカー リンカーは三重結合の１つの末端が１乃至20原子の置
換もしくは非置換ジラジカル基R1を介しアミンに結合し
ているアルキニルアミノ基である。三重結合の他の末端
はピリミジンについては５−位で、または７−デアザプ
リンについては７−位（プリン番号）で複素環塩基に共
有結合している。アルキニルアミノ基のアミン窒素は、
蛍光標識上の反応性官能基（例えばカルボニル）と結合
する。リンカーはDNAポリメラーゼへの結合あるいはDNA
ポリメラーゼによる組み込みを著しく妨害してはならな
い。ジラジカル基は直鎖アルキレン（C1〜C20）であ
り、場合により鎖二重結合の中に三重結合、アリール
基、又はN,O,Sのようなヘテロ原子を有する。ヘテロ原
子はエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、アミ
ドのような官能性基の一部となりうる。ジラジカル基上
の置換基はC1〜C6アルキル、アリール、エステル、エー
テル、アミン、アミド、またはクロロ基を含む。ジラジ
カル基は、C1〜C10の直鎖アルキレンであることが好ま
しく、ジラジカルが−CH2−であることが最も好まし
い。
（ｖ）蛍光標識（R3） 蛍光標識は、アルゴンイオンレーザのような適切な供
給源からのエネルギー吸収による刺激に引き続いて、検
知可能な発光放射を生じる。塩基配列決定に遭遇するDN
A塩基それぞれが独特で区別可能な蛍光レポーターを有
することが望ましい。
標識を付けられた連鎖ターミネーターに基づくDNA塩
基配列決定法において蛍光標識に使用できるレポーター
のファミリーは既知の色素９−カルボキシエチル−６−
ヒドロキシ−３−オキソ−3H−キサンテンから得られる
〔S.ビッグス（Biggs）他,J.Chem.,Vol.123,2934-2943
（1923）〕。このキサンテン族は一般式１により示され
る。
（R9およびR10はＨ、低級アルキル、低級アルコキシ、
ハロおよびシアノを含む）。
DNA塩基配列決定に適した色素の好ましいものは、構
造１,a）R9＝R10＝H,abs.487nm,emis.505nm;b）R9＝H,R
10＝CH3,abs.494nm,emis.512nm;c）R9＝CH3，R10＝H,ab
s.501nm,emis.519nm;およびｄ）R9＝R10＝CH3,abs.508n
m,emis.526nmである。L.M.Smith,L.E.Hood et al.,L.M.
Smith et al.,およびW.Ansorge et al.によって示され
た計器はこれら色素のいずれか１つで標識を付けられた
塩基配列決定断片をDNA塩基配列決定に適した濃度で検
知することができる。しかしこれらの計器は上記４つの
色素のセットを識別することができない。色素を識別
し、DNA塩基配列を決定するためのこの情報を利用する
手段は引用によってここにその開示内容を含める同時出
願において明らかにされている（attorney docket no.1
p-597-A）。
この出願は、密接に関連するが区別可能なレポーター
からの放射エネルギーの存在を検出する手段を有するDN
A塩基配列決定のためのシステムを開示し、そのレポー
ターは修飾されたサンガーのDNA連鎖伸長方法において
連鎖停止ヌクレオチドとして作用する化合物に共有結合
している。区別可能な蛍光レポーターの１つはサンガー
のDNA塩基配列決定反応において代表となる４つのジデ
オキシヌクレオチド塩基すなわちアデニン、グアニン、
シトシン、チミンのジデオキシヌクレオチドのそれぞれ
に結合している。これらのレポーター標識連鎖停止剤
は、伝統的なサンガー法において標識されていない連鎖
ターミネーターの代りに使用され、対応するデオキシヌ
クレオチド、適切なプライマー、鋳型、ポリメラーゼと
の反応において結合される。その結果得られる混合物
は、種々の長さのDNA断片を含み、これらDNA断片は４つ
のDNA塩基各々に対応する特有の標識を持つ連鎖ターミ
ネーターで３′末端上で終わる１つの塩基によって互い
に異なる。この新しい標識方法は、伝統的なサンガー法
のデオキシヌクレオチドの１つに含まれる通例の放射性
標識を排除することができる。
これらレポーター標識の検出は２つの定置の光電子増
倍管（RMT）を用いて行なうことができ、この光電子増
倍管はDNA断片上で連鎖ターミネーターに結合したレー
ザ刺激レポーターからの近接間隔の蛍光発光を受ける。
これらの断片は空間および／または時間において、PMT
の感知領域に対して垂直な軸に沿って移動するために電
気泳動により分離されうる。蛍光発光は、まず、透過と
反射の両特性を有し、１つの特性（透過）を１つのPMT
に導き、別の特性（反射）を別のPMTに導くために設置
されているダイクロイックフィルタを通過する。このよ
うにして、一連の蛍光レポーターが近接間隔の発光を有
していても、所定の蛍光レポーターに特有の第３の信号
を発生するために比率化され得る各PMTにおいて異なる
デジタル信号が発生される。このシステムは、488nmの
ような単一レーザ線によって効果的に全て励起され、最
大値が通常わずか５ないし7nm互いに異なる近接間隔の
発光を有するレポーターを検出することができる。それ
故、対象となるDNA鎖における連続的な塩基の割当て
は、DNAにおける４つの塩基それぞれと対応する４つの
レポーター標識連鎖ターミネーターそれぞれについて誘
導される特有の比率に基づいておこなうことができる。
これらのキサンテン色素は反応性官能基を含むので、
上記の同時出願は、これらの色素をアルキニルアミノリ
ンカーのアミノ基に結合するために有用な試薬の設計お
よび製造方法をも開示するものである。Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル２（R9およびR10が構造１とし
て定義されている）は、このような試薬の好ましい例で
ある。エステル２の製造の間、サルコシン基がベースの
色素構造に副反応を最少限にするために付加される。上
記の同時出願において、この任意のサルコシン基は「ス
ペーサー」と記載されている。好ましい試薬だけがここ
では使用されるので、標識アルキニルアミノ連鎖ターミ
ネーターの蛍光部分はサルコシンスペーサーを含むとみ
なされる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド離脱基がリン
カーのアミノ基により置換された後、蛍光色素（部分構
造１）は、濃縮水酸化アンモニウム処理によって遊離さ
れる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、上に
述べたアルキニルアミノリンカーに存在するもののよう
な高い求核性を有するアミノ基と選択的に反応するアシ
ル化剤である。対照実験は、エステル２に類似したＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルがリンカーアミノ基
とよりも複素環塩基のアミノ基とより緩慢に反応するこ
とを示している。複素環アミノ基との反応が僅かに起こ
った場合、得られるアミドは色素を遊離させる水酸化ア
ンモニウム処理によって加水分解されることが分った。
それ故、蛍光色素のようないずれそのレポーターをリン
カーのアミノ基に、そのヌクレオチドを望ましくない形
態で変性することなく選択的結合するために、化合物２
のようなエステルを使用することが可能である。
本発明の蛍光標識アルキニルアミノヌクレオチド連鎖
ターミネーターは、AMV逆転写酵素を使用するDNA塩基配
列決定においても、同時出願IP-597-Aに開示されたアリ
ルアミノリンカーを含む対応する基質として作用する。
しかしながら、本発明の化合物は、アリルアミノリンカ
ーを含む対応する基質よりも合成が容易である。これ
は、アリルアミノリンカーがDNA塩基配列決定に必要な
種々の塩基上の予め選択された部分に結合され易いため
である。さらに、アルキニルアミノリンカーは、高収量
でヌクレオチドに結合され得る。最後に、複素環ととも
にアルキンを含むヌクレオチドは、アルケンを含む対応
するヌクレオチドよりも安定であると予測される。アル
キニルアミノヌクレオチドから得られる適切な蛍光標識
連鎖ターミネーターは、構造３によって示され、この構
造３において、Nuc、R1〜R4およびR6〜R8は上に定義さ
れている通りであり、R5＝HO9P3 -3であり、ただし、R8
がＨまたはOHのとき、R6はOHであってはならない。
スキーム１は、糖が2,3−ジデオキシリボフラノシル
基である、本発明のアルキニルアミノヌクレオチドの製
造方法を示している。これらの方法は本発明の全ての糖
に適合する。ヌクレオチドの糖を修飾するための既知の
方法と結び付けられた場合、これらの方法は2,3−ジデ
オキシリボフラノシル基が本発明の別の糖により取って
代わられたアルキニルアミノヌクレオチドを製造するた
めに使用され得る。
さまざまなルートが第１の鍵中間体ヨード（iodo）ヌ
クレオシド(4)を製造するために使用される。（数列に
おいて、対応するブロモヌクレオシドがヨードヌクレオ
シドの代わりに使用される。） ５−ヨード−２′,3′−ジデオキシウリジンは２′,
3′−ジデオキシウリジン〔ピッツァー（Pfitzer）他,
J.Org.Chem.Vol.60,554-557（1982）〕をIClで処理する
ことによって製造することができる〔ロビンズ他,Can.
J.Chem.,Vol.60,554-557（1982）〕。
５−ヨード−２′,3′−ジデオキシシチジンは２′,
3′−ジデオキシシチジン〔レイコ（Rayco）社）を対応
する５−マーキュリオヌクレオシド〔バーグストローム
他,J.Carbonhydrates.Nucleosides and Nucleotides Vo
l.4,257-269（1977）〕へ転化し、それからヨウ素で処
理することによって製造することができる。
７−デアザグアノシンおよび２′−デオキシ−７−デ
アザグアノシンを製造する方法は知られているが、７−
デアザグアニンに対する求電子的攻撃が７−および８−
位の双方で生じることが示されている〔シーラ（Seel
a）他,Chem.Ber.,Vol.111,2925-2930（1978）〕。しか
しながら、所望の７−ヨード−７−デアザプリンがＮ−
ヨードスクシンイミドによる６−メトキシ−２−チオメ
チル−７−デアザプリンの処理後、２−チオメチルおよ
び６−メトキシ置換基による置換によってスキーム２お
よび実施例３に示されているように得られることが見い
出された。７−デアザプリン環系の位置選択的なヨウ素
化にＮ−ヨードスクシンイミドを使用することは前例が
ない。
７−ヨード−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシンはツベルシジンの脱酸素、およびその後の水銀化
／ヨウ素化により製造できる（スキーム３）。脱酸素反
応は、スキーム３で示され実施例４に記述されたよう
に、２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンの改
良された合成法を提供するため、モファット（Moffat
t）他〔J.Am.Chem.Soc.,Vol.95,4016-4030（1972）〕お
よびロビンズ他〔テトラヘドロン・レターズ,Vol.25,36
7-340（1984）〕によって開示された手順から手順から
適合された。
７−ヨード−７−デアザアデノシンは、バーグストロ
ーム他のJ.Carbohydrates,Nucleosides and Nucleotide
s,Vol.5,285-296（1978）およびバーグストローム他の
J.Org.Chem.,Vol.46,1424（1981）で報告されたよう
に、ツベルシジン（７−デアザアデノシン）の位置選択
的な水銀化／ヨウ素化により製造できる。
７−ヨード−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシンへの代替ルートは、高価な醗酵生成物であるツベ
ルシジンを出発材料として使用しないで用いられ得る。
これらのルートはスキーム４および５に示され、実施例
５および６に記述されている。これらのルートの１つに
おいては、７−位にヨウ素を位置選択的に導入するとい
う問題はもう１つの従来にないヨウ素化によって解決さ
れた。この場合、一塩化ヨウ素による６−クロロ−７−
デアザプリン32の処理は７−ヨード位置異性体（regioi
somer）33のみを与えた。
Pd（II）/Cu（Ｉ）触媒を用いて保護５−ヨードウラ
シルヌクレオシドに末端アルキンを結合するリングのた
めの方法はロビンズ他〔テトラヘドロン・レターズ,Vo
l.22,421-424（1981）〕により報告されたが、この方法
はアルキニルアミン（例えば、プロパギルアミン）と非
保護５−ヨード−ピリミジンまたは７−ヨード−プリン
ヌクレオシド間の所望される結合をもたらさない。直接
結合においてアルキニルアミンを用いることができると
いうことは、後の蛍光標識の結合のためのアミン基を有
する化合物を直接提供するためには非常に望ましい。同
様に、非保護ヌクレオシドを用いる方法は、さもなけれ
ば不必要な一連の保護／脱保護反応を排除することによ
って、所望の化合物へのより直接的なルートを提供する
ため求められた。
以下に記述される条件下で、アルキニルアミンはPd
（０）/Cu（Ｉ）触媒を用いて優れた収率で種々のハロ
ヌクレオシドに首尾良く結合された。この結合反応はま
た、アルキニルアミン窒素がアセチルおよびトリフロロ
アセチルなどのアシル基、９−フロレニルメチルオキシ
カルボニル基などのアルコキシカルボニル基、ｐ−トル
エンスルホニル基などのスルホニル基によって保護され
るときにも成功した。予期せざることに、アミノ基と三
重結合の間の炭素原子の数は以下に記述される手法では
重要ではないことがわかった。すなわち、３−アミノ−
１−プロピン（プロパギルアミン）、５−アミノ−１−
ペンチン、Ｎ−（２−プロピニル）トリフロロアセトア
ミド、Ｎ−（４−ペンチニル）トリフロロアセトアミ
ド、およびＮ−（11−ドデシニル）トリフロロアセトア
ミドは全て首尾よく結合反応に用いられた。
Pd（０）/Cu（Ｉ）を触媒とする結合反応の大きな成
果は、当該分野の観点では予期されないものである。例
えば、バーグストローム他〔J.Am.Chem.Soc.,Vol.100,8
106（1978）〕は、アルキンがPd触媒を用いてウラシル
ヌクレオシドの５−水銀または５−ヨード誘導体を結合
できなかったと述べている。また、ロビンズ他〔J.Org.
Chem.,Vol.48,1854-1862（1983）〕は、３′,5′−ジ−
Ｏ−アセチル−５−ヨード−２′−デオキシウリジンの
Pd（II）/Cu（Ｉ）触媒作用反応はしばしば環化された
生成物を生成するということを示した。以下に記述され
るプロセスを用いると、結合は容易に環化する可能性を
有するアルキニルアミン（５−アミノ−１−ペンチン
等）とでさえも成功する。
典型的に、本発明のアルキニルアミノ−ヌクレオシド
は、フラスコ中にハロヌクレオシドとCu（Ｉ）を入れ、
空気を除くためArによりフラッシングし、乾燥ジメチル
ホルムアミドを加え、ついでアルキニルアミン、トリエ
チルアミンおよびPd（０）を添加することによって製造
できる。反応混合物は、数時間又は薄層クロマトグラフ
ィ（TLC）がハロヌクレオシドの消失を示すまでかき混
ぜられる。非保護アルキニルアミンが用いられる場合、
アルキニルアミノ−ヌクレオシドは、反応混合物を濃縮
し、結合反応中に生成するヒドロハライドを中和するた
め水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を用いてシリカゲ
ル上でクロマトグラフィー処理することによって単離さ
れ得る。保護アルキニルアミンが用いられる場合、メタ
ノール／塩化メチレンが反応混合物に添加され、ついで
重炭酸塩形態の強塩基アニオン交換樹脂が添加され得
る。次に、このスラリは約45分間かき混ぜられ、ろ過さ
れ、この樹脂は追加のメタノール／塩化メチレンにより
すすがれ得る。併合したろ液は濃縮され、メタノール−
塩化メチレン勾配を用いてシリカゲル上のフラッシュ−
クロマトグラフィにより迅速に精製され得る。
本発明のアルキニルアミノ−ヌクレオチドは５−ヨー
ドピリミジンまたは７−ヨード−７−デアザプリンヌク
レオシドから好ましく生成されるが、類似したブロモヌ
クレオシドもまた用いられ得る。〔Pd（０）/Cu（Ｉ）
を触媒とする結合反応は、また、適切なハロヌクレオチ
ドが入手できる場合のみ、芳香環またはヘテロ芳香環上
の位置にアルキニルアミン基を導入するために用いられ
得る。〕 Pd（０）/Cu（Ｉ）を触媒とする結合反応に適切なア
ルキニルアミンは末端アルキンであって、三重結合が１
〜20原子のジラジカル基によりアミンに結合されている
ものである。ジラジカル基は直鎖アルキレン（C1〜
C20、例えば−C3H6−）であることができ、あるいは二
重結合（例えば−CH≡CHCH2におけるように）、三重結
合（例えば−Ｃ≡Ｃ−CH2−におけるように）またはア
リール基〔例えば（パラ）−C6H4−またはパラ−CH2−C
6H3−〕を含み得る。ジラジカルはまたエーテル、エス
テル、アミノ、又はアミド基の一部として鎖中にN,O,ま
たはＳのようなヘテロ原子を含み得る。ジラジカル基上
の好適な置換基はC1〜C6アルキル、アリール、エステ
ル、エーテル、アミン、アミドまたはクロロ基を含む。
好ましくは、ジラジカルは直鎖アルキレン（C1〜C10）
であり、さらに好ましくはジラジカルは−CH2−であ
る。アミン上の好適な置換基は低級アルキル（C1〜C4）
およびトリフルオロアセチル等の保護基である。一般
に、アルキニルアミンのアミンは第１、第２または第３
アミンであり得る。しかしながら、リンカーとして用い
られるためには、アルキニルアミンが第１アミンである
ことが好ましい。アルキニルアミンのアミンは、アミン
保護が次の段階で必要とされるので、通常は保護され
る。結合生成物はまた、このアミンが保護された形態で
導かれるとき、さらに容易に精製される。トリフルオロ
アセチル保護基は、結合生成物が対応する５′−トリホ
スフェートに転化された後に容易に除去されるので、好
ましい。一般的に、（ヨードヌクレオシドに関して）1.
5〜3.0倍過剰のアルキニルアミンがアルキニルアミノヌ
クレオシドへのヨードヌクレオシドの完全な転化を保障
するため用いられ得る。
結合反応のための好適な溶媒はヨード−またはブロモ
ヌクレオシドを溶解し、Pd（０）/Cu（Ｉ）触媒システ
ムを分解することのない極性溶媒を含む。N,N−ジメチ
ルホルムアミド（DMF）、アセトニトリル、THF、ジメチ
ルスルホキシド（DMSO）、ヘキサメチルホスホルアミド
（HMPA）、およびアルコールは全て用いられ得る。少量
の水を含む溶媒もまた容認される。この溶媒はDMFであ
ることが好ましい。ハロヌクレオシドの濃度は0.02〜1.
