JPH0870853A - ビブリオ属に属する新規な微生物ならびに当該微生物から生産される新規なコラーゲン分解酵素およびその利用 - Google Patents
ビブリオ属に属する新規な微生物ならびに当該微生物から生産される新規なコラーゲン分解酵素およびその利用Info
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- JPH0870853A JPH0870853A JP6235974A JP23597494A JPH0870853A JP H0870853 A JPH0870853 A JP H0870853A JP 6235974 A JP6235974 A JP 6235974A JP 23597494 A JP23597494 A JP 23597494A JP H0870853 A JPH0870853 A JP H0870853A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 食肉軟化剤、細胞分散剤に有用なコラーゲン
分解酵素および当該分解酵素を生産するビブリオ属に属
する生産菌を提供する。 【構成】 当該生産菌はビブリオ・エス・ピー（Ｖｉｂ
ｒｉｏ ｓｐ）１７０６Ｂ菌株である。当該コラーゲン
分解酵素は下記の理化学的性質を有する。 （１）作用：可溶性コラーゲンおよび不溶性コラーゲン
の双方のコラーゲンの分解に著しい活性を示し、軽鎖お
よび重鎖ミオシンに対しても高い活性を示す。コラゲナ
ーゼの合成基質（Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−ＰｒｏおよびＰｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ）によく作用する。 （２）至適ｐＨ：７〜８ （３）至適温度：３０℃〜４０℃ （４）分子量：約６０，０００
分解酵素および当該分解酵素を生産するビブリオ属に属
する生産菌を提供する。 【構成】 当該生産菌はビブリオ・エス・ピー（Ｖｉｂ
ｒｉｏ ｓｐ）１７０６Ｂ菌株である。当該コラーゲン
分解酵素は下記の理化学的性質を有する。 （１）作用：可溶性コラーゲンおよび不溶性コラーゲン
の双方のコラーゲンの分解に著しい活性を示し、軽鎖お
よび重鎖ミオシンに対しても高い活性を示す。コラゲナ
ーゼの合成基質（Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−ＰｒｏおよびＰｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ）によく作用する。 （２）至適ｐＨ：７〜８ （３）至適温度：３０℃〜４０℃ （４）分子量：約６０，０００
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なビブリオ属に属
するコラーゲン分解酵素生産菌および当該コラーゲン分
解酵素生産菌により生産される新規コラーゲン分解酵素
ならびに当該コラーゲン分解酵素の利用法に関する。当
該コラーゲン分解酵素はコラーゲンに特異的に作用する
のみならずミオシンに対しても特異的に作用し、カゼイ
ンに対しては微弱な活性を示す新規なコラーゲン分解酵
素である。当該コラーゲン分解酵素は、食肉軟化剤およ
び細胞分散剤に利用できる有用な酵素である。
するコラーゲン分解酵素生産菌および当該コラーゲン分
解酵素生産菌により生産される新規コラーゲン分解酵素
ならびに当該コラーゲン分解酵素の利用法に関する。当
該コラーゲン分解酵素はコラーゲンに特異的に作用する
のみならずミオシンに対しても特異的に作用し、カゼイ
ンに対しては微弱な活性を示す新規なコラーゲン分解酵
素である。当該コラーゲン分解酵素は、食肉軟化剤およ
び細胞分散剤に利用できる有用な酵素である。
【０００２】
【従来の技術】従来、食肉軟化剤として、植物プロテア
ーゼであるパパインのような酵素が利用されていたが、
パパインは、例えば、システィンのような還元剤を必要
とするばかりでなく、作用も比較的弱いため、一層強力
な酵素が望まれていた。酵素を食肉軟化剤として利用す
る場合、分解酵素はコラーゲンおよびミオシンへ作用す
ることが必須であることが報告されている（例えば、石
下真人、鮫島邦彦著、Ｎｅｗ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｙ 第３６巻、第５３頁、１９９４年参照）。しか
し、コラーゲンばかりでなくミオシンにも特異的に作用
するコラーゲン分解酵素は見いだされていなかった。
ーゼであるパパインのような酵素が利用されていたが、
パパインは、例えば、システィンのような還元剤を必要
とするばかりでなく、作用も比較的弱いため、一層強力
な酵素が望まれていた。酵素を食肉軟化剤として利用す
る場合、分解酵素はコラーゲンおよびミオシンへ作用す
ることが必須であることが報告されている（例えば、石
下真人、鮫島邦彦著、Ｎｅｗ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｙ 第３６巻、第５３頁、１９９４年参照）。しか
し、コラーゲンばかりでなくミオシンにも特異的に作用
するコラーゲン分解酵素は見いだされていなかった。
【０００３】一方、生化学分野等で利用される細胞分散
剤として、クロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）菌由
来のコラゲナーゼが知られているが、作用が不十分であ
った。すなわち、当該コラゲナーゼを少量用いた場合は
細胞分散がうまくゆかず、逆に大量用いた場合は細胞に
損傷が伴う欠点があった。したがって、かかる欠点のな
い細胞分散剤として有用なコラーゲン分解酵素が望まれ
ていた。
剤として、クロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）菌由
