JPH0875745A - 可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定方法及びその測定用キット - Google Patents
可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定方法及びその測定用キットInfo
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- JPH0875745A JPH0875745A JP2563795A JP2563795A JPH0875745A JP H0875745 A JPH0875745 A JP H0875745A JP 2563795 A JP2563795 A JP 2563795A JP 2563795 A JP2563795 A JP 2563795A JP H0875745 A JPH0875745 A JP H0875745A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来測定することができなかった検体中の可
溶性Ｆａｓ抗原を測定する可溶性Ｆａｓ抗原の測定方法
及びその測定用キットを提供すること。 【構成】 標準物質として用いる可溶性Ｆａｓ抗原を調
製した。また、クローンＣＢＥから得られる抗体を９６
穴マイクロプレートに結合して固相化抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体とした。更に、クローンＶＢ３から得られる
抗体をＰＯＤにより標識化し、標識抗Ｆａｓモノクロー
ナル抗体とした。そして、可溶性Ｆａｓ抗原を含む検体
と固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体とを反応させて固
相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体−可溶性Ｆａｓ抗原複
合体を形成せしめ、その後これを前記標識抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体で処理し、マイクロプレートにトラップ
された可溶性Ｆａｓ抗原をＰＯＤで標識化した。このＰ
ＯＤによる発色基質の発色量を定量することにより、可
溶性Ｆａｓ抗原を測定した。
溶性Ｆａｓ抗原を測定する可溶性Ｆａｓ抗原の測定方法
及びその測定用キットを提供すること。 【構成】 標準物質として用いる可溶性Ｆａｓ抗原を調
製した。また、クローンＣＢＥから得られる抗体を９６
穴マイクロプレートに結合して固相化抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体とした。更に、クローンＶＢ３から得られる
抗体をＰＯＤにより標識化し、標識抗Ｆａｓモノクロー
ナル抗体とした。そして、可溶性Ｆａｓ抗原を含む検体
と固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体とを反応させて固
相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体−可溶性Ｆａｓ抗原複
合体を形成せしめ、その後これを前記標識抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体で処理し、マイクロプレートにトラップ
された可溶性Ｆａｓ抗原をＰＯＤで標識化した。このＰ
ＯＤによる発色基質の発色量を定量することにより、可
溶性Ｆａｓ抗原を測定した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、可溶性Ｆａｓ抗原の免
疫学的測定方法およびその測定用キットに関するもので
ある。
疫学的測定方法およびその測定用キットに関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】多細胞生物においては個体発生の過程に
おいて多くの細胞が細胞死により除去される。この細胞
死は、あらかじめ決められたプログラムによって起こっ
ていると推測されている。また、成体においても、一方
で細胞分裂により細胞数が増えると、他方で細胞死が起
こり、全体の細胞数のバランスを保っていると考えられ
る。ワイリー（Wyllie）らは、死につつある細胞の形態
を電子顕微鏡で観察し、細胞死を形態学的に２種類（即
ちネクローシスとアポトーシス）に分類した(Wyllie,A.
H. et al.:Int.Rev.Cytol.,68:251-306,1980)。
おいて多くの細胞が細胞死により除去される。この細胞
死は、あらかじめ決められたプログラムによって起こっ
ていると推測されている。また、成体においても、一方
で細胞分裂により細胞数が増えると、他方で細胞死が起
こり、全体の細胞数のバランスを保っていると考えられ
る。ワイリー（Wyllie）らは、死につつある細胞の形態
を電子顕微鏡で観察し、細胞死を形態学的に２種類（即
ちネクローシスとアポトーシス）に分類した(Wyllie,A.
H. et al.:Int.Rev.Cytol.,68:251-306,1980)。
【０００３】ネクローシスの場合には、初期の段階で細
胞膜の透過性が増大し、核やミトコンドリアなどの細胞
内小器官が膨潤し、やがてライソゾームの破壊が起き、
放出した蛋白分解酵素などにより細胞が破壊する。一
方、アポトーシスの場合には、ミトコンドリアやライソ
ゾームの構造には大きな変化は認められず、初期の段階
で核内で染色体が凝縮し、細胞質も収縮する。同時に核
がいくつかの部分に断片化したり、細胞表面に泡のよう
な構造が生じた後、アポトーティックボディーと呼ばれ
るミニ細胞に分かれることもある。
胞膜の透過性が増大し、核やミトコンドリアなどの細胞
内小器官が膨潤し、やがてライソゾームの破壊が起き、
放出した蛋白分解酵素などにより細胞が破壊する。一
方、アポトーシスの場合には、ミトコンドリアやライソ
ゾームの構造には大きな変化は認められず、初期の段階
で核内で染色体が凝縮し、細胞質も収縮する。同時に核
がいくつかの部分に断片化したり、細胞表面に泡のよう
な構造が生じた後、アポトーティックボディーと呼ばれ
るミニ細胞に分かれることもある。
【０００４】外的原因によって起こる、いわば受動的な
死は、主としてネクローシスによって起こるのに対し、
発生や分化あるいは組織のターンオーバーの過程で見ら
れるあらかじめプログラムされた細胞死は、アポトーシ
スによって起こると考えられている。
死は、主としてネクローシスによって起こるのに対し、
発生や分化あるいは組織のターンオーバーの過程で見ら
れるあらかじめプログラムされた細胞死は、アポトーシ
スによって起こると考えられている。
【０００５】アポトーシスあるいはプログラム細胞死と
呼ばれる細胞死の制御に深く関連すると考えられている
生体構成細胞表層に存在する膜貫通性タンパクは、Ｆａ
ｓ抗原と呼ばれ、マウス及びヒトＦａｓ抗原のアミノ酸
配列、及び該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は
既に明らかにされている(Cell, Vol.66, pp.233-243,19
91,イトウナオトら、J. Immunol., Vol.148, No.4, pp.
1274-1279, 1992, ワタナベ（フクナガ）・リエら、J.
Biol.Chem.,Vol.267, No.15, pp.10709-10715, 1992,ア
レキサンダ−(Alexander Oehm)ら、J.Exp. Med., Vol.1
69, pp.1747-1756,1989 ヨネハラシンら、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol.87, pp.9620-9624, 1990, コバヤ
シノブユキら、Science,Vol.245, pp.301-305,1989,バ
−ナ−ド(Bernhard C. Trauth)ら、J. Immunol.,Vol.14
9, No.10, pp.3166-3173,1992,ジェンス(Jens Dhein)
ら、The Lancet, Vol.335, pp497-500,1990,クラウスミ
ヒャエル(Klaus-Michael Debatin)ら、J. Immunol., Vo
l.149, No.11,pp.3753-3758,1992, ミヤワキトシオら、
Genomics, Vol.14, pp.179-180,1992, ピ−タ−リヒタ
−(Peter Lichter)ら等参照) 。
呼ばれる細胞死の制御に深く関連すると考えられている
生体構成細胞表層に存在する膜貫通性タンパクは、Ｆａ
ｓ抗原と呼ばれ、マウス及びヒトＦａｓ抗原のアミノ酸
配列、及び該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は
既に明らかにされている(Cell, Vol.66, pp.233-243,19
91,イトウナオトら、J. Immunol., Vol.148, No.4, pp.
1274-1279, 1992, ワタナベ（フクナガ）・リエら、J.
Biol.Chem.,Vol.267, No.15, pp.10709-10715, 1992,ア
レキサンダ−(Alexander Oehm)ら、J.Exp. Med., Vol.1
69, pp.1747-1756,1989 ヨネハラシンら、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol.87, pp.9620-9624, 1990, コバヤ
シノブユキら、Science,Vol.245, pp.301-305,1989,バ
−ナ−ド(Bernhard C. Trauth)ら、J. Immunol.,Vol.14
9, No.10, pp.3166-3173,1992,ジェンス(Jens Dhein)
ら、The Lancet, Vol.335, pp497-500,1990,クラウスミ
ヒャエル(Klaus-Michael Debatin)ら、J. Immunol., Vo
l.149, No.11,pp.3753-3758,1992, ミヤワキトシオら、
Genomics, Vol.14, pp.179-180,1992, ピ−タ−リヒタ
−(Peter Lichter)ら等参照) 。
【０００６】米原らは、ヒトＦＳ−７細胞の細胞表面抗
原に対するモノクローナル抗体を作製し、抗Ｆａｓ抗体
を得たが、この抗体はＦａｓ抗原を発現している細胞を
殺す活性を示した(Yonehara,S. et al.:J. Exp. Med.,1
69:1747-1756, 1989)。また、その細胞死は電子顕微鏡
による観察からアポトーシスの特徴を示したことからＦ
ａｓ抗原はアポトーシスによる細胞死を媒介すると結論
された。これとは別に、トラウス（Trauth）らは、抗Ｆ
ａｓ抗体に良く似た性質を持ち、細胞を殺す活性を示す
モノクローナル抗体、ＡＰＯ−１抗体を得た(Trauth,B.
C. et al.:Science,245:301-305, 1989)。この二つの抗
体は細胞死を誘導するという点で共通なだけではなく、
抗原の分布や分子量など極めてよく似ており、同じもの
である事が明かにされている。
原に対するモノクローナル抗体を作製し、抗Ｆａｓ抗体
を得たが、この抗体はＦａｓ抗原を発現している細胞を
殺す活性を示した(Yonehara,S. et al.:J. Exp. Med.,1
69:1747-1756, 1989)。また、その細胞死は電子顕微鏡
による観察からアポトーシスの特徴を示したことからＦ
ａｓ抗原はアポトーシスによる細胞死を媒介すると結論
された。これとは別に、トラウス（Trauth）らは、抗Ｆ
ａｓ抗体に良く似た性質を持ち、細胞を殺す活性を示す
モノクローナル抗体、ＡＰＯ−１抗体を得た(Trauth,B.
C. et al.:Science,245:301-305, 1989)。この二つの抗
体は細胞死を誘導するという点で共通なだけではなく、
抗原の分布や分子量など極めてよく似ており、同じもの
である事が明かにされている。
【０００７】Ｆａｓ抗原はその構造解析の結果、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）レセプターや神経成長因子（ＮＧＦ）
に良く似た構造をしていること、外部からのシグナルを
受けて細胞死を起こす新しい種類のレセプターであるこ
とが明かにされ、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーを形
成する受容体の一つとされている。
死因子（ＴＮＦ）レセプターや神経成長因子（ＮＧＦ）
に良く似た構造をしていること、外部からのシグナルを
受けて細胞死を起こす新しい種類のレセプターであるこ
とが明かにされ、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーを形
成する受容体の一つとされている。
【０００８】最近において、自己免疫の症状を呈するマ
ウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）においてＦａｓ遺伝子の
異常が認められることや、ＨＩＶ感染者において高レベ
ルのアポトーシスがリンパ球に起こっていることとＦａ
ｓ抗原が関連していることが示唆されるようになり、Ｆ
ａｓ抗原の発現と自己免疫疾患等の疾患との関係が注目
されるようになった。
ウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）においてＦａｓ遺伝子の
異常が認められることや、ＨＩＶ感染者において高レベ
ルのアポトーシスがリンパ球に起こっていることとＦａ
ｓ抗原が関連していることが示唆されるようになり、Ｆ
ａｓ抗原の発現と自己免疫疾患等の疾患との関係が注目
されるようになった。
【０００９】チェンら(Cheng.J. et al.: Science,263:
1759-1762, 1994)は、これらＦａｓ抗原の転写の異常と
自己免疫疾患の関連を調べるために、自己免疫患者及び
健常人から細胞内のｃＤＮＡを取り出し、調べたとこ
ろ、どちらにもＦａｓ抗原の全長をコードする通常の１
１６７ｂｐのｃＤＮＡの他に、１１０４ｂｐの小さなｃ
ＤＮＡが見られることを発見した。さらにこの１１０４
ｂｐの小さなｃＤＮＡについて１１６７ｂｐのｃＤＮＡ
と比較検討したところ、疎水性の膜貫通部位（ＴＭ、Tr
ansmembrane domain）を欠いていることから、この小さ
なｃＤＮＡ（ＦａｓΔＴＭと呼ばれる）は、検体（例え
ば、血液、血清、血漿、尿、唾液、骨髄液等の体液）に
可溶なＦａｓ抗原（以下、「可溶性Ｆａｓ抗原」とい
う）をコードしていることが明かにされた。
1759-1762, 1994)は、これらＦａｓ抗原の転写の異常と
自己免疫疾患の関連を調べるために、自己免疫患者及び
健常人から細胞内のｃＤＮＡを取り出し、調べたとこ
ろ、どちらにもＦａｓ抗原の全長をコードする通常の１
１６７ｂｐのｃＤＮＡの他に、１１０４ｂｐの小さなｃ
ＤＮＡが見られることを発見した。さらにこの１１０４
ｂｐの小さなｃＤＮＡについて１１６７ｂｐのｃＤＮＡ
と比較検討したところ、疎水性の膜貫通部位（ＴＭ、Tr
ansmembrane domain）を欠いていることから、この小さ
なｃＤＮＡ（ＦａｓΔＴＭと呼ばれる）は、検体（例え
ば、血液、血清、血漿、尿、唾液、骨髄液等の体液）に
可溶なＦａｓ抗原（以下、「可溶性Ｆａｓ抗原」とい
う）をコードしていることが明かにされた。
【００１０】チェン（Cheng ）らはマウスを可溶性Ｆａ
ｓ抗原で処理することにより胸腺細胞中のＣＤ４、ＣＤ
８単独陽性細胞及びダブルネガティブの細胞が増加し、
ダブルポジティブの細胞が減少すること、脾臓細胞の総
細胞数が増加すること、さらにＳＬＥ患者においては血
清中の可溶性Ｆａｓ抗原の量が健常人に比して２倍程度
に増加していること等から、可溶性Ｆａｓ抗原の過剰産
生により胸腺や抹消組織でもアポトーシスが阻害され、
自己反応性のリンパ球クローンの適切な排除が行なわれ
ないために自己免疫疾患の発症が誘因されるとの病因論
を展開した。
ｓ抗原で処理することにより胸腺細胞中のＣＤ４、ＣＤ
８単独陽性細胞及びダブルネガティブの細胞が増加し、
ダブルポジティブの細胞が減少すること、脾臓細胞の総
細胞数が増加すること、さらにＳＬＥ患者においては血
清中の可溶性Ｆａｓ抗原の量が健常人に比して２倍程度
に増加していること等から、可溶性Ｆａｓ抗原の過剰産
生により胸腺や抹消組織でもアポトーシスが阻害され、
自己反応性のリンパ球クローンの適切な排除が行なわれ
ないために自己免疫疾患の発症が誘因されるとの病因論
を展開した。
【００１１】このことから、検体中における可溶性Ｆａ
ｓ抗原の量を測定することは、自己免疫疾患の予知、診
断及び治療方針の確立、治療の効果の判定に有用であ
る。
ｓ抗原の量を測定することは、自己免疫疾患の予知、診
断及び治療方針の確立、治療の効果の判定に有用であ
る。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、検体中
の可溶性Ｆａｓ抗原を精度よく十分な感度をもって測定
する簡便な方法は知られていなかった。本発明の目的
は、従来測定することができなかった検体中の可溶性Ｆ
ａｓ抗原を測定する可溶性Ｆａｓ抗原の測定方法及びそ
の測定用キットを提供することにある。
の可溶性Ｆａｓ抗原を精度よく十分な感度をもって測定
する簡便な方法は知られていなかった。本発明の目的
は、従来測定することができなかった検体中の可溶性Ｆ
ａｓ抗原を測定する可溶性Ｆａｓ抗原の測定方法及びそ
の測定用キットを提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段及び作用】本願の発明者ら
は、検体中の可溶性Ｆａｓ抗原を検出する方法の開発に
着手し、ウエスタンブロット法（Ｗ．Ｂ．法）、放射免
疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）な
どの適用を考えた。しかし、Ｗ．Ｂ．法では感度が高く
特異性も高いものの定量性に欠け、大量の検体を一時に
処理するには不向きであった。また、ＲＩＡ法では放射
性物質を標識物として用いることから、管理された施設
において資格を有するものにしか扱うことができなかっ
た。これに比べて、ＥＩＡ法（あるいはＥＬＩＳＡ法）
は上記のような問題がなく、簡便に感度よく測定するこ
とが可能であり、この方法を利用して可溶性Ｆａｓ抗原
を検出する方法を確立することに成功し、本発明を完成
した。
は、検体中の可溶性Ｆａｓ抗原を検出する方法の開発に
着手し、ウエスタンブロット法（Ｗ．Ｂ．法）、放射免
疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）な
どの適用を考えた。しかし、Ｗ．Ｂ．法では感度が高く
特異性も高いものの定量性に欠け、大量の検体を一時に
処理するには不向きであった。また、ＲＩＡ法では放射
性物質を標識物として用いることから、管理された施設
において資格を有するものにしか扱うことができなかっ
た。これに比べて、ＥＩＡ法（あるいはＥＬＩＳＡ法）
は上記のような問題がなく、簡便に感度よく測定するこ
とが可能であり、この方法を利用して可溶性Ｆａｓ抗原