0Mであることが好ましく、さらに好ましくは0.2〜0.5M
である。
好適なPd触媒はPd（０）錯体、例えばテトラキス（ト
リアリールホスフィン）Pd（０）である。好ましくはPd
（０）触媒はテトラキス（トリフェニルホスフィン）Pd
（０）である。使用するPd触媒の量は一般的に１〜25モ
ル％（ヨードヌクレオシドに基づく）であり、好ましく
は５〜15モル％である。更に多量の触媒が非常に小さい
規模で反応をおこなうために、または結合のための反応
時間を減少するために用いられる。
Cu（Ｉ）共触媒は好ましくはハロゲン化銅または疑似
ハロゲン化物（シアン化銅のような）であり、最も好ま
しくはCuIである。
Pd（０）触媒に対するCu（Ｉ）共触媒のモル比は1.0
より大きく20より小さい。保護アルキニルアミンが用い
られる場合、Cu/Pdの好ましいモル比は２である。アル
キニルアミンが非保護の場合、非立体障害（unhindere
d）塩基性窒素原子は銅の触媒活性を減少させ、この場
合、Cu/Pd比５が好ましい。どちらの場合にも、Cu/Pd＝
１のときは室温では反応は観察されない。反応速度は一
般にCu/Pdに比が増加するにつれ増加する。しかしなが
ら、保護アルキニルアミンおよび２以上のCu/Pd比によ
り、この増加は、TLCによって示されるように増加した
副生成物に伴われる。
トリエチルアミンは、おそらく、この反応で酸スキャ
ベンジャーとして作用する。すなわち、他の強塩基性ア
ミンもまた用いられ得る。過剰の非保護アルキニルアミ
ンもまた酸スキャベンジャーとして作用するが、好まし
くトリエチルアミンが加えられる。
保護アルキニルアミノヌクレオシドはオキシ塩化リン
による処理、ついでトリ−ｎ−ブチルアンモニウムピロ
ホスフェートによる処理によって対応する５′−トリホ
スフェートに転化され得る〔ラス（Ruth）他、Mol.Phar
macol.415（1981）〕。得られた粗製トリホスフェート
は、この段階でトリエチルアンモニウム重炭酸塩のよう
な揮発性バッファによる溶出によるイオン交換クロマト
グラフィーによって精製することができる。所望のヌク
レオシドトリホスフェートは副生成物からうまく分離さ
れるが、凍結乾燥は、この保護基がトリフルオロアセチ
ル基であるとき、リンカー窒素上の保護基のいくらかの
除去をもたらす。脱保護は、14％水性アンモニアによる
処理によって達成され、生成物は再びイオン交換クロマ
トグラフィーによって精製することができる。リンカー
及びその保護基の性質は、トリホスフェートへの転化を
防止するものとは思われないので、この方法は、種々様
々なヌクレオシドモノ−、ジ−、およびトリホスフェー
トを保護または非保護アルキニルアミノリンカーにより
生成するため用いられ得る。
本発明のアルキニルアミノ−ヌクレオチドの生成後、
本発明の所望のレポーター標識アルキニルアミノ−ヌク
レオチドの生成のための段階が準備される。
以下に示された４つの蛍光標識されたアルキニルアミ
ノ−ヌクレオチド連鎖ターミネーター（34〜37）の好ま
しいセットは本発明のアルキニルアミノ−ヌクレオチド
から得られる。この標識化された化合物のセットは、ア
ルキニルアミノヌクレオシドトリホスフェート６とＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル２との結合およびそ
の後のアンモニアによる脱保護により、実施例19に記述
されたように生成される。
これら４つの蛍光標識された連鎖ターミネーターは、
ザグルスキー（Zagursky）らの手法〔Gene Analysis Te
chniques,Vol.2,89-94（1985）〕に従ってAMV逆転写酵
素を用いてDNAの塩基配列を決定する場合には、標準ジ
デオキシヌクレオチド連鎖ターミネーターの代わりに用
いられた。生成した蛍光標識された塩基配列決定ハシゴ
（sequencing ladder）は、ゲル電気泳動中に移動する
につれ蛍光分子を検出するために設計された機器によっ
て分析することができ、その機器は、ロバートソン（Ro
bertson）らによる同時継続中の出願S.N._（IP-678）に
記述されている機器が好ましい。２つのフィルターを使
用するこの型のシステムはロバートソンらの出願に記述
されており、その内容は引用によりここに開示内容をな
すものとする。ロバートソンらが記述しているように、
一対のモデュールが、レポーターを励起する光ビームが
電気泳動ゲル上の複数のレーンを走査している平面の上
下に置かれている。各々のチャンネルはレポーターで標
識されたDNA断片を含んでいる。各々の検出モデュール
は、広い入射領域を有する光電子増倍管（PMT）、およ
びそのPMTとゲル中の蛍光種との間に置かれた分離波長
選択性フィルターを備える。これらのフィルターは、ダ
イクロイックフィルター作用を模倣した、相補的透過バ
ンド特性を有する干渉フィルターである。このフィルタ
ーはPMTが、異なる意味で種の性質の関数として変化す
る信号を発生することを可能にする。一方のフィルター
は、低発光波長を大幅に通過させ、高発光波長を拒絶す
るのに対し、他方のフィルターは正確に逆の作用をす
る。透過フィルターは、軸からのズレの角度が予め設定
されたものよりも大きい角度からの光を拒絶するため
に、各干渉フィルターと共に用いることができる。波長
フィルターは、４つの色素の発光領域において大まかに
相補的な透過対波長特性を有し、遷移波長は種の輻射エ
ネルギースペクトルの中心付近に生じる。
断片の検出は、スミス（Smith）ら、フード（Hood）
らおよびアンソーグ（Ansorge）らが記述した方法によ
っても行なうことができる。しかしながら、この４つの
蛍光色素の特別の組合わせによって得られる情報を用い
て単一レーン中の４種の塩基を同時に分析することは、
上記同時継続中の特許出願に記述される信号処理システ
ムを用いることによってのみ行なうことが可能である。
蛍光検出によって得られた結果と標準的な塩基配列決
定法によって得られた結果とを比較するために、この４
つの標識連鎖ターミネーターの組合わせが、また32Pレ
ポーターを含む蛍光標識塩基配列決定断片を生成させる
ためにも使用された。（32Pレポーターは、標識dNTPの
添加またはキナーゼを用いてプライマーの５′を標識す
ることによるプライマー伸長の間に、酵素を用いて組込
むことができる。）生成した二重標識された塩基配列決
定ハシゴは、オートラジオグラフィーによっても、蛍光
ゲル読取り機によっても分析可能である。これらの蛍光
標識された塩基配列決定ハシゴは、すべてのバンドがほ
ぼ２塩基遅れて移動することを除いて、標準ジデオキシ
ヌクレオチド連鎖ターミネーターによって生成したハシ
ゴに非常に似ており、機能的にも等価である。これらの
配列決定ハシゴの種々のバンドの相対的強度は、リンカ
ーおよび色素を添加することによって修飾されるが、こ
の修飾連鎖ターミネーターはバンドの取り違えを起こす
ことはみえない。適切な電気泳動の条件下では、これら
の連鎖ターミネーターのリンカーおよび色素はバンドを
変則的に移動させることはしない。すなわち、より速く
移動するバンドは、より移動の遅いバンドよりも少ない
塩基を含む。異なった色素を有する隣合ったバンド間の
間隔は、どの色素が互いの次なのかに依存してわずかに
変化する。最適の条件下で蛍光性または放射性検出のい
ずれかを用いた場合には、相対的バンド強度および位置
におけるこれらの小さな変化は、DNA塩基配列決定のた
めのこれら連鎖ターミネーターの使用を妨げるものでは
ない。
DNA塩基配列決定のための標識された連鎖停止基質の
調製に用いるアルキニルアミノヌクレオチドの有益性
は、上述した４種の化合物（34〜37）の組合わせのみの
合成に限られることはない。糖、塩基および色素の他の
組合わせは、アルキニルアミノリンカーにより組み立て
られており、これらの化合物はまたDNAの塩基配列決定
に有用である。
蛍光標識された連鎖ターミネーターの調製におけるそ
れらの有用性に加えて、本発明のアルキニルアミノヌク
レオチドは、一般に、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドに種々のレポーターを結合するために有用であ
る。これらの分子の最も求核性の強い部位はリンカーに
伴って導入されたアミノ基であるので、活性化されたカ
ルボン酸（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル）、イソシアネート、イソチオシアネート、活性化
されたハロゲン化アリール（例えば、１−フルオロ−2,
4−ジニトロベンゼン）、または適当な反応性を有する
他の求電子性官能基を含むレポーターは、選択的にこの
窒素原子に結合することができる。得られる標識付加物
は、以下に述べるように他の用途に使用し得る。
ヌクレオチドの複素環塩基のサブユニットが遺伝暗号
に使われているために、多くのヌクレオチドの機能がし
ばしば糖サブユニットの性質によって決定される。同様
に、アルキニルアミノヌクレオチドの有用性は、どのよ
うなタイプの糖サブユニットが存在するかに特異的に依
存する。ヌクレオチドの必要な機能をアルキニルアミノ
リンカーおよび／またはレポーターが妨げるならば、こ
の有用性は減少する。本発明のアルキニルアミノリンカ
ーを含むヌクレオチドは、以下のような明らかな利点を
有する：アルキニルアミノリンカーの小さな立体かさ
が、ヌクレオチドの震動を最少にする；ヌクレオチドが
二本鎖DNAに組込まれている場合に、リンカーがピリミ
ジンヌクレオチドの５位および７−デアザプリンヌクレ
オチドの７位に位置することは、結局リンカーおよびレ
ポーターを主たる溝に配置することになる（これは、混
成および他の手順に伴う妨害を最少にし、二本鎖形態が
可能であることを要求する）：及びレポーターが結合し
たアルキニルアミノヌクレオチドは、AMV逆転写酵素に
対する優れた基質である。機能的に関連のある酵素は類
似の方法でそれらの基質と相互作用する傾向があるた
め、これらのヌクレオチドは鋳型指向ヌクレオチドの重
合を行なう他の有用な酵素（他の逆転写酵素、DNAポリ
メラーゼ、およびRNAポリメラーゼのようなもの）に対
する基質でもあるであろう。
本発明のアルキニルアミノ−ヌクレオチドは、標識
２′−デオキシオリゴヌクレオチドの化学的（非酵素
的）合成に対する魅力的な代替法を提供する。ラス（Ru
th）は国際出願番号PCT/US84/00279で、規定された配列
の一本鎖オリゴヌクレオチドにレポーター基を組込む方
法を開示している。この方法は、保護されたアミノ基を
有するリンカーを有する、適切に保護され活性化された
単量体ヌクレオチドを調製し、これらの単量体ヌクレオ
チドをオリゴヌクレオチドを化学的に合成することに用
い、続いてレポーターをリンカーアミノ基に選択的に結
合することを含む。アルキニルアミノリンカーのサイズ
が小さいことと、それらがピリミジンヌクレオチドの５
位および７−デアザプリンヌクレオチドの７位に位置す
ることは、それらを含むオリゴヌクレオチドの機能を改
善するものと期待される。ラスによって記述されたもの
の一つに類似した、適切な保護および活性化を受けた単
量体（38）は、市販の５−ヨード−２′−デオキシウリ
ジンから、アルキルアミノリンカーのPd（０）/Cu
（Ｉ）接触結合、続く５′−アルコールの選択的ジメト
キシトリチル化及び最終のクロロ（ジイソプロピルアミ
ノ）メトキシホスフィンによる３′−ホスホルアミダイ
ト（phosphoramidite）への転化により調製することが
できる。この単量体および他の類似のアルキニルアミノ
含有単量体は、有用なオリゴヌクレオチド合成であり、
ラスによって記述された方法に従ったレポーターの結合
であるものと期待される。（リンカー窒素上のトリフル
オロアセチル保護基は、オリゴヌクレオチドの化学合成
中の最終の脱保護に通常用いられる塩基および／または
求核試薬によって除去される。）レポーターがオリゴヌ
クレオチド合成で用いられる反応によって影響を受けな
ければ、それはより早い段階でアルキニルアミノリンカ
ーに結合させることができる。
オリゴリボヌクレオチドの化学合成は現在のところ、
２′−デオキシオリゴヌクレオチドの合成のようには効
率が良くないか有用でないけれども、適切なモノマー
〔（39），−Ｏ−テトラヒドロピラニル（OTHP）〕は標
識されたRNAを作るために調製し用いることができた。
その他の適用では、二本鎖核酸の酵素標識はアルキル
アミノリンカーを用いることによって促進できる。ラン
ガー（Langer）らは、Proc.Nat.Acad.Sci.USA.78,6633
（1981）で、ビオチンリポーターで二本鎖DNAを標識す
るためのニックトランスレーション法を発表した。アリ
ルアミノリンカーが、２′−デオキシウリジントリホス
フェートとウリジントリホスフェートの５−位置にビオ
チンを結合させるために用いられた。その結果得られた
ビオチニル化ヌクレオチドはDNA及びRNAポリメラーゼの
基質である。あるいは、アルキニルアミノリンカーはビ
オチンの結合に用いられるか、もしくは一般的に蛍光色
素のような他のレポーターの結合に用いることができ
た。アルキニルアミノリンカーを有するアデノシントリ
ホスフェート類似体（40）及び（41）はアリルアミノリ
ンカーを有するアデノシン類似体よりも容易に調製でき
た。（40）及び（41）のヌクレオチドトリホスフェート
類似体は、ランガーらの酵素手法によって、DNAもしく
はRNAのニックトランスレーション標識化のために用い
ることができた。
以下の例は本発明を説明するものである。
全ての温度は摂氏である。（25度は常温もしくは室温
のことである。）全ての部及び百分率は、体積で示す液
体混合物を除き、別段の指示がない限り重量％である。
次に示すような略語を用いる。
DMF:ジメチルホルムアミド DMSO:ジメチルスルホキシド NHTFA:トリフルオロアセトアミド基 TEAB:トリエチルアンモニウム重炭酸塩 Tris:トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン SF:スクシニルフルオレセイン NMR:核磁気共鳴スペクトル IR:赤外スペクトル UV:紫外スペクトルもしくは紫外線検出 TLC:シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィー HPLC:高圧液体クロマトグラフィー GC:ガスクロマトグラフィー mp:融点 mp d:分解を伴う融点 bp:沸点 NMRデータの記載において、化学シフトはppmで与えら
れ、結合定数（Ｊ）はHzで与えられる。融点は全て訂正
されていない。イオン交換樹脂は使用前に適当な水溶液
と有機溶剤で洗浄した。全ての化合物の同定は、ここで
は適切な分光法と分析法によって行った。他に記述がな
ければ、シリカゲルを用いたクロマトグラフィーによる
精製は、スティルらが、J.Org.Chem.,43,2923-2926（19
78）に記述したように行った。
実施例を記述する前にいくつかの実施例における反応
式を記載する。
実施例１ ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジ
デオキシシチジン５′−トリホスフェート（42）の製造 （化合物42は化学構造６の一例であり、ここでHetはシ
トシン（ｉ）、R1は−CH2−である。又、これは標識連
鎖ターミネーター35への直前前駆物質である。） A.N−プロパルギルトリフルオロアセトアミド（43）の
製造 プロパルギルアミン（24.79g,0.450モル；オルドリッ
チ（Aldrich）,99％）を１時間かけて０℃でメチルトリ
フルオロアセテート（69.19g,0.540モル,1.2当量，オル
ドリッチ）に滴下した。これを０℃でさらに１時間攪拌
したのち、15cmビグロー（Vigreux）カラムを用いて蒸
留し、無色液体としてトリフルオロアセトアミド43（6
2.12g;91％）（bp:11トール（torr）で68.5〜69.5℃）
を得た。この物質はNMRおよびGCで測定したところ均質
系であることが認められ、プロパルギルアミンを無水ト
リフルオロ酢酸でアシル化して得られた分光学的に同一
の物質と互換的に使用することができた。
1N‐NMR（CDCl3）:6.85（幅広s,1H,NHTFA）、4.17（d
d,J＝5.6及び2.5,2H,CH2）、2.35（t,J＝2.5,1H,CH）。
IR（ニート：cm-1）:3300（Ｎ−Ｈ）、3095及び2935
（Ｃ−Ｈ）、2130（アセチレン）、1720（Ｃ＝Ｏ）、15
50（Ｎ−Ｈ）、1430、1365、1160、1040、998、918、85
7、829、772、及び725。
B.5−ヨード−２′,3′−ジデオキシシチジン（44）の
製造 ２′,3′−ジデオキシシチジン（2.11g,10ミリモル，
レイロ（Raylo））および酢酸第２水銀（3.35g,10.5ミ
リモル，フィッシャー（Fisher））を50mlのメタノール
に溶かした溶液を19時間還流させた。得られた白色懸濁
物をメタノール（50ml）およびジクロロメタン（100m
l）で稀釈した。次にヨウ素（3.05g,12ミリモル）を加
え、懸濁物を25℃で透明な紫色溶液が生ずるまで攪拌し
た。４時間後、遊離塩基型AG3X4A樹脂（20ml、38ミリ当
量,Bio-Rad;弱塩基性ポリスチレン樹脂）を加え、さら
に硫化水素をこの反応混合物中に15分間に亘り泡立てさ
せつつ導入した。水銀（II）の完全な析出をTLCで確認
した。反応混合物をろ過助材でろ過し、さらにこのろ過
助材を1:1のメタノール−ジクロロメタンで洗った。ろ
過をシリカゲル（10g）上へ蒸発させ、この充填された
シリカゲルを150gのシリカゲルカラムの頂部に載せた。
次にジクロロメタンに溶かした５％、10％および20％メ
タノールを用いて溶出をおこなったところ、2.79g（83
％）のヨウ化物44が無色結晶として得られた。これを沸
とう水から２回再結晶させ、真空乾燥（50℃）させたと
ころ大きな純粋なプリズム状物（mp d:178°）が得られ
た。
1H‐NMR（DMSO-d6）:8.50（s,1H,H6）、7.73（幅広,
s,1H,−NH2 a）、6.53（幅広,s,1H,−NH2 b）、5.86（d
d,J＝6.5及び2.1、1H、H1′）、5.19（t,1H,5′OH）、
4.04（m,1H,H4′）、3.75（ddd,J＝12.1,5.2及び2.9,1
H,H5′ａ）、3.53（dt,J＝12.1及び3.8,1H,H5′ｂ）、
及び2.3-1.7（m,4H,H2′及びH3′）。計算値C9H12N3O
3I:C 32.07％、H 3.59％、N 12.46％。実測値:C 32.05
％,H 3.80％,N 12.46％。
C.アミノアルキンをヨードヌクレオシドと結合させる一
般的方法 ５−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピニ
ル）−２′,3′−ジデオキシシチジン（45）の製造 50mlの３つ口フラスコにヨードシチジン44（770mg,2.
00ミリモル）およびヨウ化第１銅（76.2mg,0.400ミリモ
ル,0.20当量；オルドリッチ，金ラベル）を導入した。
このフラスコをアルゴンでフラッシングした後、乾燥し
たジメチルホルムアミド（10ml,オルドリッチ）を加
え、懸濁したヨウ化第１銅を含む0.2Mヨードシチジン溶
液を得た。次に、Ｎ−プロパルギルトリフルオロアセト
アミド（0.70ml,6.00ミリモル,3.0当量）およびトリエ
チルアミン（0.56ml,4.00ミリモル,2.0当量，モレキュ
ラーシーブ上で保存）をシリンジにより加えた。テトラ
キス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（18
1mg,0.20ミリモル,0.10当量）を乾燥ボックス中のバイ
アル中に入れ、これを反応混合物中に加えた。ヨウ化第
１銅は溶けて黄色溶液が得られ、これは数時間後に暗色
化した。この反応をTLCで出発物質が完全に消費された
ことが確認されるまで続行させた。４時間後、反応混合
物を20mlのメタノール／ジクロロメタン（1:1）で稀釈
し、重炭酸塩の形態のAGI X8樹脂（Bio-Rad,2.0g,ca,6
当量；強塩基性，アニオン交換ポリスチレン樹脂）を加
えた。約15分間攪拌したのちにガスの発生が止った。30
分後、反応混合物をろ過し、樹脂をジクロロメタン−メ
タノール（1:1）混液で洗った。このろ液を一緒にし、
これをロータリ蒸発器で急激に濃縮させた。なお、ジメ
チルホルムアミドの除去は45°、２トールで約10分を要
しておこなった。残渣を直ちにジクロロメタン中に溶か
した10％、15％および20％メタノール溶液を用い、シリ
カゲル100g上にてクロマトグラフィーにより精製した。
さらに適切な画分から溶媒を除去した結果、アルキニル
アミンヌクレオシド45が淡黄色結晶状泡状体の形で651m
g（90％）得られた。このものはTLCおよびNMRで均質物
からなることが確認された。類似する製造法から得られ
た生成物は元素分析により半水和物であることが確認さ
れた。
1H‐NMR（DMSO-d6）:9.96（幅広 s,1H,NHTFA）、8.3
2（s,1H,H6）、7.76（幅広 s,1H,NH2 a）、6.78（幅広
s,1H,NH2 b）、5.88（dd,J＝6.5及び2.5、1H、H
1′）、5.13（t,J＝5.1,1H,5′OH）、4.28（d,J＝5.0,2
H,−CH2−）、4.04（m,1H,H4′）、3.73（ddd,J＝12.0,
5.0及び3.1,1H,H5′ａ）、3.53（dt,J＝12.1及び4.0,1
H,H5′ｂ）、2.3-1.7（m,4H,H2′ and H3′）。
10F‐NMR（DMSO-d6）：−74.0（ｓ）.UV（MeOH）：最
大238.5（17,100）及び295.5（9,300）。
計算値C14H15N4O4F8 1/2H2O:C 45.5,H 4.37,N 15.17。
実測値:C 45.56,H 4.52,N 15.26。
D.トリス（トリ−Ｎ−ブチルアンモニウム）トリフォス
フェートの製造 ピロリン酸テトラナトリウム十水和物（4.46g,10ミリ
モル）を最小量の水（約50ml）に溶解し、AG50W X8樹脂
（100-200メッシュ,4×10cm床；強酸性，カチオン交
換，ポリスチレン樹脂）のカラムを通し水に注いだ。カ
ラムは水で溶出し、溶出液を氷冷フラスコで溶出液のpH
がほぼ中性になるまで集めた。トリ−ｎ−ブチルアミン
（オルドリッチ，金ラベル,7.1ml,30ミリモル）を溶出
液に加え、２層を全てのアミンが溶解するまで激しく攪
拌した。生成溶液を凍結乾燥した。残渣は乾燥ピリジン
とともに２回、乾燥ジメチルホルムアミドとともに１回
共蒸発させた。残渣を乾燥ジメチルホルムアミド（10m
l）に溶解し、生成した1.0M溶液をアルゴンの下、０°
で、使用するまで貯蔵した（１カ月の間）。
E.保護アルキニルアミノヌクレオシドの対応 ５′−トリホスフェートへの転化及びトリフルオロア
セチル保護基の除去のための一般方法。５−（３−アミ
ノ−１−プロピル）−２′,3′−ジデオキシシチジン
５′−トリオスフェート（42）の製造 アルキニルアミノヌクレオシド45（361mg,1.00ミリモ
ル）をトリメチルホスフェート（2.0ml,オルドリッチ，
金ラベル）にアルゴン下、オーブン乾燥フラスコ内で攪
拌しながら溶解した。溶解を−10°に冷却し、オキシ塩
化リン（0.093ml,1.00mモル，オルドリッチ，金ラベ
ル）をシリンジで加えた。この反応混合物を−10°で30
分間攪拌後、第２部分のオキシ塩化リン（0.093ml,1.00
ミリモル）を加え、溶液を攪拌しながら徐々に25°に暖
めた。反応混合物の部分を1N水性水酸化物で急冷し、HP
LCで分析した。対応ヌクレオシドモノホスフェートへの
転化率が最大（この場合、オキシ塩化リンの第２添加後
100分）となったとき、反応混合物をトリス（トリ−ｎ
−ブチルアンモニウムピロホスフェートの予め冷却した
（−10°）溶液（乾燥ジエチルホルムアミド1.0M溶液の
6.0ml）に滴下した。溶液はアルゴン下で攪拌しながら
徐々に25°に暖めた。100分後、反応溶液をトリエチル
アミン（1.4ml）の予め冷却した（０°）水（20ml）溶
液に徐々に加えた。溶液を15分間氷冷しながら攪拌し、
一夜約２°で放置した。25°,0.5トールでの真空蒸発に
より揮発分を除き、残渣を水（75ml）に再溶解し、DEAE
−セファーデックスイオン交換体（A-25-120、26×65cm
床）のカラムに適用した。イオン交換体は、１）pH7.6,
1.0M水性TEAB（300ml）、２）1.0M水性重炭酸カリウム
（300ml）、及び３）pH7.6,01M水性TEAB（300ml）で平
衡化したものである。カラムは、0.1M（1L）から1.0M
（1L）のpH7.6の水性TEABの線状勾配で溶出した。カラ
ムは13分毎に画分を集めながら100ml/時で駆動した。溶
出は270nm（40AUFS）での吸光度によりモニターした。
所望の物質が、良く分離された、勾配端に大きなバンド
として溶出した（画分73〜80）。生成物含有画分をプー
ルし、濃縮し（30°以下で）、絶対エタノールと２回共
蒸発させた。残渣を水（20.4ml）に取り、凍結乾燥し
た。
この中間生成物を水（12.5ml）に取り、濃水酸化アン
モニウム（12.5ml）を加えた。3.5時間攪拌後、溶液を
２時間アスピレータ真空下で２時間攪拌して過剰のアン
モニアガスを除き、凍結乾燥した。残渣をpH7.6の0.1M
水性TEAB（10ml）に取り、上述したように調製したDEAE
−セファーデックスイオン交換樹脂（A-25-120、1.6×5
5cm床）のカラムに適用した。カラムは、0.1M（280ml）
から1.0M（280ml）のTEABの線状勾配で６つの画分を集
めながら溶出させた。生成物は単一大ピークとして溶出
した。純粋生成物を含むと考えられる画分（＃39-45）
をプールし、濃縮し（30°以下で）、絶対エタノールと
共蒸発させ（２回）、水（9.8ml）に取った。溶液はUV
吸収及びHPLCで試験した後、凍結乾燥した。
生成物の稀釈溶液は、pH8.2の50mM水性Trisバッファ
中で240及び293.5nmに最大吸収を示した。生成物の吸収
係数を出発原料のもの（9,300）に等しいと考えると、
生成物の収量は、293.5nmでの吸収を基準にして、0.32
ミリモル（32％）であった。最終生成物のHPLC（ゾルバ
ックス（Zorbax）SAX,0.2M pH6.5水性リン酸カリウム、
270nmでモニター）は、本質的に単一ピークを示した
（＞99％）。
1H‐NMR（D2O）:8.57（s,1H,H6）、6.03（dd,J＝6.4
及び1.6,1H,H1′）、4.42（m,2H,H4′及びH5′ａ）、4.
