JPH0873380A - 抗癌剤 - Google Patents
抗癌剤Info
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- JPH0873380A JPH0873380A JP6232498A JP23249894A JPH0873380A JP H0873380 A JPH0873380 A JP H0873380A JP 6232498 A JP6232498 A JP 6232498A JP 23249894 A JP23249894 A JP 23249894A JP H0873380 A JPH0873380 A JP H0873380A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- calponin
- gene
- anticancer agent
- recombinant vector
- agent according
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 カルポニン遺伝子を有効成分として含む抗癌
剤。 【効果】 本発明の抗癌剤により、癌細胞の造腫瘍性を
低下させ、転移能を減弱させることができる。従って、
本発明の抗癌剤は、癌の治療および予防、特に癌転移の
抑制に極めて有効である。
剤。 【効果】 本発明の抗癌剤により、癌細胞の造腫瘍性を
低下させ、転移能を減弱させることができる。従って、
本発明の抗癌剤は、癌の治療および予防、特に癌転移の
抑制に極めて有効である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗癌剤に関し、さらに詳
細には、カルポニン遺伝子を利用した抗癌剤に関する。
細には、カルポニン遺伝子を利用した抗癌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌の治療には外科的療法、放射線療法、
化学療法など、さらにはこれらを組み合わせた集学的療
法が行われ、生存率の大幅な向上が認められるにいたっ
た。しかしながら、癌患者の生存率の更なる向上のため
に臨床上問題となるのは原発巣より遊離した癌細胞が、
他の臓器に転移し、予後不良となることである。このよ
うなきわめて致命的な癌転移について、現状では満足の
いく治療法はなく、従って、癌転移の制圧が望まれてお
り、癌転移に対し有効な薬剤の開発が急務となってい
る。癌転移の機構に関しては過去に多くの研究がなさ
れ、特に血行性転移に関してはその詳細な機構が判明し
てきている。癌細胞は原発巣より遊離し、血管内に浸潤
し、血流に乗り遠隔の転移先臓器まで運ばれる。ここで
血管内皮細胞と接着し、細胞外基底膜構成成分を破壊し
ながら、血管外へ浸潤し、血管新生を伴いながら他臓器
で増殖をするようになり転移が成立する（Liotta L.A.
et al Cell 1991 ; 64 : 327-336）。癌転移抑制剤の開
発にはこれら各ステップのいずれかを阻止すれば良いと
理論的に考えることができる。事実、接着を抑制する物
質（Humphries M.J. Olden K. and Yamada K. Science
1986 ; 233 : 4647-470、あるいは、Iwamoto Y. et al
Science 1987 ; 1132-1134）、血管新生阻害剤（Yamaok
a M. et al Cancer Reseach 1993 ; 53 : 4262-426
7）、癌細胞の浸潤を抑制する物質（公開特許公報 特
開平3-31214）、基底膜分解酵素の阻害物質（例えば、I
rimura T. Nakajima M. and Nicolson G.L. Biochemist
ry 1989 ; 25 :5322-5328、あるいは、公開特許公報
特開平5-194414）などが既に知られている。しかしなが
ら、これらの物質は基礎実験の段階であり、実用化には
至っていない。
化学療法など、さらにはこれらを組み合わせた集学的療
法が行われ、生存率の大幅な向上が認められるにいたっ
た。しかしながら、癌患者の生存率の更なる向上のため
に臨床上問題となるのは原発巣より遊離した癌細胞が、
他の臓器に転移し、予後不良となることである。このよ
うなきわめて致命的な癌転移について、現状では満足の
いく治療法はなく、従って、癌転移の制圧が望まれてお
り、癌転移に対し有効な薬剤の開発が急務となってい
る。癌転移の機構に関しては過去に多くの研究がなさ
れ、特に血行性転移に関してはその詳細な機構が判明し
てきている。癌細胞は原発巣より遊離し、血管内に浸潤
し、血流に乗り遠隔の転移先臓器まで運ばれる。ここで
血管内皮細胞と接着し、細胞外基底膜構成成分を破壊し
ながら、血管外へ浸潤し、血管新生を伴いながら他臓器
で増殖をするようになり転移が成立する（Liotta L.A.
et al Cell 1991 ; 64 : 327-336）。癌転移抑制剤の開
発にはこれら各ステップのいずれかを阻止すれば良いと
理論的に考えることができる。事実、接着を抑制する物
質（Humphries M.J. Olden K. and Yamada K. Science
1986 ; 233 : 4647-470、あるいは、Iwamoto Y. et al
Science 1987 ; 1132-1134）、血管新生阻害剤（Yamaok
a M. et al Cancer Reseach 1993 ; 53 : 4262-426
7）、癌細胞の浸潤を抑制する物質（公開特許公報 特
開平3-31214）、基底膜分解酵素の阻害物質（例えば、I
rimura T. Nakajima M. and Nicolson G.L. Biochemist
ry 1989 ; 25 :5322-5328、あるいは、公開特許公報
特開平5-194414）などが既に知られている。しかしなが
ら、これらの物質は基礎実験の段階であり、実用化には
至っていない。
【０００３】一方、遺伝子導入技術の進歩と共に、遺伝
子治療という新しい治療分野が確立されようとしてい
る。癌に対する遺伝子治療には大きくわけて４通りあ
る。第一は免疫療法の応用（例えば、Nabel G.J. at a
l. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 ; 90 : 11307-11
311、あるいはMullligan R.C. Science 1993 ; 260 : 9
26)、第二は自殺遺伝子を用いる方法で脳腫瘍の治療で
行われている（例えば、Culver K.W. et al. Science 1
992 ; 156 : 1550-1552）。第三は癌抑制遺伝子、癌原
遺伝子をターゲットとする方法、第四は化学療法時の骨
髄抑制を防御するために造血幹細胞に多剤耐性遺伝子を
導入する方法である。しかしながら、これらの遺伝子治
療法は原発腫瘍に対する効果は期待できるものの、抗転
移効果という面からの検討はなされておらず、癌転移に
対し有望と思われる遺伝子治療法は現状では未だ報告さ
れていない。
子治療という新しい治療分野が確立されようとしてい
る。癌に対する遺伝子治療には大きくわけて４通りあ
る。第一は免疫療法の応用（例えば、Nabel G.J. at a
l. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 ; 90 : 11307-11
311、あるいはMullligan R.C. Science 1993 ; 260 : 9
26)、第二は自殺遺伝子を用いる方法で脳腫瘍の治療で
行われている（例えば、Culver K.W. et al. Science 1
992 ; 156 : 1550-1552）。第三は癌抑制遺伝子、癌原
遺伝子をターゲットとする方法、第四は化学療法時の骨
髄抑制を防御するために造血幹細胞に多剤耐性遺伝子を
導入する方法である。しかしながら、これらの遺伝子治
療法は原発腫瘍に対する効果は期待できるものの、抗転
移効果という面からの検討はなされておらず、癌転移に
対し有望と思われる遺伝子治療法は現状では未だ報告さ
れていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、癌
転移の抑制に有効な抗癌剤を提供することを目的とす
る。また、本発明は、原発巣に対しても有効な抗腫瘍効
果を示す抗癌剤を提供することを目的とする。
転移の抑制に有効な抗癌剤を提供することを目的とす
る。また、本発明は、原発巣に対しても有効な抗腫瘍効
果を示す抗癌剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意努力
を重ねた結果、カルポニン遺伝子を直接腫瘍細胞に導入
することにより、造腫瘍性が低下し、転移能が減弱する
ことを見出し、さらにはカルポニン遺伝子を予め個体内
に投与することにより、動物モデルを用いた実験的転移
評価系において転移結節数が著しく減少することを見出
し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明
は、カルポニン遺伝子を有効成分として含む抗癌剤を提
供するものである。
を重ねた結果、カルポニン遺伝子を直接腫瘍細胞に導入
することにより、造腫瘍性が低下し、転移能が減弱する
ことを見出し、さらにはカルポニン遺伝子を予め個体内
に投与することにより、動物モデルを用いた実験的転移
評価系において転移結節数が著しく減少することを見出
し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明
は、カルポニン遺伝子を有効成分として含む抗癌剤を提
供するものである。
【０００６】特定の理論に拘泥するわけではないが、本
発明の抗癌剤は直接腫瘍細胞にカルポニン遺伝子を導入
し、発現させることにより、ラミニン受容体の減少に伴
う腫瘍細胞の接着能に変化をもたらし、結果的に造腫瘍
性を低下させ、転移能を減弱させるものと考えられる。
また、直接、個体内にカルポニン遺伝子を導入した場合
には血管壁内の平滑筋細胞を含む正常細胞でカルポニン
遺伝子が発現することにより、血管壁など正常細胞の運
動能、接着能を抑制し、その結果、癌細胞が血管壁外に
浸潤するのを抑制するものと考えられる。
発明の抗癌剤は直接腫瘍細胞にカルポニン遺伝子を導入
し、発現させることにより、ラミニン受容体の減少に伴
う腫瘍細胞の接着能に変化をもたらし、結果的に造腫瘍
性を低下させ、転移能を減弱させるものと考えられる。
また、直接、個体内にカルポニン遺伝子を導入した場合
には血管壁内の平滑筋細胞を含む正常細胞でカルポニン
遺伝子が発現することにより、血管壁など正常細胞の運
動能、接着能を抑制し、その結果、癌細胞が血管壁外に
浸潤するのを抑制するものと考えられる。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて使用されるカルポニン遺伝子とは、カルポニンま
たはカルポニン様タンパクをコードする遺伝子をいうも
のとする。カルポニンは、主に哺乳類平滑筋細胞に存在
するトロポニン様のタンパク質として発見され(Takahas
hi. K.et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986 ;
141 : 20-26)、アクチンフィラメントに結合しミオシ
ンATPaseの活性を阻害することが知られており(Winder.
