JPH058720B2 - - Google Patents
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- JPH058720B2 JPH058720B2 JP59501178A JP50117884A JPH058720B2 JP H058720 B2 JPH058720 B2 JP H058720B2 JP 59501178 A JP59501178 A JP 59501178A JP 50117884 A JP50117884 A JP 50117884A JP H058720 B2 JPH058720 B2 JP H058720B2
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Description
請求の範囲
１ 3′−リボースおよび2′−末端リボースアシル
化2′，5′−オリゴ(A)を結合せしめた免疫原性物質
を免疫原として得られる、式：5′−（ホスホ）ｍ
（アデニル2′−5′）ｎアデノシン（式中、ｍは１
〜３の整数、ｎは２〜50の整数である）で示され
るオリゴヌクレオチドに特異的な抗体であつて、
上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体の特異
性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定されることを特徴とする抗体。 ２ 生きている脊椎動物に対し完全または部分的
3′−リボースおよび2′−末端リボースアシル化2′，
5′−オリゴ(A)を結合せしめた免疫原性物質から成
る免疫原を該動物に免疫化に適した時間的間隔を
もつて非経口的に投与し、その結果生成した特異
抗体を含む血液を集め、該血液からクロツト化お
よび要すれば遠心分離することによつて血清を得
るか、または抗擬結剤の添加および遠心分離によ
つて血しようを得、血清または血しようから抗体
を採取することを特徴とする、3′−リボースおよ
び2′−末端リボースアシル化2′，5′−オリゴ(A)を
結合せしめた免疫原生物質を免疫原として得られ
る、5′−（ホスホ）ｍ（アデニル2′−5′）ｎアデノ
シン（式中、ｍは１〜３の整数、ｎは２〜50の整
数である）で示されるオリゴヌクレオチドに特異
的な抗体であつて、上記オリゴヌクレオチドに対
する上記抗体の特異性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定されることを特徴とする抗体を製造する方
法。 ３ 免疫原性物質がアシル化位置の１つまたはそ
れ以上に結合している請求の範囲第２項記載の方
法。 ４ 免疫原性物質が蛋白質、好ましくはキーホー
ルリンペツトへモシアニン、ペプチド、炭水化物
またはホスホリピドである請求の範囲第２項また
は第３項記載の方法。 ５ 2′，5′−オリゴ(A)がジカルボン酸無水物、特
にコハク酸無水物でアシル化されている請求の範
囲第２〜４項のいずれか１項記載の方法。 ６ 3′−リボースおよび2′−末端リボースアシル
化2′，5′−オリゴ(A)を結合せしめた免疫原性物質
を免疫原として得られる、式：5′−（ホスホ）ｍ
（アデニル2′−5′）ｎアデノシン（式中、ｍは１
〜３の整数、ｎは２〜50の整数である）で示され
るオリゴヌクレオチドに特異的な抗体であつて、
上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体の特異
性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定されることを特徴とする抗体を含んでな
る、３種の公知免疫学的分析方法、すなわちａ）
遊離または結合リガンドの測定による方法、ｂ）
遊離または結合抗体の測定による方法および(c)抗
原抗体反応により調節される信号によつて抗体−
リガンド反応を測定する方法のいずれかにより、
生物学的材料またはそれからの抽出物中における
第１項に述べた５−末端モノー、ジーまたはトリ
ーホスホリル化（アデニリル2′−5′）ｎアデノシ
ンを分析するための分析用試薬。 ７ リガンドが放射能、酵素、蛍光、酵素基質、
補酵素、酵素補欠分子族または冷光標識で標識さ
れており、非標識種が固体支持体に結合している
こともある請求の範囲第６項の分析用試薬。 ８ 3′−リボースおよび2′−末端リボースアシル
化2′，5′−オリゴ(A)を結合せしめた免疫原性物質
を免疫原として得られる、式：5′−（ホスホ）ｍ
（アデニル2′−5′）ｎアデノシン（式中、ｍは１
〜３の整数、ｎは２〜50の整数である）で示され
るオリゴヌクレオチドに特異的な抗体であつて、
上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体の特異
性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定されることを特徴とする抗体を含んでな
る、生物学的材料からの5′−末端モノー、ジーま
たはトリーホスホリル化（アデニル2′−5′）ｎア
デノシン［ただし、ｎは２〜50の整数である］の
除去剤。 ９ ａ）標識2′，5′−Ａテトラマートリホスフエ
ート、ｂ）2′，5′−オリゴ(A)に対する希釈抗血清
およびｃ）他の公知成分をそれぞれ所定濃度で含
有する5′−（ホスホ）ｍ（アデニル2′−5′）ｎアデ
ノシン（式中、ｍは１〜３の整数、ｎは２〜50の
整数である）の定量分析用キツト。 明細書 この発明は2′5′−オリゴヌクレオチドの自然形
に対する特異抗体、オリゴヌクレオチドを通常の
3′5′に代えて2′5′ホスホジエステル結合とカツプ
リングさせ、免疫原性物質に対し5′末端トリホス
フエートを結合させて非常に高い親和性と特異性
を有する抗体が得られるようにする方法および
2′5′−オリゴ(A)の5′−トリホスホリル化された自
然形または5′−末端モノまたはジホスホリル化
（2′−5′）アデニルアデノシンオリゴヌクレオチ
ドに対する高感度のイムノアツセイの一部として
もしくはこれらの物質の生物学的系の除去のため
のそれら（但し、抗体は、3′−リボースおよび
2′−末端リボースアシル化2′，5′−オリゴ(A)を結
合せしめた免疫原性物質を免疫原として得られ
る、式：5′−（ホスホ）ｍ（アデニル2′−5′）ｎア
デノシン（式中、ｍは１〜３の整数、ｎは２〜50
の整数である）で示されるオリゴヌクレオチドに
特異的な抗体であつて、上記オリゴヌクレオチド
に対する上記抗体の特異性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定される）の使用に関する。 先行技術 総合的に5′−トリホスホ−（アデニリル2′5′）ア
デノシンとして知られるポリヌクレオチドのオリ
ゴマー系は2′5′−オリゴ(A)と略され、次のような
構造を有する： 上記の構造式はトリマーを示し、繰り返し単位
は点線ではさまれる部分である。これらの化合物
は最近発見されたものであつて、インターフエロ
ンに対する結合性ならびに全く新しいクラスのメ
ツセンジヤー分子を現すが故に非常な関心が高ま
つている。この点に関して最近総括的文献があ
る：M.ミンクスおよびJ.ゴードン著，”ジ・イン
ターフエロン・ルネツサンス：モレキユラー・ア
スペクツ・オブ・インダクシヨン・アンド・アク
シヨン”，マイクロバイオロジカル・レビユース，
Vol.45，244〜266頁（1981年）。2′5′−オリゴ(A)
の生物学的作用に関する推論の多くは間接的なも
のであり、インターフエロン処理細胞中に誘導さ
れる酵素2′5′−オリゴ(A)合成酵素の測定によるも
のであつた。この酵素は細胞抽出物中そのアクテ
イベイターである２本鎖RNAの存在下に非常に
効率的に作用することが出来るので容易に測定す
ることが出来る。そのような測定は、上昇した濃
度が種々の病気において認められ、インターフエ
ロン処理に応答するものであるから、有力な診断
的用途を有するのである（A.シヤトナー，G.マ
ーリン，S.レビン，D.ワラク，T.ハーンおよび
M.レベル著，”ランセツト ii”，8745497〜499頁
（1981年）およびA.シヤトナー，G.マーリン，D.
ワラク，H.ローゼンバーグ，T.ビノ，T.ハーン．
Ｓ，レビンおよびM.レベル著，”ジヤーナル・オ
ブ・インターフエロン・リサーチ”，Vol.1，587
〜594頁（1981年））。更にこのような酵素アツセ
イの用途を保護するために特許出願が行なわれて
いる（M.レベル，A.キムチ，L.シユルマンおよ
びD.ワラク，ドイツ特許第3015462号）。2′5′−オ
リゴ(A)合成酵素に対するアツセイの有用性はそれ
が間接的であるこということによつて限定され、
生物学的活性種は2′5′−オリゴ(A)それ自身であ
る。合成酵素は本願の実施例６に示されるように
2′5′−オリゴ(A)の細胞内含有量を必ずしも忠実に
反映するものではない。 2′5′−オリゴ(A)それ自身に対する検定方法を開
発することによつてこの問題を解決しようとする
企てが為された。これは細胞抽出中物において
2′5′−オリゴ(A)が蛋白合成を阻止したりエンドヌ
クレアーゼを活性化する作用を測定することによ
つて行うことが出来る（R.G.ウイリアムス，R.E.
ブラウン，C.S.ギルバート，R.R.ゴルガー，D.
