JPH0862212A - タキサン環骨格をもつ化合物の検出、検定、及び単離法 - Google Patents
タキサン環骨格をもつ化合物の検出、検定、及び単離法Info
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- JPH0862212A JPH0862212A JP7130962A JP13096295A JPH0862212A JP H0862212 A JPH0862212 A JP H0862212A JP 7130962 A JP7130962 A JP 7130962A JP 13096295 A JP13096295 A JP 13096295A JP H0862212 A JPH0862212 A JP H0862212A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は植物供給源、或いは生物工学的供給
源のいずれであってもよいタキソール、１０−デアセチ
ルバッカチンＩＩＩ（ＤＡＢ）或いはそれらの同族体を
検定し、また単離する方法を提供することを目的とす
る。 【構成】 サクシニル−タキソール、及びウシアルブミ
ンとコンジュゲートしたサクシニル−ＤＡＢで免疫した
メンドリの卵黄から製造した多クローンＩｇＹ抗体を用
いて植物源或いは生物工学源のタキソール、１０−デア
セチルバッカチンＩＩＩ、或いはそれらの同族体を検定
し、また単離する。例えば、植物抽出物、細胞、又は微
生物培養培地から上記のタキサン類を選択的に分離する
為にこれらの抗体をマトリックス上に固定し、イムノア
フィニティークロマトグラフィーにより抗原であるタキ
ソール、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、或いはそ
れらの同族体を収量良く又高純度で単離する。
源のいずれであってもよいタキソール、１０−デアセチ
ルバッカチンＩＩＩ（ＤＡＢ）或いはそれらの同族体を
検定し、また単離する方法を提供することを目的とす
る。 【構成】 サクシニル−タキソール、及びウシアルブミ
ンとコンジュゲートしたサクシニル−ＤＡＢで免疫した
メンドリの卵黄から製造した多クローンＩｇＹ抗体を用
いて植物源或いは生物工学源のタキソール、１０−デア
セチルバッカチンＩＩＩ、或いはそれらの同族体を検定
し、また単離する。例えば、植物抽出物、細胞、又は微
生物培養培地から上記のタキサン類を選択的に分離する
為にこれらの抗体をマトリックス上に固定し、イムノア
フィニティークロマトグラフィーにより抗原であるタキ
ソール、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、或いはそ
れらの同族体を収量良く又高純度で単離する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はタキサン環骨格をもつ化
合物、特にタキソール及び１０−デアセチルバッカチン
ＩＩＩの検出、検定及び単離に関する。
合物、特にタキソール及び１０−デアセチルバッカチン
ＩＩＩの検出、検定及び単離に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】タキソ
ールはジテルペンシュウドアルカロイド複合体であり、
西洋イチイ（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹
皮から抽出され、難治性の固形癌以外の癌に対して抗癌
活性を示すものであると報告されている（Ｂ．Ａ．チャ
ブナー（Ｃｈａｂｎｅｒ），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａ
ｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ ５，
１（１９９１））。タキソールの需要の増加にもかかわ
らず、この材料の希少性（樹皮中のタキソールの含有量
は約０．０１％である）、及びその精製が困難であるが
故にその薬剤の供給は不幸にして制限されている。現時
点でのＴａｘｕｓ ｓｐ．の供給は、転位性卵巣癌及び
肺癌を患っている患者を治療するに十分な薬剤を供する
には不十分な状況にある。
ールはジテルペンシュウドアルカロイド複合体であり、
西洋イチイ（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹
皮から抽出され、難治性の固形癌以外の癌に対して抗癌
活性を示すものであると報告されている（Ｂ．Ａ．チャ
ブナー（Ｃｈａｂｎｅｒ），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａ
ｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ ５，
１（１９９１））。タキソールの需要の増加にもかかわ
らず、この材料の希少性（樹皮中のタキソールの含有量
は約０．０１％である）、及びその精製が困難であるが
故にその薬剤の供給は不幸にして制限されている。現時
点でのＴａｘｕｓ ｓｐ．の供給は、転位性卵巣癌及び
肺癌を患っている患者を治療するに十分な薬剤を供する
には不十分な状況にある。
【０００３】その結果として、薬剤としてタキソールを
使用することの可能性は、新しい供給源からタキソール
を得る為に開発されている方法に懸かっている。（Ｇ．
アペンジノ（Ａｐｐｅｎｄｉｎｏ），Ｆｉｔｏｔｅｒａ
ｐｉａ １，（ｖｏ１．ＸＩＶ 追補）（１９９３）
５）。現在のところ樹皮の収穫に代わるただ一つの実際
的なものはタキソールの半合成である。一つの方法はイ
チイから、タキソールに変換することができる１０−デ
アセチルバッカチンＩＩＩ（ＤＡＢ）の針状結晶を単離
することに基づいており、この化合物がタキソールと異
なる点はＣ−１３位にフェニルイソセリン鎖を持たず、
またＣ−１０位にアセチル基を有しないことである。他
のタキサス（Ｔａｘｕｓ）種の樹葉中のＤＡＢの含量は
まちまちであるが、通常太平洋イチイ（Ｆｉｔｏｔｅｒ
ａｐｉａ，ｓｕｐｒａ）の樹皮中のタキソールの含量よ
りもより多い（１０倍以上である）ことである。
使用することの可能性は、新しい供給源からタキソール
を得る為に開発されている方法に懸かっている。（Ｇ．
アペンジノ（Ａｐｐｅｎｄｉｎｏ），Ｆｉｔｏｔｅｒａ
ｐｉａ １，（ｖｏ１．ＸＩＶ 追補）（１９９３）
５）。現在のところ樹皮の収穫に代わるただ一つの実際
的なものはタキソールの半合成である。一つの方法はイ
チイから、タキソールに変換することができる１０−デ
アセチルバッカチンＩＩＩ（ＤＡＢ）の針状結晶を単離
することに基づいており、この化合物がタキソールと異
なる点はＣ−１３位にフェニルイソセリン鎖を持たず、
またＣ−１０位にアセチル基を有しないことである。他
のタキサス（Ｔａｘｕｓ）種の樹葉中のＤＡＢの含量は
まちまちであるが、通常太平洋イチイ（Ｆｉｔｏｔｅｒ
ａｐｉａ，ｓｕｐｒａ）の樹皮中のタキソールの含量よ
りもより多い（１０倍以上である）ことである。
【０００４】タキソール及び１０−デアセチルバッカチ
ンＩＩＩは、それぞれ次のように構造式（１）及び
（２）で示される： （１）
ンＩＩＩは、それぞれ次のように構造式（１）及び
（２）で示される： （１）
【０００５】
【化１０】
【０００６】（２）
【０００７】
【化１１】
【０００８】一括してタキサン類として知られているこ
れらの化合物、それらの誘導体、及び関連化合物はタキ
サス属の植物から得られる抗癌活性を有する物質であ
る。
れらの化合物、それらの誘導体、及び関連化合物はタキ
サス属の植物から得られる抗癌活性を有する物質であ
る。
【０００９】ＤＡＢをタキソールに変換する幾つかの方
法が今までに報告されている（例えば、Ｒ．Ａ．ホルト
ン（Ｈｏｌｔｏｎ），欧州特許明細書：ＥＰ４００，９
７１（１９９０）：Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．１４４，１
６４５６８ｑ（１９９０）及び、Ｉ．オジマ（Ｏｊｉｍ
ａ），Ｉ．ハブス（Ｈａｂｕｓ），Ｍ．ザオ（Ｚｈａ
ｏ），Ｍ．ズッコ（Ｚｕｃｃｏ），Ｙ．フックパーク
（ＨｏｏｋＰａｒｋ），Ｃ．ミンサン（Ｍｉｎｇｓｕ
