JPH0875743A - 競合抗体を利用するセルロプラスミンの測定方法 - Google Patents
競合抗体を利用するセルロプラスミンの測定方法Info
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- JPH0875743A JPH0875743A JP24204594A JP24204594A JPH0875743A JP H0875743 A JPH0875743 A JP H0875743A JP 24204594 A JP24204594 A JP 24204594A JP 24204594 A JP24204594 A JP 24204594A JP H0875743 A JPH0875743 A JP H0875743A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 生体成分に対する抗体を利用した、血中セル
ロプラスミンの免疫学的測定方法において、被検試料の
前希釈操作を軽減、あるいは削除させることのできる方
法を提供する。 【構成】 サンドイッチ酵素免疫測定法等のサンドイッ
チ型免疫学的測定方法に基づく生体成分の測定におい
て、生体成分であるセルロプラスミンを捕捉する固相抗
体と被検試料中のセルロプラスミンとの反応時に、固相
抗体と反応性を同じくする遊離抗体をセルロプラスミン
を含む被検試料に添加することにより、固相抗体と遊離
抗体との間で生じるセルロプラスミンに対する競合反応
を利用し、セルロプラスミンが固相抗体側に過剰に結合
する量を制限するものである。
ロプラスミンの免疫学的測定方法において、被検試料の
前希釈操作を軽減、あるいは削除させることのできる方
法を提供する。 【構成】 サンドイッチ酵素免疫測定法等のサンドイッ
チ型免疫学的測定方法に基づく生体成分の測定におい
て、生体成分であるセルロプラスミンを捕捉する固相抗
体と被検試料中のセルロプラスミンとの反応時に、固相
抗体と反応性を同じくする遊離抗体をセルロプラスミン
を含む被検試料に添加することにより、固相抗体と遊離
抗体との間で生じるセルロプラスミンに対する競合反応
を利用し、セルロプラスミンが固相抗体側に過剰に結合
する量を制限するものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体成分に対する抗体
を利用した、生体成分、とりわけセルロプラスミンの測
定方法に関する。さらに詳細には、酵素免疫測定法(以
下、ＥＬＩＳＡと略称することがある)等のサンドイッ
チ型免疫学的測定法に基づく血中セルロプラスミンの測
定において、固相抗体と被検試料中のセルロプラスミン
との反応時に、固相抗体と反応性を同じくする遊離抗体
をセルロプラスミンを含む被検試料に添加することによ
り、固相抗体と遊離抗体との間で生じるセルロプラスミ
ンに対する競合反応を利用し、セルロプラスミンが固相
抗体側に結合する量を制限するものである。これによ
り、従来不可欠の被検試料の前希釈操作を軽減、あるい
は削除させることのできる方法を提供する。従って、本
発明は生体成分、セルロプラスミンの測定に生化学的あ
るいは医学的意義が存在する分野、例えば臨床診断の分
野において利用価値を有する。
を利用した、生体成分、とりわけセルロプラスミンの測
定方法に関する。さらに詳細には、酵素免疫測定法(以
下、ＥＬＩＳＡと略称することがある)等のサンドイッ
チ型免疫学的測定法に基づく血中セルロプラスミンの測
定において、固相抗体と被検試料中のセルロプラスミン
との反応時に、固相抗体と反応性を同じくする遊離抗体
をセルロプラスミンを含む被検試料に添加することによ
り、固相抗体と遊離抗体との間で生じるセルロプラスミ
ンに対する競合反応を利用し、セルロプラスミンが固相
抗体側に結合する量を制限するものである。これによ
り、従来不可欠の被検試料の前希釈操作を軽減、あるい
は削除させることのできる方法を提供する。従って、本
発明は生体成分、セルロプラスミンの測定に生化学的あ
るいは医学的意義が存在する分野、例えば臨床診断の分
野において利用価値を有する。
【０００２】
【従来技術および発明が解決しようとする問題点】セル
ロプラスミンは160,000の分子量を有し、１分子中に８
個の割合で銅を含む青色の血漿タンパク質で、肝臓にお
いてアポセルロプラスミンが合成される際に銅が取り込
まれてオキシダーゼ活性を持ったホロセルロプラスミン
となり、血液中を循環している。銅代謝における役割は
なお不明な点があるが、先天性銅代謝異常症であるウィ
ルソン病の患者血液中において、セルロプラスミン濃度
は著明に低下していることが知られている(Neil A.Holt
zman,et al.,J.clin.Invest.,46,6,(1967))。即ち、血