H.レシユナー，W.K.ロバーツ，R.H.シルバーマ
ンおよびI.M.カー著：”メソツズ・イン・エンジ
モロジー”，Vol.79199〜208頁（1981年））。しか
しながら、これらの方法は間接的なものであり、
手間がかかり、常套の分析に適さないものであ
り、不安定な試薬の使用を含むものである。この
ためカー（Kerr）のグループはラジオイムノア
ツセイおよび放射能結合アツセイを含む改良を行
なつた（M.ナイト、D.H.レシユナー、R.H.シル
バーマンおよびI.M.カー著：”メソツズ・イン・
エンジモロジー、Vol.79，216〜227頁（1981））。
彼等のラジオイムノアツセイは生物活性に必須の
末端5′トリホスフエートの存在に鋭敏でない抗体
を使用することによるものであつた。彼等の放射
能結合アツセイは上記のヌクレアーゼに対する
2′5′−オリゴ(A)の結合に基づくものであつた。こ
のアツセイはアメルシヤム・インターナシヨナル
により結合プロテイン源としてウサギの細網細胞
溶解産物等を使用することによつて商業化され
た。このアツセイは充分な特異性を有するもので
はあるが、不安定であり、かつ慎重な取扱いを必
要とする生化学的製剤を使用しなければならず、
分解性酵素が存在するため分析物を優先的に分解
することとなり、更に結合蛋白質の親和性が有限
であるため達成し得る鋭敏度に限界があるなど、
その有用性には限度がある。上記の欠点は総て本
発明により克服される。 上記したカーらの抗体に加えてモノクロナール
抗体が製造された（H.カイラ、C.ルボーニユ・
ド・コール、D.ルー、M.デラーゲおよびJ.マル
チ著：“モノクローナル・アンテイボデイーズ・
トウ・5′−トリホスホ−（2′−5′）アデニル・アデ
ノシン・オリゴヌクレオチドズ”プロシーデイン
グス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ス
テーツ，Vol.79，4742〜4746（1982年））。このモ
ノクロナール抗体は2′5′結合に対して特異性を有
するものであるが、その標題とは異なつて末端
5′トリホスフエートの存在に対しては特異性を有
しない。カーらは免疫原として（A2′p）2Ａを用
い、過ヨード酸塩で酸化して2′末端リボースカラ
ジアルデヒドを生ぜしめ、これをシアノボロハイ
ドライドの使用によつて子牛血清アルブミンに交
差結合させた。カイラ（Cailla）らはジサクシニ
ル2′5′ApAを作り、これをカルボジイミドの使用
によつてヒト血清アルブミンに交差結合させた。 分子の生物学的に活性な形に対して特異性を有
する抗体を得ることは明らかに好ましいことであ
るから、これらのグループは前にこれを企てたか
失敗に終わつたか、あるいは免疫過程中において
分解するであろうとの予測の下に末端5′トリホス
フエートを持つ2′5′−オリゴ(A)の活性形を使用す
ることを試みなかつたと結論することが出来る。 本発明によれば新しい抗体は生存している脊椎
動物に対し完全にまたは部分的に3′−リボースお
よび2′−末端リボースアシル化2′5′−オリゴ(A)を
結合させた免疫原性物質からなる免疫原を前記動
物の免疫を惹起するに適した時間的間隔を持つて
非経口的に投与し、生じた特異的抗体を含む血液
を集め、この血液からクロツト化および要すれば
遠心分離によつて抗血清を得るか、または前記血
液から抗擬結剤の添加および遠心分離によつて血
しようを得ることにより調製することが出来る。
このようにして得られた抗体製剤が上記の二つの
報告における限定的特異性を持つた分子の僅かな
フラクシヨンのみを含んでいると言うことは驚く
べきことである。公知の技術によれば、ヌクレオ
チドとオリゴヌクレオチドはＯ−リボースアダク
トを形成する試薬によるホスホジエステラーゼ攻
撃から保護され得るものである。何故ならば、こ
れは下式に示すようにその機構の一部として（共
通の3′−5′結合ヌクレオチドの場合）2′ヒドロキ
シル基を通じて環状構造を形成するにはホスホジ
エステラーゼが必要であるからである： （たとえばD.E.メツラー著；”バイオケミスト
リー．ザ・ケミカル・リアクシヨンズ・オブ・リ
ビング・セルス”，アカデミツクプレス，ニユー
ヨーク，381〜382頁（1977年））。 免疫されつつある動物の免疫系に対する接近を
促進する結合剤を経て2′5′−オリゴ(A)を付加する
ことを含むＯ−リボース修飾が5′末端トリホスフ
エートを保護し、この発明で見出された特異性の
抗体を生ぜしめると言うことは驚くべきことであ
る。 リボースの水酸基は当該技術分野でよく知られ
ている適当な酸無水物によつてアシル化されるこ
とが出来る。たとえばI.ヤマモトのアメリカ特許
第4350761号（1982年）にはサイクリツクAMPで
アダクトを調製する方法が記載されている。この
目的に適した酸無水物の具体例としてはたとえば
ジカルボン酸無水物がある。好ましいものとして
はコハク酸無水物があり、充分にコハク酸化され
た2′5′−オリゴ(A)の式は下に示す通りである： 部分的にコハク酸エステル化された分子を使用
することもできる。 次いでアシル化2′5′−オリゴ(A)誘導体をカルボ
ジイミド試薬を使用することにより適当な免疫原
性物質に結合せしめる。適当な免疫原性物質とし
ては蛋白質、ペプチド、炭水化物、ホスホリピド
などが挙げられる。カルボジイミド試薬の具体例
としては１−エチル−３−（3′−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド、１−エチル−３−
（３−ジエチルアミノプロピルカルボジイミド、
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）カルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−
（４−ジエチルアミノシクロヘキシル）カルボジ
イミド、Ｎ−メチル−Ｎ，N′−ジ−第３級ブチ
ルカルボジイミジウムテトラフルオロボレートな
どが挙げられる。 たとえばコハク酸無水物でカツプリング反応
後、分子は下に示すような構造を有することにな
る。ただし、Ｒはたとえば利用し得るアミノ基を
経て結合した免疫原性蛋白質のようなものを現
す： 蛋白質の位置は反応条件によつて決まるもので
はない。原則としてどのサクシニル基とも反応す
ることが出来、立体構造的に可能ならば結合する
ことも可能である。サクシニル基の正確な数と位
置もまた反応条件によつて正確に決まるものでは
なく、大きな非均一性の可能性がある。これにも
拘わらず大きな均一性と特異性の抗体が本発明の
条件によつて得ることが出来る。 免疫原性蛋白質はいかなる適切な蛋白質であつ
てもよく、たとえば子牛血清アルブミン、免疫化
に用いられる同種もしくは他種のイムノグロブリ
ン、キーホールリンペツト（スカシガイ）ヘモシ
ニアン等が使用出来る。後者が特に好ましい。 免疫のためには適切な動物が使用されてよく、
たとえばヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、ラツト、
マウス、ヒヨコなどが一般に使用されている。ラ
ツトは最善の結果を与える。血清中の抗体の力価
は、好ましくは実施例に記載されたニトロセルロ
ーズ結合法により、公知方法で製造された［3Ｈ］
−2′5′−オリゴ(A)（M.A.ミンクス，S.ベンビン，
P.A.マロニーおよびC.バグリオニ著；”シンセシ
ス・オブ・2′5′−オリゴ(A)・イン・エクストラク
ツ・オブ・インターフエロン−トリーテツド・ヒ
ーラ・セルス”，ジヤーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー，Vol.254，5058〜5064頁
（1979年））またはT4ポリヌクレオチドキナーゼ
反応によつて標識化され、アメルシヤム・インタ
ーナシヨナルから入手することができる［32Ｐ］
−pCp−2′5′−オリゴ(A)を用いて検定すればよい。
最高の力価は２回のブースター注射後に得られ
る。 抗体の親和性定数（affinity constant）は、ｆ
モルで表され、［32P］標識検体（実施例２参照）
の最大結合体の50％阻止を示す化合物の量である
（実施例３参照）。ｆモルの逆数は親和性の大きさ
に比例する。 このようにして得られた抗血清は高い希釈度
（５万倍以上）でも活性を有し、凍結、融解、凍
結乾燥に対し安定であり、従つて何等の困難も無
く包装し、運搬しあるいは貯蔵することができ
る。この血清はまた特にアツセイで用いられる高
い希釈度において2′5′−オリゴ(A)分解活性を全く
欠如し、これは上記した放射結合アツセイで用い
られる細胞抽出物に対照的である。 2′5′−オリゴ(A)は生物学的材料から細胞除去抽
出物を調製するために通常用いられる抽出法によ
つて抽出する事が出来る。ただし、抽出条件下に
おいて分解や再合成が起きないように注意するこ
とが必要である。緩衝食塩水と共にホモゲナイズ
することも採用されてよいが、酸抽出が好まし
い。好ましくは冷トリクロロ酢酸抽出が採用さ
れ、特に５〜20％の範囲で使用するのが好まし
い。トリクロロ酢酸はエーテル抽出により好まし
くはフレオン−オクチルアミン抽出により除去す
ることが出来る（S.C.チエン，P.R.ブラウンおよ
びD.M.ロシー著；”エクストラクシヨン・プロ
シデユアス・フオー・ユース・プライヤー・ト
ウ・HLPC・ヌクレオチド・アナリシス・ユージ
ング・マイクロパーテイクル・ケミカリー・ボン
デツド・パツキングス”，ジヤーナル・オブ・ク
ロマクグラフイツク・サイエンス，Vol.15，218
〜222頁（1977年））。この方法は培養された細胞、
器官、組織あるいは血液、尿、脳脊髄液のような
生物学的液体を含む総ての種類の生物学的材料に
対して優れている。抽出物は凍結乾燥して容積を
減少せしめ、外的揮発性物質を除去する。要すれ
ば、クロマトグラフイ（高速液体クロマトグラフ
イまたは常套のカラムクロマトグラフイ）を付加
的に用いてもよい。ジエチルアミノエチルセルロ
ーズ上における段階的クロマトグラフイは特に分
析物の濃度の106倍以上の濃度であるところの細
胞ATPの除去に簡単かつ有用に使用である。 本発明によれば、得られた特異抗体は通常の免
疫学的分析方法により、すなわち遊離もしくは結
合リガンドの測定により、あるいは遊離または結
合抗体の測定により、あるいは抗体−抗原反応に
よつて調節される信号による抗体−リガンド反応
の測定により、生物学的材料中の5′末端モノー、
ジーまたはトリ−ホスホリル化（アデニル2′−
5′）アデノシンの分析に使用することができる。
たとえばこれは抗体−リガンドコンプレツクスを
ニトロセルローズのような固体支持体に結合させ
たのち、［32］−pCp−標識2′5′−オリゴ(A)のよう
な公知の放射性の高いリガンドの結合の低下を測
定することによつてなすことが出来る。リガンド
は適当な放射性同位元素で標識することができ
る。蛍光酵素的または冷光的部分でもつてリガン
ドを標識することも可能である。アツセイはまた
サンドイツチ型のものであつてもよく、この場合
ある一つの特異性の抗体を固体支持体に結合せし
め、これを未知の分析体を結合するために使用
し、第二の特異性を有する抗体でもつて検出す
る。サンドイツチを形成する一対のもののうち一
つは本発明によつて定義された特異抗体であつて
よく、他のものはカーまたはカイラーのグループ
によつて記載されたもの、エンラージヤーあるい
はバイサーに記載されたアデノシンに対して向け
られたもの（プロシーデイングス・オブ・ザ・ナ
シヨナル・アカデミー・オブ・ザ・ユナイテツ
ド・ステーツ，Vol.52，68〜74頁（1964年））で
あつてよい。ラベルは上記アツセイのいずれかに
対するリガンド中に存在する必要はなく、抗体の
中にあつてもよく、あるいは良く知られているよ
うに第一の抗体の一つに対して向けられた第二の
抗体の中にあつてもよい。 生物学的材料からの抽出物中における5′末端モ
ノー、ジーまたはトリ−ホスホリル化（アデニル
2′−5′）ｎアデノシンの検出のためのアツセイの