来のコラゲナーゼが知られているが、作用が不十分であ
った。すなわち、当該コラゲナーゼを少量用いた場合は
細胞分散がうまくゆかず、逆に大量用いた場合は細胞に
損傷が伴う欠点があった。したがって、かかる欠点のな
い細胞分散剤として有用なコラーゲン分解酵素が望まれ
ていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は上記のような欠点のないコラーゲン分解酵素を生産す
る新規なコラーゲン分解酵素生産菌を提供することにあ
る。
は上記のような欠点のないコラーゲン分解酵素を生産す
る新規なコラーゲン分解酵素生産菌を提供することにあ
る。
【０００５】更に本発明の目的は上記のような欠点のな
い新規なコラーゲン分解酵素を提供することにある。
い新規なコラーゲン分解酵素を提供することにある。
【０００６】本発明の別の目的はこの新規なコラーゲン
分解酵素を含有する肉軟化剤および細胞分散剤を提供す
ることにある。
分解酵素を含有する肉軟化剤および細胞分散剤を提供す
ることにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は東京新木場
海岸の砂土より下記に示す特殊な分離法により上記のよ
うな欠点のないコラーゲン分解酵素を生産するビブリオ
属に属する菌株を分離することにより本発明を完成し
た。すなわち、本菌株の分離は次の通り行った。
海岸の砂土より下記に示す特殊な分離法により上記のよ
うな欠点のないコラーゲン分解酵素を生産するビブリオ
属に属する菌株を分離することにより本発明を完成し
た。すなわち、本菌株の分離は次の通り行った。
【０００８】培地として次の組成のものを使用した。
【０００９】培地の組成（ｇ／ｌ） 不溶性コラーゲン ４．０ 酵母エキス １．０ リン酸１カリウム ０．５ リン酸２カリウム ０．５ 硫酸マグネシウム ０．２ 塩化ナトリウム ５．０ 硫酸第１鉄 ０．０１ 硫酸マンガン ０．０１ 塩化カルシウム ０．６ ｐＨ７ 上記培地では、通常の菌は生育できず、コラーゲンを資
化できる菌のみが増殖しうる。本発明の菌株は、山土、
畑土、排水処理場スラッジ、生皮、海岸の砂土、牧場の
土など多数のサンプルより多数の菌株を分離した中より
わずかに数株得られたうちの１株で、東京新木場海岸の
砂土より見いだされた。その菌学的特徴は次ぎの通りで
ある。
化できる菌のみが増殖しうる。本発明の菌株は、山土、
畑土、排水処理場スラッジ、生皮、海岸の砂土、牧場の
土など多数のサンプルより多数の菌株を分離した中より
わずかに数株得られたうちの１株で、東京新木場海岸の
砂土より見いだされた。その菌学的特徴は次ぎの通りで
ある。
【００１０】１）形態：長さ２．０μｍ、幅１．１μｍ
の桿菌である。
の桿菌である。
【００１１】２）生育状況：普通寒天培地およびゼラチ
ン培地上で増殖し、コロニーは黄色である。好気性菌で
嫌気的増殖はない。至適生育温度は２６℃〜３５℃であ
り、生育可能温度は１０℃〜３８℃である。
ン培地上で増殖し、コロニーは黄色である。好気性菌で
嫌気的増殖はない。至適生育温度は２６℃〜３５℃であ
り、生育可能温度は１０℃〜３８℃である。
【００１２】３）グラム染色性：− ４）ＮａＣｌ生育濃度：０．２〜７．０％ ５）運動性：あり（極鞭毛による） ６）胞子は形成しない ７）オキシダーゼ：＋ ８）カタラーゼ：＋ ９）グルコースよりの酸生成：＋ 以上の性質から本発明の新規な微生物はビブリオ属に属
する細菌であることが認められ、ビブリオ・エス・ピー
（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）１７０６Ｂ株として識別され
る。本菌株は平成６年８月２６日に通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所へ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４４９３号として寄託された。
する細菌であることが認められ、ビブリオ・エス・ピー
（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）１７０６Ｂ株として識別され
る。本菌株は平成６年８月２６日に通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所へ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４４９３号として寄託された。
【００１３】ビブリオ属に属するコラゲナーゼ生産菌と
してビブリオ・アルギノリチカム（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌ
ｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）が知られている［Ｒｅｉｄ，
Ｗｏｏｄｓ等著 Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．１４２， ｐ．１４２（１９８０）］。しか
し、本発明の菌と表１に示す点で相違する。
してビブリオ・アルギノリチカム（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌ
ｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）が知られている［Ｒｅｉｄ，
Ｗｏｏｄｓ等著 Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．１４２， ｐ．１４２（１９８０）］。しか
し、本発明の菌と表１に示す点で相違する。
【００１４】
【表１】 したがって、本発明の菌株は、ビブリオ・アルギノリチ
カム（Ｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）とは
明らかに異なる新菌株である。