を検出する方法を確立することに成功し、本発明を完成
した。
【００１４】即ち、本発明の第１は、可溶性Ｆａｓ抗原
の免疫学的測定方法であって、該可溶性Ｆａｓ抗原に特
異的に結合可能な抗Ｆａｓモノクローナル抗体を不溶性
支持体に結合せしめてなる固相化抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体に標準可溶性Ｆａｓ抗原を反応せしめた後、この
可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な標識された第２
の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を反応させ、反応生成物
の標識量を測定することにより検量線を作成する行程
と、該可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な抗Ｆａｓ
モノクローナル抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる
固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体に検体を反応せしめ
た後、この可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な標識
された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を反応させ、
反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から検体中に
含まれる可溶性Ｆａｓ抗原を定量する行程とを含むこと
を特徴とするものである。
の免疫学的測定方法であって、該可溶性Ｆａｓ抗原に特
異的に結合可能な抗Ｆａｓモノクローナル抗体を不溶性
支持体に結合せしめてなる固相化抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体に標準可溶性Ｆａｓ抗原を反応せしめた後、この
可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な標識された第２
の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を反応させ、反応生成物
の標識量を測定することにより検量線を作成する行程
と、該可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な抗Ｆａｓ
モノクローナル抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる
固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体に検体を反応せしめ
た後、この可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な標識
された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を反応させ、
反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から検体中に
含まれる可溶性Ｆａｓ抗原を定量する行程とを含むこと
を特徴とするものである。
【００１５】ここで、前記標準可溶性Ｆａｓ抗原は、ヒ
トＦａｓ抗原またはマウスＦａｓ抗原の細胞外領域とマ
ウスＩＬ−３レセプターβサブユニットＡＩＣ２Ａの細
胞外領域またはイムノグロブリン重鎖の定常領域とから
なるキメラ可溶性Ｆａｓ抗原であってもよい。また、前
記不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体は、ハイブリドーマクローンＶＢ３、Ｃ
ＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ６、ＪＡＥ及びＣ
Ｈ１１（以上８種のハイブリドーマクローンは（株）医
学生物学研究所により市販されている）からなる群の中
から選ばれた一つのハイブリドーマクローンから産生さ
れるモノクローナル抗体であってもよい。更に、前記標
識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、ハイブ
リドーマクローンＶＢ３、ＣＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、Ｕ
Ｂ２、ＡＸ６、ＪＡＥ及びＣＨ１１からなる群の中から
選ばれる一つのハイブリドーマクローンから産生される
モノクローナル抗体であってもよい。更にまた、前記標
識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、ペルオ
キシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びビオチンか
らなる群から選ばれる標識物質（好ましくはペルオキシ
ダーゼ）で標識されたモノクローナル抗体であってもよ
い。
トＦａｓ抗原またはマウスＦａｓ抗原の細胞外領域とマ
ウスＩＬ−３レセプターβサブユニットＡＩＣ２Ａの細
胞外領域またはイムノグロブリン重鎖の定常領域とから
なるキメラ可溶性Ｆａｓ抗原であってもよい。また、前
記不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体は、ハイブリドーマクローンＶＢ３、Ｃ
ＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ６、ＪＡＥ及びＣ
Ｈ１１（以上８種のハイブリドーマクローンは（株）医
学生物学研究所により市販されている）からなる群の中
から選ばれた一つのハイブリドーマクローンから産生さ
れるモノクローナル抗体であってもよい。更に、前記標
識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、ハイブ
リドーマクローンＶＢ３、ＣＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、Ｕ
Ｂ２、ＡＸ６、ＪＡＥ及びＣＨ１１からなる群の中から
選ばれる一つのハイブリドーマクローンから産生される
モノクローナル抗体であってもよい。更にまた、前記標
識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、ペルオ
キシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びビオチンか
らなる群から選ばれる標識物質（好ましくはペルオキシ
ダーゼ）で標識されたモノクローナル抗体であってもよ
い。
【００１６】この測定方法は、固相化抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体と、標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体を適宜組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡの系
を組むことにより、可溶性Ｆａｓ抗原を測定するもので
ある。ここで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用したの
は、以下の理由による。即ち、ＥＩＡ法若しくはＥＬＩ
ＳＡ法にもいくつかの方法があるが、代表的にはサンド
イッチ法あるいは競合法が用いられる。競合法により測
定する場合には精製された抗原を多量に得る必要がある
ため、作製上の手間を考えると、サンドイッチ法を用い
るのが望ましいのである。
ーナル抗体と、標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体を適宜組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡの系
を組むことにより、可溶性Ｆａｓ抗原を測定するもので
ある。ここで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用したの
は、以下の理由による。即ち、ＥＩＡ法若しくはＥＬＩ
ＳＡ法にもいくつかの方法があるが、代表的にはサンド
イッチ法あるいは競合法が用いられる。競合法により測
定する場合には精製された抗原を多量に得る必要がある
ため、作製上の手間を考えると、サンドイッチ法を用い
るのが望ましいのである。
【００１７】本発明の第２は、可溶性Ｆａｓ抗原を免疫
学的に測定するための測定用キットであって、該可溶性
Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗Ｆａ
ｓモノクローナル抗体と、標準物質としての可溶性Ｆａ
ｓ抗原とを含むことを特徴とするものであり、この測定
用キットは、さらに、可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合
可能な標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を
含んでいてもよい。
学的に測定するための測定用キットであって、該可溶性
Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗Ｆａ
ｓモノクローナル抗体と、標準物質としての可溶性Ｆａ
ｓ抗原とを含むことを特徴とするものであり、この測定
用キットは、さらに、可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合
可能な標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を
含んでいてもよい。
【００１８】ここで、前記標準物質としての可溶性Ｆａ
ｓ抗原は、ヒトＦａｓ抗原またはマウスＦａｓ抗原の細
胞外領域とマウスＩＬ−３レセプターβサブユニットＡ
ＩＣ２Ａの細胞外領域またはイムノグロブリン重鎖の定
常領域とからなるキメラ可溶性Ｆａｓ抗原であってもよ
い。また、前記不溶性支持体に結合せしめてなる固相化
抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、ハイブリドーマクロー
ンＶＢ３、ＣＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ６、
ＪＡＥ及びＣＨ１１からなる群の中から選ばれた一つの
ハイブリドーマクローンから産生されるモノクローナル
抗体であってもよい。更に、前記標識された第２の抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体は、ハイブリドーマクローンＶ
Ｂ３、ＣＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ６、ＪＡ
Ｅ及びＣＨ１１からなる群の中から選ばれる一つのハイ
ブリドーマクローンから産生されるモノクローナル抗体
であってもよい。更にまた、前記標識された第２の抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体は、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ及びビオチンからなる群から選ばれ
る標識物質（好ましくはペルオキシダーゼ）で標識され
たモノクローナル抗体であってもよい。
ｓ抗原は、ヒトＦａｓ抗原またはマウスＦａｓ抗原の細
胞外領域とマウスＩＬ−３レセプターβサブユニットＡ
ＩＣ２Ａの細胞外領域またはイムノグロブリン重鎖の定
常領域とからなるキメラ可溶性Ｆａｓ抗原であってもよ
い。また、前記不溶性支持体に結合せしめてなる固相化
抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、ハイブリドーマクロー
ンＶＢ３、ＣＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ６、
ＪＡＥ及びＣＨ１１からなる群の中から選ばれた一つの
ハイブリドーマクローンから産生されるモノクローナル
抗体であってもよい。更に、前記標識された第２の抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体は、ハイブリドーマクローンＶ
Ｂ３、ＣＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ６、ＪＡ
Ｅ及びＣＨ１１からなる群の中から選ばれる一つのハイ
ブリドーマクローンから産生されるモノクローナル抗体
であってもよい。更にまた、前記標識された第２の抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体は、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ及びビオチンからなる群から選ばれ
る標識物質（好ましくはペルオキシダーゼ）で標識され
たモノクローナル抗体であってもよい。
【００１９】本発明の第１及び第２における固相化抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体は、可溶性Ｆａｓ抗原に特異的
に結合することにより、その可溶性Ｆａｓ抗原を不溶化
支持体上にトラップして複合体を形成するという作用を
奏するものである。このとき、固相化抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体は、可溶性Ｆａｓの抗原決定基（エピトー
プ）に特異的に結合すると考えられる。また、本発明の
第１及び第２における標識された第２の抗Ｆａｓモノク
ローナル抗体は、固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体に
トラップされた可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合するこ
とにより、前記複合体を標識化するという作用を奏する
ものである。このとき、標識された第２の抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体は、可溶性Ｆａｓ抗原のうち固相化抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体が結合した可溶性Ｆａｓ抗原の
抗原決定基とは異なる位置の抗原決定基に特異的に結合
すると考えられる。
ａｓモノクローナル抗体は、可溶性Ｆａｓ抗原に特異的
に結合することにより、その可溶性Ｆａｓ抗原を不溶化
支持体上にトラップして複合体を形成するという作用を
奏するものである。このとき、固相化抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体は、可溶性Ｆａｓの抗原決定基（エピトー
プ）に特異的に結合すると考えられる。また、本発明の
第１及び第２における標識された第２の抗Ｆａｓモノク
ローナル抗体は、固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体に
トラップされた可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合するこ
とにより、前記複合体を標識化するという作用を奏する
ものである。このとき、標識された第２の抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体は、可溶性Ｆａｓ抗原のうち固相化抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体が結合した可溶性Ｆａｓ抗原の
抗原決定基とは異なる位置の抗原決定基に特異的に結合
すると考えられる。
【００２０】固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体と標識
された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体とは、通常、
それぞれ異なる抗原決定基を認識するものを用いる。但
し、同じ抗原決定基が可溶性Ｆａｓ抗原の２箇所に存在
する場合には、同じ抗原決定基を認識するものであって
もよい。この場合、そのうちの一つが固相化抗Ｆａｓモ
ノクローナル抗体と結合し、他の一つが標識された第２
の抗Ｆａｓモノクローナル抗体と結合すると考えられ
る。
された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体とは、通常、
それぞれ異なる抗原決定基を認識するものを用いる。但
し、同じ抗原決定基が可溶性Ｆａｓ抗原の２箇所に存在
する場合には、同じ抗原決定基を認識するものであって
もよい。この場合、そのうちの一つが固相化抗Ｆａｓモ
ノクローナル抗体と結合し、他の一つが標識された第２
の抗Ｆａｓモノクローナル抗体と結合すると考えられ
る。
【００２１】以下本発明を更に詳細に説明する。本発明
にいうＦａｓ抗原とは、ヒト、マウス、ラット、イヌあ
るいはサル等の哺乳動物のＦａｓ抗原を意味し、好まし
くは、ヒト、マウスあるいはラットのＦａｓ抗原を、特
に好ましくはヒトＦａｓ抗原を意味する。
にいうＦａｓ抗原とは、ヒト、マウス、ラット、イヌあ
るいはサル等の哺乳動物のＦａｓ抗原を意味し、好まし
くは、ヒト、マウスあるいはラットのＦａｓ抗原を、特
に好ましくはヒトＦａｓ抗原を意味する。
【００２２】本発明の主題である可溶性Ｆａｓ抗原の検
出に際して使用される標準物質（スタンダード）として
の可溶性Ｆａｓ抗原は、遺伝子工学的手法を用いて、Ｆ
ａｓ抗原の可溶性領域とマウスＩＬ−３レセプターＡＩ
Ｃ２Ａの可溶性領域とのキメラタンパク、あるいはＦａ
ｓ抗原の可溶性領域とイムノグロブリンの重鎖の定常領
域（constant region,Ｆｃ）とのキメラタンパクとし
て、製造、取得することができる。具体的には、以下の
ようにして製造することができる。
出に際して使用される標準物質（スタンダード）として
の可溶性Ｆａｓ抗原は、遺伝子工学的手法を用いて、Ｆ
ａｓ抗原の可溶性領域とマウスＩＬ−３レセプターＡＩ
Ｃ２Ａの可溶性領域とのキメラタンパク、あるいはＦａ
ｓ抗原の可溶性領域とイムノグロブリンの重鎖の定常領
域（constant region,Ｆｃ）とのキメラタンパクとし
て、製造、取得することができる。具体的には、以下の
ようにして製造することができる。
【００２３】Ｆａｓ抗原を産生しうる細胞から全ＲＮＡ
を調製し、これらを鋳型としてｃＤＮＡライブラリ−を
作成する。ここで用いる細胞としては、任意に選択する
ことができるが、ヒトＦａｓ抗原を産生するのであれば
例えばヒトＴ腫瘍細胞株ＫＴ３を用いることができ、マ
ウスＦａｓ抗原を産生するのであれば例えばマウスマク
ロファ−ジＢＡＭ３を用いることができる。
を調製し、これらを鋳型としてｃＤＮＡライブラリ−を
作成する。ここで用いる細胞としては、任意に選択する
ことができるが、ヒトＦａｓ抗原を産生するのであれば
例えばヒトＴ腫瘍細胞株ＫＴ３を用いることができ、マ
ウスＦａｓ抗原を産生するのであれば例えばマウスマク
ロファ−ジＢＡＭ３を用いることができる。
【００２４】次いで、ｃＤＮＡライブラリ−からＦａｓ
抗原をコードするｃＤＮＡを含むクロ−ンを選択し、該