好ましい形態は上記したごとく競争結合アツセイ
である。この方法においては未知のものを公知の
放射性リガンドの既知量と混合し、希釈した抗体
と共にインキユベートし、適当な緩衝液と混合
し、ろ過装置内でニトロセルローズ上に注ぎ、過
剰の非結合リガンドを洗浄して除き、シンチレー
シヨンカウンターで数えるものである。このアツ
セイは迅速かつ簡単であり、比較的低い温度で数
分間内に反応が完了する。標識化した2′5′−オリ
ゴ(A)の結合の低下によるアツセイはここに示す通
りである： 更に鋭敏なアツセイは標識化した抗体を使用す
ることによつて行なわれる。 現在このようなアツセイの主な適用分野として
はインターフエロン作用の生化学内における研究
の分野およびホルモン、リンホカイン、成長因子
等の作用の生化学的研究の分野がある。 2′5′−オリゴ(A)の広い重要性は、2′5′−オリゴ
(A)合成酵素がインターフエロン以外の種々の系
で、たとえばエストロゲンを除去した分化したヒ
ヨコの卵管内において（G.R.スターク，W.J.ダ
ワー，R.T.シユムク，R.E.ブラウンおよびI.M.カ
ー著；”２−5A・シンセターゼ：アツセイ，デ
イストリビユーシヨン・アンド・バリエーシヨ
ン・ウイズ・グロース・ホルモン・ステータ
ス”：ネイチヤー，Vo1278，471〜473頁（1979
年））あるいは種々の試薬によつて分化が誘発さ
れたフレンド・エリスロリウケミアを移植したマ
ウスのエリスロブラスト（A.キムチ著：”イン
クリーズド・レベル・オブ・インターフエロン・
インデユーズド（2′−5′）オリゴ・イソ・アデニ
ラーゼ・シンセターゼ・インメーチユア・リンホ
サイツ・アンド・イン・デイフアレンシエーテツ
ド・フレンド・エリスロリユーケミツク・セル
ス”，ジヤーナル・オブ・インターフエロン・リ
サーチ，Vo1.1，559〜569頁（1981年））誘導さ
れると言う事実によつて証明される。合成酵素の
真の作用はその誘導とその活性体である２本鎖
RNAの同時の存在によるものであるから、この
ような情報は限られた用途を持つものである。後
期実施例においては、本発明を使用し、インター
フエロンで処理されたヒラ細胞中において、
2′5′−オリゴ(A)合成酵素が高濃度であつても
2′5′−オリゴ(A)は元の濃度から未変化であり、分
化したフレンド・エリスロリウケミア細胞中にお
いては合成酵素と2′5′−オリゴ(A)との間に平行的
な増加があることを証明する。 本発明の方法によりなされた抗体に対する付加
的な用途は5′末端モノー、ジーまたはトリ−ホス
ホリル化（アデニリル2′−5′）ｎアデノシン錯化
剤としてのものである。それは細胞を含まない蛋
白質合成系に添加することが出来、それらを加え
られたもしくは内在的2′5′−オリゴ(A)による阻止
から救済するものである。それはまた2′5′−オリ
ゴ(A)の細胞濃度を減少せしめることが望まれる場
合に治療的に使用することが出来る。 2′5′−オリゴ(A)は重要な新しく発見された信号
分子であるから、本発明の方法は研究、診断およ
び治療の分野において多くの新しい用途を見出す
ことにつながるものであろう。 2′5′−オリゴ(A)合成酵素のビールス感染、リウ
ケミア、自己免疫および結合組織疾患への診断的
応用については既にレベル（Revel）のグループ
によつてランセツト（上記参照）に発表されたお
り、またインターフエロン処理を監視するための
応用についてもジヤーナル・オブ・インターフエ
ロン・リサーチ（上記参照）に報告がある。より
簡単な方法により、より直接的かつ適切な情報を
提供するところの生物学的活性分子に対するアツ
セイの巾広い応用は上記の状況の総てにおいて期
待し得るものである。 この発明によつて提供される2′5′−オリゴ(A)に
対するより高感度の検定はまた酵素2′5′−オリゴ
(A)合成酵素に対するより鋭敏なアツセイを提供す
るものである。さらにこの酵素は活性のために２
本鎖RNAを必要とするので、２本鎖RNAに対す
る特に鋭敏なアツセイを提供するものである。こ
の方法により2′5′−オリゴ(A)合成酵素の活性化に
必要な生物学的材料中の少量の２本鎖RNAを定
量することも可能である。本発明をさらに詳細に
説明するために以下の実施例を示すが、これらの
実施例は本発明の範囲を限定することを意図され
るものではないということが理解されなければな
らない。 実施例 １ 2′5′−オリゴヌクレオチドの自然形に対する特
異抗体の製造：− 2′5′−オリゴ(A)それ自身は公知の方法（ミンク
スら，ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー 254，5058〜5064頁（1979年））により
製造されたインターフエロン処理ヒーラ細胞抽出
物を用いてある程度の量が生産される。500mlの
反応混合物は5mM ATP，3mMフラクトースー
１，６−ビホスフエート、100mM KOAC，
25mM Mg（OAc）2、10mM HEPES／KOH，PH
7.4、1mMジチオスレイトール、10μｇ／mlポリ
（rI）・ポリ（rC）および１mg／mlのインターフエ
ロン処理ヒラ細胞からのポストミトコンドリア上
澄液を含んでいる。この混合物を30℃で15時間イ
ンキユベートすると、ATPの2′5′−オリゴ(A)に対
する変換は30％以上となる。この反応は３分間煮
沸することによつて阻止され、変性した蛋白質は
遠心分離またはろ過によつて除去される。 2′5′−オリゴ(A)はジエチルアミノセルローズ
（DEAEセルローズ）上におけるイオン交換クロ
マトグラフイーによつてATPおよび他のモノヌ
クレオチド類から分離される。清澄化した煮沸抽
出物等容量の蒸留水で希釈し、10mMトリス
HCl、PH7.6中の50mM NaClまたはKClにより、
または50mM NH4HCO3またはトリエチルアミ
ンビカルボネート，PH7.6により平衡化された
DEAEセルローズカラム上に加える。このカラム
は充填カラム容量ml当たり抽出物100A260単位を
担持せしめる。典型的には400mlのカラムが使用
される。オリゴヌクレオチドを4lのグラジエント
を使用し、選択した塩の50〜400mMのグラジエ
ントにより希釈される。まずATPが溶出し、次
いでポリマー寸法が増加するにつれ、2′5′−オリ
ゴ(A)が溶出される。これはカラム溶出液の紫外線
吸収プロフアイルによつて決定することができ
る。望ましいフラクシヨンを集め、2′5′−オリゴ
(A)をアセトン５容量で沈澱させることにより脱塩
するか、または揮発性の緩衝液が使用されるなら
ば凍結乾燥によつて脱塩せしめる。 2′5′−オリゴ(A)は10％（ｖ／ｖ）トリエチルア
ミン、50mg／mlコハク酸無水物および5mM2′5′−
オリゴ(A)を含有する混合物中でサクシニル化され
る。典型的には５ml反応容積が使用される。室温
で10分間培養する。ヌクレオチドをアセトン５容
量でもつて沈澱させ、これをセフアデツクスG25
のカラムで脱塩する。 サクシニル化2′5′−オリゴ(A)はキーホールリン
ペツトヘモシアニン（カルビオケム社製）に次の
ようにして結合される。ヘモシアニンをサクシニ
ル2′5′−オリゴ(A)の10mg／ml溶液内に10mg／mlの
濃度で溶かし、１−エチル−３−（3′−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を徐々に
加え、PHをKOHによつて5.5に再調製する。縮合
反応を暗室中で室温において一夜かかつて進行せ
しめる。結合物は0.15mM Nacl、0.01Mリン酸
カリウム緩衝液、PH6.8（PBS）に対し、４℃にお
いて二日間にわたり少なくとも４回にわたつて緩
衝液を変えることにより透析を行つて反応試剤を
除く。カツプリングの程度はカツプリングの前後
におけるスペクトル変化によつて証明される。こ
の場合、2′5′−オリゴ(A)含量を測定するためA260
の価を使用するか、または元のカツプリング反応
における放射能性2′5′−オリゴ(A)の一部を含有す
ることに伴う放射能によつて行う。得られた置換
の度合いは蛋白質1mol当たりオリゴヌクレオチ
ド80〜100molの範囲にある。 ラツト、マウスまたはウサギについて免疫を成
功裡に行うには次の方法を採用する。 等容量の完全フロイントアジユバンド中におけ
るサクシニル2′5′−オリゴ(A)複合体をまず注射
し、次いで等容量の不完全フロントアジユバント
中のブースターを投与する。複合体はPBS中1N
mg／mlの濃度である。ラツトに対し、0.5mgの複
合体を腹腔内注射し、２週間の間隔をおいて同僚
を追加投与する。マウスは同様に免疫化されるが
注射毎に100μｇを使用する。ウサギは背中の５
箇所において複合体１mgを皮下注射し、３週間の
間隔をおいて0.75mgを追加して免疫化する。先の
注射後10日間にわたりラツトとマウスの場合は尾
静脈から血液を採取し、ウサギの場合は耳静脈か
ら血液採取を行う。ラツトは好ましくは150〜200
ｇの雌のを使用し、マウスは30ｇ、ウサギは３Kg
のものが好ましい。 実施例 ２ 抗血清の力価はニトロセルローズフイルターに
対し、放射能の50％保持を与える希釈度の逆数か
ら決定される。抗血清の希釈物を１mg／ml子牛血
清アルブミン（BSA）および５〜6000cpmの［32
Ｐ］末端標識2′5′AテトラマーpCp（アメルシヤ
ム・インターナシヨナル：特異活性約3000Ci／
mmol）を含む20mM KOAc，10mM HEPES−
KOH、PH7.4、1.5mM Mg（OAc）2の25μl中でイ
ンキユベートする。０℃で１時間インキユベート
したのち、混合物を氷冷した90mM KCl，
20mM トリス−HCl、PH7.6中で希釈し、ろ過
装置を使つて25mm直径のニトロセルローズデイス
ク（MI11ipore type HAWP、0.45μ）を通過せ
しめる。フイルターを前記バツフアーの２部で洗
い、保持された放射能をシンチレイターカウンタ
ー中のセレンコフ放射によつて数える。通常、第
２のブースター注射後、ラツト、マウスおよびウ
サギについてそれぞれ50000，5000おえび1000の
最大力価が得られる。 実施例 ３ 競争結合アツセイ：−親和性定数の測定 実施例２に記載した簡単なラジオイムノアセツ
テイにおいて、未知のものを公知の放射性試料の
一定量から結合した放射性を希釈することによつ
て決定する。他の関連物質はそれらの親和性に応
じて多少とも抗体に結合し、結合親和性において
減少を示すことになる。この阻止は関連化合物の
抗体に対する親和性の尺度であり、分析すべき材
料中に存在する場合、どの程度にまでこのような
化合物がアツセイを妨害するかと言うことを示す
ものである。放射性試料の結合性の50％を阻止す
る関連物質の濃度はその相対的親和性の尺度とし
て使用される。2′5′−アデニレートと関連化合物
の集合体は次のようにして調製された。ダイマ
ー、ポリマー、テトラマーおよびペンタマーを実
施例１のDEAE前記セルローズフラクシヨンから
得た。テトラマーは部分的にバクテリア性アルカ
リ性ホスフアターゼによつて消化され、成績体は
パーテイシル（Partisil）SAXカラム
（Whatman）上の高速液体クロマトグラフイーに
より10mMリン酸カリウム緩衝液、PH6.8、20％
エタノールおよび10〜500mM KClのグラジエン
トを使用することにより分離された。テトラマー
のアセチルおよびサクシニル誘導体は実施例１の
方法に従つて酢酸無水物およびコハク酸無水物を
反応させることによつて得られた。他の化合物は
商業的なソースから得られた。［32Ｐ］標識検体
（実施例２参照）の最大結合体の50％阻止を示す
種々の化合物の量を次に示す： ｆモル pppA（2′p5′A）4 2.5 pppA（2′p5′A）3 2.5 pppA（2′p5′A）2 2.5 pppA（2′p5′A） 850 ２−０−サクシニルpppA（2′p5′A）3 2.0 ２−０−アセチルpppA（2′p5′A）3 2.5 ppA（2′p5′A）3 12 pA（2′p5′A）3 25 Ａ（2′p5′A）3 500 Ａ（2′p5′A）2 500 Ａ（3′p5′A）3 2500000 pA（3′p5′A）3 250000 AMP，ADP，ATP，GTP， ＞3000000 CTP，UTP，NADH，pCp それ故、このアツセイは適当な特異性を持つた
