JPH0870856A - ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する実質上純粋な微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のアミノ酸配
列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを保持する組換
えプラスミドによって形質転換された３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素を生産する実質上純粋な微生物、当該アミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。 【効果】 アルカリゲネス・ファエカリスＩＦＯ−１３
１１１由来の染色体ＤＮＡライブラリーから、３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリ
ーニングし、これを用いて構築された発現ベクターの組
み換えプラスミドを宿主微生物に導入することによって
得られた形質転換微生物は効率よく３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素を生産することができた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素を生産する実質上純粋な微生物、３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するＤＮＡ及び３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）
の存在下、基質として１モルの３−ヒドロキシ酪酸に作
用して１モルのＮＡＤを消費し、１モルのアセト酢酸及
び１モルの還元型ＮＡＤに変換する触媒作用を有し、酵
素番号Ｅ．Ｃ．１．１．１．３０として知られている
（酵素ハンドブック、第６頁、１９８２年、朝倉書店発
行）。

【０００３】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は糖尿病の
検査におけるケトン体の１つである３−ヒドロキシ酪酸
の定量に利用される有用な酵素である。

【０００４】これまでに、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素は動物由来のものとしては例えばラット脳〔Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６８，９８０−９８３
（１９９０）〕、ラット肝臓〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．６８，１２２５−１２３０（１９９
０）〕、ウシ心臓〔Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．，２６２，８５−９８（１９８８）〕が報告
されている。

【０００５】また、微生物由来のものとしてはロードス
ピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
ｒｕｂｒｕｍ）〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３７，
６０３−６０７（１９６２）〕、シュードモナス・レモ
イグネイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｅｍｏｉｇｎｅ
ｉ）〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４０，４０２３−
４０２８（１９６５）〕、マイコバクテリウム・フレイ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）〔Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０４，１２３−１２６
（１９７８）〕、パラコッカス・デニトリフィカンス
（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ
ｓ）〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８
３９，３００−３０７（１９８５）〕、ズーグロエア・
ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）
〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８９，６２５−６３５（１９
８１）〕、ロードシュードモナス・スフェロイデス（Ｒ
ｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅ
ｓ）〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４１，２９７−３００
（１９８７）〕、アゾスピリルム・ブラジレンズ（Ａｚ
ｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）〔Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３６，６４５−６４
９（１９９０）〕が報告されている。

【０００６】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の遺伝子に
関してはラットミトコンドリア（Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，
７３，１２１−１２９（１９９１））、ヒト心臓（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（２２），１５４５９−
１５４６３（１９９２））、ラット肝（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７１，４０６−４１１（１
９９３））等が報告されている。

【０００７】しかしながら、動物由来の３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素は活性の発現にリン脂質を必要とし、ま
た微生物由来の酵素はＥＤＴＡにより阻害を受け、更に
０℃における失活や３７℃、１５分間の処理で７０％失
活するなどの欠点があり、さらにまた、上記いずれの生
産株も生産性が低いことから、実用的ではなかった。そ
こで、活性発現にリン脂質を必要とせず、ＥＤＴＡによ
り阻害をうけず、３７℃で失活しない３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素の遺伝子工学による生産が望まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
実情のもとで、ケトン体の定量に有用で、かつ理化学的
性質において良好な３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を効
率よく生産する微生物を開発し、この微生物を用いて該
酵素を量産する方法を提供することを目的としてなされ
たものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために鋭意研究を重ねた結果、まず、アルカリ
ゲネス・エスピー・Ｎｏ．９８１（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｓｐ．Ｎｏ．９８１；ＦＥＲＭ ＢＰ−２５７
０）が３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を産生することを
見いだした（特願平６−１８１０４７号明細書）。

【００１０】しかしながら、その生産性が低いことが判
明したため、本３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素について
高純度に精製し、そのＮ末端領域のアミノ酸分析を行
い、この結果に基づき種々プローブを作成したが３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を保持するクローンを見
いだすことができなかった。

【００１１】さらに研究を続け、本ＩＦＯ−１３１１１
株から３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する微生物
由来の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この中か
ら、該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニングす
ることに成功し、次いでこのＤＮＡを用いて発現ベクタ
ーを構築した後、例えばエッシェリヒア・コリー（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；以下Ｅ．ｃｏｌｉと略
称する）に属する微生物に導入して３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素を生産する実質上純粋な形質転換微生物を作
出し、これを培地中で培養することによって、該３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素を効率よく量産することを見出
した。この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、