クロ−ンからＦａｓ抗原をコ−ドする全長ｃＤＮＡを取
得する。該全長ｃＤＮＡからＦａｓ抗原の細胞外領域を
実質的に構成するアミノ酸配列をコ−ドするｃＤＮＡフ
ラグメントを切り出し、適当なプラスミドに導入する。
抗原をコードするｃＤＮＡを含むクロ−ンを選択し、該
クロ−ンからＦａｓ抗原をコ−ドする全長ｃＤＮＡを取
得する。該全長ｃＤＮＡからＦａｓ抗原の細胞外領域を
実質的に構成するアミノ酸配列をコ−ドするｃＤＮＡフ
ラグメントを切り出し、適当なプラスミドに導入する。
【００２５】一方で、前記と同様にしてマウスインタ−
ロイキン−３レセプタ−βサブユニットＡＩＣ２Ａの細
胞外領域を実質的に構成するアミノ酸配列をコ−ドする
ｃＤＮＡフラグメントあるいはイムノグロブリンＨ鎖の
定常領域Ｆｃを実質的に構成するアミノ酸配列をコード
するｃＤＮＡフラグメントを取得する。
ロイキン−３レセプタ−βサブユニットＡＩＣ２Ａの細
胞外領域を実質的に構成するアミノ酸配列をコ−ドする
ｃＤＮＡフラグメントあるいはイムノグロブリンＨ鎖の
定常領域Ｆｃを実質的に構成するアミノ酸配列をコード
するｃＤＮＡフラグメントを取得する。
【００２６】Ｆａｓ抗原の細胞外領域を実質的に構成す
るアミノ酸配列をコ−ドするｃＤＮＡフラグメントの下
流に、挿入ＤＮＡ配列を介してまたは介さずにマウスイ
ンタ−ロイキン−３レセプタ−βサブユニットＡＩＣ２
Ａの細胞外領域を実質的に構成するアミノ酸配列をコ−
ドするｃＤＮＡフラグメントあるいはイムノグロブリン
Ｈ鎖の定常領域Ｆｃを実質的に構成するアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡフラグメントを導入するために、制
限酵素で開環したＦａｓ抗原の細胞外領域を実質的に構
成するアミノ酸配列をコ−ドするｃＤＮＡフラグメント
を導入した前記プラスミド、及び前記マウスインタ−ロ
イキン−３レセプタ−βサブユニットＡＩＣ２Ａの細胞
外領域を実質的に構成するアミノ酸配列をコ−ドするｃ
ＤＮＡフラグメントあるいはイムノグロブリンＨ鎖の定
常領域Ｆｃを実質的に構成するアミノ酸配列をコードす
るｃＤＮＡフラグメント、さらに挿入ＤＮＡ配列を介す
る場合には該挿入ＤＮＡ配列を、互いに連結可能なよう
にＤＮＡ末端を修飾した後、ＤＮＡ連結キットを用いて
常法により各ＤＮＡフラグメントを連結させ、Ｆａｓ抗
原とＡＩＣ２Ａとのキメラタンパクが産生可能に制御さ
れた発現ベクタ−を得る。
るアミノ酸配列をコ−ドするｃＤＮＡフラグメントの下
流に、挿入ＤＮＡ配列を介してまたは介さずにマウスイ
ンタ−ロイキン−３レセプタ−βサブユニットＡＩＣ２
Ａの細胞外領域を実質的に構成するアミノ酸配列をコ−
ドするｃＤＮＡフラグメントあるいはイムノグロブリン
Ｈ鎖の定常領域Ｆｃを実質的に構成するアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡフラグメントを導入するために、制
限酵素で開環したＦａｓ抗原の細胞外領域を実質的に構
成するアミノ酸配列をコ−ドするｃＤＮＡフラグメント
を導入した前記プラスミド、及び前記マウスインタ−ロ
イキン−３レセプタ−βサブユニットＡＩＣ２Ａの細胞
外領域を実質的に構成するアミノ酸配列をコ−ドするｃ
ＤＮＡフラグメントあるいはイムノグロブリンＨ鎖の定
常領域Ｆｃを実質的に構成するアミノ酸配列をコードす
るｃＤＮＡフラグメント、さらに挿入ＤＮＡ配列を介す
る場合には該挿入ＤＮＡ配列を、互いに連結可能なよう
にＤＮＡ末端を修飾した後、ＤＮＡ連結キットを用いて
常法により各ＤＮＡフラグメントを連結させ、Ｆａｓ抗
原とＡＩＣ２Ａとのキメラタンパクが産生可能に制御さ
れた発現ベクタ−を得る。
【００２７】次いで、この発現ベクタ−で適当な宿主細
胞を形質転換し、該形質転換細胞を培地中で培養し、培
養上清中よりキメラタンパクとしての可溶性Ｆａｓ抗原
を採取する。発現ベクターとしてはプラスミドベクター
を使用することができ、形質転換される細胞に適合し
て、また目的に応じて、試験研究あるいは工業分野にお
いて通常使用されるようなプラスミドから選択され、使
用され得る。例えば、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＣＥＶ４、ｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ及びｐＨβＡＰｒ−１等が使用され得る。
胞を形質転換し、該形質転換細胞を培地中で培養し、培
養上清中よりキメラタンパクとしての可溶性Ｆａｓ抗原
を採取する。発現ベクターとしてはプラスミドベクター
を使用することができ、形質転換される細胞に適合し
て、また目的に応じて、試験研究あるいは工業分野にお
いて通常使用されるようなプラスミドから選択され、使
用され得る。例えば、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＣＥＶ４、ｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ及びｐＨβＡＰｒ−１等が使用され得る。
【００２８】発現プロモ−タ−としては、形質転換され
る宿主細胞に適合して、また目的に応じて、試験研究あ
るいは工業分野において通常使用されるようなプロモ−
タ−から選択され、使用され得る。例えば、ＳＶ４０プ
ロモ−タ−、ＬＴＲプロモ−タ−、ＳＲαプロモ−タ
−、ＥＦ−１αプロモ−タ−、βアクチンプロモ−タ−
及びイムノグロブリンプロモ−タ−等が使用され得る。
る宿主細胞に適合して、また目的に応じて、試験研究あ
るいは工業分野において通常使用されるようなプロモ−
タ−から選択され、使用され得る。例えば、ＳＶ４０プ
ロモ−タ−、ＬＴＲプロモ−タ−、ＳＲαプロモ−タ
−、ＥＦ−１αプロモ−タ−、βアクチンプロモ−タ−
及びイムノグロブリンプロモ−タ−等が使用され得る。
【００２９】宿主細胞としては発現ベクターに適合し
て、また目的に応じて、試験研究あるいは工業分野にお
いて通常使用されるような、天然細胞あるいは人工的に
樹立された組換細胞に限定されない、動物細胞から選択
され、使用され得る。例えば、マウス由来細胞（ＣＯ
Ｐ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、Ｌ５１７８Ｙ及びＮＳ
−１等）、ラット由来細胞、ハムスタ−由来細胞（ＢＨ
Ｋ及びＣＨＯ等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ
３、ＣＯＳ７、ＣＶ１及びＶｅｌｏ等）及びヒト由来細
胞（Ｈｅｌａ、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエ
ロ−マ細胞及びＮａｍａｌｗａ等）等が使用され得る。
この中で好ましいは、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ３細胞、Ｃ
ＯＳ７細胞、ヒトの２倍体線維芽細胞に由来する細胞及
びミエロ−マ細胞等である。
て、また目的に応じて、試験研究あるいは工業分野にお
いて通常使用されるような、天然細胞あるいは人工的に
樹立された組換細胞に限定されない、動物細胞から選択
され、使用され得る。例えば、マウス由来細胞（ＣＯ
Ｐ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、Ｌ５１７８Ｙ及びＮＳ
−１等）、ラット由来細胞、ハムスタ−由来細胞（ＢＨ
Ｋ及びＣＨＯ等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ
３、ＣＯＳ７、ＣＶ１及びＶｅｌｏ等）及びヒト由来細
胞（Ｈｅｌａ、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエ
ロ−マ細胞及びＮａｍａｌｗａ等）等が使用され得る。
この中で好ましいは、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ３細胞、Ｃ
ＯＳ７細胞、ヒトの２倍体線維芽細胞に由来する細胞及
びミエロ−マ細胞等である。
【００３０】形質転換細胞の選択は、形質転換細胞に薬
剤耐性、温度感受性、栄養要求性あるいは放射線変異性
といった１あるいは複数の性質を持たせることにより慣
用の細胞選択手法を用いて行うことができる。本発明に
用いられる選択マ−カ−ＤＮＡとしては、目的に応じ
て、試験研究あるいは工業分野において通常使用される
ような選択マ−カ−ＤＮＡから選択され、使用され得
る。例えば、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性ＤＮＡ、テト
ラサイクリン（Ｔｃ）耐性ＤＮＡ、チミジンキナ−ゼ
（Ｔｋ）耐性ＤＮＡ、６−チオグアニン（ＨＧＰＲＴ）
耐性ＤＮＡ、ネオマイシン（Ｎｅｏ）耐性ＤＮＡ及びハ
イグロマイシン耐性ＤＮＡ等の薬剤耐性ＤＮＡ等が使用
され得る。
剤耐性、温度感受性、栄養要求性あるいは放射線変異性
といった１あるいは複数の性質を持たせることにより慣
用の細胞選択手法を用いて行うことができる。本発明に
用いられる選択マ−カ−ＤＮＡとしては、目的に応じ
て、試験研究あるいは工業分野において通常使用される
ような選択マ−カ−ＤＮＡから選択され、使用され得
る。例えば、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性ＤＮＡ、テト
ラサイクリン（Ｔｃ）耐性ＤＮＡ、チミジンキナ−ゼ
（Ｔｋ）耐性ＤＮＡ、６−チオグアニン（ＨＧＰＲＴ）
耐性ＤＮＡ、ネオマイシン（Ｎｅｏ）耐性ＤＮＡ及びハ
イグロマイシン耐性ＤＮＡ等の薬剤耐性ＤＮＡ等が使用
され得る。
【００３１】形質転換細胞の培養上清から目的の可溶性
Ｆａｓ抗原を精製単離する方法としては、得られた培養
物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を
得、該培養濾液から常法に従って精製単離することがで
きる。即ち、例えば、塩析、溶媒沈澱等の溶解度を利用
する方法、透析、限外濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
などの分子量を利用する方法、イオン交換クロマトグラ
フィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー等
の電荷を利用する方法、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、
等電点電気泳動などの等電点を利用する方法などが使用
され得る。
Ｆａｓ抗原を精製単離する方法としては、得られた培養
物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を
得、該培養濾液から常法に従って精製単離することがで
きる。即ち、例えば、塩析、溶媒沈澱等の溶解度を利用
する方法、透析、限外濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
などの分子量を利用する方法、イオン交換クロマトグラ
フィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー等
の電荷を利用する方法、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、
等電点電気泳動などの等電点を利用する方法などが使用
され得る。
【００３２】固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体及び標
識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体として用い
られるモノクローナル抗体は、既知のモノクローナル抗
体の一般的な製造方法によって製造することができる。
例えば、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリ
ドーマ（融合細胞）から製造することができる。すなわ
ち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハイブリドー
マを形成し、当該ハイブリドーマをクローン化し、例え
ばＦａｓ抗原を発現している天然の細胞あるいは人工的
に作製された形質転換細胞、又は前述のように精製、単
離された可溶性Ｆａｓ抗原を抗原として、それに対して
特異的親和性を示す抗体を産生するクローンを選択する
ことによって製造される。その操作は、免疫抗原として
前述のＦａｓ抗原発現細胞あるいはＦａｓ抗原を使用す
る以外は、従来既知の手段を用いることができる。
識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体として用い
られるモノクローナル抗体は、既知のモノクローナル抗
体の一般的な製造方法によって製造することができる。
例えば、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリ
ドーマ（融合細胞）から製造することができる。すなわ
ち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハイブリドー
マを形成し、当該ハイブリドーマをクローン化し、例え
ばＦａｓ抗原を発現している天然の細胞あるいは人工的
に作製された形質転換細胞、又は前述のように精製、単
離された可溶性Ｆａｓ抗原を抗原として、それに対して
特異的親和性を示す抗体を産生するクローンを選択する
ことによって製造される。その操作は、免疫抗原として
前述のＦａｓ抗原発現細胞あるいはＦａｓ抗原を使用す
る以外は、従来既知の手段を用いることができる。
【００３３】免疫される動物としては、マウス、ラッ
ト、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の哺乳動
物、好ましくはマウス、ラットまたはハムスターが示さ
れる。免疫は、免疫原をこれらの哺乳動物の皮下内、筋
肉内、静脈内、フッドパット内あるいは腹腔内に１乃至
数回注射するかあるいは移植することにより行われる。
ト、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の哺乳動
物、好ましくはマウス、ラットまたはハムスターが示さ
れる。免疫は、免疫原をこれらの哺乳動物の皮下内、筋
肉内、静脈内、フッドパット内あるいは腹腔内に１乃至
数回注射するかあるいは移植することにより行われる。
【００３４】通常、初回免疫から約１〜２週間毎に１〜
４度免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行
って、該最終免疫より約３〜５日後に免疫感作された動
物から抗体産生細胞が採取される。モノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミル
シュタインらの方法（Nature, Vol.256, pp.495-497,
1975）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことがで
きる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、前述
の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ
節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗
体産生細胞と、好ましくは同種のマウス、ラット、モル
モット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、
より好ましくはマウス、ラットまたはヒトの骨髄腫系細
胞（ミエローマ）との融合により得られる融合細胞（ハ
イブリドーマ）を培養することにより調製される。培養
は、インビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、
ハムスターもしくはウサギ等の哺乳動物、好ましくはマ
ウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等で
のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれ該培養上
清、または哺乳動物の腹水から取得することができる。
４度免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行
って、該最終免疫より約３〜５日後に免疫感作された動
物から抗体産生細胞が採取される。モノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミル
シュタインらの方法（Nature, Vol.256, pp.495-497,
1975）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことがで
きる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、前述
の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ
節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗
体産生細胞と、好ましくは同種のマウス、ラット、モル
モット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、
より好ましくはマウス、ラットまたはヒトの骨髄腫系細
胞（ミエローマ）との融合により得られる融合細胞（ハ
イブリドーマ）を培養することにより調製される。培養
は、インビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、
ハムスターもしくはウサギ等の哺乳動物、好ましくはマ
ウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等で
のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれ該培養上
清、または哺乳動物の腹水から取得することができる。
【００３５】細胞融合に用いられる骨髄腫系細胞として
は、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8、P3/NS1/1
-Ag4-1（NS-1と略す）、P3/X63-Ag8.U1 、SP2/0-Ag14、
F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ21ORCY3-Ag1.
2.3、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、
UC729-6、CEM-AGR、DIR11あるいはCEM-T15を挙げること
ができる。
は、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8、P3/NS1/1
-Ag4-1（NS-1と略す）、P3/X63-Ag8.U1 、SP2/0-Ag14、
F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ21ORCY3-Ag1.