S.J. et al. J. Biol. Chem. 1990 ;265 : 10148 - 101
55)、平滑筋の収縮制御において重要な役割を担ってい
ると考えられている。 チキンのカルポニンのアミノ酸
配列は高橋らによって決定されている(Takahasi, K. an
d Nadal-Ginnard,B. J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 132
84 - 13288)。また、カルポニン様タンパクとしては、S
M22、mp20が知られており、これらのカルポニン様タン
パクのアミノ酸配列は、それぞれ、Thweatt、Ayme-Sout
hgate らによって決定されている(Thweatt, R. et al.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992 ; 187 : 1 - 7)
(Ayme-Southgate, A. et al. J. Cell Biol. 1989 ; 10
8 : 521 - 531) 。本発明においては、上記のカルポニ
ンまたはカルポニン様タンパクをコードする遺伝子を利
用することができる。
おいて使用されるカルポニン遺伝子とは、カルポニンま
たはカルポニン様タンパクをコードする遺伝子をいうも
のとする。カルポニンは、主に哺乳類平滑筋細胞に存在
するトロポニン様のタンパク質として発見され(Takahas
hi. K.et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986 ;
141 : 20-26)、アクチンフィラメントに結合しミオシ
ンATPaseの活性を阻害することが知られており(Winder.
S.J. et al. J. Biol. Chem. 1990 ;265 : 10148 - 101
55)、平滑筋の収縮制御において重要な役割を担ってい
ると考えられている。 チキンのカルポニンのアミノ酸
配列は高橋らによって決定されている(Takahasi, K. an
d Nadal-Ginnard,B. J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 132
84 - 13288)。また、カルポニン様タンパクとしては、S
M22、mp20が知られており、これらのカルポニン様タン
パクのアミノ酸配列は、それぞれ、Thweatt、Ayme-Sout
hgate らによって決定されている(Thweatt, R. et al.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992 ; 187 : 1 - 7)
(Ayme-Southgate, A. et al. J. Cell Biol. 1989 ; 10
8 : 521 - 531) 。本発明においては、上記のカルポニ
ンまたはカルポニン様タンパクをコードする遺伝子を利
用することができる。
【０００８】また、カルポニンcDNAは、最初にニワトリ
砂嚢よりクロ−ニングされ(Takahashi, K. and Nadal-G
inard, B. J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 13284 - 1328
8)、その後ヒト、ラットのカルポニンcDNAについてもク
ロ−ニングの報告がなされている(Takahashi, K. et a
l. Japanease Circulation Journal 1992 ; 56 supplem
ent : 40)(Shanahan, C. M. et al. Circulation Res.
1993 ; 73 : 193 -204)。本発明においては、上記のカ
ルポニンcDNAを使用してもよい。導入する遺伝子および
発現されるタンパク質の免疫的拒絶反応を最小に抑さえ
るために、また、治療の効果を上げるために、導入する
遺伝子はヒト由来のものが望ましい。好ましくは、配列
番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むカル
ポニン遺伝子、より好ましくは、配列番号１の塩基配列
を含むカルポニン遺伝子を使用する。カルポニン遺伝子
は補助的なコード配列を含んでいてもよく、また、それ
がコードするアミノ酸配列が付加、置換、欠如されたも
のであっても、カルポニンと同様の機能を有するものを
発現するものであればよい。本発明において使用される
カルポニン遺伝子は、公知の技術を用いて、細胞から単
離精製して得られたゲノムDNAもしくはcDNAであって
も、また、これらがNarang等の方法(Narang, S. A. DNA
synthesis Tetrahedron 1993 ; 39 : 3)に従って化学
的に合成されたものであってもよい。
砂嚢よりクロ−ニングされ(Takahashi, K. and Nadal-G
inard, B. J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 13284 - 1328
8)、その後ヒト、ラットのカルポニンcDNAについてもク
ロ−ニングの報告がなされている(Takahashi, K. et a
l. Japanease Circulation Journal 1992 ; 56 supplem
ent : 40)(Shanahan, C. M. et al. Circulation Res.
1993 ; 73 : 193 -204)。本発明においては、上記のカ
ルポニンcDNAを使用してもよい。導入する遺伝子および
発現されるタンパク質の免疫的拒絶反応を最小に抑さえ
るために、また、治療の効果を上げるために、導入する
遺伝子はヒト由来のものが望ましい。好ましくは、配列
番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むカル
ポニン遺伝子、より好ましくは、配列番号１の塩基配列
を含むカルポニン遺伝子を使用する。カルポニン遺伝子
は補助的なコード配列を含んでいてもよく、また、それ
がコードするアミノ酸配列が付加、置換、欠如されたも
のであっても、カルポニンと同様の機能を有するものを
発現するものであればよい。本発明において使用される
カルポニン遺伝子は、公知の技術を用いて、細胞から単
離精製して得られたゲノムDNAもしくはcDNAであって
も、また、これらがNarang等の方法(Narang, S. A. DNA
synthesis Tetrahedron 1993 ; 39 : 3)に従って化学
的に合成されたものであってもよい。
【０００９】本発明においては、カルポニン遺伝子その
もののみを導入することにより目的を達成しうるが、ま
た、カルポニン遺伝子を含み、腫瘍細胞内、平滑筋細胞
等の正常細胞内で該遺伝子を発現することができる組換
えベクターを使用しても良い。本発明において使用でき
る組換えベクターは、カルポニン遺伝子と、該遺伝子の
発現のための発現ベクターから構成される。一般的に
は、哺乳類細胞でタンパク質を発現させることのできる
プラスミドベクターやDNAあるいはRNAのウィルスベクタ
ーを用いて、上記の発現ベクターを構築することができ
る。発現ベクターは、発現ベクタ−の複製を可能とする
複製オリジン、発現のためのプロモ−タ−、スプライス
シグナル、ポリA付加シグナル、薬剤選択マ−カ−、エ
ンハンサ−等を必要に応じて選択し、組み合わせて構築
することができるが、少なくともプロモーターを含むこ
とが好ましい。発現ベクターの複製を可能とする複製オ
リジンには、SV40ウィルス、パピロ−マウィルス、EBウ
ィルス(Epstein-barr virus)等をあげることができ、ま
た発現のためのプロモーターとしてはβ−アクチンプロ
モ−タ−、エロンゲ−ションファクタ−１α、チミジン
キナ−ゼプロモ−タ−、SV40プロモ−タ−、アデノウィ
ルス主要後期プロモ−タ−、サイトメガロウィルスプロ
モ−タ−等をあげることができる。さらに、スプライス
シグナル、ポリA付加シグナル、クローン選択を効率化
するためにアンピシリン耐性遺伝子等の薬剤撰択マーカ
ー、細胞特異的に働くエンハンサーの他、導入遺伝子の
発現を制御する転写制御遺伝子等を付加してもよい。本
発明において使用可能な組換えベクターを構築するうえ
で好ましい発現ベクターとしてはpEF-BOS (Mizushima,
S.et al. Nucleic Acid Research 1990 : 18 : 5322)、
pcDL-SR α296 (Takebe,Y. et al. Molecular and Cell
ular Biology 1988 ; 8 : 466 -472)、pCAGGS (Niwa,
H. et al. Efficient selection for high-expression
transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene
1991 ; 108 : 193 - 200) 、pAd265SVp(A)3 (Kaufman,
R. J. et al. Mol. Cell. Bio. 1985 ; 5 : 1750 - 17
59)等のプラスミドあるいはウィルス等を挙げることが
でき、このうち、pCAGGSが特に好ましい。pCAGGSは、サ
イトメガロウィルスのエンハンサー、チキンβ−アクチ
ンプロモーター、ラビットβ−グロビン 3' スプライス
シグナル、ラビットβ−グロビン 3' 隣接領域、SV40複
製オリジンを有し、哺乳動物細胞中で組込んだ遺伝子を
高い効率で発現させることができる。
もののみを導入することにより目的を達成しうるが、ま
た、カルポニン遺伝子を含み、腫瘍細胞内、平滑筋細胞
等の正常細胞内で該遺伝子を発現することができる組換
えベクターを使用しても良い。本発明において使用でき
る組換えベクターは、カルポニン遺伝子と、該遺伝子の
発現のための発現ベクターから構成される。一般的に
は、哺乳類細胞でタンパク質を発現させることのできる
プラスミドベクターやDNAあるいはRNAのウィルスベクタ
ーを用いて、上記の発現ベクターを構築することができ
る。発現ベクターは、発現ベクタ−の複製を可能とする
複製オリジン、発現のためのプロモ−タ−、スプライス
シグナル、ポリA付加シグナル、薬剤選択マ−カ−、エ
ンハンサ−等を必要に応じて選択し、組み合わせて構築
することができるが、少なくともプロモーターを含むこ
とが好ましい。発現ベクターの複製を可能とする複製オ
リジンには、SV40ウィルス、パピロ−マウィルス、EBウ
ィルス(Epstein-barr virus)等をあげることができ、ま
た発現のためのプロモーターとしてはβ−アクチンプロ
モ−タ−、エロンゲ−ションファクタ−１α、チミジン
キナ−ゼプロモ−タ−、SV40プロモ−タ−、アデノウィ
ルス主要後期プロモ−タ−、サイトメガロウィルスプロ
モ−タ−等をあげることができる。さらに、スプライス
シグナル、ポリA付加シグナル、クローン選択を効率化
するためにアンピシリン耐性遺伝子等の薬剤撰択マーカ
ー、細胞特異的に働くエンハンサーの他、導入遺伝子の
発現を制御する転写制御遺伝子等を付加してもよい。本
発明において使用可能な組換えベクターを構築するうえ
で好ましい発現ベクターとしてはpEF-BOS (Mizushima,
S.et al. Nucleic Acid Research 1990 : 18 : 5322)、
pcDL-SR α296 (Takebe,Y. et al. Molecular and Cell
ular Biology 1988 ; 8 : 466 -472)、pCAGGS (Niwa,
H. et al. Efficient selection for high-expression
transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene
1991 ; 108 : 193 - 200) 、pAd265SVp(A)3 (Kaufman,
R. J. et al. Mol. Cell. Bio. 1985 ; 5 : 1750 - 17
59)等のプラスミドあるいはウィルス等を挙げることが
でき、このうち、pCAGGSが特に好ましい。pCAGGSは、サ
イトメガロウィルスのエンハンサー、チキンβ−アクチ
ンプロモーター、ラビットβ−グロビン 3' スプライス
シグナル、ラビットβ−グロビン 3' 隣接領域、SV40複
製オリジンを有し、哺乳動物細胞中で組込んだ遺伝子を
高い効率で発現させることができる。
【００１０】本発明において使用可能な組換えベクター
は当該技術の熟練者によく知られる技術(Maniatis, T.