【００１２】

【化４】 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から実質
的になるＤＮＡを保持する組換えプラスミドによって形
質転換された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する
実質上純粋な微生物、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであ
る。更に本発明は、

【００１３】

【化５】 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から実質
的になるＤＮＡを保持する組換えプラスミドによって形
質転換された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する
実質上純粋な微生物を培地に培養し、ついでその培養物
から３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取することを特
徴とする３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法であ
る。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する形質
転換された微生物を作出するのに用いられる３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素酵素を発現する遺伝子ＤＮＡは、例えば
該酵素を生産する微生物由来の染色体ＤＮＡライブラリ
ーの中から、スクリーニングすることによって得ること
ができる。

【００１５】本発明においては、前記の３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素を生産する微生物として、アルカリゲネ
ス・ファエカリスＩＦＯ−１３１１１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−４７５０）またはアルカリゲネス・エスピー・Ｎｏ．
９８１（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．Ｎｏ９８１；
ＦＥＲＭ ＢＰ２５７０）が好ましく用いられる。

【００１６】例えば、アルカリゲネス・ファエカリスＩ
ＦＯ−１３１１１の場合、その染色体ＤＮＡライブラリ
ーから該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニング
する方法の具体例について説明すると、まず、該微生物
の染色体ＤＮＡ１００〜２０００μｇ程度を通常用いら
れている方法によって抽出した後、その１〜１０μｇ程
度を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分切断して、例えばクロ
ーニング用ベクターのプラスミドｐＵＣ１１９ＢａｍＨ
Ｉ部位に連結し、次いでこの組換えＤＮＡを宿主微生物
に導入して該染色体ＤＮＡのクローニングを行い、１０
⁴ 〜１０⁵ クローンからなる染色体ＤＮＡライブラリー
を作製する。この際用いられる宿主微生物としては、組
換えＤＮＡが安定でかつ自律的に増殖可能であるもので
あれば特に制限されず、通常の遺伝子組換えに用いられ
ているもの、例えばエッシェリヒア属、バチルス属に属
する微生物などが好ましく使用される。

【００１７】宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法
としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する
微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下に組換え
ＤＮＡの導入を行ってもよいし、コンピテントセル法を
用いてもよい。またバチルス属に属する微生物の場合に
は、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを
用いることができるし、エレクトロポレーション法ある
いはマイクロインジェクション法を用いてもよい。

【００１８】宿主微生物への所望組換えＤＮＡ導入の有
無の選択については、組換えＤＮＡを構成するベクター
の薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で、該宿主微生物
を培養し、生育する宿主微生物を選択すればよい。次い
で、前記の染色体ＤＮＡの中から、３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素を発現する遺伝子をスクリーニングするわけ
であるが、この段階が本発明において非常に困難な部分
であった。

【００１９】通常、遺伝子のクローニングは、コードさ
れているタンパクの部分的アミノ酸配列から推定される
ＤＮＡ配列をもとにした合成ＤＮＡプローブを用いるハ
イブリダイゼーション法によって行われる。常法に従
い、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のＮ末端領域のアミ
ノ酸配列から種々の合成ＤＮＡプローブを作製し、スク
リーニングを行ったが、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
遺伝子を保持するクローンを見い出すことは出来なかっ
た。

【００２０】そこで、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活
性を指標としたショットガン法によってクローニングす
ることを試みた。詳細は後述するが、３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターが大腸菌内で機能す
るかどうか判らないのでベクターに付属のｌａｃプロモ
ーターの下流に外来遺伝子を挿入し、大腸菌に導入後培
地に添加したＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ（−）−チ
オガラクトピラノシド）によってｌａｃプロモーターが
機能するよう誘導をかけた。

【００２１】その際、しばしばこのような誘導によって
大腸菌の生育が悪くなり目的のクローンを得ることがで
きないことから、一度ＩＰＴＧ無添加で遺伝子ライブラ
リーを作製した後、ＩＰＴＧ添加プレートにレプリカす
ることによってＩＰＴＧの悪影響を防いだ。また、メン
ブレン上にレプリカした菌体を用いて３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素活性の有無を調べるために、培地および大
腸菌由来の酵素タンパクの影響（バックグラウンドの上
昇）を避けるため、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が高
いｐＨの環境でも安定であることを利用して、アルカリ
性の緩衝液で前処理を行った。さらに、シグナルを検出
する感度を上げるため、反応液にリゾチームを加えた。
これらのことを組み合わせることによって初めて目的の
遺伝子ＤＮＡのクローニングを達成することが出来た。

