JPH085919B2 - 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法 - Google Patents
唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法Info
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- JPH085919B2 JPH085919B2 JP1292687A JP29268789A JPH085919B2 JP H085919 B2 JPH085919 B2 JP H085919B2 JP 1292687 A JP1292687 A JP 1292687A JP 29268789 A JP29268789 A JP 29268789A JP H085919 B2 JPH085919 B2 JP H085919B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、体液中の唾液−α−アミラーゼ活性のみを
阻害するモノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓−
α−アミラーゼの分別定量法に関する。
阻害するモノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓−
α−アミラーゼの分別定量法に関する。
（従来の技術） α−アミラーゼは、澱粉、ポリサッカライド、グリコ
ーゲン等のα−1,4−グリコシド結合をランダムに加水
分解する酵素である。体液中のα−アミラーゼは、様々
な疾患によりその含量が著しく変動するので、診断学上
重要であるが、血中や尿中のα−アミラーゼは、全く異
なった臓器である膵臓と唾液腺に由来するアイソザイム
として存在するため、総α−アミラーゼ活性を測定して
も確定的な診断は困難である。そこでα−アミラーゼの
由来を限定すること、つまり、α−アミラーゼアイソザ
イムの分別定量が必要であり、特に、膵臓α−アミラー
ゼは膵臓疾患のマーカーとしてきわめて重要である。
ーゲン等のα−1,4−グリコシド結合をランダムに加水
分解する酵素である。体液中のα−アミラーゼは、様々
な疾患によりその含量が著しく変動するので、診断学上
重要であるが、血中や尿中のα−アミラーゼは、全く異
なった臓器である膵臓と唾液腺に由来するアイソザイム
として存在するため、総α−アミラーゼ活性を測定して
も確定的な診断は困難である。そこでα−アミラーゼの
由来を限定すること、つまり、α−アミラーゼアイソザ
イムの分別定量が必要であり、特に、膵臓α−アミラー
ゼは膵臓疾患のマーカーとしてきわめて重要である。
α−アミラーゼアイソザイムの分画法は従来、電気泳
動法、小麦由来インヒビター法が一般に行われている
が、前者は、操作が煩雑で時間がかかるという欠点を有
し、後者は、小麦インヒビターによるα−アミラーゼア
イソザイムに対する選択性が十分でない上に、その阻害
率がロット、添加量、反応時間により変化するという欠
点を有する。また、膵臓−α−アミラーゼに対するモノ
クローナル抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ（EI
A）法による膵臓−α−アミラーゼ測定法が開発された
が、やはり結果を得るまでに長時間を要する。
動法、小麦由来インヒビター法が一般に行われている
が、前者は、操作が煩雑で時間がかかるという欠点を有
し、後者は、小麦インヒビターによるα−アミラーゼア
イソザイムに対する選択性が十分でない上に、その阻害
率がロット、添加量、反応時間により変化するという欠
点を有する。また、膵臓−α−アミラーゼに対するモノ
クローナル抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ（EI
A）法による膵臓−α−アミラーゼ測定法が開発された
が、やはり結果を得るまでに長時間を要する。
一方、特開昭58-183098号には、１種類のモノクロー
ナル抗体を用いた免疫阻害法による可溶性澱粉を基質と
して用いる膵臓−α−アミラーゼの測定が実施例として
掲載されている。しかし、ここで用いられているモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマの入手は困難で
あり、さらに、この抗体を用いた測定試薬も上市されて
いない。また、最近、２種類のモノクローナル抗体を用
いた免疫阻害法によるα−アミラーゼアイソザイム測定
法が開発された（特公昭63-2600号）。これは、唾液酵
素を97％よりも少なく特異的に阻害する第１モノクロー
ナル抗体を、この酵素を10％よりも少なく阻害する第２
モノクローナル抗−唾液−α−アミラーゼ−抗体と組み
合わせて使用することを特徴とする膵臓−α−アミラー
ゼの特異的測定法であり、この方法を利用した測定試薬
が現在市販されている。しかし、この方法の場合、唾液
−α−アミラーゼに対する阻害は97.5％以下である。
ナル抗体を用いた免疫阻害法による可溶性澱粉を基質と
して用いる膵臓−α−アミラーゼの測定が実施例として