18（ddd,J＝12. 5.5及び3. 1H,H5′ｂ）、4.036（s,2H,
−CH2−）、2.5-1.9（m,4H,H2′及びH3′）、及び対イ
オン（トリエチルアンモニウム）ピーク。
1H‐NMR（D2O）：−9.02（d,J＝20,1P）、−9.74（d,
J＝20,1P）、−21.37（t,J＝20,1P）。UV（pH8.2 aq Tr
is）:240及び293.5nmで最大。
実施例２ ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′−３′−
ジデオキシウリジン５′−トリホスフェート（46）の製
造 （化合物46は、Hetがウラシル（ｈ）でR1が−CH2−で
ある構造６の例である。これは標識連鎖ターミネーター
34への直前前駆体である） A.5−ヨード−２′,3′−ジデオキシウリジン（47）の
製造 ジデオキシウリジン（2.122g,10.0ミリモル）を30ml
の温メタノールに溶解し、25°に冷却後、メタノール
（20ml）中の一塩化ヨウ素（4.06g,25ミリモル,2.5当
量，フィッシャー）を５分間に亘って加えた。暗紫色反
応混合物を50°浴中窒素下で20分間加熱した後、直ちに
氷水浴で冷却した。攪拌することなく165分間放置した
後、生成沈澱をろ過により回収し冷メタノールで洗浄し
た（２×10ml）。一夜真空乾燥すると2.232g（66％）の
ヨウ化物47がオフホワイト微結晶として得られた。この
物質を更に精製することなく次の反応に用いたが、他の
調製物はクロマトグラフィー又は沸騰メタノール（30ml
/g）からの再結晶で精製して白色針状物を得た（mp d:1
60-164°）。NMRは粗製沈澱物が均質であることを示し
たが、５′−ヒドロキシルプロトンが痕跡不純物による
触媒交換により極めて広いことをも示した。クロマトグ
ラフィーにかけた又は再結晶した物質は、このプロトン
が通常のように鋭いトリプレットであるスペクトルを与
えた。
1H‐NMR（DMSO-d6）:11.60（ブロード s,1H,H3）、
8.57（s,1H,H6）、5.90（dd,J＝2.0及び6.6,1H,H
1′）、5.2（ブロード s,1H,H3）、4.06（m,1H,H
4′）、3.75及び3.53（m,2H,H5′）、2.26、2.02及び1.
84（m,4H,H2′及びH3′）。
B.5−（３−トルフルオロアセトアミド−１−プロピニ
ル）−２′,3′−ジデオキシウリジン（48）の製造 ヨードウリジン47を実施例1Cの一般方法に従ってＮ−
プロパルギルトリフルオロアセトアミドに結合させた。
ジクロロメタン中０〜５％メタノール勾配によるクロマ
トグラフィーによって、TLCでは均質であったが、乾燥
が困難な物質を得た。クロマトグラフィーにかけた生成
物を数回クロロホルムと共蒸発させ、真空乾燥した後、
536.5mgのアルキニルアミノヌクレオシド48を白色泡状
物として得た。この物質はTLCで均質であり、少量（39
モル％；補正収量66％）のクロロホルム以外はNMRで純
粋であった。
1H‐NMR（DMSO-d6）:11.61（s,1H,H3）、10.07（歪ん
だ t,1H,NHTFA）、8.35（s,1H,H6）、7.26（s,0.39H,C
HCl3）、5.89（dd,J＝6.6及び3.2,1H,H1′）、5.15（t,
J＝5.2,1H,5′OH）、4.22（ブロード d,2H,−CH2N
−）、4.04（apparent hept,J＝3.51,1H,H4′）、3.73
及び3.53（m,2H,H5′）、2.26、2.03及び1.84（m,4H,H
2′及びH3′）。
TLC（95:5のジクロロメタン−メタノール,2つの溶出,
UV）：原料アイオダイド47,Rf＝0.37;生成物48,0.28;触
媒,0.95及び0.80プラスわずかなむら（streakiness）。
C.5−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジ
デオキシウリジン５′−トリホスフェート（46）の製造 実施例1Eの一般方法に従い、アルキニルアミノヌクレ
オシド48（0.30ミリモル）を対応するトリホスフェート
に転化し、そのトリフルオロアセチル基を除去した。第
２部分のオキシ塩化リンの添加後、ホスホリル化を合計
で210分間進行させた。生成物の吸収係数を原料のもの
（13,000）と等しいと考えると、トリホスフェートの収
率は、291.5nmのUV吸収に基づいて18％であった。
実施例３ ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジ
デオキシグアノシン５′−トリホスフェート（49）の製
造 （化合物49は、Hetが７−デアザグアニン（ｋ）でR1
が−CH2−である構造６の例である。これは標識連鎖タ
ーミネーター37の直前前駆体である） A.6−メトキシ−２−メチルチオ−９−（3,5−ジ−Ｏ−
ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシ
ル）−７−デアザプリン（９）の製造 ６−メトキシ−２−メチルチオ−７−デアザプリン
（８,9.2g,F.シーラ（Seela）他,Chem.Ber.,Vol.111,29
25（1978）の方法に従って製造）を150mlの乾燥ピリジ
ンに溶解して共沸乾燥し、30〜35°で蒸発乾固した。こ
の物質を室温で窒素下、450mlの乾燥アセトニトリルに
懸濁させ、水素化ナトリウム（油中60％懸濁液2.16g）
を攪拌しながら添加した。45分後、１−クロロ−２−デ
オキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボ
フラノース（18.6g,M.ホファー（Hoffer）,Chem,Ber.,V
ol.93,2777（1960）の方法に従って製造）を３等部分に
わけて20分間に亘って加えた。反応混合物を室温で更に
45分間攪拌後、酢酸（1ml）及びジクロロメタン（300m
l）を加えた。混合物をろ過助材のパッドを通して吸引
ろ過し、ろ液を蒸発乾固した。残渣をベンゼンに溶解
し、この溶液を水（２回）及びブライン（１回）で洗浄
した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥及び蒸発後、残
渣をメタノール（400ml）に溶解し、結晶化させて無色
結晶としてリボシル化生成物９を19.24g（73.8％）得た
（mp:106〜107°）。
1H‐NMR（CDCl3）:2.42（s,3H,トルオイルCH3）、2.4
4（s,1H,CH3）、2.64（s,3H,SCH3）、2.70及び2.89（m,
2H,H2′）、4.08（m,1H,H3′）、4.56（m,1H,H3′）、
4.65（m,2H,H5′）、5.74（m,1H,H4′）、6.44（d,J＝
4,1H,H7）、6.77（dd,J＝８及び6,1H,H1′）、7.05（d,
J＝4,1H,H8）、及び7.25及び7.95（m,8H,トルオイル
Ｈ）。少量のジクロロメタンを含むメタノールからの上
記物質の試料の再結晶によりmpが109〜110°の結晶を得
た。
B.6−メトキシ−２−メチルチオ−９−（２−デオキシ
−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプリン（10）
の製造 エステル９（19g）及びレキシン（REXYN）201樹脂（3
8g,強塩基性，アニオン交換，ポリスチレン樹脂）の600
mlメタノール中懸濁液を1.5時間窒素下で還流した。熱
懸濁液を吸引ろ過して樹脂を除きろ液を蒸発乾固した。
固体残渣をエーテル（450ml）に溶解し、10分後、溶液
をろ過助剤のパッドを通して少量の着色不純物を除い
た。溶液を、前の反応で得た所望の生成物の結晶で種付
けし、一夜25°で放置した。結晶ジオール10をろ過によ
り集め、母液を濃縮して第２生産物を得た。各生産物を
エーテルで完全に洗浄し乾燥して全部で8.43g（78.0
％）のジオール10を無色結晶（mp:129〜130°）として
得た。
1H‐NMR（DMSO-d6）:2.21及び2.55（m,2H,H2′）、2.
56（s,3H,SCH3）、3.53（m,2H,H5′）、3.82（m,1H,H
3′）、4.02（s,3H,OCH3）、4.36（m,1H,H4′）、4.90
（t,J＝5.5,1H,5′OH）、5.30（d,J＝5.5,1H,3′OH）、
6.48（d,J＝4,1H,H7）、6.55（dd,J＝８及び6,1H,H
1′）、7.48（d,J＝4,1H,H8）。少量のメタノールを含
むジクロロメタンからの上記物質の試料の再結晶により
mpが130〜131°の結晶を得た。
C.6−メトキシ−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−トリ
フェニルメチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシ
ル）−７−デアザプリン（11）の製造 ジオール10（7.2g）を乾燥ピリジン中に溶解させ溶液
を35°で蒸発乾固することによって共沸乾燥した。残渣
を乾燥ピリジン（100ml）および塩化トリフェニルメチ
ル（8.0g）に溶解し、トリエチルアミン（4.0ml）、お
よび４−（ジメチルアミノ）ピリジン（300mg）を添加
した。反応混合物を窒素下で30分間65°で加熱した後、
塩化トリフェニルメチル（1.0g）をさらに添加して、1
6.5時間加熱を続けた。冷却した後、反応混合物を濃縮
し、残渣をジクロロメタンと水との間で分配した。水性
層をジクロロメタンで抽出し、一緒にした有機層を0.3N
塩酸、水性重炭酸ナトリウム、およびブラインで洗浄し
た。硫酸ナトリウム上で乾燥し濃縮した後、ジクロロメ
タン中の０％、１％、1.5％および２％のメタノール溶
液を用い、シリカゲル上のクロマトグラフィーによる粗
製生成物を精製して無色ガラスとして12.1g（94.5％）
のモノトリチルエーテル11を得た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.58（s,3H,SCH3）、2.42および2.
62（m,2H,H2′）、3.37（m,2H,H5′）、4.04（m,1H,H
3′）、4.08（s,3H,OCH3）、4.60（m,1H,H4′）、6.40
（d,J＝4,1H,H7）、6.68（見かけt,J＝7,1H,H1′）、7.
00（d,J＝4,1H,H8）、7.27および7.43（m,15H,トリチル
Ｈ）。このデータは前述のように調製された11の異な
るバッチから得られた。
D.6−メトキシ−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−トリ
フェニルメチル−2,3−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラ
ノシル）−７−デアザプリン（12）の製造 乾燥ジクロロメタン（220ml）中のトリチルエーテル1
1（12.1g）、ジメチルアミノピリジン（9.2g）、および
フェニルクロロチオノカーボネート（7.5ml、オルドリ
ッチ）の溶液を窒素下で２時間25°で攪拌した。TLC分
析によれば、反応は不完全であることが示されたので、
フェニルクロロチオノカーボネート（4.0ml）を添加
し、反応混合物をさらに１時間攪拌した。溶液をジクロ
ロメタン（280ml）で稀釈し、続いて0.5N塩酸（500m
l）、0.5N水酸化ナトリウム（500ml）、およびブライン
で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発
乾固した。
生成した粗製チオノカーボネートを乾燥トルエン（35
0ml）およびアゾイソビスブチロニトリル（350mg）に溶
解し、水素化トリ−ｎ−ブチルスズ（10ml）を添加し
た。得られた溶液を10分間100〜105°で加熱した。冷却
した後、溶液を少量のエーテルで稀釈し、10％の水性フ
ッ化カリウム（350ml）とともに振とうした。２つの層
をろ過助材のパッドを通してろ過し（ダークスラッジを
取除くために）、分離させた。有機層を0.75N水酸化カ
リウムとブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムサルフェー
ト上で乾燥し、濃縮した。1:1のジクロロメタン−エー
テル、次いでジクロロメタンにするシリカゲル上の生成
油のクロマトグラフィーにより無色の固体（mp:122〜12
4°）として9.93g（84.5％）のジデオキシヌクレオシド
12を得た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.10、2.33、および2.43（m,4H,H
2′およびH3′）、2.60（s,3H,SCH3）、3.30（m,2H,H
5′）、4.08（s,3H,OCH3）、4.29（m,1H,H4′）、6.36
（d,J＝3,7、1H、H7）、6.53（dd,J＝７および4,1H,H
1′）、7.09（d,1H,J＝3,7,H8）、7.25および7.45（m,1
5H,トリチル Ｈ）。
E.7−ヨード−６−メトキシ−２−メチルチオ−９−
（５−Ｏ−トリフェニルメチル−2,3−ジデオキシ−β
−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプリン（13）の製
造 Ｎ−ヨードスクシンイミド（10.0g）を乾燥ジメチル
ホルムアミド（550ml）中のデアザプリン12（9.9g）の
溶液に添加した。窒素下、暗所で16時間攪拌した後、10
％水性重炭酸ナトリウム（2.5ml）を添加し、反応混合
物を50°で減圧下、100mlの体積まで濃縮した。この溶
液を水と酢酸エチルとの間で分配した。有機層を５％の
水性亜硫酸水素ナトリウムとブラインで洗浄し、硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、濃縮した。シリカゲル上の微かに
不純な生成物のジクロロメタンによるクロマトグラフィ
ーにより、無色のガラス固体として11.68g（95.6％）の
ヨウ化物13を得た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.06、2.24および2.41（m,4H,H2′
およびH3′）、2.58（s,3H,SCH3）、3.30（m,2H,H
5′）、4.10（s,3H,OCH3）、4.29（m,1H,H4′）、6.47
（dd,J＝６および4,1H,H1′）、7.19（s,1H,H8）、7.30
および7.46（m,15H,トリチル Ｈ）。このデータは前述
のように調製された13の異なるバッチから得られた。
F.7−ヨード−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−トリフ
ェニルメチル−2,3−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノ
シル）−７−デアザプリン−４−オン（14）の製造 ナトリウムチオクレゾレートをナトリウムメトキシド
（１当量）をメタノール中のチオクレゾールの溶液に添
加して、次いで蒸発乾固させることによって調製した。
乾燥トルエン（150ml）中のメチルエーテル13（4.0
g）、ナトリウムチオクレゾレート（4.0g）、およびヘ
キサメチルホスホルアミド（10ml）の混合物を窒素下で
4.5時間還流させた。冷却した後、混合物を酢酸エチル
と水との間で分配した。有機層を水とブラインで洗浄
し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固させた。シリ
カゲル上の粗生成物のジクロロメタン中の０％および２
％メタノールによるクロマトグラフィーにより、無色の
ガラス固体として3.80g（97.0％）のデアザプリノン14
を得た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.05、2.27および2.42（m,4H,H2′
およびH3′）、2.60（s,3H,SCH3）、3.30（m,2H,H
5′）、4.28（m,1H,H4′）、6.40（dd,J＝７および4,1
H,H1′）、7.05（s,1H,H8）、7.30および7.46（m,15H,
トリチル Ｈ）、10.00（ブロード s,1H,H1）。
G.7−ヨード−５′−Ｏ−トリフェニルメチル−２′,
3′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン（15）の製造 メタークロロペルオキシ安息香酸（1.23g、85％、オ
ルドリッチ）を窒素下で０°で乾燥ジクロロメタン（15
0ml）中のメチルチオエーテル14（3.6g）の攪拌溶液に
添加した。15分後、冷却浴を取除き、攪拌を25°で40分
間続けた。この溶液を水性重炭酸ナトリウムとブライン
で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。メタノール
（２体積％）を添加し、得られた溶液をシリカゲルの短
プラグを通過させ、極性不純物を取除いた。得られた粗
スルホキシド（3.07g）をジオキサン（40ml）に溶解し
ガラス裏打ちボンベに入れた。アンモニア（10.0g）を
添加し、混合物を100°で２時間オートクレーブ中で加
熱した。得られた溶液を蒸発乾固させた。残渣をジクロ
ロメタン（20ml）に溶解し、ろ過助材のパッドを通して
ろ過した。メタノール（40ml）を溶液に添加し、冷却に
より1.57gの無色生成物が結晶化した。母液を蒸発に供
しジクロロメタン中の５％メタノールによるシリカゲル
上の中圧液体クロマトグラフィーによって精製し無色結
晶として328mgの生成物をさらに得た。デアザグアノシ
ン15の全収量は1.90g（55.4％）であった。
1H‐NMR（CDCl3）:2.05、2.23および2.35（m,4H,H2′
およびH3′）、3.29（m,2H,H5′）、4.26（m,1H,H
4′）、5.90（ブロード s,2H,NH2）、6.24（dd,J＝７
および4,1H,H1′）、6.90（s,1H,H8）、7.30および7.46
（m,15H,トリチル Ｈ）、10.90（ブロード s,1H,H
1）。メタノール−ジクロロメタンからのこの物質の試
料の再結晶化により、mp201〜203°の結晶を得た。
H.2′,3′−ジデオキシ−７−ヨード−７−デアザグア
ノシン（16）の製造 ギ酸（12ml）中のトリチルエーテル15（1.7g）の溶液
を10分間室温で攪拌した。ついで、生成黄色懸濁物を30
°で減圧下で急速に蒸発乾固させた。ジクロロメタン中
の５％、７％、および10％のメタノールによるシリカゲ
ル上の残渣のクロマトグラフィーにより、940mgの無色
固体を得た。少量のジクロロメタンを含有するエーテル
とのこの固体のすりつぶし（trituration）により、無
色結晶として838mg（81.0％）のヌクレオシド16を得
た。
1H‐NMR（DMSO-d6）:1.95、2.09および2.26（m,4H,H
2′およびH3′）、3.48および3.54（m,2H,H5′）、3.98
（m,1H,H4′）、4.90（ブロード t,J＝5,1H,5′OH）、
6.08（m,1H,H1′）、6.32（ブロード s,2H,NH2）、7.1
2（s,1H,H8）、10.46（ブロード s,1H,H1）。
I.7−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピニ
ル−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン（5
0）の製造 ヨウ化物16（376mg、1.00ミリモル）を実施例1Cに示
された一般的方法によってＮ−プロパルギルトリフルオ
ロアセトアミドに2.25時間結合させた。生成物と出発物
質は、TCLでは区別できず、そのため反応は逆相HPLC（1
0cmODS、1ml/分、100％水から100％メタノールまでの５
分間にわたる勾配、次いで100％メタノール、280nmのUV
検出：出発ヨウ化物16、5.49分；生成物50、5.75分；中
間体、6.58分）によって監視した。粗生成物はジクロロ
メタンにはあまり溶解せず、そのためクロマトグラフィ
ーカラムに付される前にジクロロメタン−メタノール溶
液からシリカゲル上に濃縮した。ジクロロメタン中の２
％、５％、７％、および10％のメタノールによる溶出に
より、黄色固体として300mg（78％）のアルキニルアミ
ノヌクレオシド50を得た。
1H‐NMR（DMSO-d）:1.96、2.08、および2.28（m,4H,H
2′およびH3′）、3.47および3.55（m,2H,H5′）、3.99
（m,1H,H4′）、4.22（ブロード s,2H,−CH2−）、4.9
0（t,J＝5,1H,5′,1H,5′OH）、6.09（dd,J＝６および
4,1H,H1′）、6.33（ブロード s,2H,NH2）、7.30（s,1
H,H8）、10.05（ブロード s,1H,NHTFA）、10.50（ブロ
ード s,1H,H1）。1H−デカップルド 13C‐NMR（DMSO-d6）:155.5（g,J＝36.5、トリフルオ
ロアセチル カルボニル）、157.8、153.1および149.9
（C2,C4およびC6）、122.6（C8）、115.9（q,J−288、C
F3）、99.4および97.5（C7およびC5）、84.2および77.4
（アセチレン性）、83.2および81.0（C1′およびC
4′）、62.9（C5′）、29.7（プロパルジリック）、31.