【００２２】次に、この目的の遺伝子ＤＮＡを含む形質
転換された宿主微生物から、例えばマニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）らの方法［「モレキュラル・クローニン
グ：コールドスプリングハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）」（１９８２年）］などに従って、３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素を発現するＤＮＡを含む組換えプラスミ
ド（ｐＨＢＤ１と命名した）を調製することができる。
このプラスミドの構成を示す模式図を図４に示した。

【００２３】次に、前記のようにして染色体ＤＮＡライ
ブラリーの中から、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を発
現する遺伝子ＤＮＡを選択し、それを組み込んだ発現ベ
クターを構築する。この発現用ベクターとしては、宿主
微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミド
から遺伝子組換え用として構築されたものが適してい
る。前者のファージとしては、例えばＥ．ｃｏｌｉを宿
主微生物とする場合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ
などが用いられる。

【００２４】また、プラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ
を宿主微生物とする場合には、例えばｐＢＲ３２２、ｐ
ＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１
３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１
１９などが用いられる。さらに、バチルス属を宿主微生
物とする場合は、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫなどを用い
ればよく、サッカロミセス属を宿主微生物とする場合
は、例えばｐＹＡＣ５などを用いればよい。

【００２５】これらのベクターに、３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素遺伝子ＤＮＡを組み込む方法についてはとく
に制限はなく、従来慣用されている方法を用いることが
できる。例えば適当な制限酵素を用いて、前記の３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラ
スミド及び該発現用ベクターを処理し、それぞれ３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片及びベ
クター断片を得た後、それぞれの接着末端をアニーリン
グ後、適当なＤＮＡリガーゼを用いて結合させることに
よって、発現プラスミドが得られる。

【００２６】後述の実施例における発現プラスミドは、
前記の組換えプラスミドｐＨＢＤ１とベクタープラスミ
ドｐＵＣ１１９から得られ、ｐＨＢＤ２と命名されたも
のであり、その構成の模式図は図５に示したとおりであ
る。また、該プラスミド中のアルカリゲネス・ファエカ
リスＩＦＯ−１３１１１染色体ＤＮＡ由来（３−ＨＢＤ
Ｈ Ｇｅｎｅ）の部位の制限酵素地図は図３に示したと
おりである。

【００２７】このようにして、構築された発現ベクター
をＥ．ｃｏｌｉに属する微生物に導入し、該宿主微生物
を形質転換させれば３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生
産する実質上純粋な微生物が得られる。発現ベクターの
導入及び選択方法については前述した方法を用いて行
う。

【００２８】本発明においては、前記組換えプラスミド
ｐＨＢＤ２によって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉに属す
る微生物は、エッシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐＨＢＤ
２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４９）と命名された。

【００２９】このようにして得られた形質転換微生物の
培養は、該微生物の生育に必要な炭素源や窒素源などの
栄養源や無機成分などを含む培地中において行うことが
できる。炭素源としては、例えばグルコース、デンプ
ン、ショ糖、モラッセス、デキストリンなどが挙げられ
る。窒素源としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼ
イン加水分解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アン
モニウム塩などが挙げられ、無機成分としては、例えば
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コ
バルト、亜鉛、マンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫
酸、リン酸などの陰イオンを含む塩が挙げられる。

【００３０】培養方法については特に制限はなく公知の
方法、例えば通気撹拌培養、振盪培養、回転培養、静置
培養などの方法によって、通常２０〜５０℃、好ましく
は２５〜４２℃、より好ましくは３７℃近辺で、１２〜
４８時間程度培養する方法が用いられる。

【００３１】このようにして培養を行ったのち、遠心分
離処理などの手段によって菌体を集め、次いで酵素処
理、自己消化、フレンチプレス、超音波処理などによっ
て細胞を破壊して目的とする酵素を含有する抽出液を得
る。この抽出液から、該酵素を分離、精製するには、例
えば、塩析、脱塩、イオン交換樹脂による吸脱着処理な
どを行ったのち、さらに吸着クロマトグラフィー、ゲル
濾過、電気泳動法などによって精製すればよい。

【００３２】この精製標品について、３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素の酵素活性及び物理化学的性質を調べるこ
とによって、該形質転換微生物が３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素の産生能を有することが確認された。したがっ
て、本発明において用いた３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素を発現する遺伝子ＤＮＡは、図１で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有し、かつその塩基配列が
図２に示す配列であることが明らかであり、特に本発明
は３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列から実質的になるＤＮＡを提供でき、上
記塩基配列の均等物も包含される。