掲載されている。しかし、ここで用いられているモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマの入手は困難で
あり、さらに、この抗体を用いた測定試薬も上市されて
いない。また、最近、２種類のモノクローナル抗体を用
いた免疫阻害法によるα−アミラーゼアイソザイム測定
法が開発された（特公昭63-2600号）。これは、唾液酵
素を97％よりも少なく特異的に阻害する第１モノクロー
ナル抗体を、この酵素を10％よりも少なく阻害する第２
モノクローナル抗−唾液−α−アミラーゼ−抗体と組み
合わせて使用することを特徴とする膵臓−α−アミラー
ゼの特異的測定法であり、この方法を利用した測定試薬
が現在市販されている。しかし、この方法の場合、唾液
−α−アミラーゼに対する阻害は97.5％以下である。
（発明が解決しようとする課題） 免疫阻害法によるα−アミラーゼアイソザイム分別定
量は現在、最も優れていると考えられるが、この方法の
場合でも、前記のごとく、唾液−α−アミラーゼに対す
る阻害が97.5％以下であり、唾液−α−アミラーゼの影
響を十分には回避できているとはいえず、残存する2.5
％以上の唾液−α−アミラーゼ活性が診断上しばしば混
乱を引き起こすことになる。
量は現在、最も優れていると考えられるが、この方法の
場合でも、前記のごとく、唾液−α−アミラーゼに対す
る阻害が97.5％以下であり、唾液−α−アミラーゼの影
響を十分には回避できているとはいえず、残存する2.5
％以上の唾液−α−アミラーゼ活性が診断上しばしば混
乱を引き起こすことになる。
免疫阻害法によるα−アミラーゼアイソザイムの測定
において、用いる抗体が２種類以上のモノクローナル抗
体の組合せである場合、これまではそれらの抗体を唾液
−α−アミラーゼをそのままか、あるいは化学的に修飾
したものを動物に免疫することにより、各々、別個に作
製した部分的に唾液−α−アミラーゼ活性を阻害するモ
ノクローナル抗体のなかから選び出しているため、酵素
活性をほぼ完全に抑えることのできるような抗体の組合
せを捜し出すためには、多くの労力が必要であるうえ、
その組合せは偶然性に依存するものである。
において、用いる抗体が２種類以上のモノクローナル抗
体の組合せである場合、これまではそれらの抗体を唾液
−α−アミラーゼをそのままか、あるいは化学的に修飾
したものを動物に免疫することにより、各々、別個に作
製した部分的に唾液−α−アミラーゼ活性を阻害するモ
ノクローナル抗体のなかから選び出しているため、酵素
活性をほぼ完全に抑えることのできるような抗体の組合
せを捜し出すためには、多くの労力が必要であるうえ、
その組合せは偶然性に依存するものである。
ところで、エム・エム・ベンキランら（M.M.Benkiran
e et al.）、モレキュラー．イムノロジー（Mol.Immuno
l）、1987 24（12）p1309-1315は、ヒト−TSHと抗ヒト
−TSHモノクローナル抗体の免疫複合体を動物に免疫し
て、その免疫複合体に対するモノクローナル抗体を作製
し、ラジオイムノアッセイ （RIA）に用いている。
e et al.）、モレキュラー．イムノロジー（Mol.Immuno
l）、1987 24（12）p1309-1315は、ヒト−TSHと抗ヒト
−TSHモノクローナル抗体の免疫複合体を動物に免疫し
て、その免疫複合体に対するモノクローナル抗体を作製
し、ラジオイムノアッセイ （RIA）に用いている。
本発明者はこの方法を発展させることにより、より優
れた唾液−α−アミラーゼ活性に対する阻害度を有する
モノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を
完成するに至った。
れた唾液−α−アミラーゼ活性に対する阻害度を有する
モノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を
完成するに至った。
（課題を解決するための手段） 本発明は膵臓−α−アミラーゼ活性を全く阻害せず、
唾液−α−アミラーゼ活性のみを部分的に阻害する第一
のモノクローナル抗体と唾液−α−アミラーゼとの免疫
複合体で動物を免疫して得ることができる第二のモノク
ローナル抗体であって、IgG1サブクラスに属し、50％飽
和硫酸アンモニウムで沈澱し、生理食塩水に対する透析
後、1.5Mグリシン−3.0M NaCL（pH9.0）溶液との等量混
合物とすることにより、プロテインＡと結合し、プロテ
インＡカラムクロマトグラフィーにおいて0.1Mクエン酸
（pH3.0）溶液で溶出し、単独では膵臓−α−アミラー
ゼ活性を全く阻害せず、唾液−α−アミラーゼ活性のみ
を85％以下しか阻害しないが、該第一のモノクローナル
抗体と組み合わせると、唾液−α−アミラーゼ活性のみ
を99％以上阻害する唾液−α−アミラーゼ活性阻害モノ
クローナル抗体を提供するものである。また、本発明は
ヒト−α−アミラーゼの唾液型（Ｓ）と膵臓型（Ｐ）の
アイソザイムを含む試料中の膵臓型アイソザイムを、唾
液型アイソザイムの活性を阻害して分別定量するに際
し、前記第一のモノクローナル抗体と本発明の第二のモ
ノクローナル抗体を組み合わせて用いることを特徴とす