ｎ），Ｔ．ブリガウド（Ｂｒｉｇａｕｄ），Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｏｒｏｎ，４８，６９８５（１９９２）参照）。
さらにＤＡＢは、Ｃ−１３位のヒドロキシ基を色々なア
ミノ酸誘導体でエステル修飾することができる。この形
式でのアプローチによって、所謂「タキソテル類」の製
造に導くことができ、これらのものはタキソール半合成
同族体であり、強い抗癌活性を示すものである（Ｆ．グ
エリッテ−フェルゲライン（Ｇｕｅｒｉｔｔｅ−Ｖｏｅ
ｌｇｅｌｅｉｎ），Ｄ．ゲナルド（Ｇｕｅｎａｒｄ），
Ｆ．レーベル（Ｌａｖｅｌｌｅ），Ｍ−Ｔ．Ｌ．レゴッ
フ（ＬｅＧｏｆｆ），Ｐ．ポチエール（Ｐｏｔｉｅ
ｒ），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３４，９９２（１９９
１）。半合成の企画は、もし価値のあるタキソール前駆
体（例えば１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、及びバ
ッカチンＩＩＩ）の含有量の高いイチイの種類を選択す
ることが可能であったならば有意に改良されていたと考
えられる。しかしタキソール及びその潜在的な前駆体が
複雑な化学構造を有している為に、化学的な、又物理化
学的な検定法はあまり有効であるとは考えられない。植
物源から純粋な形でのタキサン類の単離は煩雑なクロマ
トグラフによる分離が必要であり、その最終収量は高い
ものではない。
法が今までに報告されている（例えば、Ｒ．Ａ．ホルト
ン（Ｈｏｌｔｏｎ），欧州特許明細書：ＥＰ４００，９
７１（１９９０）：Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．１４４，１
６４５６８ｑ（１９９０）及び、Ｉ．オジマ（Ｏｊｉｍ
ａ），Ｉ．ハブス（Ｈａｂｕｓ），Ｍ．ザオ（Ｚｈａ
ｏ），Ｍ．ズッコ（Ｚｕｃｃｏ），Ｙ．フックパーク
（ＨｏｏｋＰａｒｋ），Ｃ．ミンサン（Ｍｉｎｇｓｕ
ｎ），Ｔ．ブリガウド（Ｂｒｉｇａｕｄ），Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｏｒｏｎ，４８，６９８５（１９９２）参照）。
さらにＤＡＢは、Ｃ−１３位のヒドロキシ基を色々なア
ミノ酸誘導体でエステル修飾することができる。この形
式でのアプローチによって、所謂「タキソテル類」の製
造に導くことができ、これらのものはタキソール半合成
同族体であり、強い抗癌活性を示すものである（Ｆ．グ
エリッテ−フェルゲライン（Ｇｕｅｒｉｔｔｅ−Ｖｏｅ
ｌｇｅｌｅｉｎ），Ｄ．ゲナルド（Ｇｕｅｎａｒｄ），
Ｆ．レーベル（Ｌａｖｅｌｌｅ），Ｍ−Ｔ．Ｌ．レゴッ
フ（ＬｅＧｏｆｆ），Ｐ．ポチエール（Ｐｏｔｉｅ
ｒ），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３４，９９２（１９９
１）。半合成の企画は、もし価値のあるタキソール前駆
体（例えば１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、及びバ
ッカチンＩＩＩ）の含有量の高いイチイの種類を選択す
ることが可能であったならば有意に改良されていたと考
えられる。しかしタキソール及びその潜在的な前駆体が
複雑な化学構造を有している為に、化学的な、又物理化
学的な検定法はあまり有効であるとは考えられない。植
物源から純粋な形でのタキサン類の単離は煩雑なクロマ
トグラフによる分離が必要であり、その最終収量は高い
ものではない。
【００１０】免疫学的な方法は、粗製の植物抽出液（前
記Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ参照）中に複合混合体として
存在するタキサン類の面倒なクロマトグラフ分析を迅速
且つ単純にする可能性があり、タキソール含有生物学的
試料の定量に好適な多クローン抗体（ｐＡｂ）及び単ク
ローン抗体（ｍＡｂ）が既に開発されている（Ｍ．ヤジ
リ（Ｊａｚｉｒｉ），Ｂ．Ｍ．ジアロ（Ｄｉａｌｌ
ｏ），Ｍ．Ｈ．バンハーレレン（Ｖａｎｈａｌｅｌｅ
ｎ），Ｒ．Ｊ．バンハーレラン−ファストレ（Ｖａｎｈ
ａｌｅｌａｎ−Ｆａｓｔｒｅ），Ａ．ジリ（Ｚｈｉｒ
ｉ），Ａ．Ｃ．ベク（Ｂｅｃｕ），Ｊ．Ｊ．ホームス
（Ｈｏｍｅｓ），Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４６，９３
（１９９１）；Ｐ．Ｇ．グロタウス（Ｇｒｏｔｈａｕ
ｓ），Ｔ．Ｊ．Ｇ．レイボウルド（Ｒａｙｂｏｕｌ
ｄ），Ｇ．Ｓ．ビグナミ（Ｂｉｇｎａｍｉ），Ｃ．Ｂ．
ラゾ（Ｌａｚｏ），Ｊ．Ｂ．ビルネス（Ｂｙｒｎｅ
ｓ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５８，
５（１９９３），及びＪ−Ｃ．ルウ（Ｌｅｕ），Ｂ−
Ｘ．チェン（Ｃｈｅｎ），Ｐ．Ｂ．シッフ（Ｓｃｈｉｆ
ｆ），Ｂ．Ｆ．エルランゲル（Ｅｒｌａｎｇｅｒ），Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３，１３８８（１９
９３））が、タキソール前駆体を効率良く検定する必要
性を効果的に満足させるものは全くない。
記Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ参照）中に複合混合体として
存在するタキサン類の面倒なクロマトグラフ分析を迅速
且つ単純にする可能性があり、タキソール含有生物学的
試料の定量に好適な多クローン抗体（ｐＡｂ）及び単ク
ローン抗体（ｍＡｂ）が既に開発されている（Ｍ．ヤジ
リ（Ｊａｚｉｒｉ），Ｂ．Ｍ．ジアロ（Ｄｉａｌｌ
ｏ），Ｍ．Ｈ．バンハーレレン（Ｖａｎｈａｌｅｌｅ
ｎ），Ｒ．Ｊ．バンハーレラン−ファストレ（Ｖａｎｈ
ａｌｅｌａｎ−Ｆａｓｔｒｅ），Ａ．ジリ（Ｚｈｉｒ
ｉ），Ａ．Ｃ．ベク（Ｂｅｃｕ），Ｊ．Ｊ．ホームス
（Ｈｏｍｅｓ），Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４６，９３
（１９９１）；Ｐ．Ｇ．グロタウス（Ｇｒｏｔｈａｕ
ｓ），Ｔ．Ｊ．Ｇ．レイボウルド（Ｒａｙｂｏｕｌ
ｄ），Ｇ．Ｓ．ビグナミ（Ｂｉｇｎａｍｉ），Ｃ．Ｂ．
ラゾ（Ｌａｚｏ），Ｊ．Ｂ．ビルネス（Ｂｙｒｎｅ
ｓ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５８，
５（１９９３），及びＪ−Ｃ．ルウ（Ｌｅｕ），Ｂ−
Ｘ．チェン（Ｃｈｅｎ），Ｐ．Ｂ．シッフ（Ｓｃｈｉｆ
ｆ），Ｂ．Ｆ．エルランゲル（Ｅｒｌａｎｇｅｒ），Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３，１３８８（１９
９３））が、タキソール前駆体を効率良く検定する必要
性を効果的に満足させるものは全くない。
【００１１】また植物、又は細胞、或いは微生物培養培
地、また特に複合体及び不均一性混合物中に極少量存在
する物質を工業的な規模で抽出する場合には免疫学的方
法は煩雑なクロマトグラフ分離を迅速且つ単純化する利
点を有している。
地、また特に複合体及び不均一性混合物中に極少量存在
する物質を工業的な規模で抽出する場合には免疫学的方
法は煩雑なクロマトグラフ分離を迅速且つ単純化する利
点を有している。
【００１２】哺乳動物より分離された抗タキソール及び
抗バッカチン抗体の製造は文献に報告されている（ヤン
ウエン グオ（Ｙａｎｗｅｎ Ｇｕｏ）ら、Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅｓｅｙｌｅｒ，３７５，２８１
（１９９４））。しかしながらこれらの抗体は製造する
には高価であり、別の廉価な抗体の製造法を見出すこと
が急務となっている。別法の準備及び適宜な特異的抗体
の優れた供給源の準備はタキソールやそれらの前駆体を
単離する工程に於いて有用な結合剤の必要性をも満たす
ものとなるであろう。
抗バッカチン抗体の製造は文献に報告されている（ヤン
ウエン グオ（Ｙａｎｗｅｎ Ｇｕｏ）ら、Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅｓｅｙｌｅｒ，３７５，２８１
（１９９４））。しかしながらこれらの抗体は製造する