et al. Molecular cloning : A laboratory manual 19
89 ;Cold Spring Harbor Laboratory)を用いて、上記の
ような発現ベクターにカルポニン遺伝子を組込むことに
よって構築することができる。
は当該技術の熟練者によく知られる技術(Maniatis, T.
et al. Molecular cloning : A laboratory manual 19
89 ;Cold Spring Harbor Laboratory)を用いて、上記の
ような発現ベクターにカルポニン遺伝子を組込むことに
よって構築することができる。
【００１１】カルポニン遺伝子、または、カルポニン遺
伝子を含みかつ腫瘍細胞内および／または正常細胞内で
該遺伝子を発現することができる組換えベクター（以
下、「カルポニン遺伝子を含む組換えベクター」と記
す。）を医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成物
として、溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化して、投
与することができる。
伝子を含みかつ腫瘍細胞内および／または正常細胞内で
該遺伝子を発現することができる組換えベクター（以
下、「カルポニン遺伝子を含む組換えベクター」と記
す。）を医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成物
として、溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化して、投
与することができる。
【００１２】また、カルポニン遺伝子、または、カルポ
ニン遺伝子を含む組換えベクターを膜の中に封入した粒
子を医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成物とし
て、溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化して、投与し
てもよい。カルポニン遺伝子、または、カルポニン遺伝
子を含む組換えベクターを膜の中に封入することによ
り、該遺伝子または該組換えベクターをヌクレア−ゼに
よる消化から防ぐことができ、またカルポニン遺伝子を
導入する細胞を傷害することなく細胞内に高効率で導入
することができる。リポソ−ム(Wong, T. K. et al. Sc
ience 1980 ; 215: 166)や脂質エマルジョン等の合成膜
の他、植物細胞から取ったプロトプラスト(Schaffner,
W. Proc. Natl. Acad. Sci. 1980 ; 77 : 2163)、レト
ロウィルスのようなウィルスキャプシド(Cone, R. D. e
t al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1984 ; 81 : 6349)、赤
血球膜ゴ−スト(Furusawa, M. et al. Nature 1974 ; 2
49: 449)等の天然由来の膜を利用することができるが、
このうち、リポソームが好ましい。というのは、カルポ
ニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクタ
ーに特別な処理を施すこととなくそのまま用いてリポソ
ーム中に封入することができ、また、ヒトに存在する脂
質またはヒトの体内で代謝される脂質をリポソーム形成
原料として用いれば、カルポニン遺伝子導入後にリポソ
ームは代謝されて無害となる利点を有するからである。
リポソ−ムを形成する原料としては、N-［1-(2,3- ジオ
レオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニ
ウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)、N-［1-(2,3- ジオレ
イロキシ)-プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウム
クロライド(DOTMA)、ジラウロイルフォスファチジルコ
リン(DLPC)、ジオレオイルフォスファチジルエタノ−ル
アミン(DOPE)、ジラウロイルフォスファチジルエタノ−
ルアミン(DLPE)、ジミリストイルフォスファチジルエタ
ノ−ルアミン(DMPE)、ジオレオイルフォスファチジルコ
リン(DOPC)、ジミリストイルフォスファチジルコリン(D
MPC)、N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシ
ル-D-グルタメ−トクロライド(TMAG)等の脂質、および
これらの混合物をあげることができる。これらの脂質
は、カルポニン遺伝子DNAやカルポニン遺伝子を含む組
換えベクターDNAに障害を与えることなく、これらDNAを
効率よく取り込める十分な内容積を持つ大きな一枚膜リ
ポソームを(LUV)を形成するので好ましい。例えば、N-
［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリ
メチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)とジオ
レオイルフォスファチジルエタノ−ルアミン(DOPE)の
1：1(w/w)の混合物(Felgner, D. L. et al. Lipofectio
n : A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfe
ction procedure Proc. Natl. Acad. Sci.1987 ; 84 :
7413)やN-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデ
シル-D-グルタメ−トクロライド(TMAG)とジラウロイル
フォスファチジルコリン(DLPC)とジオレオイルフォスフ
ァチジルエタノ−ルアミン(DOPE)の1：2：2 (mol/mol/m
ol)の混合物(Koshizaka, T. et al. J.Clin. Biochem.
Nutr.1989 ; 7 : 185)等は、DNAを取り込むリポソーム
を形成することが知られている。上記脂質のうち、細胞
毒性が低いことから、N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-
プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサル
フェ−ト(DOTAP)が特に好ましい。さらに、リポソーム
の表面にHVJ(Hemagglutinating virus of Japan)の糖タ
ンパクを組み込み、あるいは共有結合させてたり、ポリ
エチレングリコール等を添加すると、細胞への遺伝子導
入の効率が上がる。また、腫瘍細胞や平滑筋細胞へのタ
ーゲッティングの特異性を上げるために、腫瘍細胞や平
滑筋細胞表面に特異的な抗体や受容体リガンドをリポソ
ームに組み込み、あるいは共有結合させてもよい。
ニン遺伝子を含む組換えベクターを膜の中に封入した粒
子を医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成物とし
て、溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化して、投与し
てもよい。カルポニン遺伝子、または、カルポニン遺伝
子を含む組換えベクターを膜の中に封入することによ
り、該遺伝子または該組換えベクターをヌクレア−ゼに
よる消化から防ぐことができ、またカルポニン遺伝子を
導入する細胞を傷害することなく細胞内に高効率で導入
することができる。リポソ−ム(Wong, T. K. et al. Sc
ience 1980 ; 215: 166)や脂質エマルジョン等の合成膜
の他、植物細胞から取ったプロトプラスト(Schaffner,
W. Proc. Natl. Acad. Sci. 1980 ; 77 : 2163)、レト
ロウィルスのようなウィルスキャプシド(Cone, R. D. e
t al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1984 ; 81 : 6349)、赤
血球膜ゴ−スト(Furusawa, M. et al. Nature 1974 ; 2
49: 449)等の天然由来の膜を利用することができるが、
このうち、リポソームが好ましい。というのは、カルポ
ニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクタ
ーに特別な処理を施すこととなくそのまま用いてリポソ
ーム中に封入することができ、また、ヒトに存在する脂
質またはヒトの体内で代謝される脂質をリポソーム形成
原料として用いれば、カルポニン遺伝子導入後にリポソ
ームは代謝されて無害となる利点を有するからである。
リポソ−ムを形成する原料としては、N-［1-(2,3- ジオ
レオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニ
ウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)、N-［1-(2,3- ジオレ
イロキシ)-プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウム
クロライド(DOTMA)、ジラウロイルフォスファチジルコ
リン(DLPC)、ジオレオイルフォスファチジルエタノ−ル
アミン(DOPE)、ジラウロイルフォスファチジルエタノ−
ルアミン(DLPE)、ジミリストイルフォスファチジルエタ
ノ−ルアミン(DMPE)、ジオレオイルフォスファチジルコ
リン(DOPC)、ジミリストイルフォスファチジルコリン(D
MPC)、N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシ
ル-D-グルタメ−トクロライド(TMAG)等の脂質、および
これらの混合物をあげることができる。これらの脂質
は、カルポニン遺伝子DNAやカルポニン遺伝子を含む組
換えベクターDNAに障害を与えることなく、これらDNAを
効率よく取り込める十分な内容積を持つ大きな一枚膜リ
ポソームを(LUV)を形成するので好ましい。例えば、N-
［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリ
メチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)とジオ
レオイルフォスファチジルエタノ−ルアミン(DOPE)の
1：1(w/w)の混合物(Felgner, D. L. et al. Lipofectio
n : A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfe
ction procedure Proc. Natl. Acad. Sci.1987 ; 84 :
7413)やN-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデ
シル-D-グルタメ−トクロライド(TMAG)とジラウロイル
フォスファチジルコリン(DLPC)とジオレオイルフォスフ
ァチジルエタノ−ルアミン(DOPE)の1：2：2 (mol/mol/m
ol)の混合物(Koshizaka, T. et al. J.Clin. Biochem.
Nutr.1989 ; 7 : 185)等は、DNAを取り込むリポソーム
を形成することが知られている。上記脂質のうち、細胞
毒性が低いことから、N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-
プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサル
フェ−ト(DOTAP)が特に好ましい。さらに、リポソーム
の表面にHVJ(Hemagglutinating virus of Japan)の糖タ
ンパクを組み込み、あるいは共有結合させてたり、ポリ
エチレングリコール等を添加すると、細胞への遺伝子導
入の効率が上がる。また、腫瘍細胞や平滑筋細胞へのタ
ーゲッティングの特異性を上げるために、腫瘍細胞や平
滑筋細胞表面に特異的な抗体や受容体リガンドをリポソ
ームに組み込み、あるいは共有結合させてもよい。
【００１３】カルポニン遺伝子やカルポニン遺伝子を含
む組換えベクターは、当業界の熟練者によく知られてい
る技術を用いて、上記のような膜の中に封入することが
できる。例えば、Danos, O. et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. 1988 ; 85 : 6460、またはVenkatesh, L. K. et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1990 ; 87 : 8746に記載
の方法に準じてカルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝
子を含む組換えベクターをウィルスキャプシド中に封入
することができる。また、カルポニン遺伝子やカルポニ
ン遺伝子を含む組換えベクターを合成膜の中に封入する
ためには、カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を
含む組換えベクターを、上記のような脂質、および、
水、Hepes緩衝生理食塩水(150mM NaCl/20mM Hepes.pH7.