8および25.8（C2′およびC3′）。この13C‐NMRデータ
は前述のように調製された50の異なるバッチから得られ
た。
J.7−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジ
デオキシ−７−デアザグアノシン５′−トリホスフェー
ト（49）の製造 アルキニルアミノヌクレオシド50（0.90ミリモル）を
対応する５′−トリホスフェートに転化し、トリフルオ
ロアセチル保護基を実施例1Eに示された一般的方法に従
って除去した。オキシ塩化リンの第２の添加後、反応混
合物をさらに165分間攪拌した。生成物に対する吸収係
数が出発物質の吸収係数（11,900）に等しいと仮定する
と、272.5mmでの吸収に基づいて、５′−トリホスフェ
ート49の収率は18％であった。
実施例４ ７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジ
デオシ−７−デアザアデノシン５′−トリホスフェート
（51）の調製 （化合物51はHetが７−デアザアデニン（ｊ）で、R1
が−CH2−である構造の６の例である。これは標識され
た連鎖ターミネーター36の直前前駆体である。） A.2′−アセトキシ−３′−ブロモ−５′−（２−アセ
トキシイソブチリル）アデノシン（18）の製造 ２−アセトキシイソブチリルブロマイド（19.5ml,150
ミリモル,5eq;J.Am.Chem.Soc.,95,4016-4030（1973）に
記載されたラッセル他の方法に従って調製した）を、乾
燥アセトニトリル（250ml,Aldrich）中のツベルシジン
懸濁液（17,7−デアザアデノシン,6.66g,25.0ミリモル,
Sigma）に15分かけて添加した。懸濁した固体は約５分
以内に溶解した。窒素下に、反応混合液を25℃で22時間
攪拌した。この反応混合液を、水400mlに硫酸水素二カ
リウム（43.55g,300ミリモル,6eq）を溶解した水溶液中
に加えた。30分間の攪拌後、溶液を酢酸エチル（１×40
0mlおよび２×200ml）で抽出した。集めた有機層を硫酸
マグネシウム上で乾燥し、蒸発に供することにより、白
色の泡状物14.73g（118％）を得た。この物質は、TLC
（UV検出による）で95％以上のやや広がった一つのスポ
ットであるが、NMRでは一つの主生成物と少なくとも一
つの副生成物の存在が示された。そのNMRスペクトル
は、主生成物がブロモアセテート18であることと一致し
ていた。
主成分18の1H‐NMR（DMSO-d6中）:8.08（s,1H,H2）,
7.34（d,J＝3.7,1H,H8）、7.12（ブロードs,2H,NH2）、
6.70（d,J＝3.7,1H,H7）、6.32（d,J＝3.8,1H,H1′）、
5.61（dd,J＝2.4,3.8,1H,H2′）、4.89（dd,J＝2.4,4.
5,1H,H3′）、4.43（m,1H,H4′）、4.35（dd,J＝12,4,1
H,H5′ａ）、4.29（dd,J＝12.7,1H,H5′ｂ）、2.08（s,
3H,OAc）、2.00（s,3H,OAc）、1.49（s,6H,2CH3）。
B.2′,3′−ジデオキシ−２′,3′−デヒドロ−７−デ
アザアデノシン（19）の製造 亜鉛粉末（20g,Mallinkrodt）を、1N塩酸（３×50m
l）、水（２×50ml）、２％の硫酸銅溶液（２×50m
l）、水（４×50ml）、エタノール（３×50ml）、およ
びエーテル（２×50ml）で速やかに洗浄（要した時間は
約10分）することにより、新鮮な亜鉛−銅カップルを調
製した。夫々の洗浄の間、空気中への亜鉛の露出を最小
限にするために、懸濁状態になるまで亜鉛粉末をフリッ
ト磁器製の漏斗中で攪拌し、洗浄液を吸引した。この亜
鉛−銅カップルを30分間減圧乾燥した。上記で得た粗製
のブロモアセテート（14.63g）を乾燥ジメチルホルムア
ミ（150ml,Aldrich）に溶解し、ロータリーエバポレー
タ（45℃,2torr）でほぼ25mlの溶媒を除去した。新鮮な
亜鉛−銅カップル（14.63g,約9eq）を加え、得られた懸
濁液を窒素雰囲気下に25℃で攪拌した。この反応は、亜
鉛−銅カップルの質によって、誘導時間および／または
異なった速度を示す。従って、TLC（90:9:1のジクロロ
メタン−メタノール−濃水酸化アンモニウム；出発物質
のRf＝0.45、生成物のRf＝0.39,0.36）により出発物質
が完全に消費されたことが示されるまで、反応を続け
た。この実施例の場合、反応は15分以内に完了した。10
0分後、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（75ml）を、1
0分間かけて注意深く反応混合液に添加した。ろ過助材
を通して反応混合液をろ過し、ろ過助材をメタノール
（２×50ml）で洗浄した。合体したろ液を蒸発乾固し、
残渣を水（150ml）と酢酸エチル（150ml）の間で分配さ
せた。水層を酢酸エチル（２×100ml）で抽出し、合体
した抽出有機溶媒を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮
した後、１時間かけて減圧乾燥した。
得られた暗いオレンジ色の半固体をメタノール（100m
l）に溶解し、次いで水（25ml）およびレキシン201樹脂
（29g,4.3meg/g,5eq、水酸化物型）を添加した。この反
応混合液を、全部で210分間還流した。TLC（85:13:2の
ジクロロメタン−メタノール−濃水酸化アンモニウム；
中間体のRf＝0.49、最終生成物（19）のRf＝0.24）によ
るモニターの結果、反応は転化率70％で急速に停止する
ことが示されたため、165分後に追加の樹脂（29g）を添
加した。冷却することなく樹脂をろ過により除去し、1:
1のジクロロメタン−メタノール（２×75ml）で洗浄し
た。ろ液を集めて蒸発乾固させ、得られた紫色の固体を
沸騰イソプロパノール（159ml）から再結晶させること
により、オフホワイト色の針状結晶（mp205〜206°）と
して3.778gのオレフィン19が得られた。母液を25mlに濃
縮することにより、生成物（青紫色の針状結晶;mp202〜
203°）の第二の収穫0.631gが得られた。両者の収穫物
（全部で4.409g,76％）は均一であることがTLCで示さ
れ、また痕跡量のイソプロパノールの存在を除いて純粋
であることがNMRで示された。
1H‐NMR（DMSO-d6中）:8.07（s,1H,H2）、7.15（d,J
＝3.7,1H,H8）、7.12（ブロードs,1H,H1′）、7.01（ブ
ロードs,2H,NH2）、6.57（d,J＝3.6,1H,H7）、6.64と6.
02（ブロードd,J＝6.0、夫々1H,H2′とH3′）、4.95
（t,J＝6.5,1H,5′OH）、4.79（m,1H,H4′）、3.52（m,
2H,H5′）。
C.2′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン（20）
の調製 450mlのパールボトル（Parr Bottle）中に、オレフィ
ン19（3.80g）、エタノール（76ml）、カーボン担持10
％パラジウム（380g,Aldrich）を収容し、40psiの水素
を導入した。25℃で4.67時間振り混ぜることにより14.6
7psiの水素が吸収され、水素の取込みが止まった。TLC
（85:13:2のジクロロメタン−メタノール−濃水酸化ア
ンモニウムで二回溶出；出発物質19のRf＝0.45、生成物
20のRf＝0.48）によって、単一なUV−活性の生成物に完
全に転化したことが示された。ろ過助材を通してろ過す
ることにより触媒を除去し、エタノールで洗浄した。ろ
液から溶媒を除去し、一晩減圧乾燥することにより、白
色の泡状体として3.98g（104％）のジデオキシヌクレオ
シド20が得られた。NMRによって、８重量％のエタノー
ルが存在することを除いて均一であることが示された
（補正収率96％）。この物質と同様のバッチは難結晶性
で、無水溶媒との共沸乾燥で極端に吸湿性となった。従
って、この物質は減圧下で約１週間保存し、NMRが５重
量％のエタノール含有量を示したときに使用した。この
生成物について観察される結晶性の欠如および分光学的
特徴は、既にロビンズ他によってCan.J.Chem.,vol.55,1
259（1977）に報告されたものと一致していた。
1H‐NMR（DMSO-d6中）:8.04（s,1H,H2）、7.33（d,J
＝3.6,1H,H8）、6.97（ブロードs,2H,NH2）、6.56（d,J
＝3.6,1H,H7）、6.34（dd,J＝5.2と6.4,1H,H1′）、4.9
6（t,J＝5.6,1H,5′OH）、4.33（t,J＝5.1,0.43H,エタ
ノールOH）、4.04（m,1H,H4′）、3.4〜3.6（m,2.86H,H
5′とエタノールCH2）、2.33と2.21と2.02（m,4H,H2′
とH3′）、1.06（t,J＝7.0,1.3H,エタノールCH3）。
D.7−ヨード−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシン（21）の製造 純度95％のジデオキシヌクレオシド20（2.95g,11.96
ミリモル）、無水酢酸ナトリウム（4.13g、50.3ミリモ
ル,4eq）および酢酸第二水銀（3.81g,11.95ミリモル,1.
00eq,Fisher,99.9％）の水（180ml）溶液を機械的に攪
拌し、窒素下に65℃で２時間加熱した。得られた水銀性
の白色懸濁液を25℃にまで冷却した後、ヨウ素（4.97g,
18.9ミリモル,1.6eq）および酢酸エチル（190ml）を添
加した。１時間後、懸濁された水銀剤は消尽し、透明な
紫色の溶液が残った。２時間後、亜硫酸ナトリウム（6.
35g）を添加すると、紫色が消失した。30分間の攪拌
後、反応液中に硫化水素ガスを15分の間穏やかにバブリ
ングさせた。硫化第二水銀（黒色コロイド）およびヨウ
化物21（白色粉末）が反応液から沈殿した。二つの主な
UV−活性スポットのうちの一つの消失をモニターするこ
とにより、水銀（II）の完全な沈殿を確認した。反応溶
液はろ過助材を通してろ過し、二層に分離した。ろ過助
材は、生成物がもはや抽出されないことがTLCで示され
るまで、沸騰酢酸エチル（９×100ml）で洗浄した。各
酢酸エチル抽出液を水層で洗浄した。合体した酢酸エチ
ル層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発乾固させた。
得られた粗製固体は、空気中で露出されると赤色に変化
した。この物質を3:1のジクロロメタン−メタノール（1
00ml）に溶解し、遊離塩基型のAG3X4A陰イオン交換樹脂
（5.0g,BioRad,2.9meq/g乾燥状態）を添加した。この赤
色溶液中に硫化水素を10分間バルリングしたところ、赤
色が脱色された。短時間加温することにより僅かな曇り
を除去し、溶液をシリカゲルの2cmプラグを通して速や
かにろ過した。シリカゲルを3:1のジクロロメタン−メ
タノール（100ml）を追加して洗浄した。シリカゲル（5
0g）をろ液中に添加し、硫化水素ガスを10分間バブリン
グした。ロータリーエバポレータを用いてこの混合液か
ら溶媒を除去し、またクロロホルム（200ml）と共に蒸
発させることによってシリカゲルを乾燥した。このシリ
カゲルを、窒素気流で脱ガスされたシリカゲルカラム
（500g）上に速やかに載置した。窒素下に、５％（6L）
および10％（4L）の沸騰しているジクロロメタン中メタ
ノール溶液で溶出することにより、白色粉末状のヨウ化
物（21）2.92g（64％）と、456mg（7.5％）のより少な
い極性の7,8−ジヨード−２′,3′−ジデオキシ−７−
デアザアデノシンを得た。主生成物を沸騰酢酸エチル
（200ml）から再結晶することにより、2.626gの白色針
状結晶（mp158〜160℃）が得られた。母液を10mlにまで
濃縮することにより、第二の収穫物として明赤色針状結
晶（mp156〜158℃）が得られた。NMRおよびTLCによれば
両者の収穫物は共に均一であり、共にオレフィン19から
ヨードヌクレオシド21への総収率64％を示した。
1H‐NMR（DMSO-d6中）:8.09（s,1H,H2）、7.67（s,1
H,H8）、4.95（t,J＝5.5,1H,5′OH）、4.04（見掛け上
の７重線、Ｊ＝3.5,1H,H4′）、3.59と3.49（m,2H,H
5′）、2.30と2.28と2.20（m,4H,H2′とH3′）。
E.7−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピニ
ル）−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン
（52）の製造 実施例1Cに示した標準的な手法に従って、ヨウ化物21
（720.3mg,200ミリモル）をＮ−プロパルギルトリフル
オロアセトアミドに90分間で結合した。ジクロロメタン
中の７％のメタノール溶液でのクロマトグラフィーによ
り、オフホワイト色の粉末として705.8mgの結合生成物5
2（92％）が得られ、NMRおよびTLCによれば該生成物は
均一であった。沸騰酢酸エチル（10ml）から再結晶させ
ることにより、372mgの白色微結晶（mp169〜171℃）が
得られた。
1H‐NMR（DMSO-d6中）:10.1（歪んだt,1H,NHTFA）、
8.10（s,1H,H2）、7.78（s,1H,H8）、6.0-7.5（非常に
ブロードなs,2H,NH2）、6.34（dd,J＝4.5と7.0,1H,H
1′）、4.98（t,J＝5,1H,5′OH）、4.31（僅かにブロー
ドなs,2H,−CH2N−）、4.10（見掛け上の７重線、Ｊ＝
3.5,1H,H4′）、3.60と3.40（m,2H,H5′）、2.37と2.18
と2.00（m,4H,H2′,H3′） TLC（90:9:1のジクロロメタン−メタノール−濃水酸
化アンモニウム;UV）：出発物質であるヨウ化物（21）
のRf＝0.36、生成物（52）のRf＝0.26. F.7−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジ
デオキシ−７−デアザアデノシン５′−トリホスフェー
ト（51）の製造 実施例1Eに示した一般的手法に従い、アルキニルアミ
ノヌクレオシド52（1.00ミリモル）を対応する５′−ト
リホスフェートに転化し、トリフルオロアセチル基を除
去した。オキシ塩化リンの第二アリコートを添加した
後、溶液を120分間攪拌した。生成物の吸収係数が出発
物質のそれ（12,700）に等しいと仮定して、729.5nmに
おける吸収に基づくトリホスフェート51の収率は、40％
であった。
1H‐NMR（D2O中）:7.97（s,1H,H2）、7.80（s,1H,H
8）、6.33（m,1H,H1′）、4.44（m,1H,H4′）、4.27
（m,1H,H5′ａ）、4.14（m,1H,H5′ｂ）、4.11（ブロー
ドs,2H,−CH2−）、2.6-2.0（m,4H,H2′とH3′）、これ
らに加えて対イオン（トリエチルアンモニウム）のピー
ク。
31P‐NMR（D2O）：−8.59（ブロードd,J＝20,1P）、
−21.38（m.1P） UV（pH8.2のTris溶液）:238nm及び279.5nmに極大吸
収。
実施例５ ７−ヨード−２′,3′ジデオキシ−７−デアザアデノ
シン（21）の第２の製造 （化合物21は実施例４で調製し、使用した中間体であ
る） A.6−クロロ−２−メチルチオ−９−（２−デオキシ−
β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプリン（23）の
製造 メタノール（210ml）及び濃水酸化アンモニウム（210
ml）を、ジクロロメタン（210ml）中の６−クロロ−２
−メチルチオ−９−（3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルイル−２
−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプ
リン（22,26.8g:J.Am.Chem.Soc.,Vol.106,6379（1984）
に記載された方法に従って調製した）の溶液に加えた。
得られた混合物を室温で５日間攪拌した後、蒸発乾固さ
せた。残渣をエタノールとの共蒸発により乾燥した。粗
生成物をジクロロメタンに溶解し、放置したところ、無
色の結晶が沈殿した。沈殿物を集め、エーテルで完全に
洗浄することにより、14.5g（79.1％）のジオール23（m
p d:190〜192℃）が得られた。
1H‐NMR（DMSO-d6）:2.26と2.55（m,2H,H2′）、2.57
（s,3H,SC3）、3.54（m,2H,H5′）、3.84（m,1H,H
3′）、4.37（m,1H,H4′）、4.95（m,1H,OH）、5.34
（m,1H,OH）、6.57（m,1H,H1′）、6.63（m,1H,H7）、
7.80（m,1H,H8）。
このNMRデータは、上記のようにして調製されたジオ
ール23の異なったバッチから得られたものである。
B.6−クロロ−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−トリフ
ェニルメチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシ
ル）−７−デアザプリン（24）の製造 ジオール23（14.5g）を乾燥ピリジンとの共蒸発によ
り乾燥した。塩化トリフェニルメチル（165g）、４−
（ジメチルアミノ）ピリジン（600mg）及びトリエチル
アミン（8.0ml）を、乾燥ピリジン（200ml）中の該乾燥
ジオールの溶液に加えた。反応混合液を65℃において窒
素下に６時間攪拌した後、追加の塩化トリフェニルメチ
ル（2.0g）及びトリエチルアミン（1.0ml）を添加し、1
7時間加熱を継続した。冷却後、メタノール（3ml）を添
加し、反応混合液を蒸発乾固させた。残渣をジクロロメ
タンと0.3N塩酸水溶液との間で分配させた。有機層を重
炭酸ナトリウム水溶液およびブライン（塩水）で洗浄
し、硫酸ナトリウム上で乾燥した後、蒸発乾固させた。
得られた粗生成物について、１％及び1.5％のメタノー
ル（ジクロロメタン中）を用いてシリカゲル上でクロマ
トグラフィーを行なったところ、ガラス状の固体として
22.7g（88.6％）のモノトリチルエーテル24が得られ
た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.48と2.60（m,2H,H2′）、2.59
（s,3H,SC3）、3.40（m,2H,H5′）、4.08（m,1H,H
3′）、4.61（m,1H,H4′）、6.43（m,1H,H7）、6.68
（m,1H,H1′）、7.2-7.5（m,16H,トリチルＨとH8）。
このNMRデータは、上記のようにして調製された24の
異なったバッチから得られたものである。
C.6−クロロ−２−メチルチオ−９−（５−Ｏ−トリフ
ェニルメチル−2,3−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノ
シル）−７−デアザプリン（25）の製造 ４−（ジメチルアミノ）ピリジン（16.5g）およびフ
ェニルクロロチオノカーボネートをトリチルエーテル24
の乾燥ジクロロメタン溶液（300ml）に添加した。室温
で窒素下に反応混合物を2.25時間攪拌した後、ジクロロ
メタン（200ml）を加えた。この溶液を、0.5N塩酸（700
ml）、0.5N水酸化ナトリウム（700ml）およびブライン
で洗浄した。有機層を亜硫酸ナトリウム上で乾燥させ、
蒸発乾固した。
得られた粗製チオカーボネートを乾燥トルエン（450m
l）に溶解し、加熱して穏やかに還流させた。アゾイソ
ビスブチロニトリル（600mg）および水素化トリ−ｎ−
ブチルスズ（17.7ml）を添加した。窒素下で還流させな
がら15分間攪拌した後、さらに水素化トリ−ｎ−ブチル
スズ（2.0ml）を添加し、反応混合物をさらに15分間還
流させた。冷却後、反応混合物をエーテル（200ml）で
希釈し、10％フッ化カリウム水溶液（500ml）、0.75N水
酸化カリウム（500ml）およびブラインで洗浄した。亜
硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した後、得られた粗生
成物を2:1ジクロロメタン−エーテルおよびジクロロメ
タンを用いてシリカゲルクロマトグラフィーにかけるこ
とにより、10.1gのジデオキシヌクレオシド25を得た。
不純物の分画を集めて再度クロマトグラフィーにかける
ことにより、さらに3.76gの純生成物を得た。これらを
合せて、25を無色の固体（mp140〜142.5°）として13.9
g（63.0％）得た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.11,2.36、および2.46（m,4H,H
2′およびH3′）、2.60（s,3H,SCH3）、3.33（明瞭なd,
J＝4,2H,H5′）、4.32（m,1H,H4′）、6.39（d,J＝3.7,
1H,H7）、6.52（dd,J＝6.7および3.7,1H,H1′）、7.25
および7.45（m,15H,トリチルＨ）、7.32（d,1H,J＝3.7,
H8）。
このデータは、上述のように調製された25の異なるバ
ッチから得られたものである。
D.6−クロロ−２−メチルチオ−９−（２′,3′−ジデ
オキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプリン
（26）の製造 1:1メタノール−ジクロロメタン（100ml）にトリチル
エーテル25（7.58g）を溶解した溶液にトリフルオロ酢
酸（10ml）を添加し、溶液を25℃で窒素下に17時間攪拌
した。反応溶液をジクロロメタン（500ml）と重炭酸ナ
トリウム水溶液との間で分配させ、水層をジクロロメタ
ンを用いて再抽出した。有機層を集めて亜硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、蒸発乾固した。残渣を、ジクロロメタン
中に０％および５％のメタノールを混合させた溶液を用
いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけること
により、ヌクレオシド26を粘稠無色ガラス状物質として
4.07g得た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.16,2.26および2.50（m,4H,H2′
およびH3′）、2.63（s,3H,SCH3）、2.76（広いs,1H,O
H）、3.67および3.93（m,2H,H5′）、4.27（m,1H,H
4′）、6.38（dd,J＝6.7および5.2Hz,1H,H1′）、6.51
（d,J＝3.7Hz,1H,H7）、7.26（d,1H,J＝3.7Hz,H8）。こ
のデータは、上述したように調製された26の異なるバッ
チより得られた。
E.2′,3′−ジデオキシ−２−メチルチオ−７−デアザ
アデノシン（27）の製造 メタノール（50ml）に塩化物26（1.83g）を溶解した
溶液をガラスを内張りしたボンベに入れ、アンモニアを
滴下した。溶液をオートクレーブにおいて100°で15時
間加熱した。冷却後、反応溶液を蒸発乾固した。得られ
た粗生成物を、ジクロロメタンに０％,3％および５％の
メタノールを混合した溶液を用いてシリカゲルによって
精製することにより、デアザアデノシン27を無色の固体
（mp.184〜185°）として1.27g（80.4％）得た。
1H‐NMR（DMSO-d6）:2.01,2.21および2.39（m,4H,H
2′およびH3′）、2.45（s,3H,SCH3）、3.50（m,2H,H
5′）、4.02（m,1H,H4′）、4.83（t,J＝5.5,1H,5′O
H）、6.32（dd,J＝７および4.5,1H,H1′）、6.50（d,J
＝3.7,1H,H7）、7.07（広いs,2H,NH2）、7.02（d,1H,J
＝3.7,H8）。
F.2′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン（20）
の製造 600mgの27および過剰のラネーニッケル（Aldrich、水
およびメタノールで洗浄済み）の混合物を、窒素下で、
TCLが出発物質の消失を示すまで（６時間）還流させ
た。熱い溶液をろ過し、ろ過助材およびろ集したラネー
ニッケルをメタノールで洗浄した。集めたろ液の溶媒を
留去させることにより、20を実施例4Cで調製した物質と
同一の無色のガラス状固体として424g（84.9％）得た。
G.7−ヨード−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシン（21）の製造 ジデオキシ−７−デアザアデノシン20を下記の実施例
4Dに示した手法によりヨウ素化した。
実施例６ ７−ヨード−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデ
ノシン（21）の第３の製造 （化合物21は実施例４で製造し、用いた中間体であ
る。） A.6−クロロ−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラ
ノシル）−７−デアザプリン（29）の製造 濃水酸化アンモニウム（100ml）のメタノール（174m
l）溶液を、６−クロロ−９−（3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トル
オイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７
−デアザプリン（28,10.0g、カジミエールクズク（Kazi
mierczuku）他J.Amer.Chem.Soc.106巻、6379（1984）に
記載されている通りに製造）のジクロロメタン（100m
l）溶液に加えた。この混合物を25℃で24時間攪拌した
後、濃水酸化アンモニウム（50ml）をさらに加えた。全
部で５日間攪拌した後、反応混合物を蒸発乾固し、粗生
成物をエタノールとともに共蒸発に供した。残渣をジク
ロロメタンに溶解し、所望生成物を結晶化させた。ろ過
および乾燥により、4.90g（92％）のヌクレオシド（29
を無色結晶として得た（mp:155.5〜158.5°）。
1H‐NMR（DMSO-d6）:2.30および2.55（m,2H,H2′）、
3.58（m,2H,H5′）、3.85（m,1H,H3′）、4.40（m,1H,H
4′）、4.97（m,1H,OH）,5.35（m,1H,H3′）、6.65（m,
1H,H1′）、6.75（d,1H,H7）、8.00（m,1H,H8）、8.65
（s,1H,H2）このデータは上記した通りに製造した29の
異なるバッチのものから得たものである。
B.6−クロロ−９−（５−Ｏ−トリフェニルメチル−２
−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプ
リン（30）の製造 ヌクレオシド29（2.5g）を乾燥ピリジンとともに共蒸
発させることにより乾燥した。残渣を乾燥ピリジン（49
ml）に溶解し、トリフェニルメチルクロリド（2.5g）、
４−（ジメチルアミノ）ピリジン（120mg）およびトリ
エチルアミン（1.6ml）を加えた。反応混合液を65℃で
４時間窒素下に攪拌した。トリフェニルメチルクロリド
（1.0g）およびトリエチルアミン（0.6ml）をさらに加
え、反応混合物を75℃で18時間攪拌した。冷却後、メタ
ノール（2ml）を加え、その混合物を蒸発乾固させた。
残渣をジクロロメタンおよび0.5N塩酸の間で分配させ
た。有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液およびブライン
で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固させ
た。ジクロロメタン中メタノールの０％、1.5％および
３％溶液を用いシリカゲルクロマトグラフィーにより2.