には高価であり、別の廉価な抗体の製造法を見出すこと
が急務となっている。別法の準備及び適宜な特異的抗体
の優れた供給源の準備はタキソールやそれらの前駆体を
単離する工程に於いて有用な結合剤の必要性をも満たす
ものとなるであろう。
【００１３】鳥類のＩｇＹ抗体、例えば卵黄から得たニ
ワトリのＩｇＹ抗体は、タキサン環骨格を持つ化合物、
例えばＤＡＢ様タキサン類の環と特異的に反応し得るこ
とが知られている。太平洋イチイ又は西洋イチイに代わ
りうるタキソール前駆体の分析方法や単離法の開発に於
いて、そのような化合物の新しい供給源の探索、及び選
択の為の試薬として、これらの抗体は有用性を持ってい
る。
ワトリのＩｇＹ抗体は、タキサン環骨格を持つ化合物、
例えばＤＡＢ様タキサン類の環と特異的に反応し得るこ
とが知られている。太平洋イチイ又は西洋イチイに代わ
りうるタキソール前駆体の分析方法や単離法の開発に於
いて、そのような化合物の新しい供給源の探索、及び選
択の為の試薬として、これらの抗体は有用性を持ってい
る。
【００１４】
【課題を解決するための手段】この様にして鳥類の雌、
例えばメンドリを、タキソール及び１０−デアセチルバ
ッカチンＩＩＩの適宜な免疫原結合体によって免疫化す
ることにより、動物の血液を使用することなく、又実質
的に量的な制限を受けることなくこれらの物質に特異的
な多クローン抗体を容易に製造することができることが
見出された。これらの抗体の製造、及び免疫化された鳥
類の雌の卵の卵黄中での抗体の蓄積は実際一年以上も持
続し、工業的製造価格の点でかなりの利点をもたらすも
のである。生物学的な物質からの単離の容易さは、これ
らの抗体が操作の段階、及びマトリックスに固定する場
合、抗体に弊害のある保存剤を加えないで長期間滅菌状
態を維持する為に有機溶媒を比較的高濃度に使用するに
も関わらず工業的生産上さらに有利である。この特性は
又粗抗体が最終の精製を行うまで、及び／又はいろいろ
な方面に適用されるまで長期間貯蔵することができ、そ
してまた安全に回収することが可能であることを意味す
る。
例えばメンドリを、タキソール及び１０−デアセチルバ
ッカチンＩＩＩの適宜な免疫原結合体によって免疫化す
ることにより、動物の血液を使用することなく、又実質
的に量的な制限を受けることなくこれらの物質に特異的
な多クローン抗体を容易に製造することができることが
見出された。これらの抗体の製造、及び免疫化された鳥
類の雌の卵の卵黄中での抗体の蓄積は実際一年以上も持
続し、工業的製造価格の点でかなりの利点をもたらすも
のである。生物学的な物質からの単離の容易さは、これ
らの抗体が操作の段階、及びマトリックスに固定する場
合、抗体に弊害のある保存剤を加えないで長期間滅菌状
態を維持する為に有機溶媒を比較的高濃度に使用するに
も関わらず工業的生産上さらに有利である。この特性は
又粗抗体が最終の精製を行うまで、及び／又はいろいろ
な方面に適用されるまで長期間貯蔵することができ、そ
してまた安全に回収することが可能であることを意味す
る。
【００１５】免疫化に必要な抗原の量は、哺乳動物に於
いて通常使用されている量よりも遥かに少ない量（しば
しば１０分の１の量）である。
いて通常使用されている量よりも遥かに少ない量（しば
しば１０分の１の量）である。
【００１６】本発明に従って製造された抗体は、例えば
１０−デアセチルバッカチンＩＩＩの炭素骨格をもつ化
合物と特異的に反応する能力を持っている。それ故に１
０−デアセチルバッカチンＩＩＩとタキソールを（鳥類
の雌を特定の誘導体で免疫化する事により）識別するこ
とができる。本技術で有利に単離することができる化合
物としては１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、バッカ
チンＩＩＩ、及び１４−ヒドロキシ−１０−デアセチル
バッカチンＩＩＩが含まれる。
１０−デアセチルバッカチンＩＩＩの炭素骨格をもつ化
合物と特異的に反応する能力を持っている。それ故に１
０−デアセチルバッカチンＩＩＩとタキソールを（鳥類
の雌を特定の誘導体で免疫化する事により）識別するこ
とができる。本技術で有利に単離することができる化合
物としては１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、バッカ
チンＩＩＩ、及び１４−ヒドロキシ−１０−デアセチル
バッカチンＩＩＩが含まれる。
【００１７】同様の技術が、セファロマンニンや７−エ
ピタキソールのようなタキサン類に対する他の特定の抗
体の製造に使用することが出来、またこれらの化合物は
通常興味ある主たる生成物の不純物である。それ故本発
明は二つの主な目的を持っている。即ち上記の化合物の
免疫診断法による分析的検定、及び種々の基質よりの定
量的単離である。
ピタキソールのようなタキサン類に対する他の特定の抗
体の製造に使用することが出来、またこれらの化合物は
通常興味ある主たる生成物の不純物である。それ故本発
明は二つの主な目的を持っている。即ち上記の化合物の
免疫診断法による分析的検定、及び種々の基質よりの定
量的単離である。
【００１８】本発明の主題である抗体、これは鳥類の
雌、例えばメンドリによって製造されるものであり、哺
乳動物より得られた同様な抗体と比較すると驚くべきこ
とに有利な安定な性質を持っていることが明らかになっ
ている。特に、これらの抗体は製造及び抽出の工程に使
用される通常の有機溶媒に抵抗するので水性及び非水性
の植物抽出物に使用する場合に安定である特性を持って
いる；又これらの抗体は、水とエタノールや水性アセト
ンに可溶なアルコール類のような有機溶媒との混合物中
で抗体が完全に溶解する濃度まで使用できる利点があ
る。
雌、例えばメンドリによって製造されるものであり、哺
乳動物より得られた同様な抗体と比較すると驚くべきこ
とに有利な安定な性質を持っていることが明らかになっ
ている。特に、これらの抗体は製造及び抽出の工程に使
用される通常の有機溶媒に抵抗するので水性及び非水性
の植物抽出物に使用する場合に安定である特性を持って
いる；又これらの抗体は、水とエタノールや水性アセト
ンに可溶なアルコール類のような有機溶媒との混合物中
で抗体が完全に溶解する濃度まで使用できる利点があ
る。
【００１９】この様に本発明の一つの観点に従えば、タ
キサン環骨格よりなる抗原に対して抗体特異性を示すＩ
ｇＹクラスの抗体を提供することである。
キサン環骨格よりなる抗原に対して抗体特異性を示すＩ
ｇＹクラスの抗体を提供することである。
【００２０】本発明はさらに、前記したように鳥類の雌
に該抗原で攻撃誘発し、続いてＩｇＹ抗体を産卵した卵
から単離する抗体の製造法を提供するものである。
に該抗原で攻撃誘発し、続いてＩｇＹ抗体を産卵した卵
から単離する抗体の製造法を提供するものである。
【００２１】タキサン環骨格（立体化学は表さず炭素原
子のみを示す）は以下のＣ−２０三員環構造を基本とし
ている：
子のみを示す）は以下のＣ−２０三員環構造を基本とし
ている：
【００２２】
【化１２】
【００２３】典型的な化合物は以下の構造で示される：
【００２４】
【化１３】
【００２５】
【化１４】
【００２６】
【化１５】
【００２７】
【化１６】
【００２８】
【化１７】
【００２９】
【化１８】
【００３０】
【化１９】
【００３１】
【化２０】
【００３２】
【化２１】
【００３３】本発明に従って製造したＩｇＹ抗体は、タ
キサン環骨格より成る化合物を検出及び／又は検定する
為の分析試薬として有用であり、またタキサン環骨格よ
り成る化合物の単離又は精製をする為の合成試薬として
有用である。特に、ＤＡＢ様タキサン類のジテルペン環
を選別出来る点では本発明のＩｇＹ類はタキソール前駆
体の新しい供給源を発見する為の数多くの植物の免疫学
的スクリーニングに使用することが出来る。
キサン環骨格より成る化合物を検出及び／又は検定する
為の分析試薬として有用であり、またタキサン環骨格よ
り成る化合物の単離又は精製をする為の合成試薬として
有用である。特に、ＤＡＢ様タキサン類のジテルペン環
を選別出来る点では本発明のＩｇＹ類はタキソール前駆
体の新しい供給源を発見する為の数多くの植物の免疫学
的スクリーニングに使用することが出来る。
【００３４】それ故に本発明の更なる観点は、タキサン