オリゴヌクレオチドのｆモル量を検出することが
出来る。抗体の親和性は非常に高いので前例にお
ける25μlの特異物質と１mlの間の反応容量で同じ
結果を得ることが出来る。抗体の親和性は1012
M-1以下である。抗体の2′5′−オリゴ(A)の5′−ホ
スホリル化体に対する親和性は該抗体のデホスホ
リル化中心に対する親和性の20〜200倍である。
これは抗体が5′−ホスホリル化2′5′−オリゴ(A)に
対して特異的であると言う概念を支持するもので
ある。 実施例 ４ 2′5′−オリゴ(A)ラジオイムノアツセイ用抽出物
の調製：− 本例は培養液中で成育した細胞に対するもので
あるが、他の生物学的材料、たとえば細胞培養、
器官、組織、体液（血液、尿）、脳脊髄液、ミル
ク、その他の適当な入手しうる材料等に等しく適
用し得るものである。ペトリデツシユ中の細胞は
緩衝食塩水で迅速に洗い（このステツプは体液の
場合には、省略される。）、次いで細胞の層を覆う
ように氷冷５％トリクロル酢酸（TAC）を添加
し（７cm直径のペトリデイツシユに対し、３cm）、
このデイツシユを氷上に５分間保持する。TCA
および分離した細胞をとり出し、遠心分離して不
溶性物質を除去し、デイツシユとペレツトを５％
TCAの同容量により再抽出し、上澄液を集める。
この方法に代え、細胞けんだく培養においては細
胞を室温で遠心法によつてペレツト化し、この細
胞をペレツトと同容量の緩衝食塩水に再懸濁し、
５％TCA約10容量を加える。不溶性物質を遠心
法によつて除去し、ぺレツトを５％TCAの先の
容量の1/2で抽出する。上澄液を集める。TCAを
使用する総ての操作は０〜５℃の間で行う。集め
た上澄液を等容量のフレオン113（ダウ・ケミカ
ル）中の30％（ｖ／ｖ）トリ−Ｎ−オクチルアミ
ンで抽出することによつてTCAを除去する。上
方の水層を集め、フレオン層を蒸留水の前記容量
の1/2で再抽出する。生物的材料はmMの範囲で
ATPを含むので、また、nMの範囲で2′5′−オリ
ゴ(A)を測定することが望ましいので、測定を妨害
するかもしれない106過剰のATPを除去すること
が望ましい。アツセイを妨害するかも知れない
ATPおよび他のヌクレオチドは125mM NH4
HCO3（PH7.8）で平衡化したDEAEセルローズ
（Whatman DE−52）でクロマトグラフイー的に
除去する。ローデイング比は実施例１のプレパレ
イテイブカラムに対するものと同じであつてよい
が、200μlのマイクロカラムはこの分析スケール
に対し好ましいものである。カラムを同じバツフ
アー15mlで洗つて、ATPとその他の未結合物質
を除去する。2′5′−オリゴ(A)を0.5M NH4HCO3
２mlで溶出し、この試料を1/10倍容量のエタノー
ルを添加後、凍結乾燥する。この試料は無水の形
で不定期間保存し、実施例３に記載したラジオイ
ムノアツセイに対する適当容量の溶媒でもつて再
溶解されてよい。 実施例 ５ 分化細胞中の2′5′−オリゴ(A)濃度の測定：− フレンド・マウス・エリスロリユウケミア細胞
は種々の試薬、特にジメチルスルホキサイドの影
響の下に分化し、エリスロポイエテイツクとな
る。このような細胞はまた、2′5′−オリゴ(A)合成
酵素を生産することが知られている。本発明の方
法に先立つてこれらの細胞中における2′5′−オリ
ゴ(A)を直接に定量することは不可能であつた。本
例においてはこのような定量法を記載する。フレ
ンド細胞（クローンFBUまたはN46AP）を10％
牛胎児血清、２％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキサ
イド（FBUの場合）または1.4％（ｖ／ｖ）
DMSO（N46 APの場合）および1mMグルタミン
を含むダルベツコウの修正イーグル培地中で培養
する。細胞を同じ培地で毎日希釈し、濃度をml当
たり5.105細胞に維持する。時折、培地30mlを集
め、前記実施例の記載の方法に従つて処理する。
凍結乾燥材料は実施例２のようなアツセイに対す
る反応混合物に対応する緩衝液であつて、子牛血
清アルブミン0.1mg／mlを含むものに溶解する。
2′5′−オリゴ(A)含量は実施例２および３における
ような［32Ｐ］標識試料の結合度の減少によつて
決定される。次の結果が得られる：
化2′，5′−オリゴ(A)を結合せしめた免疫原性物質
を免疫原として得られる、式：5′−（ホスホ）ｍ
（アデニル2′−5′）ｎアデノシン（式中、ｍは１
〜３の整数、ｎは２〜50の整数である）で示され
るオリゴヌクレオチドに特異的な抗体であつて、
上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体の特異
性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定されることを特徴とする抗体。 ２ 生きている脊椎動物に対し完全または部分的
3′−リボースおよび2′−末端リボースアシル化2′，
5′−オリゴ(A)を結合せしめた免疫原性物質から成
る免疫原を該動物に免疫化に適した時間的間隔を
もつて非経口的に投与し、その結果生成した特異
抗体を含む血液を集め、該血液からクロツト化お
よび要すれば遠心分離することによつて血清を得
るか、または抗擬結剤の添加および遠心分離によ
つて血しようを得、血清または血しようから抗体
を採取することを特徴とする、3′−リボースおよ
び2′−末端リボースアシル化2′，5′−オリゴ(A)を
結合せしめた免疫原生物質を免疫原として得られ
る、5′−（ホスホ）ｍ（アデニル2′−5′）ｎアデノ
シン（式中、ｍは１〜３の整数、ｎは２〜50の整
数である）で示されるオリゴヌクレオチドに特異
的な抗体であつて、上記オリゴヌクレオチドに対
する上記抗体の特異性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定されることを特徴とする抗体を製造する方
法。 ３ 免疫原性物質がアシル化位置の１つまたはそ
れ以上に結合している請求の範囲第２項記載の方
法。 ４ 免疫原性物質が蛋白質、好ましくはキーホー
ルリンペツトへモシアニン、ペプチド、炭水化物
またはホスホリピドである請求の範囲第２項また
は第３項記載の方法。 ５ 2′，5′−オリゴ(A)がジカルボン酸無水物、特
にコハク酸無水物でアシル化されている請求の範
囲第２〜４項のいずれか１項記載の方法。 ６ 3′−リボースおよび2′−末端リボースアシル
化2′，5′−オリゴ(A)を結合せしめた免疫原性物質
を免疫原として得られる、式：5′−（ホスホ）ｍ
（アデニル2′−5′）ｎアデノシン（式中、ｍは１
〜３の整数、ｎは２〜50の整数である）で示され
るオリゴヌクレオチドに特異的な抗体であつて、
上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体の特異
性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定されることを特徴とする抗体を含んでな
る、３種の公知免疫学的分析方法、すなわちａ）
遊離または結合リガンドの測定による方法、ｂ）
遊離または結合抗体の測定による方法および(c)抗
原抗体反応により調節される信号によつて抗体−
リガンド反応を測定する方法のいずれかにより、
生物学的材料またはそれからの抽出物中における
第１項に述べた５−末端モノー、ジーまたはトリ
ーホスホリル化（アデニリル2′−5′）ｎアデノシ
ンを分析するための分析用試薬。 ７ リガンドが放射能、酵素、蛍光、酵素基質、
補酵素、酵素補欠分子族または冷光標識で標識さ
れており、非標識種が固体支持体に結合している
こともある請求の範囲第６項の分析用試薬。 ８ 3′−リボースおよび2′−末端リボースアシル
化2′，5′−オリゴ(A)を結合せしめた免疫原性物質
を免疫原として得られる、式：5′−（ホスホ）ｍ
（アデニル2′−5′）ｎアデノシン（式中、ｍは１
〜３の整数、ｎは２〜50の整数である）で示され
るオリゴヌクレオチドに特異的な抗体であつて、
上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体の特異
性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定されることを特徴とする抗体を含んでな
る、生物学的材料からの5′−末端モノー、ジーま
たはトリーホスホリル化（アデニル2′−5′）ｎア
デノシン［ただし、ｎは２〜50の整数である］の
除去剤。 ９ ａ）標識2′，5′−Ａテトラマートリホスフエ
ート、ｂ）2′，5′−オリゴ(A)に対する希釈抗血清
およびｃ）他の公知成分をそれぞれ所定濃度で含
有する5′−（ホスホ）ｍ（アデニル2′−5′）ｎアデ
ノシン（式中、ｍは１〜３の整数、ｎは２〜50の
整数である）の定量分析用キツト。 明細書 この発明は2′5′−オリゴヌクレオチドの自然形
に対する特異抗体、オリゴヌクレオチドを通常の
3′5′に代えて2′5′ホスホジエステル結合とカツプ
リングさせ、免疫原性物質に対し5′末端トリホス
フエートを結合させて非常に高い親和性と特異性
を有する抗体が得られるようにする方法および
2′5′−オリゴ(A)の5′−トリホスホリル化された自
然形または5′−末端モノまたはジホスホリル化
（2′−5′）アデニルアデノシンオリゴヌクレオチ
ドに対する高感度のイムノアツセイの一部として
もしくはこれらの物質の生物学的系の除去のため
のそれら（但し、抗体は、3′−リボースおよび
2′−末端リボースアシル化2′，5′−オリゴ(A)を結
合せしめた免疫原性物質を免疫原として得られ
る、式：5′−（ホスホ）ｍ（アデニル2′−5′）ｎア
デノシン（式中、ｍは１〜３の整数、ｎは２〜50
の整数である）で示されるオリゴヌクレオチドに
特異的な抗体であつて、上記オリゴヌクレオチド
に対する上記抗体の特異性が、 ａ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｎ＜２
）に対する上記抗体の親和性定数 が1/100、またはそれ以下であり； ｂ ［上記オリゴヌクレオチドに対する上記抗体
の親和性定数］／［オリゴヌクレオチド（式中、ｍ＝０
）に対する上記抗体の親和性定数］ が1/20、またはそれ以下である； で規定される）の使用に関する。 先行技術 総合的に5′−トリホスホ−（アデニリル2′5′）ア
デノシンとして知られるポリヌクレオチドのオリ
ゴマー系は2′5′−オリゴ(A)と略され、次のような
構造を有する： 上記の構造式はトリマーを示し、繰り返し単位
は点線ではさまれる部分である。これらの化合物
は最近発見されたものであつて、インターフエロ
ンに対する結合性ならびに全く新しいクラスのメ
ツセンジヤー分子を現すが故に非常な関心が高ま
つている。この点に関して最近総括的文献があ
る：M.ミンクスおよびJ.ゴードン著，”ジ・イン
ターフエロン・ルネツサンス：モレキユラー・ア
スペクツ・オブ・インダクシヨン・アンド・アク
シヨン”，マイクロバイオロジカル・レビユース，
Vol.45，244〜266頁（1981年）。2′5′−オリゴ(A)
の生物学的作用に関する推論の多くは間接的なも
のであり、インターフエロン処理細胞中に誘導さ
れる酵素2′5′−オリゴ(A)合成酵素の測定によるも
のであつた。この酵素は細胞抽出物中そのアクテ
イベイターである２本鎖RNAの存在下に非常に
効率的に作用することが出来るので容易に測定す
ることが出来る。そのような測定は、上昇した濃
度が種々の病気において認められ、インターフエ
ロン処理に応答するものであるから、有力な診断
的用途を有するのである（A.シヤトナー，G.マ
ーリン，S.レビン，D.ワラク，T.ハーンおよび
M.レベル著，”ランセツト ii”，8745497〜499頁
（1981年）およびA.シヤトナー，G.マーリン，D.