る膵臓−α−アミラーゼの分別定量法も提供する。
唾液−α−アミラーゼ活性のみを部分的に阻害する第一
のモノクローナル抗体と唾液−α−アミラーゼとの免疫
複合体で動物を免疫して得ることができる第二のモノク
ローナル抗体であって、IgG1サブクラスに属し、50％飽
和硫酸アンモニウムで沈澱し、生理食塩水に対する透析
後、1.5Mグリシン−3.0M NaCL（pH9.0）溶液との等量混
合物とすることにより、プロテインＡと結合し、プロテ
インＡカラムクロマトグラフィーにおいて0.1Mクエン酸
（pH3.0）溶液で溶出し、単独では膵臓−α−アミラー
ゼ活性を全く阻害せず、唾液−α−アミラーゼ活性のみ
を85％以下しか阻害しないが、該第一のモノクローナル
抗体と組み合わせると、唾液−α−アミラーゼ活性のみ
を99％以上阻害する唾液−α−アミラーゼ活性阻害モノ
クローナル抗体を提供するものである。また、本発明は
ヒト−α−アミラーゼの唾液型（Ｓ）と膵臓型（Ｐ）の
アイソザイムを含む試料中の膵臓型アイソザイムを、唾
液型アイソザイムの活性を阻害して分別定量するに際
し、前記第一のモノクローナル抗体と本発明の第二のモ
ノクローナル抗体を組み合わせて用いることを特徴とす
る膵臓−α−アミラーゼの分別定量法も提供する。
該第一のモノクローナル抗体は膵臓−α−アミラーゼ
活性を全く阻害せず、唾液−α−アミラーゼ活性のみを
部分的に阻害するいずれのモノクローナル抗体でもよ
く、例えば、唾液−α−アミラーゼを抗原として動物に
免疫し、該動物の抗体産生細胞と動物のミエローマ細胞
とを常法に従い、融合させて得られる。ミエローマ細胞
としては、マウスのミエローマ細胞FOが好ましいが、そ
の他の細胞も用いることができる。細胞融合法として
は、ポリエチレングリコール法、HVJ法、電気融合法等
を挙げることができる。得られたハイブリドーマを、例
えば、適当な培地で培養し、その培養液中の抗体を唾液
−α−アミラーゼに作用させた後、残存するα−アミラ
ーゼ活性を測定して、適当なモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを選択する。この様にして得られる
第一のモノクローナル抗体は、例えば、膵臓−α−アミ
ラーゼ活性を全く阻害せず、唾液−α−アミラーゼ活性
のみを10％以上阻害するものが好ましいが、単独ではア
イソザイムの測定には使用できないいずれのものでもよ
い。
活性を全く阻害せず、唾液−α−アミラーゼ活性のみを
部分的に阻害するいずれのモノクローナル抗体でもよ
く、例えば、唾液−α−アミラーゼを抗原として動物に
免疫し、該動物の抗体産生細胞と動物のミエローマ細胞
とを常法に従い、融合させて得られる。ミエローマ細胞
としては、マウスのミエローマ細胞FOが好ましいが、そ
の他の細胞も用いることができる。細胞融合法として
は、ポリエチレングリコール法、HVJ法、電気融合法等
を挙げることができる。得られたハイブリドーマを、例
えば、適当な培地で培養し、その培養液中の抗体を唾液
−α−アミラーゼに作用させた後、残存するα−アミラ
ーゼ活性を測定して、適当なモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを選択する。この様にして得られる
第一のモノクローナル抗体は、例えば、膵臓−α−アミ
ラーゼ活性を全く阻害せず、唾液−α−アミラーゼ活性
のみを10％以上阻害するものが好ましいが、単独ではア
イソザイムの測定には使用できないいずれのものでもよ
い。
本発明のモノクローナル抗体（第二のモノクローナル
抗体）は、該第一のモノクローナル抗体と唾液−α−ア
ミラーゼとの免疫複合体を免疫原として動物に投与し、
第一のモノクローナル抗体と同様にして作製した第二の
モノクローナル抗体産生のハイブリドーマから得られ
る。この免疫原に用いた免疫複合体の残存酵素活性に対
する阻害作用を調べることにより、第二のモノクローナ
ル抗体を選択することができる。これにより、従来の第
一および第二のモノクローナル抗体を個別に作製する方
法に比べて第一のモノクローナル抗体と組み合わせるべ
き第二のモノクローナル抗体をハイブリドーマ作製の段
階でより効果的に選抜することが可能となる。
抗体）は、該第一のモノクローナル抗体と唾液−α−ア
ミラーゼとの免疫複合体を免疫原として動物に投与し、
第一のモノクローナル抗体と同様にして作製した第二の
モノクローナル抗体産生のハイブリドーマから得られ
る。この免疫原に用いた免疫複合体の残存酵素活性に対
する阻害作用を調べることにより、第二のモノクローナ
ル抗体を選択することができる。これにより、従来の第
一および第二のモノクローナル抗体を個別に作製する方
法に比べて第一のモノクローナル抗体と組み合わせるべ
き第二のモノクローナル抗体をハイブリドーマ作製の段
階でより効果的に選抜することが可能となる。
得られたハイブリドーマを、例えば、適当な培地で培
養し、その培養上清から第二のモノクローナル抗体を分
離精製する。あるいは、該ハイブリドーマをこれを適合
性のある哺乳動物の腹腔内に投与し、増殖させ、その動
物の腹水より第二のモノクローナル抗体を分離精製す
る。前者の方法で用いる培地としては、ダルベッコ改変
