JPH0867694A - ペプチド基質並びにこれを用いるプロテイナーゼａ活性およびビールの泡安定性の測定方法 - Google Patents
ペプチド基質並びにこれを用いるプロテイナーゼａ活性およびビールの泡安定性の測定方法Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 例えばビール中におけるような微量のプロテ
イナーゼＡの定量／活性測定方法及び該方法に用いる測
定用基質を提供する。 【構成】 一般式 PG−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−FLG 〔式中、PGはアミノ基の保護基を表し、A3、A4、A5、A6
はそれぞれAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPr
o で表されるアミノ酸であり、FLG は 4-メチルクマリ
ル-7-アミド（ＭＣＡ）などの蛍光基を表す。〕で表さ
れるオクタペプチド誘導体あるいは fg-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)ア
セチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)
基を表し、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、
Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミ
ノ酸であり、(Dnp)はジニトロフェニル基を表す。〕で
表されるノナペプチド誘導体を用いることを特徴とする
プロテイナーゼＡ活性およびビールの泡安定性の測定方
法。
イナーゼＡの定量／活性測定方法及び該方法に用いる測
定用基質を提供する。 【構成】 一般式 PG−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−FLG 〔式中、PGはアミノ基の保護基を表し、A3、A4、A5、A6
はそれぞれAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPr
o で表されるアミノ酸であり、FLG は 4-メチルクマリ
ル-7-アミド（ＭＣＡ）などの蛍光基を表す。〕で表さ
れるオクタペプチド誘導体あるいは fg-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)ア
セチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)
基を表し、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、
Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミ
ノ酸であり、(Dnp)はジニトロフェニル基を表す。〕で
表されるノナペプチド誘導体を用いることを特徴とする
プロテイナーゼＡ活性およびビールの泡安定性の測定方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般式 A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu 〔式中、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、As
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸を表す。〕で表されるペプチドを基本骨格とし、プロ
テイナーゼＡによって該ペプチドの-Phe-Phe-間が切断
されたとき検出可能な発色もしくは蛍光を生じさせるた
めの修飾基を付与されていてよい、プロテイナーゼＡ活
性測定用の基質に関する。本発明は、とりわけ一般式 A3−A4−A5−A6−Phe−(NO2)Phe−Arg−Leu （II） 〔式中、A3、A4、A5及びA6は、それぞれ独立にAla 、As
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸であり、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを
表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体あるいは一般
式 PG−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−FLG （III） 〔式中、PGはアミノ基の保護基、例えばスクシニル基を
表し、A3、A4、A5およびA6は、それぞれ独立にAla 、As
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸であり、FLG は 4-メチルクマリル-7-アミド（ＭＣ
Ａ）などの蛍光基を表す。〕で表されるオクタペプチド
誘導体あるいは fg-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 （VI） 〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)ア
セチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)
基を表し、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、
Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミ
ノ酸であり、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表
されるノナペプチド誘導体からなるプロテアーゼＡ活性
測定用の基質に関し、さらに該基質を用いることを特徴
とするプロテイナーゼＡ活性の測定方法及び上記基質を
用いてビール中のプロテイナーゼＡ活性を測定してビー
ルの泡安定性を測定する方法に関する。本発明はさら
に、一般式 Lys−Pro−A1−A2−Phe−Phe−Arg−Leu （Ｉ） （式中、A1およびA2は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Le
u 、Arg 又はSer で表されるアミノ酸である。）で表さ
れる新規オクタペプチドまたは Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-P
he-Arg-Leuで表される新規オクタペプチドにも関する。
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸を表す。〕で表されるペプチドを基本骨格とし、プロ
テイナーゼＡによって該ペプチドの-Phe-Phe-間が切断
されたとき検出可能な発色もしくは蛍光を生じさせるた
めの修飾基を付与されていてよい、プロテイナーゼＡ活
性測定用の基質に関する。本発明は、とりわけ一般式 A3−A4−A5−A6−Phe−(NO2)Phe−Arg−Leu （II） 〔式中、A3、A4、A5及びA6は、それぞれ独立にAla 、As
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸であり、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを
表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体あるいは一般
式 PG−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−FLG （III） 〔式中、PGはアミノ基の保護基、例えばスクシニル基を
表し、A3、A4、A5およびA6は、それぞれ独立にAla 、As
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸であり、FLG は 4-メチルクマリル-7-アミド（ＭＣ
Ａ）などの蛍光基を表す。〕で表されるオクタペプチド
誘導体あるいは fg-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 （VI） 〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)ア
セチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)
基を表し、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、
Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミ
ノ酸であり、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表
されるノナペプチド誘導体からなるプロテアーゼＡ活性
測定用の基質に関し、さらに該基質を用いることを特徴
とするプロテイナーゼＡ活性の測定方法及び上記基質を
用いてビール中のプロテイナーゼＡ活性を測定してビー
ルの泡安定性を測定する方法に関する。本発明はさら
に、一般式 Lys−Pro−A1−A2−Phe−Phe−Arg−Leu （Ｉ） （式中、A1およびA2は、それぞれ独立にAla 、Asp 、Le
u 、Arg 又はSer で表されるアミノ酸である。）で表さ
れる新規オクタペプチドまたは Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-P
he-Arg-Leuで表される新規オクタペプチドにも関する。
【０００２】
【従来の技術】プロテイナーゼＡ（Proteinase A）は、
微生物アスパルティック プロテイナーゼ（Microbial
Aspartic Proteinase 、ＥＣ3.4.23.6）に属し、サッカ