ワラク，H.ローゼンバーグ，T.ビノ，T.ハーン．
Ｓ，レビンおよびM.レベル著，”ジヤーナル・オ
ブ・インターフエロン・リサーチ”，Vol.1，587
〜594頁（1981年））。更にこのような酵素アツセ
イの用途を保護するために特許出願が行なわれて
いる（M.レベル，A.キムチ，L.シユルマンおよ
びD.ワラク，ドイツ特許第3015462号）。2′5′−オ
リゴ(A)合成酵素に対するアツセイの有用性はそれ
が間接的であるこということによつて限定され、
生物学的活性種は2′5′−オリゴ(A)それ自身であ
る。合成酵素は本願の実施例６に示されるように
2′5′−オリゴ(A)の細胞内含有量を必ずしも忠実に
反映するものではない。 2′5′−オリゴ(A)それ自身に対する検定方法を開
発することによつてこの問題を解決しようとする
企てが為された。これは細胞抽出中物において
2′5′−オリゴ(A)が蛋白合成を阻止したりエンドヌ
クレアーゼを活性化する作用を測定することによ
つて行うことが出来る（R.G.ウイリアムス，R.E.
ブラウン，C.S.ギルバート，R.R.ゴルガー，D.
H.レシユナー，W.K.ロバーツ，R.H.シルバーマ
ンおよびI.M.カー著：”メソツズ・イン・エンジ
モロジー”，Vol.79199〜208頁（1981年））。しか
しながら、これらの方法は間接的なものであり、
手間がかかり、常套の分析に適さないものであ
り、不安定な試薬の使用を含むものである。この
ためカー（Kerr）のグループはラジオイムノア
ツセイおよび放射能結合アツセイを含む改良を行
なつた（M.ナイト、D.H.レシユナー、R.H.シル
バーマンおよびI.M.カー著：”メソツズ・イン・
エンジモロジー、Vol.79，216〜227頁（1981））。
彼等のラジオイムノアツセイは生物活性に必須の
末端5′トリホスフエートの存在に鋭敏でない抗体
を使用することによるものであつた。彼等の放射
能結合アツセイは上記のヌクレアーゼに対する
2′5′−オリゴ(A)の結合に基づくものであつた。こ
のアツセイはアメルシヤム・インターナシヨナル
により結合プロテイン源としてウサギの細網細胞
溶解産物等を使用することによつて商業化され
た。このアツセイは充分な特異性を有するもので
はあるが、不安定であり、かつ慎重な取扱いを必
要とする生化学的製剤を使用しなければならず、
分解性酵素が存在するため分析物を優先的に分解
することとなり、更に結合蛋白質の親和性が有限
であるため達成し得る鋭敏度に限界があるなど、
その有用性には限度がある。上記の欠点は総て本
発明により克服される。 上記したカーらの抗体に加えてモノクロナール
抗体が製造された（H.カイラ、C.ルボーニユ・
ド・コール、D.ルー、M.デラーゲおよびJ.マル
チ著：“モノクローナル・アンテイボデイーズ・
トウ・5′−トリホスホ−（2′−5′）アデニル・アデ
ノシン・オリゴヌクレオチドズ”プロシーデイン
グス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ス
テーツ，Vol.79，4742〜4746（1982年））。このモ
ノクロナール抗体は2′5′結合に対して特異性を有
するものであるが、その標題とは異なつて末端
5′トリホスフエートの存在に対しては特異性を有
しない。カーらは免疫原として（A2′p）2Ａを用
い、過ヨード酸塩で酸化して2′末端リボースカラ
ジアルデヒドを生ぜしめ、これをシアノボロハイ
ドライドの使用によつて子牛血清アルブミンに交
差結合させた。カイラ（Cailla）らはジサクシニ
ル2′5′ApAを作り、これをカルボジイミドの使用
によつてヒト血清アルブミンに交差結合させた。 分子の生物学的に活性な形に対して特異性を有
する抗体を得ることは明らかに好ましいことであ
るから、これらのグループは前にこれを企てたか
失敗に終わつたか、あるいは免疫過程中において
分解するであろうとの予測の下に末端5′トリホス
フエートを持つ2′5′−オリゴ(A)の活性形を使用す
ることを試みなかつたと結論することが出来る。 本発明によれば新しい抗体は生存している脊椎
動物に対し完全にまたは部分的に3′−リボースお
よび2′−末端リボースアシル化2′5′−オリゴ(A)を
結合させた免疫原性物質からなる免疫原を前記動
物の免疫を惹起するに適した時間的間隔を持つて
非経口的に投与し、生じた特異的抗体を含む血液
を集め、この血液からクロツト化および要すれば
遠心分離によつて抗血清を得るか、または前記血
液から抗擬結剤の添加および遠心分離によつて血
しようを得ることにより調製することが出来る。
このようにして得られた抗体製剤が上記の二つの
報告における限定的特異性を持つた分子の僅かな
フラクシヨンのみを含んでいると言うことは驚く
べきことである。公知の技術によれば、ヌクレオ
チドとオリゴヌクレオチドはＯ−リボースアダク
トを形成する試薬によるホスホジエステラーゼ攻
撃から保護され得るものである。何故ならば、こ
れは下式に示すようにその機構の一部として（共
通の3′−5′結合ヌクレオチドの場合）2′ヒドロキ
シル基を通じて環状構造を形成するにはホスホジ
エステラーゼが必要であるからである： （たとえばD.E.メツラー著；”バイオケミスト
リー．ザ・ケミカル・リアクシヨンズ・オブ・リ
ビング・セルス”，アカデミツクプレス，ニユー
ヨーク，381〜382頁（1977年））。 免疫されつつある動物の免疫系に対する接近を
促進する結合剤を経て2′5′−オリゴ(A)を付加する
ことを含むＯ−リボース修飾が5′末端トリホスフ
エートを保護し、この発明で見出された特異性の
抗体を生ぜしめると言うことは驚くべきことであ
る。 リボースの水酸基は当該技術分野でよく知られ
ている適当な酸無水物によつてアシル化されるこ
とが出来る。たとえばI.ヤマモトのアメリカ特許
第4350761号（1982年）にはサイクリツクAMPで
アダクトを調製する方法が記載されている。この
目的に適した酸無水物の具体例としてはたとえば
ジカルボン酸無水物がある。好ましいものとして
はコハク酸無水物があり、充分にコハク酸化され
た2′5′−オリゴ(A)の式は下に示す通りである： 部分的にコハク酸エステル化された分子を使用
することもできる。 次いでアシル化2′5′−オリゴ(A)誘導体をカルボ
ジイミド試薬を使用することにより適当な免疫原
性物質に結合せしめる。適当な免疫原性物質とし
ては蛋白質、ペプチド、炭水化物、ホスホリピド
などが挙げられる。カルボジイミド試薬の具体例
としては１−エチル−３−（3′−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド、１−エチル−３−
（３−ジエチルアミノプロピルカルボジイミド、
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）カルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−
（４−ジエチルアミノシクロヘキシル）カルボジ
イミド、Ｎ−メチル−Ｎ，N′−ジ−第３級ブチ
ルカルボジイミジウムテトラフルオロボレートな
どが挙げられる。 たとえばコハク酸無水物でカツプリング反応
後、分子は下に示すような構造を有することにな
る。ただし、Ｒはたとえば利用し得るアミノ基を
経て結合した免疫原性蛋白質のようなものを現
す： 蛋白質の位置は反応条件によつて決まるもので
はない。原則としてどのサクシニル基とも反応す
ることが出来、立体構造的に可能ならば結合する
ことも可能である。サクシニル基の正確な数と位
置もまた反応条件によつて正確に決まるものでは
なく、大きな非均一性の可能性がある。これにも
拘わらず大きな均一性と特異性の抗体が本発明の
条件によつて得ることが出来る。 免疫原性蛋白質はいかなる適切な蛋白質であつ
てもよく、たとえば子牛血清アルブミン、免疫化
に用いられる同種もしくは他種のイムノグロブリ
ン、キーホールリンペツト（スカシガイ）ヘモシ
ニアン等が使用出来る。後者が特に好ましい。 免疫のためには適切な動物が使用されてよく、
たとえばヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、ラツト、
マウス、ヒヨコなどが一般に使用されている。ラ
ツトは最善の結果を与える。血清中の抗体の力価
は、好ましくは実施例に記載されたニトロセルロ
ーズ結合法により、公知方法で製造された［3Ｈ］
−2′5′−オリゴ(A)（M.A.ミンクス，S.ベンビン，
P.A.マロニーおよびC.バグリオニ著；”シンセシ
ス・オブ・2′5′−オリゴ(A)・イン・エクストラク
ツ・オブ・インターフエロン−トリーテツド・ヒ
ーラ・セルス”，ジヤーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー，Vol.254，5058〜5064頁
（1979年））またはT4ポリヌクレオチドキナーゼ
反応によつて標識化され、アメルシヤム・インタ
ーナシヨナルから入手することができる［32Ｐ］
−pCp−2′5′−オリゴ(A)を用いて検定すればよい。
最高の力価は２回のブースター注射後に得られ
る。 抗体の親和性定数（affinity constant）は、ｆ
モルで表され、［32P］標識検体（実施例２参照）
の最大結合体の50％阻止を示す化合物の量である
（実施例３参照）。ｆモルの逆数は親和性の大きさ
に比例する。 このようにして得られた抗血清は高い希釈度
（５万倍以上）でも活性を有し、凍結、融解、凍
結乾燥に対し安定であり、従つて何等の困難も無
く包装し、運搬しあるいは貯蔵することができ
る。この血清はまた特にアツセイで用いられる高
い希釈度において2′5′−オリゴ(A)分解活性を全く
欠如し、これは上記した放射結合アツセイで用い
られる細胞抽出物に対照的である。 2′5′−オリゴ(A)は生物学的材料から細胞除去抽
出物を調製するために通常用いられる抽出法によ
つて抽出する事が出来る。ただし、抽出条件下に
おいて分解や再合成が起きないように注意するこ
とが必要である。緩衝食塩水と共にホモゲナイズ
することも採用されてよいが、酸抽出が好まし
い。好ましくは冷トリクロロ酢酸抽出が採用さ
れ、特に５〜20％の範囲で使用するのが好まし
い。トリクロロ酢酸はエーテル抽出により好まし
くはフレオン−オクチルアミン抽出により除去す
ることが出来る（S.C.チエン，P.R.ブラウンおよ
びD.M.ロシー著；”エクストラクシヨン・プロ
シデユアス・フオー・ユース・プライヤー・ト
ウ・HLPC・ヌクレオチド・アナリシス・ユージ
ング・マイクロパーテイクル・ケミカリー・ボン
デツド・パツキングス”，ジヤーナル・オブ・ク