26gのトリチルエーテル30をガラス様固体として得た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.46および2.65（m,2H,H2′）、3.
40（m,2H,H5′）、4.10（m,1H,H3′）、4.65（m,1H,H
4′）、6.55（d,1H,H7）、6.72（m,1H,H1′）、7.2-7.5
（m,16H,トリチルＨおよびH8）および8.60（s,1H,H
2）。
C.6−クロロ−９−（５−Ｏ−トリフェニルメチル−２
−デオキシ−３−チオノカルボフェノキシ−β−Ｄ−リ
ボフラノシル）−７−デアザプリン（30a）の製造 ４−ジメチルアミノ）ピリジン（1.35g）およびフェ
ニルクロロチオカーボネート（1.20ml）を、トリチルエ
ーテル30の乾燥ジクロロメタン（30ml）溶液に加えた。
この反応混合物を窒素下、25℃で２時間攪拌した後、ジ
クロロメタン（20ml）をさらに加え、この溶液を0.5塩
酸、0.5N水酸化ナトリウムおよびブラインで洗浄した。
有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固させた。
残渣をジクロロメタン−エーテルでトリチュレートした
ところ、1.53g（76％）のチオカーボネート30aを無色結
晶として得た（mp186.5〜188.5°）。
1H‐NMR（CDCl3）:2.85および3.00（m,2H,H2′）、3.
55（m,2H,H5′）、4.50（m,1H,H4′）、6.00（m,1H,H
3′）、6.60（d,1H,H7）、6.85（m,1H,H1′）、7.1-7.5
（m,20H,トリチルおよびフェニルＨ）、7.50（d,1H,H
8）および8.60（s,1H,H2）。
D.6−クロロ−９−（５−Ｏ−トリフェニルメチル−2,3
−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザ
プリン（31）の製造 チオカーボネート30a（1.2g）、アゾイソビスブチロ
ニトリル（50mg）およびトリ−ｎ−ブチルスズ水素化物
（0.60ml）の乾燥トルエン（50ml）溶液を窒素下110℃
で15分間熱した。冷却後、この反応混合物をエーテル50
mlで稀釈し、10％フッ化カリウム水溶液（50ml）および
ブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥
し、蒸発乾固させた。得られた粗生成物を、ジクロロメ
タン中０％および1.5％メタノールを用いたシリカゲル
クロマトグラフィーにより0.84g（92％）のジデオキシ
ヌクレオシド31を無色固体として得た（融点60-63.5
℃）。
1H‐NMR（CDCl3）:2.11,2.36および2.50（m,4H,H2′
およびH3′）、3.37（m,2H,H5′）、4.35（m,1H,H
4′）、6.50（d,J＝3.7,1H,H7）、6.58（dd,1H,H
1′）、7.25および7.45（m,15H,トリチルＨ）、7.55
（d,1H,J＝3.7,H8）および8.60（s,1H,H2）。
E.6−クロロ−９−（2,3−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフ
ラノシル）−７−デアザプリン（31a）の製造 トリフルオロ酢酸（1.5ml）をトリチルエーテル31（7
00mg）の1:1メタノール−ジクロロメタン（20ml）溶液
に加えた。窒素下、25℃で17時間攪拌した後、炭酸水素
ナトリウム（1.5g）を加え、その混合物を30分間攪拌し
た。この反応混合物をろ過し、蒸発乾固させた。得られ
た粗生成物をジクロロメタン中メタノール０％および２
％溶液を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより30
0mg（84％）のアルコール31aを無色ガラスとして得た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.20,2.40および2.65（m,4H,H2′
およびH3′）、3.65および4.00（m,2H,H5′）、3.95
（幅広s,1H,OH）、4.35（m,1H,H4′）、6.28（dd,1H,H
1′）、6.62（d,J＝4,1H,H7）、7.40（d,1H,J＝4,H8）
および8.65（s,1H,H2）。
F.6−クロロ−９−（５−アセトキシ−2,3−ジデオキシ
−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デアザプリン（32）
の製造 無水酢酸（2.0ミリモル）をアルコール31a（284mg）
の乾燥ピリジン（10ml）溶液に加えた。この溶液を25℃
で1.25時間攪拌した後、メタノール（10ml）を加えた。
さらに30分間攪拌後、この反応混合物を蒸発乾固させ
た。残渣をジクロロメタンに溶解し、その溶液を1N塩酸
（2X）およびブライン（1X）で洗浄した。有機層を硫酸
ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固させて295mg（89％）
の粗アセテート32を無色ガラスとして得た。
1H‐NMR（CDCl3）:2.07（s,3H,アセチル）、2.20,2.4
5および2.55（m,4H,H2′およびH3′）、4.25および4.35
（m,2H,H5′）、4.40（m,1H,H4′）、6.55（dd,1H,H
1′）、6.65（d,1H,H7）、7.50（d,1H,H8）および8.60
（s,1H,H2）。
G.6−クロロ−７−ヨード−９−（５−Ｏ−アセチル−
2,3−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−デ
アザアプリン（33）の製造 一塩化ヨウ素（340mg）のジクロロメタン（約1ml）溶
液をアセテート32（200mg）のジクロロメタン（20ml）
溶液に加えた。25℃で３時間攪拌した後、反応混合物を
ジクロロメタンおよび亜ジチオン酸ナトリウム水溶液の
間で分配させた。有機層を炭酸水素ナトリウムおよびブ
ラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固
させた。残渣をジクロロメタン−エーテルでトリチュレ
ートして無色結晶135mg（47％）を得た（融点132.5〜13
4℃）。
1H‐NMR（CDCl3）:2.10,2.40および2.55（m,4H,H2′
およびH3′）、2.17（s,3H,COCH3）、4.27および4.37
（m,2H,H5′）、4.40（m,1H,H4′）、6.55（dd,1H,H
1′）、7.72（s,1H,H8）および8.60（s,1H,H2）。H.7−
ヨード−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン
（21）の製造 ガラス内張りしたボンベ内で、アンモニ
ア（4g）をクロリド33（125mg）のメタノール（20ml）
溶液に加えた。このボンベをオートクレーブ中100℃で
３時間熱した。冷却後、反応混合物を蒸発乾固させた。
残渣を熱酢酸エチルに溶解し、その熱溶液をろ過助材の
パッドを通してろ過した。ろ液を蒸発乾固した後、残渣
をエーテルでトリチュレートしてやや不純な生成物21
（85mg）を無色結晶として得た。この生成物を、ジクロ
ロメタン中５％メタノール溶液を用いたシリカゲルTLC
によりさらに精製したところ67mg（63％）のヨウ化物21
を無色固体として得た。この物質は実施例4Dで得たもの
と同一のものであった。
実施例７ ７−ヨード−２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノ
シン（53）の製造 （化合物53はHetが７−デアザヒポキサンチン（１）
である構造４の例である。） 窒素下に、デアザアデノシン21（720.3mg、2.00ミリ
モル）の氷酢酸（2.0ml）中懸濁液に水（18ml）を滴下
して透明溶液を調製した。アルゴン気流を通して固体亜
硝酸ナトリウム（1.38g、20.0ミリモル、10当量）を10
分間かけて小バッチづつ加えた。得られた曇った反応混
合物をアルゴン下に機械的に攪拌したところゴム状沈殿
が徐々に生成した。18時間後、反応混合物をろ過し、沈
殿を酢酸エチル（100ml）および水（約10ml）で充分に
洗浄した。併せたろ液を分配させ、水層を酢酸エチル
（２×50ml）で抽出した。併せた有機層を硫酸マグネシ
ウム上で乾燥し、蒸発乾固させた。TLCによると、沈殿
と酢酸エチル抽出物の双方が生成物53からなり、５％未
満の未反応21で汚染されていた。両バッチの生成物を1:
1メタノール−ジクロロメタンに溶解し、それを併せ、
シリカゲル（7g）上に蒸発させた。シリカゲルをクロロ
ホルム（50ml）と共蒸発させ、シリカゲルカラム（50
g）上に置いた。ジクロロメタン中８％メタノールで溶
出させたところ、558.3mg（78％）のデアザイノシン53
を淡黄色固体として得た。この物質を沸騰イソプロパノ
ールから再結晶させることによりそれぞれ白色針状晶を
得た。これら針状晶は分解を伴ない200℃ないし210℃間
で変化する融点を示した。クロマトグラフ精製し再結晶
した生成物は、TLCおよびNMRにより、イソプロパノール
（５モル％）の存在を除き均質であった。
1H‐NMR（DMSO-d6中）:12.04（幅広S,1H,H1）、7.93
（s,1H,H2）、7.56（s,1H,H8）、6.29（dd,J＝4.0およ
び6.8,1H,H1′）、4.94（t,J＝5.0,1H,5′OH）、4.04
（見掛け上の７重線、Ｊ＝3.5,1H,H4′）、2.36,2.18お
よび1.99（m,4H,H2′およびH3′）。
実施例８ ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′−デオキ
シシチジン５′−トリホスフェート（54）の製造 （化合物54は、R1が−CH2−、Hetがシトシン（ｉ）、
R2、R3、R7およびR8がＨ、R6がOH、R5がP3O9H3-である
アルキニルアミノヌクレオチド（Ｉ）の例である。） A.5−ヨード−２′−デオキシシチジン（55）の製造 ２′デオキシシチジン一水和物（1.226g,5.00ミリモ
ル，オルドリッチ）および酢酸第二水銀（1.753g,5.5ミ
リモル、1.1当量、フィッシャー）のメタノール（30m
l）溶液を14.5時間還流させた。得られた白色懸濁液を
メタノール（30ml）およびジクロロメタン（50ml）で稀
釈した後、ヨウ素（1.522g,6.00ミリモル,1.2当量）を
加えた。60分間攪拌した後、得られた紫色溶液を脱色し
たが、未反応水銀物質（mercurial）がまだ白色懸濁液
として目で見えた。100分後と240分後に、ヨウ素（それ
ぞれ0.381g,1.5ミリモル,0.3当量，および0.122g,0.50
ミリモル,0.1当量）をさらに加えた。全部で５時間後、
反応混合物は透明で紫色であった。遊離塩基型のAG3×4
A樹脂（5.17g,2.9ミリ当量/g,3 当量バイオーラド）を
加えた後、硫化水素を５分間反応混合物に吹込んだ。水
銀（II）が完全に沈殿したことをTLCにより確認した。
この反応混合物をろ過助材を通してろ過し、ろ過助材を
1:1メタノール−ジクロロメタンで洗浄した。ろ液を併
せ、これにシリカゲル（5g）を加え、この混合物を蒸発
乾固させた。シリカゲルをクロロホルム（50ml）と共蒸
発させ、シリカゲルカラム（50g）上に置いた。ジクロ
ロメタン中メタノールの15％、20％および30％溶液で溶
出させたところ、1.378g（78％）のヨードシチジン55を
白色粉末として得た。沸騰メタノール（35ml）から再結
晶し、一夜真空乾燥したところ、白色針状晶0.953gを得
た（融点179〜180℃）。
母液を10mlに濃縮したところ、淡黄色針状晶0.140gを
得た（融点172〜174℃）。痕跡量のメタノールを除き、
両方とも（全収率62％）TLCおよびNMRによって均質であ
った。
1H‐NMR（DMSO-d6）:8.28（s,1H,H6）、7.8および6.6
（幅広s,2H,NH）6.08（t,J＝6.3,1H,H1′）,5.20（d.J
＝4,1H,3′OH）、4.90（t,J＝5,1H,5′OH）、4.20（m,1
H,H4′）、3.77（歪んだq,1H,H3′）、3.60および3.54
（m,1H,H5′）、2.12および1.98（m,1H,H2′）。TLC（7
5:20:5ジクロロメタン−メタノール−濃水酸化アンモニ
ウム;UV）；出発物質Rf＝0.15、生成物55,0.33;水銀（I
I）,0.54。
B.5−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピニ
ル）−２′−デオキシシチジン（56）の製造 実施例1Cの一般工程に従ってヨウ化物55（353.1mg,1.
00ミリモル）を４時間でＮ−プロパルギルトリフルオロ
アセトアミドに結合させた。ジクロロメタン中メタノー
ルの０〜20％メタノール勾配により粗生成物をクロマト
グラフ精製し、一夜真空乾燥したところ、白色粉末3.84
g（102％）を得た。この物質はTLCにより均質であった
が、溶媒を強固に保持していた。この粉末を沸騰イソプ
ロパノール（10ml）から再結晶し、−20℃に冷却したと
ころ、299.6mg（74％）のアルキルアミノヌクレオシド5
6を白色針状晶として得た（mp168-170°）。NMRによっ
て再結晶生成物は均質であり、結晶は生成物56の１分子
当り0.5分子のイソプロパノールを含んでいることが示
された。
1H‐NMR（DMSO-d6）:9.96（幅広s,1H,NHTFA）、8.15
（s,1H,H6）,7.83および6.86（幅広s,2H,NH2）、610
（t,J＝6.5,1H,H1′）、5.21（d,J＝4,5,1H,3′OH）、
5.06（t,J＝5,1H,H1′）、5.21（d,J＝4,5,1H,3′O
H）、5.06（t,J＝5,1H,5′OH）、4.35（d,J＝4,0.5H,イ
ソプロパノールOH）,4.28（幅広s,2H,−CH2N−）、4.20
（見掛け上の六重線、Ｊ＝3.5,1H,H4′）、3.79（m,1.5
H,H3′およびイソプロパノールCH3）、3.56（m,2H,H
5′）、2.13および1.97（m,1H,H2′）、および1.04（d,
J＝6,3H,イソプロパノールCH）。TLC（85:13:2ジクロロ
メタン−メタノール−濃水酸化アンモニウム、２回流
出;UV）：出発ヨウ化物55,Rf＝0.31;生成物56,0.27。
C.5−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′−デオキ
シシチジン５′−トリホスフェート（54）の製造 実施例1Eの一般手法に従い、アルキルアミノヌクレオ
シド56（0.275ミリモル）を対応する５′−トリホスフ
ェートに転化し、そのトリフルオロアセチル基を除去し
た。オキシ塩化リンをさらに加えた後、加リン酸（ホス
ホリル化）反応を3.5時間おこなった。生成物の吸収係
数が出発物質のそれ（8,780）と同じであると仮定し
て、トリホスフェートの収率は、その293nmにおけるUV
吸収に基づき、17％であった。
実施例９ ５−（３−トリフルオロアセトアミド−１−プロピニ
ル）−２′−デオキシウリジン（57）の製造 （化合物57は、R1が−CH2−、R2がCOCF3、Hetがウラ
シル（ｈ）、R3、R5、R7およびR8がＨ、およびR6がOHで
あるアルキルアミノヌクレオチド（Ｉ）の例である） 反応混合物を通常よりも2.5倍濃縮した以外は実施例1
Cの一般手法により、５−ヨード−２′−デオキシウリ
ジン（7.08g、20.0ミリモル、アルドリッチ）を４時間
でＮ−トリフルオロアセチルプロパルギルアミンに結合
させた。ジクロロメタン中10〜20％メタノールを用いて
シリカゲル（500g）クロマトグラフ精製したところ、3.
50g（46％）のアルキルアミノヌクレオシド57を黄褐色
固体として得た。NMRおよびTLCにより、この物質は、真
空乾燥によって除去されなかったメタノール（約50モル
％）の存在を除き、純度＞95％であった。
1H‐NMR（DMSO-d6）:11.63（s,1H,H3）、10.06（歪ん
だt,1H,NHTFA）、8.19（s,1H,H6）、6.10（見掛け上の
t,1H,H1′）、5.23（d,J＝4,1H,3′OH）、5.07（t,J＝
5,1H,5′OH）、4.23（m,3H,−CH2−およびH4′）、3.8
（見掛け上のq,J＝4,1H,H3′）、3.58（m,2H,H5′）お
よび2.12（m,2H,H2′）。
実施例10 ５−（５−トリフルオロアセトアミド−１−ペンチニ
ル）−２′,3′−ジデオキシウリジン（58）の製造 （化合物58は、Hetがウラシル（ｈ）であり、R1が−
(CH2)3−である構造５の例である。
A.5−トリフルオロアセトアミド−１−ペンチン（59）
の製造 水素化ナトリウム（油中60％懸濁液、アルファ）を、
ペンタンで完全かつ迅速に洗浄した後真空乾燥すること
によって油除去した。この油除去水素化ナトリウム（4.
40g,0.110モル,1.1当量）を約20部分にわけて25分間か
けて、５−クロロペンチン（10.6ml,0.100モル,1.0当
量）、トリフルオロアセトアミド（14.13g,0.125モル,
1.25当量）およびヨウ化ナトリウム（14.99g,0.100モ
ル,1.0当量）の乾燥ジメチルホルムアミド（250ml）溶
液に加えた。この反応混合物を25°で4.5時間および60
℃で21時間攪拌した。冷却後、反応混合物をリン酸二水
素カリウム（43.5g,0.250モル、2.0当量）の水（500m
l）溶液に加えた。この溶液をペンタン（２×500ml）お
よびエーテル（３×500ml）で抽出した。有機層を併
せ、水（１×100ml）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で
乾燥し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。20cmの
Vigreuxカラムを通して２回分別蒸留したところ8.09g
（54％）の５−トリフルオロアセトアミド−１−ペンチ
ン（58）を無色流動性液体として得た（bp:13Torrで68
〜69℃）。
1H‐NMR（CDCl3）:6.77（幅広s,1H,NHTFA）、3.53
（q,J＝6.7および2.7,2H,−CH2NHTFA）,2.31（td,J＝6.
