JPH08800B2

JPH08800B2 - 検出可能な分子を構成する修飾剤

Info

Publication number: JPH08800B2
Application number: JP60014636A
Authority: JP
Inventors: スタブリアンオポロスジヤニス
Original assignee: エンゾ− バイオケムインコ−ポレイテツド
Priority date: 1984-01-30
Filing date: 1985-01-30
Publication date: 1996-01-10
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: ES8900237A1; AU581577B2; NO850354L; IL74186A; DK39885D0; EP0154788A3; ES539928A0; AU3821285A; ES554043A0; US4707440A; EP0810435A2; DK39885A; ES554044A0; JPS60197645A; EP0154788A2; IL74186A0; CA1314503C; EP0810435A3; ES8706967A1; ES8801620A1

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の要約〕式:A₃〔−Ｘ−R¹−Ｅ−Det^b〕_ｍの化学構造を有する検出可能な分子を構成する修飾剤に
つき開示し、ここでA³は修飾を受ける分子であって、ア
ミノ、ヒドロキシ、cis1,2−diOH、ハロゲン化物、アリ
ール、イミダゾイル、カルボニル、カルボキシル、チオ
ールまたは活性炭素を含む残基よりなる群から選択され
る少なくとも１個の改変しうる反応基を有し、Ｘは −Ｎ＝Ｎ−，−NHSO₂−，−OSO₂−，−NH−Ｎ＝Ｎ−， −CH₂−NH−， −Ｓ−CH₂−，−Ｏ−CO−NH− よりなる群から選択され、 R¹はまたはC₁−C₁₀の分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキ
ルもしくはアラルキルであって、OHにより置換すること
ができ、ＹはＥに対する直接結合であるか、またはＹは
Ｅ−R²であり、ここでR²はC₁−C₁₀の分枝鎖もしくは分
枝鎖のないアルキルであり、Z_aは塩素，臭素もしくは沃
素であり、ＥはO,NHまたは非環式の二価硫黄原子であ
り、Det^bは好ましくはビオチンまたは式：の金属キレート化剤からなる検出しうる化学成分である
か、またはその４−ヒドロキシもしくはアシルオキシ誘
導体であり、R³はC₁−C₄アルキルもしくはCH₂COOMであ
り、ここでＭは同一でも異なってもよく水素，金属もし
くは非金属陽イオンよりなる群から選択され、或いはC₁
−C₁₀のアルキル，アリールもしくはアラルキルであ
り、ｍは１乃至A³における改変反応基の全個数の範囲の
整数である。この検出可能な分子は、試験管内または生
体内での分析もしくは治療に有用である。

〔発明の属する技術分野〕

本発明は、金属錯化剤またはビオチン含有の検出しう
る基を有する分子の製造および使用方法、並びに化合物
自身に関するものである。

〔従来技術とその問題点〕

薬剤を金属イオンで標識することにより得られる放射
能標識した診断用および治療用薬剤を使用することは、
近年、新たな興味を集めている。この技術においては、
キレート化成分を問題とする分子に共有結合させ、放射
性イオンをキレート化剤の金属封鎖基によりキレート化
する。かくして、放射能標識した薬剤を試験管内（たと
えば、放射線免疫分析方式）および生体内（たとえば、
診断影像技術および放射線治療技術）の両者に使用する
ことができる。非放射性型の金属標識を使用すること
も、たとえば核磁気共鳴、電子スピン共鳴、触媒技術な
どを利用する際に興味がある。

種々異なる金属キレート化基が、従来ビオポリマーに
結合されている。１−（Ｐ−ベンゼンジアゾニウム）ED
TA（Ｉ）から得られるエチレンジアミンテトラ酢酸（ED
TA）の活性同族体が、蛋白質に対し使用されている：〔たとえば、メアレス等に係る米国特許第4,043,998
号；サンドベルク等、ジャーナル・オブ・メジカル・ケ
ミストリー、第17巻、第1304−1307頁（1974）；または
サンドベルク等、ネイチャー、第250巻、第587−588頁
（1947）〕。式ＩのＰ−ベンゼンジアゾニウムEDTAは、
アゾ結合を介して選択チロシン，ヒスチジンもしくは蛋
白質のアミン残部へ結合され、これらは酸性に弱いトリ
アジンを生成する。

ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）は金属キレ
ート化剤であって、これもポリペプチドに結合されてい
る〔たとえば、クレジュカレク等、バイオケミカル・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミューニケーション、第
77巻、第582−585頁（1977）；ヒナトビッチ、サイエン
ス、第220巻、第613−615頁（1983）；またはカウ、同
上、第209巻、第295−297頁（1980）〕。キレート化剤
は、そのカルボキシル基の１つによりアミド結合を介し
て蛋白質由来のアミノ基に結合され、これを下記式IIに
示す：このDTPA結合体は、先ず二無水物を作成し、次いでこ
れを蛋白質と反応させることにより得られる〔たとえ
ば、シャインベルク、サイエイス、第215巻、第1511−1
513頁（1982）〕。しかしながら、二無水物の使用は、
分子内もしくは分子間で生ずる重大な架橋問題を引き起
こす。さらに、カルボキシ基の１つによるキレート化剤
の結合は、錯化成分としての配慮から、このカルボキシ
基を除去することがあり、したがって結合親和恒数およ
び構造の変化によりキレート化効率を低下させる。

さらに、ビーダー等に係る米国特許第4,352,751号
も、トランス−ジアミノシクロヘキサンテトラ酢酸（DC
TA）を使用してそのカルボキシ基の１個を介して蛋白質
のアミノ基へ結合させることによる蛋白質に対する金属
キレート化基の結合を示唆している。例として、ビーダ
ー等は、化合物（III）を生成するためのエチルアミン
との反応を示している：この化合物は、結合がカルボキシ基の１個を介して起
こり、したがって結合親和性を著しく低下させかつ得ら
れる金属錯体の構造を変化させる点において、DTPA錯体
と同じ問題を提起する。

さらに他の金属キレート化基がビオポリマーに結合さ
れており、たとえばメチルピコリンイミデートがリゾチ
ウムに〔ベニセク等、ジャーナル・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第243巻、第4267−4271頁（1968）〕、ま
たはフエリチンがモノクローナル抗体に〔ブロック等、
ネイチャー、第301巻、第342−344頁（1983）〕結合さ
れるなどしている。

親和性の喪失、蛋白質反応性残基に対する制約および
構造もしくは架橋における変化のような上記問題を克服
しうる手段が、本出願人による1982年６月23日付け出願
のエンゲルハルト等に係る「改変ヌクレオチド、その製
造および使用方法、並びにそれを含有する組成物」と題
する米国特許出願第391,440号明細書に開示され、これ
を参考のためここに引用する。エンゲルハルト等の特許
出願は、アリルアミン改変したデオキシUTPに対するDCT
Aのチオシアン酸誘導体の結合、およびポリヌクレオチ
ドに対する組み込みを開示している。下記式IVを参照。

デオキシUTPアリルアミンの使用、およびたとえばビ
オチンのような他の検出しうる基に対するその結合も開
示されており〔たとえば、ランガー等、プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミー・サイエンス、第78巻、第
6633−6637頁（1981）または1981年４月17日付け出願の
ワード等に係る「改変ヌクレオチド並びにその製造およ
び使用方法」と題する米国特許出願第255,223号〕、こ
れを参考のためここに引用する。

ヌクレオチド自身を大して改変する必要なくDCTAキレ
ート化剤またはその他のキレート化剤を使用し、生理学
的な化学工程条件を利用し、かつポリペプチド，ポリヌ
クレオチド，多糖類および小分子化学に利用しうる広範
囲の代替法を提供すれば有利である。

この種の方法の開発は、高親和性の有能な金属キレー
ト化剤、たとえばDCTAの使用を可能にすると共に、他の
キレート化剤またはたとえばビオチンのような検出しう
る成分の結合に拡大適用することもできるであろう。

〔発明の目的〕

したがって、本発明は、従来の上記問題点を解決しか
つ広範囲に使用しうる検出可能な分子を提供することで
ある。

〔発明の要点〕

１部として、本発明は重合体、特にたとえばポリヌク
レオチド，ポリペプチドもしくは多糖類のようなビオポ
リマーに対する金属キレート化基およびビオチンの迅
速、緩和かつ有能な結合法を見い出したことに基づいて
いる。結合法は公知の中間結合剤（しかしながら、これ
はこの目的には従来使用されていなかった）の使用を含
み、或いは或る場合には新規な結合もしくは架橋基の開
発を含んでいる。さらに本発明はこれら方法により得ら
れる生成物をも提供し、キレート化剤に結合された重合
体とその同族体との両者からなる生成物、ビオチンおよ
びその同族体、並びに各種の中間体まで拡張される。

