JPH0870857A - アラニンアナログ耐性微生物およびビオチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ビオチンの収率の高い製造法を提供する。 【構成】アラニンアナログ耐性およびビオチンオペロン
の一部または全部を含むプラスミドを有する微生物およ
びこの微生物を培地で培養し、培養物中にビオチンを生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするビオチ
ンの製造法。 【効果】本発明の微生物は優れたビオチン生産能を有し
ており、この微生物を培養することにより、ビオチンを
大量に生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規アラニンアナログ耐
性微生物およびこれを利用するビオチンの製造法に関す
る。本発明により得られるビオチンは、医薬品、化粧品
の原料、飼料添加物等として用いられる。

【０００２】

【従来の技術】ビオチン（ビタミンＨ）はビタミンＢ群
の一種で、カルボキシル化酵素の補酵素として脂肪酸合
成や糖代謝に関与している。このビオチンは、医薬品、
化粧品の原料または飼料添加物等として化学合成法によ
り、年間約１０トン製造されているが、その工程が複雑
なことから、かなり高価である。一方、醗酵法によるビ
オチンの生産は古くから研究されているが、生産性が低
いため実用化されていない。そこで遺伝子組換え技術を
用いてビオチンを製造し、安価なビオチンを提供する方
法が期待されている。これらの製造方法に用いられる遺
伝子工学的に改良した微生物としては、エシェリヒア
（Escherichia）属に属するものとしてα−デヒドロビ
オチン耐性株（例、特開昭６１−１４９０９１号公報
等）などが知られている。これらエシェリヒア属に属す
る微生物以外のものとして以下の微生物が知られてい
る。例えばバチルス（Bacillus）属に属するものとして
は、バチルス・スフェリカスを形質転換し、ついでテノ
イルトリフルオロアセトン耐性を付与した微生物（特開
平４−１１８９４号公報）が、あるいは、セラチア（Se
rratia）属に属するものとしては、セラチア・マルッセ
ンスＳＢ４１１にエチオニン耐性を付与し、次いでＳ−
アミノエチルシステイン耐性を付与し、その後ビオチン
遺伝子断片を含む組換えプラスミドで形質転換させた微
生物（特開平５−１９９８６７号公報）が、同様にビオ
チン構造類似物質であるアクチチアジン酸又は５−（２
−チエニル）−ｎ−吉草酸耐性を付与した形質転換体
（特開平２−２７９８０号公報）が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ビオチンの生産方法では、ビオチンの工業的製造には不
十分なため、ビオチンの生産性をさらに向上させる生産
方法が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ビオチン
の生合成にアラニンが利用されることに着目し、ビオチ
ン生産菌のアラニン生合成を強化することによりビオチ
ンの蓄積量が向上すると予想した。そこでビオチン生産
菌からアラニンアナログ耐性株を分離したところ、ビオ
チン蓄積量が著しく増大した株を取得できた。この知見
に基づきさらに鋭意検討した結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、（１）ビオチンオペロンの一部ま
たは全部を含むプラスミドを有するアラニンアナログ耐
性微生物、（２）微生物が、エシェリヒア（Escherichi
a）属、バチルス（Bacillus）属又はセラチア（Serrati
a）属に属する微生物である上記（１）記載の微生物、
（３）アラニンアナログが、β−クロロ−Ｄ−アラニン
である上記（１）記載の微生物、および（４）上記
（１）記載の微生物を培地で培養し、培養物中にビオチ
ンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
ビオチンの製造法を提供するものである。

【０００５】アラニンアナログとしては、例えばβ−ク
ロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニン、β−
２−チエニル−ＤＬ−アラニン、ＤＬ−アラニンヒドロ
キサメート、ＤＬ−１,２,４−トリアゾール−３−アラ
ニン、Ｄ−サイクロセリン等があげられる。このうち、
β−クロロ−Ｄ−アラニン、β−２−チエニル−ＤＬ−
アラニン等が好ましい。特に好ましくはβ−クロロ−Ｄ
−アラニンである。ビオチンオペロンとしては、例えば
エシェリヒア属、バチルス属、セラチア属由来のビオチ
ンオペロン等があげられる。エシェリヒア属由来として
はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のビオ
チンオペロン（特開昭６１−２０２６８６号等）があげ
られる。該ビオチンオペロンには、ビオチン生合成に関
与するbioＡ、bioＢ、bioＦ、bioＣ、bioＤの５つの遺
伝子がコードされている。また、これらのビオチンオペ
ロンの一部を改変したものも本発明では用いることがで
き、例えば、エシェリヒア・コリのビオチンオペロンの
制御領域及び bioＢ開始コドン近傍のいずれかの塩基配
列が野生型に比べて少なくとも１塩基対変異しているも
の等が挙げられる。ここでビオチンオペロンの制御領域
とは、bioＡとbioＢの間に存在するｒ鎖を示す配列表の
配列番号１、及びより詳細には〔図１〕に示す塩基配列
のうち bioＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として−１番目
の塩基対から−８６番目の塩基対までの領域をいい、bi
oＢ開始コドン近傍とは、bioＢ開始コドンＡＴＧのＡを
１として１番目の塩基対から６番目の塩基対までの領域
をいう。さらに具体的には、bioＢ開始コドンＡＴＧの
Ａを１として上流−５３番目、−５番目、下流４番目の
少なくともいずれかひとつのＧＣ対がＡＴ対に変異され
たもの等が挙げられる（特開平５−２１９９５６号）。