4)、トリス−塩酸緩衝液等と混合し、攪拌すればよい。
さらに、、カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を
含む組換えベクターを合成膜の中に封入する際に、ポリ
エチレングリコール、植物レクチン等を添加してもよ
い。本発明の抗癌剤において、カルポニン遺伝子と膜の
比率、および、カルポニン遺伝子を含む組換えベクター
と膜の比率は、カルポニン遺伝子の所望の発現量が得ら
れるように選択されるが、膜の中にカルポニン遺伝子ま
たはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターが10〜50重
量% の割合で含まれることが好ましい。
む組換えベクターは、当業界の熟練者によく知られてい
る技術を用いて、上記のような膜の中に封入することが
できる。例えば、Danos, O. et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. 1988 ; 85 : 6460、またはVenkatesh, L. K. et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1990 ; 87 : 8746に記載
の方法に準じてカルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝
子を含む組換えベクターをウィルスキャプシド中に封入
することができる。また、カルポニン遺伝子やカルポニ
ン遺伝子を含む組換えベクターを合成膜の中に封入する
ためには、カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を
含む組換えベクターを、上記のような脂質、および、
水、Hepes緩衝生理食塩水(150mM NaCl/20mM Hepes.pH7.
4)、トリス−塩酸緩衝液等と混合し、攪拌すればよい。
さらに、、カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を
含む組換えベクターを合成膜の中に封入する際に、ポリ
エチレングリコール、植物レクチン等を添加してもよ
い。本発明の抗癌剤において、カルポニン遺伝子と膜の
比率、および、カルポニン遺伝子を含む組換えベクター
と膜の比率は、カルポニン遺伝子の所望の発現量が得ら
れるように選択されるが、膜の中にカルポニン遺伝子ま
たはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターが10〜50重
量% の割合で含まれることが好ましい。
【００１４】本発明の抗癌剤の投与形態としては、通常
の静脈内、動脈内投与等の全身投与の他に、癌原発巣に
対して、または、癌種に対応した予想転移部位に対し
て、局部注射、局部塗布、経口投与、経皮投与等の局所
投与を行うことができる。さらに、本発明の抗癌剤の投
与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術また
は、外科的手術等と組み合わせた投与形態をとることも
できる。
の静脈内、動脈内投与等の全身投与の他に、癌原発巣に
対して、または、癌種に対応した予想転移部位に対し
て、局部注射、局部塗布、経口投与、経皮投与等の局所
投与を行うことができる。さらに、本発明の抗癌剤の投
与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術また
は、外科的手術等と組み合わせた投与形態をとることも
できる。
【００１５】有効成分である、任意に膜内に封入された
カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換え
ベクターを医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成
物として、従来の製剤上の慣用技術に従って、製剤化す
ることができる。医薬的に許容できる賦形剤としては、
希釈剤、充填剤、滅菌した水性媒体および種々の無毒性
有機溶媒を挙げることができる。また、この医薬組成物
に、製剤上許容しうるもの、例えば、安定剤、緩衝剤、
等張剤を適宜組み合わせ、あるいは選択して添加するこ
とができる。ここで、安定剤の例として、グルコース、
マンニトール等の糖類、グリシンなどのアミノ酸類、HS
A、BSA、あるいはゼラチン等が、緩衝剤の例として、ト
リス緩衝剤、PBS緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝
剤、あるいはHEPES緩衝剤等が、等張剤の例として、塩
化ナトリウムなどの塩類、グルコース、マンニトール等
の糖類があり、これらの水溶液に有効成分を溶解、もし
くは懸濁した製剤を用いることができる。また、遺伝子
導入の効率をあげるために、ポリエチレングリコールや
DMSO等を添加することもできる。
カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換え
ベクターを医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成
物として、従来の製剤上の慣用技術に従って、製剤化す
ることができる。医薬的に許容できる賦形剤としては、
希釈剤、充填剤、滅菌した水性媒体および種々の無毒性
有機溶媒を挙げることができる。また、この医薬組成物
に、製剤上許容しうるもの、例えば、安定剤、緩衝剤、
等張剤を適宜組み合わせ、あるいは選択して添加するこ
とができる。ここで、安定剤の例として、グルコース、
マンニトール等の糖類、グリシンなどのアミノ酸類、HS
A、BSA、あるいはゼラチン等が、緩衝剤の例として、ト
リス緩衝剤、PBS緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝
剤、あるいはHEPES緩衝剤等が、等張剤の例として、塩
化ナトリウムなどの塩類、グルコース、マンニトール等
の糖類があり、これらの水溶液に有効成分を溶解、もし
くは懸濁した製剤を用いることができる。また、遺伝子
導入の効率をあげるために、ポリエチレングリコールや
DMSO等を添加することもできる。
【００１６】カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子
を含む組換えベクターを膜の中に封入することなく用い
る場合には、リン酸カルシウム共沈法(Graham, F.L .et
al. Virology 1973 ; 52 : 456)、DEAE-デキストラン
法(McCutchan, J. H. et al.J. Natl. Cancer Inst. 19
68 ; 41 : 351)等を用いたインビボ(in vivo)トランス
フェクションを局部に適用したり、または、カルポニン
遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを
局所血管内などに適用することにより、カルポニン遺伝
子を腫瘍細胞、あるいは、血管平滑筋細胞などの正常細
胞内に導入することができる。また、カルポニン遺伝子
やカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを膜の中に封
入して用いる場合には、静脈内への注入により、カルポ
ニン遺伝子を腫瘍細胞あるいは血管内皮などの正常細胞
内に導入することができる。
を含む組換えベクターを膜の中に封入することなく用い
る場合には、リン酸カルシウム共沈法(Graham, F.L .et
al. Virology 1973 ; 52 : 456)、DEAE-デキストラン
法(McCutchan, J. H. et al.J. Natl. Cancer Inst. 19
68 ; 41 : 351)等を用いたインビボ(in vivo)トランス
フェクションを局部に適用したり、または、カルポニン
遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを
局所血管内などに適用することにより、カルポニン遺伝
子を腫瘍細胞、あるいは、血管平滑筋細胞などの正常細
胞内に導入することができる。また、カルポニン遺伝子
やカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを膜の中に封
入して用いる場合には、静脈内への注入により、カルポ
ニン遺伝子を腫瘍細胞あるいは血管内皮などの正常細胞
内に導入することができる。
【００１７】本発明の抗癌剤の投与量は、年齢、性別、
症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一
般に、成人では一日当たりカルポニン遺伝子の重量にし
て、約20mg〜600mgの範囲が適当である。本発明の抗癌
剤は哺乳類の平滑筋細胞に存在するカルポニンをコード
する遺伝子を有効成分とすることから、毒性が低く安全
性が高いと考えられる。また、カルポニン遺伝子を平滑
筋培養細胞に導入することによって、c-フォス(c-fos)
のようなプロトオンコジ−ンの発現を抑制することも知
られていることから、本発明の抗癌剤は発癌性の点にお
いても安全性が高いと考えられる。さらに、本発明の抗
癌剤はカルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む
組換えベクターをリポソーム等の膜の中に封入すること
により、細胞毒性がさらに低減される。本発明を、以下
の実施例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例
は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するも
のではない。
症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一
般に、成人では一日当たりカルポニン遺伝子の重量にし
て、約20mg〜600mgの範囲が適当である。本発明の抗癌
剤は哺乳類の平滑筋細胞に存在するカルポニンをコード
する遺伝子を有効成分とすることから、毒性が低く安全
性が高いと考えられる。また、カルポニン遺伝子を平滑
筋培養細胞に導入することによって、c-フォス(c-fos)
のようなプロトオンコジ−ンの発現を抑制することも知
られていることから、本発明の抗癌剤は発癌性の点にお
いても安全性が高いと考えられる。さらに、本発明の抗
癌剤はカルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む
組換えベクターをリポソーム等の膜の中に封入すること
により、細胞毒性がさらに低減される。本発明を、以下
の実施例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例
は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するも
のではない。
【００１８】
Ａ．癌細胞に直接カルポニン遺伝子を導入した場合の造
腫瘍性低減効果の確認試験
腫瘍性低減効果の確認試験
【００１９】１．ヒトカルポニンcDNAのクロ−ニング 日本人の肝臓癌患者（男子、54才）のヒト大動脈より、
Chirgwin(Chirgwin, J. M. et al. Biochemistry 1977
; 18 : 5294 - 5299)らの方法に従いRNAを単離し、精
製した。さらにこのRNAからオリゴテックスTM−dT30<Su
per>（カタログ番号9021B,宝酒造社製）を用いてpoly
(A)+RNAを精製した。poly(A)+RNA から、ZAP-cDNA 合成
キット（カタログ番号200400,ストラタジ−ン社製）と
ギガパックR Iゴ−ルド（カタログ番号200216,ストラタ
ジ−ン社製）を用いてヒト大動脈λZAPR-cDNAライブラ
リ−を作成した。このライブラリ−からの組換え体をナ
イロンメンブレンフィルタ−HybondTM-N+ （カタログ番
号RPN.137B,アマシャム社製）にプレ−トし、ニワトリ
カルポニンcDNA(Takahashi, K. and Nadal-Ginard, B.
J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 13284 - 13288)をプロ
−ブとして、プラ−クハイブリダイゼ−ションをおこな
い陽性クロ−ンを得た。陽性クロ−ンをf1ヘルパ−ファ
−ジR408,VCSM13で感染させることによって、pBluescri
pt SK-(Takahashi,K. et al. Japanese Circulation Jo
urnal 1992 ; 56 supplement1: 40)にサブクロ−ニング
し、そのなかで最長のクロ−ンを選択し、pBluescript
SK-hCNとした。これをシ−クエネ−スR Version 2.0 D
NA シ−クエンシングキット（カタログ番号70781, USB
社製）を用いてシ−クエンスした。得られたヒトカルポ
ニンcDNAの塩基配列は、配列表の配列番号１に示す。
Chirgwin(Chirgwin, J. M. et al. Biochemistry 1977
; 18 : 5294 - 5299)らの方法に従いRNAを単離し、精
製した。さらにこのRNAからオリゴテックスTM−dT30<Su
per>（カタログ番号9021B,宝酒造社製）を用いてpoly
(A)+RNAを精製した。poly(A)+RNA から、ZAP-cDNA 合成
キット（カタログ番号200400,ストラタジ−ン社製）と
ギガパックR Iゴ−ルド（カタログ番号200216,ストラタ
ジ−ン社製）を用いてヒト大動脈λZAPR-cDNAライブラ
リ−を作成した。このライブラリ−からの組換え体をナ
イロンメンブレンフィルタ−HybondTM-N+ （カタログ番
号RPN.137B,アマシャム社製）にプレ−トし、ニワトリ
カルポニンcDNA(Takahashi, K. and Nadal-Ginard, B.