ロミセス アスパルティック プロテイナーゼ（Saccar
omyces Aspartic Proteinase）、ベイカーズ イースト
プロテイナーゼＡ（Baker's yeast Proteinase A）及
びサッカロミセス カルボキシル プロテイナーゼ（Sa
ccaromyces Carboxyl Proteinase）の別名があり、一般
的なアスパルティック プロテイナーゼ阻害剤であるペ
プスタチンに感受性がある。
微生物アスパルティック プロテイナーゼ（Microbial
Aspartic Proteinase 、ＥＣ3.4.23.6）に属し、サッカ
ロミセス アスパルティック プロテイナーゼ（Saccar
omyces Aspartic Proteinase）、ベイカーズ イースト
プロテイナーゼＡ（Baker's yeast Proteinase A）及
びサッカロミセス カルボキシル プロテイナーゼ（Sa
ccaromyces Carboxyl Proteinase）の別名があり、一般
的なアスパルティック プロテイナーゼ阻害剤であるペ
プスタチンに感受性がある。
【０００３】酵母においてはプロテイナーゼＡはリソゾ
ーム様液胞に局在し、老廃タンパク質等の分解により酵
母の生存に必要なアミノ酸を供給する役割を担ってお
り、特に窒素源が枯渇した場合の胞子形成時に、細胞内
タンパク質の分解の制御に関与していると考えられてい
る。しかし、この酵素はビールの泡を形成するタンパク
質の分解に関与することによりビールの泡立ちに影響を
与えるので、ビール及びビール酵母中のプロテイナーゼ
Ａの活性はできるだけ低いことが望ましい。しかしなが
ら、微量のプロテイナーゼＡを測定する信頼性の高い方
法は知られていない。例えば、プロテイナーゼＡの比較
的簡便な活性測定法としては、レニンに対する特異的基
質であるSuc−Arg−Pro−Phe−His−Leu−Leu−Val−Ty
r−MCA （Suc はスクシニル基を表し、MCA は 4-メチル
クマリル-7-アミドを表す。）を基質とする蛍光法によ
る方法が開発されている〔Hideyoshi Yokozawa,Hiroshi
Ito,Shigeki Murata,and Shin-ichi Ishii ; Analytic
al Biochemistry,134,210-215(1983) 〕。後述するとお
り、この方法の感度はビール中のプロテイナーゼＡの測
定には不十分である。
ーム様液胞に局在し、老廃タンパク質等の分解により酵
母の生存に必要なアミノ酸を供給する役割を担ってお
り、特に窒素源が枯渇した場合の胞子形成時に、細胞内
タンパク質の分解の制御に関与していると考えられてい
る。しかし、この酵素はビールの泡を形成するタンパク
質の分解に関与することによりビールの泡立ちに影響を
与えるので、ビール及びビール酵母中のプロテイナーゼ
Ａの活性はできるだけ低いことが望ましい。しかしなが
ら、微量のプロテイナーゼＡを測定する信頼性の高い方
法は知られていない。例えば、プロテイナーゼＡの比較
的簡便な活性測定法としては、レニンに対する特異的基
質であるSuc−Arg−Pro−Phe−His−Leu−Leu−Val−Ty
r−MCA （Suc はスクシニル基を表し、MCA は 4-メチル
クマリル-7-アミドを表す。）を基質とする蛍光法によ
る方法が開発されている〔Hideyoshi Yokozawa,Hiroshi
Ito,Shigeki Murata,and Shin-ichi Ishii ; Analytic
al Biochemistry,134,210-215(1983) 〕。後述するとお
り、この方法の感度はビール中のプロテイナーゼＡの測
定には不十分である。
【０００４】また、P1−P2−P3−P4−P5−(NO2)Phe−Ar
g−Leu 〔式中、P1、P2、P3、P4、P5は種々のアミノ酸
を表し、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表
す。〕を発色性の基質とするペプスタチン非感受性のカ
ルボキシル プロテイナーゼの活性測定法が知られてい
る〔Kohei Oda,Hiroshi Nakatani and Ben M.Dunn ;Bio
chimica et Biophysica Acta,1120,208-214(1992)〕。
この酵素の基質の一部はプロテイナーゼＡの基質ともな
りうるが、この場合の測定感度も低すぎて、ビール中の
プロテイナーゼＡの測定には不十分なものであった。
g−Leu 〔式中、P1、P2、P3、P4、P5は種々のアミノ酸
を表し、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表
す。〕を発色性の基質とするペプスタチン非感受性のカ
ルボキシル プロテイナーゼの活性測定法が知られてい
る〔Kohei Oda,Hiroshi Nakatani and Ben M.Dunn ;Bio
chimica et Biophysica Acta,1120,208-214(1992)〕。
この酵素の基質の一部はプロテイナーゼＡの基質ともな
りうるが、この場合の測定感度も低すぎて、ビール中の
プロテイナーゼＡの測定には不十分なものであった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のYokozawaらによ
る、Suc−Arg−Pro−Phe−His−Leu−Leu−Val−Tyr−M
CA を基質とする測定方法は、ビール酵母よりビール中
に漏出する微量のプロテイナーゼＡを定量するために
は、感度が不十分である。即ち、もともとこの基質はレ
ニン（ＥＣ3.4.23.4）活性の測定用なのでプロテイナー
ゼＡの検出限界は２．０ｎｇ／ｍｌと比較的感度が低
く、以下の問題がある。１）この基質に対するプロテイ
ナーゼＡの親和性が非常に低いために、活性測定のため
の反応時間が２４時間程度と長くならざるをえない。そ
のために、基質の非特異的な分解が起きる。２）上記親
和性が低いために、プロテイナーゼＡをめぐり、ビール
蛋白質そのものと基質が競合する。解決のために基質の
量を多くせざるをえなくなり、測定コストが非常に高い
ものとなる。３）この基質を用いてビール中のプロテイ
ナーゼＡを定量するには、蛍光分析機で分析可能な強さ
の蛍光を得るために、わざわざ、市販のプロテイナーゼ
Ａを添加して測定せざるをえず、正確な定量は困難であ
る。
る、Suc−Arg−Pro−Phe−His−Leu−Leu−Val−Tyr−M
CA を基質とする測定方法は、ビール酵母よりビール中
に漏出する微量のプロテイナーゼＡを定量するために
は、感度が不十分である。即ち、もともとこの基質はレ
ニン（ＥＣ3.4.23.4）活性の測定用なのでプロテイナー
ゼＡの検出限界は２．０ｎｇ／ｍｌと比較的感度が低
く、以下の問題がある。１）この基質に対するプロテイ
ナーゼＡの親和性が非常に低いために、活性測定のため
の反応時間が２４時間程度と長くならざるをえない。そ
のために、基質の非特異的な分解が起きる。２）上記親
和性が低いために、プロテイナーゼＡをめぐり、ビール
蛋白質そのものと基質が競合する。解決のために基質の
量を多くせざるをえなくなり、測定コストが非常に高い
ものとなる。３）この基質を用いてビール中のプロテイ
ナーゼＡを定量するには、蛍光分析機で分析可能な強さ
の蛍光を得るために、わざわざ、市販のプロテイナーゼ
Ａを添加して測定せざるをえず、正確な定量は困難であ
る。
【０００６】以上のことより、例えばビール中における
ような微量のプロテイナーゼＡの定量／活性測定は困難
であり、プロテイナーゼＡに特異的な基質の開発が急務
とされていた。
ような微量のプロテイナーゼＡの定量／活性測定は困難
であり、プロテイナーゼＡに特異的な基質の開発が急務
とされていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、カテプシ
ンＤ（ＥＣ3.4.23.5）に特異性の高い基質であるLys−P
ro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu をもとにプロテイ
ナーゼＡに特異性の高い基質を鋭意探索した。その結
果、次の一般式（IV） A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu （IV） （式中、A3、A4、A5及びA6は、それぞれ独立にAla 、As
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸である。）で表されるオクタペプチドが、プロテイナ
ーゼＡに対して極めて良好な親和性を有し、プロテイナ
ーゼＡによってPhe−Phe の間で開裂することを見いだ
した。従って、本発明は一般式（IV）で表される、プロ
テイナーゼＡに特異的な新規基質を提供するものであ
る。本発明の基質は、他のプロテアーゼよりもプロテイ
ナーゼＡに対する親和性が大きいのが特徴である。
ンＤ（ＥＣ3.4.23.5）に特異性の高い基質であるLys−P
ro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu をもとにプロテイ
ナーゼＡに特異性の高い基質を鋭意探索した。その結
果、次の一般式（IV） A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu （IV） （式中、A3、A4、A5及びA6は、それぞれ独立にAla 、As
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸である。）で表されるオクタペプチドが、プロテイナ
ーゼＡに対して極めて良好な親和性を有し、プロテイナ
ーゼＡによってPhe−Phe の間で開裂することを見いだ
した。従って、本発明は一般式（IV）で表される、プロ
テイナーゼＡに特異的な新規基質を提供するものであ