2.3、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、
UC729-6、CEM-AGR、DIR11あるいはCEM-T15を挙げること
ができる。
【００３６】モノクローナル抗体を産生する融合細胞ク
ローンのスクリーニングは、融合細胞を、例えばマイク
ロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウエル
の培養上清の抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥ
ＬＩＳＡ等の酵素抗体法によって測定することにより行
うことができる。
ローンのスクリーニングは、融合細胞を、例えばマイク
ロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウエル
の培養上清の抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥ
ＬＩＳＡ等の酵素抗体法によって測定することにより行
うことができる。
【００３７】モノクローナル抗体の精製、単離は、上述
のような方法によって取得される本発明のモノクローナ
ル抗体を含有する血清あるいは腹水をイオン交換クロマ
トグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２など）、抗イム
ノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のア
フィニティーカラムクロマトグラフィーに付することに
より行うことができる。
のような方法によって取得される本発明のモノクローナ
ル抗体を含有する血清あるいは腹水をイオン交換クロマ
トグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２など）、抗イム
ノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のア
フィニティーカラムクロマトグラフィーに付することに
より行うことができる。
【００３８】本発明に用いられる抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩ
ｇＥのいずれかのイムノグロブリンクラスに属するモノ
クローナル抗体を用いることが好ましい。この中で特に
好ましいのは、ＩｇＧまたはＩｇＭである。
ル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩ
ｇＥのいずれかのイムノグロブリンクラスに属するモノ
クローナル抗体を用いることが好ましい。この中で特に
好ましいのは、ＩｇＧまたはＩｇＭである。
【００３９】本発明の可溶性Ｆａｓ抗原の測定方法にお
いては、上述のようにして調製された抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体から、測定の目的あるいは条件に応じ、少な
くとも２種類のモノクローナル抗体を適宜選択して使用
することができるが、不溶性支持体に結合させるモノク
ローナル抗体と、標識されるもう１つのモノクローナル
抗体は、通常、それぞれ異なる抗原決定基を認識するも
のを用いるのが望ましい。但し、同じ抗原決定基が可溶
性Ｆａｓ抗原の２箇所に存在する場合には、同じ抗原決
定基を認識するものであってもよい。
いては、上述のようにして調製された抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体から、測定の目的あるいは条件に応じ、少な
くとも２種類のモノクローナル抗体を適宜選択して使用
することができるが、不溶性支持体に結合させるモノク
ローナル抗体と、標識されるもう１つのモノクローナル
抗体は、通常、それぞれ異なる抗原決定基を認識するも
のを用いるのが望ましい。但し、同じ抗原決定基が可溶
性Ｆａｓ抗原の２箇所に存在する場合には、同じ抗原決
定基を認識するものであってもよい。
【００４０】具体的には、例えば、インターナショナル
・イムノロジー（International Immunology）第６巻、
No.12 、第１８４９〜１８５６頁（１９９４年）におけ
る米原らの報告、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディシン（Journal ofExperimental Medicine）
第１６９巻、第１７４７〜１７５６頁（１９８９年）に
おける報告、セル（Cell）第６６巻、第２３３〜２４３
頁（１９９１年）における報告及び後述の実施例に記載
されている抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマであるクローンＺＢ４（ＩｇＧ）、ＵＢ２（Ｉ
ｇＧ）、ＷＢ３（ＩｇＧ）、ＶＢ３（ＩｇＧ）、ＣＢＥ
（ＩｇＧ），ＪＡＥ（ＩｇＭ）、ＡＸ６（ＩｇＭ）ある
いはＣＨ１１（ＩｇＭ）等より産生されるモノクローナ
ル抗体から選択して用いることができる。
・イムノロジー（International Immunology）第６巻、
No.12 、第１８４９〜１８５６頁（１９９４年）におけ
る米原らの報告、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディシン（Journal ofExperimental Medicine）
第１６９巻、第１７４７〜１７５６頁（１９８９年）に
おける報告、セル（Cell）第６６巻、第２３３〜２４３
頁（１９９１年）における報告及び後述の実施例に記載
されている抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマであるクローンＺＢ４（ＩｇＧ）、ＵＢ２（Ｉ
ｇＧ）、ＷＢ３（ＩｇＧ）、ＶＢ３（ＩｇＧ）、ＣＢＥ
（ＩｇＧ），ＪＡＥ（ＩｇＭ）、ＡＸ６（ＩｇＭ）ある
いはＣＨ１１（ＩｇＭ）等より産生されるモノクローナ
ル抗体から選択して用いることができる。
【００４１】具体的な組合せの一例としては、固相化抗
Ｆａｓモノクローナル抗体を調製するためのモノクロー
ナル抗体としてクローンＣＢＥから得られるモノクロー
ナル抗体を、標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル
抗体を調製するためのモノクローナル抗体としてクロー
ンＶＢ３から得られるモノクローナル抗体を使用するこ
とができる。
Ｆａｓモノクローナル抗体を調製するためのモノクロー
ナル抗体としてクローンＣＢＥから得られるモノクロー
ナル抗体を、標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル
抗体を調製するためのモノクローナル抗体としてクロー
ンＶＢ３から得られるモノクローナル抗体を使用するこ
とができる。
【００４２】固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体に関
し、モノクローナル抗体が結合される不溶性支持体とし
ては、例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹
脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等のプラスチックや、
ガラスといった水に不溶性の物質が該当する。この不溶
性支持体への担持は単なる物理吸着でもよく、化学的な
結合でもよい。
し、モノクローナル抗体が結合される不溶性支持体とし
ては、例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹
脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等のプラスチックや、
ガラスといった水に不溶性の物質が該当する。この不溶
性支持体への担持は単なる物理吸着でもよく、化学的な
結合でもよい。
【００４３】標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル
抗体に関し、標識物質としてはペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ等の各種酵素やアイソトープの
他、より高い感度を得る方法としてビオチン化抗体を反
応させた後にアビジンペルオキシダーゼを反応させる方
法も用いることができる。また、放射性元素を標識物質
として用いれば、ＲＩＡ法により可溶性Ｆａｓ抗原の濃
度を測定することができる。この場合、管理された施設
において資格を有するものにより行うことが必要とな
る。
抗体に関し、標識物質としてはペルオキシダーゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ等の各種酵素やアイソトープの
他、より高い感度を得る方法としてビオチン化抗体を反
応させた後にアビジンペルオキシダーゼを反応させる方
法も用いることができる。また、放射性元素を標識物質
として用いれば、ＲＩＡ法により可溶性Ｆａｓ抗原の濃
度を測定することができる。この場合、管理された施設
において資格を有するものにより行うことが必要とな
る。
【００４４】このように固相化抗Ｆａｓモノクローナル
抗体及び標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体
を用いることによって、臨床の現場においても特異的
に、また、容易に検体中の可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測
定することができる。
抗体及び標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体
を用いることによって、臨床の現場においても特異的
に、また、容易に検体中の可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測
定することができる。
【００４５】
【実施例】以下、本発明をその好適な実施例により更に
詳細に説明する。 ［実施例１］標準物質可溶性Ｆａｓ抗原の調製 標準物質（スタンダード）として用いる可溶性Ｆａｓ抗
原は、下記のように調製した。即ち、後述する参考例１
に従って調製した形質転換細胞ＪＭ１０９（寄託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４４３６）から、プラスミドｐＭＥ１８
Ｓ／ｈＦａｓ・ＥＸＴ−ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴを取り出
し、ジーンパルサー（バイオラッド社（製）のキット）
を用いて、ｐＭＡＭneo （クローンテック社（製））と
ともにＬ５１７８Ｙ細胞にエレクトロポレーション法に
より共形質転換した。該細胞をＧ４１８含有培地中で培
養し、Ｇ４１８耐性クローンを選別することにより可溶
性ヒトＦａｓ抗原発現クローンを得た。選別されたクロ
ーンを、１０％ウマ血清含有フィッシャー培地を用いて
大量培養し、培養上清を回収・濃縮し、Ｑセファロース
（ファルマシア社（製））を用いたカラムクロマトグラ
フィーにより、標準物質としてのキメラ可溶性Ｆａｓ抗
原を取得した。 ［実施例２］抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の製造 （２−１）抗体産生細胞の調製 ヒトＦａｓ抗原を発現しているヒト２倍体線維芽細胞Ｆ
Ｓ−７細胞株を用いてＢａｌｂ／ｃ雌マウスを免疫感作
させた。感作マウスを開腹し脾臓を摘出し、無血清ＲＰ
ＭＩ１６４０培養液中でステンレスメッシュ上ですりつ
ぶした後、脾臓細胞液を遠心分離（１５００ｒｐｍで７
分間）した。遠心残査を回収し、無血清ＲＰＭＩ１６４
０培養液に懸濁させた。さらに、無血清ＲＰＭＩ１６４
０培養液で２回洗浄し、抗体産生マウス脾臓細胞を取得
した。 （２−２）マウスミエロ−マ細胞の調製 マウスミエロ−マ細胞ＮＳ−１（ATCC TIB18）を、３７
℃、５％ＣＯ2 下、１０％ＦＣＳ及び５０Ｕ／ｍｌのカ
ナマイシン含有ＡＳＦ−１０４培地（味の素社（製））
中で培養した。 （２−３）モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マの調
製 無血清ＲＰＭＩ１６４０培養液で洗浄したマウスミエロ
−マ細胞ＮＳ−１細胞と前述のように調製したマウス脾
臓細胞を混合した無血清ＲＰＭＩ１６４０溶液を遠心分
離（１０００ｒｐｍで１０分間）し、遠心残査を回収
し、ヘルツェンバ−グ（Herzenberg, L. A. ）らの方法
（セレクテッド・メソッズ・イン・セリュラー・イムノ
ロジー（ Selected Methods in Cellular Immunology）
第３５１頁（１９８０年））に従って細胞融合を行な
い、複数のハイブリド−マのコロニ−を得た。
詳細に説明する。 ［実施例１］標準物質可溶性Ｆａｓ抗原の調製 標準物質（スタンダード）として用いる可溶性Ｆａｓ抗
原は、下記のように調製した。即ち、後述する参考例１
に従って調製した形質転換細胞ＪＭ１０９（寄託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４４３６）から、プラスミドｐＭＥ１８
Ｓ／ｈＦａｓ・ＥＸＴ−ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴを取り出
し、ジーンパルサー（バイオラッド社（製）のキット）
を用いて、ｐＭＡＭneo （クローンテック社（製））と
ともにＬ５１７８Ｙ細胞にエレクトロポレーション法に
より共形質転換した。該細胞をＧ４１８含有培地中で培
養し、Ｇ４１８耐性クローンを選別することにより可溶
性ヒトＦａｓ抗原発現クローンを得た。選別されたクロ
ーンを、１０％ウマ血清含有フィッシャー培地を用いて
大量培養し、培養上清を回収・濃縮し、Ｑセファロース
（ファルマシア社（製））を用いたカラムクロマトグラ
フィーにより、標準物質としてのキメラ可溶性Ｆａｓ抗
原を取得した。 ［実施例２］抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の製造 （２−１）抗体産生細胞の調製 ヒトＦａｓ抗原を発現しているヒト２倍体線維芽細胞Ｆ
Ｓ−７細胞株を用いてＢａｌｂ／ｃ雌マウスを免疫感作
させた。感作マウスを開腹し脾臓を摘出し、無血清ＲＰ
ＭＩ１６４０培養液中でステンレスメッシュ上ですりつ
ぶした後、脾臓細胞液を遠心分離（１５００ｒｐｍで７
分間）した。遠心残査を回収し、無血清ＲＰＭＩ１６４
０培養液に懸濁させた。さらに、無血清ＲＰＭＩ１６４
０培養液で２回洗浄し、抗体産生マウス脾臓細胞を取得
した。 （２−２）マウスミエロ−マ細胞の調製 マウスミエロ−マ細胞ＮＳ−１（ATCC TIB18）を、３７
℃、５％ＣＯ2 下、１０％ＦＣＳ及び５０Ｕ／ｍｌのカ
ナマイシン含有ＡＳＦ−１０４培地（味の素社（製））
中で培養した。 （２−３）モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マの調
製 無血清ＲＰＭＩ１６４０培養液で洗浄したマウスミエロ
−マ細胞ＮＳ−１細胞と前述のように調製したマウス脾
臓細胞を混合した無血清ＲＰＭＩ１６４０溶液を遠心分
離（１０００ｒｐｍで１０分間）し、遠心残査を回収
し、ヘルツェンバ−グ（Herzenberg, L. A. ）らの方法
（セレクテッド・メソッズ・イン・セリュラー・イムノ
ロジー（ Selected Methods in Cellular Immunology）
第３５１頁（１９８０年））に従って細胞融合を行な
い、複数のハイブリド−マのコロニ−を得た。
【００４６】抗ヒトＦａｓモノクロ−ナル抗体を産生し
ているハイブリド−マをスクリ−ニングするため、Ｆａ
ｓ抗原を発現しているヒト胸腺細胞に対する各ハイブリ
ド−マコロニ−の培養上清の反応性をフロ−サイトメ−
タ−により測定し、抗ヒトＦａｓモノクロ−ナル抗体を
産生しているハイブリド−マクローンＣＨ１１（Ｉｇ
Ｍ）を取得した。 （２−４）抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の取得 ハイブリドーマクローンＣＨ１１（２×１０8 個）を無
血清ＡＳＦ１０４培地（味の素社（製））中、３７℃で
５日間培養し、得られた培養上清をオメガセル（フィル
トロン社（製））で超遠心した。遠心上清を回収し、ヒ
ドロキシルアパタイトカラム（アサヒ光学社（製））に
供した。ＦＰＬＣシステム（ファルマシアファインケミ
カル社（製））を用いて、リン酸ナトリウム（ｐＨ７．
４、１０〜４００ｍＭ）で溶出させた。
ているハイブリド−マをスクリ−ニングするため、Ｆａ
ｓ抗原を発現しているヒト胸腺細胞に対する各ハイブリ
ド−マコロニ−の培養上清の反応性をフロ−サイトメ−
タ−により測定し、抗ヒトＦａｓモノクロ−ナル抗体を
産生しているハイブリド−マクローンＣＨ１１（Ｉｇ
Ｍ）を取得した。 （２−４）抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の取得 ハイブリドーマクローンＣＨ１１（２×１０8 個）を無
血清ＡＳＦ１０４培地（味の素社（製））中、３７℃で
５日間培養し、得られた培養上清をオメガセル（フィル
トロン社（製））で超遠心した。遠心上清を回収し、ヒ
ドロキシルアパタイトカラム（アサヒ光学社（製））に
供した。ＦＰＬＣシステム（ファルマシアファインケミ
カル社（製））を用いて、リン酸ナトリウム（ｐＨ７．
４、１０〜４００ｍＭ）で溶出させた。
【００４７】溶出画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供
し、９５％以上の純度で精製された（ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）第
１６９巻、第１７４７〜１７５６頁（１９８９年）にお
ける報告を参照）。更に、以下のようにして別の抗ヒト
Ｆａｓモノクローナル抗体を調製した。 （２−５）免疫感作抗原の調製 ヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＦ５８
をＸｈｏＩで消化して得たヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡを含
有するフラグメントを、発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ
（ヌクレイック・アシド・リサーチ（Nucl. Acid Res.
）第１８巻、第５３２２頁における報告を参照）に、
ＢｓｔＸＩアダプターを用いて導入し、発現プラスミド
ｐＥＦＦ５８を得た。
し、９５％以上の純度で精製された（ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン（J. Exp. Med.）第
１６９巻、第１７４７〜１７５６頁（１９８９年）にお
ける報告を参照）。更に、以下のようにして別の抗ヒト
Ｆａｓモノクローナル抗体を調製した。 （２−５）免疫感作抗原の調製 ヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＦ５８
をＸｈｏＩで消化して得たヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡを含
有するフラグメントを、発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ
（ヌクレイック・アシド・リサーチ（Nucl. Acid Res.
）第１８巻、第５３２２頁における報告を参照）に、
ＢｓｔＸＩアダプターを用いて導入し、発現プラスミド
ｐＥＦＦ５８を得た。
【００４８】ＶｓｐＩで消化した２５μｇ／ｍｌのｐＥ
ＦＦ５８フラグメントとＥｃｏＲＩで消化した２．５μ
ｇ／ｍｌのｐＭＡＭneo （クローンテック社（製））フ
ラグメントを用いて、１×１０7 個（０．８ｍｌ）マウ
スＴリンパ腫ＷＲ１９Ｌ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ５２）