を含む混合物を該タキサンに対する多クローン抗体と接
触させ、続いてタキサン−抗体複合体を単離し、それか
ら該タキサンを回収し、これに使用した多クローン抗体
がＩｇＹ抗体であり、特にその抗体がメンドリの卵から
得たものであることを特徴とする該タキサンの精製法で
ある。
を含む混合物を該タキサンに対する多クローン抗体と接
触させ、続いてタキサン−抗体複合体を単離し、それか
ら該タキサンを回収し、これに使用した多クローン抗体
がＩｇＹ抗体であり、特にその抗体がメンドリの卵から
得たものであることを特徴とする該タキサンの精製法で
ある。
【００３５】多クローン抗体それ自体、及びその製造に
使用される方法は、上記に示した方法を使用するもので
あり、本発明の展望内に入るものである。
使用される方法は、上記に示した方法を使用するもので
あり、本発明の展望内に入るものである。
【００３６】本発明は更に混合物中、或いは生物学的流
体中のタキサン類を検定する（例えばタキサン類の存在
を検出或いは検定する）分析規模に使用することが出来
る方法を提供する。従って本発明のもう一つの観点は、
混合物中、及び生物学的流体中のタキサン類を検定する
既述の多クローン抗体を使用することを特徴とする方法
である。
体中のタキサン類を検定する（例えばタキサン類の存在
を検出或いは検定する）分析規模に使用することが出来
る方法を提供する。従って本発明のもう一つの観点は、
混合物中、及び生物学的流体中のタキサン類を検定する
既述の多クローン抗体を使用することを特徴とする方法
である。
【００３７】特に本発明のもう一つの観点は生物学的流
体試料或いは培養培地中の、特に血液中のタキサン類を
検定する方法を提供することであり、この方法は該試料
を上記で示したように多クローン抗体で処理し、続いて
免疫診断法によって検定する方法を包含する。
体試料或いは培養培地中の、特に血液中のタキサン類を
検定する方法を提供することであり、この方法は該試料
を上記で示したように多クローン抗体で処理し、続いて
免疫診断法によって検定する方法を包含する。
【００３８】本発明によるＩｇＹの製造は以下で詳細に
述べる。
述べる。
【００３９】〔詳細な説明〕実質的には適宜なタキサン
の誘導体、例えばタキソール、１０−デアセチルバッカ
チンＩＩＩ又はそれらの同族体は、４−ジメチルアミノ
ピリジンの存在下その化合物をピリジン中のコハク酸無
水物と反応させ、そしてシリカゲルカラムによるクロマ
トグラフまたはそれと同等な方法でサクシニル−タキサ
ンを分離することによって製造する。このようにして得
たサクシニルータキサンはＤＭＳＯに溶解することによ
り、文献既知の方法（Ｂ．Ｆ．エルランジャー（Ｅｒｌ
ａｎｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
７０，ハン ブナキス（ＶａｎＶｕｎａｋｉｓ）編集，
アカデミックプレス社，１９８０）によって結合させ、
そしてこのものをＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）
−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩の生理食塩水溶液に
加える。生成した誘導体は再び生理食塩水中でウシ血清
アルブミンと２４時間反応させ、それから蒸留水で透析
する。
の誘導体、例えばタキソール、１０−デアセチルバッカ
チンＩＩＩ又はそれらの同族体は、４−ジメチルアミノ
ピリジンの存在下その化合物をピリジン中のコハク酸無
水物と反応させ、そしてシリカゲルカラムによるクロマ
トグラフまたはそれと同等な方法でサクシニル−タキサ
ンを分離することによって製造する。このようにして得
たサクシニルータキサンはＤＭＳＯに溶解することによ
り、文献既知の方法（Ｂ．Ｆ．エルランジャー（Ｅｒｌ
ａｎｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
７０，ハン ブナキス（ＶａｎＶｕｎａｋｉｓ）編集，
アカデミックプレス社，１９８０）によって結合させ、
そしてこのものをＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）
−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩の生理食塩水溶液に
加える。生成した誘導体は再び生理食塩水中でウシ血清
アルブミンと２４時間反応させ、それから蒸留水で透析
する。
【００４０】これらの結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を
選ばれた鳥類の雌に投与する、例えば卵を産んでいるメ
ンドリに１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、或いはタ
キソール及び／又は他のタキサン類とウシ血清アルブミ
ンとのコンジュゲートの全量０．５ｍｇをフロイントの
アジュバントを使用してメンドリの身体のいろいろな場
所に皮下注射し；最初の一ヵ月間おおざっぱな間隔で
０．２５ｍｇのコンジュゲートで追加免疫を行う。文献
既知の方法（ポルソン（Ｐｏｌｓｏｎ）ら、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｃｏｍｍ．，９，４７５，１９８０）に従って卵
白から卵黄を分離し、０．１Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ
７．５のリン酸バッファー中で破砕する。激しく攪拌し
た後、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を固体状態で
その懸濁液に濃度が３％になるまで加え、遠心分離す
る；沈殿は捨て、更にＰＥＧを上澄液にその濃度が１２
％になるまで加える；沈殿を遠心分離により集め、ＥＤ
ＴＡを含むｐＨ７．９のトリスバッファーに再溶解す
る。抗体は組成物がＮ−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩の存在下分離し
反応した時、血清アルブミンとタキサン誘導体が結合し
た活性化したセファローズのカラムを用いて精製する。
選ばれた鳥類の雌に投与する、例えば卵を産んでいるメ
ンドリに１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、或いはタ
キソール及び／又は他のタキサン類とウシ血清アルブミ
ンとのコンジュゲートの全量０．５ｍｇをフロイントの
アジュバントを使用してメンドリの身体のいろいろな場
所に皮下注射し；最初の一ヵ月間おおざっぱな間隔で
０．２５ｍｇのコンジュゲートで追加免疫を行う。文献
既知の方法（ポルソン（Ｐｏｌｓｏｎ）ら、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｃｏｍｍ．，９，４７５，１９８０）に従って卵
白から卵黄を分離し、０．１Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ
７．５のリン酸バッファー中で破砕する。激しく攪拌し
た後、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を固体状態で
その懸濁液に濃度が３％になるまで加え、遠心分離す
る；沈殿は捨て、更にＰＥＧを上澄液にその濃度が１２
％になるまで加える；沈殿を遠心分離により集め、ＥＤ
ＴＡを含むｐＨ７．９のトリスバッファーに再溶解す
る。抗体は組成物がＮ−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩の存在下分離し
反応した時、血清アルブミンとタキサン誘導体が結合し
た活性化したセファローズのカラムを用いて精製する。
【００４１】レジンの反応しなかった基は酢酸で飽和す
る。このようにして調製したレジンを０．５Ｍ ＮａＣ
ｌを含む０．１Ｍ 酢酸バッファー（ｐＨ４．５）、
０．１Ｍ 重炭酸塩（ｐＨ８．３）で繰り返し洗う。こ
れで抗体を精製する為のレジンの準備ができ、吸着され
た抗体はカラムを０．２Ｍのグリシン塩酸塩溶液（ｐＨ
２．５）で洗浄することにより再溶出することができ
る。