る。本発明の基質は、他のプロテアーゼよりもプロテイ
ナーゼＡに対する親和性が大きいのが特徴である。
【０００８】本発明のプロテイナーゼＡ用新規基質のう
ち、好ましいものは、A3がAla 、Asp 、Leu 、Arg 又は
Ser であるもの、あるいはA4がLeu 又はPro であるも
の、あるいはA5がAla 、Asp 、Leu 又はSer であるも
の、あるいはA6がAla 、Leu 、Lys 又はSer であるもの
である。特に好ましい基質は、Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Ph
e-Arg-Leu である。
ち、好ましいものは、A3がAla 、Asp 、Leu 、Arg 又は
Ser であるもの、あるいはA4がLeu 又はPro であるも
の、あるいはA5がAla 、Asp 、Leu 又はSer であるも
の、あるいはA6がAla 、Leu 、Lys 又はSer であるもの
である。特に好ましい基質は、Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Ph
e-Arg-Leu である。
【０００９】なお、一般式（IV）のオクタペプチドのう
ち前記一般式（Ｉ）のもの、およびAla-Leu-Asp-Ala-Ph
e-Phe-Arg-Leu で表されるペプチドは、新規化合物であ
り、それ自体本発明の対象である。一般式（Ｉ）で表さ
れるオクタペプチドは、プロテイナーゼＡによる切断部
位であるPhe−Phe のペプチド結合を有するオクタペプ
チドであり、好ましい具体例には、Lys−Pro−Ala−Ala
−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ala−Leu−Phe−Ph
e−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ala−Ser−Phe−Phe−Arg−L
eu 、Lys−Pro−Asp−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys
−Pro−Leu−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Se
r−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu などがある。
ち前記一般式（Ｉ）のもの、およびAla-Leu-Asp-Ala-Ph
e-Phe-Arg-Leu で表されるペプチドは、新規化合物であ
り、それ自体本発明の対象である。一般式（Ｉ）で表さ
れるオクタペプチドは、プロテイナーゼＡによる切断部
位であるPhe−Phe のペプチド結合を有するオクタペプ
チドであり、好ましい具体例には、Lys−Pro−Ala−Ala
−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ala−Leu−Phe−Ph
e−Arg−Leu 、Lys−Pro−Ala−Ser−Phe−Phe−Arg−L
eu 、Lys−Pro−Asp−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys
−Pro−Leu−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu 、Lys−Pro−Se
r−Ala−Phe−Phe−Arg−Leu などがある。
【００１０】本明細書において、アミノ酸、ペプチド、
保護基、溶媒等は当該技術分野で慣用されている略号、
あるいは、IUPAC-IUB の命名委員会で採用された略号を
使用している。例えば下記の略号が使用されている。ま
た、アミノ酸はＬ型を意味するものとする。
保護基、溶媒等は当該技術分野で慣用されている略号、
あるいは、IUPAC-IUB の命名委員会で採用された略号を
使用している。例えば下記の略号が使用されている。ま
た、アミノ酸はＬ型を意味するものとする。
【００１１】 Ala ：アラニン Leu ：ロイシン Ser ：セリン Asp ：アスパラギン酸 Lys ：リシン Arg ：アルギニン Phe ：フェニルアラニン Pro ：プロリン 一般式（IV）で表される本発明のプロテイナーゼＡ用基
質であるオクタペプチドは、ペプチド化学において通常
用いられる方法、例えば、Schroder and Lubke著「ザ
ペプチド（The Peptides）」第一卷、Academic Press ,
New York , U.S.A （１９６５年）、泉屋信夫ら著「ペ
プチド合成の基礎と実験」丸善（株）（１９８５年）な
どに記載されている方法である液相法及び固相法のいず
れによっても製造することができる。
質であるオクタペプチドは、ペプチド化学において通常
用いられる方法、例えば、Schroder and Lubke著「ザ
ペプチド（The Peptides）」第一卷、Academic Press ,
New York , U.S.A （１９６５年）、泉屋信夫ら著「ペ
プチド合成の基礎と実験」丸善（株）（１９８５年）な
どに記載されている方法である液相法及び固相法のいず
れによっても製造することができる。
【００１２】液相法及び固相法のいずれによる場合も、
ペプチド結合を形成するための縮合方法として、アジド
法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、Ｄ
ＣＣ法、ＤＣＣ−アディティブ法、活性エステル法、カ
ルボニルジイミダゾール法、酸化還元法、ウッドワード
試薬Ｋを用いる方法等が挙げられる。
ペプチド結合を形成するための縮合方法として、アジド
法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、Ｄ
ＣＣ法、ＤＣＣ−アディティブ法、活性エステル法、カ
ルボニルジイミダゾール法、酸化還元法、ウッドワード
試薬Ｋを用いる方法等が挙げられる。
【００１３】縮合反応を行う前に、それ自体公知の手段
により、アミノ酸やペプチド中の反応に関与しないカル
ボキシル基、アミノ基等を保護したり、また反応に関与
するカルボキシル基、アミノ基を活性化してもよい。
により、アミノ酸やペプチド中の反応に関与しないカル
ボキシル基、アミノ基等を保護したり、また反応に関与
するカルボキシル基、アミノ基を活性化してもよい。
【００１４】縮合反応は、通常溶媒中で行われ、例え
ば、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化
水素類、酢酸エチル等のエステル類、N,N-ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノ
ール、エタノール等のアルコール類、ピリジン、水等の
溶媒、又は、これらの混合物中で行うことができる。
ば、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化
水素類、酢酸エチル等のエステル類、N,N-ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノ
ール、エタノール等のアルコール類、ピリジン、水等の
溶媒、又は、これらの混合物中で行うことができる。
【００１５】反応温度は、一般に使用される約−３０℃
〜約５０℃の範囲で行うことができる。
〜約５０℃の範囲で行うことができる。
【００１６】本発明のペプチドの合成に所望により用い
られる保護基の脱離反応は、使用する保護基の種類によ
って異なるが、ペプチド結合に影響を与えずに保護基を
除く方法はよく知られている。
られる保護基の脱離反応は、使用する保護基の種類によ
って異なるが、ペプチド結合に影響を与えずに保護基を
除く方法はよく知られている。
【００１７】このようにして製造された本発明のオクタ
ペプチドは、反応終了後、それ自体公知のペプチドの分
離手段、例えば、抽出、分配、再沈澱、再結晶、クロマ
トグラフィー等によって収得することができる。
ペプチドは、反応終了後、それ自体公知のペプチドの分
離手段、例えば、抽出、分配、再沈澱、再結晶、クロマ
トグラフィー等によって収得することができる。
【００１８】また、前記オクタペプチドの塩として、酸
付加塩及び塩基性塩を挙げることができる。このような
酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、リン
酸等）又は有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、クエ
ン酸、酒石酸、リンゴ酸、シュウ酸、メタスルホン酸
等）等の塩が挙げられる。また、塩基性塩としては、ナ
トリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩等が挙げ
られる。
付加塩及び塩基性塩を挙げることができる。このような
酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、リン
酸等）又は有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、クエ
ン酸、酒石酸、リンゴ酸、シュウ酸、メタスルホン酸
等）等の塩が挙げられる。また、塩基性塩としては、ナ
トリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩等が挙げ
られる。
【００１９】一般式（IV）で表される本発明のプロテイ
ナーゼＡ用基質は、Phe−Phe の間の開裂を検出してプ
ロテイナーゼＡの活性を測定するために、そのまま又は
適当な修飾を加えた誘導体として用いることができる。
例えば、前記一般式（II）あるいは（III）で表される
誘導体は、該開裂を吸光法または蛍光法で検出するため
に適し、測定感度が低いという、従来技術の欠点を解決
した新たなプロテイナーゼＡ活性の微量測定法を提供す
る。なお、Phe−Phe の間の開裂を検出できる他の適当