J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 13284 - 13288)をプロ
−ブとして、プラ−クハイブリダイゼ−ションをおこな
い陽性クロ−ンを得た。陽性クロ−ンをf1ヘルパ−ファ
−ジR408,VCSM13で感染させることによって、pBluescri
pt SK-(Takahashi,K. et al. Japanese Circulation Jo
urnal 1992 ; 56 supplement1: 40)にサブクロ−ニング
し、そのなかで最長のクロ−ンを選択し、pBluescript
SK-hCNとした。これをシ−クエネ−スR Version 2.0 D
NA シ−クエンシングキット（カタログ番号70781, USB
社製）を用いてシ−クエンスした。得られたヒトカルポ
ニンcDNAの塩基配列は、配列表の配列番号１に示す。
【００２０】２．組換えベクターpcDL-SRa296/hCNの構
築 上記１．で調整したpBluescript SK- hCNを制限酵素Eco
RI および Kpn I（ベーリンガーマンハイム社製）で消
化し、約1300bpのヒトカルポニンcDNA断片を0.8%アガロ
−スゲル電気泳動により分離し、プレップ−A−ジ−ン
DNA精製キット（カタログ番号732-6010,バイオラッド社
製）を用いて精製した。このDNA断片を、同じ制限酵素
で処理したプラスミドpcDL-SRα296(Takebe, Y. et al.
Molecular and Cellular Biology 1988 ; 8 466 -472)
とT4 DNAリガ−ゼを用いてライゲ−トした。この反応液
を用いてE.coli DH5α株を形質転換し、形質転換株培養
液よりプラスミドを精製して、制限酵素EcoRI および K
pn Iで処理したところ、この消化によってヒトカルポニ
ンcDNA約1300bpを含む断片と、pcDL-SRα296プラスミド
の断片を生じることから、目的のプラスミドであること
が確認された。図１にヒトカルポニンcDNAを含む組換え
ベクターpcDL-SRα296/hCNの制限酵素地図を示す。組換
えベクターpcDL-SRα296/hCNの大きさは約4.7kbであ
る。
築 上記１．で調整したpBluescript SK- hCNを制限酵素Eco
RI および Kpn I（ベーリンガーマンハイム社製）で消
化し、約1300bpのヒトカルポニンcDNA断片を0.8%アガロ
−スゲル電気泳動により分離し、プレップ−A−ジ−ン
DNA精製キット（カタログ番号732-6010,バイオラッド社
製）を用いて精製した。このDNA断片を、同じ制限酵素
で処理したプラスミドpcDL-SRα296(Takebe, Y. et al.
Molecular and Cellular Biology 1988 ; 8 466 -472)
とT4 DNAリガ−ゼを用いてライゲ−トした。この反応液
を用いてE.coli DH5α株を形質転換し、形質転換株培養
液よりプラスミドを精製して、制限酵素EcoRI および K
pn Iで処理したところ、この消化によってヒトカルポニ
ンcDNA約1300bpを含む断片と、pcDL-SRα296プラスミド
の断片を生じることから、目的のプラスミドであること
が確認された。図１にヒトカルポニンcDNAを含む組換え
ベクターpcDL-SRα296/hCNの制限酵素地図を示す。組換
えベクターpcDL-SRα296/hCNの大きさは約4.7kbであ
る。
【００２１】３．B16メラノーマ細胞へのカルポニン遺
伝子のトランスフェクション 上記２で得られた組換えベクターを、リポフェクション
法により、マウスB16メラノーマ細胞の低転移株B16G6
(Tanaka H. et al. Cancer Research 1988; 48: 1456-
1459)に導入した。上記２．で構築した発現ベクターpcD
L-SRα296/hCN 30μｇとpSV-neo 耐性プラスミド３μｇ
をHepes 緩衝生理食塩水250μlに溶解した。これとは別
に、N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N
- トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(DOTAP)
(ベーリンガーマンハイム社製)(1 mg/ml) 70 μl をHep
es緩衝生理食塩水で希釈し250 μl とした。これら両溶
液500μl を混合し室温で20分以上インキュベートする
ことにより、pcDL-SRα296/hCNAをリポソーム中に封入
した粒子を得た。さらに10％血清を含むDMEM培地14mlを
加えて混合した後、B16 メラノーマ細胞の培養容器に加
え、37℃で18時間培養を行った。10％血清を含むDMEM培
地を加え、さらに48時間培養を継続した。継代(1:40)し
た後、カルポニン遺伝子を組み込んだマウスB16G6 メラ
ノーマのサブクローンをゲネテシン500μg/mlを培地に
加え選択した。
伝子のトランスフェクション 上記２で得られた組換えベクターを、リポフェクション
法により、マウスB16メラノーマ細胞の低転移株B16G6
(Tanaka H. et al. Cancer Research 1988; 48: 1456-
1459)に導入した。上記２．で構築した発現ベクターpcD
L-SRα296/hCN 30μｇとpSV-neo 耐性プラスミド３μｇ
をHepes 緩衝生理食塩水250μlに溶解した。これとは別
に、N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N
- トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(DOTAP)
(ベーリンガーマンハイム社製)(1 mg/ml) 70 μl をHep
es緩衝生理食塩水で希釈し250 μl とした。これら両溶
液500μl を混合し室温で20分以上インキュベートする
ことにより、pcDL-SRα296/hCNAをリポソーム中に封入
した粒子を得た。さらに10％血清を含むDMEM培地14mlを
加えて混合した後、B16 メラノーマ細胞の培養容器に加
え、37℃で18時間培養を行った。10％血清を含むDMEM培
地を加え、さらに48時間培養を継続した。継代(1:40)し
た後、カルポニン遺伝子を組み込んだマウスB16G6 メラ
ノーマのサブクローンをゲネテシン500μg/mlを培地に
加え選択した。
【００２２】４．トランスフェクションした細胞の造腫
瘍性 上記３でトランスフェクションしたB16G6のいくつかの
サブクローンのうちヒトカルポニン遺伝子産物を高発現
したサブクローンhCN:8-3とhCN:2-1の1x106個をC57BLマ
ウスの皮下に移植し、経日的（16日後、22日後、28日あ
るいは29日後）に腫瘍の生着と腫瘍経の大きさを測定し
た。対照として、トランスフェクトしていないB16G6細
胞を移植した。その結果を図３の写真に示す。この結果
を数値化し、まとめたものを表１に示す。対照群では16
日目で既に全例のマウスで腫瘍の生着が認められるのに
対し、8-3クローン移植群では全く腫瘍の生着を認め
ず、2-1クローン移植群では６匹中１匹に腫瘍の生着を
認めただけであった。28日あるいは29日後でも8-3クロ
ーン移植群は５匹中２匹に、2-1クローン移植群では６
匹中３匹に腫瘍の生着を認めただけであった。さらには
腫瘍の大きさも対照群に比較してこれら二つのクローン
移植群では有意に低下していた。
瘍性 上記３でトランスフェクションしたB16G6のいくつかの
サブクローンのうちヒトカルポニン遺伝子産物を高発現
したサブクローンhCN:8-3とhCN:2-1の1x106個をC57BLマ
ウスの皮下に移植し、経日的（16日後、22日後、28日あ
るいは29日後）に腫瘍の生着と腫瘍経の大きさを測定し
た。対照として、トランスフェクトしていないB16G6細
胞を移植した。その結果を図３の写真に示す。この結果
を数値化し、まとめたものを表１に示す。対照群では16
日目で既に全例のマウスで腫瘍の生着が認められるのに
対し、8-3クローン移植群では全く腫瘍の生着を認め
ず、2-1クローン移植群では６匹中１匹に腫瘍の生着を
認めただけであった。28日あるいは29日後でも8-3クロ
ーン移植群は５匹中２匹に、2-1クローン移植群では６
匹中３匹に腫瘍の生着を認めただけであった。さらには
腫瘍の大きさも対照群に比較してこれら二つのクローン
移植群では有意に低下していた。
【００２３】
【表１】 表１ トランスフェクションした細胞の造腫瘍性 群 生着率：腫瘍体積(cm3) 16日 22 日 28/29日 対照群 5/5:0.43±0.21 5/5:1.12±0.37 5/5:4.00±1.28 hCN:8-3 移植群 0/5:(-) 1/5: 0.01 2/5:1.45±1.19 hCN:2-1 移植群 1/6:0.08 2/6:0.43±0.37 3/6:2.27±1.11
【００２４】５．トランスフェクションした細胞の転移
能 試験例１ 上記３でトランスフェクションしたB16G6のいくつかの
サブクローンのうちヒトカルポニン遺伝子産物を高発現
したサブクローンhCN:8-3とhCN:2-1の1x106個をC57BLマ
ウスの尾静脈内に移植した。対照として、トランスフェ
クトしていないB16G6を同じ細胞数でC57BLマウスの尾静
脈内に移植した。21日間飼育した後、開胸して肺を摘出
し、肺表面に形成されたB16G6の結節を計測し、対照群
と比較した。その結果を図４の写真に示す。この結果を
数値化し、まとめたものを表２に示す。対照群では転移
形成が認められたが、8-3、2-1両クローン移植群では有
意な転移結節数の低下を認めた。
能 試験例１ 上記３でトランスフェクションしたB16G6のいくつかの
サブクローンのうちヒトカルポニン遺伝子産物を高発現
したサブクローンhCN:8-3とhCN:2-1の1x106個をC57BLマ
ウスの尾静脈内に移植した。対照として、トランスフェ
クトしていないB16G6を同じ細胞数でC57BLマウスの尾静
脈内に移植した。21日間飼育した後、開胸して肺を摘出