イーグル培地、RPMI 1640培地、市販の無血清培地等が
挙げられる。分離精製は硫酸アンモニウム塩析、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等で行える。
養し、その培養上清から第二のモノクローナル抗体を分
離精製する。あるいは、該ハイブリドーマをこれを適合
性のある哺乳動物の腹腔内に投与し、増殖させ、その動
物の腹水より第二のモノクローナル抗体を分離精製す
る。前者の方法で用いる培地としては、ダルベッコ改変
イーグル培地、RPMI 1640培地、市販の無血清培地等が
挙げられる。分離精製は硫酸アンモニウム塩析、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等で行える。
かくして得られた本発明の第二のモノクローナル抗体
はIgG1サブクラスに属し、50％飽和硫酸アンモニウムで
沈澱する。また、この沈澱を生理食塩水に溶解し、生理
食塩水に透析後、等量の1.5Mグリシン‐3.0M NaCL（pH
9.0）溶液と混合するとプロテインＡと結合し、プロテ
インＡのカラムクロマトグラフィーにおいて0.1Mクエン
酸溶液（pH3.0）で溶出されるようになる。該第二のモ
ノクローナル抗体は単独では膵臓−α−アミラーゼ活性
を全く阻害せず、唾液−α−アミラーゼ活性のみを85％
以下しか阻害しないが、該第一のモノクローナル抗体と
組み合わせると、唾液−α−アミラーゼ活性のみを99％
以上阻害する。
はIgG1サブクラスに属し、50％飽和硫酸アンモニウムで
沈澱する。また、この沈澱を生理食塩水に溶解し、生理
食塩水に透析後、等量の1.5Mグリシン‐3.0M NaCL（pH
9.0）溶液と混合するとプロテインＡと結合し、プロテ
インＡのカラムクロマトグラフィーにおいて0.1Mクエン
酸溶液（pH3.0）で溶出されるようになる。該第二のモ
ノクローナル抗体は単独では膵臓−α−アミラーゼ活性
を全く阻害せず、唾液−α−アミラーゼ活性のみを85％
以下しか阻害しないが、該第一のモノクローナル抗体と
組み合わせると、唾液−α−アミラーゼ活性のみを99％
以上阻害する。
本発明の膵臓−α−アミラーゼ分別定量法は、公知の
免疫阻害法に従い、血液、尿等の被検試料と第一および
第二モノクローナル抗体を混合して試料中の唾液−α−
アミラーゼ活性を不活化するための第一段階と、その後
酵素活性を測定するための第二段階の２ステップ法で行
うことができる。また、第一段階の抗原抗体反応は、酵
素活性測定の条件（温度、pH、塩濃度等）で迅速に進む
ために、酵素活性測定の可能な従来の自動分析装置に、
容易に適用することができる。α−アミラーゼ活性を測
定するための系は、全ての公知の方法を使用することが
できる。例えば、合成基質であるパラントロフェンルマ
ルトペプタオシドを用いる市販のα−アミラーゼ測定試
薬（オートパックα−アミラーゼ、西独ベーリンガー・
マンハイム社製）のR1溶液に、精製モノクローナル抗体
を適当量添加することにより行う。この試薬は、自動分
析機、例えば、日立−705、日立−7150等に適用ができ
る。これらを用いて市販のα−アミラーゼアイソザイム
スタンダード（キャリブザイムAMY［P,S］、国際試薬、
製品番号7892）や唾液−α−アミラーゼ標品（米国シグ
マ社、製品番号A0521）を測定することにより、それぞ
れのアイソザイムに対する阻害を知ることができる。
免疫阻害法に従い、血液、尿等の被検試料と第一および
第二モノクローナル抗体を混合して試料中の唾液−α−
アミラーゼ活性を不活化するための第一段階と、その後
酵素活性を測定するための第二段階の２ステップ法で行
うことができる。また、第一段階の抗原抗体反応は、酵
素活性測定の条件（温度、pH、塩濃度等）で迅速に進む
ために、酵素活性測定の可能な従来の自動分析装置に、
容易に適用することができる。α−アミラーゼ活性を測
定するための系は、全ての公知の方法を使用することが
できる。例えば、合成基質であるパラントロフェンルマ
ルトペプタオシドを用いる市販のα−アミラーゼ測定試
薬（オートパックα−アミラーゼ、西独ベーリンガー・
マンハイム社製）のR1溶液に、精製モノクローナル抗体
を適当量添加することにより行う。この試薬は、自動分
析機、例えば、日立−705、日立−7150等に適用ができ
る。これらを用いて市販のα−アミラーゼアイソザイム
スタンダード（キャリブザイムAMY［P,S］、国際試薬、
製品番号7892）や唾液−α−アミラーゼ標品（米国シグ
マ社、製品番号A0521）を測定することにより、それぞ
れのアイソザイムに対する阻害を知ることができる。
（実施例） 以下に実施例を挙げてさらに詳しく本発明を説明す
る。
る。
実施例１ 第一のモノクローナル抗体の作製 ヒト−唾液−α−アミラーゼ標品（米国シグマ社、製
品番号A0521）100μｇをフロイント・コンプリート・ア
ジュバント（FCA）と共にオス８週令のマウスに背部皮
下投与し免疫を開始した。１ケ月後に、唾液−α−アミ
ラーゼ50μｇをフロイント・インコンプリート・アジュ
バント（FIA）と共に背部皮下投与し追加免疫を行い、
さらに１ケ月後、50μｇ唾液−α−アミラーゼを腹腔内