カム（Ｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）とは
明らかに異なる新菌株である。
【００１５】本発明のコラーゲン分解酵素は、前記Ｖｉ
ｂｒｉｏ ｓｐ．１７０６Ｂ株を培養して得られる新規
な酵素である。当該酵素はコラーゲンの分解に著しい活
性を示すが、カゼインに対しては微弱な活性であり、基
質特異性に特徴をもっている。
ｂｒｉｏ ｓｐ．１７０６Ｂ株を培養して得られる新規
な酵素である。当該酵素はコラーゲンの分解に著しい活
性を示すが、カゼインに対しては微弱な活性であり、基
質特異性に特徴をもっている。
【００１６】本発明の新規なコラーゲン分解酵素の理化
学的性質および酵素化学的性質は以下に示す通りであ
る。
学的性質および酵素化学的性質は以下に示す通りであ
る。
【００１７】１）作用：コラーゲン（可溶性コラーゲン
および不溶性コラーゲン）に対して著しい分解活性を示
す。また、コラーゲンの変性物であるゼラチンに対して
も作用するが、カゼインに対する活性は微弱である。す
なわち、コラーゲンと比較しておよそ１／１００の力価
である。ミオシン（軽鎖および重鎖）にも高い活性を示
す。コラゲナーゼの合成基質［Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（Ｚ−ＧＰＬＧＰと略すこと
がある）、Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ（ＰＺ−ＰＬＧＰＲと略すことがある）］に対して
もよく作用する。但し、上式中、Ｃｂｚはカルボキシベ
ンゾイル基を示し、Ｐｚはフェニラゾベンゾキシカルボ
ニル基を意味する。
および不溶性コラーゲン）に対して著しい分解活性を示
す。また、コラーゲンの変性物であるゼラチンに対して
も作用するが、カゼインに対する活性は微弱である。す
なわち、コラーゲンと比較しておよそ１／１００の力価
である。ミオシン（軽鎖および重鎖）にも高い活性を示
す。コラゲナーゼの合成基質［Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（Ｚ−ＧＰＬＧＰと略すこと
がある）、Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ（ＰＺ−ＰＬＧＰＲと略すことがある）］に対して
もよく作用する。但し、上式中、Ｃｂｚはカルボキシベ
ンゾイル基を示し、Ｐｚはフェニラゾベンゾキシカルボ
ニル基を意味する。
【００１８】２）精製方法：本発明のコラーゲン分解酵
素は、下記表２のゼラチン培地の培養上澄みの硫安分
画、Ｑセファロースカラムクロマトグラフイー、次いで
ゲル濾過法により精製でき、ＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと称する）によって
均一になったか否かの精製程度を確認できる。
素は、下記表２のゼラチン培地の培養上澄みの硫安分
画、Ｑセファロースカラムクロマトグラフイー、次いで
ゲル濾過法により精製でき、ＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと称する）によって
均一になったか否かの精製程度を確認できる。
【００１９】
【表２】 ３）至適温度：３０℃〜４０℃（図１参照） ４）至適ｐＨ：７〜８（図２参照） ５）熱安定性：３０℃以下（図３参照） ６）ｐＨ安定性：４．０〜１１．５（図４参照） ７）阻害剤：ＥＤＴＡにより阻害され、ｐＣＭＢ，ＤＥ
Ｐで阻害されない（表３参照）。
Ｐで阻害されない（表３参照）。
【００２０】
【表３】 ここで、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸の略記であ
って、キレート剤である。ＰＣＭＢはパラクロメルクリ
安息香酸の略記であって、ＳＨ酵素の阻害剤である。Ｄ
ＦＰはフルオロリン酸ジイソプロピルでセリン酵素の阻
害剤である。ＡＰＭＳＦはアミノフェニルメタンスルホ
ニルフルオライドの略記であって、セリン酵素の阻害剤
である。
って、キレート剤である。ＰＣＭＢはパラクロメルクリ
安息香酸の略記であって、ＳＨ酵素の阻害剤である。Ｄ
ＦＰはフルオロリン酸ジイソプロピルでセリン酵素の阻
害剤である。ＡＰＭＳＦはアミノフェニルメタンスルホ
ニルフルオライドの略記であって、セリン酵素の阻害剤
である。
【００２１】８）分子量：６０，０００（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） ９）紫外部吸収：吸収極大（λｍａｘ）＝２８０ｎｍ
（図５参照） Ａ２８０／Ａ２６０＝１．６８ １０）力価測定法 （コラーゲン分解法）：５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．９ｍｌ中不
溶性コラーゲン（シグマ社製）１０ｍｇと酵素溶液０．
１ｍｌとを３０℃、１〜３時間反応後ＴＣＡ（三塩化酢
酸）試薬１．０ｍｌを加え、遠心分離し、上澄みをニン
ヒドリン発色し、５７０ｎｍで比色測定する。力価は１
分間に１μｍｏｌＬｅｕを生じさせる酵素量を１単位と
する。
ＧＥ） ９）紫外部吸収：吸収極大（λｍａｘ）＝２８０ｎｍ
（図５参照） Ａ２８０／Ａ２６０＝１．６８ １０）力価測定法 （コラーゲン分解法）：５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．９ｍｌ中不
溶性コラーゲン（シグマ社製）１０ｍｇと酵素溶液０．
１ｍｌとを３０℃、１〜３時間反応後ＴＣＡ（三塩化酢
酸）試薬１．０ｍｌを加え、遠心分離し、上澄みをニン
ヒドリン発色し、５７０ｎｍで比色測定する。力価は１
分間に１μｍｏｌＬｅｕを生じさせる酵素量を１単位と
する。
【００２２】本発明のコラーゲン分解酵素の純品の上記
コラーゲン分解法による力価は２０．８単位／ｍｇであ
った。
コラーゲン分解法による力価は２０．８単位／ｍｇであ
った。