【０００６】本発明で用いるプラスミドとしては、例え
ばエシェリヒア属、バチルス属またはセラチア属に属す
る微生物に保持され、かつ遺伝子が発現できるものがあ
げられる。好ましくはエシェリヒア属に属する微生物に
保持されているプラスミドである。該プラスミドとして
は、例えば pＸＢＡ３１２（エシェリヒア・コリＤＲＫ
−３３２３〔pＸＢＡ３１２〕（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１
１７）由来、特開平２−５０２０６５号公報）、後述の
実施例１で得られるpＸＢＲＰ３１９（エシェリヒア・
コリＭＭ４４／pＸＢＲＰ３１９〕（ＩＦＯ １５７２
１，ＦＥＲＭＢＰ−４７２４）由来）、およびそれらの
誘導体等があげられる。本発明の微生物としては、ビオ
チン生成蓄積能を有する微生物であればよく、例えばエ
シェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus)属
またはセラチア（Serratia）属などに属する微生物があ
げられる。このうちエシェリヒア属に属する微生物が好
ましい。該微生物としては、例えばエシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）などがあげられ、好ましい例とし
ては後述の実施例１で得られたエシェリヒア・コリＢＤ
１０／pＸＢＲＰ３１９（ＩＦＯ １５７２２，ＦＥＲ
ＭＢＰ−４７２５）等があげられる。

【０００７】本発明のアラニンアナログ耐性およびビオ
チンオペロンの一部または全部を含むプラスミドを有す
る微生物としては、好ましくはアラニンアナログ耐性お
よびビオチンオペロンの一部または全部を含むプラスミ
ドで形質転換された微生物である。本発明の微生物は、
例えば親株となる微生物にアラニンアナログ耐性を付与
し、得られたアラニンアナログ耐性株にビオチンオペロ
ンの一部または全部を含むプラスミドを導入する、ある
いは、親株となる微生物にビオチンオペロンの一部また
は全部を含むプラスミドを導入し、得られた微生物にア
ラニンアナログ耐性を付与する、またはビオチンオペロ
ンの一部または全部を含むプラスミドを保持している親
株となる微生物にアラニンアナログ耐性を付与すること
により得られる。本発明で用いる親株となる微生物とし
ては、ビオチン生成蓄積能を有する微生物であればいず
れでもよく、例えばエシェリヒア（Escherichia）属、
バチルス（Bacillus）属またはセラチア（Serratia）属
に属する微生物等があげられる。エシェリヒア属に属す
る微生物としては、例えばエシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli）に属する微生物などがあげられ、具体的に
はエシェリヒア・コリ ＩＦＯ １４４１０、エシェリ
ヒア・コリ Ｗ−３１１０（ＩＦＯ １２７１３）およ
びその由来株エシェリヒア・コリ ＤＲ−８５（特開昭
６１−２０２６８６号）、エシェリヒア・コリ ＤＲ−
３３２（特開昭６２−１５５０８１号）、エシェリヒア
・コリ ＤＲＫ−３３２３（特表平２−５０２０６５
号）、エシェリヒア・コリ ＢＭ４０６２（特表昭６４
−５０００８１号）などがあげられる。上記のエシェリ
ヒア・コリＩＦＯ １４４１０およびエシェリヒア・コ
リＩＦＯ１２７１３は、リスト・オブ・カルチャーズ
（List of Cultures）第９版、１９９２年（ＩＦＯ発
行）にそれぞれ収載されている公知株であり、財団法人
醗酵研究所から入手することができる。