に投与し最終免疫を行った。３日後、脾臓を摘出し、ポ
リエチレングリコール（PEG）4000を細胞融合促進剤と
して、常法によりマウスミエローマ細胞FOと融合させ
た。融合細胞はHAT選抜後、唾液−α−アミラーゼ活性
阻害モノクローナル抗体産生細胞を選択した。選択に
は、合成基質であるパラントロフェニルマルトペプタオ
シドを用いる市販のα−アミラーゼ測定試薬（ネスコー
トAMY-V2、日本商事（株）製）を利用した。まず、約50
0IU/lのアイソアミラーゼスタンダード溶液（Ｐ型およ
びＳ型α−アミラーゼ、西独ベーリンガー・マンハイム
社製、製品番号836176）に同量のハイブリドーマ培養上
清を加え約30分間反応させた。この反応後10μｌにα−
アミラーゼ測定試薬のR1の溶液（α−Ｄ−グルコシダー
ゼ含有）300μｌを添加し５分間インキュベート後、R2
溶液（ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシ
ド含有）25μｌを添加して主波長415nm、副波長480nmで
吸光度の変化を測定した。対照としてハイブリドーマ培
養上清の代わりにミエローマ培養上清を用いた。唾液−
α−アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを、限界希釈法によりクローニングし
た。得られたクローンから唾液−α−アミラーゼ活性の
みを部分的に阻害し、膵臓−α−アミラーゼ活性を全く
阻害しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを選び、NHAMY-2と命名した。これをダルベッコ改変
イーグル培地で大量培養した。培養上清に硫酸アンモニ
ウムを50％飽和となるまで加えて塩析し、沈澱を遠心分
離した。これを生理食塩水に溶解後、生理食塩水を外液
とし、４℃で20時間透析した。得られた透析内液を等量
の1.5Mグリシン−3.0M-NaCl（pH9.0）溶液と混合し、プ
ロテインＡのカラムクロマトグラフィーに付し、同じ溶
液で洗浄した。ついで、0.1Mクエン酸（pH3.0）溶液で
溶出させ、溶出液を280nmの吸光度でモニターしながら
蛋白画分を分取し、IgG1サブクラスに属する精製した第
一のモノクローナル抗体を得た。α−アミラーゼ測定試
薬（オートパックα−アミラーゼ、西独ベーリンガー・
マンハイム社製）のR1溶液に、精製モノクローナル抗体
を60μg/mlの濃度で添加し、日立−7150自動分析装置を
用いて唾液−および膵臓−α−アミラーゼスタンダード
（キャリブザイムAMY［P,S］、国際試薬、製品番号789
2）の活性を測定した。同時に、対照として抗体無添加
の同測定試薬を用いて測定することにより、第一のモノ
クローナル抗体の唾液−および膵臓−α−アミラーゼに
対する阻害度を測定した。その結果を第１表に示す。
品番号A0521）100μｇをフロイント・コンプリート・ア
ジュバント（FCA）と共にオス８週令のマウスに背部皮
下投与し免疫を開始した。１ケ月後に、唾液−α−アミ
ラーゼ50μｇをフロイント・インコンプリート・アジュ
バント（FIA）と共に背部皮下投与し追加免疫を行い、
さらに１ケ月後、50μｇ唾液−α−アミラーゼを腹腔内
に投与し最終免疫を行った。３日後、脾臓を摘出し、ポ
リエチレングリコール（PEG）4000を細胞融合促進剤と
して、常法によりマウスミエローマ細胞FOと融合させ
た。融合細胞はHAT選抜後、唾液−α−アミラーゼ活性
阻害モノクローナル抗体産生細胞を選択した。選択に
は、合成基質であるパラントロフェニルマルトペプタオ
シドを用いる市販のα−アミラーゼ測定試薬（ネスコー
トAMY-V2、日本商事（株）製）を利用した。まず、約50
0IU/lのアイソアミラーゼスタンダード溶液（Ｐ型およ
びＳ型α−アミラーゼ、西独ベーリンガー・マンハイム
社製、製品番号836176）に同量のハイブリドーマ培養上
清を加え約30分間反応させた。この反応後10μｌにα−
アミラーゼ測定試薬のR1の溶液（α−Ｄ−グルコシダー
ゼ含有）300μｌを添加し５分間インキュベート後、R2
溶液（ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシ
ド含有）25μｌを添加して主波長415nm、副波長480nmで
吸光度の変化を測定した。対照としてハイブリドーマ培
養上清の代わりにミエローマ培養上清を用いた。唾液−
α−アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを、限界希釈法によりクローニングし
た。得られたクローンから唾液−α−アミラーゼ活性の
みを部分的に阻害し、膵臓−α−アミラーゼ活性を全く
阻害しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを選び、NHAMY-2と命名した。これをダルベッコ改変
イーグル培地で大量培養した。培養上清に硫酸アンモニ
ウムを50％飽和となるまで加えて塩析し、沈澱を遠心分
離した。これを生理食塩水に溶解後、生理食塩水を外液
とし、４℃で20時間透析した。得られた透析内液を等量
の1.5Mグリシン−3.0M-NaCl（pH9.0）溶液と混合し、プ