な修飾を施した一般式（IV）の基質を用いることも本発
明の範囲内である。
ナーゼＡ用基質は、Phe−Phe の間の開裂を検出してプ
ロテイナーゼＡの活性を測定するために、そのまま又は
適当な修飾を加えた誘導体として用いることができる。
例えば、前記一般式（II）あるいは（III）で表される
誘導体は、該開裂を吸光法または蛍光法で検出するため
に適し、測定感度が低いという、従来技術の欠点を解決
した新たなプロテイナーゼＡ活性の微量測定法を提供す
る。なお、Phe−Phe の間の開裂を検出できる他の適当
な修飾を施した一般式（IV）の基質を用いることも本発
明の範囲内である。
【００２０】吸光法によるプロテイナーゼＡ活性の測定
においては、一般式（IV）の基質のＣ末端に近い方のＰ
ｈｅをＮＯ2 により修飾して、前記一般式（II）で表さ
れるオクタペプチド誘導体とし、そのPhe−(NO2)Phe
〔(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表す。〕
の間が加水分解されることにより生ずる３００ｎｍにお
ける吸光度の減少を測定する。ＮＯ2 により修飾された
誘導体の製造方法は、例えば、日本生化学会編 新生化
学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化
学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されている。
においては、一般式（IV）の基質のＣ末端に近い方のＰ
ｈｅをＮＯ2 により修飾して、前記一般式（II）で表さ
れるオクタペプチド誘導体とし、そのPhe−(NO2)Phe
〔(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表す。〕
の間が加水分解されることにより生ずる３００ｎｍにお
ける吸光度の減少を測定する。ＮＯ2 により修飾された
誘導体の製造方法は、例えば、日本生化学会編 新生化
学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化
学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されている。
【００２１】吸光法による本発明のプロテイナーゼＡの
活性測定法を説明すると、次のとおりである。プロテイ
ナーゼＡを含むビール液等のサンプル適量（例えば１μ
ｌ）、プロテイナーゼＡが作用するｐＨを与えるための
０．２Ｍ程度のリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍ程度
のクエン酸を含むｐＨ４．３のマックルバイン（McIlva
ine ）緩衝液適量（例えば２５０μｌ）、前記一般式
（II）で表される基質の約１ｍＭの水溶液適量（例えば
５０μｌ）及び蒸留水適量（例えば１９９μｌ）を混合
して、プロテイナーゼＡの作用温度（例えば１５℃〜３
７℃好ましくは３７℃）で、１０秒〜２０分間反応させ
る。約３００ｎｍにおける吸光度の減少を測定し、既知
量のプロテイナーゼＡによる減少と比較して、サンプル
中のプロテイナーゼＡの量を求めることができる。
活性測定法を説明すると、次のとおりである。プロテイ
ナーゼＡを含むビール液等のサンプル適量（例えば１μ
ｌ）、プロテイナーゼＡが作用するｐＨを与えるための
０．２Ｍ程度のリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍ程度
のクエン酸を含むｐＨ４．３のマックルバイン（McIlva
ine ）緩衝液適量（例えば２５０μｌ）、前記一般式
（II）で表される基質の約１ｍＭの水溶液適量（例えば
５０μｌ）及び蒸留水適量（例えば１９９μｌ）を混合
して、プロテイナーゼＡの作用温度（例えば１５℃〜３
７℃好ましくは３７℃）で、１０秒〜２０分間反応させ
る。約３００ｎｍにおける吸光度の減少を測定し、既知
量のプロテイナーゼＡによる減少と比較して、サンプル
中のプロテイナーゼＡの量を求めることができる。
【００２２】蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定
の一つとして、一般式（IV）の基質のＮ末端にアミノ基
の保護基を、そしてＣ末端に蛍光基を導入して、前記一
般式（III）で表されるオクタペプチド誘導体として使
用する。例えば、Ｎ末端にスクシニル基を付加させ、Ｃ
末端に検出用の蛍光基であるＡＭＣ（７−アミノ−４−
メチルクマリン）を付加させた一般式 Suc−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA （Ｖ） （式中、Suc はスクシニル基を表し、A3、A4、A5、A6は
それぞれAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro
で表されるアミノ酸であり、MCA は 4-メチルクマリル-
7-アミドを表す。）で表されるオクタペプチド誘導体を
基質として用いる。蛍光基としては、ＡＭＣ（７−アミ
ノ−４−メチルクマリン）が好ましいが、他の検出基と
してｐ−ニトロアニリド、β−ナフチルアミド、β−ナ
フチルエステル等を用いてもよい。アミノ基の保護基と
しては、スクシニル基が好ましいが、他にｔ−ブトキシ
カルボニル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレ
ニルメトキシカルボニル等を挙げることができる。これ
らの基をオクタペプチドに付加させる方法は、例えば、
前記の日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク
質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３
〜７４頁に記載されている。
の一つとして、一般式（IV）の基質のＮ末端にアミノ基
の保護基を、そしてＣ末端に蛍光基を導入して、前記一
般式（III）で表されるオクタペプチド誘導体として使
用する。例えば、Ｎ末端にスクシニル基を付加させ、Ｃ
末端に検出用の蛍光基であるＡＭＣ（７−アミノ−４−
メチルクマリン）を付加させた一般式 Suc−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA （Ｖ） （式中、Suc はスクシニル基を表し、A3、A4、A5、A6は
それぞれAla 、Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro
で表されるアミノ酸であり、MCA は 4-メチルクマリル-
7-アミドを表す。）で表されるオクタペプチド誘導体を
基質として用いる。蛍光基としては、ＡＭＣ（７−アミ
ノ−４−メチルクマリン）が好ましいが、他の検出基と
してｐ−ニトロアニリド、β−ナフチルアミド、β−ナ
フチルエステル等を用いてもよい。アミノ基の保護基と
しては、スクシニル基が好ましいが、他にｔ−ブトキシ
カルボニル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレ
ニルメトキシカルボニル等を挙げることができる。これ
らの基をオクタペプチドに付加させる方法は、例えば、
前記の日本生化学会編 新生化学実験講座１「タンパク
質IV 合成及び発現」（東京化学同人、１９９１）の３
〜７４頁に記載されている。
【００２３】上記一般式（III）のオクタペプチド誘導
体を基質として用いた場合においても、プロテイナーゼ
ＡはPhe −Phe の間を加水分解するわけであるが、生じ
た分解産物より蛍光基を遊離させるためには適当な蛋白
分解酵素、例えば、Ｎ末端に保護基を持たないペプチド
のみに作用する、アミノペプチダーゼＭを用いる。
体を基質として用いた場合においても、プロテイナーゼ
ＡはPhe −Phe の間を加水分解するわけであるが、生じ
た分解産物より蛍光基を遊離させるためには適当な蛋白
分解酵素、例えば、Ｎ末端に保護基を持たないペプチド
のみに作用する、アミノペプチダーゼＭを用いる。
【００２４】蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定
の実施方法を、一般式（Ｖ）で表されるオクタペプチド
誘導体を基質として用いる場合を例にして説明すると次
のとおりである。プロテイナーゼＡを含むビール液等の
サンプル適量（例えば、１０〜１００μｌ、好ましくは
４０μｌ）、プロテイナーゼＡが作用するｐＨを与える
ための０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエ
ン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン（McIlvaine ）
緩衝液適量（例えば、２５０μｌ）、一般式（Ｖ）で表
される基質の１ｍＭ水溶液適量（例えば、０．１〜１０
０μｌ、好ましくは１〜１０μｌ）及び蒸留水適量（例
えば、２０８μｌ）で反応液を作成し、プロテイナーゼ
Ａの作用温度（例えば、１５℃〜３７℃、好ましくは３
７℃）で、１〜６時間好ましくは約３時間、遮光下で反
応させる。カルシウムイオンはプロテイナーゼＡ活性に
全く影響を与えないので、カルシウムを反応液中に添加
する必要はないが、存在していてもさしつかえない。
の実施方法を、一般式（Ｖ）で表されるオクタペプチド
誘導体を基質として用いる場合を例にして説明すると次
のとおりである。プロテイナーゼＡを含むビール液等の
サンプル適量（例えば、１０〜１００μｌ、好ましくは
４０μｌ）、プロテイナーゼＡが作用するｐＨを与える
ための０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエ
ン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン（McIlvaine ）
緩衝液適量（例えば、２５０μｌ）、一般式（Ｖ）で表