【０００８】バチルス属に属する微生物としては、例え
ばバチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）に
属する微生物などがあげられ、より具体的にはバチルス
・スフェリカスＩＦＯ ３５２５およびその由来株バチ
ルス・スフェリカスＮＺ−８８０２（特開平４−１１８
９４号）などがあげられる。上記のバチルス・スフェリ
カスＩＦＯ ３５２５は、リスト・オブ・カルチャーズ
（List of Cultures）第９版、１９９２年，（ＩＦＯ発
行）に収載されている公知株であり、財団法人醗酵研究
所から入手できる。セラチア属に属する微生物として
は、例えばセラチア・マルセッセンス（Serratia marce
scens）に属する微生物などがあげられ、具体例として
はセラチア・マルセッセンスＳn ４１およびその由来株
セラチア・マルセッセンスＴＡ５０２４（特開平２−２
７９８０号）、セラチア・マルセッセンスＳＢ４１１お
よびその由来株セラチア・マルセッセンスＥＴ２、セラ
チア・マルセッセンスＥＴＡ２３（特開平５−１９９８
６７号）などがあげられる。上記した微生物は、そのま
ま用いてもよいが、さらにこれらの変異株を用いてもよ
い。これらの微生物の中で、ビオチンオペロンの一部ま
たは全部を含むプラスミドを保持しないものは、必要に
応じ、後工程で、ビオチンオペロンの一部または全部を
含むプラスミドを導入すればよい。

【０００９】アラニンアナログ耐性株を得る方法として
は、自体公知の方法、例えばＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ−methyl−Ｎ'−nitro−
Ｎ−nitrosoguanidine，以下、ＮＴＧと略すこともあ
る）などの薬剤で処理する方法、紫外線を照射する方法
などがあげられる。次に変異処理した菌体の懸濁液を適
当な濃度、例えば親株が生育できない濃度のアラニンア
ナログを含む培地（例、寒天平板培地）にまき、生育す
るコロニーを分離することによりアラニンアナログ耐性
株を得ることができる。上記の方法で得られたアラニン
耐性株を培養し、培養上清中のビオチンを定量すること
によりビオチンの蓄積量が向上した菌を選ぶことができ
る。ビオチンオペロンの一部または全部を含むプラスミ
ドを導入する方法としては、自体公知の方法に従って行
えばよい。まず、ビオチンオペロンの一部または全部を
含むプラスミドを構築する方法としては自体公知の方
法、例えば、制限酵素によるＤＮＡの切断、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼによるＤＮＡの結合などを行い、目的とするプ
ラスミドを構築する方法〔モレキュラー・クローニング
ア・ラボラトリー・マニュアル コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（Molecular Cloning, A L
aboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory）１
９８２〕等があげられる。上記のプラスミドを用いて宿
主細菌を形質転換する方法としては、自体公知の方法、
例えばエシェリヒア属に属する細菌を宿主とする場合
は、上記のモレキュラー・クローニング ア・ラボラト
リー・マニュアル コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（Molecular Cloning, A Laboratory Manu
al, Cold Spring Habor Laboratory）, １９８２に記載
されている方法等があげられる。

【００１０】上記の方法により得られた本発明の微生物
を培地で培養し、ビオチンを培地に生成させる。本発明
の培養に用いられる培地は、用いられる微生物が利用し
得る栄養源を含むものなら、液状でも固状でもよいが、
大量に処理するときには液体培地を用いるのがより適当
である。培地には同化し得る炭素源、消化し得る窒素
源，無機物質，微量栄養素等が適宜配合される。炭素源
としては、たとえばブドウ糖，乳糖，ショ糖，麦芽糖，
デキストリン，でん粉，マニトール，ソルビトール，グ
リセロール，油脂類（例、大豆油，オリーブ油，ヌカ
油，ごま油，ラード，チキン油など），各種脂肪酸
（例、ラウリン酸，ミリスチン酸，パルミチン酸，ステ
アリン酸，オレイン酸など）等が用いられる。窒素源と
しては、たとえば肉エキス，酵母エキス，乾燥酵母，大
豆粉，脱脂大豆粉，コーン・スチープ・リカー，ペプト
ン，綿実粉，癈糖蜜，尿素，チオ尿素，アンモニア，ア
ンモニウム塩類（例、硫酸アンモニウム，塩化アンモニ
ウム，硝酸アンモニウム，酢酸アンモニウムなど）等が
用いられる。さらにナトリウム，カリウム，カルシウ
ム，マグネシウムなどを含む塩類，鉄，マンガン，亜
鉛，コバルト，ニッケルなどの金属塩類，リン酸，ホウ
酸などの塩類、酢酸，プロピオン酸などの有機酸の塩類
が適宜用いられる。さらに、アミノ酸（例、グルタミン
酸，アスパラギン酸，アラニン，リジン，バリン，メチ
オニン，プロリン等），ペプチド（例、ジペプチド，ト
リペプチド等），ビタミン類（例、Ｂ₁，Ｂ₂，ニコチン
酸，Ｂ₁₂，Ｃ等），核酸類（例、プリン，ピリミジンお
よびその誘導体）等を用いてもよい。培地のｐＨを調節
する目的で無機または有機の酸、アルカリ類等を加えて
もよく、あるいは消泡の目的で油脂類，界面活性剤等の
適量が使用される。培地のｐＨは約４〜１０が好まし
く、特にｐＨ約６〜９が好ましい。