【００３３】このようにして得られた３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素は、ＮＡＤの存在下、３−ヒドロキシ酪酸
をアセト酢酸に効果的に変換する触媒作用を有すること
から、例えば血清中のケトン体の１つである３−ヒドロ
キシ酪酸の定量など、臨床用酵素として有用である。な
お、本発明明細書に記載の塩基配列の記号及びアミノ酸
配列の記号は、当該分野における慣用略号に基づくもの
で、それらの例を以下に列記する。また、すべてのアミ
ノ酸はＬ体を示すものとする。

【００３４】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン Ｎ：アデニン、チミン、グアニンまたはシトシン Ｒ：アデニンまたはグアニン Ｙ：チミンまたはシトシン Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：システイン Ｇｌｎ：グルタミン

【００３５】Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏ：プロリン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン

【００３６】

【実施例】次に、参考例及び実施例によって本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってな
んら限定されるものではない。 参考例１ 染色体ＤＮＡの分離：アルカリゲネス・ファエカリスＩ
ＦＯ−１３１１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７５０）菌株を
普通ブイヨン培地〔１８ｇ／リットル、普通ブイヨン
「栄研」（栄研化学社製）〕２００ｍｌにて３０℃で一
昼夜振盪培養した後、この培養液を高速冷却遠心機（ト
ミーＣＸ−２５０型）を用い、６５００ｒｐｍ（７６６
０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して、菌体を集菌した。

【００３７】次いで、この菌体を５０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及
び１５％シュクロースからなる溶液２０ｍｌ中に懸濁
し、最終濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチーム
（生化学工業社製）を加え、３７℃で３０分間処理して
菌株の細胞壁を破壊した。次に、これに１０％ラウリル
硫酸ナトリウム（シグマ社製）水溶液１ｍｌを加えて、
３７℃で２０分間処理した後、１００００ｒｐｍ（１２
０８０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して水相を回収し
た。

【００３８】この水相に２倍量のエタノールを静かに重
層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながら、ＤＮＡをガラ
ス棒にまきつかせて分離した後、１０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液２０
ｍｌで溶解し、次いでこれに等量のフェノール／クロロ
ホルム（１／１）混合液を加え、撹拌した後、１０００
０ｒｐｍ（１２０８０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して
水相を分取した。次に、この水相に２倍量のエタノール
を加えて前記の方法でもう一度ＤＮＡを分離した後、１
０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴ
Ａからなる溶液２ｍｌに溶解した。

【００３９】参考例２ アルカリゲネス・ファエカリスＩＦＯ−１３１１１遺伝
子ライブラリーの作製：参考例１で得られたアルカリゲ
ネス・ファエカリスＩＦＯ−１３１１１染色体１０μｇ
を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）０．３単位を用
い、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍ
ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂ 及び１ｍＭのＤＴ
Ｔからなる混合物１００μｇ／ｍｌの存在下、３７℃で
３０分間切断処理した。そして、０．７％アガロースゲ
ル電気泳動にて約２．０〜６．０ｋｂのＤＮＡ断片を回
収した。

【００４０】また、クローニングベクターｐＵＣ１１９
（宝酒造社製）５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社
製）３０単位を用い、２０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ
８．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂
及び１ｍＭのＤＴＴから成る混合物１００μｇ／ｍｌの
存在下、３７℃で３時間切断処理した。ｐＵＣ１１９の
切断溶液は、５’末端を脱リン酸化するために、さらに
反応液にアルカリ性ホスファターゼ（宝酒造社製）１単
位を加えて６５℃で２時間処理した。

【００４１】次に、前記のようにして得られた２種のＤ
ＮＡ溶液を混合し、この混合液に等量のフェノール／ク
ロロホルム（１／１）混合液を加えて処理した後、遠心
分離処理によって水相を分取した。次いで、この水相に
１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加え、さらに２
倍量のエタノールを加えて遠心分離処理することによっ
てＤＮＡを沈澱させた後、減圧乾燥した。

【００４２】このＤＮＡを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡ溶液からなる溶液にて溶
解した後、６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、６．
６ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭのＤＴＴ及び６６０μＭ
のＡＴＰ（ベーリンガーマンハイム社製）の存在下、Ｔ
４ＤＮＡライゲース（宝酒造社製）１００単位を用い、
１６℃で１６時間ライゲーションを行った。