される基質の１ｍＭ水溶液適量（例えば、０．１〜１０
０μｌ、好ましくは１〜１０μｌ）及び蒸留水適量（例
えば、２０８μｌ）で反応液を作成し、プロテイナーゼ
Ａの作用温度（例えば、１５℃〜３７℃、好ましくは３
７℃）で、１〜６時間好ましくは約３時間、遮光下で反
応させる。カルシウムイオンはプロテイナーゼＡ活性に
全く影響を与えないので、カルシウムを反応液中に添加
する必要はないが、存在していてもさしつかえない。
【００２５】次いで、熱処理（例えば約８０℃−５分）
によりプロテイナーゼＡの反応を停止させた後に、ｐＨ
約８．５の１Ｍトリス塩酸緩衝液適量（例えば２００μ
ｌ）と適当なアミノペプチダーゼ溶液適量（例えば、ア
ミノペプチダーゼＭを蒸留水に約０．２ｍｇ／ｍｌの濃
度に溶解させたもの５μｌ）を加えて更に３７℃で１時
間程度、遮光下でインキュベートした後、熱処理（例え
ば約８０℃−５分）によりアミノペプチダーゼ反応を停
止させ、反応液を適当に希釈したものの蛍光度を励起波
長３５０〜３７５ｎｍの間、蛍光波長４４０〜４７０ｎ
ｍの間で測定する。励起波長および蛍光波長は、用いる
蛍光基によって適宜選択する。上記の反応条件でビール
のプロテアーゼＡ活性を測定する場合には、反応混合物
を約７倍に希釈すれば蛍光分析機による測定に都合がよ
い。
によりプロテイナーゼＡの反応を停止させた後に、ｐＨ
約８．５の１Ｍトリス塩酸緩衝液適量（例えば２００μ
ｌ）と適当なアミノペプチダーゼ溶液適量（例えば、ア
ミノペプチダーゼＭを蒸留水に約０．２ｍｇ／ｍｌの濃
度に溶解させたもの５μｌ）を加えて更に３７℃で１時
間程度、遮光下でインキュベートした後、熱処理（例え
ば約８０℃−５分）によりアミノペプチダーゼ反応を停
止させ、反応液を適当に希釈したものの蛍光度を励起波
長３５０〜３７５ｎｍの間、蛍光波長４４０〜４７０ｎ
ｍの間で測定する。励起波長および蛍光波長は、用いる
蛍光基によって適宜選択する。上記の反応条件でビール
のプロテアーゼＡ活性を測定する場合には、反応混合物
を約７倍に希釈すれば蛍光分析機による測定に都合がよ
い。
【００２６】蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測定
の別の例として、一般式（IV）の基質のＮ末端に蛍光
基、例えば(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル(MOCA
c)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)基を、そし
てＣ末端に該蛍光基の蛍光を抑制するためのジニトロフ
ェニル(Dnp)含有基、例えば-Lys(Dnp)-NH2を導入して、
前記一般式（VI）で表されるノナペプチド誘導体として
使用する。例えば、Ｎ末端にMOCAc基を付加させ、Ｃ末
端に-Lys(Dnp)-NH2基を付加させた一般式 MOCAc−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−Lys(Dnp)-NH2 (VII） （式中、MOCAcは(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル
基を表し、A3、A4、A5、A6はそれぞれAla 、Asp 、Lys
、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸を表
す。）で表されるノナペプチド誘導体を基質として用い
る。蛍光基としては、アントラニロイルベンジル(ABz)
基等を用いてもよい。−Lys(Dnp)-NH2部分は、リジン以
外にもジニトロフェニル置換基を持つ適当なアミノ酸を
用いることができる。該リジンをアミド化したのは、カ
ルボキシペプチダーゼによる非特異的切断から保護する
ためであり、他の適当な保護基を同様に用いることも可
能である。これらの基を一般式（IV）のオクタペプチド
に付加させる方法は、例えば、前記の日本生化学会編
新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」
（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されて
いる。
の別の例として、一般式（IV）の基質のＮ末端に蛍光
基、例えば(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル(MOCA
c)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)基を、そし
てＣ末端に該蛍光基の蛍光を抑制するためのジニトロフ
ェニル(Dnp)含有基、例えば-Lys(Dnp)-NH2を導入して、
前記一般式（VI）で表されるノナペプチド誘導体として
使用する。例えば、Ｎ末端にMOCAc基を付加させ、Ｃ末
端に-Lys(Dnp)-NH2基を付加させた一般式 MOCAc−A3−A4−A5−A6−Phe−Phe−Arg−Leu−Lys(Dnp)-NH2 (VII） （式中、MOCAcは(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル
基を表し、A3、A4、A5、A6はそれぞれAla 、Asp 、Lys
、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ酸を表
す。）で表されるノナペプチド誘導体を基質として用い
る。蛍光基としては、アントラニロイルベンジル(ABz)
基等を用いてもよい。−Lys(Dnp)-NH2部分は、リジン以
外にもジニトロフェニル置換基を持つ適当なアミノ酸を
用いることができる。該リジンをアミド化したのは、カ
ルボキシペプチダーゼによる非特異的切断から保護する
ためであり、他の適当な保護基を同様に用いることも可
能である。これらの基を一般式（IV）のオクタペプチド
に付加させる方法は、例えば、前記の日本生化学会編
新生化学実験講座１「タンパク質IV 合成及び発現」
（東京化学同人、１９９１）の３〜７４頁に記載されて
いる。
【００２７】上記一般式(VI）のノナペプチド誘導体を
基質として用いた場合においても、プロテイナーゼＡは
Phe −Phe の間を加水分解するわけであるが、本蛍光法
においては上記の蛍光法の場合と異なって、生じた分解
産物より蛍光基を遊離させるためのアミノペプチダーゼ
Ｍ等の蛋白分解酵素の使用を必要としない。即ち、本蛍
光法では、基質の蛍光基は分解前にはジニトロフェニル
の存在により抑制されており、この基質のPhe −Phe の
間が加水分解されると蛍光値が約２００倍上昇して検出
可能になる。したがって、反応が１工程であるため簡便
且つ迅速である。例えばビール中のプロテアーゼＡ活性
の測定を約２時間で行うことが可能である。
基質として用いた場合においても、プロテイナーゼＡは
Phe −Phe の間を加水分解するわけであるが、本蛍光法
においては上記の蛍光法の場合と異なって、生じた分解
産物より蛍光基を遊離させるためのアミノペプチダーゼ
Ｍ等の蛋白分解酵素の使用を必要としない。即ち、本蛍
光法では、基質の蛍光基は分解前にはジニトロフェニル
の存在により抑制されており、この基質のPhe −Phe の
間が加水分解されると蛍光値が約２００倍上昇して検出
可能になる。したがって、反応が１工程であるため簡便
且つ迅速である。例えばビール中のプロテアーゼＡ活性
の測定を約２時間で行うことが可能である。
【００２８】本蛍光法によるプロテイナーゼＡの活性測
定の実施方法を、一般式(VII）で表されるノナペプチド
誘導体を基質として用いる場合を例にして説明すると次
のとおりである。前記同様にしてプロテイナーゼＡを含
むビール液等のサンプル適量を、一般式(VII）で表され
る基質と、プロテイナーゼＡの作用温度で反応させる。
次いで、熱処理（例えば約８０℃−５分）によりプロテ
イナーゼＡの反応を停止させた後に、反応液を適当に希
釈したものの蛍光度を励起波長３１０〜３５０ｎｍの間
（蛍光基がMOCAcの場合は３２８ｎｍが好ましい）、蛍
光波長３７０〜４１０ｎｍの間（蛍光基がMOCAcの場合
は３９３ｎｍが好ましい）で測定する。励起波長および
蛍光波長は、用いる蛍光基によって適宜選択する。上記
の反応条件の場合には、反応混合物を約７倍に希釈すれ
ば蛍光分析機による測定に都合がよい。
定の実施方法を、一般式(VII）で表されるノナペプチド
誘導体を基質として用いる場合を例にして説明すると次
のとおりである。前記同様にしてプロテイナーゼＡを含
むビール液等のサンプル適量を、一般式(VII）で表され
る基質と、プロテイナーゼＡの作用温度で反応させる。
次いで、熱処理（例えば約８０℃−５分）によりプロテ
イナーゼＡの反応を停止させた後に、反応液を適当に希
釈したものの蛍光度を励起波長３１０〜３５０ｎｍの間
（蛍光基がMOCAcの場合は３２８ｎｍが好ましい）、蛍
光波長３７０〜４１０ｎｍの間（蛍光基がMOCAcの場合
は３９３ｎｍが好ましい）で測定する。励起波長および
蛍光波長は、用いる蛍光基によって適宜選択する。上記
の反応条件の場合には、反応混合物を約７倍に希釈すれ
ば蛍光分析機による測定に都合がよい。
【００２９】上記いずれの基質を用いる測定方法におい
ても、既知濃度の市販酵素（シグマ社製、米国）につい
て測定した検量線からサンプル中のプロテイナーゼＡ濃
度を測定することができる。本発明の好ましい態様で
は、検出限界は０．０３ｎｇ／ｍｌ以下である。ただ
し、このプロテイナーゼＡの量は、その１ｍｇが１５単
位（ユニット）の活性を示すとして計算したものであ
る。１ユニットは、インシュリンのβ鎖（分子量３，３
５３）を基質とした場合に、ｐＨ６．０、２５℃で１分
間に１μｍｏｌの基質を加水分解する酵素活性である。
従って、１．５×１０-5ユニットの酵素活性が１ｎｇの
プロテイナーゼＡに相当する。
ても、既知濃度の市販酵素（シグマ社製、米国）につい
て測定した検量線からサンプル中のプロテイナーゼＡ濃
度を測定することができる。本発明の好ましい態様で