【００１１】培養の手段としては静置培養、振とう培
養、通気撹拌培養のいずれでもよい。大量の培養の際は
通気撹拌培養が好ましい。培養の温度は約１５〜３７
℃、好ましくは約３０〜３７℃である。培養時間は培養
条件によって適宜選択されるが約１〜１０日、好ましく
は約２〜４日である。培養方法としては自体公知の方
法、例えばバッチ培養、フィード培養などがあげられ
る。得られた培養液を遠心分離し、その上清に蓄積され
たビオチンを定量する。ビオチンの定量方法としては、
自体公知の方法に従えばよく、例えば、ラクトバチルス
・プランタルム（Lactobacillus plantarum）を定量菌
とするバイオアッセイ法（「ザ・ビタミンズ」（The Vi
tamins），第７巻、３０３頁（１９６７）、「ビタミン
学、実験法〔II〕」４７５頁、日本ビタミン学会編（１
９８５年）等）等が挙げられる。上記の方法で微生物を
培養し、培養物中にビオチンを生成蓄積させ、次にこの
培養物からビオチンを採取する。生成したビオチンは主
として培養液中に存在するので、培養液を自体公知の方
法（例、ろ過、遠心分離等）により菌体を分離し、得ら
れたろ液からビオチンを分離、精製するのが有利であ
る。また、培養液から直接に精製してもよい。上記の分
離、精製する方法としては、例えば、適当な溶媒に対す
る溶解性および溶解度の差、溶液からの析出法および析
出速度の差、種々の吸収親和力の差、イオン交換体によ
るイオン交換クロマトグラフィーあるいは減圧濃縮，凍
結乾燥，結晶化，再結晶，乾燥などの手段が単独あるい
は任意の順序に組合わせて、または反復して利用され
る。本発明で得られるビオチンは、医薬品や化粧品の原
料、飼料添加物等として使用しうる。

【００１２】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的
に説明する。培地中の％はW/V％を示す。下記実施例で
得られたエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＭＭ
４４／pＸＢＲＰ３１９およびエシェリヒア・コリ（Esc
herichia coli）ＢＤ１０／pＸＢＲＰ３１９は、１９９
４年６月１０日より各々受託番号ＩＦＯ １５７２１お
よびＩＦＯ １５７２２として財団法人醗酵研究所（Ｉ
ＦＯ）に寄託され、また１９９４年６月２９日よりブタ
ペスト条約下受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２４およ
びＦＥＲＭ ＢＰ−４７２５として通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託されている。

【００１３】実施例１ （１）エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３／pＸＢＡ
３１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１７）（特表平２−５０
２０６５号）から単離したプラスミドpＸＢＡ３１２
（図２参照）を制限酵素ＥcoＲＩで切断した後、ＰstＩ
で部分分解し、アガロースゲル電気泳動、電気溶出法に
より完全長のビオチンオペロンを含むＥcoＲＩ−ＰstＩ
断片（６.０Kbp）を単離した。得られたpＸＢＡ３１２
のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片とプラスミドpＢＲ３２２のＥc
oＲＩ−ＰstＩ断片（３.６Kbp）とを連結してプラスミ
ドpＸＢＡ３１９を得た。プラスミドpＭＷ１１９（ニッ
ポンジーン，日本）を制限酵素ＡatIIとＡvaＩで切断
後、アガロースゲル電気泳動と電気溶出法により、Ａat
II−ＡvaＩ断片（０.４Kbp）を得、ついでブランティン
グキット（宝酒造，日本）を用いて、ＡatII−ＡvaＩ断
片の両端を平滑化した。得られたＡatII−ＡvaＩ断片を
pＸＢＲ３１９のＳmaＩ部位に連結することによりプラ
スミドpＸＢＲＰ３１９を得た。 （２）エシェリヒア・コリ ＩＦＯ １４４１０〔(財)
醗酵研究所より入手〕をＮＴＧで変異処理して得られた
優良株に上記（１）で得られたプラスミドpＸＢＲＰ３
１９を導入し、さらにＮＴＧで変異処理したのち各種の
薬剤耐性株を分離した。この中からビオチン蓄積量が多
い菌株を選び、エシェリヒア・コリＭＭ４４／pＸＢＲ
Ｐ３１９を得た。 （３）上記（２）で得られたエシェリヒア・コリＭＭ４
４／pＸＢＲＰ３１９を２０mlの２ｘＹＴ培地（酵母エ
キス１０g/L，ペプトン１６g/L および塩化ナトリウム
５g/L 含有）に接種し、３７℃で１６時間振とう培養し
た。得られた培養液の０.２mlを２０mlの２ｘＹＴ培地
に移し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養
液を遠心分離し、集められた菌体をＴＭ緩衝液（マレイ
ン酸５.０８g/L，トリス６.０５g/L，pＨ６.０）で２回
洗浄した。この洗浄菌体を２００μg／mlのＮＴＧを含
むＴＭ緩衝液に懸濁し、３７℃で２５分間処理した。遠
心分離して処理菌体を集め、ＴＭ緩衝液で２回洗浄した
のち、同じ緩衝液に懸濁した。得られた懸濁液を、１mg
／mlのβ−クロロ−Ｄ−アラニンを含むＭ９最少培地の
寒天平板にまき、３７℃で５日間放置することによって
β−クロロ−Ｄ−アラニン耐性株のコロニーが出現し
た。このうち１株を選び、エシェリヒア・コリＢＤ１０
／pＸＢＲＰ３１９と命名した。