さらに本発明は、たとえば各種のキレート化剤のよう
な種々の検出しうる薬剤およびビオチン成分に結合した
或る種の低分子量（約2000未満の分子量）を有する分子
を提供する。低分子量化合物は、直接結合により、また
は任意公知の結合手によりキレート化分子またはキレー
ト化能力を有する分子に結合することができる。低分子
量化合物とキレート化分子との間の低分子量結合体は、
したがって式（Ｖ）を有する： A¹……Det^a （Ｖ）式中、A¹は好ましくは2000未満の分子量を有する低分
子量化合物であり、Det^aはビオチンまたは検出しうる化
学成分であって、置換もしくは未置換の金属キレート化
剤または金属キレート化合物を生成しうる化合物であ
り、特に好ましくは式（VI）：〔式中、ＭおよびR³は下記する通りであり、かつ結合
「・・・」は直接共有結合、またはDet^aの信号能力を妨
げずかつA¹の分子識別特性を備え、さらにA¹とDet^aとの
間の安定な結合体を確保するような適当な結合手を示
す〕の一種である。

本発明の他の面は式（VII）:A³〔−Ｘ−R¹−Ｅ−Det^b〕_ｍ（VII）の化学構造をを有する検出可能な分子を構成する修飾剤
からなり、式中A³は修飾を受ける分子であって、アミ
ノ、ヒドロキシ、cis1,2−diOH、ハロゲン化物、アリー
ル、イミダゾイル、カルボニル、カルボキシル、チオー
ルまたは活性炭素を含む残基よりなる群から選択される
少なくとも１個の改変しうる反応基を有し、Ｘは −NH−CO−，−NH−CNH−，−Ｎ＝Ｎ−，−NH−SO
₂−，−OSO₂−，−NH−Ｎ＝Ｎ−，−NH−CH₂−，−CH₂
−NH−，−Ｏ−CO−，−NH−CO−CH₂−Ｓ−，−NH−CO
−CH₂−NH−，−Ｏ−CO−CH₂−，−Ｓ−CH₂−，−Ｏ−C
O−NH− よりなる群から選択され、 R¹はであるか、またはOHにより置換しうるC₁−C₁₀の分枝鎖
もしくは分枝鎖のないアルキルもしくはアラルキルであ
り、ＹはＳに対する直接結合であるか、またはＹはＳ−R²
（ここでR²はC₁−C₁₀の分枝鎖もしくは分枝鎖のないア
ルキルである）であり、 Z_aは塩素，臭素もしくは沃素であり、ＥはO,Nまたは非環式の二価硫黄原子であり、 Det^bはビオチンまたは置換もしくは未置換の金属キレ
ート化剤または金属キレート化合物を生成しうる化合物
からなる検出しうる化学成分であり、好ましくは式：〔式中、R³はC₁−C₄アルキルであるか、またはCH₂−COO
Mであり、各Ｍは適当な陽イオンである〕の化合物であり、ｍは１乃至A³における改変反応基の全個数の範囲の整
数である。

A³の例として、重合体または約2000未満の分子量を有
する化学実体であるA²が挙げられる。

さらに本発明の他の面は、式：〔式中、A³は上記の意味を有し、ｊは電子吸引基であ
り、Ｋは信号発生特性を有するか、または固体マトリッ
クスであり、ｎは１〜約２の整数であり、ｍは上記の意
味を有する〕の検出可能な分子を提供する。

本発明の他の具体例によれば、上記の基−Ｘ−R¹−Ｅ
−Det^bにより改変された個々のヌクレオチド，糖類また
はアミノ酸を提供する。さらに本発明の他の面は、上記
生成物の合成法、並びに一般的使用法を提供する。

ビオポリマーもしくは小分子と金属キレート化剤もし
くはビオチン成分との間に得られる共有結合体は、広範
囲の用途に使用することができる。たとえば、これら生
成物は、これに放射性金属をキレート化させることによ
り検出可能な化合物として使用することができる。さら
に、これらは広範囲の生体内および試験管内の治療，診
断，影像および分析（免疫分析またはハイブリッド化分
析）技術に使用することができる。ビオチン標識したビ
オポリマーまたは小分子は、ビオチン／アビジンまたは
ビオチン／ストレプトアビジンに基づく検出方式が従来
技術で使用されている所にはどこでも検出可能な分子と
して使用することができる。本発明の合成重合体は、こ
の合成重合体をビオポリマーまたは小分子へ結合させる
ことにより、ビオポリマーまたは小分子と同じ用途に使
用することができる。たとえば、この種の合成重合体
は、ビオポリマーまたは小分子１個当り多くの放射性金
属を与えて、極めて強力な信号を発生させることができ
る。

DCTAに基づくキレート化剤を使用する際の導入の容易
さ、生理学的工程条件、有能性およびその他の利点によ
り、特に高親和性を有し、構造を損うことなく、かつ導
入の際に架橋を防止するキレート化剤を提供することが
できる。さらに、この方法は、少なくとも下記する或る
種の結合法により、従来技術よりも多量の標識剤を１分
子当りに導入する能力を有する。