【００２３】（カゼイン分解法）：１．１％のカゼイン
を含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５，
４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．９ｍｌに酵素溶液０．１ｍ
ｌを加え、３０℃で３０分間反応させる。反応停止液
（ＴＣＡ試薬）０．９ｍｌを加え、濾過する。濾液０．
５ｍｌをとり、０．４ＭＮａ2ＣＯ3液２．５ｍｌおよび
Ｆｏｌｉｎ試薬０．５ｍｌを加え、３０℃で２０分間保
温し、６６０ｎｍで比色測定をする。力価は１分間に１
μｍｏｌＴｙｒを生じさせる酵素量を１単位とする。
を含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５，
４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．９ｍｌに酵素溶液０．１ｍ
ｌを加え、３０℃で３０分間反応させる。反応停止液
（ＴＣＡ試薬）０．９ｍｌを加え、濾過する。濾液０．
５ｍｌをとり、０．４ＭＮａ2ＣＯ3液２．５ｍｌおよび
Ｆｏｌｉｎ試薬０．５ｍｌを加え、３０℃で２０分間保
温し、６６０ｎｍで比色測定をする。力価は１分間に１
μｍｏｌＴｙｒを生じさせる酵素量を１単位とする。
【００２４】本発明のコラーゲン分解酵素の純品の上記
カゼイン分解法による力価は０．２１単位／ｍｇであっ
た。
カゼイン分解法による力価は０．２１単位／ｍｇであっ
た。
【００２５】１１）本発明のコラーゲン分解酵素の精製
段階（硫安塩析→Ｑセファロース→ゲル濾過）のＳＤＳ
−ＰＡＧＥは図６に示す通りである。ここで、ゲル濃度
は１０％を使用した。
段階（硫安塩析→Ｑセファロース→ゲル濾過）のＳＤＳ
−ＰＡＧＥは図６に示す通りである。ここで、ゲル濃度
は１０％を使用した。
【００２６】本発明のコラーゲン分解酵素をそのまま又
は適当な溶媒、例えば、トリス緩衝液、生理食塩水、水
等で希釈して食肉軟化剤として使用できる。本発明のコ
ラーゲン分解酵素は低温型であって、５℃でも、至適温
度（３５℃）の６０％の活性がある（図１参照）ため、
食肉を低温保存中においても軟化処理ができる利点を有
する。したがって、例えば、屠殺後の低温保存中の吊る
してある肉を酵素液に浸漬、スプレーする等により硬肉
の軟化が可能である。その他の当業者の公知の方法によ
り食肉を軟化できる。
は適当な溶媒、例えば、トリス緩衝液、生理食塩水、水
等で希釈して食肉軟化剤として使用できる。本発明のコ
ラーゲン分解酵素は低温型であって、５℃でも、至適温
度（３５℃）の６０％の活性がある（図１参照）ため、
食肉を低温保存中においても軟化処理ができる利点を有
する。したがって、例えば、屠殺後の低温保存中の吊る
してある肉を酵素液に浸漬、スプレーする等により硬肉
の軟化が可能である。その他の当業者の公知の方法によ
り食肉を軟化できる。
【００２７】本発明のコラーゲン分解酵素は、コラーゲ
ン、筋原繊維に特異的に作用するため、生化学分野の細
胞分散剤として使用できる。細胞分散剤は、本発明のコ
ラーゲン分解酵素をそのまま又は適当な溶媒、例えば、
トリス緩衝液、生理食塩水、水等で希釈して調製でき
る。本発明の細胞分散剤は、当業者に公知の方法により
使用できる。
ン、筋原繊維に特異的に作用するため、生化学分野の細
胞分散剤として使用できる。細胞分散剤は、本発明のコ
ラーゲン分解酵素をそのまま又は適当な溶媒、例えば、
トリス緩衝液、生理食塩水、水等で希釈して調製でき
る。本発明の細胞分散剤は、当業者に公知の方法により
使用できる。
【００２８】
【実施例】以下に本発明の実施例を示す。 （実施例１）本発明のコラーゲン分解酵素を不溶性コラ
ーゲンと、３０℃で反応させ、不溶性コラーゲンの分解
の経時変化を観察した。試験法は、５０ｍＭトリスＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．９
ｍｌ中不溶性コラーゲン（シグマ社製）１０ｍｇとコラ
ーゲン分解酵素（純品）を３８μｇ含有する酵素溶液
０．１ｍｌとを３０℃で１、２、４、８、１２、１６お
よび２４時間反応させた後、各反応物にＴＣＡ（三塩化
酢酸）試薬１．０ｍｌを加え、遠心分離し、上澄みをニ
ンヒドリン発色し、５７０ｎｍで比色測定する。コント
ロールとしてトリプシン［１００μｇ；力価＝１８，３
００単位／ｍｇ（ＢＡＥＥ法）；シグマ社製）を使用
し、ブランク試験（酵素無添加）も行った。結果を図７
に示す。図７に示されているように、本発明のコラーゲ
ン分解酵素を使用した場合、２４時間で不溶性コラーゲ
ンを完全に分解した。肉眼観察では、反応溶液の不溶物
は８時間で消失した。コントロールは経時にわたって低
いレベルの分解でほぼ一定値を示した。ブランクはニン
ヒドリン値は、２４時間経過しても分解しなかった。 （実施例２）本発明のコラーゲン分解酵素を可溶性コラ
ーゲン（基質）に作用させた場合の可溶性コラーゲンの
分解の経時変化を観察した。
ーゲンと、３０℃で反応させ、不溶性コラーゲンの分解
の経時変化を観察した。試験法は、５０ｍＭトリスＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．９
ｍｌ中不溶性コラーゲン（シグマ社製）１０ｍｇとコラ
ーゲン分解酵素（純品）を３８μｇ含有する酵素溶液
０．１ｍｌとを３０℃で１、２、４、８、１２、１６お
よび２４時間反応させた後、各反応物にＴＣＡ（三塩化
酢酸）試薬１．０ｍｌを加え、遠心分離し、上澄みをニ
ンヒドリン発色し、５７０ｎｍで比色測定する。コント
ロールとしてトリプシン［１００μｇ；力価＝１８，３
００単位／ｍｇ（ＢＡＥＥ法）；シグマ社製）を使用
し、ブランク試験（酵素無添加）も行った。結果を図７
に示す。図７に示されているように、本発明のコラーゲ
ン分解酵素を使用した場合、２４時間で不溶性コラーゲ
ンを完全に分解した。肉眼観察では、反応溶液の不溶物