【００１４】実施例２ 実施例１で得られたエシェリヒア・コリＢＤ１０／pＸ
ＢＲＰ３１９をグルコース２％，炭酸カルシウム１％，
コーンスティープリカー４％，硫安０.４％，ＫＨ₂ＰＯ
₄ ０.１％，Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％ およびＭgＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ０.０１％からなる種培地（pＨ７.１）３０mlを
含む２００ml容フラスコで３７℃で１６時間振とう培養
した。得られた培養液の０.６mlをグルコース５％，コ
ーンスティープリカー５％，硫安０.２％，ＤＬ−アラ
ニン０.３％，ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.１％，Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.
２％，ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.０１％，ＦeＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ ０.００１％，ＭnＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ０.００１
％およびチアミン塩酸塩０.００２％からなる主培地（p
Ｈ７.１）３０mlを含む２００ml容フラスコに移し、３
７℃で３０時間振とう培養した。培養後の培養液を遠心
分離し、得られた培養上清中のビオチン蓄積量をラクト
バチルス・プランタルムＩＦＯ ３０７０を定量菌とし
て前記のバイオアッセイ法（「ザ・ビタミンズ」（The
Vitamins），第７巻、３０３頁（１９６７））により定
量したところ１４０mg/L であった。

【００１５】

【発明の効果】本発明の微生物は優れたビオチン生産能
を有しており、この微生物を培養することにより、ビオ
チンを大量に生産することができる。

【００１６】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：エシェリヒア コリ（Esherichia coli） 配列 ＣＧＴＣＣＧＴＴＧＴ ＣＡＴＡＡＴＣＧＡＣ ＴＴＧＴＡＡＡＣＣＡ ＡＡＴ
ＴＧＡＡＡＡＧ ＡＴＴＴＡＧＧＴＴＴ ＡＣＡＡＧＴＣＴＡＣ ６０ ＡＣＣＧＡＡＴＴＡＡ ＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡ ＣＡＣＧＴＴＴＴＧＧ ＡＧＡ
ＡＧＣＣＣＣＡ ＴＧＧＣＴＣＡＣＣＧ ＣＣＣＡ １１４

【図面の簡単な説明】

【図１】ビオチンオペロンの制御領域及びｂｉｏＢ開始
コドン近傍の塩基配列を示す。

【図２】プラスミドpＸＢＡ３１２のＤＮＡの制限酵素
切断地図を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 松井 純二 大阪府吹田市江坂町２丁目１−11−1109 (72)発明者 中濱 一雄 京都府長岡京市梅が丘１丁目16番地の２ (72)発明者 伊福 欧二 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ビオチンオペロンの一部または全部を含む
   プラスミドを有するアラニンアナログ耐性微生物。
2. 【請求項２】微生物が、エシェリヒア（Escherichia）
   属、バチルス（Bacillus）属又はセラチア（Serratia）
   属に属する微生物である請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】アラニンアナログが、β−クロロ−Ｄ−ア
   ラニンである請求項１記載の微生物。
4. 【請求項４】請求項１記載の微生物を培地で培養し、培
   養物中にビオチンを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするビオチンの製造法。