【００４３】次いで、これをケー・シゲサダ（Ｋ．Ｓｈ
ｉｇｅｓａｄａ）の方法［「細胞工学」第２巻、６１６
〜６２６ページ（１９８３年）］によりコンピテント細
胞としたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）
［Ｆ^- 、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈ
ｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒ_k ^- 、ｍ_k ⁺ ）、ＳｕｐＥ４
４、ｒｅｌＡ１、λ^- ］［「モレキュラル・クローニン
グ：コールドスプリングハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ）」５０４〜５０６ページ（１９８２年）］にトラン
スフォーメーションし、これをアンピシリン５０μｇ／
ｍｌ含有ＢＨＩ寒天培地にて、３７℃で一昼夜培養し、
約３００００株の形質転換微生物を得て、これを遺伝子
ライブラリーとした。

【００４４】実施例１ ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子含有ＤＮＡのスク
リーニング：参考例２で得た遺伝子ライブラリー、すな
わち平板寒天培地上のアンピシリン耐性コロニーの上
に、ナイロンメンブレンフィルター［ハイボンド−Ｎ＋
（アマシャムジャパン社製）］を重ね、フィルター上に
該コロニー菌体の一部を移行させた後、このフィルター
をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ、１ｍＭのＩＰＴＧ含有
ＢＨＩ寒天培地上に菌体が上になるようにして置き、３
７℃で６時間培養した。

【００４５】そしてこのナイロンメンブレンを１００ｍ
Ｍのグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．０）で浸した濾紙
上に置き、５分間放置し、これをもう一度繰り返した。
次に、１００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．５）で浸し
た濾紙上に置き、５分間放置した。これを３回繰り返し
た。

【００４６】更に、１００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ
８．５）、０．１％のリゾチーム（生化学工業社製）、
１ｍＭのＮＡＤ、５ｍＭの３−ヒドロキシ酪酸、５単位
／ｍｌのジアフォラーゼ、０．０２５％のＮＢＴ及び
０．１％のトリトンＸ−１００から成る溶液を浸した濾
紙上に置き、発色（紫色）するコロニーを選択し、１株
の陽性株を得た。該コロニーを３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ１−ｐＨＢＤ１と命名した。

【００４７】実施例２ 組み換えプラスミドの抽出：上記実施例１で取得した
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＨＢＤ１を、アンピシリン５
０μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ培地にて３７℃で一昼夜培養し
た後、ティー・マニアティスらの方法［「モレキュラル
・クローニング：コールド・スプリング・ハーバー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）」第８６〜９４ページ（１９８
２年）］により、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコー
ドするＤＮＡを含む組み換えプラスミドｐＨＢＤ１を抽
出した。このプラスミドの構成を示す模式図を図４に示
した。

【００４８】該プラスミド中のアルカリゲネス・ファエ
カリスＩＦＯ−１３１１１染色体由来の部位をジデオキ
シ法［「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」第２１４巻、
第１２０５〜１２１０ページ（１９８１年）］により、
塩基配列を決定し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコ
ードする全ＤＮＡが含まれていることを確認すると共
に、その全塩基配列を決定し、少なくとも図２にて示さ
れる配列を含むものであることを確認した。今回解析し
た３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素精製標品のＮ末端側ア
ミノ酸配列３０残基（図６）が完全に一致した。

【００４９】実施例３ 大腸菌内での３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性発
現：実施例２で得られたプラスミドｐＨＢＤ１の５μｇ
を制限酵素ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）それ
ぞれ１０単位を用い、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂
及び１ｍＭのＤＴＴから成る溶液５０μｇ／ｍｌで切断
し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を含む約１．
５ｋｂのＤＮＡフラグメントを０．７％アガロースゲル
電気泳動で分離回収した。

【００５０】一方、Ｅ．ｃｏｌｉのベクタープラスミド
ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）５μｇを制限酵素ＸｂａＩ
及びＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用い、上記と同じ反応
溶液で切断し、１００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．
０）存在下に、アルカリ性フォスファターゼ（宝酒造社
製）１単位を加え、６５℃で２時間処理した。

【００５１】次いで、前記のＤＮＡ溶液を混合し、参考
例２と同様にライゲーション、トランスフォーメーショ
ンを行い、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ寒天
培地にまき、３７℃で一昼夜培養した。このようにし
て、ベクタープラスミドｐＵＣ１１９のＸｂａＩ及びＥ
ｃｏＲＩ部位に３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を
含む約１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが挿入されたプ
ラスミドを得、これをプラスミドｐＨＢＤ２と命名し、
このプラスミドで常法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１
を形質転換して、形質転換微生物を取得した。