る。このようにして調製したレジンを０．５Ｍ ＮａＣ
ｌを含む０．１Ｍ 酢酸バッファー（ｐＨ４．５）、
０．１Ｍ 重炭酸塩（ｐＨ８．３）で繰り返し洗う。こ
れで抗体を精製する為のレジンの準備ができ、吸着され
た抗体はカラムを０．２Ｍのグリシン塩酸塩溶液（ｐＨ
２．５）で洗浄することにより再溶出することができ
る。
【００４２】現在ではイムノアフィニティークロマトグ
ラフ法は多くの抗体を精製する為の良く知られた技術で
ある。この技術は免疫グロブリンと特定の抗原との間の
相互作用を利用するものであり、この場合の抗原はタキ
ソール、又は１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、或い
はそれらの同族体のようなタキサンである。それ故に、
これは本発明の展望を制限するものではないが、メタア
クリル構造に誘導化されたレジン、例えばＡｆｆｉ−ｐ
ｒｅｐ Ｈｚヒドラジド（バイオラッド社製）、或いは
エイビッドクロムス（Ａｖｉｄｃｈｒｏｍｓ）のような
ヒドラジン基を含むレジンカラムが抗体を固定する支持
マトリックスとして使用される。これらのレジンは免疫
グロブリンの酸化された炭水化物のヒドラゾンのような
安定な環を形成する能力を持っている。この免疫グロブ
リンは他の供給源からの抗体と比較すると酸化可能な炭
水化物部分が特に豊富である。
ラフ法は多くの抗体を精製する為の良く知られた技術で
ある。この技術は免疫グロブリンと特定の抗原との間の
相互作用を利用するものであり、この場合の抗原はタキ
ソール、又は１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、或い
はそれらの同族体のようなタキサンである。それ故に、
これは本発明の展望を制限するものではないが、メタア
クリル構造に誘導化されたレジン、例えばＡｆｆｉ−ｐ
ｒｅｐ Ｈｚヒドラジド（バイオラッド社製）、或いは
エイビッドクロムス（Ａｖｉｄｃｈｒｏｍｓ）のような
ヒドラジン基を含むレジンカラムが抗体を固定する支持
マトリックスとして使用される。これらのレジンは免疫
グロブリンの酸化された炭水化物のヒドラゾンのような
安定な環を形成する能力を持っている。この免疫グロブ
リンは他の供給源からの抗体と比較すると酸化可能な炭
水化物部分が特に豊富である。
【００４３】マトリックス上に固定された抗体は、対応
した抗原と結合した後に文献記載の通常の方法で処理
し、抗原を回収し、カラムを再生する。抗原の回収に
は、ｐＨ２．５のバッファー、例ええグリシン／ＨＣｌ
を含んだ水性ジオキサン或いは水性脂肪族アルコールが
通常使用される。アフィニティークロマトグラフィーの
マトリックスの供給者によって通常推奨される他の技術
もまた使用することができる。
した抗原と結合した後に文献記載の通常の方法で処理
し、抗原を回収し、カラムを再生する。抗原の回収に
は、ｐＨ２．５のバッファー、例ええグリシン／ＨＣｌ
を含んだ水性ジオキサン或いは水性脂肪族アルコールが
通常使用される。アフィニティークロマトグラフィーの
マトリックスの供給者によって通常推奨される他の技術
もまた使用することができる。
【００４４】分析学的な展望に関する限り、上記の方法
は、上記の化合物を１から１００ｎｇを含む薬剤（タキ
ソールが好ましい）を投与した後、植物抽出液、培養培
地、及びプラズマ中の抗原の量を検定するのに使用する
ことができる。
は、上記の化合物を１から１００ｎｇを含む薬剤（タキ
ソールが好ましい）を投与した後、植物抽出液、培養培
地、及びプラズマ中の抗原の量を検定するのに使用する
ことができる。
【００４５】他の態様として、本発明による方法は他の
免疫診断法、例えば競合阻害酵素免疫検定法（ＣＩＥＩ
Ａ）によって検定することが出来る。
免疫診断法、例えば競合阻害酵素免疫検定法（ＣＩＥＩ
Ａ）によって検定することが出来る。
【００４６】工業的な製造の観点に関する限り、本発明
の主題であるタキサン類は抽出操作によって水性アルコ
ール抽出物として直接「捕捉する」ことが出来る。例え
ば植物バイオマスを、５０％までに水で希釈された、好
ましくは約４０％に希釈されたエタノール又はメタノー
ルで抽出することによって得られる。この溶媒は全ての
タキサン類を抽出し、タキサス属の気孔部分に特に高濃
度に含まれる葉緑素及び他の色素のような望ましくない
物質は抽出しないという利点をもっている。
の主題であるタキサン類は抽出操作によって水性アルコ
ール抽出物として直接「捕捉する」ことが出来る。例え
ば植物バイオマスを、５０％までに水で希釈された、好
ましくは約４０％に希釈されたエタノール又はメタノー
ルで抽出することによって得られる。この溶媒は全ての
タキサン類を抽出し、タキサス属の気孔部分に特に高濃
度に含まれる葉緑素及び他の色素のような望ましくない
物質は抽出しないという利点をもっている。
【００４７】これらの抽出物は更なる精製工程を必要と
せずただ単に濾過すれば十分であり、特異性イムノアフ
ィニティーカラムによってカラムクロマトグラフ精製す
ることができる。溶媒に対して、また操作中のｐＨに対
して、本発明に従って得られた抗体が強い抵抗性を示す
為に、これらのカラムは少なくとも１００回連続的に繰
り返して使用することが出来る。腫瘍学的に興味のある
他のタキサン類と同様タキソール、及び１０−デアセチ
ルバッカチンＩＩＩは、同様な方法で製造した所望の抗
原を用いてこの方法により製造することができる。
せずただ単に濾過すれば十分であり、特異性イムノアフ
ィニティーカラムによってカラムクロマトグラフ精製す
ることができる。溶媒に対して、また操作中のｐＨに対
して、本発明に従って得られた抗体が強い抵抗性を示す
為に、これらのカラムは少なくとも１００回連続的に繰
り返して使用することが出来る。腫瘍学的に興味のある
他のタキサン類と同様タキソール、及び１０−デアセチ
ルバッカチンＩＩＩは、同様な方法で製造した所望の抗
原を用いてこの方法により製造することができる。
【００４８】この意味において、この方法は通常のクロ
マトグラフ法、例えばシリカゲルカラム、或いは高圧逆
相工業カラムでは分離することが困難なタキサン不純物
を分離するのに特に有用であり；又その高い特異性によ
り、イムノアフィニティークロマトグラフ法はタキソー
ルを７−エピータキソール、或いはセファロマンニンの
様なその異性体、又は類似体より分離することができ；
また、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、及び１４−
ヒドロキシバッカチンの分離にも使用することが出来
る。
マトグラフ法、例えばシリカゲルカラム、或いは高圧逆
相工業カラムでは分離することが困難なタキサン不純物
を分離するのに特に有用であり；又その高い特異性によ
り、イムノアフィニティークロマトグラフ法はタキソー
ルを７−エピータキソール、或いはセファロマンニンの
様なその異性体、又は類似体より分離することができ；
また、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、及び１４−
ヒドロキシバッカチンの分離にも使用することが出来
る。
【００４９】当然のことながらこの方法は、植物体中に
極少量存在する既述の化合物を植物種から純粋な状態で
得るのに使用することが出来る。
極少量存在する既述の化合物を植物種から純粋な状態で
得るのに使用することが出来る。
【００５０】通常工業的に使用されるタキサス属の種
は、タキサス バッカタ（Ｔａｘｕｓｂａｃｃａｔ
ａ）、Ｔ．ブレビフォリア（ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、
Ｔ．ワリキアナ（ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ）、Ｔ．ヒッ
クシ（ｈｉｃｋｓｉ）、Ｔ．カナデンシス（ｃａｎａｄ
ｅｎｓｉｓ）、Ｔ．ヒアマネンシス（ｈｉａｍａｎｅｎ
ｓｉｓ）、Ｔ．ピラミダリス（ｐｉｒａｍｉｄａｌｉ
ｓ）、及び選ばれた変種である。
は、タキサス バッカタ（Ｔａｘｕｓｂａｃｃａｔ
ａ）、Ｔ．ブレビフォリア（ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、