ロテインＡのカラムクロマトグラフィーに付し、同じ溶
液で洗浄した。ついで、0.1Mクエン酸（pH3.0）溶液で
溶出させ、溶出液を280nmの吸光度でモニターしながら
蛋白画分を分取し、IgG1サブクラスに属する精製した第
一のモノクローナル抗体を得た。α−アミラーゼ測定試
薬（オートパックα−アミラーゼ、西独ベーリンガー・
マンハイム社製）のR1溶液に、精製モノクローナル抗体
を60μg/mlの濃度で添加し、日立−7150自動分析装置を
用いて唾液−および膵臓−α−アミラーゼスタンダード
（キャリブザイムAMY［P,S］、国際試薬、製品番号789
2）の活性を測定した。同時に、対照として抗体無添加
の同測定試薬を用いて測定することにより、第一のモノ
クローナル抗体の唾液−および膵臓−α−アミラーゼに
対する阻害度を測定した。その結果を第１表に示す。
かくして得られたハイブリドーマNHAMY-2は1989年10
月25日付けで工業技術院微生物工業研究所に受託番号FE
RM P-11067として寄託してある。
月25日付けで工業技術院微生物工業研究所に受託番号FE
RM P-11067として寄託してある。
実施例２ 第二のモノクローナル抗体の作製 ハイブリドーマNHAMY-2の産生する第一のモノクロー
ナル抗体と唾液−α−アミラーゼとの抗原抗体複合体を
調製した。即ち、第一のモノクローナル抗体および唾液
−α−アミラーゼ標品を生理的リン酸緩衝液（PBS）中
でモル比1:2となるように混合し、抗原抗体反応により
複合体を生成せしめた。抗原抗体複合体はセファクリル
S-200カラムクロマトグラフィーにより精製した。精製
した複合体200μｇをリビ アジュバント システム（R
AS）と共にオス８週令のマウスに腹腔内投与し免疫を開
始した。１ケ月後に、さらに50μｇを腹腔内投与し追加
免疫を行い、さらに１ケ月後、50μｇを腹腔内に投与し
最終免疫を行った。３日後、脾臓を摘出しPEG4000を細
胞融合促進剤として、常法によりマウスミエローマ細胞
FOと融合させた。融合細胞はHAT選抜後、NHAMY-2から得
られた第一のモノクローナル抗体・唾液−α−アミラー
ゼ複合体に対する活性阻害モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを選択し、NHAMY-3と命名した。得られたハ
イブリドーマをダルベッコ改変イーグル培地で大量培養
し、培養上清に硫酸アンモニウムを50％飽和となるまで
加えて塩析し、沈澱を遠心分離した。これを生理食塩水
に溶解後、生理食塩水を外液とし、４℃で20時間透析し
た。得られた透析内液を等量の1.5Mグリシン−3.0M-NaC
l（pH9.0）溶液と混合し、プロテインＡのカラムクロマ
トグラフィーに付し、同じ溶液で洗浄した。ついで、0.
1Mクエン酸（pH3.0）溶液で溶出させ、溶出液を280nmの
吸光度でモニターしながら蛋白画分を分取し、IgG1に属
する精製した第二のモノクローナル抗体を得た。α−ア
ミラーゼ測定試薬（オートパックα−アミラーゼ、西独
ベーリンガー・マンハイム社製）のR1溶液に、精製した
第二のモノクローナル抗体を60μg/mlの濃度で添加した
ものおよびこれにさらに第一のモノクローナル抗体60μ
g/mlの濃度で添加したものを用いて、日立−7150自動分
析装置により唾液−および膵臓−α−アミラーゼスタン
ダード（キャリブザイムAMY［P,S］、国際試薬、製品番
号7892）の活性を測定した。同時に、対照として抗体無
添加の同測定試薬を用いてα−アミラーゼスタンダード
の活性を測定した。これらの測定値より各阻害度を算出
した。その結果を第２表に示す。
ナル抗体と唾液−α−アミラーゼとの抗原抗体複合体を
調製した。即ち、第一のモノクローナル抗体および唾液
−α−アミラーゼ標品を生理的リン酸緩衝液（PBS）中
でモル比1:2となるように混合し、抗原抗体反応により
複合体を生成せしめた。抗原抗体複合体はセファクリル
S-200カラムクロマトグラフィーにより精製した。精製
した複合体200μｇをリビ アジュバント システム（R
AS）と共にオス８週令のマウスに腹腔内投与し免疫を開
始した。１ケ月後に、さらに50μｇを腹腔内投与し追加
免疫を行い、さらに１ケ月後、50μｇを腹腔内に投与し
最終免疫を行った。３日後、脾臓を摘出しPEG4000を細
胞融合促進剤として、常法によりマウスミエローマ細胞
FOと融合させた。融合細胞はHAT選抜後、NHAMY-2から得
られた第一のモノクローナル抗体・唾液−α−アミラー
ゼ複合体に対する活性阻害モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを選択し、NHAMY-3と命名した。得られたハ
イブリドーマをダルベッコ改変イーグル培地で大量培養
し、培養上清に硫酸アンモニウムを50％飽和となるまで
加えて塩析し、沈澱を遠心分離した。これを生理食塩水
に溶解後、生理食塩水を外液とし、４℃で20時間透析し
た。得られた透析内液を等量の1.5Mグリシン−3.0M-NaC
l（pH9.0）溶液と混合し、プロテインＡのカラムクロマ
トグラフィーに付し、同じ溶液で洗浄した。ついで、0.