7および2.7,2H,HCCCH 2−）、2.04（t,J＝2.7,1H,HCCCH2
−）、および1.83（５重線、Ｊ＝6.7,2H,−CH 2CH2CH
2−）。
B.5−（５−トリフルオロアセトアミド−１−ペンチニ
ル）−２′,3′−ジデオキシウリジン（58）の製造 実施例1Cの一般手法に従って、５−トリフルオロアセ
トアミド−１−ペンチン（59）を４時間で５−ヨード−
２′,3′−ジデオキシウリジン（47、実施例2Aに記載し
た通りに製造）に結合させた。ジクロロメタン中０〜５
％メタノールを用いシリカゲルクロマトグラフ精製した
ところ、647.7mgのアルキニルアミノヌクレオシド58を
淡黄褐色泡状物として得た。この物質はTLCおよびNMRに
より、約16モル％のジメチルホルムアミドの存在を除
き、均質であった。ジメチルホルムアミドの存在につい
て補正した結果、所望の生成物の収率は80％であった。
1H‐NMR（DMSO-d6）:11.52（s,1H,H3）、9.47（歪ん
だt,1H,NHTFA）、5.90（q,1H,H1′）、5.12（5,1H,5′O
H）、4.04（m,1H,H4′）、3.71および3.52（m,2H,5′
Ｈ）、3.30（m,2H,−CH2CH2CH 2NHTFA）、2.40（t,2H,−
CH 2CH2CH2NHTFA）、2.23,2.01および1.85（m,4H,H2′お
よびH3′）、および1.73（５重線、2H,−CH2CH 2CH2NHTF
A）。
実施例11 ５−（12−トリフルオロアセトアミド−１−ドデシニ
ル）−２′,3′−ジデオキシウリジン（60）の製造 （化合物60は、Hetがウラシル（ｈ）で、R1が−(CH2)
10−である構造５の例である） A.11−ドデシン−１−オール（61）の製造 予備冷却された、リチウムアセチリドエチレンジアミ
ン錯体（23.94g、0.260モル,1.3当量，オルドリッチ,90
％）の乾燥ジメチルスルホキシド（100ml）中懸濁液
に、１−ブロモ−10−テトラヒドロピラニルオキシデカ
ン（64.26g,0.200モル，ランカスター，“97＋％”）を
内部温度が５〜10℃のままであるように140分かけて滴
下した。滴下が完了した後、冷却浴を除去し、反応混合
物を4.5時間攪拌した。この反応混合物に水（20ml）を
滴下した。10分間攪拌した後、反応混合物を水（300m
l）中に注いだ。この溶液をペンタン（２×300ml）およ
びエーテル（２×300ml）で順次抽出した。各有機層を
別々に水（約20ml）で洗浄し、洗液を主水相と併せて再
抽出した。有機層を併せ、硫酸マグネシウム上で乾燥
し、蒸発乾固させたところ、粗製12−（テトラヒドロピ
ラニルオキシ）−１−ドデシン51.38g（96％）を油状物
として得た。
強酸性イオン交換樹脂（AG-50W-X8,50g,5.1ミリ当量/
g,バイオーラド）を上記粗製生成物（49.96g）のクロロ
ホルム（260ml）とメタノール（260ml）との混合物溶液
に加えた。この懸濁液を還流下に4.5時間加熱した後、
冷却した。この反応混合物をろ過し、ろ液を濃縮した。
残渣をヘキサン中10％、20％および30％酢酸エチルを用
いてシリカゲル（500g）クロマトグラフ生成したとこ
ろ、油状物31gを得た。これはホスホモリブデン酸によ
る検出により＞95％１スポットであった。この物質を20
cmのVigreuxカラムを通して蒸留したところ、0.78gの先
駆物の後に、11−ドデシン−１−オール（61）17.91gを
粘稠無色油状物として得た（1.4Torrでの沸点104-108
℃）。これは放置することによって白色固体に固化し
た。この物質はGCによる98％１ピークであった。
蒸留前のクロマトグラフ精製した生成物の1H‐NMR（C
DCl3）:3.64（t,2H,−CH 2OH）、3.37および3.33（m,約
0.2H,不純物）、2.17（td,2H,HCCCH 2−）、1.92（t,1H,
HCCCH2−）および1.2-1.6（m,17H,(CH2)8およびOH）。I
R（溶融物の薄膜）:3392（−OH）、3311,2930および285
4（Ｃ−Ｈ）、2160（アセチレン）、1466,1432,1394,14
71,1352,1328,1303,1103および1001。
B.12−ヨード−１−ドデシン（62）の製造 蒸留したアルコール61（15.50g,85ミリモル）および
トリフェニルホスフィン（66.90g,255ミリモル,3.0当
量）の乾燥トルエン（425ml,モレキュラーシーブ上で保
存したもの）中懸濁液にヨウ素（43.16g,170ミリモル,
2.0当量）を加えた。この反応混合物を激しく攪拌しな
がら25分間還流下に熱したところ、油状沈殿を含む黄色
溶液が生成した。25℃に冷却した後、飽和炭酸水素ナト
リウム水溶液（200ml）およびヨウ素（23.73g,93.5ミリ
モル,1.1当量）を加え、この反応混合物を１時間激しく
攪拌した。飽和亜硫酸ナトリウム水溶液（40ml）を加え
て紫色を消失させた。この反応混合物を２層に分離さ
せ、有機層をブラインで洗浄した。その有機層を硫酸マ
グネシウム上で乾燥し、濃縮した。残渣をジクロロメタ
ン（50ml）に溶解し、エーテル（200ml）を加えた。30
分間放置した後、得られた沈殿（トリフェニルホスフィ
ンオキシド）をろ過によって除去し、エーテル（100m
l）で洗浄した。さらに放置したところ、併せた母液お
よび他の洗液から結晶が得られ、これを前と同様に除去
した。併せて母液とエーテル洗液を濃縮し、暖かいトル
エン（200ml）に溶解した。この溶液をシリカゲルカラ
ム上に置き、トルエン（３リットル）で溶出させたとこ
ろ、13.55g（55％）のヨウ化物62を淡黄色流動性液体と
して得た。この物質はGCによる96％１ピークであった。
1H‐NMR（CDCl3）:3.20（t,2H,−CH 2I）、2.17（td,2
H,HCCCH 2−）、1.94（t,1H,HCCCH2−）、1.82,1.51およ
び1.20-1.42（m,16H,(CH2)8）。
C.12−トリフルオロアセトアミド−１−ドデシン（63）
の製造 水素化ナトリウム（油中60％懸濁液、アルファ）をペ
ンタンで迅速かつ充分に洗浄し真空乾燥することによっ
て油除去した。この油除去した水素化ナトリウム（3.84
g,160ミリモル,4当量）の乾燥ジメチルホルムアミド（9
0ml,オルドリッチ）中懸濁液にトリフルオロアセトアミ
ド（22.61g,200ミリモル,5当量）を約10の部分にわけて
50分かけて加えた。この添加の初期に、反応混合物は暖
かくなることが見い出されたとき、氷−水浴を加え、残
りの添加を約10℃の内部温度でおこなった。氷−水浴を
取り除き、反応混合物を、水素の発生が停止するまで攪
拌した。さらに10分間攪拌した後、ヨウ化物63（11.69
g,40.0ミリモル）の乾燥ジメチルホルムアミド（10ml）
溶液を10分間かけて滴下した。20℃で４時間攪拌した
後、反応混合物を、飽和塩化アンモニウム水溶液（200m
l）、水（200ml）およびペンタン（200ml）の攪拌した
混合物に素早く注いだ。反応容器を、水（50ml）、飽和
塩化アンモニウム（50ml）およびペンタン（200ml）の
混合物ですすいだ。溶液を併せ、放置して２層に分離さ
せ、水相をペンタン（２×200ml）で抽出した。有機層
を併せ、硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発乾固させて
10.42g（94％）のトリフルオロアセトアミド63油状物と
して得た。これは放置によりワックス状固体に固化し
た。この物質を沸騰ヘキサン（100ml）から、ゆっくり
と−20℃まで冷却し再結晶させることによって10.42g
（94％）のトリフルオロアセトアミド63を淡黄色針状晶
として得た（融点46-47℃）。
1H‐NMR（CDCl3）:6.27（幅広s,1H,NHTFA）、3.34
（見掛け上のq,2H,−CH 2NHTFA）、2.18（td,2H,HCCCH 2
−）、1.95（t,1H,HCCCH2−）、1.20-1.65（m,16H,(C
H2)8）。
IR（溶融物の薄膜）:3312,3298,2932,および2857（Ｃ
−ＨおよびＮ−Ｈ）、2117（アセチレン）、1706（Ｃ＝
Ｏ）、1675,1563,1460,1448,1208,1182,1166,722および
643。
D.5−（12−トリフルオロアセトアミド−１−ドデシ
ル）−２′,3′−ジデオキシウリジン（60）の製造 実施例1Cに記載した一般手法に従い、保護されたアル
キニルアミン63を24時間で５−ヨード−２′,3′−ジデ
オキシウリジン（47,676.2mg,200ミリモル，実施例2Aに
記載した通りに製造）に結合させた。ジクロロメタン中
０〜５％メタノールで溶出させるシリカゲル（100g）ク
ロマトグラフ精製により暗赤色泡状物を得た。赤色不純
物をメタノール中40％水を用い逆相カラム（100g,40μ
ｍシリカゲル上のオクタデシルシラン，ベーカー）上に
おけるクロマトグラフにより除去した。適切が画分を併
せ、濃縮し、無水エタノールと２回共蒸発させて731mg
のアルキニルアミノヌクレオシド60を透明油状物として
得た。この物質は、残渣エタノール（25モル％、補正収
率73％）の存在を除きTLCおよびNMRにより均質であっ
た。
1H‐NMR（DMSO-d6）:11.49（幅広s,1H,H3）、9.38
（歪んだt,1H,NHTFA）、8.15（s,1H,H6）、5.90（dd,1
H,H1′）、5.12（歪んだt,1H,5′OH）、4.35（t,0.25H,
CH2CH2OH）、4.03（m,1H,H4′）、3.72および3.52（m,2
H,H5′）、3.43（m,0.5H,CH3CH 2OH）、3.16（５重線,2
H,−CH 2NHTFA）、2.34（t,2H,プロパルギルＨ）、2.16,
2.01および1.86（m,4H,H2′およびH3′）、1.65-1.15
（m,16H,(CH2)8）、および1.06（t,0.75H,CH 3CH2OH） 実施例12 ５−（５−アミノ−１−ペンチニル）−２′,3′−ジ
デオキシウリジン（64）の製造 （化合物64は、Hetがウラシル（ｈ）、R1が(CH2)3、
並びにR2、R3、R5、R6、R7およびR8がＨであるアルキル
アミノヌクレオチド（Ｉ）の例である） A.5−アミノ−１−ペンチン（65）の製造 ５−クロロペンチン（20.51g,0.200モルおよびヨウ化
ナトリウム（7.46g,0.050モル,0.25当量）を収容するボ
ンベ中にアンモニア（340g,20モル）を蒸留させた。こ
のボンベを封止し、オートクレーブ中100℃で12時間熱
した。アンモニアを蒸発させ、残渣を水酸化ナトリム
（40g,1.0モル,5当量）水（100ml）およびエーテル（10
0ml）からなる２相混合物とともに攪拌した。得られた
混合物をろ過した後、２層に分離させた。有機層を硫酸
マグネシウム上で乾燥し、20cmのVigreuxカラムを通し
て蒸留した。４つの画分（12.46g,沸点95〜127℃，大気
圧）はGCにより有意量の生成物を含んでいることがわか
った。これら画分を併せ、スピニングバンドカラムを通
して注意深く蒸留して6.55g（39％）の５−アミノ−１
−ペンチン（65）を無色流動性液体として得た（沸点12
5.5〜126℃）。この物質はGCによる＞99％１ピークであ
った。
1H‐NMR（CDCl3）:2.81（t,J＝7.5,2H,−CH 2NH2）、
2.27（td,J＝7.5および2.5,2H,HCCCH 2−）、1.96（t,J
＝2.5,1H,HCCCH2−）、1.66（％重線,J＝7.5,2H,−CH2C
H 2CH2−）および1.07（幅広s,2H,NH）。
B.保護されていないアルキニルアミン類のヨードヌクレ
オシド類への結合の一般手法。５−（５−アミノ−１−
ペンチン）−２′,3′−ジデオキシウリジン（64）の製
造 乾燥した35ml丸底フラスコに５−ヨード−２′,3′−
ジデオキシウリジン（47,676.2mg,2.00ミリモル，実施
例2Aに記載した通りに製造）を仕込み、アルゴンでフラ
ッシングした。乾燥ジメチルホルムアミド（10ml,オル
ドリッチ）、乾燥トリエチルアミン（0.56ml,4.0ミリモ
ル,2.0当量，シーブ上で貯蔵）、５−アミノ−１−ペン
チン（0.59ml,6.03ミリモル,3.0当量）およびテトラキ
ス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０）（23
1mg,0.200ミリモル,0.1当量、ドライボックス内のガラ
スビン中に秤量）を加えた。得られた懸濁液を45分間攪
拌したが、パラジウム触媒は少なくとも部分的に未溶解
のままであった。ヨウ化第１銅（190.4mg,1.00ミリモ
ル,0.5当量、アルドリッチ・ゴールド・ラベル）を加え
た。15分間攪拌した後、均質な青色溶液が生成し、約15
0分後溶液は曇った。200分後、TLCにより、出発のヨウ
化物47の全てが消費されたことが示された。４時間後、
反応混合物45℃,2Torrで約10分間ロータリーエバポレー
ターで濃縮した。残渣をすぐにシリカゲルカラム（100
g）上に吸収させ、ジクロロメタン、メタノールおよび
濃水酸化アンモニウム（90:9:1,85:13:2,75:20:5,65:3
0:5および50:45:5の各々400ml）の混合物で溶出させ
た。TLCによる主極性生成物を含む画分を併せ、エタノ
ールと２回共蒸発させ、一夜真空乾燥して395.9g（67
％）のアルキニルアミノヌクレオシド64を黄色固体とし
て得た。この物質は、真空乾燥で除去されなかったエタ
ノール（33モル％）の存在を除きTLCおよびNMRにより均
質であった。エタノールの存在に対して補正した64の収
率は64％であった。
1H‐NMR（DMSO-d6）:8.33（s,1H,H6）、5.90（dd,J＝
6,6および3.0,1H,H1′）、4.05（m,1H,H4′）、3.73（d
d,J＝12,1および2.8,1H,H5′ａ）、3.53（dd,J＝12.1お
よび3.1,1H,H5′ｂ）、2.80（幅広s,2H,−CH 2H2）、2.4
5（t,J＝7.0,2H,プロパルギルＨ）、2.28,2.02、および
1.86（m,4H,H2′およびH3′）、および1.70（５重線,J
＝7.0Hz,2H,−CH2CH 2CH2−）。このNMRデータは、上記
と同じ様の方法によって得た64の別のバッチのものから
得た。両物質のNMR試料における交換可能な水素（H3,
5′OH,および−NH2）についての信号は、これを併せ
て、ベースラインからほとんど解析できなかった単一の
幅広（幅＞2ppm）信号とした。
実施例13 ５−（３−アミノ−１−プロピニル）−２′,3′−ジ
デオキシウリジン（66）の製造 （化合物66は、Hetがウラシル（ｈ）、R1がCH2、並び
にR2、R3、R5、R6、R7およびR8がＨであるアルキニルア
ミノヌクレオチド（Ｉ）の例である） ５−アミノ−１−ペンチンの代りにプロパルギルアミ
ンを用いた以外は実施例12Bに記載した手法に従い、５
−ヨード−２′,3′−ジデオキシウリジン（47,2.00ミ
リモル）を３時間でプロパルギルアミン（6.00ミリモ
ル，オルドリッチ）に結合させた。上記したクロマトグ
ラフィーにより794.5mgの不純アアルキルアミノヌクレ
オシド66を黄色固体として得、これはTLCにより分析し
たところ、単一スポットを与えた。NMRおよび反応の物
質収支により、この物質はエタノールおよび恐らく無機
不純物により汚染されていることが示された。
1H‐NMR（DMSO-d6）:11.70（幅広s,1H,H3）、8.40
（s,1H,H6）、8.25（幅広s,2H,NH）、5.89（dd,J＝6.6
および3.0,1H,H1′）、5.13（t,J＝5.0,1H,5′OH）、4.
07（m,1H,H4′）、3.96（s,2H,−CH 2NH2）、3.71および
3.56（m,2H,H5′）、2.30,2.04および1.85（m,4H,H2′
およびH3′）、並びにエタノールおよび未知の不純物の
信号。このNMRデータは、0.2当量のヨウ化第１銅を用い
かつ反応を完結までさせなかった以外は上記と同様に製
造した66の別のバッチから取った。
実施例14 １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−（３−
アミノ−１−プロピニル）シトシントリホスフェート
（67）の製造 （化合物67は、R1が−CH2−、R2およびR3はＨ、Hetが
シトシン（ｉ）、R4が（ｇ）およびR5がP3O9H3-である
アルキニルアミノヌクレオチド（Ｉ）の例である） A.1−（２−ヒドロキシエトキメチル）−５−ヨードシ
トシン（68）の製造 １−（２−ヒドロキシエトキシメチル）シトシン（1.
85g,10.0ミリモル）および酢酸第１銅（3.35g,10.5ミリ
モル）をメタノール（50ml）およびジクロロメタン（10
0ml）中で還流させた。ヨウ素（3.05g,12.0ミリモル）
を加え、反応混合物を１時間攪拌した。遊離塩基型のAG
3-X4樹脂（38ミリ当量）を加え、この溶液に硫化水素を
15分間吹込んだ。ろ過により固形物を除去し、ろ液をシ
リカゲル（10g）上にストリッピングさせた。このシリ
カゲルをシリカゲルカラム（４×25cm）上に載せ、ジク
ロロメタン中５％、10％および20％メタノールで溶出さ
せた。蒸発および真空乾燥により、無色固体（1.73g,56
％）を得た。
95％エタノールから再結晶させて分析して純粋な物質
（融点172℃）を得た。C7HN3O3Iとして計算値:C27.03
％,H3.24％,N13.51％、実測値:C27.08％,H3.41％,N13.5
1％。UV（メタノール）：極大292.5（5300）。
1H‐NMR（DMSO-d6）:3.481（m,4H）、4.659（t,J＝5,
1H）、5.070（s,2H,6.665（幅広s,1H）、7.869（幅広s,
1H）および8.107（s,1H） B.1−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−（３−
トリフルオロアセトアミド−１−プロピニル）シトシン
（69）の製造 ヨウ化物68（311mg,1.00ミリモル）を、実施例1Cに詳
述した一般的な方法に従ってＮ−プロパルギルトリフル
オロアセトアミドに結合させた。ジクロロメタン中５
％、10％および20％メタノールを用いたシリカゲル（３
×20cm）上のフラッシュクロマトグラフィーにより、ア
ルキニルアミノヌクレオチド69を淡黄色の泡状物（77.4
mg,23％）として得た。
1H‐NMR（DMSO-d6）:3.472（幅広s,4.276（d,J＝5.0,
2H）、4.653（幅広t,J＝4.5,1H）、5.091（s,2H）、6.9
25（（幅広s,1H）、8.037（s,1H）及び9.964（幅広,1
H） C.1−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−５−（３−
アミノ−プロピニル）シトシン（67）の製造 実施例1Eの一般的手法に従い、アルキルアミノヌクレ
オチド69（0.167ミリモル）の糖部分の水酸基を、トリ
ホスフェートに転化し、トリフルオロアセチル基を除去
した。第２のアリコートのオキシ塩化リンを添加した
後、ホスホリル化を75分間行なった。生成物の吸収係数
が出発物質（7790）の吸収係数に等しいと仮定して、ト
リホスフェート67の収率は、291nmにおけるUV吸収に基
づいて、21％であった。
実施例15 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル2a（アルキニ
ルアミノヌクレオチド（R9及びR10がＨの場合）への505
nm蛍光色素の結合のための好ましい試薬）の製造 A.9−（カルボキシエチリデン）−3,6−ジヒドロキシ−
9H−キサンテン（SF-505）の製造 レゾルシノール（33.0g,0.300モル）及び無水コハク
酸（30.0g,0.300モル）を丸底フラスコに入れ窒素でパ
ージした。メタンスルホン酸（150ml）を加え、溶液を
窒素雰囲気下で２時間65℃で攪拌した。反応混合物を氷
冷水（１）に急速攪拌しながら滴下し、同時に50％水
性水酸化ナトリウムを添加してpHを2.5＋/0.5に保っ
た。粒状沈殿として出現した生成物をろ過回収し、水
（３×10ml）、次いでアセトン（３×100ml）で濯い
だ。生成物を空気乾燥し、次いで110℃18時間真空乾燥
（真空オーブン）して暗赤粉末（37.7g,88％）を得た。
分析試料を、生成物1.04を25mlの熱0.3NのHClに溶解
して調製した。冷却して生成した沈殿をろ過で除き、捨
てた。稀水性水酸化ナトリウムを添加してpHを1.25にあ
げた。生成沈殿をろ過回収し、水で濯ぎ、空気乾燥し、
次いでP2O5上で140℃で36時間真空乾燥した。分析：計
算〔Ｃ（16）Ｈ（12）Ｏ（５）〕C67.60,H4.26。実測:C
67.37,H4.34,0.52％水〔Ｋ−Ｆ〕 NMR（DMSO−d6）：（ほとんどスピロラクトン型）δ
2.690（t,J＝8.6hz,2H）;3.070（t,J＝8.6hz,2H）、6.5
30（d,J＝1.8hz,2H）;6.676（dd,J＝8.7,1.8hz,2H）、
7.432（d,J＝8.7,1.8hz,2H）、7.432（d,J＝8.7hz,2
H）、及び9.964（s,2H）.Vis.abs.（pH8.2;50mM aq Tri
s/HCl:max486nm（72,600）。
B.9−（２−カルボキシエチル）−3,6−ジアセトキシ−
９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF-505）の製造 SF-505（29.3g,103ミリモル）を氷冷却無水酢酸（500
ml）に添加し次いでピリジン（100ml）を加えた。混合
物を氷中で20分間攪拌し次いで急速攪拌氷冷却水（7l）
に20分間に亙つて加えた。更に30分間攪拌後、中間生成
物をろ過し、水（4l）に再懸濁し更に30分間攪拌した。
固体をろ過回収し、絶対エタノール（１）に溶解し45
分間還流した。溶液をロータリエバポレータで200mlま
で濃縮すると、結晶を生じた。生成物をろ過回収、空気
乾燥、次いで真空乾燥し、淡橙色微結晶を得た（21.9g,
51％）。塩化メチレン／シクロヘキサンからの再結晶で
無色微結晶を得た。M.P.142-143℃。分析：計算〔Ｃ（2
2）Ｈ（22）Ｏ（８）〕C6.63.76,H5.35、実測:C63.58,H
5.39.NMR（DMSO−d6）：δ1.035（t,J＝6.9hz,3H）、1.