は、検出限界は０．０３ｎｇ／ｍｌ以下である。ただ
し、このプロテイナーゼＡの量は、その１ｍｇが１５単
位（ユニット）の活性を示すとして計算したものであ
る。１ユニットは、インシュリンのβ鎖（分子量３，３
５３）を基質とした場合に、ｐＨ６．０、２５℃で１分
間に１μｍｏｌの基質を加水分解する酵素活性である。
従って、１．５×１０-5ユニットの酵素活性が１ｎｇの
プロテイナーゼＡに相当する。
【００３０】また、プロテイナーゼＡ活性をより簡便に
測定するためには、 (a) プロテイナーゼＡの特異的基質である、一般式（I
I）または（III）で表されるオクタペプチド誘導体ある
いは一般式(VI)で表されるノナペプチド誘導体 (b) プロテイナーゼＡの精製標品（例えば、米国シグマ
社製のもの） (c) 反応用緩衝液〔例えば、マックルバイン（McIlvain
e ）緩衝液〕 を含むプロテイナーゼＡ活性測定用キットを利用すれば
よい。
測定するためには、 (a) プロテイナーゼＡの特異的基質である、一般式（I
I）または（III）で表されるオクタペプチド誘導体ある
いは一般式(VI)で表されるノナペプチド誘導体 (b) プロテイナーゼＡの精製標品（例えば、米国シグマ
社製のもの） (c) 反応用緩衝液〔例えば、マックルバイン（McIlvain
e ）緩衝液〕 を含むプロテイナーゼＡ活性測定用キットを利用すれば
よい。
【００３１】
【実施例】次いで、実施例に基づいて本発明を詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
【００３２】実施例１．オクタペプチド誘導体の合成 表１に示すオクタペプチド誘導体は全て米国アプライド
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製のモデ
ル４３２Ａシナジー（Model 432A SYNERGY）型ペプチド
シンセサイザーを用いて固相法により合成した。ニトロ
基（ＮＯ2 ）の導入は、日本生化学会編 新生化学実験
講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同
人、１９９１）の３〜７４頁に記載の方法により、行っ
た。
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製のモデ
ル４３２Ａシナジー（Model 432A SYNERGY）型ペプチド
シンセサイザーを用いて固相法により合成した。ニトロ
基（ＮＯ2 ）の導入は、日本生化学会編 新生化学実験
講座１「タンパク質IV 合成及び発現」（東京化学同
人、１９９１）の３〜７４頁に記載の方法により、行っ
た。
【００３３】これとは別に、Suc−Ala−Pro−Ala−Lys
−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA （Sucはスクシニル基を表
し、MCA は 4-メチルクマリル-7-アミドを表す。）を、
Ｃ末端を７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）で
保護したアミノ酸から出発して液相法により合成した。
MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2
(式中、MOCAcは(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル
基を、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。) も同様にし
て合成した。合成されたペプチドは全てＨＰＬＣ的に純
粋であった。
−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA （Sucはスクシニル基を表
し、MCA は 4-メチルクマリル-7-アミドを表す。）を、
Ｃ末端を７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）で
保護したアミノ酸から出発して液相法により合成した。
MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2
(式中、MOCAcは(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル
基を、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。) も同様にし
て合成した。合成されたペプチドは全てＨＰＬＣ的に純
粋であった。
【００３４】ＨＰＬＣの条件は、溶離液は１０ｍＭのリ
ン酸カリウム溶液と５０ｍＭの硫酸二ナトリウムを等量
混合した溶液に２０容量％から６０容量％のアセトニト
リルの濃度勾配（２５分）をつけたもので、ＹＭＣ Ｐ
ａｃｋ Ａ−３０２ ＯＤＳカラム（内径４．６ｍｍ×
長さ１５０ｍｍ、米国ＹＭＣ社製）を用い、２１０ｎｍ
で検出し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ．であった。
ン酸カリウム溶液と５０ｍＭの硫酸二ナトリウムを等量
混合した溶液に２０容量％から６０容量％のアセトニト
リルの濃度勾配（２５分）をつけたもので、ＹＭＣ Ｐ
ａｃｋ Ａ−３０２ ＯＤＳカラム（内径４．６ｍｍ×
長さ１５０ｍｍ、米国ＹＭＣ社製）を用い、２１０ｎｍ
で検出し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ．であった。
【００３５】この測定条件下において、例えば上記Suc
−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA の保
持時間（ retention time ）は１８分前後であった。
−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA の保
持時間（ retention time ）は１８分前後であった。
【００３６】実施例２．プロテイナーゼＡに対する親和
性の測定（吸光法） 実施例１で合成した種々のオクタペプチド誘導体を基質
とした場合の市販プロテイナーゼＡ（シグマ社製、米
国）活性を吸光法により測定した。
性の測定（吸光法） 実施例１で合成した種々のオクタペプチド誘導体を基質
とした場合の市販プロテイナーゼＡ（シグマ社製、米
国）活性を吸光法により測定した。
【００３７】すなわち、市販プロテイナーゼＡ溶液（１
ｍｇ／ｍｌ、蒸留水中）１μｌ、０．２Ｍリン酸水素二
ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ４．３のマッ
クルバイン（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、基質の１
ｍＭ水溶液５０μｌ及び蒸留水１９９μｌで全量５００
μｌの反応液を作成し、３７℃で１０秒〜２０分間反応
させ、３００ｎｍにおける吸光度の減少により酵素活性
を測定した。その結果を表１に示す。
ｍｇ／ｍｌ、蒸留水中）１μｌ、０．２Ｍリン酸水素二
ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ４．３のマッ
クルバイン（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、基質の１
ｍＭ水溶液５０μｌ及び蒸留水１９９μｌで全量５００
μｌの反応液を作成し、３７℃で１０秒〜２０分間反応
させ、３００ｎｍにおける吸光度の減少により酵素活性
を測定した。その結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】 表 １ -------------------------------------------------------------------- シークエンス Kcat / Km P5 P4 P3 P2 P1 P'1 P'2 P'3 (mM -1sec. -1) -------------------------------------------------------------------- カテプシンＤあるいはＥの基質 Lys −Pro −Ala −Lys −Phe −XPhe−Arg −Leu １３６ -------------------------------------------------------------------- P2 誘導体 Lys −Pro −Ala −Ala −Phe −XPhe−Arg −Leu ７９９ −Asp − ９８ −Leu − ４９１ −Arg − ９７ −Ser − ４５９ -------------------------------------------------------------------- P3 誘導体 Lys −Pro −Asp −Lys −Phe −XPhe−Arg −Leu − −Leu − ２８１ −Arg − − −Ser − ３７５ -------------------------------------------------------------------- P4 誘導体 Lys −Asp −Ala −Lys −Phe −XPhe−Arg −Leu １７７ −Ala − ９６ −Leu − ２１８ -------------------------------------------------------------------- P5 誘導体 Ser −Pro −Ala −Lys −Phe −XPhe−Arg −Leu ４４９ Asp − ７１０ Arg − ７５０ Ala − １１７１ Leu − ９７２ -------------------------------------------------------------------- Ala −Leu −Asp −Ala −Phe −XPhe−Arg −Leu １０９９ -------------------------------------------------------------------- X はニトロ基を示す。