は８時間で消失した。コントロールは経時にわたって低
いレベルの分解でほぼ一定値を示した。ブランクはニン
ヒドリン値は、２４時間経過しても分解しなかった。 （実施例２）本発明のコラーゲン分解酵素を可溶性コラ
ーゲン（基質）に作用させた場合の可溶性コラーゲンの
分解の経時変化を観察した。
【００２９】５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）中で、本発明のコラーゲン
分解酵素対可溶性コラーゲンの重量割合を１：２５００
にし、氷冷下で反応させた。１、２、５、３０および６
０分間反応させた後、直ちに煮沸し、当該酵素を失活さ
せ反応を停止させた。反応後の各試料についてＳＤＳ−
ＰＡＧＥを行った。結果を図８に示す。図中、ＳＣＬは
反応前の可溶性コラーゲンの電気泳動パターンであり、
β、α１、α２は可溶性コラーゲンの主成分のバンドで
ある。１、・・・６０の数字は作用時間（分）を示す。
Ｍ（Ｈ）は分子量マーカーである。ゲル濃度は４％であ
る。図８から分かるように、反応前は可溶性コラーゲン
の主成分（β、α１、α２）は太いバンドとして観察さ
れた。作用時間１〜２分までは反応前の可溶性コラーゲ
ンと同様のバンドが観察されたが、作用時間５分以上で
は低分子化され、可溶性コラーゲンが細かく切断された
ことが分かる。
５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）中で、本発明のコラーゲン
分解酵素対可溶性コラーゲンの重量割合を１：２５００
にし、氷冷下で反応させた。１、２、５、３０および６
０分間反応させた後、直ちに煮沸し、当該酵素を失活さ
せ反応を停止させた。反応後の各試料についてＳＤＳ−
ＰＡＧＥを行った。結果を図８に示す。図中、ＳＣＬは
反応前の可溶性コラーゲンの電気泳動パターンであり、
β、α１、α２は可溶性コラーゲンの主成分のバンドで
ある。１、・・・６０の数字は作用時間（分）を示す。
Ｍ（Ｈ）は分子量マーカーである。ゲル濃度は４％であ
る。図８から分かるように、反応前は可溶性コラーゲン
の主成分（β、α１、α２）は太いバンドとして観察さ
れた。作用時間１〜２分までは反応前の可溶性コラーゲ
ンと同様のバンドが観察されたが、作用時間５分以上で
は低分子化され、可溶性コラーゲンが細かく切断された
ことが分かる。
【００３０】酵素反応では酵素対基質が１：１００で常
温で作用させるのが通常であるので、上記の条件（酵素
対基質＝１：２５００、氷冷（０℃））で作用すること
は、本発明のコラーゲン分解酵素が非常に作用が強力で
あることが分かる。
温で作用させるのが通常であるので、上記の条件（酵素
対基質＝１：２５００、氷冷（０℃））で作用すること
は、本発明のコラーゲン分解酵素が非常に作用が強力で
あることが分かる。
【００３１】上記の試験とは別に、本発明のコラーゲン
分解酵素：可溶性コラーゲン＝１：２５００で２５℃の
条件で作用させたところ、反応直後（１分以内）でも可
溶性コラーゲンのバンドパターンが消失することが観察
された。 （実施例３）本発明のコラーゲン分解酵素のミオシン
（軽鎖および重鎖）に対する作用を観察した。
分解酵素：可溶性コラーゲン＝１：２５００で２５℃の
条件で作用させたところ、反応直後（１分以内）でも可
溶性コラーゲンのバンドパターンが消失することが観察
された。 （実施例３）本発明のコラーゲン分解酵素のミオシン
（軽鎖および重鎖）に対する作用を観察した。
【００３２】１）ミオシン軽鎖（フラグメント１；シグ
マ社製）に対する作用。
マ社製）に対する作用。
【００３３】５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）中で、本発明のコラーゲン
分解酵素対ミオシン軽鎖の重量割合を１：２００にし、
５℃で反応させた。反応時間は０．５、１、２、５、
８、１６および２４時間で、実施例２と同様に１分間煮
沸により反応を停止し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）中で、本発明のコラーゲン
分解酵素対ミオシン軽鎖の重量割合を１：２００にし、
５℃で反応させた。反応時間は０．５、１、２、５、
８、１６および２４時間で、実施例２と同様に１分間煮
沸により反応を停止し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００３４】結果を図９に示す。図中、左横（縦方向）
に記載した数字は分子量マーカーのｋＤａの値である。
下（横方向）に記載したＥは本発明のコラーゲン分解酵
素であり、Ｍ（Ｈ）は分子量マーカーであり、Ｓｔは未
作用の軽鎖ミオシンであり、０．５、・・・２４は作用
時間（時間）である。ゲル濃度は７．５％であった。図
９から分かるように、本発明のコラーゲン分解酵素は６
０ｋＤにバンドを示した。反応の経過と共にミオシン軽
鎖は分解され、消失し、代わって低分子化した一本のバ
ンドが生じることが観察された。これより、本発明の分
解酵素はミオシン軽鎖に対して特異的切断点に作用する
ことが分かる。
に記載した数字は分子量マーカーのｋＤａの値である。
下（横方向）に記載したＥは本発明のコラーゲン分解酵
素であり、Ｍ（Ｈ）は分子量マーカーであり、Ｓｔは未
作用の軽鎖ミオシンであり、０．５、・・・２４は作用
時間（時間）である。ゲル濃度は７．５％であった。図
９から分かるように、本発明のコラーゲン分解酵素は６
０ｋＤにバンドを示した。反応の経過と共にミオシン軽
鎖は分解され、消失し、代わって低分子化した一本のバ
ンドが生じることが観察された。これより、本発明の分
解酵素はミオシン軽鎖に対して特異的切断点に作用する
ことが分かる。
【００３５】２）ミオシン重鎖（シグマ社製）に対する
作用。
作用。
【００３６】ミオシン重鎖についてもミオシン軽鎖と同
様の条件下で反応させ、同様に処理してＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行った。