し、肺表面に形成されたB16G6の結節を計測し、対照群
と比較した。その結果を図４の写真に示す。この結果を
数値化し、まとめたものを表２に示す。対照群では転移
形成が認められたが、8-3、2-1両クローン移植群では有
意な転移結節数の低下を認めた。
【００２５】
【表２】 表２ トランスフェクションした細胞の転移能 肺転移結節 群 総数 平均 群数 対照群 568 71±20 8 hCN:8-3 移植群 29 3.6±1.1 8 p=0.012 hCN:2-1 移植群 10 1.3±0.5 8 p=0.010
【００２６】試験例２ 上記３でトランスフェクションしたB16G6のいくつかの
サブクローンのうちヒトカルポニン遺伝子産物を高発現
したサブクローンhCN:8-3の1x106個をC57BLマウスの尾
静脈内に移植した。対照として、ヒトカルポニン遺伝子
を含まない発現ベクターpcDL-SRα296 をトランスフェ
クトしたB16G6を同じ細胞数でC57BLマウスの尾静脈内に
移植した。21日間飼育した後、開胸して肺を摘出し、肺
表面に形成されたB16G6の結節を計測し、対照群と比較
した。その結果を表３に示す。対照群では転移形成が認
められたが、8-3クローン移植群では有意な転移結節数
の低下を認めた。
サブクローンのうちヒトカルポニン遺伝子産物を高発現
したサブクローンhCN:8-3の1x106個をC57BLマウスの尾
静脈内に移植した。対照として、ヒトカルポニン遺伝子
を含まない発現ベクターpcDL-SRα296 をトランスフェ
クトしたB16G6を同じ細胞数でC57BLマウスの尾静脈内に
移植した。21日間飼育した後、開胸して肺を摘出し、肺
表面に形成されたB16G6の結節を計測し、対照群と比較
した。その結果を表３に示す。対照群では転移形成が認
められたが、8-3クローン移植群では有意な転移結節数
の低下を認めた。
【００２７】
【表３】 表３ トランスフェクションした細胞の転移能 肺転移結節 群 総数 平均 群数 対照群 148 18.5±7.7 8 hCN:8-3 移植群 6 0.7±0.4 8 p<0.001
【００２８】Ｂ．カルポニン遺伝子を静脈内投与した場
合の転移抑制効果の確認試験 １．ヒトカルポニンcDNAのクロ−ニング 上記のビトロ試験Ａの１と同様にして、ヒトカルポニン
ｃＤＮＡをクローニングし、pBluescript SK-hCNを得
た。
合の転移抑制効果の確認試験 １．ヒトカルポニンcDNAのクロ−ニング 上記のビトロ試験Ａの１と同様にして、ヒトカルポニン
ｃＤＮＡをクローニングし、pBluescript SK-hCNを得
た。
【００２９】２．組換えベクターpCAGGS/hCNの構築 上記１．で調整したpBluescript SK- hCNのヒトカルポ
ニンcDNA5'側にXho I制限酵素部位を挿入するために、
このプラスミドを制限酵素Sam I（ベーリンガーマンハ
イム社製）で直線化し、アニーリングしたXho Iリンカ
ー（ベーリンガーマンハイム社製）とT4 DNA リガーゼ
（宝酒造社製）を用いてライゲートした。この遺伝子を
導入し発現させるために用いたベクタ−の構築は下記の
ようにしておこなった。この反応液を用いてE.coli DH5
α株（ライフテクノロジー社より入手）を形質転換し、
形質転換株培養液よりプラスミドを精製して、制限酵素
Xho Iで処理したところ、Xho I消化によってヒトカルポ
ニンcDNA 1522bpを含む断片と、pBluescript SK-プラス
ミドの断片を生じることから、目的のプラスミドである
ことが確認された。
ニンcDNA5'側にXho I制限酵素部位を挿入するために、
このプラスミドを制限酵素Sam I（ベーリンガーマンハ
イム社製）で直線化し、アニーリングしたXho Iリンカ
ー（ベーリンガーマンハイム社製）とT4 DNA リガーゼ
（宝酒造社製）を用いてライゲートした。この遺伝子を
導入し発現させるために用いたベクタ−の構築は下記の
ようにしておこなった。この反応液を用いてE.coli DH5
α株（ライフテクノロジー社より入手）を形質転換し、
形質転換株培養液よりプラスミドを精製して、制限酵素
Xho Iで処理したところ、Xho I消化によってヒトカルポ
ニンcDNA 1522bpを含む断片と、pBluescript SK-プラス
ミドの断片を生じることから、目的のプラスミドである
ことが確認された。
【００３０】次に、このプラスミドを制限酵素XhoIで処
理し、0.8%アガロ−スゲル電気泳動により配列番号1に
示されたヒトカルポニンcDNA1522bpを含む断片を分離
し、プレップ−A−ジ−ン DNA精製キット（カタログ番
号732-6010,バイオラッド社製）を用いて精製した。こ
のDNA断片を、制限酵素Xho Iで処理したプラスミドpCAG
GS(Niwa, H. et al. Gene 1991 ; 108 : 193 - 200)と
T4 DNAリガ−ゼを用いてライゲ−トした。この反応液を
用いてE.coli DH5α株を形質転換し、形質転換株培養液
よりプラスミドを精製して、ヒトカルポニンcDNAの挿入
及びプロモーターに対するヒトカルポニンcDNAの方向性
を確認するために、制限酵素Xho I及びPst I（ベ−リン
ガ−マンハイム社製）で処理したところ、Xho I消化に
よってヒトカルポニンcDNA 1522bpを含む断片、及びPst
I消化によりヒトカルポニンcDNA 3'側とラビットb-グ
ロビン3'隣接領域を含む約1270bpの断片を生じることか
ら、ヒトカルポニン発現のための組換えベクターである
プラスミドpCAGGS/hCNであることが確認された。プラス
ミドpCAGGS/hCNを組み込んだ大腸菌DH5αをEscherichia
coli DH5α(pCAGGS/hCN)と命名して、工業技術院生命工
学工業技術研究所に平成６年８月31日に寄託した（受託
番号：FERM BP-4789）。
理し、0.8%アガロ−スゲル電気泳動により配列番号1に
示されたヒトカルポニンcDNA1522bpを含む断片を分離
し、プレップ−A−ジ−ン DNA精製キット（カタログ番
号732-6010,バイオラッド社製）を用いて精製した。こ
のDNA断片を、制限酵素Xho Iで処理したプラスミドpCAG
GS(Niwa, H. et al. Gene 1991 ; 108 : 193 - 200)と
T4 DNAリガ−ゼを用いてライゲ−トした。この反応液を
用いてE.coli DH5α株を形質転換し、形質転換株培養液
よりプラスミドを精製して、ヒトカルポニンcDNAの挿入
及びプロモーターに対するヒトカルポニンcDNAの方向性
を確認するために、制限酵素Xho I及びPst I（ベ−リン
ガ−マンハイム社製）で処理したところ、Xho I消化に
よってヒトカルポニンcDNA 1522bpを含む断片、及びPst
I消化によりヒトカルポニンcDNA 3'側とラビットb-グ
ロビン3'隣接領域を含む約1270bpの断片を生じることか
ら、ヒトカルポニン発現のための組換えベクターである
プラスミドpCAGGS/hCNであることが確認された。プラス
ミドpCAGGS/hCNを組み込んだ大腸菌DH5αをEscherichia
coli DH5α(pCAGGS/hCN)と命名して、工業技術院生命工
学工業技術研究所に平成６年８月31日に寄託した（受託
番号：FERM BP-4789）。
【００３１】図２にヒトカルポニンcDNAを含む組換えベ
クターpCAGGS/hCNの制限酵素地図を示す。組換えベクタ
ーpCAGGS/hCNの大きさは約6.5kbである。
クターpCAGGS/hCNの制限酵素地図を示す。組換えベクタ
ーpCAGGS/hCNの大きさは約6.5kbである。
【００３２】３．カルポニン遺伝子による遺伝子治療剤
の調製 上記２．で構築した発現ベクタ−を効率よく個体内に導
入するために、発現ベクタ−のリポソ−ムによる被覆を
おこなったが、その調製方法は下記のとおりであった。
の調製 上記２．で構築した発現ベクタ−を効率よく個体内に導
入するために、発現ベクタ−のリポソ−ムによる被覆を
おこなったが、その調製方法は下記のとおりであった。
【００３３】上記２．で構築した発現ベクタ−pCAGGS/h
CN 100μgをHepes緩衝生理食塩水100μlに溶解した。こ
の溶液とN-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-
N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DO
TAP)（ベ−リンガ−マンハイム社製）(1mg/ml) 200μl
を混合し室温で20分以上インキュベ−することにより、
pCAGGS/hCNをリポソ−ム中に封入した粒子を得た。ま
た、対照実験のために、上記２．で構築した組換えベク
タ−pCAGGS/hCN の代わりにプラスミドpCAGGSを用い
て、上記の操作を繰り返すことにより、プラスミドpCAG
GSをリポソ−ム中に封入した粒子を得た。
CN 100μgをHepes緩衝生理食塩水100μlに溶解した。こ
の溶液とN-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-
N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DO
TAP)（ベ−リンガ−マンハイム社製）(1mg/ml) 200μl
を混合し室温で20分以上インキュベ−することにより、
pCAGGS/hCNをリポソ−ム中に封入した粒子を得た。ま
た、対照実験のために、上記２．で構築した組換えベク
タ−pCAGGS/hCN の代わりにプラスミドpCAGGSを用い
て、上記の操作を繰り返すことにより、プラスミドpCAG
GSをリポソ−ム中に封入した粒子を得た。
【００３４】４．カルポニン遺伝子による癌転移抑制効
果 試験例１ マウスの腫瘍であるB16メラノーマより選択されたB16高
転移株B16G10 (Tanakaet al.Cancer Reserch 48 1456-
1459, 1998)を使用した。癌転移抑制作用の評価はFidle
rらの方法に従って行った（Poste, G and Fidler, I.