にエレクトロポレーション法により共形質転換した。該
細胞をＧ４１８を含む培地中で培養してＧ４１８耐性ク
ローンを選別した。得られたＧ４１８耐性クローンをフ
ローサイトメーター及び限界希釈法で分析することによ
り、ヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ１
２ａをクローン化した（セル（cell）第６６巻、第２３
３〜２４３頁（１９９１年）における報告を参照）。
ＦＦ５８フラグメントとＥｃｏＲＩで消化した２．５μ
ｇ／ｍｌのｐＭＡＭneo （クローンテック社（製））フ
ラグメントを用いて、１×１０7 個（０．８ｍｌ）マウ
スＴリンパ腫ＷＲ１９Ｌ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ５２）
にエレクトロポレーション法により共形質転換した。該
細胞をＧ４１８を含む培地中で培養してＧ４１８耐性ク
ローンを選別した。得られたＧ４１８耐性クローンをフ
ローサイトメーター及び限界希釈法で分析することによ
り、ヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ１
２ａをクローン化した（セル（cell）第６６巻、第２３
３〜２４３頁（１９９１年）における報告を参照）。
【００４９】ＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞をホモジナイズし、
遠心分離して、形質膜画分を取得し、免疫抗原とした。 （２−６）抗体産生細胞の調製 ヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ１２ａ
の形質膜画分をＢａｌｂ／Ｃマウスに免疫し、前述と同
様にして、抗体産生マウス脾臓細胞を取得した。 （２−７）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調
製 マウスミエローマＮＳ−１細胞と得られたマウス脾臓細
胞とを用い、前述と同様にして、複数のハイブリドーマ
クローンを得、７つの抗ヒトＦａｓ抗体産生ハイブリド
ーマクローンＺＢ４（ＩｇＧ）、ＵＢ２（ＩｇＧ）、Ｖ
Ｂ３（ＩｇＧ）、ＣＢＥ（ＩｇＧ）、ＷＢ３（Ｉｇ
Ｇ）、ＡＸ６（ＩｇＭ）及びＪＡＥ（ＩｇＭ）を得た
（尚、これらのハイブリドーマクローンは（株）医学生
物学研究所により市販されている）。 （２−８）抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の取得 前述と同様にして、得られた各々のハイブリドーマクロ
ーンから、７種類の抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体を
精製、取得した（インターナショナル・イムノロジー
（International Immunology）第６巻、No.12 、第１８
４９〜１８５６頁（１９９４年）における報告を参
照）。 ［実施例３］可溶性Ｆａｓ抗原の測定−その１ （３−１）不溶性支持体への固相化（マイクロプレート
型試薬の作製） クローンＣＢＥのモノクローナル抗体ＩｇＧ分画を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１％アジ化ナトリ
ウム加）に溶解し、濃度０．００５ｍｇ／ｍｌに調整し
た。この液を９６穴マイクロプレート（ヌンク社（製）
マキシソープ）の各ウエルに１００μｌづつ添加し、４
℃で約１８時間静置してモノクローナル抗体を結合させ
た。
遠心分離して、形質膜画分を取得し、免疫抗原とした。 （２−６）抗体産生細胞の調製 ヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ１２ａ
の形質膜画分をＢａｌｂ／Ｃマウスに免疫し、前述と同
様にして、抗体産生マウス脾臓細胞を取得した。 （２−７）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調
製 マウスミエローマＮＳ−１細胞と得られたマウス脾臓細
胞とを用い、前述と同様にして、複数のハイブリドーマ
クローンを得、７つの抗ヒトＦａｓ抗体産生ハイブリド
ーマクローンＺＢ４（ＩｇＧ）、ＵＢ２（ＩｇＧ）、Ｖ
Ｂ３（ＩｇＧ）、ＣＢＥ（ＩｇＧ）、ＷＢ３（Ｉｇ
Ｇ）、ＡＸ６（ＩｇＭ）及びＪＡＥ（ＩｇＭ）を得た
（尚、これらのハイブリドーマクローンは（株）医学生
物学研究所により市販されている）。 （２−８）抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の取得 前述と同様にして、得られた各々のハイブリドーマクロ
ーンから、７種類の抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体を
精製、取得した（インターナショナル・イムノロジー
（International Immunology）第６巻、No.12 、第１８
４９〜１８５６頁（１９９４年）における報告を参
照）。 ［実施例３］可溶性Ｆａｓ抗原の測定−その１ （３−１）不溶性支持体への固相化（マイクロプレート
型試薬の作製） クローンＣＢＥのモノクローナル抗体ＩｇＧ分画を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１％アジ化ナトリ
ウム加）に溶解し、濃度０．００５ｍｇ／ｍｌに調整し
た。この液を９６穴マイクロプレート（ヌンク社（製）
マキシソープ）の各ウエルに１００μｌづつ添加し、４
℃で約１８時間静置してモノクローナル抗体を結合させ
た。
【００５０】抗体結合後ウエル内のモノクローナル溶液
を除き、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と５％ショ
糖を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３００μｌを
加えて４℃で約２４時間静置反応させ、マイクロプレー
トのウエルの未反応部分をブロックした。このブロッキ
ングは標識抗体等がマイクロプレートの壁面に吸着され
ないようにして、測定系の定量性が損なわれないように
するためである。ブロッキングの後ウエル内のブロッキ
ング液を除き、室温で完全に風乾させ、マイクロプレー
ト型試薬（固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体）を得
た。 （３−２）標識モノクローナル抗体の作製 クローンＶＢ３のモノクローナル抗体ＩｇＧ分画５ｍｇ
を採り、このＩｇＧ分画にジャーナル・オブ・ヒストケ
ミストリー・アンド・サイトケミストリー（J.Histoche
m. Cytochem）第２２巻、第１０８４頁（１９７４年）
に従い、過ヨウ素酸法によりＰＯＤ［Horse radish per
oxidase：シグマ社（製）］を結合させて、ペルオキシ
ダーゼ標識モノクローナル抗体（標識された第２の抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体）を得た。 （３−３）可溶性Ｆａｓ抗原の測定 上記（３−１）及び（３−２）において作製した各試薬
を用いた測定法について説明する。 （３−３−１）検体、標準可溶性Ｆａｓ抗原の調製 血清をＰＢＳで５０倍希釈し、検体とした。同時に実施
例１で調製して作製した標準可溶性Ｆａｓ抗原を同様に
希釈して標準液とした。検体中の可溶性Ｆａｓ抗原の量
が多く、検出限界を越えるような場合にはＰＢＳを用い
て検体を測定範囲内にはいるように希釈し、その希釈検
体の定量値に希釈倍数を乗じて検体中の可溶性Ｆａｓ抗
原の濃度とした。 （３−３−２）マイクロプレート型試薬と検体中の可溶
性Ｆａｓ抗原との抗原抗体反応 上記（３−１）にて作製したマイクロプレート型試薬に
（３−３−１）で調製した検体及び標準液を１ウエルに
１００μｌずつ分注した。同時にＰＢＳのみを１００μ
ｌ分注し、盲検とした。以上の反応系を室温にて１時間
静置した。反応終了後５％ＰＢＳで３回洗浄後、同緩衝
液をよく取り除いた。 （３−３−３）マイクロプレート型試薬と検体中の可溶
性Ｆａｓ抗原との結合物へのペルオキシダーゼ標識抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体の結合 上記（３−２）で作製したペルオキシダーゼ標識抗Ｆａ
ｓモノクローナル抗体を０．１％ＢＳＡ、０．１５Ｍ
ＮａＣｌを添加した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）にて２５０〜１０００倍に希釈し、（３
−３−２）で抗原抗体反応させたマイクロプレートに各
ウエル１００μｌずつ分注し室温にて１時間静置後、Ｐ
ＢＳにて３回洗浄後、同緩衝液を除いた。 （３−３−４）発色反応 テトラメチルベンチジン２塩酸塩（シグマ社（製））を
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、１．
６ｍＭの溶液を作製した。この溶液と過酸化水素を１０
ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で希釈して１０ｍＭ
とした溶液とを等量混合し、酵素基質液とした。
を除き、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と５％ショ
糖を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３００μｌを
加えて４℃で約２４時間静置反応させ、マイクロプレー
トのウエルの未反応部分をブロックした。このブロッキ
ングは標識抗体等がマイクロプレートの壁面に吸着され
ないようにして、測定系の定量性が損なわれないように
するためである。ブロッキングの後ウエル内のブロッキ
ング液を除き、室温で完全に風乾させ、マイクロプレー
ト型試薬（固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体）を得
た。 （３−２）標識モノクローナル抗体の作製 クローンＶＢ３のモノクローナル抗体ＩｇＧ分画５ｍｇ
を採り、このＩｇＧ分画にジャーナル・オブ・ヒストケ
ミストリー・アンド・サイトケミストリー（J.Histoche
m. Cytochem）第２２巻、第１０８４頁（１９７４年）
に従い、過ヨウ素酸法によりＰＯＤ［Horse radish per
oxidase：シグマ社（製）］を結合させて、ペルオキシ
ダーゼ標識モノクローナル抗体（標識された第２の抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体）を得た。 （３−３）可溶性Ｆａｓ抗原の測定 上記（３−１）及び（３−２）において作製した各試薬
を用いた測定法について説明する。 （３−３−１）検体、標準可溶性Ｆａｓ抗原の調製 血清をＰＢＳで５０倍希釈し、検体とした。同時に実施
例１で調製して作製した標準可溶性Ｆａｓ抗原を同様に
希釈して標準液とした。検体中の可溶性Ｆａｓ抗原の量
が多く、検出限界を越えるような場合にはＰＢＳを用い
て検体を測定範囲内にはいるように希釈し、その希釈検
体の定量値に希釈倍数を乗じて検体中の可溶性Ｆａｓ抗
原の濃度とした。 （３−３−２）マイクロプレート型試薬と検体中の可溶
性Ｆａｓ抗原との抗原抗体反応 上記（３−１）にて作製したマイクロプレート型試薬に
（３−３−１）で調製した検体及び標準液を１ウエルに
１００μｌずつ分注した。同時にＰＢＳのみを１００μ
ｌ分注し、盲検とした。以上の反応系を室温にて１時間
静置した。反応終了後５％ＰＢＳで３回洗浄後、同緩衝
液をよく取り除いた。 （３−３−３）マイクロプレート型試薬と検体中の可溶
性Ｆａｓ抗原との結合物へのペルオキシダーゼ標識抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体の結合 上記（３−２）で作製したペルオキシダーゼ標識抗Ｆａ
ｓモノクローナル抗体を０．１％ＢＳＡ、０．１５Ｍ
ＮａＣｌを添加した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）にて２５０〜１０００倍に希釈し、（３
−３−２）で抗原抗体反応させたマイクロプレートに各
ウエル１００μｌずつ分注し室温にて１時間静置後、Ｐ
ＢＳにて３回洗浄後、同緩衝液を除いた。 （３−３−４）発色反応 テトラメチルベンチジン２塩酸塩（シグマ社（製））を
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、１．
６ｍＭの溶液を作製した。この溶液と過酸化水素を１０
ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で希釈して１０ｍＭ
とした溶液とを等量混合し、酵素基質液とした。
【００５１】この酵素基質液を、（３−３−３）におい
てペルオキシダーゼ標識抗Ｆａｓモノクローナル抗体で
処理したマイクロプレートへ、１ウエルにつき１００μ
ｌずつ分注し、室温にて１０〜２０分間静置後、１．５
Ｎリン酸を１ウエルにつき１００μｌずつ分注し、ｐＨ
を下げることによりペルオキシダーゼの酵素活性を停止
させた。
てペルオキシダーゼ標識抗Ｆａｓモノクローナル抗体で
処理したマイクロプレートへ、１ウエルにつき１００μ
ｌずつ分注し、室温にて１０〜２０分間静置後、１．５
Ｎリン酸を１ウエルにつき１００μｌずつ分注し、ｐＨ
を下げることによりペルオキシダーゼの酵素活性を停止
させた。
【００５２】こうしてマイクロプレートの各ウエルに生
じた発色の程度は、吸光度計（東ソー社（製）ＭＰＲ−
Ａ４）にて波長４５０ｎｍでの吸光度を測定することに
より検出した。この吸光度から検体中の可溶性Ｆａｓ抗
原の濃度が分かる。吸光度から濃度を求めるには、次に
示すごとく検量線を作製して求めた。 （３−３−５）検量線の作成 （３−３−１）において作製した可溶性Ｆａｓ抗原に対
して、上記マイクロプレート型試薬を用いた検出を行な
い、吸光度を測定した。その結果を表１及び図１に示
す。
じた発色の程度は、吸光度計（東ソー社（製）ＭＰＲ−
Ａ４）にて波長４５０ｎｍでの吸光度を測定することに
より検出した。この吸光度から検体中の可溶性Ｆａｓ抗
原の濃度が分かる。吸光度から濃度を求めるには、次に
示すごとく検量線を作製して求めた。 （３−３−５）検量線の作成 （３−３−１）において作製した可溶性Ｆａｓ抗原に対
して、上記マイクロプレート型試薬を用いた検出を行な
い、吸光度を測定した。その結果を表１及び図１に示
す。
【００５３】
【表１】
【００５４】（３−３−６）検体の定量 上記の試薬及び測定方法により、ＳＬＥ患者５０名、Ｒ
Ａ患者５０名、正常人２００名より常法によって採取し
た血清を検体とし、（３−３−１）から（３−３−５）
に従い測定した結果を表２に示す。
Ａ患者５０名、正常人２００名より常法によって採取し
た血清を検体とし、（３−３−１）から（３−３−５）
に従い測定した結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】表２からも分かるように、可溶性Ｆａｓ抗
原の含有量が特異的に多いＳＬＥ患者において測定値が
顕著な高濃度を示すことが分かる。従って、本実施例の
試薬を用い、本実施例の測定法を実施すれば、臨床現場
でも容易に可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測定でき、ＳＬＥ
等の自己免疫疾患の患者の発見が迅速にできる。
原の含有量が特異的に多いＳＬＥ患者において測定値が
顕著な高濃度を示すことが分かる。従って、本実施例の
試薬を用い、本実施例の測定法を実施すれば、臨床現場
でも容易に可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測定でき、ＳＬＥ
等の自己免疫疾患の患者の発見が迅速にできる。
【００５７】尚、放射性元素を標識物として用いれば、
ＲＩＡ法により可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測定すること
ができる。この場合、管理された施設において資格を有
するものにより行うことが必要となる。 ［実施例４］ 可溶性Ｆａｓ抗原の測定−その２ 標準物質可溶性Ｆａｓ抗原の調製は実施例１と同様にし
て行い、また、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の製造
は実施例２と同様にして行った。 （４−１）不溶性支持体への固相化（マイクロプレート
型試薬の作製） クローンＣＢＥのモノクローナル抗体ＩｇＧ分画を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１％アジ化ナトリ
ウム加）に溶解し、濃度０．０１５ｍｇ／ｍｌに調整し
た。この液を９６穴マイクロプレート（ヌンク社（製）
マキシソープ）の各ウエルに１００μｌづつ添加し、４
℃で約１８時間静置してモノクローナル抗体を結合させ
た。
ＲＩＡ法により可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測定すること
ができる。この場合、管理された施設において資格を有
するものにより行うことが必要となる。 ［実施例４］ 可溶性Ｆａｓ抗原の測定−その２ 標準物質可溶性Ｆａｓ抗原の調製は実施例１と同様にし
て行い、また、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の製造
は実施例２と同様にして行った。 （４−１）不溶性支持体への固相化（マイクロプレート
型試薬の作製） クローンＣＢＥのモノクローナル抗体ＩｇＧ分画を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１％アジ化ナトリ
ウム加）に溶解し、濃度０．０１５ｍｇ／ｍｌに調整し
た。この液を９６穴マイクロプレート（ヌンク社（製）
マキシソープ）の各ウエルに１００μｌづつ添加し、４
℃で約１８時間静置してモノクローナル抗体を結合させ
た。
【００５８】抗体結合後ウエル内のモノクローナル溶液
を除き、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１０％シ
ョ糖を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３００μｌ
を加えて３７℃で２時間静置反応させ、マイクロプレー
トのウエルの未反応部分をブロックした。このブロッキ
ングは標識抗体等がマイクロプレートの壁面に吸着され
ないようにして、測定系の定量性が損なわれないように
するためである。
を除き、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１０％シ
ョ糖を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３００μｌ
を加えて３７℃で２時間静置反応させ、マイクロプレー
トのウエルの未反応部分をブロックした。このブロッキ
ングは標識抗体等がマイクロプレートの壁面に吸着され
ないようにして、測定系の定量性が損なわれないように
するためである。
【００５９】ブロッキングの後ウエル内のブロッキング
液を除き、室温で完全に風乾させ、マイクロプレート型
試薬（固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体）を得た。 （４−２）標識モノクローナル抗体の作製 クローンＶＢ３のモノクローナル抗体ＩｇＧ分画を０．
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）に透析し、蛋白濃度を５
ｍｇ／ｍｌとなるように調製した後、総蛋白量の３％の
ペプシンを加えて、３７℃で一晩撹拌し反応を行なっ
た。２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を適量加えて
反応を停止させた後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有す