様の条件下で反応させ、同様に処理してＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行った。
【００３７】結果を図１０に示す。図中の表示は、図９
と同様である。図１０より分かるように、ミオシン軽鎖
と異なり、細分化され、２時間作用で相当細かく切断さ
れていることが分かる。
と同様である。図１０より分かるように、ミオシン軽鎖
と異なり、細分化され、２時間作用で相当細かく切断さ
れていることが分かる。
【００３８】以上の結果より、本発明の分解酵素は肉軟
化剤として有用であることが分かる。 （実施例４）本発明の分解酵素を筋の多い肉（牛のスネ
硬肉）に作用させ、その観察を行った。当該酵素は硫安
塩析製品を用い、力価は純品の１／６．３であった。比
較のため、パパイン［力価＝３，０００単位／ｍｇ（カ
ゼイン分解法）；和光純薬］、パンクレアチン［力価＝
１０．７単位／ｍｇ（カゼイン分解法）；ミクニ化学産
業］も使用した。
化剤として有用であることが分かる。 （実施例４）本発明の分解酵素を筋の多い肉（牛のスネ
硬肉）に作用させ、その観察を行った。当該酵素は硫安
塩析製品を用い、力価は純品の１／６．３であった。比
較のため、パパイン［力価＝３，０００単位／ｍｇ（カ
ゼイン分解法）；和光純薬］、パンクレアチン［力価＝
１０．７単位／ｍｇ（カゼイン分解法）；ミクニ化学産
業］も使用した。
【００３９】５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．２ｍｌ中に、前記硬肉
３０ｍｇを入れ、各酵素３．０、１．５および０．７５
ｍｇを添加して、５℃に保持し、所定日数処理した。パ
パインは０．１Ｍシスティン存在下で行った。
５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．２ｍｌ中に、前記硬肉
３０ｍｇを入れ、各酵素３．０、１．５および０．７５
ｍｇを添加して、５℃に保持し、所定日数処理した。パ
パインは０．１Ｍシスティン存在下で行った。
【００４０】結果を表４に示す。
【００４１】
【表４】 表４から分かるように、本発明の分解酵素の場合、３．
０ｍｇおよび１．５ｍｇ添加で４日処理したものは完全
に分解した。０．７５ｍｇ添加でも４日処理したものは
３／４程度分解した。パパインの場合、３．０ｍｇ添加
で４日処理したものは３／４程度しか分解しなかった。
パンクレアチンの場合、いずれの添加量でも４日処理し
ても硬肉の形が多少崩れる程度でほとんど作用しなかっ
た。
０ｍｇおよび１．５ｍｇ添加で４日処理したものは完全
に分解した。０．７５ｍｇ添加でも４日処理したものは
３／４程度分解した。パパインの場合、３．０ｍｇ添加
で４日処理したものは３／４程度しか分解しなかった。
パンクレアチンの場合、いずれの添加量でも４日処理し
ても硬肉の形が多少崩れる程度でほとんど作用しなかっ
た。
【００４２】上記の試験は、結果を鮮明に出すために酵
素／基質の割合を高い値で作用させたが、一層マイルド
な結果を望むなら、酵素／基質の割合を下げたり、処理
温度を低くする、又は適当な阻害剤を使用する等の条件
を変え、目的に応じた調節をすることができる。 （実施例５）本発明の分解酵素を更に牛上肉に作用さ
せ、その観察を行った。
素／基質の割合を高い値で作用させたが、一層マイルド
な結果を望むなら、酵素／基質の割合を下げたり、処理
温度を低くする、又は適当な阻害剤を使用する等の条件
を変え、目的に応じた調節をすることができる。 （実施例５）本発明の分解酵素を更に牛上肉に作用さ
せ、その観察を行った。
【００４３】５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．２ｍｌ中に、前記牛上
肉３０ｍｇを入れ、実施例４で使用したと同様の硫安塩
析酵素（力価は純品の１／６．３）を３．０、１．５お
よび０．７５ｍｇを添加して、５℃に保持し、２４時間
処理した後、観察をした。
５，４ｍＭＣａＣｌ2含有）０．２ｍｌ中に、前記牛上
肉３０ｍｇを入れ、実施例４で使用したと同様の硫安塩
析酵素（力価は純品の１／６．３）を３．０、１．５お
よび０．７５ｍｇを添加して、５℃に保持し、２４時間
処理した後、観察をした。
【００４４】その結果、３ｍｇを添加したものは、振盪
するだけで、肉がばらばらに崩れた。１．５ｍｇおよび
０．７５ｍｇを添加したものは、振盪するだけではばら
ばらに崩れなかったが、ガラス板上に置き、スパーテル
で押し潰すと、容易にばらばらに崩れた。
するだけで、肉がばらばらに崩れた。１．５ｍｇおよび
０．７５ｍｇを添加したものは、振盪するだけではばら
ばらに崩れなかったが、ガラス板上に置き、スパーテル
で押し潰すと、容易にばらばらに崩れた。
【００４５】図１１は、上記の３．０ｍｇ添加して処理
した場合の顕微鏡写真である（倍率２５０倍）。図１２
は、０．７５ｍｇ添加して処理した場合の同様の顕微鏡
写真である。いずれの場合も、おおむね正方形の薄い板
状の断片に切断されていることが観察された。この切断
された小さい正方形の一辺はおおよそ０．１ｍｍであっ
た。比較のため、酵素を添加しないで同様に処理したブ
ランク試験の顕微鏡写真を図１３に示す。
した場合の顕微鏡写真である（倍率２５０倍）。図１２
は、０．７５ｍｇ添加して処理した場合の同様の顕微鏡
写真である。いずれの場合も、おおむね正方形の薄い板
状の断片に切断されていることが観察された。この切断
された小さい正方形の一辺はおおよそ０．１ｍｍであっ
た。比較のため、酵素を添加しないで同様に処理したブ
ランク試験の顕微鏡写真を図１３に示す。
【００４６】別に、パパイン［力価＝３，０００単位／
ｍｇ（カゼイン分解法）；和光純薬；０．１Ｍシスティ
ン存在下で反応］およびパンクレアチン［力価＝１０．
７単位／ｍｇ（カゼイン分解法）；ミクニ化学産業］で