ロマクグラフイツク・サイエンス，Vol.15，218
〜222頁（1977年））。この方法は培養された細胞、
器官、組織あるいは血液、尿、脳脊髄液のような
生物学的液体を含む総ての種類の生物学的材料に
対して優れている。抽出物は凍結乾燥して容積を
減少せしめ、外的揮発性物質を除去する。要すれ
ば、クロマトグラフイ（高速液体クロマトグラフ
イまたは常套のカラムクロマトグラフイ）を付加
的に用いてもよい。ジエチルアミノエチルセルロ
ーズ上における段階的クロマトグラフイは特に分
析物の濃度の106倍以上の濃度であるところの細
胞ATPの除去に簡単かつ有用に使用である。 本発明によれば、得られた特異抗体は通常の免
疫学的分析方法により、すなわち遊離もしくは結
合リガンドの測定により、あるいは遊離または結
合抗体の測定により、あるいは抗体−抗原反応に
よつて調節される信号による抗体−リガンド反応
の測定により、生物学的材料中の5′末端モノー、
ジーまたはトリ−ホスホリル化（アデニル2′−
5′）アデノシンの分析に使用することができる。
たとえばこれは抗体−リガンドコンプレツクスを
ニトロセルローズのような固体支持体に結合させ
たのち、［32］−pCp−標識2′5′−オリゴ(A)のよう
な公知の放射性の高いリガンドの結合の低下を測
定することによつてなすことが出来る。リガンド
は適当な放射性同位元素で標識することができ
る。蛍光酵素的または冷光的部分でもつてリガン
ドを標識することも可能である。アツセイはまた
サンドイツチ型のものであつてもよく、この場合
ある一つの特異性の抗体を固体支持体に結合せし
め、これを未知の分析体を結合するために使用
し、第二の特異性を有する抗体でもつて検出す
る。サンドイツチを形成する一対のもののうち一
つは本発明によつて定義された特異抗体であつて
よく、他のものはカーまたはカイラーのグループ
によつて記載されたもの、エンラージヤーあるい
はバイサーに記載されたアデノシンに対して向け
られたもの（プロシーデイングス・オブ・ザ・ナ
シヨナル・アカデミー・オブ・ザ・ユナイテツ
ド・ステーツ，Vol.52，68〜74頁（1964年））で
あつてよい。ラベルは上記アツセイのいずれかに
対するリガンド中に存在する必要はなく、抗体の
中にあつてもよく、あるいは良く知られているよ
うに第一の抗体の一つに対して向けられた第二の
抗体の中にあつてもよい。 生物学的材料からの抽出物中における5′末端モ
ノー、ジーまたはトリ−ホスホリル化（アデニル
2′−5′）ｎアデノシンの検出のためのアツセイの
好ましい形態は上記したごとく競争結合アツセイ
である。この方法においては未知のものを公知の
放射性リガンドの既知量と混合し、希釈した抗体
と共にインキユベートし、適当な緩衝液と混合
し、ろ過装置内でニトロセルローズ上に注ぎ、過
剰の非結合リガンドを洗浄して除き、シンチレー
シヨンカウンターで数えるものである。このアツ
セイは迅速かつ簡単であり、比較的低い温度で数
分間内に反応が完了する。標識化した2′5′−オリ
ゴ(A)の結合の低下によるアツセイはここに示す通
りである： 更に鋭敏なアツセイは標識化した抗体を使用す
ることによつて行なわれる。 現在このようなアツセイの主な適用分野として
はインターフエロン作用の生化学内における研究
の分野およびホルモン、リンホカイン、成長因子
等の作用の生化学的研究の分野がある。 2′5′−オリゴ(A)の広い重要性は、2′5′−オリゴ
(A)合成酵素がインターフエロン以外の種々の系
で、たとえばエストロゲンを除去した分化したヒ
ヨコの卵管内において（G.R.スターク，W.J.ダ
ワー，R.T.シユムク，R.E.ブラウンおよびI.M.カ
ー著；”２−5A・シンセターゼ：アツセイ，デ
イストリビユーシヨン・アンド・バリエーシヨ
ン・ウイズ・グロース・ホルモン・ステータ
ス”：ネイチヤー，Vo1278，471〜473頁（1979
年））あるいは種々の試薬によつて分化が誘発さ
れたフレンド・エリスロリウケミアを移植したマ
ウスのエリスロブラスト（A.キムチ著：”イン
クリーズド・レベル・オブ・インターフエロン・
インデユーズド（2′−5′）オリゴ・イソ・アデニ
ラーゼ・シンセターゼ・インメーチユア・リンホ
サイツ・アンド・イン・デイフアレンシエーテツ
ド・フレンド・エリスロリユーケミツク・セル
ス”，ジヤーナル・オブ・インターフエロン・リ
サーチ，Vo1.1，559〜569頁（1981年））誘導さ
れると言う事実によつて証明される。合成酵素の
真の作用はその誘導とその活性体である２本鎖
RNAの同時の存在によるものであるから、この
ような情報は限られた用途を持つものである。後
期実施例においては、本発明を使用し、インター
フエロンで処理されたヒラ細胞中において、
2′5′−オリゴ(A)合成酵素が高濃度であつても
2′5′−オリゴ(A)は元の濃度から未変化であり、分
化したフレンド・エリスロリウケミア細胞中にお
いては合成酵素と2′5′−オリゴ(A)との間に平行的
な増加があることを証明する。 本発明の方法によりなされた抗体に対する付加
的な用途は5′末端モノー、ジーまたはトリ−ホス
ホリル化（アデニリル2′−5′）ｎアデノシン錯化
剤としてのものである。それは細胞を含まない蛋
白質合成系に添加することが出来、それらを加え
られたもしくは内在的2′5′−オリゴ(A)による阻止
から救済するものである。それはまた2′5′−オリ
ゴ(A)の細胞濃度を減少せしめることが望まれる場
合に治療的に使用することが出来る。 2′5′−オリゴ(A)は重要な新しく発見された信号
分子であるから、本発明の方法は研究、診断およ
び治療の分野において多くの新しい用途を見出す
ことにつながるものであろう。 2′5′−オリゴ(A)合成酵素のビールス感染、リウ
ケミア、自己免疫および結合組織疾患への診断的
応用については既にレベル（Revel）のグループ
によつてランセツト（上記参照）に発表されたお
り、またインターフエロン処理を監視するための
応用についてもジヤーナル・オブ・インターフエ
ロン・リサーチ（上記参照）に報告がある。より
簡単な方法により、より直接的かつ適切な情報を
提供するところの生物学的活性分子に対するアツ
セイの巾広い応用は上記の状況の総てにおいて期
待し得るものである。 この発明によつて提供される2′5′−オリゴ(A)に
対するより高感度の検定はまた酵素2′5′−オリゴ
(A)合成酵素に対するより鋭敏なアツセイを提供す
るものである。さらにこの酵素は活性のために２
本鎖RNAを必要とするので、２本鎖RNAに対す
る特に鋭敏なアツセイを提供するものである。こ
の方法により2′5′−オリゴ(A)合成酵素の活性化に
必要な生物学的材料中の少量の２本鎖RNAを定
量することも可能である。本発明をさらに詳細に
説明するために以下の実施例を示すが、これらの
実施例は本発明の範囲を限定することを意図され
るものではないということが理解されなければな
らない。 実施例 １ 2′5′−オリゴヌクレオチドの自然形に対する特
異抗体の製造：− 2′5′−オリゴ(A)それ自身は公知の方法（ミンク
スら，ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー 254，5058〜5064頁（1979年））により
製造されたインターフエロン処理ヒーラ細胞抽出
物を用いてある程度の量が生産される。500mlの
反応混合物は5mM ATP，3mMフラクトースー
１，６−ビホスフエート、100mM KOAC，
25mM Mg（OAc）2、10mM HEPES／KOH，PH
7.4、1mMジチオスレイトール、10μｇ／mlポリ
（rI）・ポリ（rC）および１mg／mlのインターフエ
ロン処理ヒラ細胞からのポストミトコンドリア上
澄液を含んでいる。この混合物を30℃で15時間イ
ンキユベートすると、ATPの2′5′−オリゴ(A)に対
する変換は30％以上となる。この反応は３分間煮
沸することによつて阻止され、変性した蛋白質は
遠心分離またはろ過によつて除去される。 2′5′−オリゴ(A)はジエチルアミノセルローズ
（DEAEセルローズ）上におけるイオン交換クロ
マトグラフイーによつてATPおよび他のモノヌ
クレオチド類から分離される。清澄化した煮沸抽
出物等容量の蒸留水で希釈し、10mMトリス
HCl、PH7.6中の50mM NaClまたはKClにより、
または50mM NH4HCO3またはトリエチルアミ
ンビカルボネート，PH7.6により平衡化された
DEAEセルローズカラム上に加える。このカラム
は充填カラム容量ml当たり抽出物100A260単位を
担持せしめる。典型的には400mlのカラムが使用
される。オリゴヌクレオチドを4lのグラジエント
を使用し、選択した塩の50〜400mMのグラジエ
ントにより希釈される。まずATPが溶出し、次
いでポリマー寸法が増加するにつれ、2′5′−オリ
ゴ(A)が溶出される。これはカラム溶出液の紫外線
吸収プロフアイルによつて決定することができ
る。望ましいフラクシヨンを集め、2′5′−オリゴ
(A)をアセトン５容量で沈澱させることにより脱塩
するか、または揮発性の緩衝液が使用されるなら
ば凍結乾燥によつて脱塩せしめる。 2′5′−オリゴ(A)は10％（ｖ／ｖ）トリエチルア
ミン、50mg／mlコハク酸無水物および5mM2′5′−
オリゴ(A)を含有する混合物中でサクシニル化され
る。典型的には５ml反応容積が使用される。室温
で10分間培養する。ヌクレオチドをアセトン５容
量でもつて沈澱させ、これをセフアデツクスG25
のカラムで脱塩する。 サクシニル化2′5′−オリゴ(A)はキーホールリン
ペツトヘモシアニン（カルビオケム社製）に次の
ようにして結合される。ヘモシアニンをサクシニ
ル2′5′−オリゴ(A)の10mg／ml溶液内に10mg／mlの
濃度で溶かし、１−エチル−３−（3′−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を徐々に
加え、PHをKOHによつて5.5に再調製する。縮合
反応を暗室中で室温において一夜かかつて進行せ
しめる。結合物は0.15mM Nacl、0.01Mリン酸
カリウム緩衝液、PH6.8（PBS）に対し、４℃にお
いて二日間にわたり少なくとも４回にわたつて緩
衝液を変えることにより透析を行つて反応試剤を
除く。カツプリングの程度はカツプリングの前後
におけるスペクトル変化によつて証明される。こ
の場合、2′5′−オリゴ(A)含量を測定するためA260
の価を使用するか、または元のカツプリング反応
における放射能性2′5′−オリゴ(A)の一部を含有す
ることに伴う放射能によつて行う。得られた置換