る０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウ
ルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社（製））カラム（２．
０×６０ｃｍ）でゲル濾過を行ない、Ｆ（ａｂ’）２分
画２．５ｍｇを得た。
液を除き、室温で完全に風乾させ、マイクロプレート型
試薬（固相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体）を得た。 （４−２）標識モノクローナル抗体の作製 クローンＶＢ３のモノクローナル抗体ＩｇＧ分画を０．
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）に透析し、蛋白濃度を５
ｍｇ／ｍｌとなるように調製した後、総蛋白量の３％の
ペプシンを加えて、３７℃で一晩撹拌し反応を行なっ
た。２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を適量加えて
反応を停止させた後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有す
る０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウ
ルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社（製））カラム（２．
０×６０ｃｍ）でゲル濾過を行ない、Ｆ（ａｂ’）２分
画２．５ｍｇを得た。
【００６０】スクシミジル4-（N-マレイミドメチル）-
シクロヘキサン-1-カルボキシレート［Succimidyl 4-(N
-maleimi-domethyl)-cyclohexan-1-carboxylate：ジー
ベンケミカル社(Zieben Chemical Co., Ltd. )社
（製）］を用いたヒンジ法（ジャーナル・オブ・イムノ
アッセイ（J. Immunoassay）第４巻、第２０９頁（１９
８３年））に従い、ＰＯＤ［Horseradish peroxidase：
シグマ社製］を、上記で得たマウス抗Ｆａｓモノクロー
ナル抗体のＩｇＧ／Ｆａｂ’にＳＨ基を介して結合させ
て、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体（標識さ
れた第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体）を得た。 （４−３）可溶性Ｆａｓ抗原の測定 上記実施例３の（３−３−１）とほぼ同様にして検体、
標準可溶性Ｆａｓ抗原を調製し、（３−３−２）とほぼ
同様にしてマイクロプレート型試薬と検体中の可溶性Ｆ
ａｓ抗原との抗原抗体反応を行い、（３−３−３）とほ
ぼ同様にしてマイクロプレート型試薬と検体中の可溶性
Ｆａｓ抗原との結合物にペルオキシダーゼ標識抗Ｆａｓ
モノクローナル抗体を結合させた。
シクロヘキサン-1-カルボキシレート［Succimidyl 4-(N
-maleimi-domethyl)-cyclohexan-1-carboxylate：ジー
ベンケミカル社(Zieben Chemical Co., Ltd. )社
（製）］を用いたヒンジ法（ジャーナル・オブ・イムノ
アッセイ（J. Immunoassay）第４巻、第２０９頁（１９
８３年））に従い、ＰＯＤ［Horseradish peroxidase：
シグマ社製］を、上記で得たマウス抗Ｆａｓモノクロー
ナル抗体のＩｇＧ／Ｆａｂ’にＳＨ基を介して結合させ
て、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体（標識さ
れた第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体）を得た。 （４−３）可溶性Ｆａｓ抗原の測定 上記実施例３の（３−３−１）とほぼ同様にして検体、
標準可溶性Ｆａｓ抗原を調製し、（３−３−２）とほぼ
同様にしてマイクロプレート型試薬と検体中の可溶性Ｆ
ａｓ抗原との抗原抗体反応を行い、（３−３−３）とほ
ぼ同様にしてマイクロプレート型試薬と検体中の可溶性
Ｆａｓ抗原との結合物にペルオキシダーゼ標識抗Ｆａｓ
モノクローナル抗体を結合させた。
【００６１】発色反応は以下のようにして行った。オル
トフェニレンジアミン（シグマ社（製））を０．１Ｍク
エン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．１）にて１ｍｇ／ｍ
ｌの濃度に溶解し、ペルオキシダーゼ標識抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体で処理したマイクロプレートへ、１ウエ
ルにつき１００μｌずつ分注し、室温にて１０〜２０分
間静置後、２Ｎ硫酸を１ウエルにつき１００μｌずつ分
注し、ｐＨを下げることによりペルオキシダーゼの酵素
活性を停止させた。
トフェニレンジアミン（シグマ社（製））を０．１Ｍク
エン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．１）にて１ｍｇ／ｍ
ｌの濃度に溶解し、ペルオキシダーゼ標識抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体で処理したマイクロプレートへ、１ウエ
ルにつき１００μｌずつ分注し、室温にて１０〜２０分
間静置後、２Ｎ硫酸を１ウエルにつき１００μｌずつ分
注し、ｐＨを下げることによりペルオキシダーゼの酵素
活性を停止させた。
【００６２】こうしてマイクロプレートの各ウエルに生
じた発色の程度は、吸光度計（東ソー社（製）ＭＰＲ−
Ａ４）にて波長４９２ｎｍでの吸光度を測定することに
より検出した。この吸光度から検体中の可溶性Ｆａｓ抗
原の濃度が分かる。尚、検量線の作製及び検体の定量は
上記実施例３の（３−３−５）、（３−３−６）とほぼ
同様の手順により行った。検量線のデータを表３及び図
２に、また、上記の試薬及び測定方法により実際に正常
人、ＳＬＥ患者の血清を測定した結果を表４に示す。
じた発色の程度は、吸光度計（東ソー社（製）ＭＰＲ−
Ａ４）にて波長４９２ｎｍでの吸光度を測定することに
より検出した。この吸光度から検体中の可溶性Ｆａｓ抗
原の濃度が分かる。尚、検量線の作製及び検体の定量は
上記実施例３の（３−３−５）、（３−３−６）とほぼ
同様の手順により行った。検量線のデータを表３及び図
２に、また、上記の試薬及び測定方法により実際に正常
人、ＳＬＥ患者の血清を測定した結果を表４に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
【表４】
【００６５】表４からも分かるように、ＳＬＥ患者にお
いて測定値が顕著な高濃度を示すことが分かる。従っ
て、本実施例の試薬を用い、本実施例の測定法を実施す
れば、臨床現場でも容易に可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測
定でき、ＳＬＥ等の自己免疫疾患の患者の発見が迅速に
できる。
いて測定値が顕著な高濃度を示すことが分かる。従っ
て、本実施例の試薬を用い、本実施例の測定法を実施す
れば、臨床現場でも容易に可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測
定でき、ＳＬＥ等の自己免疫疾患の患者の発見が迅速に
できる。
【００６６】尚、放射性元素を標識物として用いれば、
ＲＩＡ法により可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測定すること
ができる。この場合、管理された施設において資格を有
するものにより行うことが必要となる。 ［実施例５］（ビオチンで標識されたモノクローナル抗
体の作製） 上記実施例３の（３−２）、上記実施例４の（４−２）
に代えて、ビオチンで標識されたモノクローナル抗体を
作製し、これを用いて上記実施例３、４とほぼ同様にし
て可溶性Ｆａｓ抗原の測定を行うことができる。
ＲＩＡ法により可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を測定すること
ができる。この場合、管理された施設において資格を有
するものにより行うことが必要となる。 ［実施例５］（ビオチンで標識されたモノクローナル抗
体の作製） 上記実施例３の（３−２）、上記実施例４の（４−２）
に代えて、ビオチンで標識されたモノクローナル抗体を
作製し、これを用いて上記実施例３、４とほぼ同様にし
て可溶性Ｆａｓ抗原の測定を行うことができる。
【００６７】クローンＶＢ３のモノクローナル抗体Ｉｇ
Ｇ分画を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解して
ＩｇＧ濃度が５ｍｇ／ｍｌになるよう調製した。このＩ
ｇＧ溶液に同じく０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に
溶解して２５ｍｇ／ｍｌに調製したＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩ
ＯＴＩＮ（ピアース（PIERCE）社（製））をＩｇＧ１０
０ｍｇにつき８９１μｌ加え、スターラーを用いて室温
で４時間攪拌し、ビオチンで標識されたモノクローナル
抗体を調製した。
Ｇ分画を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解して
ＩｇＧ濃度が５ｍｇ／ｍｌになるよう調製した。このＩ
ｇＧ溶液に同じく０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に
溶解して２５ｍｇ／ｍｌに調製したＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩ
ＯＴＩＮ（ピアース（PIERCE）社（製））をＩｇＧ１０
０ｍｇにつき８９１μｌ加え、スターラーを用いて室温
で４時間攪拌し、ビオチンで標識されたモノクローナル
抗体を調製した。
【００６８】このようにして得られたビオチンで標識さ
れたモノクローナル抗体を用いる場合には、さらにアビ
ジンで標識した前記酵素（ペルオキシダーゼ、ガラクト
シダーゼ等）を反応させ、固相化抗モノクローナル抗体
−可溶性Ｆａｓ抗原−ビオチン標識抗体−アビジン標識
酵素の複合体を形成させ、上記実施例３、４と同様に発
色基質の発色を測定することによって、検体中の可溶性
Ｆａｓ抗原の濃度を決定した。尚、ビオチン標識抗体と
アビジン標識酵素の組合せを用いた場合には、上記実施
例３、４のように通常の酵素標識抗体を用いた場合に比
べて、さらに高い感度で可溶性Ｆａｓ抗原を測定するこ
とができた。 ［参考例１］Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株ＪＭ１０９（寄託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−４４３６）の製造 以下、ｈＦａｓはヒトＦａｓ抗原を意味し、ＥＸＴは細
胞外領域（可溶性領域）を意味する。 （参１−１）全長ｈＦａｓをコ−ドするｃＤＮＡの取得 （参１−１−Ａ）細胞株の調製 本参考例において使用される細胞株を予め調製した。 ・ヒトＴ腫瘍細胞株ＫＴ３（金沢医科大学清水博士より
分譲）：１０％牛胎児血清（fetal calf serum; FCS)及
び５ｎｇ／ｍｌヒト組換ＩＬ−６（味の素（製））を含
有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。 ・サル細胞株ＣＯＳ７(ATCC CRL 1651) ：１０％ＦＣＳ
含有ＤＭＥＭ培地中で培養した。 （参１−１−Ｂ）抗体の調製 本参考例において使用されるマウス抗ｈＦａｓ抗体ＣＨ
１１（ＩｇＭ）を、米原ら(J. Exp. Med., Vol.169, p
p.1747-1756, 1989) の報文に従って、実施例２と同様
にして調製した。 （参１−１−Ｃ）プラスミドの構築 本参考例において使用される外来ｃＤＮＡクロ−ニング
ベクタ−（プラスミド）を予め構築した。 ・プラスミドｐＣＥＶ４(Science, Vol.247, pp.324-32
7, 1990,イトウら参照)：プラスミドｐｃＤＳＲα(Mol.
CEll Biol., Vol.2, pp.161, 1982,オカヤマら、Mol.
CEll Biol., Vol.3, pp.280, 1983, オカヤマら及びMo
l. CEll Biol.,Vol.8, pp.466-472, 1988,タケベら等参
照)を基本骨格として用い、ポリオ−マウィルス(polyom
a virus) からＢｇｌＩ−ＢｃｌＩ切断フラグメントと
して取り出した複製開始点ＤＮＡ（Ｐｙ ｏｒｉ）及び
プラスミドＣＤＭ８(Proc. Natl.Acad. sci. USA, Vol.
84, pp.3365-3369, 1987, ブライアン・シ−ド(Brian S
eedら及びNature, Vol.329, pp.840-842, 1987, Brian
Seed等参照)からＸｂａＩ切断フラグメントとして取り
出した２つのＢｓｔＸＩ切断部位を有するスタッファ−
(stuffer) ＤＮＡをそれぞれｐｃＤＳＲαのＮｄｅＩ切
断部位及びＰｓｔＩ切断部位に挿入し、該スタッファ−
（ＸｂａＩ切断フラグメント）中のＮｏｔＩ切断部位を
フィリングインすることにより除去し、該ＮｏｔＩリン
カーをｐｃＤＳＲαのＣｌａＩ切断部位に挿入してプラ
スミドｐＣＥＶ４を構築した。 ・プラスミドｐＭＥ１８Ｓ（東京大学丸山和夫博士より
分譲）：ｐＣＥＶ４を基本骨格として構築された動物細
胞における発現に適したｃＤＮＡクロ−ニングベクタ−
であり、ｐＵＣの複製開始点配列、ＳＶ４０の１６Ｓイ
ントロン配列、ｐｏｌｙＡシグナル配列及びｐｏｌｙＡ
シグナル配列直前の各フレ−ムの翻訳終止等を有してい
る（実験医学「遺伝子工学ハンドブック」（別冊）, p
p.101-107,1992,丸山和夫ら参照）。
れたモノクローナル抗体を用いる場合には、さらにアビ
ジンで標識した前記酵素（ペルオキシダーゼ、ガラクト
シダーゼ等）を反応させ、固相化抗モノクローナル抗体
−可溶性Ｆａｓ抗原−ビオチン標識抗体−アビジン標識
酵素の複合体を形成させ、上記実施例３、４と同様に発
色基質の発色を測定することによって、検体中の可溶性
Ｆａｓ抗原の濃度を決定した。尚、ビオチン標識抗体と
アビジン標識酵素の組合せを用いた場合には、上記実施
例３、４のように通常の酵素標識抗体を用いた場合に比
べて、さらに高い感度で可溶性Ｆａｓ抗原を測定するこ
とができた。 ［参考例１］Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株ＪＭ１０９（寄託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−４４３６）の製造 以下、ｈＦａｓはヒトＦａｓ抗原を意味し、ＥＸＴは細
胞外領域（可溶性領域）を意味する。 （参１−１）全長ｈＦａｓをコ−ドするｃＤＮＡの取得 （参１−１−Ａ）細胞株の調製 本参考例において使用される細胞株を予め調製した。 ・ヒトＴ腫瘍細胞株ＫＴ３（金沢医科大学清水博士より
分譲）：１０％牛胎児血清（fetal calf serum; FCS)及
び５ｎｇ／ｍｌヒト組換ＩＬ−６（味の素（製））を含
有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。 ・サル細胞株ＣＯＳ７(ATCC CRL 1651) ：１０％ＦＣＳ
含有ＤＭＥＭ培地中で培養した。 （参１−１−Ｂ）抗体の調製 本参考例において使用されるマウス抗ｈＦａｓ抗体ＣＨ
１１（ＩｇＭ）を、米原ら(J. Exp. Med., Vol.169, p
p.1747-1756, 1989) の報文に従って、実施例２と同様
にして調製した。 （参１−１−Ｃ）プラスミドの構築 本参考例において使用される外来ｃＤＮＡクロ−ニング
ベクタ−（プラスミド）を予め構築した。 ・プラスミドｐＣＥＶ４(Science, Vol.247, pp.324-32
7, 1990,イトウら参照)：プラスミドｐｃＤＳＲα(Mol.
CEll Biol., Vol.2, pp.161, 1982,オカヤマら、Mol.
CEll Biol., Vol.3, pp.280, 1983, オカヤマら及びMo
l. CEll Biol.,Vol.8, pp.466-472, 1988,タケベら等参
照)を基本骨格として用い、ポリオ−マウィルス(polyom
a virus) からＢｇｌＩ−ＢｃｌＩ切断フラグメントと
して取り出した複製開始点ＤＮＡ（Ｐｙ ｏｒｉ）及び
プラスミドＣＤＭ８(Proc. Natl.Acad. sci. USA, Vol.
84, pp.3365-3369, 1987, ブライアン・シ−ド(Brian S
eedら及びNature, Vol.329, pp.840-842, 1987, Brian
Seed等参照)からＸｂａＩ切断フラグメントとして取り
出した２つのＢｓｔＸＩ切断部位を有するスタッファ−
(stuffer) ＤＮＡをそれぞれｐｃＤＳＲαのＮｄｅＩ切
断部位及びＰｓｔＩ切断部位に挿入し、該スタッファ−
（ＸｂａＩ切断フラグメント）中のＮｏｔＩ切断部位を
フィリングインすることにより除去し、該ＮｏｔＩリン
カーをｐｃＤＳＲαのＣｌａＩ切断部位に挿入してプラ
スミドｐＣＥＶ４を構築した。 ・プラスミドｐＭＥ１８Ｓ（東京大学丸山和夫博士より
分譲）：ｐＣＥＶ４を基本骨格として構築された動物細
胞における発現に適したｃＤＮＡクロ−ニングベクタ−
であり、ｐＵＣの複製開始点配列、ＳＶ４０の１６Ｓイ
ントロン配列、ｐｏｌｙＡシグナル配列及びｐｏｌｙＡ
シグナル配列直前の各フレ−ムの翻訳終止等を有してい
る（実験医学「遺伝子工学ハンドブック」（別冊）, p
p.101-107,1992,丸山和夫ら参照）。
【００６９】プラスミドｐＣＥＶ４及びｐＭＥ１８Ｓの
制限酵素地図をそれぞれ図３及び図４に示した。 （参１−１−Ｄ）ヒトＴ腫瘍細胞ＫＴ３由来ｃＤＮＡラ
イブラリ−の作成 グアニジンイソチオシアネ−ト／酸フェノ−ル法(Anal.
Biochem., Vol.162,pp.156-159, 1987, Chomczynski及
びSacchiら参照)によりＫＴ３から全ＲＮＡを調製し、
ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡをｏｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロ−ス
カラムクロマトグラフィ−により選択した。ランダムヘ
キサマ−オリゴヌクレオチド（ｐｄＮ6）（ＢＲＬ社
（製））及びオリゴ（ｄＴ）（ＢＲＬ社（製））をプラ
イマ−としてＭ−ＭＬＶＲＮＡａｓｅＨ- 逆転写酵素を
用い、それぞれ該ＲＮＡから２重鎖ｃＤＮＡを合成した
(Cell, Vol.61, pp.341-350, 1990, フクナガら参照)。
予め合成したＢｓｔＸＩ非パリンドロ−ムアダプタ−を
連結し、アガロ−スゲル電気泳動により２ｋｂより長い
ｃＤＮＡを分離し、それらをＢｓｔＸＩ切断ｐＣＥＶ４
ベクタ−フラグメントに連結した。エレクトロポレ−シ
ョン法(Nucl. Acids Res.,Vol.16,pp.6127-6145, 1988,
Dowerら参照) により該ベクタ−をＥ．ＣｏｌｉＷＭ１
１００にそれぞれ形質転換して、ヒトＴ腫瘍細胞ＫＴ３
由来ｃＤＮＡライブラリ−を作成した。 （参１−１−Ｅ）ｈＦａｓｃＤＮＡフラグメントの取得 ブライアンシ−ドらの方法(Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, Vol.84, pp.3365-3369, 1987)と同様にして以下の操
作を行った。
制限酵素地図をそれぞれ図３及び図４に示した。 （参１−１−Ｄ）ヒトＴ腫瘍細胞ＫＴ３由来ｃＤＮＡラ
イブラリ−の作成 グアニジンイソチオシアネ−ト／酸フェノ−ル法(Anal.