【００３９】実施例３．蛍光法によるビール中のプロテ
イナーゼＡ活性の測定 ビール液４０μｌ、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと
０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン
（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、実施例１で合成した
Suc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA
の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を
作成し、３７℃で３時間反応させた。
イナーゼＡ活性の測定 ビール液４０μｌ、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと
０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン
（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、実施例１で合成した
Suc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA
の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を
作成し、３７℃で３時間反応させた。
【００４０】次いで、８０℃−５分の熱処理によりプロ
テイナーゼＡ反応を停止させた後に、ｐＨ８．５の１Ｍ
トリス塩酸緩衝液２００μｌとアミノペプチダーゼＭ溶
液〔ピアース ケミカル社（Pierce Chemical Co. ）製
のアミノペプチダーゼを蒸留水に０．２ｍｇ／ｍｌの濃
度、溶解させたもの〕５μｌを加えて更に３７℃で１時
間インキュベートした後、７倍に希釈したものの蛍光度
を励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで測定し
た。既知濃度の市販酵素について測定した検量線からビ
ール中のプロテイナーゼＡ含量を測定した。その結果を
表２に示す。
テイナーゼＡ反応を停止させた後に、ｐＨ８．５の１Ｍ
トリス塩酸緩衝液２００μｌとアミノペプチダーゼＭ溶
液〔ピアース ケミカル社（Pierce Chemical Co. ）製
のアミノペプチダーゼを蒸留水に０．２ｍｇ／ｍｌの濃
度、溶解させたもの〕５μｌを加えて更に３７℃で１時
間インキュベートした後、７倍に希釈したものの蛍光度
を励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで測定し
た。既知濃度の市販酵素について測定した検量線からビ
ール中のプロテイナーゼＡ含量を測定した。その結果を
表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】実施例４．蛍光法によるビール中のプロテ
イナーゼＡ活性の測定（２） 市販プロテイナーゼＡを０．１〜０．８ｎｇ／ｍｌ添加
したビール液４０μl、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウ
ムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイ
ン(McIlvaine)緩衝液２５０μl 、実施例１で合成したM
OCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2
の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を
作成し、３７℃で１時間反応させ、７５℃で５分の熱処
理後、４℃で１０，０００ｒｐｍ、１分の遠心で得た上
清の蛍光度を励起波長３２８ｎｍ、蛍光波長３９３ｎｍ
で測定した。表３に示すようにプロテイナーゼＡ含量と
蛍光度は良く相関した。
イナーゼＡ活性の測定（２） 市販プロテイナーゼＡを０．１〜０．８ｎｇ／ｍｌ添加
したビール液４０μl、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウ
ムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイ
ン(McIlvaine)緩衝液２５０μl 、実施例１で合成したM
OCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2
の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を
作成し、３７℃で１時間反応させ、７５℃で５分の熱処
理後、４℃で１０，０００ｒｐｍ、１分の遠心で得た上
清の蛍光度を励起波長３２８ｎｍ、蛍光波長３９３ｎｍ
で測定した。表３に示すようにプロテイナーゼＡ含量と
蛍光度は良く相関した。
【００４３】
【表３】
【００４４】実施例５．ビール中のプロテイナーゼＡ活
性と泡安定性との相関 ビールに市販プロテイナーゼＡ（シグマ社製、米国）を
適当量添加し、３０℃にて２０日間保存した後の泡持ち
度を測定し、プロテイナーゼＡ含量と泡安定性との相関
を調べたところ、表４及び図１に示すような相関性が得
られた。プロテイナーゼＡ含量は実施例３と同様にして
測定し、泡持ち度は以下のようにして測定した。
性と泡安定性との相関 ビールに市販プロテイナーゼＡ（シグマ社製、米国）を
適当量添加し、３０℃にて２０日間保存した後の泡持ち
度を測定し、プロテイナーゼＡ含量と泡安定性との相関
を調べたところ、表４及び図１に示すような相関性が得
られた。プロテイナーゼＡ含量は実施例３と同様にして
測定し、泡持ち度は以下のようにして測定した。
【００４５】参考例１ 泡持ち度測定法（ＳＨＶ−Scha
umhaftvermogen−法） ビールの泡持ち度を泡の立ち具合とガラス面への泡の付
着性を測定することにより評価する。すなわち、ビール
全量を一度に２０秒間平均してメスシリンダーに注ぎ込
み、注ぎ込み終了３０分後のメスシリンダー壁に付着し
て残っている泡の量をプラニメーターを用いて測り、泡
持ち度を定量的に評価する。この際、泡持ち度の単位は
平方センチメーターで表す〔化学と生物、ｐ１３５４、
（１９７５）参照〕。
umhaftvermogen−法） ビールの泡持ち度を泡の立ち具合とガラス面への泡の付
着性を測定することにより評価する。すなわち、ビール
全量を一度に２０秒間平均してメスシリンダーに注ぎ込
み、注ぎ込み終了３０分後のメスシリンダー壁に付着し
て残っている泡の量をプラニメーターを用いて測り、泡
持ち度を定量的に評価する。この際、泡持ち度の単位は
平方センチメーターで表す〔化学と生物、ｐ１３５４、
（１９７５）参照〕。
【００４６】
【表４】
【００４７】
【発明の効果】本発明は、前記一般式（IV）で表される
ペプチドからなるプロテイナーゼＡの基質を提供する。
これを前記一般式（III）で表されるオクタペプチド誘
導体あるいは前記一般式(VI)で表されるノナペプチド誘
導体を基質とする本発明のプロテイナーゼＡ活性の測定
方法によれば、該酵素濃度の検出感度が、前記Yokozawa
らによるレニン活性測定用の基質を用いる従来の方法と
比べて数十倍向上するので、例えばビール中におけるよ
うな微量のプロテイナーゼＡの定量が可能となった。
ペプチドからなるプロテイナーゼＡの基質を提供する。
これを前記一般式（III）で表されるオクタペプチド誘
導体あるいは前記一般式(VI)で表されるノナペプチド誘
導体を基質とする本発明のプロテイナーゼＡ活性の測定
方法によれば、該酵素濃度の検出感度が、前記Yokozawa
らによるレニン活性測定用の基質を用いる従来の方法と
比べて数十倍向上するので、例えばビール中におけるよ
うな微量のプロテイナーゼＡの定量が可能となった。
【図１】ビール中のプロテイナーゼＡ含量と泡安定性と
の相関を示すグラフである。
の相関を示すグラフである。
Claims (12)
- 【請求項１】 一般式 A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu 〔式中、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、As
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸を表す。〕で表されるペプチドを基本骨格とし、プロ
テイナーゼＡによって該ペプチドの-Phe-Phe-間が切断
されたとき検出可能な発色もしくは蛍光を生じさせるた
めの修飾基を付与されていてよい、プロテイナーゼＡ活
性測定用の基質。 - 【請求項２】 一般式 A3-A4-A5-A6-Phe-(NO2)Phe-Arg-Leu または PG-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-FLG 〔式中、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、As
p 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミノ
酸であり、(NO2)Pheはp-ニトロ-L- フェニルアラニンを
表し、PGはアミノ基の保護基を表し、そしてFLG は蛍光
基を表す。〕で表されるオクタペプチド誘導体あるいは fg-A3-A4-A5-A6-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)ア
セチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)
基を表し、A3、A4、A5およびA6はそれぞれ独立にAla 、