【００５２】プラスミドｐＨＢＤ２を保持する形質転換
微生物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ培地に
て３７℃一昼夜培養した後、培養液を１５０００ｒｐｍ
で１分間遠心分離処理して沈澱を回収した。この沈澱
に、該培養液と同量の１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．
０）を加え、超音波破砕を行った。

【００５３】この破砕液を適宜希釈した後、５μｌと
り、これに１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ８．５）５０μ
ｌ、５０ｍＭの３−ヒドロキシ酪酸の１００μｌ、１０
ｍＭのＮＡＤの１００μｌ、０．２５％ニトロブルーテ
トラゾリウム ２０μｌ、１００単位／ｍｌのジアフォ
ラーゼ５０μｌ、１０％のトリトンＸ−１００を１０μ
ｌ及び水６７０μｌからなる反応液１０００μｌを加
え、３７℃で１０分間反応した後、０．１ＮのＨＣｌを
２ｍｌ加えて反応を停止し、５５０ｎｍにおける吸光度
を測定することによって、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素活性を定量した。

【００５４】なお、比較のためにｐＵＣ１１９のみをト
ランスフォーメーションしたＥ．ｃｏｌｉの破砕液につ
いても前記と同様の処理を行い、３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素活性を測定した。

【００５５】その結果、プラスミドｐＨＢＤ２を保持し
た形質転換微生物での活性は２２．４Ｕ／ｍｌであった
が、ｐＵＣ１１９を持つものの活性は検出できなかっ
た。これより、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性をも
つ形質転換体が得られていることが確認された。この形
質転換体をエッシェリヒア・コリー ＤＨ１−ｐＨＢＤ
２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＨ
ＢＤ２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４９）と命名した。さ
らに得られた３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を単離・精
製し、物理化学的性質を検討した結果は下記の通りであ
る。

【００５６】物理化学的性質： （１）酵素作用：基質として３−ヒドロキシ酪酸を用い
た酵素作用を以下に示す。

【００５７】

【化６】 （２）基質特異性：３−ヒドロキシ酪酸に基質特異性を
示す。各種基質に対する特異性は表１の通りである。

【００５８】

【表１】

【００５９】（３）Ｋｍ値：１．６±０．５（ｍＭ）
（３−ヒドロキシ酪酸） ０．１２±０．００５（ｍＭ）（ＮＡＤ） （４）等電点：５．０±０．２（キャリアーアンフォラ
インを用いた電気泳動法にて） （５）分子量：６００００±５０００（ＴＳＫ Ｇ−３
０００ＳＷによるゲル濾過法にて）、３００００±５０
００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて）

【００６０】（６）至適ｐＨ：ｐＨ５．０〜６．０の範
囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５の範
囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０の
範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜
１１．０の範囲は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液を使用して、至適ｐＨを求めた。その結果、
至適ｐＨは８〜９にあった。

【００６１】（７）ｐＨ安定性：１００ｍＭの各種緩衝
液（３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素１Ｕ／ｍｌ）を３７
℃、６０分間処理し、その残存活性を求めた。ｐＨ４．
０〜５．０は１００ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０〜
６．０は１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０は
１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．
０は１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使
用した。その結果、ｐＨ７．５〜１１の範囲で最も良好
な安定性を示した。

【００６２】（８）至適温度：温度を２５℃〜６０℃の
範囲で変化させて至適温度を求めた結果、本酵素の至適
温度は４５〜５０℃であった。 （９）熱安定性：１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）（３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素１Ｕ／ｍ
ｌ）を各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を測
定した結果、少なくとも３７℃まで安定であった。 （１０）金属イオンの影響：各種金属イオン（１ｍＭ）
の本酵素活性への影響について調べた結果は表２に示す
通りで、銅イオンによる強い阻害がみられた。

【００６３】

【表２】

【００６４】（１１）ＥＤＴＡ、ＮａＮ₃ の影響：ＥＤ
ＴＡ、ＮａＮ₃ （１ｍＭ）の本酵素活性への阻害影響に
ついて調べた結果、影響はなかった。 上記のように発現蛋白の理化学的性質を確認し、３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素が発現されたことを確認した。

【００６５】

【発明の効果】本発明によるとアルカリゲネス・ファエ
カリスＩＦＯ−１３１１１由来の染色体ＤＮＡライブラ
リーから、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を発現する遺
伝子ＤＮＡをスクリーニングし、これを用いて構築され
た発現ベクターの組み換えプラスミドを例えばＥ．ｃｏ
ｌｉに属する微生物に導入することによって、得られた
形質転換微生物は効率よく３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素を生産することができた。また、本発明によって、３
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の全アミノ酸配列及びこの
アミノ酸をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列が決定で
きたので、該酵素の基質及び補酵素特異性の変換や耐熱
性の向上などのプロテインエンジニアリングが可能とな
った。