の度合いは蛋白質1mol当たりオリゴヌクレオチ
ド80〜100molの範囲にある。 ラツト、マウスまたはウサギについて免疫を成
功裡に行うには次の方法を採用する。 等容量の完全フロイントアジユバンド中におけ
るサクシニル2′5′−オリゴ(A)複合体をまず注射
し、次いで等容量の不完全フロントアジユバント
中のブースターを投与する。複合体はPBS中1N
mg／mlの濃度である。ラツトに対し、0.5mgの複
合体を腹腔内注射し、２週間の間隔をおいて同僚
を追加投与する。マウスは同様に免疫化されるが
注射毎に100μｇを使用する。ウサギは背中の５
箇所において複合体１mgを皮下注射し、３週間の
間隔をおいて0.75mgを追加して免疫化する。先の
注射後10日間にわたりラツトとマウスの場合は尾
静脈から血液を採取し、ウサギの場合は耳静脈か
ら血液採取を行う。ラツトは好ましくは150〜200
ｇの雌のを使用し、マウスは30ｇ、ウサギは３Kg
のものが好ましい。 実施例 ２ 抗血清の力価はニトロセルローズフイルターに
対し、放射能の50％保持を与える希釈度の逆数か
ら決定される。抗血清の希釈物を１mg／ml子牛血
清アルブミン（BSA）および５〜6000cpmの［32
Ｐ］末端標識2′5′AテトラマーpCp（アメルシヤ
ム・インターナシヨナル：特異活性約3000Ci／
mmol）を含む20mM KOAc，10mM HEPES−
KOH、PH7.4、1.5mM Mg（OAc）2の25μl中でイ
ンキユベートする。０℃で１時間インキユベート
したのち、混合物を氷冷した90mM KCl，
20mM トリス−HCl、PH7.6中で希釈し、ろ過
装置を使つて25mm直径のニトロセルローズデイス
ク（MI11ipore type HAWP、0.45μ）を通過せ
しめる。フイルターを前記バツフアーの２部で洗
い、保持された放射能をシンチレイターカウンタ
ー中のセレンコフ放射によつて数える。通常、第
２のブースター注射後、ラツト、マウスおよびウ
サギについてそれぞれ50000，5000おえび1000の
最大力価が得られる。 実施例 ３ 競争結合アツセイ：−親和性定数の測定 実施例２に記載した簡単なラジオイムノアセツ
テイにおいて、未知のものを公知の放射性試料の
一定量から結合した放射性を希釈することによつ
て決定する。他の関連物質はそれらの親和性に応
じて多少とも抗体に結合し、結合親和性において
減少を示すことになる。この阻止は関連化合物の
抗体に対する親和性の尺度であり、分析すべき材
料中に存在する場合、どの程度にまでこのような
化合物がアツセイを妨害するかと言うことを示す
ものである。放射性試料の結合性の50％を阻止す
る関連物質の濃度はその相対的親和性の尺度とし
て使用される。2′5′−アデニレートと関連化合物
の集合体は次のようにして調製された。ダイマ
ー、ポリマー、テトラマーおよびペンタマーを実
施例１のDEAE前記セルローズフラクシヨンから
得た。テトラマーは部分的にバクテリア性アルカ
リ性ホスフアターゼによつて消化され、成績体は
パーテイシル（Partisil）SAXカラム
（Whatman）上の高速液体クロマトグラフイーに
より10mMリン酸カリウム緩衝液、PH6.8、20％
エタノールおよび10〜500mM KClのグラジエン
トを使用することにより分離された。テトラマー
のアセチルおよびサクシニル誘導体は実施例１の
方法に従つて酢酸無水物およびコハク酸無水物を
反応させることによつて得られた。他の化合物は
商業的なソースから得られた。［32Ｐ］標識検体
（実施例２参照）の最大結合体の50％阻止を示す
種々の化合物の量を次に示す： ｆモル pppA（2′p5′A）4 2.5 pppA（2′p5′A）3 2.5 pppA（2′p5′A）2 2.5 pppA（2′p5′A） 850 ２−０−サクシニルpppA（2′p5′A）3 2.0 ２−０−アセチルpppA（2′p5′A）3 2.5 ppA（2′p5′A）3 12 pA（2′p5′A）3 25 Ａ（2′p5′A）3 500 Ａ（2′p5′A）2 500 Ａ（3′p5′A）3 2500000 pA（3′p5′A）3 250000 AMP，ADP，ATP，GTP， ＞3000000 CTP，UTP，NADH，pCp それ故、このアツセイは適当な特異性を持つた
オリゴヌクレオチドのｆモル量を検出することが
出来る。抗体の親和性は非常に高いので前例にお
ける25μlの特異物質と１mlの間の反応容量で同じ
結果を得ることが出来る。抗体の親和性は1012
M-1以下である。抗体の2′5′−オリゴ(A)の5′−ホ
スホリル化体に対する親和性は該抗体のデホスホ
リル化中心に対する親和性の20〜200倍である。
これは抗体が5′−ホスホリル化2′5′−オリゴ(A)に
対して特異的であると言う概念を支持するもので
ある。 実施例 ４ 2′5′−オリゴ(A)ラジオイムノアツセイ用抽出物
の調製：− 本例は培養液中で成育した細胞に対するもので
あるが、他の生物学的材料、たとえば細胞培養、
器官、組織、体液（血液、尿）、脳脊髄液、ミル
ク、その他の適当な入手しうる材料等に等しく適
用し得るものである。ペトリデツシユ中の細胞は
緩衝食塩水で迅速に洗い（このステツプは体液の
場合には、省略される。）、次いで細胞の層を覆う
ように氷冷５％トリクロル酢酸（TAC）を添加
し（７cm直径のペトリデイツシユに対し、３cm）、
このデイツシユを氷上に５分間保持する。TCA
および分離した細胞をとり出し、遠心分離して不
溶性物質を除去し、デイツシユとペレツトを５％
TCAの同容量により再抽出し、上澄液を集める。
この方法に代え、細胞けんだく培養においては細
胞を室温で遠心法によつてペレツト化し、この細
胞をペレツトと同容量の緩衝食塩水に再懸濁し、
５％TCA約10容量を加える。不溶性物質を遠心
法によつて除去し、ぺレツトを５％TCAの先の
容量の1/2で抽出する。上澄液を集める。TCAを
使用する総ての操作は０〜５℃の間で行う。集め
た上澄液を等容量のフレオン113（ダウ・ケミカ
ル）中の30％（ｖ／ｖ）トリ−Ｎ−オクチルアミ
ンで抽出することによつてTCAを除去する。上
方の水層を集め、フレオン層を蒸留水の前記容量
の1/2で再抽出する。生物的材料はmMの範囲で
ATPを含むので、また、nMの範囲で2′5′−オリ
ゴ(A)を測定することが望ましいので、測定を妨害
するかもしれない106過剰のATPを除去すること
が望ましい。アツセイを妨害するかも知れない
ATPおよび他のヌクレオチドは125mM NH4
HCO3（PH7.8）で平衡化したDEAEセルローズ
（Whatman DE−52）でクロマトグラフイー的に
除去する。ローデイング比は実施例１のプレパレ
イテイブカラムに対するものと同じであつてよい
が、200μlのマイクロカラムはこの分析スケール
に対し好ましいものである。カラムを同じバツフ
アー15mlで洗つて、ATPとその他の未結合物質
を除去する。2′5′−オリゴ(A)を0.5M NH4HCO3
２mlで溶出し、この試料を1/10倍容量のエタノー
ルを添加後、凍結乾燥する。この試料は無水の形
で不定期間保存し、実施例３に記載したラジオイ
ムノアツセイに対する適当容量の溶媒でもつて再
溶解されてよい。 実施例 ５ 分化細胞中の2′5′−オリゴ(A)濃度の測定：− フレンド・マウス・エリスロリユウケミア細胞
は種々の試薬、特にジメチルスルホキサイドの影
響の下に分化し、エリスロポイエテイツクとな
る。このような細胞はまた、2′5′−オリゴ(A)合成
酵素を生産することが知られている。本発明の方
法に先立つてこれらの細胞中における2′5′−オリ
ゴ(A)を直接に定量することは不可能であつた。本
例においてはこのような定量法を記載する。フレ
ンド細胞（クローンFBUまたはN46AP）を10％
牛胎児血清、２％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキサ
イド（FBUの場合）または1.4％（ｖ／ｖ）
DMSO（N46 APの場合）および1mMグルタミン
を含むダルベツコウの修正イーグル培地中で培養
する。細胞を同じ培地で毎日希釈し、濃度をml当
たり5.105細胞に維持する。時折、培地30mlを集
め、前記実施例の記載の方法に従つて処理する。
凍結乾燥材料は実施例２のようなアツセイに対す
る反応混合物に対応する緩衝液であつて、子牛血
清アルブミン0.1mg／mlを含むものに溶解する。
2′5′−オリゴ(A)含量は実施例２および３における
ような［32Ｐ］標識試料の結合度の減少によつて
決定される。次の結果が得られる：
【表】
【表】
N46APセルラインの場合においては2′5′−オリ
ゴ(A)合成酵素の最初の出現と2′5′−オリゴ(A)それ
自身の間に遅れがあるが、FBUラインにおいて
は両者は平行している。この例は最初インターフ
エロンで処理されなかつた細胞中に2′5′−オリゴ
(A)の定量の可能性を初めて証明するものである。 実施例 ６ ヒーラ細胞で処理されたインターフエロン中に
おける2′5′−オリゴ(A)の定量：− ヒーラ細胞の培養物は2′5′−オリゴ(A)合成酵素
の誘導におけるインターフエロンに非常に良く応
答する（実施例１参照）。基本的な2′5′−オリゴ
(A)それ自身は他の方法で測定するには低過ぎる。
本例はこのような測定を証明するものである。
S3ラインのヒーラ細胞をインターフエロンα2の
20単位mlの存在下、24時間にわたつて培養する。
細胞を遠心分離し、実施例４に従つて処理する。
2′5′−オリゴ(A)合成酵素を平行培地中、文献に記
載した方法によつて定量する。合成酵素は基本的
濃度の10倍以上に増加するが、2′5′−オリゴ(A)そ
れ自身は基本的濃度0.45±0.15nMにとどまる。
これは2′5′−オリゴ(A)合成酵素濃度が必ずしも常
に生物学的活性種2′5′−オリゴ(A)を示すものでは
ないということを証明する。 実施例 ７ 2′5′−オリゴ(A)合成酵素に対する増強された鋭
敏性アツセイ：− 細胞を含まない系は著しく効率的な反応条件で
あるから、2′5′−オリゴ(A)合成酵素の低濃度を定
量することが可能である。しかしながら、高価な
原料物質の極めて少量から低濃度を測定すること
が望ましい場合がある。本発明方法による著しく
鋭敏な2′5′−オリゴ(A)の測定方法を2′5′−オリゴ
(A)ポリメラーゼの酵素的定量法と組み合わせるこ
とによりこれまで可能であつた感度の105倍以上
高い感度で酵素を定量することが出来る。本例に
おいて、スイスマウス3T3フイブロブラスト細胞
は種々のホルモンとフアクターにより細胞周期へ
刺激する（この点の文献としてJ.ゴードン，P.J.