Biochem., Vol.162,pp.156-159, 1987, Chomczynski及
びSacchiら参照)によりＫＴ３から全ＲＮＡを調製し、
ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡをｏｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロ−ス
カラムクロマトグラフィ−により選択した。ランダムヘ
キサマ−オリゴヌクレオチド（ｐｄＮ6）（ＢＲＬ社
（製））及びオリゴ（ｄＴ）（ＢＲＬ社（製））をプラ
イマ−としてＭ−ＭＬＶＲＮＡａｓｅＨ- 逆転写酵素を
用い、それぞれ該ＲＮＡから２重鎖ｃＤＮＡを合成した
(Cell, Vol.61, pp.341-350, 1990, フクナガら参照)。
予め合成したＢｓｔＸＩ非パリンドロ−ムアダプタ−を
連結し、アガロ−スゲル電気泳動により２ｋｂより長い
ｃＤＮＡを分離し、それらをＢｓｔＸＩ切断ｐＣＥＶ４
ベクタ−フラグメントに連結した。エレクトロポレ−シ
ョン法(Nucl. Acids Res.,Vol.16,pp.6127-6145, 1988,
Dowerら参照) により該ベクタ−をＥ．ＣｏｌｉＷＭ１
１００にそれぞれ形質転換して、ヒトＴ腫瘍細胞ＫＴ３
由来ｃＤＮＡライブラリ−を作成した。 （参１−１−Ｅ）ｈＦａｓｃＤＮＡフラグメントの取得 ブライアンシ−ドらの方法(Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, Vol.84, pp.3365-3369, 1987)と同様にして以下の操
作を行った。
【００７０】細菌学用６ｃｍディッシュ（Falcon1007）
を１０μｇヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（カッペル（Cappe
l）社（製））含有５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（３ｍ
ｌ；ｐＨ９．５）存在下室温で９０分間培養し、パンニ
ングディッシュ(panning dish)を作成した。パンニング
ディッシュを０．１５ＭのＮａＣｌで３回洗浄すること
により未反応抗体を除去した後、０．５ｍＭのＥＤＴ
Ａ、０．０２％のＮａＮ3及び５％ＦＣＳを含有するＰ
ＢＳ(phosphate-buffered saline)（３ｍｌ）を用いた
一晩のインキュベ−ションにてブロックした。
を１０μｇヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（カッペル（Cappe
l）社（製））含有５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（３ｍ
ｌ；ｐＨ９．５）存在下室温で９０分間培養し、パンニ
ングディッシュ(panning dish)を作成した。パンニング
ディッシュを０．１５ＭのＮａＣｌで３回洗浄すること
により未反応抗体を除去した後、０．５ｍＭのＥＤＴ
Ａ、０．０２％のＮａＮ3及び５％ＦＣＳを含有するＰ
ＢＳ(phosphate-buffered saline)（３ｍｌ）を用いた
一晩のインキュベ−ションにてブロックした。
【００７１】１０８枚の６ｃｍディッシュ(Falcon1007)
に蒔いたＣＯＳ７が５０％まで増殖した段階で、スフェ
ロプラスト融合法（spheroplast fusion; Mol. Cell. B
iol.,Vol.1, pp.743-752, 1981, Sandi-Goldrinら参
照）により、先に作成したｃＤＮＡライブラリ−をＣＯ
Ｓ７に形質転換した。７２時間後、０．５ｍＭのＥＤＴ
Ａ及び０．０２％のＮａＮ3 含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＥＤ
ＴＡ／ＮａＮ3 ）を加え、３７℃で３０分間培養するこ
とにより細胞をディッシュから剥がした。剥がした細胞
を回収し、遠心分離し、１０μｇ／ｍｌのマウス抗ｈＦ
ａｓ抗体ＣＨ１１（ＩｇＭ）(J.Exp. Med., Vol.169, p
p.1747-1756, 1989,ヨネハラら参照) を含有する氷冷Ｐ
ＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 （９ｍｌ）中に再懸濁させ
た。氷上６０分間のインキュベ−ションの後、ＰＢＳ／
ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 で細胞を１：２に希釈し、２％フィ
コ−ル(Ficoll)４００に重層して、１０００ｒｐｍで遠
心分離した。フィコ−ルの上層に集まった生細胞を５％
ＦＣＳ含有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 （２７ｍｌ）中
に懸濁させ、ナイロンメッシュ（孔径１００μｍ）濾過
により凝集物を除去した。
に蒔いたＣＯＳ７が５０％まで増殖した段階で、スフェ
ロプラスト融合法（spheroplast fusion; Mol. Cell. B
iol.,Vol.1, pp.743-752, 1981, Sandi-Goldrinら参
照）により、先に作成したｃＤＮＡライブラリ−をＣＯ
Ｓ７に形質転換した。７２時間後、０．５ｍＭのＥＤＴ
Ａ及び０．０２％のＮａＮ3 含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＥＤ
ＴＡ／ＮａＮ3 ）を加え、３７℃で３０分間培養するこ
とにより細胞をディッシュから剥がした。剥がした細胞
を回収し、遠心分離し、１０μｇ／ｍｌのマウス抗ｈＦ
ａｓ抗体ＣＨ１１（ＩｇＭ）(J.Exp. Med., Vol.169, p
p.1747-1756, 1989,ヨネハラら参照) を含有する氷冷Ｐ
ＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 （９ｍｌ）中に再懸濁させ
た。氷上６０分間のインキュベ−ションの後、ＰＢＳ／
ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 で細胞を１：２に希釈し、２％フィ
コ−ル(Ficoll)４００に重層して、１０００ｒｐｍで遠
心分離した。フィコ−ルの上層に集まった生細胞を５％
ＦＣＳ含有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 （２７ｍｌ）中
に懸濁させ、ナイロンメッシュ（孔径１００μｍ）濾過
により凝集物を除去した。
【００７２】濾過した細胞を先に作成したパンニングデ
ィッシュ（５４枚）に蒔いた。室温下、２乃至３時間放
置し、細胞をディッシュに付着させた後、５％ＦＣＳ含
有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 （２ｍｌ）で静かに３回
洗浄し、ディッシュに結合しない細胞を除去した。ハ−
ト(Hirt)らの方法に従い、ディッシュに結合したＣＯＳ
細胞からプラスミドＤＮＡを調製した。即ち、各ディッ
シュに１０ｍＭのＥＤＴＡ含有０．６％ＳＤＳ溶液
（０．４ｍｌ）を加え、室温下２０分間放置した。溶解
物をマイクロチュ−ブに回収し、ＮａＣｌを１Ｍ濃度に
なるまで加え、チュ−ブを氷上で５時間以上静置した。
次いで、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上
清をフェノ−ル／クロロフォルムで抽出し、エタノ−ル
析出法によりプラスミドＤＮＡを回収した。回収プラス
ミドＤＮＡでＥ．ＣｏｌｉＷＭ１１００を形質転換し、
約３．２×１０5 個のコロニ−を得、コロニ−を分析し
形質転換細胞を選択した後、スフェロプラスト融合法に
よりＣＯＳ７に形質転換した（４８ディッシュ）。同様
の操作をさらに２回行い、１４個のｈＦａｓｃＤＮＡフ
ラグメント含有プラスミドクロ−ン（ｐＦ１−ｐＦ１
４）を取得した。これらのプラスミドクロ−ンを制限酵
素ＸｈｏＩで切断し、同一の３．０ｋｂの挿入配列を含
むクロ−ン（ｐＦ１、２、５及び１１）及び同一の１．
５ｋｂの挿入配列を含むクロ−ン（ｐＦ３、４、６、７
及び９）に分けた。ｐＦ１及びｐＦ３プラスミドクロ−
ンをＣＯＳ７に形質転換した後、抗Ｆａｓ抗体を用いた
フロ−サイトメトリ−(flow cytometry)分析により、こ
れらのクロ−ンがＦａｓ抗原をコ−ドするｃＤＮＡフラ
グメントであることを確認した。 （参１−１−Ｆ）全長ｈＦａｓｃＤＮＡの取得 （参１−１−Ｅ）で取得したｐＦ３の５’末端側の０．
５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ切断フラグメントをプロ
−ブとして用いたコロニ−ハイブリダイゼ−ション法に
より、（参１−１−Ｂ）で作成したｃＤＮＡライブラリ
−から、１０個のｃＤＮＡクロ−ンを取得した。制限酵
素マッピングにより、これらのクロ−ンが同一の制限酵
素地図を有する１．８−２．６ｋｂの挿入配列を含有す
ることが確認された。種々の分析により最長のクロ−ン
ｐＦ５８は、２５３４ｂｐからなり、３’末端ポリアデ
ニレ−ションシグナル(polyadenylation signal)配列
（ＡＴＴＡＡＡ）、１９５乃至１９７番目の塩基に位置
する翻訳開始コドンから始まる１００５ｂｐのオ−プン
リ−ディングフレ−ム(open reading frame)及び１２０
０乃至１２０２番目の塩基に位置する翻訳終止コドン
（ＴＡＧ）を有し、クロ−ンｐＦ５８が全長ｈＦａｓｃ
ＤＮＡを有していることが確認された。ｐＦ５８クロ−
ンからＸｈｏＩ切断フラグメントとして取り出した全長
Ｆａｓ抗原ｃＤＮＡを含む２５５５ｂｐのＤＮＡを、Ｂ
ｓｔＸＩアダプタ−を用い哺乳動物発現プラスミドｐＣ
ＥＶ４に組み込みプラスミドｐＣＥＶ４／ｈＦａｓを構
築した。 （参１−２）ｈＦａｓの細胞外領域（ｈＦａｓ・ＥＸ
Ｔ）をコ−ドするｃＤＮＡの取得 （参１−１−Ｆ）で構築したｐＣＥＶ４／ｈＦａｓをＸ
ｈｏＩで消化し、全長ＦａｓｃＤＮＡをＸｈｏＩ切断フ
ラグメント（２５５５ｂｐ）として取り出した。また、
ｐＭＥ１８ＳをＸｈｏＩで消化し、スタッファ−部分を
ＸｈｏＩ切断フラグメントとして除去した。切断面の
５’末端のリン酸基を除去するためアルカリホスファタ
−ゼ(bacterial alkaline phosphatase;ＢＡＰ）（Ｅ．
ｃｏｌｉＣ７５；宝酒造（製））でｐＭＥ１８Ｓフラグ
メントを処理した。全長ｈＦａｓｃＤＮＡをＸｈｏＩ切
断フラグメント（２５５５ｂｐ）とＢＡＰ処理したｐＭ
Ｅ１８ＳフラグメントをＤＮＡ連結キット（宝酒造
（製））で連結してプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ
を構築した。
ィッシュ（５４枚）に蒔いた。室温下、２乃至３時間放
置し、細胞をディッシュに付着させた後、５％ＦＣＳ含
有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 （２ｍｌ）で静かに３回
洗浄し、ディッシュに結合しない細胞を除去した。ハ−
ト(Hirt)らの方法に従い、ディッシュに結合したＣＯＳ
細胞からプラスミドＤＮＡを調製した。即ち、各ディッ
シュに１０ｍＭのＥＤＴＡ含有０．６％ＳＤＳ溶液
（０．４ｍｌ）を加え、室温下２０分間放置した。溶解
物をマイクロチュ−ブに回収し、ＮａＣｌを１Ｍ濃度に
なるまで加え、チュ−ブを氷上で５時間以上静置した。
次いで、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上
清をフェノ−ル／クロロフォルムで抽出し、エタノ−ル
析出法によりプラスミドＤＮＡを回収した。回収プラス
ミドＤＮＡでＥ．ＣｏｌｉＷＭ１１００を形質転換し、
約３．２×１０5 個のコロニ−を得、コロニ−を分析し
形質転換細胞を選択した後、スフェロプラスト融合法に
よりＣＯＳ７に形質転換した（４８ディッシュ）。同様
の操作をさらに２回行い、１４個のｈＦａｓｃＤＮＡフ
ラグメント含有プラスミドクロ−ン（ｐＦ１−ｐＦ１
４）を取得した。これらのプラスミドクロ−ンを制限酵
素ＸｈｏＩで切断し、同一の３．０ｋｂの挿入配列を含
むクロ−ン（ｐＦ１、２、５及び１１）及び同一の１．
５ｋｂの挿入配列を含むクロ−ン（ｐＦ３、４、６、７
及び９）に分けた。ｐＦ１及びｐＦ３プラスミドクロ−
ンをＣＯＳ７に形質転換した後、抗Ｆａｓ抗体を用いた
フロ−サイトメトリ−(flow cytometry)分析により、こ
れらのクロ−ンがＦａｓ抗原をコ−ドするｃＤＮＡフラ
グメントであることを確認した。 （参１−１−Ｆ）全長ｈＦａｓｃＤＮＡの取得 （参１−１−Ｅ）で取得したｐＦ３の５’末端側の０．
５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ切断フラグメントをプロ
−ブとして用いたコロニ−ハイブリダイゼ−ション法に
より、（参１−１−Ｂ）で作成したｃＤＮＡライブラリ
−から、１０個のｃＤＮＡクロ−ンを取得した。制限酵
素マッピングにより、これらのクロ−ンが同一の制限酵
素地図を有する１．８−２．６ｋｂの挿入配列を含有す
ることが確認された。種々の分析により最長のクロ−ン
ｐＦ５８は、２５３４ｂｐからなり、３’末端ポリアデ
ニレ−ションシグナル(polyadenylation signal)配列
（ＡＴＴＡＡＡ）、１９５乃至１９７番目の塩基に位置
する翻訳開始コドンから始まる１００５ｂｐのオ−プン
リ−ディングフレ−ム(open reading frame)及び１２０
０乃至１２０２番目の塩基に位置する翻訳終止コドン
（ＴＡＧ）を有し、クロ−ンｐＦ５８が全長ｈＦａｓｃ
ＤＮＡを有していることが確認された。ｐＦ５８クロ−
ンからＸｈｏＩ切断フラグメントとして取り出した全長
Ｆａｓ抗原ｃＤＮＡを含む２５５５ｂｐのＤＮＡを、Ｂ
ｓｔＸＩアダプタ−を用い哺乳動物発現プラスミドｐＣ
ＥＶ４に組み込みプラスミドｐＣＥＶ４／ｈＦａｓを構
築した。 （参１−２）ｈＦａｓの細胞外領域（ｈＦａｓ・ＥＸ
Ｔ）をコ−ドするｃＤＮＡの取得 （参１−１−Ｆ）で構築したｐＣＥＶ４／ｈＦａｓをＸ
ｈｏＩで消化し、全長ＦａｓｃＤＮＡをＸｈｏＩ切断フ
ラグメント（２５５５ｂｐ）として取り出した。また、
ｐＭＥ１８ＳをＸｈｏＩで消化し、スタッファ−部分を
ＸｈｏＩ切断フラグメントとして除去した。切断面の
５’末端のリン酸基を除去するためアルカリホスファタ
−ゼ(bacterial alkaline phosphatase;ＢＡＰ）（Ｅ．
ｃｏｌｉＣ７５；宝酒造（製））でｐＭＥ１８Ｓフラグ
メントを処理した。全長ｈＦａｓｃＤＮＡをＸｈｏＩ切
断フラグメント（２５５５ｂｐ）とＢＡＰ処理したｐＭ
Ｅ１８ＳフラグメントをＤＮＡ連結キット（宝酒造
（製））で連結してプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ
を構築した。
【００７３】ｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓをＢｇｌII及びＰ
ｓｔＩで消化して、ｈＦａｓの膜貫通領域及び引き続く
細胞内領域に対応するｃＤＮＡ領域を除去した。つい
で、ＤＮＡ末端平滑化キット（宝酒造（製））を用いて
切断末端を平滑化し、ｐＭＥ１８Ｓフラグメントを自己
連結させｈＦａｓ・ＥＸＴをコ−ドするｃＤＮＡのみが
導入されたプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ・ＥＸＴ
を構築した。
ｓｔＩで消化して、ｈＦａｓの膜貫通領域及び引き続く
細胞内領域に対応するｃＤＮＡ領域を除去した。つい
で、ＤＮＡ末端平滑化キット（宝酒造（製））を用いて
切断末端を平滑化し、ｐＭＥ１８Ｓフラグメントを自己
連結させｈＦａｓ・ＥＸＴをコ−ドするｃＤＮＡのみが
導入されたプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ・ＥＸＴ
を構築した。
【００７４】プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ・ＥＸ
Ｔの構築工程を図５に示した。 （参１−３）マウスＩＬ−３レセプタ−βサブユニット
ＡＩＣ２Ａ（ＡＩＣ２Ａ）をコ−ドするｃＤＮＡの取得 （参１−３−Ａ）細胞株の調製 本参考例において使用される細胞株を予め調製した。 ・マウス肥満細胞株ＭＣ／９（ATCC CRL 8306）：１０
０Ｕ／ｍｌ組換マウスＩＬ−３及び１０％ＦＣＳ含有Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。 ・サル細胞株ＣＯＳ７(ATCC CRL 1651) ：１０％ＦＣＳ
含有ＤＭＥＭ培地中で増殖させた。 （参１−３−Ｂ）抗体の調製 本参考例で使用されるマウス抗ＡＩＣ２抗体（ＩｇＭ）
を米原ら(Int. Immunol., Vol.2, No.2, pp.143-150, 1
990)の報文に従って予め調製した。 （参１−３−Ｃ）プラスミドの構築 （参１−１−Ｃ）で構築したプラスミドｐＣＥＶ４を使
用した。 （参１−３−Ｄ）マウス肥満細胞ＭＣ／９由来ｃＤＮＡ
ライブラリ−の作成 （参１−１−Ｄ）に記載した方法と同様にして、ＭＣ／
９より選択したｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡから２重鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、ＢｓｔＸＩ非パリンドロ−ムアダプタ−に
連結し、アガロ−スゲル電気泳動により１．５ｋｂより
長いｃＤＮＡを分離し、それらをＢｓｔＸＩ切断ｐＣＥ
Ｖ４ベクタ−フラグメントに連結した。エレクトロポレ
−ション法により該ベクタ−をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに
形質転換して、マウス肥満細胞ＭＣ／９由来ｃＤＮＡラ
イブラリ−を作成した(Science,Vol.247, pp324-327, 1
990, イトウら参照) 。 （参１−３−Ｅ）ＡＩＣ２ＡｃＤＮＡフラグメントの取
得 （参１−１−Ｅ）に記載した方法と同様にして、２次抗
体としてヤギ抗ラットＩｇＭ抗体（カッペル(Cappel)社
（製））をコ−ティングすることによりパンニングディ
ッシュを作成し、１次抗体としてラット抗Ａｉｃ２抗体
（ＩｇＭ）を用いることにより、ＣＯＳ７に形質転換さ
れた２４個のプラスミドクロ−ンを取得し、それぞれの
クロ−ンを分析して１３のクロ−ンが同一の１．６ｋｂ
のＡＩＣ２ＡｃＤＮＡフラグメント（挿入配列）を有す
ることを確認し、次の工程で使用するプロ−ブと用いる
ため、プラスミドクロ−ンｐＡＩＣ２−２を選択した(S
cience,Vol.247, pp324-327, 1990, イトウら参照) 。 （参１−３−Ｆ）全長ＡＩＣ２ＡｃＤＮＡの取得 （参１−１−Ｆ）に記載した方法と同様にして、ｐＡＩ
Ｃ２−２をプロ−ブとして用いたコロニ−ハイブリダイ
ゼ−ション法により、（参１−３−Ｄ）で作成したｃＤ
ＮＡライブラリ−から１８個のｃＤＮＡクロ−ンを取得
し、全長ＡＩＣ２ＡｃＤＮＡを有するｃＤＮＡクロ−ン
ｐＡＩＣ２−２６を取得した（GenBank寄託番号: Ｍ２
９８５５）。種々の分析によりｐＡＩＣ２−２６は、３
３５１ｂｐからなり、８７８のアミノ酸残基をコ−ドす
るオ−プンリ−ディングフレ−ムを有しており、該オ−
プンリ−ディングフレ−ムは、２２のアミノ酸残基から
なるシグナルペプチド及び８５６のアミノ酸残基からな
る成熟タンパクをコ−ドしており、成熟タンパクは、４
１７のアミノ酸残基からなる細胞外領域、２６のアミノ
酸残基からなる膜貫通領域及び４１３のアミノ酸残基か
らなる細胞内領域から構成されていることが確認され
た。
Ｔの構築工程を図５に示した。 （参１−３）マウスＩＬ−３レセプタ−βサブユニット
ＡＩＣ２Ａ（ＡＩＣ２Ａ）をコ−ドするｃＤＮＡの取得 （参１−３−Ａ）細胞株の調製 本参考例において使用される細胞株を予め調製した。 ・マウス肥満細胞株ＭＣ／９（ATCC CRL 8306）：１０
０Ｕ／ｍｌ組換マウスＩＬ−３及び１０％ＦＣＳ含有Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。 ・サル細胞株ＣＯＳ７(ATCC CRL 1651) ：１０％ＦＣＳ
含有ＤＭＥＭ培地中で増殖させた。 （参１−３−Ｂ）抗体の調製 本参考例で使用されるマウス抗ＡＩＣ２抗体（ＩｇＭ）
を米原ら(Int. Immunol., Vol.2, No.2, pp.143-150, 1
990)の報文に従って予め調製した。 （参１−３−Ｃ）プラスミドの構築 （参１−１−Ｃ）で構築したプラスミドｐＣＥＶ４を使