J., Nature 1980; 283; 1329-145) 。C57BLマウス（8〜
12週令、メス）に組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソ
ーム中に封入した粒子、または、組換えベクタ−pCAGGS
/hCN のみを300μl尾静脈より投与した。対照として、
リポソーム化試薬であるN-［1-(2,3- ジオレオイロキ
シ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチル
サルフェ−ト(DOTAP)を投与した。一週間飼育を行った
後、フラスコ内で増殖させたB16G10 をトリプシン・EDT
A溶液で培養容器よりはがし、この細胞をPBS溶液で生細
胞として1mlあたり1x106個となるように懸濁した。この
細胞液の0.1mlをマウス尾静脈より移植し、さらに21日
間飼育した後、開胸して肺を摘出し、肺表面に形成され
たB16G10の結節を計測し、対照群と比較した。その結果
を図５および表４に示す。組換えベクタ−pCAGGS/hCN
をリポソーム中に封入した粒子を投与した群では著明な
転移結節数の減少が認められ、ヒトカルポニンcDNAを含
む組換えベクターpCAGGS/hCN は肺への癌転移を抑制し
ていることが確認できた。
果 試験例１ マウスの腫瘍であるB16メラノーマより選択されたB16高
転移株B16G10 (Tanakaet al.Cancer Reserch 48 1456-
1459, 1998)を使用した。癌転移抑制作用の評価はFidle
rらの方法に従って行った（Poste, G and Fidler, I.
J., Nature 1980; 283; 1329-145) 。C57BLマウス（8〜
12週令、メス）に組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソ
ーム中に封入した粒子、または、組換えベクタ−pCAGGS
/hCN のみを300μl尾静脈より投与した。対照として、
リポソーム化試薬であるN-［1-(2,3- ジオレオイロキ
シ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチル
サルフェ−ト(DOTAP)を投与した。一週間飼育を行った
後、フラスコ内で増殖させたB16G10 をトリプシン・EDT
A溶液で培養容器よりはがし、この細胞をPBS溶液で生細
胞として1mlあたり1x106個となるように懸濁した。この
細胞液の0.1mlをマウス尾静脈より移植し、さらに21日
間飼育した後、開胸して肺を摘出し、肺表面に形成され
たB16G10の結節を計測し、対照群と比較した。その結果
を図５および表４に示す。組換えベクタ−pCAGGS/hCN
をリポソーム中に封入した粒子を投与した群では著明な
転移結節数の減少が認められ、ヒトカルポニンcDNAを含
む組換えベクターpCAGGS/hCN は肺への癌転移を抑制し
ていることが確認できた。
【００３５】
【表４】 表４ カルポニン遺伝子による癌転移抑制効果 肺転移結節 薬剤 総数 平均 群数 DOTAP 1237 412 ± 57 3 pCAGGS/hCN 453 113 ± 23 4 pCAGGS/hCN+DOTAP 6 2.7 ± 0.3 3
【００３６】試験例２ C57BLマウス（8〜12週令、メス）に組換えベクタ−pCAG
GS/hCN をリポソーム中に封入した粒子を300μl尾静脈
より投与した。対照として、リポソーム化試薬であるN-
［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリ
メチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)を同量
投与した。一週間飼育を行った後、フラスコ内で増殖さ
せたB16G10 をトリプシン・EDTA溶液で培養容器よりは
がし、この細胞をPBS溶液で生細胞として1mlあたり1x10
6個となるように懸濁した。この細胞液の0.1mlをマウス
尾静脈より移植し、さらに21日間飼育した後、開胸して
肺を摘出し、肺表面に形成されたB16G10の結節を計測
し、対照群と比較した。その結果を表５に示す。組換え
ベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子を
投与した群では著明な転移結節数の減少が認められ、ヒ
トカルポニンcDNAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN は
肺への癌転移を抑制していることが確認できた。
GS/hCN をリポソーム中に封入した粒子を300μl尾静脈
より投与した。対照として、リポソーム化試薬であるN-
［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリ
メチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)を同量
投与した。一週間飼育を行った後、フラスコ内で増殖さ
せたB16G10 をトリプシン・EDTA溶液で培養容器よりは
がし、この細胞をPBS溶液で生細胞として1mlあたり1x10
6個となるように懸濁した。この細胞液の0.1mlをマウス
尾静脈より移植し、さらに21日間飼育した後、開胸して
肺を摘出し、肺表面に形成されたB16G10の結節を計測
し、対照群と比較した。その結果を表５に示す。組換え
ベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子を
投与した群では著明な転移結節数の減少が認められ、ヒ
トカルポニンcDNAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN は
肺への癌転移を抑制していることが確認できた。
【００３７】
【表５】
【００３８】試験例３ マウスの肝細胞癌であるG5F5を用いてヒトカルポニンcD
NAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN の転移抑制効果を
検討した。癌転移抑制作用の評価はFidlerらの方法に従
って行った。C57BLマウス（8〜12週令、メス）に組換え
ベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子、
または、組換えベクタ−pCAGGS/hCN のみを300μl尾静
脈より投与した。対照として、リポソーム化試薬である
N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- ト
リメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)を同
量投与した。三日間飼育を行った後、フラスコ内で増殖
させたG5F5をトリプシン・EDTA溶液で培養容器よりはが
し、この細胞をPBS溶液で生細胞として1mlあたり2x107
個となるように懸濁した。この細胞液の0.1mlをマウス
尾静脈より移植した。腫瘍細胞移植一週間後、二週間後
にさらに、組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中
に封入した粒子、または、組換えベクタ−pCAGGS/hCN
のみを300μl尾静脈より投与した。対照として、リポソ
ーム化試薬であるN-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロ
ピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ
−ト(DOTAP)を同量投与した。さらに一週間飼育した
後、開胸して肺を摘出し、肺表面に形成されたG5F5の結
節を計測し、対照群と比較した。組換えベクタ−pCAGGS
/hCN をリポソーム中に封入した粒子を投与した群では
著明な転移結節数の減少が認められ、ヒトカルポニンcD
NAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN は肺への癌転移を
抑制していることが確認できた。
NAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN の転移抑制効果を
検討した。癌転移抑制作用の評価はFidlerらの方法に従
って行った。C57BLマウス（8〜12週令、メス）に組換え
ベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子、
または、組換えベクタ−pCAGGS/hCN のみを300μl尾静
脈より投与した。対照として、リポソーム化試薬である
N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- ト
リメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)を同
量投与した。三日間飼育を行った後、フラスコ内で増殖
させたG5F5をトリプシン・EDTA溶液で培養容器よりはが
し、この細胞をPBS溶液で生細胞として1mlあたり2x107
個となるように懸濁した。この細胞液の0.1mlをマウス
尾静脈より移植した。腫瘍細胞移植一週間後、二週間後
にさらに、組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中
に封入した粒子、または、組換えベクタ−pCAGGS/hCN
のみを300μl尾静脈より投与した。対照として、リポソ
ーム化試薬であるN-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロ
ピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ
−ト(DOTAP)を同量投与した。さらに一週間飼育した
後、開胸して肺を摘出し、肺表面に形成されたG5F5の結
節を計測し、対照群と比較した。組換えベクタ−pCAGGS
/hCN をリポソーム中に封入した粒子を投与した群では
著明な転移結節数の減少が認められ、ヒトカルポニンcD
NAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN は肺への癌転移を
抑制していることが確認できた。
【００３９】
【発明の効果】本発明の抗癌剤により、癌細胞の造腫瘍
性を低下させ、転移能を減弱させることができる。従っ
て、本発明の抗癌剤は、癌の治療および予防、特に癌転
移の抑制に極めて有効である。
性を低下させ、転移能を減弱させることができる。従っ
て、本発明の抗癌剤は、癌の治療および予防、特に癌転
移の抑制に極めて有効である。
【００４０】
【００４１】配列番号：１ 配列の長さ：1522 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 配列 AACATGTGAG GAGGGAAGAG TGTGCAGACG GAACTTCAGC CGCTGCCTCT GTTCTCAGCG 60 TCAGTGCCGC CACTGCCCCC GCCAGAGCCC ACCGGCCAGC ATG TCC TCT GCT CAC 115 Met Ser Ser Ala His 5 TTC AAC CGA GGC CCT GCC TAC GGG CTG TCA GCC GAG GTT AAG AAC AAG 163 Phe Asn Arg Gly Pro Ala Tyr Gly Luu Ser Ala Glu Val Lys Asn Lys 10 15 20 CTG GCC CAG AAG TAT GAC CAC CAG CGG GAG CAG GAG CTG AGA GAG TGG 211 Leu Ala Gln Lys Tyr Asp His Gln Arg Glu Gln Glu Leu Arg Glu Trp 25 30 35 ATC GAG GGG GTG ACA GGC CGT CGC ATC GGC AAC AAC TTC ATG GAC GGC 259 Ile Glu Gly Val Thr Gly Arg Arg Ile Gly Asn Asn Phe Met Asp Gly 40 45 50 CTC AAA GAT GGC ATC ATT CTT TGC GAA TTC ATC AAT AAG CTG CAG CCA 307 Leu Lys Asp Gly Ile Ile Leu Cys Glu Phe Ile Asn Lys Leu Gln Pro 55 60 65 GGC TCC GTG AAG AAG ATC AAT GAG TCA ACC CAA AAT TGG CAC CAG CTG 355 Gly Ser Val Lys Lys Ile Asn Glu Ser Thr Gln Asn Trp His Gln Leu 70 75 80 85 GAG AAC ATC GGC AAC TTC ATC AAG GCC ATC ACC AAG TAT GGG GTG AAG 403 Glu Asn Ile Gly Asn Phe Ile Lys Ala Ile Thr Lys Tyr Gly Val Lys 90 95 100 CCC CAC GAC ATT TTT GAG GCC AAC GAC CTG TTT GAG AAC ACC AAC CAT 451 Pro His Asp Ile Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe Glu Asn Thr asn His 105 110 115 ACA CAG GTG CAG TCC ACC CTC CTG GCT TTG GCC AGC ATG GCG AAG ACG 499 Thr Gln Val Gln Ser Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ser Met Ala Lys Thr 120 125 130 AAA GGA AAC AAG GTG AAC GTG GGA GTG AAG TAC GCA GAG AAG CAG