667（m,2H）、2.232（m,2H）、2.294（s,6H）、2.888
（q,J＝6.9hz,2H）7.0−7.1（m,4H）、及び7.575（d,J
＝9.1hz,2H）。
C.9−（２−（Ｎ−スクシンイミジルキシカルボニ
ル））−エチル）−3,6−ジアセトキシ−９−エトキシ
−9H−キサンテン（Ac2EtSF-505-NHS）の製造 Ac2EtSF-505（10.4g,25.1ミリモル）を塩化メチレン
（300ml）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−
３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（9.70g,50.6
ミリモル）と混合し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（4.32g,37.5ミリモル）を加えた。混合物を１時間攪拌
して水で（５×50ml）で洗浄した。合せた水性層を塩化
メチレン（50ml）でバック抽出し、プールした有機層を
硫酸ナトリウム上で乾燥しストリップダウンした。エタ
ノール（75ml）とのトリテュレーション、次いでろ過、
空気乾燥により粗生成物が明黄色固体（c.10g）として
得られた。この物質を塩化メチレン（50ml）に溶解しシ
クロヘキサン（50ml）を加えた。茶さじ一杯チャーコー
ルを加え、混合物をろ過し、生成物を追加の部分のシク
ロヘキサン（100ml）で処理した。ろ過で回収、空気乾
燥、及び真空乾燥により、無色結晶（6.94g,54％）を得
た。エタノールからの第２の結晶化により分析試料を得
た。M.P:162-3℃。分析：計算〔Ｃ（26）Ｈ（25）Ｎ
（１）Ｏ（10）〕C61.05,H4.93,N2.74。実測:C60.78,H
5.01,N2.65。NMR（DM SO−d6）：δ1.056（t,J＝7.0hz,
3H）、2.4-2.1（m,4H）、2.293（s,6H）、2.757（s,4
H）、2.922（q,J＝7.0hz,2H）7.069（m,4H）、及び7.61
7（pd,J＝9.1hz,2H）。
D.9−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジルオキシカル
ボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−3,6−ジア
セトキシ−９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF-50
5-Sar−OBn）の製造 サルコシンベンジルエステル＊（1.13g,6.31ミリモ
ル）の塩化メチレン（50ml）溶液にAc2EtSF-505-NHS
（2.58g,5.05ミリモル）及び５％重炭酸ナトリウム水溶
液（30ml）を加えた。２層混合物を迅速に20時間攪拌し
た。層を分離し有機層を３×15mlの水で洗浄し、硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、25mlまで濃縮した。この溶液をシ
クロヘキサンで150mlまで希釈し、チャーコール処理
し、窒素流下で75mlまで減少させて生成物の沈殿を得
た。上澄みをデカントし、残渣を塩化メチレンと共蒸発
させて無色泡状物（1.70g,58％）を得た。
徹底した真空乾燥により分析試料を得た。分析：計算
〔Ｃ（32）Ｈ（33）Ｎ（１）Ｏ（９）〕C66.77,H5.78,N
2.43。実測:C66.66,H5.89.N2.25。NMR（DMSO−d6）：
（アミド結合回転異性体の5:2混合物を示す）δ（メジ
ャー及びマイナー）1.040及び1.018（t,J＝6.7hz,3
H）、1.789及び1.670（m,2H）、2.211（m,2H）、2.290
及び2.276（s,6H）、2.713及び2.695（s,3H）、2.893
（q,J＝6.7hz,2H）、3.963（s,2H）、5.075及び5.039
（s,2H）、7.044（m,4H）、7.324（m,5H）及び7.573及
び7.516（pd,J＝9.2hz,2H）＊ サルコシンベンジルエステルｐ−トシレート塩（アダ
ムスケミカル社）は塩化メチレンに取り、繰返し５％水
性重炭酸ナトリウムで繰返し洗浄し、次いで水で洗浄
し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリップダウンし
た。
E.9−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシンイミ
ジルオキシカルボニルメチル）カルボキサミド）エチ
ル）−3,6−ジアセトキシ−９−エトキシ−9H−エトキ
シ−9H−キサンテン（Ac2EtSF-505-Sar−NHS、構造2a）
の製造 Ac2EtSF-505-Sar−OBn（1.55g,2.69ミリモル）の絶対
エタノール（60ml）溶液に炭素（0.15g）上の10％パラ
ジウムを加えた。混合物を水素のバルーン圧力下で30分
間攪拌した。触媒をろ過で除去し、エタノールをストリ
ッピングするとシロップ状の残渣を得た。
この残渣を塩化メチレン（85ml）に溶解し、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド（0.495g,4.30ミリモル）及び１
−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ
ジイミドヒドロクロリド（1.12g,5.84ミリモル）を加え
た（４×25ml）。溶液を25mlまで濃縮し、シクロヘキサ
ンで175mlまで希釈し、チャーコール処理し、窒素流下
で75mlまで減少させた。固体生成物をろ過、空気乾燥、
真空乾燥で回収して無色粉末（0.97g,62％）を得た。塩
化メチレンとの共蒸発、続いて40℃での徹底した真空乾
燥により、痕跡のシクロヘキサン除き分析試料を無定形
固体として得た。分析：計算〔Ｃ（29）Ｈ（30）Ｎ
（２）Ｏ（11）〕C59.79,H5.19,N4.81。実測:C59.37,H
4.62.N4.62,0.93％水（Ｋ−Ｆ）。NMR（DMSO−d6）：
（アミド結合回転異性体の4:1混合物を示す）δ）（メ
ジャー及びマイナー）1.034（t,J＝6.9hz,3H）、1.827
及び1.935（m,2H）、2.223（m,2H）、2.289（s,6H）、
2.758（s,4H）、2.779及び2.894（s,3H）、2.888（q,J
＝6.8hz,2H）、4.333及び4.473（s,2H）、7.043（m,4
H）、7.587（pd,J＝9.1hz,2H）。
実施例16 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル2b（アルキニ
ルアミノヌクレオチド（R9がＨ及びR10がCH3の場合）へ
の512nm蛍光色素の結合のための好ましい試薬） A.4−メチルレゾルシノールの製造 気体入口及びバブラー出口を備えた丸底フラスコ中
で、2,4−ジヒドロキシベンズアルデヒド（33.97mg,0.2
46モル）（トルエンから再結晶）を分光グレードの２−
プロパノール（3l）に溶解した。炭素担持10％パラジウ
ム（1.35mg）、次いでリン酸（3ml）を加え、混合物を
窒素でスパージした。窒素流を水素流に切替え、混合物
を氷冷却しながら迅速に攪拌した。３時間後水素の吸収
が終了し、触媒をろ過で除いた。ろ過液を200mlまでス
トリッピングし、200mlの酢酸エチルを加えた。溶液を
４×200mlの水で洗浄し、合せた水抽出物を酢酸エチル
でバック抽出した。有機抽出物を水洗浄し、合せた有機
層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ストリッピングして生
成物を無色結晶固体として得た（29.95mg,98％）。M.
P.:106℃（Lit.106-107℃〔J.C.Bell,W.Bridge,A.Rober
ts on,J.Chem.Soc.,1542〜45（1937）。NMR（DMSO−
d6）：δ1.961（s.Me）、6.076（dd,H−6,J〔5,6〕＝8h
z,J〔2,6〕＝2hz）、6.231（d,H−２）、6.760（d.H−
５）、8.867（s,OH）、及び9.008（s,OH）。
B.9−カルボキシエチリデン−3,6−ジヒドロキシ−2,7
−ジメチル−9H−キサンテン（SF-512）の製造 ４−メチルレゾルシノール（25.8g,0.208モル）及び
無水コハク酸（20.8g,0.208モル）を丸底フラスコに入
れ、窒素でフラスコをパージした。メタンスルホン酸
（150ml）を加え、溶液を窒素下で65℃に２時間加熱し
た。溶液を１の急速攪拌、氷冷却水に滴下し、同時に
50％水性水酸化ナトリウムを添加してpHを2.25±0.25に
保った。生成物を遠心分離で回収し、水（３×）及びア
セトン（２×）で洗浄した。固体を空気乾燥し、次いで
110℃で真空乾燥して煉瓦赤色粉末（24.1g,74％）を得
た。
酢酸エチルを生成物のジメチルスルホキシド溶液に徐
々に拡散させることによって精製を行なった。沈殿をろ
過して回収し、空気乾燥し、次いで真空乾燥した。NMR
（DMSO−d6）：（水及びジメチルフルホキシドのそれぞ
れの１モルと共に純粋デルタ型を示す）δ2.124（s,6
H）、3.421（d.J＝7,2hz,2H、5.769（t,J＝7.2hz,1
H）、6.512（s,1H）,6.573（s,1H）、7.295（s,2H）、
9.681（s,1H）、9.825（s,1H）及び12.346（bs,1H）.Vi
s.abs.（pH8.2aq Tris）:max493.5nm。
C.9−カルボキシエチル−3,6−ジアセトキシ−2,7−ジ
メチル−９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF-51
2）の製造 SF-512の試料（20.0g,64.0ミリモル）を無水酢酸（35
0ml）に加え、次いでピリジン（80ml）を加えた。これ
を１時間攪拌しろ過して未反応色素の痕跡を除いた。ろ
過液を3.5lの急速攪拌水に注いだ。固体中間体をろ過で
回収し、2lの冷水に再懸濁し、15分間攪拌し、次いで再
回収し、空気乾燥してスピロラクトン中間体（20.8g）
を得た。これを絶対エタノール（600ml）に溶解し、45
分間還流した。溶液をチャーコール処理し、300mlまで
濃縮した。生成物をろ過で回収し、冷エタノール（２×
50ml）で濯ぎ、空間乾燥し、次いで真空乾燥して無色微
結晶（14.9g,53％）を得た。M.P:143℃。分析：計算
〔Ｃ（24）Ｈ（26）Ｏ（８）〕C65.15,H5.92。実測:C6
5.31,H5.92。NMR（DMSO−d6）：δ1.027（t,J＝6.9hz,3
H）、1.628（m,2H）、2.136（s,6H）、2.207（m,2H）、
2.303（s,6H）、2.884（q,6.9hz,2H）、6.939（s,2H）
及び7.417（s,2H）。
D.9−（２−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニ
ル）−エチル）−3,6−ジアセトキシ−2,7−ジメチル−
９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF-512-NHS）の
製造 （Ac2EtSF-512（9.42g,21.3ミリモル）の塩化メチレ
ン（175ml）溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（3.6
2g,31.5ミリモル）、直後に１−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド
（8.05g,42.0ミリモル）を加えた。溶液を室温で２時間
攪拌した。混合物を水（４×100ml）で洗浄し水性洗浄
を塩化メチレン（２×50ml）でバック抽出した。合せた
有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し油にストリップダウ
ンした。絶対エタノールを加え、スクラッチングで結晶
化を誘起した。生成物をろ過で回収し、空気乾燥し、次
いで真空乾燥して淡オレンジ色の微結晶を得た（9.80g,
85％）。
分析試料を、1gを塩化メチレン（10ml）に溶解し、シ
クロヘキサン（40ml）を加えて調製した。チャーコール
処理後冷却しスクラッチングにより結晶化を誘起して無
色結晶固体を得た。M.P:159℃。分析：計算〔Ｃ（28）
Ｈ（29）Ｎ（１）Ｏ（10）〕C62.33,H5.42,N2.60。実
測:C62.06,H5.71,N2.39。NMR（DMSO−d6）：δ1.053＝
（t,J＝6.9hz,3H）、2.149（s,6H）、2.304（s,6H）、
2.1-2.4（m,4H）、2.747（s,4H）、2.920（q,J＝6.9hz,
2H）、6.975（s,2H）、及び7.464（s,2H）。
E.9−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジルオキシカル
ボニル）−カルボキサミド）−エチル−3,6−ジアセト
キシ−2,7−ジメチル−９−エトキシ−9H−キサンテン
（Ac2EtSF-512-Sar-OBn）の製造 サルコシンベンジルエステル（0.72g,4.02ミリモル）
の塩化メチレン（25ml）溶液にAc2EtSF-512-NHS（1.73
g,3.21ミリモル）及び５％重炭酸ナトリウム水溶液（20
ml）を加えた。２相混合物を20時間迅速攪拌した。層を
分離し有機層を３×15ml水で洗浄し硫酸ナトリウム上で
乾燥し、10mlに濃縮した。溶液をシクロヘキサンで60ml
に希釈しチャーコール処理し窒素流下で25mlに減少させ
て生成物の沈殿を得た。上澄み液をデカンテーションし
無色固体に真空乾燥した（1.44g,74％）。
塩化メチレン／シクロヘキサンからの再結晶、チャー
コール処理で分析試料を得た。
M.P:150-2℃。分析：計算〔Ｃ（34）Ｈ（37）Ｎ
（１）Ｏ（９）〕C67.65,H6.18,N2.32。実測:C67.42,H
6.08.N2.33。NMR（DMSO−d6）：（アミド結合回転異性
体の5:2混合物を示す）δ（メージャー及びマイナー）
1.049及び1.008（t,J＝6.8hz,3H）、1.747及び1.66（m,
2H）、2.144及び2.115（s,6H）、2.18（m,2H）、2.314
及び2.303（s,3H）2.694（s,3H）、2.907及び2.884（q,
J＝6.8hz,2H）、3.961（s,2H）、5.075及び5.016（s,2
H）、6.960及び6.917（s,2H）、7.430及び7.396（s,2
H）、及び7.30（m,5H）。
F.9−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシンイミ
ジルオキシカルボニルメチル）カルボキサミド）エチ
ル）−3,6−ジアセトキシ−９−エトキシ−2,4,5,7−テ
トラメチル−9H−キサンテン（Ac2EtSF-512-Sar-NHS、
構造2b）の製造 （Ac2EtSF-512-Sar-OBn（0.45g,0.745モル）の絶対エ
タノール（20ml）懸濁液に炭素担持10％パラジウム（0.
05g）を添加した。混合物を水素のバルーン圧力下で30
分間攪拌した。触媒をろ過で除去し、エタノールをスト
リッピング除去してシロップ状残渣を得た。
この残渣を塩化メチレン（25ml）に溶解し、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド（0.129g,1.12ミリモル）及び１
−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カル
ボジイミドヒドロクロリド（0.292g,1.52ミリモル）を
加えた。混合物を30分間攪拌し、水で洗浄した（３×15
ml）。溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、10mlに濃縮
し、シクロヘキサンで40mlに希釈し、チャーコール処理
し、窒素流下で体積を20mlに減少させた。上澄液をデカ
ンテーションし、残渣を塩化メチレンから第２の沈殿処
理に付して無色粉末を得た（0.27g,59％）。分析：計算
〔Ｃ（31）Ｈ（34）Ｎ（２）Ｏ（11）〕C60.98,H5.61,N
4.59。実測:C60.28,H5.71,N4.40,1.08水（Ｋ−Ｆ）。NM
R（DMSO−d6）：（アミド結合の回りの回転異性体の5:1
混合物を示す）δ（メージャー及びマイナー）1.043
（t,J＝7.0hz,3H）、1.793及び1.933（m,2H）、2.145及
び2.133（s,6H）、2.198（m,2H）、2.314（s,6H）2.740
（s,4H）、2.778及び2.821（s,3H）、2.900（q,J＝7.0h
z,2H）、4.334及び4.469（s,2H）、6.960及び6.925（s,
2H）、及び7.441（s,2H）。
実施例17 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル2c（アルキニ
ルアミノヌクレオチド（R9がCH3及びR10がＨの場合）へ
の519nm蛍光色素の結合のための好ましい試薬）の製造 A.9−（２−カルボキシエチリデン）−3,6−ジヒドロキ
シ−4,5−ジメチル−9H−ヘキサンテン（SF-519）の製
造 ２−メチルレゾルシノール（37.2g,0.300モル）及び
無水コハク酸（30.0g,0.300モル）を丸底フラスコに入
れ、窒素でパージした。メタンスルホン酸（150ml）を
加え、溶液を窒素雰囲気下65℃で４時間攪拌した。反応
混合物を迅速攪拌氷冷水（１）に滴下し同時に50％水
性水酸化ナトリウムを添加してpHを6.0±0.5に保った。
遠心分離で微細に分離された固体を回収し、水で濯ぎ
（４×250ml）、毎回再懸濁し、スピニングし、上澄み
を捨てた。粗生成物を水（１）に懸濁し充分な水性水
酸化ナトリウム（50％）を加えpHを10.2にあげた。溶液
をろ過しろ液のpHを濃HClで1.2にした。生成物を遠心分
離で回収し、上記のように水（３×350ml）及びアセト
ン（３×250ml）で濯いだ。生成固体をトルエンと共沸
させ、ろ過回収し、110℃で真空乾燥して煉瓦赤色の粉
末を得た。（24.6g,53％）。分析：計算〔Ｃ（18）Ｈ
（16）Ｏ（５）〕C69.22,H5.16。実測:C68.95,H5.30,0.
80％水（Ｋ−Ｆ）。NMR（DMSO−d6）：〔ほとんどがデ
ルタ型〕δ2.164,（s,3H）、2.177（s,3H）、3.376（d,
J＝7.1hz,1H）、5.749（t,J＝7.2hz,1H）、6.642（d,J
＝8.8hz,1H）、6.672（d,J＝8,8hz,1H）、7.216（d,J＝
8.5hz,1H）、7.227（d,J＝8.5hz,1H）、9.602（bs,1
H）、及び9.758（bs,1H）、Vis.abs.（pH8.2:50mM aq T
ris/HCl）max500nm（69,800） B.9−（２−カルボキシエチル）−3.6−ジアセトキシ−
4,5−ジメチル−９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2Et
SF-519）の製造 SF-519（15.0g,48.0ミリモル）を無水酢酸（250ml）
に加え、固体を粉末化した（高不溶性SF-519を分散する
ため超音波処理が有効である。）懸濁液を氷冷し、ピリ
ジン（50ml）を加え、混合物を２時間攪拌した。溶液を
ろ過し、ゆっくりと、しかし一定の流れで迅速攪拌氷冷
水（4l）に加えた。更に20分間攪拌後、中間体生成物を
ろ過し、水（3l）に再懸濁し、更に25分間攪拌した。固
体をろ過で回収し、空気乾燥した。乾燥中間体を絶対エ
タノール（600ml）に溶解し、１時間還流した。溶液を
ロータリエバポレータで200mlに濃縮して結晶化を生じ
させた。生成物をろ過で回収し、空気乾燥し、次いで真
空乾燥して無色微結晶を得た（12.13g,57％）。
分析試料を塩化メチレン溶液からシクロヘキサンで沈
殿させて得た。NMR（DMSO−d6）：δ1.033（t,J＝6.9h
z,3H）、1.674（m,2H）、2.189（s,6H）、2.19（m,2
H）、2.348（s,6H）、2.878（q,J＝6.9hz,2H）、7.006
（d,J＝8.6hz,2H）、及び7.399（d,J＝8.6hz,2H）。
C.9−（２−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニ
ル）−エチル−3,6−ジアセトキシ−4,5−ジメチル−９
−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF-519-NHS）の製
造 Ac2EtSF-519-NHS（7.80g,17.6ミリモル）を塩化メチ
レン（175ml）と混合し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（2.75g,23.9ミリモル）及び１−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリ
ド（7.00g,36.5ミリモル）を加えた。混合物を90分間攪
拌し、水で洗浄した（５×100ml）。合せた水性層を塩
化メチレン（２×50ml）でバック抽出し、プールした有
機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、スリッピングした。
エタノール（100ml）でトリチュレートし、ろ過、空気
乾燥して明黄色固体として生成物を得た（7.45g,78
％）。
シクロヘキサン／塩化メチレンからの２回の再結晶に
より分析試料を得た。M.P:164-5℃。分析：計算〔Ｃ（2
8）Ｈ（29）Ｎ（１）Ｏ（10）〕C62.33,H5.42,N2.60。
実測:C62.17,H5.47,N2.48.NMR-（DMSO−d6）：δ1.051
（t,J＝7.0hz,3H）、2.4-2.1（m,4H）、2.191（s,6
H）、2.337（s,6H）、2.715（s,4H）、2.912（q,J＝8.6
hz,2H）、及び7.429（d,J＝8.6hz,2H）。
D.9−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジルオキシカル
ボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−3,6−ジア
セトキシ−4,5−ジメチル−９−エトキシ−9H−キサン
テン（Ac2EtSF-519-Sar-OBn）の製造 サルコシンベンジルエステル（0.557g,3.11ミリモ
ル）の塩化メチレン（19ml）溶液にAc2EtSF-519-NHS
（1.30g,2.4ミリモル）及び５％重炭酸ナトリウム水溶
液（15ml）を加えた。２相混合物を18時間急速攪拌し
た。層を分離し有機層を３×10mlで洗浄し、硫酸ナトリ
ウム上で乾燥し10mlに濃縮した。溶液をシクロヘキサン
で40mlに希釈し、チャコール処理し、窒素流下で20mlに
減少させると粘着性固体として生成物の沈殿を生じた。
上澄みをデカンテーションし、残渣を塩化メチレンと共
沸し、無色泡状物を得た（0.97g,67％）。
徹底した真空乾燥により分析試料を得た。分析：計算
〔Ｃ（34）Ｈ（37）Ｎ（１）Ｏ（９）〕C67.65,H6.18,N
2.32。実測:C67.43,H6.37.N2.32。NMR（DMSO−d6）（ア
ミド結合回転異性体の5:2混合物を示す）：δ（メージ
ャー及びマイナー）1.044及び1.020（t,J＝7.0hz,3
H）、1.824及び1.714（m,2H）、2.17（m,2H）、2.195及
び2.169（s,6H）、2.346及び2.337（s,6H）、2.720及び
2.691（s,3H）、2.889（q,J＝7.0hz,2H）、3.959及び3.