Ｔ．ワリキアナ（ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ）、Ｔ．ヒッ
クシ（ｈｉｃｋｓｉ）、Ｔ．カナデンシス（ｃａｎａｄ
ｅｎｓｉｓ）、Ｔ．ヒアマネンシス（ｈｉａｍａｎｅｎ
ｓｉｓ）、Ｔ．ピラミダリス（ｐｉｒａｍｉｄａｌｉ
ｓ）、及び選ばれた変種である。
【００５１】本発明をより詳細に説明する為に以下に種
々の実施例を示す。
々の実施例を示す。
【００５２】
実施例１： タキサス バッカタの抽出物からタキソー
ルの単離に有用な抗タキソール多クローン抗体で活性化
されたマトリックスの製造： 〔抗原の製造〕０．０６７ｍｍｏｌの４−ジメチルアミ
ノピリジンの存在下ピリジン中で０．９ｍｍｏｌのタキ
ソールとベンジルアルコールを１．４ｍｍｏｌの無水コ
ハク酸と反応させた。この全体を室温で７時間維持し
た。反応混合物を減圧下低温で濃縮乾固し、サクシニル
タキソールをクロロホルム−メタノール（８５：１５）
の混合物を溶出剤として使用するシリカゲルクロマトグ
ラフによって単離した（収量７０％）。分光スペクトル
データよりその誘導体は、２’−サクシニルタキソール
であった。
ルの単離に有用な抗タキソール多クローン抗体で活性化
されたマトリックスの製造： 〔抗原の製造〕０．０６７ｍｍｏｌの４−ジメチルアミ
ノピリジンの存在下ピリジン中で０．９ｍｍｏｌのタキ
ソールとベンジルアルコールを１．４ｍｍｏｌの無水コ
ハク酸と反応させた。この全体を室温で７時間維持し
た。反応混合物を減圧下低温で濃縮乾固し、サクシニル
タキソールをクロロホルム−メタノール（８５：１５）
の混合物を溶出剤として使用するシリカゲルクロマトグ
ラフによって単離した（収量７０％）。分光スペクトル
データよりその誘導体は、２’−サクシニルタキソール
であった。
【００５３】〔抗原とウシ血清アルブミンとの結合〕３
０ｍｇの２’−サクシニルタキソールを攪拌しながら
０．９％のＮａＣｌ中の１−エチル−３−（ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドの溶液に加えた。この混
合物を室温で２４時間放置して反応させ、それから生理
食塩水中の１２０ｍｇのウシ血清アルブミンと更に２４
時間反応させた。この反応混合物を更に３６時間蒸留水
で透析して試薬を除去した。
０ｍｇの２’−サクシニルタキソールを攪拌しながら
０．９％のＮａＣｌ中の１−エチル−３−（ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドの溶液に加えた。この混
合物を室温で２４時間放置して反応させ、それから生理
食塩水中の１２０ｍｇのウシ血清アルブミンと更に２４
時間反応させた。この反応混合物を更に３６時間蒸留水
で透析して試薬を除去した。
【００５４】〔抗体を精製する基質の製造〕５０ｍｇの
ウシ血清アルブミンをＣＮＢｒで活性化したセファロー
ズと反応させ、それからこの全体を上記で製造した２’
−サクシニルタキソールと１００ｍｇのＮ’−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩
酸塩の存在下ｐＨ５−６で１２時間反応させた。レジン
上の過剰の反応しなかった基は酢酸で飽和した；それか
らレジンは０．５Ｍ ＮａＣｌを含んだ０．１Ｍ酢酸バ
ッファー（ｐＨ４．５）、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３で洗
った。このレジンをイムノアフィニティー分離に使用す
るときは０．２Ｍグリシン／ＨＣｌバッファー（ｐＨ
２．５）で洗った。
ウシ血清アルブミンをＣＮＢｒで活性化したセファロー
ズと反応させ、それからこの全体を上記で製造した２’
−サクシニルタキソールと１００ｍｇのＮ’−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩
酸塩の存在下ｐＨ５−６で１２時間反応させた。レジン
上の過剰の反応しなかった基は酢酸で飽和した；それか
らレジンは０．５Ｍ ＮａＣｌを含んだ０．１Ｍ酢酸バ
ッファー（ｐＨ４．５）、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３で洗
った。このレジンをイムノアフィニティー分離に使用す
るときは０．２Ｍグリシン／ＨＣｌバッファー（ｐＨ
２．５）で洗った。
【００５５】〔メンドリの免疫化、及び抗体の製造〕１
０羽の卵を産んでいるメンドリに皮下で数カ所にウシ血
清アルブミンと結合したタキソールを合計０．５ｍｇフ
ロイントのアジュバントを用いて注射した；この操作
を、１５日後、２１日後に繰り返した。３０日目から卵
の収集を始めた。６０個の卵を潰し、卵黄を卵白から分
離し、卵白は捨てた。卵黄は０．１ＭのＮａＣｌを含む
２倍量の０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中
で均一化した。激しく攪拌しながらＰＥＧ６０００を加
え、その濃度を３％（ｗ／ｖ）にした；懸濁液はそれか
ら２０分、１３，０００ｇで遠心分離し、沈殿を除去し
た。激しく攪拌しながらＰＥＧ６０００を上澄液に加
え、濃度を１２％にした。懸濁液を遠心分離し、抗体を
含む固体を集めた。この固体をＥＤＴＡ及び安定剤とし
てＮａＮ３を含む５０ｍＭトリスバッファー中に再溶解
した。抗体はこの溶液を、抗原を含む上記のレジン上を
通過させることにより精製した。抗体は使用時０．２Ｍ
グリシン／ＨＣ１バッファー（ｐＨ２．５）で再溶出し
た。
０羽の卵を産んでいるメンドリに皮下で数カ所にウシ血
清アルブミンと結合したタキソールを合計０．５ｍｇフ
ロイントのアジュバントを用いて注射した；この操作
を、１５日後、２１日後に繰り返した。３０日目から卵
の収集を始めた。６０個の卵を潰し、卵黄を卵白から分
離し、卵白は捨てた。卵黄は０．１ＭのＮａＣｌを含む
２倍量の０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中
で均一化した。激しく攪拌しながらＰＥＧ６０００を加
え、その濃度を３％（ｗ／ｖ）にした；懸濁液はそれか
ら２０分、１３，０００ｇで遠心分離し、沈殿を除去し
た。激しく攪拌しながらＰＥＧ６０００を上澄液に加
え、濃度を１２％にした。懸濁液を遠心分離し、抗体を
含む固体を集めた。この固体をＥＤＴＡ及び安定剤とし
てＮａＮ３を含む５０ｍＭトリスバッファー中に再溶解
した。抗体はこの溶液を、抗原を含む上記のレジン上を
通過させることにより精製した。抗体は使用時０．２Ｍ
グリシン／ＨＣ１バッファー（ｐＨ２．５）で再溶出し
た。
【００５６】〔抗タキソール多クローン抗体のマトリッ
クス固定〕０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）で平衡
化したヒドラジド基を持つエイビソド−クロム（Ａｖｉ
ｄ−Ｃｈｒｏｍ）カラムを，過ヨウ素酸ナトリウムで前
酸化（上記のように精製した抗体３０ｍｇを０．０５Ｍ
酢酸ナトリウム溶液３０ｍｌに溶解し、そして１０ｍＭ
の過ヨウ素酸ナトリウムで酸化）した抗体の溶液で、マ
トリックスと抗体溶液を約１時間放置して反応させる方
法で処理した。最後にカラムは０．０２Ｍリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７．４）で洗浄し過剰の未反応の抗体を除い
た。
クス固定〕０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）で平衡
化したヒドラジド基を持つエイビソド−クロム（Ａｖｉ
ｄ−Ｃｈｒｏｍ）カラムを，過ヨウ素酸ナトリウムで前
酸化（上記のように精製した抗体３０ｍｇを０．０５Ｍ
酢酸ナトリウム溶液３０ｍｌに溶解し、そして１０ｍＭ
の過ヨウ素酸ナトリウムで酸化）した抗体の溶液で、マ
トリックスと抗体溶液を約１時間放置して反応させる方
法で処理した。最後にカラムは０．０２Ｍリン酸バッフ
ァー（ｐＨ７．４）で洗浄し過剰の未反応の抗体を除い
た。
【００５７】〔タキサス バッカタの抽出物からタキソ
ールの単離〕細断したタキサス バッカタの葉１００ｇ
を３５％水性エタノールで徹底的にタキソールを抽出し
た（溶媒約２Ｌ）。この抽出液を濾過した後、上記で調