も同様の条件で作用させたが、作用は弱く、ブランク試
験の結果とほぼ近い結果であった。
ｍｇ（カゼイン分解法）；和光純薬；０．１Ｍシスティ
ン存在下で反応］およびパンクレアチン［力価＝１０．
７単位／ｍｇ（カゼイン分解法）；ミクニ化学産業］で
も同様の条件で作用させたが、作用は弱く、ブランク試
験の結果とほぼ近い結果であった。
【００４７】上記試験も実施例４と同様に結果を鮮明に
出すために酵素／基質の割合を高い値で作用させたが、
一層マイルドな結果を望むなら、酵素／基質の割合を下
げたり、処理温度を低くする、又は適当な阻害剤を使用
する等の条件を変え、目的に応じた調節をすることがで
きる。
出すために酵素／基質の割合を高い値で作用させたが、
一層マイルドな結果を望むなら、酵素／基質の割合を下
げたり、処理温度を低くする、又は適当な阻害剤を使用
する等の条件を変え、目的に応じた調節をすることがで
きる。
【００４８】上記実施例４および５の結果より、本発明
のコラーゲン分解酵素は、細胞分散剤としての利用が期
待できることが分かる。
のコラーゲン分解酵素は、細胞分散剤としての利用が期
待できることが分かる。
【図１】図１は、本発明のコラーゲン分解酵素の至適温
度を示す図表である。基質として、合成基質Ｚ−ＧＰＬ
ＧＰを使用した。
度を示す図表である。基質として、合成基質Ｚ−ＧＰＬ
ＧＰを使用した。
【図２】図２は、本発明のコラーゲン分解酵素の至適ｐ
Ｈを示す図表である。ａ）は合成基質Ｚ−ＧＰＬＧＰに
対する至適ｐＨを示し、ｂ）は不溶性コラーゲンに対す
る至適ｐＨを示す。
Ｈを示す図表である。ａ）は合成基質Ｚ−ＧＰＬＧＰに
対する至適ｐＨを示し、ｂ）は不溶性コラーゲンに対す
る至適ｐＨを示す。
【図３】図３は、本発明のコラーゲン分解酵素の温度安
定性を示す図表である。基質として合成基質Ｚ−ＧＰＬ
ＧＰを使用した。
定性を示す図表である。基質として合成基質Ｚ−ＧＰＬ
ＧＰを使用した。
【図４】図４は、本発明のコラーゲン分解酵素のｐＨ安
定性を示す図表である。基質として、合成基質Ｚ−ＧＰ
ＬＧＰを使用した。
定性を示す図表である。基質として、合成基質Ｚ−ＧＰ
ＬＧＰを使用した。
【図５】図５は、本発明のコラーゲン分解酵素の紫外部
吸収曲線を示す図表である。
吸収曲線を示す図表である。
【図６】図６は、本発明のコラーゲン分解酵素の精製段
階のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。図中、Ｈおよ
びＬは分子量マーカーである。１は硫安塩析沈殿物を、
２はＱ−セファロースクロマトにより精製したものを、
３はＳｕｐｅｒｏｓｅ６（ゲル濾過）クロマトにより精
製したものを示す。
階のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。図中、Ｈおよ
びＬは分子量マーカーである。１は硫安塩析沈殿物を、
２はＱ−セファロースクロマトにより精製したものを、
３はＳｕｐｅｒｏｓｅ６（ゲル濾過）クロマトにより精
製したものを示す。
【図７】図７は、本発明のコラーゲン分解酵素およびト
リプシンの不溶性コラーゲンに対する分解能力を示す図
表である。
リプシンの不溶性コラーゲンに対する分解能力を示す図
表である。
【図８】図８は、本発明のコラーゲン分解酵素の可溶性
コラーゲンに対する分解能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの
写真である。
コラーゲンに対する分解能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの
写真である。
【図９】図９は、本発明のコラーゲン分解酵素のミオシ
ン軽鎖に対する分解能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真
である。
ン軽鎖に対する分解能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真
である。
【図１０】図１０は、本発明のコラーゲン分解酵素のミ
オシン重鎖に対する分解能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの
写真である。
オシン重鎖に対する分解能力を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの
写真である。
【図１１】図１１は、本発明のコラーゲン分解酵素の牛
上肉の細胞分散能力を示す顕微鏡写真である。
上肉の細胞分散能力を示す顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、本発明のコラーゲン分解酵素の牛
上肉の細胞分散能力を示す顕微鏡写真である。
上肉の細胞分散能力を示す顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、本発明のコラーゲン分解酵素を添
加しない場合の牛上肉の細胞分散能力を示す顕微鏡写真
である。
加しない場合の牛上肉の細胞分散能力を示す顕微鏡写真
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:63）
Claims (4)
- 【請求項１】 コラーゲン分解酵素を生産するビブリオ
・エス・ピー（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ）１７０６Ｂ菌株。 - 【請求項２】 下記の理化学的性質を有する、請求項１
記載の菌株により生産されたコラーゲン分解酵素。 （１）作用：可溶性コラーゲンおよび不溶性コラーゲン
の双方のコラーゲンの分解に著しい活性を示し、ミオシ
ンに対しても高い活性を示す。コラゲナーゼの合成基質
（Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏお
よびＰｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）