GAG 547 Lys Gly Asn Lys Val Asn Val Gly Val Lys Tyr Ala Glu Lys Gln Glu 135 140 145 CGG AAA TTC GAG CCG GGG AAG CTA AGA GAA GGG CGG AAC ATC ATT GGG 595 Arg Lys Phe Glu Pro Gly Lys Leu Arg Glu Gly Arg Asn Ile Ile Gly 150 155 160 165 CTG CAG ATG GGC ACC AAC AAG TTT GCC AGC CAG CAG GGC ATG ACG GCC 643 Leu Gln Met Gly Thr Asn Lys Phe Ala Ser Gln Gln Gly Met Thr Ala 170 175 180 TAT GGC ACC CGG CGC CAC CTC TAC GAC CCC AAG CTG GGC ACA GAC CAG 691 Tyr Gly Thr Arg Arg His Leu Tyr Asp Pro Lys Leu Gly Thr Asp Gln 185 190 195 CCT CTG GAC CAG GCG ACC ATC AGC CTG CAG ATG GGC ACC AAC AAA GGA 739 Pro Leu Asp Gln Ala Thr Ile Ser Leu Gln Met Gly Thr Asn Lys Gly 200 205 210 GCC AGC CAG GCT GGC ATG ACT GCG CCA GGG ACC AAG CGG CAG ATC TTC 787 Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Ala Pro Gly Thr Lys Arg Gln Ile Phe 215 220 225 GAG CCG GGG CTG GGC ATG GAG CAC TGC GAC ACG CTC AAT GTC AGC CTG 835 Glu Pro Gly Leu Gly Met Glu His Cys Asp Thr Leu Asn Val Ser Leu 230 235 240 245 CAG ATG GGC AGC AAC AAG GGC GCC TCG CAG CGG GGC ATG ACG GTG TAT 883 Gln Met Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ser Gln Arg Gly Met Thr Val Tyr 250 255 260 GGG CTG CCA CGC CAG GTC TAC GAC CCC AAG TAC TGT CTG ACT CCC GAG 931 Gly Leu Pro Arg Gln Val Tyr Asp Pro Lys Tyr Cys Leu Thr Pro Glu 265 270 275 TAC CCA GAG CTG GGT GAG CCC GCC CAC AAC CAC CAC GCA CAC AAC TAC 979 Tyr Pro Glu Leu Gly Glu Pro Ala His Asp His His Ala His Asn Tyr 280 285 290 TAC AAT TCC GCC TAGGGCCACA AGGCCTTCCC TGTTTTCCCC CCAAGGGAGG 1031 Tyr Asn Ser Ala 295 CTGCTGCTGC TCTTGGCTGG ACCCAGCCAG GCCCAGCCGA CCCCCTCTCC CTGCATGGCA 1091 TCCTCCAGCC CCTGTAGAAC TCAACCTCTA CAGGGTTAGA GTTTGGAGAG AGCAGACTGG 1151 CGGGGGGCCC ATTGGGGGGA AGGGGACCCT CCGCTCTGTA GTGCTACAGG GTCCAACATA 1211 GAGCCGGGTG TCCCCAACAG CGCCCAAAGG ACGCACTGAG CAACGCTATT CCAGCTGTCC 1271 CCCCACTCCC TCACAAGTGG GTACCCCCAG GACCAGAAGC TCCCCCAGCA AAGCCCCCAG 1331 AGCCCAGGCT CGGCCTGCCC CCACCCCATT CCCGCAGTGG GAGCAAACTG CATGCCCAGA 1391 GACCCAGCGG ACACACGCGG TTTGGTTTGC AGCGACTGGC ATACTATGTG GATGTGACAG 1451 TGGCGTTTGT AATGAGAGCA CTTTCTTTTT TTTCTATTTC ACTGGAGCAC AATAAATGGC 1511 TGTAAAATCT C 1522
【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：297 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 Met Ser Ser Ala His Phe Asn Arg Gly Pro Ala Tyr Gly Leu Ser 5 10 15 Ala Glu Val Lys Asn Lys Leu Ala Gln Lys Tyr Asp His Gln Arg 20 25 30 Glu Gln Glu Leu Arg Glu Trp Ile Glu Gly Val Thr Gly Arg Arg 35 40 45 Ile Gly Asn Asn Phe Met Asp Gly Leu Lys Asp Gly Ile Ile Leu 50 55 60 Cys Glu Phe Ile Asn Lys Leu Gln Pro Gly Ser Val Lys Lys Ile 65 70 75 Asn Glu Ser Thr Gln Asn Trp His Gln Leu Glu Asn Ile Gly Asn 80 85 90 Phe Ile Lys Ala Ile Thr Lys Tyr Gly Val Lys Pro His Asp Ile 95 100 105 Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe Glu Asn Thr asn His Thr Gln Val 110 115 120 Gln Ser Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ser Met Ala Lys Thr Lys Gly 125 130 135 Asn Lys Val Asn Val Gly Val Lys Tyr Ala Glu Lys Gln Glu Arg 140 145 150 Lys Phe Glu Pro Gly Lys Leu Arg Glu Gly Arg Asn Ile Ile Gly 155 160 165 Leu Gln Met Gly Thr Asn Lys Phe Ala Ser Gln Gln Gly Met Thr 170 175 180 Ala Tyr Gly Thr Arg Arg His Leu Tyr Asp Pro Lys Leu Gly Thr 185 190 195 Asp Gln Pro Leu Asp Gln Ala Thr Ile Ser Leu Gln Met Gly Thr 200 205 210 Asn Lys Gly Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Ala Pro Gly Thr Lys 215 220 225 Arg Gln Ile Phe Glu Pro Gly Leu Gly Met Glu His Cys Asp Thr 230 235 240 Leu Asn Val Ser Leu Gln Met Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ser Gln 245 250 255 Arg Gly Met Thr Val Tyr Gly Leu Pro Arg Gln Val Tyr Asp Pro 260 265 270 Lys Tyr Cys Leu Thr Pro Glu Tyr Pro Glu Leu Gly Glu Pro Ala 275 280 285 His Asp His His Ala His Asn Tyr Tyr Asn Ser Ala 290 295
【図１】図１は、ヒトカルポニンcDNAを組込んだ発現ベ
クタ−であるpcDL-SRα296/hCNのプラスミドの構造を示
す図である。
クタ−であるpcDL-SRα296/hCNのプラスミドの構造を示
す図である。
【図２】図２は、ヒトカルポニンcDNAを組込んだ発現ベ
クタ−であるpCAGGS/hCNのプラスミドの構造を示す図で
ある。
クタ−であるpCAGGS/hCNのプラスミドの構造を示す図で
ある。
【図３】図３は、ヒトカルポニン遺伝子を導入すること
により形質転換したB16メラノーマ細胞の造腫瘍性を示
す生物の形態の写真である。
により形質転換したB16メラノーマ細胞の造腫瘍性を示
す生物の形態の写真である。
【図４】図４は、ヒトカルポニン遺伝子を導入すること
により形質転換したB16メラノーマ細胞の転移能を示す
生物の形態の写真である。
により形質転換したB16メラノーマ細胞の転移能を示す
生物の形態の写真である。
【図５】図５は、B16 メラノーマ細胞の実験的転移に対
するヒトカルポニン遺伝子による遺伝子治療の結果を示
す生物の形態の写真である。
するヒトカルポニン遺伝子による遺伝子治療の結果を示
す生物の形態の写真である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Claims (13)
- 【請求項１】 カルポニン遺伝子を有効成分として含む
抗癌剤。 - 【請求項２】 癌の治療に用いる、請求項１記載の抗癌
剤。 - 【請求項３】 癌転移の抑制に用いる、請求項１記載の
抗癌剤。 - 【請求項４】 カルポニン遺伝子が配列番号２のアミノ
酸配列をコードする塩基配列を含むものである、請求項
１記載の抗癌剤。 - 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸配列をコードする
塩基配列が配列番号１の塩基配列である、請求項４記載
の抗癌剤。 - 【請求項６】 カルポニン遺伝子が合成または天然由来
の膜の中に封入されたものである、請求項１〜５のいず
れかに記載の抗癌剤。 - 【請求項７】 カルポニン遺伝子がリポソームの中に封
入されたものである、請求項６記載の抗癌剤。 - 【請求項８】 カルポニン遺伝子が、腫瘍細胞内および
／または正常細胞内で該遺伝子を発現することができる
組換えベクターに含まれたものである、請求項１〜５の
いずれかに記載の抗癌剤。 - 【請求項９】 組換えベクターがプロモーターを含むも
のである、請求項８記載の抗癌剤。 - 【請求項１０】 プロモーターがアクチンプロモーター
である請求項９記載の抗癌剤。 - 【請求項１１】 組換えベクターが約6.5kbの大きさを
有し、サイトメガロウィルスのエンハンサー、チキンβ
−アクチンプロモーター、ラビットβ−グロビン3' 隣
接領域、SV40複製オリジン、およびヒトカルポニン遺伝
子を含み、下記の制限酵素地図で表される組換えベクタ
ーpCAGGC/hCNである、請求項10記載の抗癌剤。 【化１】 - 【請求項１２】 カルポニン遺伝子を含み組換えベクタ
ーが合成または天然由来の膜の中に封入されたものであ
る、請求項８〜11のいずれかに記載の抗癌剤。 - 【請求項１３】 ヒトカルポニン遺伝子を含む組換えベ
クターがリポソームの中に封入されたものである、請求
項12記載の抗癌剤。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP23249894A JP3713290B2 (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | 抗癌剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23249894A JP3713290B2 (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | 抗癌剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0873380A true JPH0873380A (ja) | 1996-03-19 |
| JP3713290B2 JP3713290B2 (ja) | 2005-11-09 |
Family
ID=16940274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23249894A Expired - Fee Related JP3713290B2 (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | 抗癌剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3713290B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
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| CN101528158B (zh) | 2006-08-21 | 2011-10-05 | 21世纪国际新技术株式会社 | 骨模型、骨填充材以及骨填充材的制造方法 |
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-
1994
- 1994-09-02 JP JP23249894A patent/JP3713290B2/ja not_active Expired - Fee Related
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