製したエイビッド−クロムカラム２０ｍｌに通過させ
た。カラムは１２．６ｍｇのタキソールを固定した。こ
の量は事前に葉中のタキソールをＨＰＬＣで検定した量
と同じであった。タキソールは、グリシン／ＨＣ１バッ
ファー（ｐＨ２．５）を含むジオキサン−水（１：１）
の混合溶液で洗うことによってカラムから分離した。タ
キソールはメチレンクロリドでカラムから溶出し、そし
てアルコールから結晶化した。タキソールの純度は９９
％以上であった。
ールの単離〕細断したタキサス バッカタの葉１００ｇ
を３５％水性エタノールで徹底的にタキソールを抽出し
た（溶媒約２Ｌ）。この抽出液を濾過した後、上記で調
製したエイビッド−クロムカラム２０ｍｌに通過させ
た。カラムは１２．６ｍｇのタキソールを固定した。こ
の量は事前に葉中のタキソールをＨＰＬＣで検定した量
と同じであった。タキソールは、グリシン／ＨＣ１バッ
ファー（ｐＨ２．５）を含むジオキサン−水（１：１）
の混合溶液で洗うことによってカラムから分離した。タ
キソールはメチレンクロリドでカラムから溶出し、そし
てアルコールから結晶化した。タキソールの純度は９９
％以上であった。
【００５８】実施例２： タキサス バッカタの抽出物
から１０−デアセチルバッカチンＩＩＩの単離に有用な
抗１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ多クローン抗体を
含む活性化したマトリックスの製造： 特異性抗体、及びイムノアフィニティーカラムは、抗原
が異なる以外は実施例１に記載と同じ工程及び方法で製
造した。該抗原は次の様にして製造した：
から１０−デアセチルバッカチンＩＩＩの単離に有用な
抗１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ多クローン抗体を
含む活性化したマトリックスの製造： 特異性抗体、及びイムノアフィニティーカラムは、抗原
が異なる以外は実施例１に記載と同じ工程及び方法で製
造した。該抗原は次の様にして製造した：
【００５９】〔１０−サクシニル−１０−デアセチルバ
ッカチンＩＩＩの製造〕０．０６７ｍｍｏｌの４−ジメ
チルアミノピリジンの存在下０．９ｍｍｏｌの１０−デ
アセチルバッカチンＩＩＩをピリジン中の１．４ｍｍｏ
ｌの無水コハク酸と反応させた。この全体を室温で７時
間維持した。反応混合物を減圧下低温で濃縮乾固し、そ
れからＣＨＣｌ３／イソプロパノール（７：３）を溶出
液とするシリカゲルクロマトグラフにより１０−デアセ
チルバッカチンＩＩＩ誘導体を単離した。分光分析デー
タに依ると、この誘導体は１０−サクシニルバッカチン
ＩＩＩであった。
ッカチンＩＩＩの製造〕０．０６７ｍｍｏｌの４−ジメ
チルアミノピリジンの存在下０．９ｍｍｏｌの１０−デ
アセチルバッカチンＩＩＩをピリジン中の１．４ｍｍｏ
ｌの無水コハク酸と反応させた。この全体を室温で７時
間維持した。反応混合物を減圧下低温で濃縮乾固し、そ
れからＣＨＣｌ３／イソプロパノール（７：３）を溶出
液とするシリカゲルクロマトグラフにより１０−デアセ
チルバッカチンＩＩＩ誘導体を単離した。分光分析デー
タに依ると、この誘導体は１０−サクシニルバッカチン
ＩＩＩであった。
【００６０】〔タキサス ワリキアナ（Ｔａｘｕｓ ｗ
ａｌｌｉｃｈｉａｎａ）の抽出物か１０−デアセチルバ
ッカチンＩＩＩの分離〕１００ｇのタキサス ワリキア
ナの細断した葉からタキサン類を４５％水性エタノール
（約２．８Ｌ）で十分に抽出した。最初の量の２／３に
濃縮し、濾過した後、この抽出物を前記のタキソールの
項で記載したエイビッド−クロムカラム６０ｍｌに通し
た。このカラムは３０．５ｍｇの１０−デアセチルバッ
カチンＩＩＩを固定した。この量は事前に葉中の１０−
デアセチルバッカチンＩＩＩをＨＰＬＣで検定した量の
９５％であった。この１０−デアセチルバッカチンＩＩ
Ｉはグリシン／ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．５）を含む
ジオキサン／水（２：１）の混合溶液で洗って切り離し
た。このジテルペンは水で希釈した後、カラム溶出液か
らメチレンクロリドで抽出し、そしてメタノールから結
晶化した。このようにして得た１０−デアセチルバッカ
チンＩＩＩの純度は９９％以上であった。
ａｌｌｉｃｈｉａｎａ）の抽出物か１０−デアセチルバ
ッカチンＩＩＩの分離〕１００ｇのタキサス ワリキア
ナの細断した葉からタキサン類を４５％水性エタノール
（約２．８Ｌ）で十分に抽出した。最初の量の２／３に
濃縮し、濾過した後、この抽出物を前記のタキソールの
項で記載したエイビッド−クロムカラム６０ｍｌに通し
た。このカラムは３０．５ｍｇの１０−デアセチルバッ
カチンＩＩＩを固定した。この量は事前に葉中の１０−
デアセチルバッカチンＩＩＩをＨＰＬＣで検定した量の
９５％であった。この１０−デアセチルバッカチンＩＩ
Ｉはグリシン／ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．５）を含む
ジオキサン／水（２：１）の混合溶液で洗って切り離し
た。このジテルペンは水で希釈した後、カラム溶出液か
らメチレンクロリドで抽出し、そしてメタノールから結
晶化した。このようにして得た１０−デアセチルバッカ
チンＩＩＩの純度は９９％以上であった。
【００６１】実施例３： 競合阻害免疫検定（ＣＩＥＩ
Ａ）によるヒト血清中の１０−デアセチルバッカチンＩ
ＩＩの検定： ３０ｎｇの１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ−ＢＳＡ
コンジュゲートをミクロ滴定プレートのウエルに付着さ
せた。ＣＩＥＩＡ検定の為に１０−デアセチルバッカチ
ンＩＩＩ抗原の倍々希釈（０．１ｎｇ／ｍｌから１０μ
ｇ／ｍｌ）したものをその抗体、α−１０−デアセチル
バッカチンＩＩＩ ＩｇＹ（２．３μｇ／ｍｌ）と混合
した（両者とも同じバッファーで１：５０で希釈したＰ
ＢＳ−Ｔ及び血清溶液）。前培養した後、１００μｌの
これらの溶液を付着抗原と競合させる為にウエル中で１
時間３７°Ｃでインキュベートした。この条件下ではＰ
ＢＳ−Ｔ溶液でＩＣ５０が０．７ｎｇを与える競合抗原
の量は、１：５０希釈血清が存在する場合と同じであっ
た。
Ａ）によるヒト血清中の１０−デアセチルバッカチンＩ
ＩＩの検定： ３０ｎｇの１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ−ＢＳＡ
コンジュゲートをミクロ滴定プレートのウエルに付着さ
せた。ＣＩＥＩＡ検定の為に１０−デアセチルバッカチ
ンＩＩＩ抗原の倍々希釈（０．１ｎｇ／ｍｌから１０μ
ｇ／ｍｌ）したものをその抗体、α−１０−デアセチル
バッカチンＩＩＩ ＩｇＹ（２．３μｇ／ｍｌ）と混合
した（両者とも同じバッファーで１：５０で希釈したＰ
ＢＳ−Ｔ及び血清溶液）。前培養した後、１００μｌの
これらの溶液を付着抗原と競合させる為にウエル中で１
時間３７°Ｃでインキュベートした。この条件下ではＰ
ＢＳ−Ｔ溶液でＩＣ５０が０．７ｎｇを与える競合抗原
の量は、１：５０希釈血清が存在する場合と同じであっ
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ (72)発明者 フランコ エム ベナンジィ イタリア国 62032 カメリノ エムシー ロカリタ エス マルセロ 29
Claims (28)
- 【請求項１】 タキサン環骨格よりなる抗原に対して抗
体特異性であるＩｇＹクラスの抗体。 - 【請求項２】 抗原が下記に示す構造式： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 の中の一つである請求項１記載の抗体。
- 【請求項３】 抗原がタキソール又はタキソール前駆体
である請求項１又は２記載の抗体。 - 【請求項４】 抗原が１０−デアセチルバッカチンＩＩ
Ｉである請求項３記載の抗体。 - 【請求項５】 抗体がメンドリのＩｇＹである前請求項
のいずれかに記載の抗体。 - 【請求項６】 該抗原で鳥類の雌を攻撃誘発し、その鳥
類が産卵した卵よりＩｇＹ抗体を単離することを包含す
る前請求項のいずれかに記載の抗体を製造する方法。 - 【請求項７】 タキサン環骨格よりなる化合物を検出及