【配列表】

【００６６】配列番号：１ 配列の長さ：１５５１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アルカリゲネス・ファエカリス 株名：ＩＦＯ−１３１１１ 配列の名称：３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子 配列 GCTAGCATGG GTTCTTGATT TATGGCAGAC ACCCTGTCCG CCACCTGGAA TTTTGAAAGC 60 CCTTGATTAT TCAAGGGCTT TTTTGTTTTC TGCTGCTTTG ACCGTCCTGC TCTTTCAGCA 120 TGATTTGTTT GCTGTTTTGT CACATAAGAA CGTTAAGGTA AAAGTGTCAG TAGCGGCCGA 180 TGTTCGGAAA ACTCATCCGC AACATTTTGT ATGGCCGCCT TTTCCCAGCG CAAGCCGAAG 240 TTTTAGGGGG TAATGCGCTA ATACGTGCTC CGATGGTGTT TGGCCTTGTT TTGCAAGCCT 300 TGATGATTCC GGACAAAACC AGCCCATTGC ATCTCCCGGC AGTGCGAGGC GACGAGTACA 360 CTTGGGGTTT CAGTTCTCTG TTGTCCATAC TCACGAGGTA TCT ATG CTG AAA GGT 415 Met Leu Lys Gly 1 AAA AAA GCG GTC GTA ACA GGA TCG ACC AGT GGT ATC GGT CTG GCC ATG 463 Lys Lys Ala Val Val Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ile Gly Leu Ala Met 5 10 15 20 GCC ACC GAG TTG GCA AAA GCT GGT GCA GAT GTG GTG ATC AAT GGT TTT 511 Ala Thr Glu Leu Ala Lys Ala Gly Ala Asp Val Val Ile Asn Gly Phe 25 30 35 GGT CAG CCT GAA GAC ATC GAG CGC GAG CGC AGC ACG CTG GAG TCC AAG 559 Gly Gln Pro Glu Asp Ile Glu Arg Glu Arg Ser Thr Leu Glu Ser Lys 40 45 50 TTT GGT GTC AAA GCC TAT TAT CTG AAT GCA GAC CTG AGC GAT GCA CAG 607 Phe Gly Val Lys Ala Tyr Tyr Leu Asn Ala Asp Leu Ser Asp Ala Gln 55 60 65 GCC ACG CGC GAT TTT ATT GCC AAG GCG GCA GAG GCC CTC GGC GGT CTG 655 Ala Thr Arg Asp Phe Ile Ala Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Gly Leu 70 75 80 GAT ATT CTG GTC AAT AAT GCC GGT ATT CAA CAC ACC GCG CCT ATT GAA 703 Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln His Thr Ala Pro Ile Glu 85 90 95 100 GAG TTC CCG GTT GAT AAA TGG AAC GCC ATC ATT GCC CTG AAC CTG TCG 751 Glu Phe Pro Val Asp Lys Trp Asn Ala Ile Ile Ala Leu Asn Leu Ser 105 110 115 GCC GTA TTC CAC GGC ACC GCG GCG GCC TTG CCC ATC ATG CAA AAG CAG 799 Ala Val Phe His Gly Thr Ala Ala Ala Leu Pro Ile Met Gln Lys Gln 120 125 130 GGC TGG GGA CGC ATC ATC AAT ATC GCC TCG GCT CAC GGT CTG GTG GCC 847 Gly Trp Gly Arg Ile Ile Asn Ile Ala Ser Ala His Gly Leu Val Ala 135 140 145 TCG GTG AAT AAG TCC GCT TAT GTG GCT GCC AAG CAC GGT GTG GTG GGG 895 Ser Val Asn Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val Gly 150 155 160 CTG ACC AAA GTG ACC GCG CTG GAA AAT GCT GGC AAG GGG ATT ACG TGC 943 Leu Thr Lys Val Thr Ala Leu Glu Asn Ala Gly Lys Gly Ile Thr Cys 165 170 175 180 AAC GCC ATC TGC CCG GGC TGG GTA CGT ACT CCC TTG GTG GAA AAA CAG 991 Asn Ala Ile Cys Pro Gly Trp Val Arg Thr Pro Leu Val Glu Lys Gln 185 190 195 ATT GAA GCT ATC AGC CAG CAA AAA GGG ATT GAT ATT GAA GCC GCC GCT 1039 Ile Glu Ala Ile Ser Gln Gln Lys Gly Ile Asp Ile Glu Ala Ala Ala 200 205 210 CGC GAG CTG CTG GCT GAA AAA CAG CCC TCC CTG CAG TTC GTG ACT CCC 1087 Arg Glu Leu Leu Ala Glu Lys Gln Pro Ser Leu Gln Phe Val Thr Pro 215 220 225 GAG CAA TTG GGT GGT GCT GCT GTG TTC CTG TCC TCT GCC GCT GCA GAT 1135 Glu Gln Leu Gly Gly Ala Ala Val Phe Leu Ser Ser Ala Ala Ala Asp 230 235 240 CAA ATG ACA GGT ACG ACG CTA AGC CTG GAT GGC GGC TGG ACA GCA CGC 1183 Gln Met Thr Gly Thr Thr Leu Ser Leu Asp Gly Gly Trp Thr Ala Arg 245 250 255 260 TAATCGCTGT CAGAGCGTAT TGTGTAGATA ACAGATAAAG GGCTTGGCCC TTTGTCTGTT 1243 TGGATTGAAA GGATATAGGC GCATGTTGTT ATTGCTCTCG CCAGCCAAAA AGCTGGATTA 1303 CGATTCCCCT GTACGCACGG AGCTGGAGAC TCAGCCGCTG TTTGTGGAGC AGGCGCAAGG 1363 CTTGATTGAT ATTTTGCGCA CTCAGTCCGA AGAGGATATT GCTGGCTTGA TGAAGCTGAG 1423 CGACGATCTG GCGCGTTTGA ATGTCCAGCG TTACCAGGAG TGGGAGCCCA AGTTTGACCG 1483 CTCCAATGCG CGTCAGGCCA TTCTGGCGTT CAATGGCGAT GTGTATGAAG GCATGGCTGC 1543 CACGGATC 1551