漿中に存在するセルロプラスミンの量は、一般健常人で
は１７〜３７mg/dlに分布し、ウィルソン病患者ではほ
とんどが５mg/dl以下である。このことから、セルロプ
ラスミンの測定はウィルソン病の診断に広く利用されて
いる。
ロプラスミンは160,000の分子量を有し、１分子中に８
個の割合で銅を含む青色の血漿タンパク質で、肝臓にお
いてアポセルロプラスミンが合成される際に銅が取り込
まれてオキシダーゼ活性を持ったホロセルロプラスミン
となり、血液中を循環している。銅代謝における役割は
なお不明な点があるが、先天性銅代謝異常症であるウィ
ルソン病の患者血液中において、セルロプラスミン濃度
は著明に低下していることが知られている(Neil A.Holt
zman,et al.,J.clin.Invest.,46,6,(1967))。即ち、血
漿中に存在するセルロプラスミンの量は、一般健常人で
は１７〜３７mg/dlに分布し、ウィルソン病患者ではほ
とんどが５mg/dl以下である。このことから、セルロプ
ラスミンの測定はウィルソン病の診断に広く利用されて
いる。
【０００３】ウィルソン病は肝硬変、錐体外路症状およ
びKayser-Fleischer角膜輪を三主徴とする先天性銅代謝
異常症の一つであり、常染色体劣性遺伝型式をとる。本
症の成因は不明な点が多いが、日常摂取された食品銅
が、肝、大脳基底部、角膜あるいは腎といった主要臓器
に過剰蓄積し、各組織の細胞変性や壊死を起こしている
と考えられている(Scheinberg IH,Sternlieb I:Wilson'
s disease.WB SaundersCo.,Philadelphia,1984)。治療
法は、組織に沈着した銅と結合して体外に銅を排泄する
作用を有するペニシラミン、トリエン等の金属キレート
剤の投与および銅制限食である。また、早期に治療を開
始すれば予後は良い。
びKayser-Fleischer角膜輪を三主徴とする先天性銅代謝
異常症の一つであり、常染色体劣性遺伝型式をとる。本
症の成因は不明な点が多いが、日常摂取された食品銅
が、肝、大脳基底部、角膜あるいは腎といった主要臓器
に過剰蓄積し、各組織の細胞変性や壊死を起こしている
と考えられている(Scheinberg IH,Sternlieb I:Wilson'
s disease.WB SaundersCo.,Philadelphia,1984)。治療
法は、組織に沈着した銅と結合して体外に銅を排泄する
作用を有するペニシラミン、トリエン等の金属キレート
剤の投与および銅制限食である。また、早期に治療を開
始すれば予後は良い。
【０００４】セルロプラスミンの測定法としては、血清
中のオキシダーゼ活性測定や、血清銅値の測定よりセル
ロプラスミンの量を換算する方法と、種々の免疫学的測
定法により直接セルロプラスミンの量を測定する方法が
ある。免疫学的測定法としては、通常のポリクローナル
抗体を用いた免疫拡散法、免疫比濁法、ＥＬＩＳＡ法等
がある。ウィルソン病は、治療との関連から早期発見が
重要である。そのため、本願発明者等は乳児を対象に毛
細管血あるいは乾燥濾紙血を用いたＥＬＩＳＡ法による
セルロプラスミン測定のマススクリーニングを検討して
きた。従来の測定法ではポリクローナル抗体を用いてい
るため、非活性型であるアポセルロプラスミンと活性型
であるホロセルロプラスミンを区別することができなか
った。そこで、ウィルソン病を診断する上では、活性型
のホロセルロプラスミンのみを測定することがより病態
を反映するものと考え、ホロセルロプラスミンのみと反
応するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を開発
した(中村公俊他, J Jpn Society for Mass-screening,
vol3,No2,89-90,(1993))。
中のオキシダーゼ活性測定や、血清銅値の測定よりセル
ロプラスミンの量を換算する方法と、種々の免疫学的測
定法により直接セルロプラスミンの量を測定する方法が
ある。免疫学的測定法としては、通常のポリクローナル
抗体を用いた免疫拡散法、免疫比濁法、ＥＬＩＳＡ法等
がある。ウィルソン病は、治療との関連から早期発見が
重要である。そのため、本願発明者等は乳児を対象に毛
細管血あるいは乾燥濾紙血を用いたＥＬＩＳＡ法による
セルロプラスミン測定のマススクリーニングを検討して
きた。従来の測定法ではポリクローナル抗体を用いてい
るため、非活性型であるアポセルロプラスミンと活性型
であるホロセルロプラスミンを区別することができなか
った。そこで、ウィルソン病を診断する上では、活性型
のホロセルロプラスミンのみを測定することがより病態
を反映するものと考え、ホロセルロプラスミンのみと反
応するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を開発