1Mクエン酸（pH3.0）溶液で溶出させ、溶出液を280nmの
吸光度でモニターしながら蛋白画分を分取し、IgG1に属
する精製した第二のモノクローナル抗体を得た。α−ア
ミラーゼ測定試薬（オートパックα−アミラーゼ、西独
ベーリンガー・マンハイム社製）のR1溶液に、精製した
第二のモノクローナル抗体を60μg/mlの濃度で添加した
ものおよびこれにさらに第一のモノクローナル抗体60μ
g/mlの濃度で添加したものを用いて、日立−7150自動分
析装置により唾液−および膵臓−α−アミラーゼスタン
ダード（キャリブザイムAMY［P,S］、国際試薬、製品番
号7892）の活性を測定した。同時に、対照として抗体無
添加の同測定試薬を用いてα−アミラーゼスタンダード
の活性を測定した。これらの測定値より各阻害度を算出
した。その結果を第２表に示す。
かくして得られたハイブリドーマNHAMY-3は1989年10
月25日付けで工業技術院微生物工業研究所に受託番号FE
RM P-11068で寄託してある。
月25日付けで工業技術院微生物工業研究所に受託番号FE
RM P-11068で寄託してある。
実施例３ 唾液−α−アミラーゼ、膵臓−α−アミラーゼスタン
ダード（キャリブザイムAMY［P,S］、国際試薬、製品番
号7892）を蒸留水で溶解し、それぞれ1431,1211 IU/Lの
標準液を調製した。さらに両標準液を所定の割合（5:
0、4:1、3:2、2:3、1:4および0:5）で混合しα−アミラ
ーゼアイソザイム含量既知の標準液を作製した。
ダード（キャリブザイムAMY［P,S］、国際試薬、製品番
号7892）を蒸留水で溶解し、それぞれ1431,1211 IU/Lの
標準液を調製した。さらに両標準液を所定の割合（5:
0、4:1、3:2、2:3、1:4および0:5）で混合しα−アミラ
ーゼアイソザイム含量既知の標準液を作製した。
次に、α−アミラーゼ測定試薬（ネスコートAMY-V2、
日本商事（株）製）のR1溶液にハイブリドーマNHAMY-2
およびNHAMY-3の生産するモノクローナル抗体をそれぞ
れ60μg/mlおよび100μg/mlの濃度で添加し膵臓−α−
アミラーゼ測定試薬を作製した。この測定試薬を用い
て、前記標準液中の膵臓−α−アミラーゼ活性を日立−
7150自動分析装置で測定した。第１図に示すごとく、抗
体を添加した膵臓−α−アミラーゼ測定試薬を用いるこ
とにより、混在する唾液−α−アミラーゼの影響を受け
ずに膵臓−α−アミラーゼを測定することができた。
日本商事（株）製）のR1溶液にハイブリドーマNHAMY-2
およびNHAMY-3の生産するモノクローナル抗体をそれぞ
れ60μg/mlおよび100μg/mlの濃度で添加し膵臓−α−
アミラーゼ測定試薬を作製した。この測定試薬を用い
て、前記標準液中の膵臓−α−アミラーゼ活性を日立−
7150自動分析装置で測定した。第１図に示すごとく、抗
体を添加した膵臓−α−アミラーゼ測定試薬を用いるこ
とにより、混在する唾液−α−アミラーゼの影響を受け
ずに膵臓−α−アミラーゼを測定することができた。
実施例４ 市販のアミラーゼ測定試薬（ネスコートAMY-V2、日本
商事（株）製）のR1溶液にハイブリドーマNHAMY-2およ
びNHAMY-3の生産するモノクローナル抗体をそれぞれ60
μg/mlの濃度で添加し膵臓−α−アミラーゼ測定試薬を
作製した。この測定試薬と，合成基質であるパラントロ
フェニルマルトペプタオシドを用いる市販のα−アミラ
ーゼアイソザイム測定試薬（アイソアミラーゼ測定用試
薬PNP、ベーリンガー・マンハイム社製 製品番号97975
9）を用いてヒト血清中の膵臓−α−アミラーゼを日立
−7150で測定し、その測定値を比較した（第２図参
照）。
商事（株）製）のR1溶液にハイブリドーマNHAMY-2およ
びNHAMY-3の生産するモノクローナル抗体をそれぞれ60
μg/mlの濃度で添加し膵臓−α−アミラーゼ測定試薬を
作製した。この測定試薬と，合成基質であるパラントロ
フェニルマルトペプタオシドを用いる市販のα−アミラ
ーゼアイソザイム測定試薬（アイソアミラーゼ測定用試
薬PNP、ベーリンガー・マンハイム社製 製品番号97975
9）を用いてヒト血清中の膵臓−α−アミラーゼを日立
−7150で測定し、その測定値を比較した（第２図参
照）。
（発明の効果） 本発明によれば、免疫阻害法により、高い精度で膵臓
−α−アミラーゼを分別定量することができ、膵臓疾患
の診断の精度を向上できる。
−α−アミラーゼを分別定量することができ、膵臓疾患
の診断の精度を向上できる。
第１図は、濃度既知のα−アミラーゼアイソザイム混合
標準液を本発明法による膵臓−α−アミラーゼ測定試薬
で活性を測定した結果を示すグラフであり、横軸は標準
液中の膵臓（Ｐ）型と唾液（Ｓ）型α−アミラーゼの含
有および混合比を、縦軸は各測定試薬の実測値を示す。
第２図は、本発明法による膵臓−α−アミラーゼ測定試
薬で得られたヒト血清中の膵臓−α−アミラーゼ活性測
定値と市販アイソアミラーゼ測定試薬で得られた同測定
値の相関関係を表すグラフである。
標準液を本発明法による膵臓−α−アミラーゼ測定試薬
で活性を測定した結果を示すグラフであり、横軸は標準
液中の膵臓（Ｐ）型と唾液（Ｓ）型α−アミラーゼの含
有および混合比を、縦軸は各測定試薬の実測値を示す。
第２図は、本発明法による膵臓−α−アミラーゼ測定試
薬で得られたヒト血清中の膵臓−α−アミラーゼ活性測
定値と市販アイソアミラーゼ測定試薬で得られた同測定