によく作用する。 （２）至適ｐＨ：７〜８ （３）至適温度：３０℃〜４０℃ （４）分子量：約６０，０００ - 【請求項３】 請求項２記載のコラーゲン分解酵素を含
有する肉軟化剤。 - 【請求項４】 請求項２記載のコラーゲン分解酵素を含
有する細胞分散剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6235974A JPH0870853A (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | ビブリオ属に属する新規な微生物ならびに当該微生物から生産される新規なコラーゲン分解酵素およびその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6235974A JPH0870853A (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | ビブリオ属に属する新規な微生物ならびに当該微生物から生産される新規なコラーゲン分解酵素およびその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870853A true JPH0870853A (ja) | 1996-03-19 |
Family
ID=16993963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6235974A Pending JPH0870853A (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | ビブリオ属に属する新規な微生物ならびに当該微生物から生産される新規なコラーゲン分解酵素およびその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0870853A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009219383A (ja) * | 2008-03-13 | 2009-10-01 | Kagawa Univ | コラーゲン分解酵素を産生する低温細菌、コラーゲン分解酵素、その製造方法、およびその酵素を用いた軟化食肉の製造方法 |
| WO2015133636A1 (ja) * | 2014-03-06 | 2015-09-11 | 株式会社ニッピ | グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼおよび細胞分離用酵素剤 |
| WO2021200955A1 (ja) | 2020-03-31 | 2021-10-07 | 天野エンザイム株式会社 | コラゲナーゼ剤及びその用途 |
| WO2023054315A1 (ja) | 2021-09-28 | 2023-04-06 | 天野エンザイム株式会社 | コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤 |
| KR20230170105A (ko) * | 2021-06-08 | 2023-12-18 | 산동 유니버시티 | 콜라겐을 분해할 수 있는 균주 및 이의 응용 |
-
1994
- 1994-09-05 JP JP6235974A patent/JPH0870853A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009219383A (ja) * | 2008-03-13 | 2009-10-01 | Kagawa Univ | コラーゲン分解酵素を産生する低温細菌、コラーゲン分解酵素、その製造方法、およびその酵素を用いた軟化食肉の製造方法 |
| WO2015133636A1 (ja) * | 2014-03-06 | 2015-09-11 | 株式会社ニッピ | グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼおよび細胞分離用酵素剤 |
| JPWO2015133636A1 (ja) * | 2014-03-06 | 2017-04-27 | 株式会社ニッピ | グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼおよび細胞分離用酵素剤 |
| US10047353B2 (en) | 2014-03-06 | 2018-08-14 | Nippi, Incorporated | Grimonitia-hollisae-derived recombinant collagenase and enzyme agent for cell and tissue dissociation |
| WO2021200955A1 (ja) | 2020-03-31 | 2021-10-07 | 天野エンザイム株式会社 | コラゲナーゼ剤及びその用途 |
| KR20230170105A (ko) * | 2021-06-08 | 2023-12-18 | 산동 유니버시티 | 콜라겐을 분해할 수 있는 균주 및 이의 응용 |
| WO2023054315A1 (ja) | 2021-09-28 | 2023-04-06 | 天野エンザイム株式会社 | コラーゲントリペプチド製造又は軟骨分解のための酵素剤 |
| EP4410981A4 (en) * | 2021-09-28 | 2025-12-31 | Amano Enzyme Inc | ENZYMATIC AGENT FOR THE PRODUCTION OF COLLAGEN TRIPEPTIDE OR THE DEGRADATION OF CARTILAGE |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050201 |