した(中村公俊他, J Jpn Society for Mass-screening,
vol3,No2,89-90,(1993))。
【０００５】しかし、一般にＥＬＩＳＡの測定感度は非
常に高く、セルロプラスミンの測定においても測定可能
域はおよそ１〜５０μg/dlであり高感度である。従っ
て、一般健常人の血漿において１７〜３７mg/dlに分布
するセルロプラスミンを、通常のＥＬＩＳＡ法により血
液を検体として測定する際には、適当な希釈溶液で数千
倍に希釈する必要がある。このような被測定物質が多量
に存在する被検試料の実際の測定においては、数段階に
及ぶ希釈操作を経て被検試料を調製することを余儀なく
される。この被検試料調製操作は、測定者に多大な労力
を課すと共に、希釈率の増大は誤差の増大に結び付くも
のである。従って、この被検試料の希釈操作に付随する
問題は、解決されるべき重要な課題である。
常に高く、セルロプラスミンの測定においても測定可能
域はおよそ１〜５０μg/dlであり高感度である。従っ
て、一般健常人の血漿において１７〜３７mg/dlに分布
するセルロプラスミンを、通常のＥＬＩＳＡ法により血
液を検体として測定する際には、適当な希釈溶液で数千
倍に希釈する必要がある。このような被測定物質が多量
に存在する被検試料の実際の測定においては、数段階に
及ぶ希釈操作を経て被検試料を調製することを余儀なく
される。この被検試料調製操作は、測定者に多大な労力
を課すと共に、希釈率の増大は誤差の増大に結び付くも
のである。従って、この被検試料の希釈操作に付随する
問題は、解決されるべき重要な課題である。
【０００６】
【課題を解決するための手段、発明の構成】本願発明者
等は、上述の問題点に鑑み、競合反応をサンドイッチ免
疫学的測定方法に導入することによる被検試料の希釈操
作を軽減する方法に着眼し、この方法を用いてセルロプ
ラスミンを好適に測定できる方法の提供を課題として検
討した。鋭意研究の結果、ハイブリドーマ法の技術を用
いてセルロプラスミンに対するモノクローナル抗体を調
製し、当該モノクローナル抗体をマイクロプレートに固
定化し、抗原抗体反応時にこの固定化したモノクローナ
ル抗体と反応性を同じくする遊離モノクローナル抗体を
被検試料と共に添加することにより、被検試料中のセル
ロプラスミンに対して固定化抗体と遊離抗体が競合する
免疫学的測定系を構築した。なお、遊離モノクローナル
抗体の添加量については、被検試料中のセルロプラスミ
ン量を考慮して、適宜増減され得る。この方法により、
固相抗体側に結合するセルロプラスミン量を制限するこ
とが可能となり、従来不可欠であった希釈操作を低減あ
るいは削除することのできる本願発明を完成させるに至
った。
等は、上述の問題点に鑑み、競合反応をサンドイッチ免
疫学的測定方法に導入することによる被検試料の希釈操
作を軽減する方法に着眼し、この方法を用いてセルロプ
ラスミンを好適に測定できる方法の提供を課題として検
討した。鋭意研究の結果、ハイブリドーマ法の技術を用
いてセルロプラスミンに対するモノクローナル抗体を調
製し、当該モノクローナル抗体をマイクロプレートに固
定化し、抗原抗体反応時にこの固定化したモノクローナ
ル抗体と反応性を同じくする遊離モノクローナル抗体を
被検試料と共に添加することにより、被検試料中のセル
ロプラスミンに対して固定化抗体と遊離抗体が競合する
免疫学的測定系を構築した。なお、遊離モノクローナル
抗体の添加量については、被検試料中のセルロプラスミ
ン量を考慮して、適宜増減され得る。この方法により、
固相抗体側に結合するセルロプラスミン量を制限するこ
とが可能となり、従来不可欠であった希釈操作を低減あ
るいは削除することのできる本願発明を完成させるに至
った。
【０００７】以下、本願発明を概説する。本測定法の原
理および測定法の概略を図１および図２に示した。今回
の測定法では、一般にサンドイッチ型免疫学的測定方法
として分類される測定系、すなわち定量を目的とする抗
原に特異的な抗体を固相プレートに固着させ、ついで抗
原試料を反応後、抗原に特異的に反応する標識抗体と反
応させる原理に基づく測定系の一次反応(抗原抗体反応)
時に、固相抗体と反応性を同じくする遊離抗体を被検試
料と共に反応系に添加させることを大きな特徴とする。
なお、本測定系の標識抗体に関しては、セルロプラスミ
ンを認識するポリクローナル抗体あるいは固定化抗体と
は異なるセルロプラスミン上のエピトープを認識するも
のであればどの部位を認識しているモノクローナル抗体
を用いても本測定は可能である。以下に、遊離抗体を競
合的に作用させる本発明を、サンドイッチＥＬＩＳＡに
適用した場合のセルロプラスミンの測定について概略を
述べる。しかしながら、本発明は抗ヒトセルロプラスミ
ンモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ型免疫学的
測定方法を広く包含するものであり、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡに限定されるものではない。サンドイッチ型ＲＩ
Ａ(放射免疫測定法)、蛍光物質あるいは化学発光物質を
標識化したサンドイッチ型免疫学的測定法等も好適な態
様と考えられる。
理および測定法の概略を図１および図２に示した。今回
の測定法では、一般にサンドイッチ型免疫学的測定方法
として分類される測定系、すなわち定量を目的とする抗
原に特異的な抗体を固相プレートに固着させ、ついで抗
原試料を反応後、抗原に特異的に反応する標識抗体と反
応させる原理に基づく測定系の一次反応(抗原抗体反応)
時に、固相抗体と反応性を同じくする遊離抗体を被検試
料と共に反応系に添加させることを大きな特徴とする。
なお、本測定系の標識抗体に関しては、セルロプラスミ
ンを認識するポリクローナル抗体あるいは固定化抗体と
は異なるセルロプラスミン上のエピトープを認識するも
のであればどの部位を認識しているモノクローナル抗体
を用いても本測定は可能である。以下に、遊離抗体を競
合的に作用させる本発明を、サンドイッチＥＬＩＳＡに
適用した場合のセルロプラスミンの測定について概略を
述べる。しかしながら、本発明は抗ヒトセルロプラスミ
ンモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ型免疫学的
測定方法を広く包含するものであり、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡに限定されるものではない。サンドイッチ型ＲＩ
Ａ(放射免疫測定法)、蛍光物質あるいは化学発光物質を
標識化したサンドイッチ型免疫学的測定法等も好適な態
様と考えられる。
【０００８】まず、あらかじめ用意した抗セルロプラス
ミンモノクローナル抗体をマイクロタイタープレートに
吸着固定させる。アルブミンを用いブロッキングを行な
った後、ここにセルロプラスミンを含む被検試料と、マ
イクロタイタープレートに固定させたものと反応性を同
じくする遊離モノクローナル抗体を同時に添加する。イ
ンキュベートし、洗浄後、酵素標識した抗ヒトセルロプ
ラスミン抗体を加えインキュベートし、さらに洗浄後、
基質を添加し、一定時間後に反応を停止し、基質の発色
量を吸光度で測定すればよい。なお、本願発明に用いら
れる被検試料については特別な制約はないが、セルロプ
ラスミンを含有する血液、血清あるいは血漿等を採取
後、乾燥濾紙等の不溶性担体に分散させて保存し、測定
時に溶出して測定試料とすることが、多数の被検試料の
測定を余儀なくされるマススクリーニングにおいては実
際的である。
ミンモノクローナル抗体をマイクロタイタープレートに
吸着固定させる。アルブミンを用いブロッキングを行な
った後、ここにセルロプラスミンを含む被検試料と、マ
イクロタイタープレートに固定させたものと反応性を同
じくする遊離モノクローナル抗体を同時に添加する。イ
ンキュベートし、洗浄後、酵素標識した抗ヒトセルロプ
ラスミン抗体を加えインキュベートし、さらに洗浄後、
基質を添加し、一定時間後に反応を停止し、基質の発色
量を吸光度で測定すればよい。なお、本願発明に用いら
れる被検試料については特別な制約はないが、セルロプ
ラスミンを含有する血液、血清あるいは血漿等を採取
後、乾燥濾紙等の不溶性担体に分散させて保存し、測定
時に溶出して測定試料とすることが、多数の被検試料の
測定を余儀なくされるマススクリーニングにおいては実
際的である。
【０００９】抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗
体は通常用いられている方法を参考にして調製すればよ
く、その概略は以下のごとくである。セルロプラスミン
は正常ヒト血清より、硫安塩析４０％飽和の沈澱画分を
採り、それらをセファクリルＳ３００を用いたゲル濾過
により青色の精製セルロプラスミンの画分を得る。得ら
れたセルロプラスミンをマウスに免疫し、このマウスよ
り得られた脾臓細胞と適当なミエローマ細胞とを融合
し、ハイブリドーマを作製してこのハイブリドーマよ
り、ヒトセルロプラスミンとのみ反応する抗体を産生す
るクローンを選択し、所望のマウスモノクローナル抗体
を調製する。
体は通常用いられている方法を参考にして調製すればよ
く、その概略は以下のごとくである。セルロプラスミン
は正常ヒト血清より、硫安塩析４０％飽和の沈澱画分を
採り、それらをセファクリルＳ３００を用いたゲル濾過
により青色の精製セルロプラスミンの画分を得る。得ら
れたセルロプラスミンをマウスに免疫し、このマウスよ
り得られた脾臓細胞と適当なミエローマ細胞とを融合