988（s,2H）、5.073及び5.048（s,2H）、7.000及び6.95
4（d,J＝8,6hz,2H）、及び7.45-7.25（m,7H）。
E.9−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ−スクシンイミジ
ルオキシカルボニルメチル）カルボキサミド（エチル）
−3,6−ジアセトキシ−4,5−ジメチル−９−エトキシ−
9H−キサンテン（Ac2EtSF-519-Sar-NHS構造2c）の製造 （Ac2EtSF-519-Sar-OBn（1.35g,2.24ミリモル）の絶
対エタノール（50ml）溶液に炭素担持10％パラジウム
（0.13g）を加えた。混合物を水素バルーン圧力下た20
時間攪拌した。触媒をろ過で除き、エタノールをストリ
ッピング除去してシロップ状態残渣を得た。
残渣を塩化メチレン（50ml）に溶解し、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（0.39g,3.39ミリモル）及び１−（３
−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイ
ミドヒドロクロリド（1.57g,8.19ミリモル）を加えた。
混合物を75分間攪拌した後、水で洗浄した（４×15m
l）。溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、25mlに濃縮
し、シクロヘキサンで125mlに希釈し、チャコール処理
し、体積を窒素流下で50mlべ減少させた。上澄みをデカ
ンテーションし、残留油を塩化メチレン（5ml）でと
り、急速攪拌シクロヘキサン（75ml）に滴下し、無色粉
末（0.587g,43％）を得た。
分析試料を得るため生成物の一部を塩化メチレンにと
り、モレキュラシーブ上で乾燥し、窒素流下で蒸発さ
せ、最終的に乾燥ピストル中48℃で五酸化リン上で20時
間乾燥した。分析：計算〔Ｃ（31）Ｈ（34）Ｎ（２）Ｏ
（11）〕C60.98,H5.61,N4.59。実測:C60.15,H5.71N4.5
1。NMR-（DMSO−d6）（アミド結合回転異性体の4:1混合
物を示す）δ（メージャー及びマイナー）1.039（t,J＝
6.9hz,3H）、1.841及び1.945（m,2H）、2.19（m,2H）、
2.194（s,6H）、2.345（s,6H）、2.767及び2.744（s,4
H）、2.778及び2.825（s,3H）、2.888（q,J＝6.9hz,2
H）、4.328及び4.461（s,2H）、7.000（d,J＝8,6hz,2
H）、及び7.410（d,J＝8,6hz,2H）。
実施例18 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル2d（R9及びR
10がCH3であるアルキニルアミノ−ヌクレオチドに526nm
色素を結合するために好ましい試薬）の製造 A.2,4−ジヒドロキシ−３−メチルベンズアルデヒドの
製造 オキシ塩化リン（80ml,0.86モル）をＮ−メチルホル
ムアニリド（102ml,0.82モル）のエーテル（250ml）中
攪拌混合物に加えた。この混合物を１時間室温で攪拌し
た後、氷で冷却した。２−メチルレゾルシノール（オル
ドリッチ、100g,0.81モル）を加え、混合物を一夜攪拌
しながら放置して室温に暖めた。沈殿した中間生成物を
ろ過で回収し、エーテルで濯いだ（３×）。中間体をア
セトン（250ml）及び水（250ml）の混合物に溶解し、30
分間攪拌して加水分解した。水（2l）を加え、混合物を
沸騰させた後、放置して冷却し、結晶生成物を沈殿させ
た。これを２回目に水（4l）から再結晶させて純粋生成
物（70g,57％）を得た。M.P:150℃。（Lit.152-3℃〔W.
Baker et al J.Chem.Soc.2834-5,（1948）〕）NMR（DMS
O−d6：δ1.973（s,3H）、6.551（d,J＝8.5hz,1H）、7.
428（d,J＝8,5hz,1H）、9.703（s,1H）、10.745（s,1
H）及び11.592（s,1H）。
B.2,4−ジメチルレゾルシノールの製造 磁気攪拌機を備えた5l3つ口フラスコ内で2,4−ジヒド
ロキシ−３−メチルベンズアルデヒド（30.0g,197ミリ
モル）とイソプロパノール（3l）の溶液を氷冷した。リ
ン酸（4ml）及び炭素担持10％パラジウムを加え、窒素
で次いで水素でスパージした。吸収が完了したと判定さ
れた時（約1.5時間）、溶液を再び窒素でスパージし、
次いでセライト（登録商標）を通してろ過した。溶媒を
ストリッピング除去し残渣を酢酸エチルに取り、生成溶
液を水で洗浄した（４×100ml）。水洗液を酢酸エチル
でバック抽出し、合せた有機層を硫酸ナトリウム上で乾
燥し、ストリッピングした。昇華（95°,0.05トール）
により無色固体（19.6qg,72％）を得た。M.P:107-8℃
（Lit.108-9℃〔W.Baker et al J.Chem.Soc.2834-5,（1
948）〕）NMR（DMSO−d6：δ1.969（s,3H）、2.037（s,
3H）、6.220（d,J＝8.1hz,1H）6.637（d,J＝8,1hz,1
H）、7.929（s,1H）及び8.785（s,1H）。
C.9−（２−カルボキシエチリデン）−3,6−ジヒドロキ
シ−2,4,5,7−テトラメチル−9H−キサンテン（SF-52
6）製造 2,4−ジメチルレゾルシノール（28.4g,0.205モル）及
び無水コハク酸（20.0g,0.200モル）を丸底フラスコに
入れ、窒素でパージした。メタンスルホン酸（231ml）
を添加し、溶液を70℃で20時間窒素雰囲気下で攪拌し
た。反応混合物を水性水酸化ナトリウム（150mlの水中9
5g）と氷（3l）の急速攪拌混合物に滴下した。充分量の
メタンスルホン酸を添加して最終pHを4.7から1.5にし
た。生成固体を遠心分離で回収し、懸濁、スピニングダ
ウン及び水からのデカンテーション（５×1.2l）により
洗浄した。最終懸濁液をろ過で回収し、空気乾燥した
後、110℃で６時間オーブン乾燥して煉瓦赤色固体を得
た（30.6g,44％）。
アルカリ性溶液からの第２の沈殿，遠心分離及び水洗
により分析試料を得た。分析：計算〔Ｃ（16）Ｈ（12）
Ｏ（５）〕70.57,H5.92。実測:70.39,H6.00,0.12％（Ｋ
−Ｆ）。NMR（DMSO−d6）（ほとんどがスピロラクトン
型）：δ2.172（s,12H）、2.508（m,2H）、及び7.604
（s,2H）Vis.abs（pH8.2;50mM aq Tris/HCl:509nm（71,
300）。
D.9−（２−カルボキシエチル）−3,6−ジアセトキシ−
９−エトキシ−2,4,5,7−テトラメチル−9H−キサンテ
ン（Ac2EtSF-526）の製造 SF-526（25.2g,74ミリモルを氷冷無水酢酸（450ml）
に加えた後、ピリジン（100ml）を加え、混合物を氷冷
しながら150分間攪拌した。反応混合物をろ過した後、
ゆっくりした定常流で急速攪拌氷冷水（7l）に加え、更
に30分間攪拌後、中間生成物をろ過し、水洗し、水（4
l）中に再懸濁し、更に30分間攪拌した。固体をろ過で
回収し、空間乾燥してスピロラクトン中間体を得た（2
8.9g）。この中間体の一部（18.6g）を絶対エタノール
（１）に溶解し、90分間還流した。溶液をロタリエバ
ポレータで300mlに濃縮し結晶を生じさせた。生成物を
ろ過で回収し、エタノールで濯ぎ、空間乾燥した後、真
空乾燥して無色微結晶を得た（11.6g、用いた中間体の
量を基準にして52％）。
塩化メチレン／シクロヘキサンからの再結晶、チャコ
ール処理で無色微結晶を得た。M.P:154〜155℃、塩化メ
チレンからの２回の蒸発でシクロヘキサンの痕跡を除き
分析に供した。分析：計算〔Ｃ（30）Ｈ（33）Ｎ（１）
Ｏ（10）〕C6.48,H5.86,N2.47。実測:C63.08,H6.00,N2.
37。NMR（DMSO−d6：δ1.058（（t,J＝6.9hz,3H）、2.1
36（s,6H）、2.155（s,6H）、2.228（m,4H）,2.371（s,
6H）、2.748（s,4H）,2.918（q,J＝6.9hz,2H）及び7.30
0（s,2H）。
F.9−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（ベンジルオキシカル
ボニルメチル）カルボキサミド）エチル）−3,6−ジア
セトキシ−９−エトキシ−9H−キサンテン（Ac2EtSF-50
5-Sar-OBn）の製造 サルコシンベンジルエステル（0.72g,4.02ミリモル）
の塩化メチレン（40ml）溶液にAc2EtSF-526-NHS（1.82
g,3.21ミリモル）及び５％重炭酸ナトリウム水溶液（30
ml）を加えた。２相混合物を急速に20時間攪拌した。こ
の層を分離し、有機層を４×15mlの水で洗浄し、硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、15mlに濃縮した。溶液をシクロヘ
キサンで100mlに希釈し、チャーコル処理し、窒素流下
で50mlに減少させて生成物の沈殿を得た。ろ過後空気乾
燥して無色固体を得た（0.96g,47％）。
塩化メチレンとの共沸後徹底した真空乾燥により分析
試料を得た。分析：計算〔Ｃ（36）Ｈ（41）Ｎ（１）Ｏ
（９）〕C68.45,H6.54,N2.22。実測:C68.29,H6.70.N2.0
7。NMR（DMSO−d6）（アミド結合回転異性体の5:2混合
物を示す）：δ（メージャー及びマイナー）1.049及び
1.027（t,J＝6.8hz,3H）、1.783及び1.700（m,2H）、2.
129及び2.099（s,6H）、2.159及び（s,6H）、2.14（m,2
H）、2.379及び2.371（s,6H）、2.699及び2.690（s,3
H）、2.873（q,J＝6.8hz,2H）、3.958及び3.976（s,2
H）、5.075及び5.019（s,2H）、7.266及び7.233（s,2
H）及び7.25-7.40（m,5H）。
G.9−（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（Ｎ′−スクシンイミ
ジルオキシカルボニルメチル）カルボキサミドエチル）
−3,6−ジアセトキシ−９−2,4,5,7−テトラメチル−9H
−キサンテン（Ac2EtSF-526-Sar-NHS,構造2dの製造 Ac2EtSF-526-Sar-OBn（0.96g,1.52ミリモル）の絶対
エタノール（40ml）溶液に炭素担持10％パラジウム（0.
10g）を添加した。混合物を水素バルーン圧力下で30分
間攪拌した。触媒をろ過で除き、エタノールをストリッ
ピング除去してシロップ状残渣を得た。
この残渣を塩化メチレン（40ml）に溶解し、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド（0.26g,2.26ミリモル及び１−
（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボ
ジイミドヒドロクロリド（0.59g,3.08ミリモル）を加え
た。混合物を30分間攪拌した後、水洗した（４×15m
l）。溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、15mlに濃縮
し、シクロヘキサンで100mlに希釈し、チャコール処理
し窒素流下で体積を50mlに減少させた。生成物をろ過で
回収し、空気乾燥して無色微結晶を得た（0.573g,59
％）。
塩化メチレンとの共沸後、40℃での徹底した真空乾燥
によりシクロヘキサンを除き、無定形固体として分析試
料を得た。NMR（DMSO−d6）：δ1.043（t,J＝6.7hz,3
H）、1.82（m,2H）、2.130（s,6H）、2.157（s,6H）、
2.15（m,2H）、2.378（s,6H）、2.748（s,4H）、2.778
（s,3H）、2.891（q,J＝6.7hz,2H）、4.327（s,2H）及
び7.275（s,2H）。
実施例19 アルキニルアミノヌクレオチドとＮ−ヒドロキシスク
シンイミドとの結合の一般方法 蛍光標識連鎖停止アルキニルアミノヌクレオチド34〜
37の製造 アルキニルアミノヌクレオチドトリホスフェイト49
（10マイクロモル、実施例3Jから）を水（0.050ml）に
とり、ジメチルホルムアミド（0.100ml）で希釈した。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル2a（12.3mg,21
マイクロモル、2.1eq,実施例15Eから）のジメチルホル
ムアミド（0.100ml）溶液を加え混合物を50°で４時間
攪拌した。濃水酸化アンモニウム（0.25ml）を加え、反
応容器に栓をし、50°での加熱を25分間継続した。生成
赤色溶液を水で10mlに希釈し、DEAE−セファデックス
（Sephadex）A-25-120（１×19cm床）のカラムに適用し
た。これは1.0MのpH7.6水性TEAB（50ml）、次いで0.2M
のpH7.6水性TEAB（50ml）で平衡化した。カラムを0.4M
（150ml）から0.7M（150ml）のpH7.6水性TEABの直線勾
配で溶出した。カラムを３分毎に100ml/時回収フラクシ
ョンで駆動した。溶出液は498nm（40AUFS）で吸光度を
観測した。２少ない副産物のバンドが先ず溶出した後、
ベースライン解像を有するより強い生成物バンドが溶出
した。純粋生成物を含むと考えられる画分をプールし、
ストリッピングし（Ｔ＜30°）、３回絶対エタノールと
共蒸発し、水（0.74ml）にとった。溶液を可視吸収（pH
8.2の50mM水性Trisバッファー）により評価し、凍結乾
燥した。生成物の稀溶液は487.5nmに最大吸収を示し
た。生成物の吸収係数を遊離色素のもの（72,600）に等
しいと考えると、標識アルキニルアミノ−ヌクレオチド
37の収量は4.2マイクロモル（42％）であった。
上記方法で、Hetが７−デアザグアニン（ｋ）である
蛍光標識連鎖ターミネーター37を製造した。蛍光標識連
鎖ターミネーター34（Hetがウラシル（ｈ）である、35
（シトシン（ｉ））、及び36（７−デアザアデノシン
（ｊ））が、アルキニルアミノ−ヌクレオチドトリホス
フェート46，42及び51と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド2d，2c，及び2bとを、それぞれ結合させることによ
り、同様の方法に従って製造された。他の蛍光標識ヌク
レオチドトリホスフェートも同じ方法で製造された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｆ 9/6561 Ｚ 9155−4Ｈ Ｃ０７Ｈ 19/10 19/14 19/20 // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9453−4Ｂ (72)発明者 チャールス・ウイリアム・ロバートソン・ ジュニア アメリカ合衆国、デラウエア州 19732, ロックランド、ピー・オー・ボックス 154 (72)発明者 フランク・ワーデン・ホッブス・ジュニア アメリカ合衆国、デラウエア州 19809, ウイルミントン、プライアー・ロード 2227−エフ (72)発明者 ジョージ・レナード・トレイナー アメリカ合衆国、ペンシルバニア州 19342，グレン・ミルズ、マーシャル・ロ ード ７ (72)発明者 アンソニー・ジョセフ・コカッザ アメリカ合衆国、デラウエア州 19809, ウイルミントン、ライトハウス・ロード 306

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の構造を有するアルキニルアミノヌクレ
    オチド： Nuc−Ｃ≡Ｃ−R1−R2R3 〔式中、R1は、C1〜C10の直鎖アルキレン基、 R2およびR3は、独立して、Ｈ、C1〜C4アルキル基又は保
    護基、及びNucは、次の構造： （ここで、Ｚは、Ｈ又はNH2）を有するR4−Hetであり、
    かつR4は次のものである： （ここで、R5はＨ、PO3H2、P2O6H3、P3O9H4又はその塩
    であり、 （ｉ）R7＝R8＝Ｈである場合、R6＝Ｈ、OH、Ｆ、N3又は
    NH2、又は （ii）R7＝ＨかつR8＝OHである場合、R6＝Ｈ又はOH、又
    は （iii）R7＝OHかつR8＝Ｈである場合、R6はOHであ
    る。）〕。
  2. 【請求項２】R1が−CH2−基である特許請求の範囲第１
    項記載のアルキニルアミノヌクレオチド。
  3. 【請求項３】R2がＨであり、R3がＨ又は保護基である特
    許請求の範囲第１項記載のアルキニルアミノヌクレオチ
    ド。
  4. 【請求項４】R4が鎖末端糖である特許請求の範囲第１項
    記載のアルキニルアミノヌクレオチド。
  5. 【請求項５】次の工程を包含する７−（３−アミノ−１
    −プロピニル）−２′,3′−ジデオキシグアノシン５′
    −トリホスフェートの製造方法： （Ａ）水素化ナトリウムの存在下で、６−メトキシ−２
    −メチルチオ−７−デアザプリンと１−クロロ−２−デ
    オキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トリオイル−α−Ｄ−リボ
    フラノースとを接触させる工程、 （Ｂ）塩基性条件下で工程（Ａ）のエステル生成物９を
    ジオール10に加水分解する工程、 （Ｃ）ジオール10の５−OH位置をトリチル基で保護する
    工程、 （Ｄ）中間体チオノカルボネートを水素化スズ還元剤で
    還元して３−OH基を除く工程、 （Ｅ）工程（Ｄ）で生成するジデオキシデアザプリン12
    をＮ−ヨードスクシンイミドで処理して７−ヨード誘導
    体13を生成する工程、 （Ｆ）化合物13をヘキサメチルホスホルアミド中でナト
    リウムチオクレゾレートと接触させて７−デアザプリン
    −６−オン14を生成する工程、 （Ｇ）化合物14をメタ−クロロパーオキシ安息香酸及び
    アンモニアで順次処理して７−デアザグアノシン15を得
    る工程、 （Ｈ）Ｎ−プロパルギルトリフルオロアセトアミドを脱
    保護７−ヨード化合物16とカップリングして７−（３−
    トリフルオロアセトアミド−１−プロピニル）−２′,
    3′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンを得る工程、
    及び （Ｉ）工程（Ｈ）の生成物を５′−トリホスフェートに
    変換し次いで脱保護する工程。
  6. 【請求項６】式Nuc−Ｃ≡Ｃ−R1−R2R3 〔式中、R1は、C1〜C10の直鎖アルキレン基、 R2およびR3は、独立して、Ｈ、C1〜C4アルキル基又は保
    護基、及びNucは、次の構造： （ここで、Ｚは、Ｈ又はNH2）を有するR4−Hetであり、
    かつR4は次のものである： （ここで、R5はＨ、PO3H2、P2O6H3、P3O9H4又はその塩
    であり、 （ｉ）R7＝R8＝Ｈである場合、R6＝Ｈ、OH、Ｆ、N3又は
    NH2、又は （ii）R7＝ＨかつR8＝OHである場合、R6＝Ｈ又はOH、又
    は （iii）R7＝OHかつR8＝Ｈである場合、R6はOHであ
    る。）〕で表わされるアルキニルアミノヌクレオチド
    を、当該複素環塩基内の炭素原子にヨウ素原子が結合し
    たNucとHC≡Ｃ−R1−R2R3で示される末端アルキニルア
    ミンとをビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムジ
    クロライド／ヨウ化第一銅触媒を用いて結合させること
    により製造するにあたり、テトラキス（トリフェニルホ
    スフィン）パラジウム（０）／ヨウ化第一銅触媒を用い
    ることを特徴とするアルキニルアミノヌクレオチドの製
    造方法。
  7. 【請求項７】複素環塩基内の炭素原子にヨウ素原子が結
    合したNucが、式 で示される特許請求の範囲第６項記載の製造方法。
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