ニールセン、K.L.マンチエスター，H.タウビン，
L.ジメネ・ド・アシユアおよびＧ・トーマス
著；”クリテリア・フオー・エスタブリツシユメ
ント・オブ・ザ・バイオロジカル・シグニフイカ
ンス・オブ・リボソ−マル、プロテイン、ホスホ
リレーシヨン”カレント・トピツクス・セルラ
ー・レギユレーシヨン，Vo1.21，89〜99頁
（1982年））。10cmペトリデイツシユ中におけるダ
ルベツコ改良イーグル最小培地および10％牛胎児
血清中でキツセント3T3細胞を種々の試薬で一晩
処理する。翌日、単層をリン酸緩衝生理食塩水で
洗い、細胞をデイツシユ当たり該食塩水２ml中に
懸濁させる。セルを５分間800ｇで遠心分離し、
パツクした細胞を０℃において10分間２回に亙り
ペレツト容量の10mM HEPES−KOH、PH7.4、
20mM KOAc、1.5mM Mg（OAc）2、2mM
DTT、0.1％（ｖ／ｖ）tritonX−100および10％
グリセリンで処理する。細胞片を30000ｇで10分
間にわたり遠心分離して除去し、上澄液を2′5′−
オリゴ(A)ポリメラーゼ源として使用する。上澄液
（40μl、30A260）を100μlのポリ（rI）．ポリ（rC）
−アガロースビーズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals）
および100μlの20mM トリス−HCl PH7.6、
225mM KOAc、12mMMg（OAc）2、1mMジチ
オスレイトール、10μMフエニルメチルスルホニ
ルクロリドおよび10％グリセリンと混合する。非
吸着物質は遠心してビーズをペレツトにしてから
除き、アガロースを上記緩衝液200μlづつで３回
にわたり洗浄する。2′5′−オリゴ(A)合成は
500000cpmの［3Ｈ］−ATPを含む10mM ATPを
補給した前記緩衝液50μlの存在下一夜で行進す
る。反応を90mM KCl、20mM トリスーHClPH
7.6、150μlの添加によつて停止せしめる。遠心分
離によつてビーズを除き、上澄液を２分する。そ
の一方は常套のアツセイ用であり、他方は反応成
績体のラジオイムノアツセイ用である。一部
（198μl）は分析用DEAEセルローズカラム上の放
射能の保持によりATPから2′5′−オリゴ(A)への変
換について分析する（実施例４参照）。他の部分
2μlは250〜10000倍に希釈し、ラジオイムノアツ
セイによつて2′5′−オリゴ(A)を定量する（実施例
３参照）。次の結果が得られる。
ゴ(A)合成酵素の最初の出現と2′5′−オリゴ(A)それ
自身の間に遅れがあるが、FBUラインにおいて
は両者は平行している。この例は最初インターフ
エロンで処理されなかつた細胞中に2′5′−オリゴ
(A)の定量の可能性を初めて証明するものである。 実施例 ６ ヒーラ細胞で処理されたインターフエロン中に
おける2′5′−オリゴ(A)の定量：− ヒーラ細胞の培養物は2′5′−オリゴ(A)合成酵素
の誘導におけるインターフエロンに非常に良く応
答する（実施例１参照）。基本的な2′5′−オリゴ
(A)それ自身は他の方法で測定するには低過ぎる。
本例はこのような測定を証明するものである。
S3ラインのヒーラ細胞をインターフエロンα2の
20単位mlの存在下、24時間にわたつて培養する。
細胞を遠心分離し、実施例４に従つて処理する。
2′5′−オリゴ(A)合成酵素を平行培地中、文献に記
載した方法によつて定量する。合成酵素は基本的
濃度の10倍以上に増加するが、2′5′−オリゴ(A)そ
れ自身は基本的濃度0.45±0.15nMにとどまる。
これは2′5′−オリゴ(A)合成酵素濃度が必ずしも常
に生物学的活性種2′5′−オリゴ(A)を示すものでは
ないということを証明する。 実施例 ７ 2′5′−オリゴ(A)合成酵素に対する増強された鋭
敏性アツセイ：− 細胞を含まない系は著しく効率的な反応条件で
あるから、2′5′−オリゴ(A)合成酵素の低濃度を定
量することが可能である。しかしながら、高価な
原料物質の極めて少量から低濃度を測定すること
が望ましい場合がある。本発明方法による著しく
鋭敏な2′5′−オリゴ(A)の測定方法を2′5′−オリゴ
(A)ポリメラーゼの酵素的定量法と組み合わせるこ
とによりこれまで可能であつた感度の105倍以上
高い感度で酵素を定量することが出来る。本例に
おいて、スイスマウス3T3フイブロブラスト細胞
は種々のホルモンとフアクターにより細胞周期へ
刺激する（この点の文献としてJ.ゴードン，P.J.
ニールセン、K.L.マンチエスター，H.タウビン，
L.ジメネ・ド・アシユアおよびＧ・トーマス
著；”クリテリア・フオー・エスタブリツシユメ
ント・オブ・ザ・バイオロジカル・シグニフイカ
ンス・オブ・リボソ−マル、プロテイン、ホスホ
リレーシヨン”カレント・トピツクス・セルラ
ー・レギユレーシヨン，Vo1.21，89〜99頁
（1982年））。10cmペトリデイツシユ中におけるダ
ルベツコ改良イーグル最小培地および10％牛胎児
血清中でキツセント3T3細胞を種々の試薬で一晩
処理する。翌日、単層をリン酸緩衝生理食塩水で
洗い、細胞をデイツシユ当たり該食塩水２ml中に
懸濁させる。セルを５分間800ｇで遠心分離し、
パツクした細胞を０℃において10分間２回に亙り
ペレツト容量の10mM HEPES−KOH、PH7.4、
20mM KOAc、1.5mM Mg（OAc）2、2mM
DTT、0.1％（ｖ／ｖ）tritonX−100および10％
グリセリンで処理する。細胞片を30000ｇで10分
間にわたり遠心分離して除去し、上澄液を2′5′−
オリゴ(A)ポリメラーゼ源として使用する。上澄液
（40μl、30A260）を100μlのポリ（rI）．ポリ（rC）
−アガロースビーズ（Ｐ−Ｌ Biochemicals）
および100μlの20mM トリス−HCl PH7.6、
225mM KOAc、12mMMg（OAc）2、1mMジチ
オスレイトール、10μMフエニルメチルスルホニ
ルクロリドおよび10％グリセリンと混合する。非
吸着物質は遠心してビーズをペレツトにしてから
除き、アガロースを上記緩衝液200μlづつで３回
にわたり洗浄する。2′5′−オリゴ(A)合成は
500000cpmの［3Ｈ］−ATPを含む10mM ATPを
補給した前記緩衝液50μlの存在下一夜で行進す
る。反応を90mM KCl、20mM トリスーHClPH
7.6、150μlの添加によつて停止せしめる。遠心分
離によつてビーズを除き、上澄液を２分する。そ
の一方は常套のアツセイ用であり、他方は反応成
績体のラジオイムノアツセイ用である。一部
（198μl）は分析用DEAEセルローズカラム上の放
射能の保持によりATPから2′5′−オリゴ(A)への変
換について分析する（実施例４参照）。他の部分
2μlは250〜10000倍に希釈し、ラジオイムノアツ
セイによつて2′5′−オリゴ(A)を定量する（実施例
３参照）。次の結果が得られる。
【表】
スタグランジ
ンF2α
＋100μ／ml 4109 2000
インターフエ
ロン
アツセイの背 (197) 0
景
ンF2α
＋100μ／ml 4109 2000
インターフエ
ロン
アツセイの背 (197) 0
景
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8306617 | 1983-03-10 | ||
| GB08306617A GB2136435A (en) | 1983-03-10 | 1983-03-10 | Specific anti-oligo (a) antibodies |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60500865A JPS60500865A (ja) | 1985-06-06 |
| JPH058720B2 true JPH058720B2 (ja) | 1993-02-02 |
Family
ID=10539319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59501178A Granted JPS60500865A (ja) | 1983-03-10 | 1984-03-06 | ２’５’−オリゴヌクレオチドの自然形に対する特異抗体、その製造法およびそのイムノアッセイまたは生物系における２’５’−オリゴヌクレオチドを結合するための試薬としての使用 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4743539A (ja) |
| EP (1) | EP0137822B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60500865A (ja) |
| DE (1) | DE3468324D1 (ja) |
| GB (1) | GB2136435A (ja) |
| IT (1) | IT1175455B (ja) |
| WO (1) | WO1984003444A1 (ja) |
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| US5352584A (en) * | 1990-01-22 | 1994-10-04 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Monoclonal antibodies which bind (E)-5- (2-bromovinyl)-arabinofuranosyluracil and diagnostic methods based thereon |
| ES2188667T3 (es) * | 1994-09-14 | 2003-07-01 | Univ Temple | 2',5'-oligoadenilatos de fosforotioato/fosfodiester y sus usos antivirales. |
-
1983
- 1983-03-10 GB GB08306617A patent/GB2136435A/en not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-03-06 EP EP84901067A patent/EP0137822B1/en not_active Expired
- 1984-03-06 WO PCT/EP1984/000062 patent/WO1984003444A1/de not_active Ceased
- 1984-03-06 DE DE8484901067T patent/DE3468324D1/de not_active Expired
- 1984-03-06 US US06/672,266 patent/US4743539A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-03-06 JP JP59501178A patent/JPS60500865A/ja active Granted
- 1984-03-09 IT IT19994/84A patent/IT1175455B/it active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2136435A (en) | 1984-09-19 |
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| GB8306617D0 (en) | 1983-04-13 |
| EP0137822B1 (en) | 1988-01-07 |
| WO1984003444A1 (fr) | 1984-09-13 |
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