し、ハイブリドーマを作製してこのハイブリドーマよ
り、ヒトセルロプラスミンとのみ反応する抗体を産生す
るクローンを選択し、所望のマウスモノクローナル抗体
を調製する。
【００１０】標識抗体の調製法としては、固相抗体とは
異なる部位を認識する抗ヒトセルロプラスミンモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、これを
マウス腹腔内に接種し増殖させた腹腔液よりProtein Ａ
カラムを用いて精製し、さらにペプシン処理後、そのF
(ab)'2を例えば石川等の方法に従いペルオキシダーゼで
標識すればよい。または、得られた精製セルロプラスミ
ンを適当なアジュバント、例えばフロイントのコンプリ
ートアジュバントと共に、適当な動物、例えば山羊等に
対して皮下接種して得られる免疫血清より精製したポリ
クローナル抗体を用いて同様にペルオキシダーゼで標識
すればよい。
異なる部位を認識する抗ヒトセルロプラスミンモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、これを
マウス腹腔内に接種し増殖させた腹腔液よりProtein Ａ
カラムを用いて精製し、さらにペプシン処理後、そのF
(ab)'2を例えば石川等の方法に従いペルオキシダーゼで
標識すればよい。または、得られた精製セルロプラスミ
ンを適当なアジュバント、例えばフロイントのコンプリ
ートアジュバントと共に、適当な動物、例えば山羊等に
対して皮下接種して得られる免疫血清より精製したポリ
クローナル抗体を用いて同様にペルオキシダーゼで標識
すればよい。
【００１１】
【発明の効果】本発明において確立した測定系によっ
て、ＥＬＩＳＡ法において従来不可欠であった被検試料
の希釈操作を低減あるいは削除することのできるセルロ
プラスミンの好適な測定が可能となった。以下、本発明
の理解を深めるために実施例に添って詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に何等限定されるものでは
ない。
て、ＥＬＩＳＡ法において従来不可欠であった被検試料
の希釈操作を低減あるいは削除することのできるセルロ
プラスミンの好適な測定が可能となった。以下、本発明
の理解を深めるために実施例に添って詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に何等限定されるものでは
ない。
【００１２】
【実施例】実施例 １ (抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体の調製)本
発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は、精製ヒトセルロプラスミンを免疫原として、ケラー
とミルシュタインの方法(Kohler and Milstein,Nature,
256 p,495-497(1975))としてよく知られた方法を参考に
して作製された。得られたハイブリドーマより調製され
た数十種の抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体
のうち、ＣＰ２-２３-５と命名された抗体を固相抗体お
よび競合用抗体として選択した。こうして得られたモノ
クローナル抗体を実施例２に示すＥＬＩＳＡ法による測
定に供した。なお上述のモノクローナル抗体はいずれも
ＩｇＧ１タイプのサブクラスに属し、代表的なモノクロ
ーナル抗体であるＣＰ２-２３-５を産生するハイブリド
ーマは、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号
FERM Ｐ-１４４６６として寄託されている。
発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は、精製ヒトセルロプラスミンを免疫原として、ケラー
とミルシュタインの方法(Kohler and Milstein,Nature,
256 p,495-497(1975))としてよく知られた方法を参考に
して作製された。得られたハイブリドーマより調製され
た数十種の抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体
のうち、ＣＰ２-２３-５と命名された抗体を固相抗体お
よび競合用抗体として選択した。こうして得られたモノ
クローナル抗体を実施例２に示すＥＬＩＳＡ法による測
定に供した。なお上述のモノクローナル抗体はいずれも
ＩｇＧ１タイプのサブクラスに属し、代表的なモノクロ
ーナル抗体であるＣＰ２-２３-５を産生するハイブリド
ーマは、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号