値の相関関係を表すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭61−164161（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−22600（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−155134（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−183098（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】膵臓−α−アミラーゼ活性を全く阻害せ
ず、唾液−α−アミラーゼ活性のみを部分的に阻害する
第一のモノクローナル抗体と唾液−α−アミラーゼとの
免疫複合体で動物を免疫して得ることができる第二のモ
ノクローナル抗体であって、 IgG1サブクラスに属し、 50％飽和硫酸アンモニウムで沈澱し、 生理食塩水に対する透析後、1.5Mグリシン−3.0M NaCl
（pH9.0）溶液との等量混合物とすることにより、プロ
テインＡと結合し、 プロテインＡカラムクロマトグラフィーにおいて0.1Mク
エン酸（pH3.0）溶液で溶出し、 単独では膵臓−α−アミラーゼ活性を全く阻害せず、唾
液−α−アミラーゼ活性のみを85％以下しか阻害しない
が、該第一のモノクローナル抗体と組み合わせると、唾
液−α−アミラーゼ活性のみを99％以上阻害することを
特徴とする唾液−α−アミラーゼ活性阻害モノクローナ
ル抗体。 - 【請求項２】該第一のモノクローナル抗体がNHAMY-2（F
ERM P-11067）のハイブリドーマから産生されるもので
あり、該第二のモノクローナル抗体がNHAMY-3（FERM P-
11068）のハイブリドーマから産生されるものである請
求項（１）記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】ヒト−α−アミラーゼの唾液型と膵臓型の
アイソザイムを含む試料中の膵臓型アイソザイムを、唾
液型アイソザイムの活性を阻害して分別定量するに際
し、請求項（１）または（２）記載の第一のモノクロー
ナル抗体と、第二のモノクローナル抗体とを組み合わせ
て用いることを特徴とする分別定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1292687A JPH085919B2 (ja) | 1989-11-10 | 1989-11-10 | 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1292687A JPH085919B2 (ja) | 1989-11-10 | 1989-11-10 | 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03151892A JPH03151892A (ja) | 1991-06-28 |
| JPH085919B2 true JPH085919B2 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=17785002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1292687A Expired - Fee Related JPH085919B2 (ja) | 1989-11-10 | 1989-11-10 | 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH085919B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0736544B1 (en) * | 1995-04-05 | 2001-10-24 | Unilever Plc | Oral care compositions |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58183098A (ja) * | 1982-04-20 | 1983-10-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | アイソザイム分別定量法 |
| DE3342736A1 (de) * | 1983-11-25 | 1985-06-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Hybridoma-antikoerper |
| DE3500526A1 (de) * | 1985-01-09 | 1986-07-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Spezifisch hemmender s-amylase-mak |
| DE3525926A1 (de) * | 1985-07-19 | 1987-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von pankreas-alpha-amylase |
-
1989
- 1989-11-10 JP JP1292687A patent/JPH085919B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03151892A (ja) | 1991-06-28 |
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