用した。 （参１−３−Ｄ）マウス肥満細胞ＭＣ／９由来ｃＤＮＡ
ライブラリ−の作成 （参１−１−Ｄ）に記載した方法と同様にして、ＭＣ／
９より選択したｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡから２重鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、ＢｓｔＸＩ非パリンドロ−ムアダプタ−に
連結し、アガロ−スゲル電気泳動により１．５ｋｂより
長いｃＤＮＡを分離し、それらをＢｓｔＸＩ切断ｐＣＥ
Ｖ４ベクタ−フラグメントに連結した。エレクトロポレ
−ション法により該ベクタ−をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに
形質転換して、マウス肥満細胞ＭＣ／９由来ｃＤＮＡラ
イブラリ−を作成した(Science,Vol.247, pp324-327, 1
990, イトウら参照) 。 （参１−３−Ｅ）ＡＩＣ２ＡｃＤＮＡフラグメントの取
得 （参１−１−Ｅ）に記載した方法と同様にして、２次抗
体としてヤギ抗ラットＩｇＭ抗体（カッペル(Cappel)社
（製））をコ−ティングすることによりパンニングディ
ッシュを作成し、１次抗体としてラット抗Ａｉｃ２抗体
（ＩｇＭ）を用いることにより、ＣＯＳ７に形質転換さ
れた２４個のプラスミドクロ−ンを取得し、それぞれの
クロ−ンを分析して１３のクロ−ンが同一の１．６ｋｂ
のＡＩＣ２ＡｃＤＮＡフラグメント（挿入配列）を有す
ることを確認し、次の工程で使用するプロ−ブと用いる
ため、プラスミドクロ−ンｐＡＩＣ２−２を選択した(S
cience,Vol.247, pp324-327, 1990, イトウら参照) 。 （参１−３−Ｆ）全長ＡＩＣ２ＡｃＤＮＡの取得 （参１−１−Ｆ）に記載した方法と同様にして、ｐＡＩ
Ｃ２−２をプロ−ブとして用いたコロニ−ハイブリダイ
ゼ−ション法により、（参１−３−Ｄ）で作成したｃＤ
ＮＡライブラリ−から１８個のｃＤＮＡクロ−ンを取得
し、全長ＡＩＣ２ＡｃＤＮＡを有するｃＤＮＡクロ−ン
ｐＡＩＣ２−２６を取得した（GenBank寄託番号: Ｍ２
９８５５）。種々の分析によりｐＡＩＣ２−２６は、３
３５１ｂｐからなり、８７８のアミノ酸残基をコ−ドす
るオ−プンリ−ディングフレ−ムを有しており、該オ−
プンリ−ディングフレ−ムは、２２のアミノ酸残基から
なるシグナルペプチド及び８５６のアミノ酸残基からな
る成熟タンパクをコ−ドしており、成熟タンパクは、４
１７のアミノ酸残基からなる細胞外領域、２６のアミノ
酸残基からなる膜貫通領域及び４１３のアミノ酸残基か
らなる細胞内領域から構成されていることが確認され
た。
【００７５】ｐＡＩＣ２−２６クロ−ンからＸｈｏＩ切
断フラグメントとして取り出した全長ＡＩＣ２ＡｃＤＮ
Ａを含むＤＮＡを、ＢｓｔＸＩアダプタ−を用い哺乳動
物発現プラスミドｐＣＥＶ４に組み込みプラスミドｐＣ
ＥＶ４／ＡＩＣ２Ａを構築した。 （参１−４）ｈＦａｓ・ＥＸＴをコ−ドするｃＤＮＡ及
びＡＩＣ２Ａの細胞外領域（ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴ）をコ
−ドするｃＤＮＡからなるｃＤＮＡの取得 （参１−２）で構築したプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦ
ａｓ・ＥＸＴをＮｏｔＩで消化、直線化し、ＤＮＡ末端
平滑化キットを用いて切断末端を平滑化し、切断面の
５’末端のリン酸基を除去するためＢＡＰで処理した。
断フラグメントとして取り出した全長ＡＩＣ２ＡｃＤＮ
Ａを含むＤＮＡを、ＢｓｔＸＩアダプタ−を用い哺乳動
物発現プラスミドｐＣＥＶ４に組み込みプラスミドｐＣ
ＥＶ４／ＡＩＣ２Ａを構築した。 （参１−４）ｈＦａｓ・ＥＸＴをコ−ドするｃＤＮＡ及
びＡＩＣ２Ａの細胞外領域（ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴ）をコ
−ドするｃＤＮＡからなるｃＤＮＡの取得 （参１−２）で構築したプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦ
ａｓ・ＥＸＴをＮｏｔＩで消化、直線化し、ＤＮＡ末端
平滑化キットを用いて切断末端を平滑化し、切断面の
５’末端のリン酸基を除去するためＢＡＰで処理した。
【００７６】（参１−３−Ｆ）で構築したプラスミドｐ
ＣＥＶ４／ＡＩＣ２ＡをＤｒａIIIで消化することによ
りＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴをコ−ドするｃＤＮＡを取り出
し、ＤＮＡ末端平滑化キットを用いて該フラグメントの
切断末端を平滑化した。ＤＮＡ連結キットを用いて、Ｄ
ｒａIII 切断ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴｃＤＮＡフラグメント
を、先に作成したＮｏｔＩ切断ｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ
・ＥＸＴプラスミドフラグメントに導入し、プラスミド
ｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ・ＥＸＴ−ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴ
を構築した。
ＣＥＶ４／ＡＩＣ２ＡをＤｒａIIIで消化することによ
りＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴをコ−ドするｃＤＮＡを取り出
し、ＤＮＡ末端平滑化キットを用いて該フラグメントの
切断末端を平滑化した。ＤＮＡ連結キットを用いて、Ｄ
ｒａIII 切断ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴｃＤＮＡフラグメント
を、先に作成したＮｏｔＩ切断ｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ
・ＥＸＴプラスミドフラグメントに導入し、プラスミド
ｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ・ＥＸＴ−ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴ
を構築した。
【００７７】ｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ・ＥＸＴ−ＡＩＣ
２Ａ・ＥＸＴの構築工程を図６に示した。 （参１−５）可溶性ｈＦａｓ−ＡＩＣ２Ａを発現するＪ
Ｍ１０９の取得 （参１−４）で構築したプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦ
ａｓ・ＥＸＴ−ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴを、Ｅ．ｃｏｌｉ細
胞株ＪＭ１０９に形質転換し、コロニ−を分析して形質
転換細胞を選択した。なお、この形質転換したＥ．ｃｏ
ｌｉ細胞株ＪＭ１０９は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４４
３６として通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に
国際寄託されている。
２Ａ・ＥＸＴの構築工程を図６に示した。 （参１−５）可溶性ｈＦａｓ−ＡＩＣ２Ａを発現するＪ
Ｍ１０９の取得 （参１−４）で構築したプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦ
ａｓ・ＥＸＴ−ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴを、Ｅ．ｃｏｌｉ細
胞株ＪＭ１０９に形質転換し、コロニ−を分析して形質
転換細胞を選択した。なお、この形質転換したＥ．ｃｏ
ｌｉ細胞株ＪＭ１０９は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４４
３６として通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に
国際寄託されている。
【００７８】
【発明の効果】以上詳述したように、本発明の可溶性Ｆ
ａｓ抗原の測定方法及びその測定用キットによれば、従
来不可能であった検体中の可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を容
易に測定することができるという効果が得られる。この
測定方法及び測定用キットにより測定した検体中の可溶
性Ｆａｓ抗原の量に基づいて、自己免疫疾患の予知、診
断及び治療方針の確立、治療の効果の判定を行うことが
できるため、有用である。
ａｓ抗原の測定方法及びその測定用キットによれば、従
来不可能であった検体中の可溶性Ｆａｓ抗原の濃度を容
易に測定することができるという効果が得られる。この
測定方法及び測定用キットにより測定した検体中の可溶
性Ｆａｓ抗原の量に基づいて、自己免疫疾患の予知、診
断及び治療方針の確立、治療の効果の判定を行うことが
できるため、有用である。
【図１】 実施例３の吸光度から可溶性Ｆａｓ抗原の濃
度を求めるための検量線のグラフを示す。
度を求めるための検量線のグラフを示す。
【図２】 実施例４の吸光度から可溶性Ｆａｓ抗原の濃
度を求めるための検量線のグラフを示す。
度を求めるための検量線のグラフを示す。
【図３】 プラスミドｐＣＥＶ４の制限酵素地図であ
る。
る。
【図４】 プラスミドｐＭＥ１８Ｓの制限酵素地図であ
る。
る。
【図５】 プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ｈＦａｓ・ＥＸＴ
の構築工程図である。
の構築工程図である。
【図６】 プラスミドｐＭＥ１８ＳｈＦａｓ・ＥＸＴ−
ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴの構築工程図である。
ＡＩＣ２Ａ・ＥＸＴの構築工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 蜂矢 隆久 長野県伊那市大字手良沢岡字大原1063− 103 株式会社医学生物学研究所内
Claims (11)
- 【請求項１】 可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定方法で
あって、 ａ）可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な抗Ｆａｓモ
ノクローナル抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固
相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体に標準可溶性Ｆａｓ抗
原を反応せしめた後、 ｂ）可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な標識された
第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を反応させ、 ｃ）反応生成物の標識量を測定することにより検量線を
作成する行程、及び ｄ）可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な抗Ｆａｓモ
ノクローナル抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固
相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体に検体を反応せしめた
後、 ｅ）可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な標識された
第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を反応させ、 ｆ）反応生成物の標識量を測定し、 前記検量線から検体中に含まれる可溶性Ｆａｓ抗原を定
量する行程を含むことを特徴とする可溶性Ｆａｓ抗原の
免疫学的測定方法。 - 【請求項２】 前記標準可溶性Ｆａｓ抗原が、ヒトＦａ
ｓ抗原またはマウスＦａｓ抗原の細胞外領域とマウスＩ
Ｌ−３レセプターβサブユニットＡＩＣ２Ａの細胞外領
域またはイムノグロブリン重鎖の定常領域とからなるキ
メラ可溶性Ｆａｓ抗原である請求項１記載の可溶性Ｆａ
ｓ抗原の免疫学的測定方法。 - 【請求項３】 前記不溶性支持体に結合せしめてなる固
相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体が、ハイブリドーマク
ローンＶＢ３、ＣＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ
６、ＪＡＥ及びＣＨ１１からなる群の中から選ばれた一
つのハイブリドーマクローンから産生されるモノクロー
ナル抗体である請求項１または２記載の可溶性Ｆａｓ抗
原の免疫学的測定方法。 - 【請求項４】 前記標識された第２の抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体が、ハイブリドーマクローンＶＢ３、ＣＢ
Ｅ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ６、ＪＡＥ及びＣＨ
１１からなる群の中から選ばれる一つのハイブリドーマ
クローンから産生されるモノクローナル抗体である請求
項１〜３のいずれかに記載の可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学
的測定方法。 - 【請求項５】 前記標識された第２の抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体が、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ及びビオチンからなる群から選ばれる標識物質で
標識されたモノクローナル抗体である請求項１〜４のい
ずれかに記載の可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定方法。 - 【請求項６】 可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な
抗Ｆａｓモノクローナル抗体を不溶性支持体に結合せし
めてなる固相化抗Ｆａｓモノクローナ抗体と、 標準物質としての可溶性Ｆａｓ抗原とを含むことを特徴
とする可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定用キット。 - 【請求項７】 可溶性Ｆａｓ抗原に特異的に結合可能な
標識された第２の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を含む請
求項６記載の可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定用キッ
ト。 - 【請求項８】 標準物質として、ヒトＦａｓ抗原または
マウスＦａｓ抗原の細胞外領域とマウスＩＬ−３レセプ
ターβサブユニットＡＩＣ２Ａの細胞外領域またはイム
ノグロブリン重鎖の定常領域とからなるキメラ可溶性Ｆ
ａｓ抗原を用いる請求項６または７記載の可溶性Ｆａｓ
抗原の免疫学的測定用キット。 - 【請求項９】 前記不溶性支持体に結合せしめてなる固
相化抗Ｆａｓモノクローナル抗体が、ハイブリドーマク
ローンＶＢ３、ＣＢＥ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ
６、ＪＡＥ及びＣＨ１１からなる群の中から選ばれた一
つのハイブリドーマクローンから産生されるモノクロー
ナル抗体である請求項６〜８のいずれかに記載の可溶性
Ｆａｓ抗原の免疫学的測定用キット。 - 【請求項１０】 前記標識された第２の抗Ｆａｓモノク
ローナル抗体が、ハイブリドーマクローンＶＢ３、ＣＢ
Ｅ、ＷＢ３、ＺＢ４、ＵＢ２、ＡＸ６、ＪＡＥ及びＣＨ
１１からなる群の中から選ばれる一つのハイブリドーマ
クローンから産生されるモノクローナル抗体である請求
項６〜９のいずれかに記載の可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学
的測定用キット。 - 【請求項１１】 前記標識された第２の抗Ｆａｓモノク
ローナル抗体が、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ及びビオチンからなる群から選ばれる標識物質
で標識されたモノクローナル抗体である請求項６〜１０
のいずれかに記載の可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定用
キット。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2563795A JPH0875745A (ja) | 1994-07-06 | 1995-02-14 | 可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定方法及びその測定用キット |
| PCT/JP1995/000349 WO1996001277A1 (en) | 1994-07-06 | 1995-03-03 | METHOD FOR IMMUNOASSAYING SOLUBLE Fas ANTIGEN AND KIT THEREFOR |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-154706 | 1994-07-06 | ||
| JP15470694 | 1994-07-06 | ||
| JP2563795A JPH0875745A (ja) | 1994-07-06 | 1995-02-14 | 可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定方法及びその測定用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0875745A true JPH0875745A (ja) | 1996-03-22 |
Family
ID=26363280
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2563795A Pending JPH0875745A (ja) | 1994-07-06 | 1995-02-14 | 可溶性Ｆａｓ抗原の免疫学的測定方法及びその測定用キット |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0875745A (ja) |
| WO (1) | WO1996001277A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5663070A (en) * | 1993-11-15 | 1997-09-02 | Lxr Biotechnology Inc. | Recombinant production of a soluble splice variant of the Fas (Apo-1) antigen, fas TM |
| ES2706403T3 (es) | 2008-12-10 | 2019-03-28 | Joslin Diabetes Center Inc | Métodos para diagnosticar y predecir una enfermedad renal |
| CN104459100B (zh) * | 2014-11-25 | 2016-06-29 | 成都威尔诺生物科技有限公司 | 一种抗sm-rnp抗体试剂盒 |
-
1995
- 1995-02-14 JP JP2563795A patent/JPH0875745A/ja active Pending
- 1995-03-03 WO PCT/JP1995/000349 patent/WO1996001277A1/ja not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1996001277A1 (en) | 1996-01-18 |
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