FERM Ｐ-１４４６６として寄託されている。
【００１３】実施例 ２ (競合抗体を用いたＥＬＩＳＡによるヒトセルロプラス
ミンの測定)ＰＢＳよりなる抗体希釈液に抗ヒトセルロ
プラスミンモノクローナル抗体を５μg/mlになるように
溶解し、これを９６ウエルマイクロタイタープレート(N
UNC社製、IMMUNO MODULE MAXI SORP F8)に、１ウエル当
たり１５０μlずつ添加し４℃で一晩静置した。各ウエ
ルより上記抗体液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄
器(DYNATECH社製、ULTRA WASH II)を用いて洗浄後、１
％アルブミン(生化学工業社製、Albumin Fraction V,Bo
vine)溶解液を３００μl添加し、４℃で静置した。アル
ブミン溶液を吸引除去し、前記緩衝液で３回洗浄し測定
ウエルとした。
ミンの測定)ＰＢＳよりなる抗体希釈液に抗ヒトセルロ
プラスミンモノクローナル抗体を５μg/mlになるように
溶解し、これを９６ウエルマイクロタイタープレート(N
UNC社製、IMMUNO MODULE MAXI SORP F8)に、１ウエル当
たり１５０μlずつ添加し４℃で一晩静置した。各ウエ
ルより上記抗体液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄
器(DYNATECH社製、ULTRA WASH II)を用いて洗浄後、１
％アルブミン(生化学工業社製、Albumin Fraction V,Bo
vine)溶解液を３００μl添加し、４℃で静置した。アル
ブミン溶液を吸引除去し、前記緩衝液で３回洗浄し測定
ウエルとした。
【００１４】別にペルオキシダーゼ標識した抗セルロプ
ラスミン山羊抗体を準備した。また、ＰＢＳを基本とす
る緩衝液に、４μg/mlの濃度になるよう、マイクロタイ
タープレートに結合させたものと同種のモノクローナル
抗体を希釈し、これを競合用抗体液とした。測定用ウエ
ルに下記の方法で調製した測定試料を１ウエルあたり１
０μlずつ入れ、同時に競合用抗体液２００μlを入れ、
３０℃で４５分間放置し一次の抗原抗体反応を実施し
た。各ウエル中の反応液を吸引除去し、０.５％のTween
20を含むＰＢＳ(pH7.2)で４回洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識した抗ヒトセルロプラスミン抗体を１ウエル当た
り１００μlずつ加え、さらに４５分間反応を行なっ
た。同様に緩衝液で４回洗浄の後、基質溶液(ＯＰＤ／
Ｈ2Ｏ2)１００μlを各ウエルに添加後４５分間遮光下で
放置した後、２Ｎ硫酸を各ウエルに１００μlずつ加え
反応を停止した。撹拌し、各ウエルを均一にした後、４
９２nmの吸光度を測定した。
ラスミン山羊抗体を準備した。また、ＰＢＳを基本とす
る緩衝液に、４μg/mlの濃度になるよう、マイクロタイ
タープレートに結合させたものと同種のモノクローナル
抗体を希釈し、これを競合用抗体液とした。測定用ウエ
ルに下記の方法で調製した測定試料を１ウエルあたり１
０μlずつ入れ、同時に競合用抗体液２００μlを入れ、
３０℃で４５分間放置し一次の抗原抗体反応を実施し
た。各ウエル中の反応液を吸引除去し、０.５％のTween
20を含むＰＢＳ(pH7.2)で４回洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識した抗ヒトセルロプラスミン抗体を１ウエル当た
り１００μlずつ加え、さらに４５分間反応を行なっ
た。同様に緩衝液で４回洗浄の後、基質溶液(ＯＰＤ／
Ｈ2Ｏ2)１００μlを各ウエルに添加後４５分間遮光下で
放置した後、２Ｎ硫酸を各ウエルに１００μlずつ加え
反応を停止した。撹拌し、各ウエルを均一にした後、４
９２nmの吸光度を測定した。
【００１５】実施例 ３ (濾紙血液を測定試料とする競合用抗体を用いたＥＬＩ
ＳＡによるセルロプラスミンの測定)下記の方法で調製
した濾紙血液測定試料３ｍｍφ１枚を用い、実施例２に
示した測定ウェルおよび抗体液を用い、一次の抗原抗体
反応を１２時間行なうこと以外は、実施例２と同様の操
作により測定した。高濃度のセルロプラスミンを含む被
検試料である血液の希釈系を市販の化学濾紙(東洋濾紙
ＰＫＵ用等)に５０μl滴下し室温で風乾した濾紙血液試
料を用い、競合用抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定して、
その反応曲線を図３に示した。また対照として、競合抗
体を含まない同様の系で測定した結果を白丸で示した。
図に示したように、本測定方法により、１.０〜約２０m
g/dl付近の測定範囲でセルロプラスミンが測定可能とな
り、一方、従来のＥＬＩＳＡ法での測定範囲は０.１〜