【配列表】

【００６７】配列番号：２ 配列の長さ：３０アミノ酸残基 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：アルカリゲネス・ファエカリス 株名：ＩＦＯ−１３１１１ 配列の名称：３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素Ｎ末端アミ
ノ酸 配列 Met Leu Lys Gly Lys Lys Ala Val Val Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ile 1 5 10 15 Gly Leu Ala Met Ala Thr Glu Leu Ala Lys Ala Gly Ala Asp 20 25 30

【図面の簡単な説明】

【図１】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のアミノ酸配列
を示す図である。

【図２】図１のアミノ酸をコードする３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す図である。

【図３】プラスミドｐＨＢＤ２におけるアルカリゲネス
・ファエカリスＩＦＯ−１３１１１由来の染色体ＤＮＡ
の制限酵素地図である。

【図４】プラスミドｐＨＢＤ１の構造を示す模式図であ
る。

【図５】プラスミドｐＨＢＤ２の構造を示す模式図であ
る。

【図６】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素精製標品のＮ末
端側アミノ酸配列を示す図である。

【図７】本発明で用いた３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
遺伝子発現プラスミドの構築の流れを示す模式図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示した１〜２６０で表さ
   れるアミノ酸配列をコードする塩基配列から実質的にな
   るＤＮＡを保持する組換えプラスミドによって形質転換
   された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する実質上
   純粋な微生物。
2. 【請求項２】 微生物がエッシェリヒア属に属する微生
   物である請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】 エッシェリヒア属に属する微生物が、プ
   ラスミドｐＨＢＤ２によって形質転換されたものである
   請求項２記載の微生物。
4. 【請求項４】 プラスミドｐＨＢＤ２によって形質転換
   された微生物が、エッシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐＨ
   ＢＤ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４９）である請求項３記
   載の微生物。
5. 【請求項５】 ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のアミノ
   酸配列をコードする塩基配列から実質的になるＤＮＡ。
6. 【請求項６】 アミノ酸配列が、 【化１】 で表されるアミノ酸配列である請求項５記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 塩基配列が、 【化２】 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列である請
   求項６記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 下記のアミノ酸配列、 【化３】 で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から実質
   的になるＤＮＡを保持する組換えプラスミドによって形
   質転換された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する
   実質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその培養物
   から３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取することを特
   徴とする３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。
9. 【請求項９】 形質転換された微生物が、プラスミドｐ
   ＨＢＤ２によって形質転換された微生物である請求項８
   記載の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。
10. 【請求項１０】 プラスミドｐＨＢＤ２によって形質転
    換された微生物が、エッシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐ
    ＨＢＤ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４９）である請求項９
    記載の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。