び／又は検定するための分析試薬として請求項１から５
のいずれかに記載の抗体を使用する方法。 - 【請求項８】 タキサン環骨格よりなる化合物を単離又
は精製する分取用試薬として請求項１から５のいずれか
に記載の抗体を使用する方法。 - 【請求項９】 タキサンを含有する混合物を、鳥類、特
にメンドリより得られたものであることを特徴とする該
タキサンに対する多クローン抗体で処理し、つづいてタ
キサン−抗体複合体を単離し、タキサンを回収すること
を包含するタキサンの精製法。 - 【請求項１０】 該多クローン抗体をイムノアフィニテ
ィークロマトグラフ法のクロマトグラフ支持体上に固定
化することを特徴とする請求項９記載の精製法。 - 【請求項１１】 該クロマトグラフの支持体が、ヒドラ
ジン基で誘導体化されたメタアクリル構造をもつレジン
であることを特徴とする請求項９記載の精製法。 - 【請求項１２】 該支持体の溶出をｐＨ２．５で緩衝化
されたジオキサン又は脂肪族アルコールの水性混合物で
効果的にすることを特徴とする請求項１１記載の精製
法。 - 【請求項１３】 溶出剤がグリシン／ＨＣ１で緩衝化さ
れたジオキサン及び水の混合物であることを特徴とする
請求項１２記載の精製法。 - 【請求項１４】 混合物がタキサス バッカタ（Ｔａｘ
ｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、Ｔ．ブレビフォリア（ｂｒｅ
ｖｉｆｏｌｉａ）、Ｔ．ワリキアナ（ｗａｌｌｉｃｈｉ
ａｎａ）、Ｔ．ヒックシ（ｈｉｃｋｓｉ）、Ｔ．カナデ
ンシス（ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、Ｔ．ヒアマネンシス
（ｈｉａｍａｎｅｎｓｉｓ）、Ｔ．ピラミダリス（ｐｉ
ｒａｍｉｄａｌｉｓ）よりなる群より選ばれたタキサス
（Ｔａｘｕｓ）属の種より得られた抽出物であることを
特徴とする請求項９記載の精製法。 - 【請求項１５】 単離されたタキサンが、タキソール、
１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、１４−ヒドロキシ
−１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、セファロマンニ
ン、１９−ヒドロキシ−１０−デアセチルバッカチンＩ
ＩＩ，及び７−エピタキソールよりなる群より選ばれた
ものであることを特徴とする請求項９から１４のいずれ
かに記載の精製法。 - 【請求項１６】 単離されたタキサンがタキソールであ
り、そして溶出剤がグリシンでｐＨ２．５に緩衝された
ジオキサンと水１：１の混合物であることを特徴とする
請求項９から１４のいずれかに記載の精製法。 - 【請求項１７】 単離されたタキサンが１０−デアセチ
ルバッカチンＩＩＩであり、そして溶出剤がグリシン／
ＨＣ１でｐＨ２に緩衝された２：１／ジオキサン：水の
混合溶液であることを特徴とする請求項９から１５のい
ずれかに記載の精製法。 - 【請求項１８】 抗タキサン多クローン抗体の製造法
が； ａ） サクシニル−タキサン−アルブミン複合体により
メンドリを免疫化し； ｂ） 該メンドリの卵黄から抗体を単離する； ことを特徴とする卵黄から抗タキサン多クローン抗体を
製造する方法。 - 【請求項１９】 該サクシニル−タキサンがサクシニル
タキソールであり、又該アルブミンがウシ血清アルブミ
ンであることを特徴とする請求項１８記載の製造法。 - 【請求項２０】 該サクシニル−タキサンがサクシニル
−１０−デアセチルバッカチンＩＩＩであり、又該アル
ブミンがウシ血清アルブミンであることを特徴とする請
求項１８記載の製造法。 - 【請求項２１】 多クローン抗体が請求項１８から２０
のいずれかに記載の製造法によって得られる多クローン
抗体。 - 【請求項２２】 混合物及び生物学的流動体中のタキソ
ンの単離及び検定する為の請求項２１記載の抗体の使用
法。 - 【請求項２３】 該検定がイムノアフィニティークロマ
トグラフィー法、或いは競合阻害酵素免疫検定法（ＣＩ
ＥＩＡ）によってなされることを特徴とする請求項２２
記載の抗体の使用法。 - 【請求項２４】 検定試料が多クローン抗体で、請求項
２１記載の方法で処理してタキサン−抗体複合体を得、
そして、該タキサンを該複合体から検定することを特徴
とする生物学的流動体或いは培地の試料中のタキサン類
を検定する方法。 - 【請求項２５】 該生物学的流動体が血液であることを
特徴とする請求項２４記載の検定法。 - 【請求項２６】 該タキサンの検定法が、該抗体がクロ
マトグラフの支持体に結合するイムノアフィニティーク
ロマトグラフィーにより効果的になされるものであるこ
とを特徴とする請求項２４又は請求項２５記載の検定
法。 - 【請求項２７】 該タキサンの検定法が競合阻害酵素免
疫検定法によって効果的になされることを特徴とする請
求項２４又は請求項２５記載の検定法。 - 【請求項２８】 タキサンがタキソール又は１０−デア
セチルバッカチンＩＩＩであることを特徴とする請求項
２４から請求項２７のいずれかに記載の検定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI941499A IT1271682B (it) | 1994-07-19 | 1994-07-19 | Determinazione e isolamento di taxolo e 10-desacetil-bacatina iii e analoghi attraverso anticorpi |
| IT94A001499 | 1994-07-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0862212A true JPH0862212A (ja) | 1996-03-08 |
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ID=11369302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7130962A Pending JPH0862212A (ja) | 1994-07-19 | 1995-04-21 | タキサン環骨格をもつ化合物の検出、検定、及び単離法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH0862212A (ja) |
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| DE (1) | DE69518597T2 (ja) |
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| WO2005049653A1 (en) * | 2003-07-14 | 2005-06-02 | Genway Biotech, Inc. | Affinity separation composition and method |
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| KR100987000B1 (ko) * | 2010-01-28 | 2010-10-11 | 이관준 | 압축성형 코이어 망사포트의 제조방법 |
| KR20120068244A (ko) * | 2010-12-17 | 2012-06-27 | (주)에코원 | 식생포트 및 그 제조방법 |
| CN115932146B (zh) * | 2022-11-16 | 2025-04-04 | 无锡紫杉药业股份有限公司 | 一种口服紫杉醇处方的筛选方法 |
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|---|---|---|---|---|
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1994
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-
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