約２mg/dlである。対照と比較すれば、本測定法におい
ては約１０倍の希釈を削除できることとなり、希釈操作
の問題を軽減することができる。
ＳＡによるセルロプラスミンの測定)下記の方法で調製
した濾紙血液測定試料３ｍｍφ１枚を用い、実施例２に
示した測定ウェルおよび抗体液を用い、一次の抗原抗体
反応を１２時間行なうこと以外は、実施例２と同様の操
作により測定した。高濃度のセルロプラスミンを含む被
検試料である血液の希釈系を市販の化学濾紙(東洋濾紙
ＰＫＵ用等)に５０μl滴下し室温で風乾した濾紙血液試
料を用い、競合用抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定して、
その反応曲線を図３に示した。また対照として、競合抗
体を含まない同様の系で測定した結果を白丸で示した。
図に示したように、本測定方法により、１.０〜約２０m
g/dl付近の測定範囲でセルロプラスミンが測定可能とな
り、一方、従来のＥＬＩＳＡ法での測定範囲は０.１〜
約２mg/dlである。対照と比較すれば、本測定法におい
ては約１０倍の希釈を削除できることとなり、希釈操作
の問題を軽減することができる。
【００１６】実施例 ４ (血清または血漿を測定試料とする競合用抗体を用いた
ＥＬＩＳＡによるセルロプラスミンの測定)下記の方法
で調製した測定試料を用い、実施例２に示した測定ウェ
ルおよび抗体液を用い、実施例２と同様の操作により測
定した。高濃度のセルロプラスミンを含む被検試料であ
る血清または血漿の希釈系を用い、競合用抗体を用いた
ＥＬＩＳＡで測定し、その反応曲線を図４に示した。ま
た対照として、競合抗体を含まない同様の系で測定した
結果を白丸で示した。図に示したように、本測定方法に
より、０.０２〜約２.０mg/dl付近の測定範囲でセルロ
プラスミンが測定可能となり、一方、従来のＥＬＩＳＡ
法での測定範囲は０.００２〜約０.２mg/dlである。対
象と比較すれば、本測定法においては約１０倍の希釈を
削除できることとなる。
ＥＬＩＳＡによるセルロプラスミンの測定)下記の方法
で調製した測定試料を用い、実施例２に示した測定ウェ
ルおよび抗体液を用い、実施例２と同様の操作により測
定した。高濃度のセルロプラスミンを含む被検試料であ
る血清または血漿の希釈系を用い、競合用抗体を用いた
ＥＬＩＳＡで測定し、その反応曲線を図４に示した。ま
た対照として、競合抗体を含まない同様の系で測定した
結果を白丸で示した。図に示したように、本測定方法に
より、０.０２〜約２.０mg/dl付近の測定範囲でセルロ
プラスミンが測定可能となり、一方、従来のＥＬＩＳＡ
法での測定範囲は０.００２〜約０.２mg/dlである。対
象と比較すれば、本測定法においては約１０倍の希釈を
削除できることとなる。
【００１７】
【図１】本測定の原理および測定方法を示す図である。
【図２】本測定の原理および測定方法を示す図である。
(図１の続き)
(図１の続き)
【図３】セルロプラスミン、競合用抗体を用いた濾紙血
液を測定試料とするＥＬＩＳＡでの反応曲線を示す図で
ある。
液を測定試料とするＥＬＩＳＡでの反応曲線を示す図で
ある。
【図４】セルロプラスミン、競合用抗体を用いた血清ま
たは血漿を測定試料とするＥＬＩＳＡでの反応曲線を示
す図である。
たは血漿を測定試料とするＥＬＩＳＡでの反応曲線を示
す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 モノクローナル抗体を用いたサンドイ
ッチ型免疫測定方法において、希釈操作を施さないか選
択的に希釈操作を施した生体試料を被検試料とし、被検
試料中のセルロプラスミンとセルロプラスミンを捕捉す
る固相抗体との反応時に、当該固相抗体と反応性を同じ
くする遊離抗体を添加し、固相抗体と遊離抗体との間に
競合を生ぜしめることを特徴とするセルロプラスミンの
測定方法。 - 【請求項２】 サンドイッチ型免疫測定方法がサンド
イッチ酵素免疫測定法(以下、サンドイッチＥＬＩＳＡ
と略称することがある)である請求項１記載のセルロプ
ラスミンの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24204594A JPH0875743A (ja) | 1994-09-08 | 1994-09-08 | 競合抗体を利用するセルロプラスミンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24204594A JPH0875743A (ja) | 1994-09-08 | 1994-09-08 | 競合抗体を利用するセルロプラスミンの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0875743A true JPH0875743A (ja) | 1996-03-22 |