Asp 、Lys 、Leu 、Arg 、Ser 又はPro で表されるアミ
ノ酸であり、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表
されるノナペプチド誘導体からなる、請求項１の基質。 - 【請求項３】 A3がAla 、Asp 、Leu 、Arg 又はSer で
表されるアミノ酸である請求項２記載の基質。 - 【請求項４】 A4がLeu 又はPro で表されるアミノ酸で
ある請求項２記載の基質。 - 【請求項５】 A5がAla 、Asp 、Leu 又はSer で表され
るアミノ酸である請求項２記載の基質。 - 【請求項６】 A6がAla 、Leu 、Lys 又はSer で表され
るアミノ酸である請求項２記載の基質。 - 【請求項７】 式： Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-(NO2)Phe-Arg-Leu または Suc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-MCA 〔式中、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表
し、Suc はスクシニル基を表し、そしてMCA は 4-メチ
ルクマリル-7-アミドを表す。〕で表されるオクタペプ
チド誘導体あるいは fg-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)ア
セチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)
基を表し、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表さ
れるノナペプチド誘導体からなる、請求項１の基質。 - 【請求項８】 式： Ala-Leu-Asp-Ala-(NO2)Phe-Phe-Arg-Leu または Suc-Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu-MCA 〔式中、(NO2)Pheはp-ニトロ-L-フェニルアラニンを表
し、Suc はスクシニル基を表し、そしてMCA は 4-メチ
ルクマリル-7-アミドを表す。〕で表されるオクタペプ
チド誘導体あるいは fg-Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2 〔式中、fgは蛍光基の(7-メトキシクマリン-4-イル)ア
セチル(MOCAc)基またはアントラニロイルベンジル(ABz)
基を表し、(Dnp)はジニトロフェニルを表す。〕で表さ
れるノナペプチド誘導体よりなる、請求項１の基質。 - 【請求項９】 請求項１ないし８のいずれか１項に記載
の基質を用いることを特徴とする、試料中のプロテアー
ゼＡ活性の測定方法。 - 【請求項１０】 試料がビールであり、ビール中のプロ
テアーゼＡ活性の値から、ビールの泡安定性を求めるこ
とを特徴とする、請求項９の測定方法。 - 【請求項１１】 請求項１ないし８のいずれか１項に記
載の基質を用いることを特徴とする、プロテイナーゼＡ
活性測定キット。 - 【請求項１２】 一般式 Lys-Pro-A1-A2-Phe-Phe-Arg-Leu （式中、A1およびA2はそれぞれ独立にAla 、Asp 、Leu
、Arg 又はSer で表されるアミノ酸である。）で表さ
れるオクタペプチドまたは式： Ala-Leu-Asp-Ala-Phe-Phe-Arg-Leu で表されるオクタペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15479795A JP4043535B2 (ja) | 1994-06-21 | 1995-06-21 | ペプチド基質並びにこれを用いるプロテイナーゼａ活性およびビールの泡安定性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-138704 | 1994-06-21 | ||
| JP13870494 | 1994-06-21 | ||
| JP15479795A JP4043535B2 (ja) | 1994-06-21 | 1995-06-21 | ペプチド基質並びにこれを用いるプロテイナーゼａ活性およびビールの泡安定性の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0867694A true JPH0867694A (ja) | 1996-03-12 |
| JP4043535B2 JP4043535B2 (ja) | 2008-02-06 |
Family
ID=26471690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15479795A Expired - Lifetime JP4043535B2 (ja) | 1994-06-21 | 1995-06-21 | ペプチド基質並びにこれを用いるプロテイナーゼａ活性およびビールの泡安定性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4043535B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001094377A3 (en) * | 2000-06-06 | 2004-10-14 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Metalloprotease peptide substrates and methods |
| WO2007032521A1 (ja) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | Suntory Limited | プロテイナーゼaをコードする遺伝子及びその用途 |
| JP2015188326A (ja) * | 2014-03-27 | 2015-11-02 | 住化エンバイロメンタルサイエンス株式会社 | 生物または生物由来物質の検知方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01104178A (ja) * | 1986-12-24 | 1989-04-21 | Genentech Inc | エンケファリナーゼの製造方法、アッセイ法およびそれを含有する医薬組成物 |
| JPH03118375A (ja) * | 1989-08-17 | 1991-05-20 | Abbott Lab | ４位置換７―ヒドロキシクマリン誘導体およびその製法 |
| JPH03172196A (ja) * | 1989-11-03 | 1991-07-25 | Abbott Lab | 蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法 |
| JPH05137599A (ja) * | 1991-11-22 | 1993-06-01 | Takara Shuzo Co Ltd | 蛍光基質 |
| JPH05506235A (ja) * | 1990-04-17 | 1993-09-16 | カルルスベルグ アクテイーゼルスカブ | 蛍光ペプチド及び酵素活性の測定におけるその使用 |
-
1995
- 1995-06-21 JP JP15479795A patent/JP4043535B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| BIOCHEMISTRY (1988), VOL.27, P.4827-4834, JPN6007001397, ISSN: 0000908026 * |
| BIOCHIM.BIOPHYS.ACTA (1992), VOL.1120, P.208-214, JPN6007001395, ISSN: 0000908024 * |
| CARLSBERG RES.COMMUN.(1989), VOL54, P.85-97, JPN6007001398, ISSN: 0000908027 * |
| PROCEEDINGS OF THE CONGRESS - EUROPEAN BREWERY CONVENTION (1993), 24TH,357-64, JPN6007001400, ISSN: 0000908029 * |
| PROTEIN SCIENCE (1993), VOL.2, NO.2, P.264-276, JPN6007001396, ISSN: 0000908025 * |
Cited By (3)
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| WO2001094377A3 (en) * | 2000-06-06 | 2004-10-14 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Metalloprotease peptide substrates and methods |
| WO2007032521A1 (ja) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | Suntory Limited | プロテイナーゼaをコードする遺伝子及びその用途 |
| JP2015188326A (ja) * | 2014-03-27 | 2015-11-02 | 住化エンバイロメンタルサイエンス株式会社 | 生物または生物由来物質の検知方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4043535B2 (ja) | 2008-02-06 |
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