Family
ID=17083454
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24204594A Withdrawn JPH0875743A (ja) | 1994-09-08 | 1994-09-08 | 競合抗体を利用するセルロプラスミンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0875743A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999067638A1 (fr) * | 1998-06-24 | 1999-12-29 | Idemitsu Kosan Co., Ltd. | Procede et reactifs de detection d'une dystocie |
| EP1245957A3 (en) * | 2001-03-31 | 2002-10-09 | Zenovac, Inc. | Method of measuring ceruloplasmin concentration with enzyme-linked immunosorbent assay or dissociation-enhanced time-resolved fluoroimmunoassay in a blood spot, and Wilson's disease screening kit and method of diagnosing Wilson's disease |
| WO2010038829A1 (ja) * | 2008-10-02 | 2010-04-08 | 独立行政法人国立病院機構 | 糖尿病性末梢血管障害の検査のための方法、組成物およびキット |
| JP2023542497A (ja) * | 2020-09-11 | 2023-10-10 | アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 抗セルロプラスミン抗体及びその使用 |
-
1994
- 1994-09-08 JP JP24204594A patent/JPH0875743A/ja not_active Withdrawn
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999067638A1 (fr) * | 1998-06-24 | 1999-12-29 | Idemitsu Kosan Co., Ltd. | Procede et reactifs de detection d'une dystocie |
| EP1245957A3 (en) * | 2001-03-31 | 2002-10-09 | Zenovac, Inc. | Method of measuring ceruloplasmin concentration with enzyme-linked immunosorbent assay or dissociation-enhanced time-resolved fluoroimmunoassay in a blood spot, and Wilson's disease screening kit and method of diagnosing Wilson's disease |
| US6806044B2 (en) | 2001-03-31 | 2004-10-19 | Zenovac, Inc. | Method of measuring ceruloplasmin concentration in a blood spot, kit and method of diagnosing Wilson's disease |
| WO2010038829A1 (ja) * | 2008-10-02 | 2010-04-08 | 独立行政法人国立病院機構 | 糖尿病性末梢血管障害の検査のための方法、組成物およびキット |
| JP2023542497A (ja) * | 2020-09-11 | 2023-10-10 | アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 抗セルロプラスミン抗体及びその使用 |
| US12590977B2 (en) | 2020-09-11 | 2026-03-31 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Anti-ceruloplasmin antibodies and uses thereof |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20011120 |