〔検出可能な分子の具体例の説明〕

生成物小分子量A²は、測定に際し免疫分析法に一般に関与す
るいわゆるリガンドをも包含することを意味する。これ
らは治療目的に使用される薬剤，天然に生ずる生理学的
化合物，代謝物，殺虫剤，汚染物質，酵素基質，酵素と
その基質との反応生成物などを包含する（有用なA²とし
ては、たとえばラウリー等に係る米国特許第4,220,722
号公報の第12,13,14および15欄を参照することができ、
これを参考のためここに引用する）。たとえば、A²には
アルカロイド，ステロイド，ラクタム，アミノアルキル
ベンゼン，ベンズヘテロシクリック，プリン，ビタミ
ン，プロスタグランジン，抗生物質，アミノ酸，殺虫剤
などが包含される。A²の分子量は約2000未満、特に約10
00未満である。

他方、低分子量化合物A¹にはA²につき上記した全ての
化合物が包含され、ただしA¹は単糖類またはモノヌクレ
オチドでない。好ましくは、A¹はアミノ酸でもない。し
たがって、一般にA¹は殺虫剤，薬剤，汚染物質，他の生
理学的化合物などの化合物を包含する。たとえば、A¹は
アルカロイド，ステロイド，ラクタム，アミノアルキル
ベンゼン，ベンズヘテロシクリック，プロスタグランジ
ン，抗生物質などを包含する。

本発明の修飾剤により構成される検出可能な分子の範
囲内にある或る種の他の化合物は、たとえばポリヌクレ
オチド，ポリペプチドもしくは多糖類またはこれらを含
有する大型フラクションのような合成重合体およびビオ
ポリマーを包含する検出可能な重合体である。

「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリリボヌクレ
オチド，ポリデオキシリボヌクレオチド並びに全ゆるポ
リプリン，ポリピリミジン若しくはその同族体およびそ
の混合物を包含することを意味する。例としてはDNA,RN
Aおよびその断片がある。

「ポリペプチド」という用語は、分子量が大きくても
小さくても、全てのポリアミノ酸連鎖を包含することを
意味する。これらは蛋白質，ホルモン，酵素，免疫グロ
ブリン，たとえばモノクローナル抗体，蛋白質錯体など
を包含する。

「多糖類」という用語は、天然もしくは非天然の線状
もしくは非線状、或いは架橋された水溶性もしくは不溶
性の未置換または部分的にもしくは完全に置換された全
ゆる多糖類を包含することを意味する。これらはセルロ
ース，澱粉，アミロース，アミロペプチンなどを包含す
る。

「合成」重合体という用語は、アミノ，ヒドロキシ,
1,2−cis−ジOH,ハロゲン，アリール，イミダゾイル，
カルボニル，カルボキシ，チオールまたは活性炭素を含
む残基よりなる群から選択される少なくとも１個の改変
しうる反応基を有する全ての合成重合体を包含すること
を意味する。この種の改変しうる反応基を有するよう改
変しうる適当な重合体の例は、限定はしないがポリエチ
レン，ポリアクリルアミド，ポリウレタン，ポリスチレ
ン，ポリエチレングリコール，ポリブタジエン，ポリビ
ニルアルコールおよびそのハロゲン化物および共重合体
を包含する。重合体が改変しうる反応基を含有しなけれ
ば、この種の反応基を有機化学の分野における当業者に
周知された任意の方法で重合体へ結合させることもでき
る。

反応前のA³（これはA²（上記）または重合体であって
もよい）は少なくとも１個乃至数個までの改変しうる反
応基を有する必要があり、この反応基はアミノ基（たと
えばリジンのアミノ基，蛋白質中のアミノ基，アミノ多
糖類におけるアミノ基またはヌクレオチド塩基における
反応性アミノ基），ヒドロキシ基もしくはcis−OH基
（たとえばステロイド，糖類，セリンまたはポリヌクレ
オチドの糖成分に存在するもの，たとえば末端３′もし
くは５′ヒドロキシ），カルボキシル基（たとえばアス
パラギン酸，グルタミン酸またはその誘導体），チホル
基（たとえばシスティン），カルボニル基（たとえば或
る種のステロイド，アルカロイド，天然蛋白質の末端部
分に存在するもの，或いは下記するように改変により得
られるもの），および活性炭素基を含む残基（たとえば
チロシン残基におけるＣ−３もしくはＣ−５炭素部位，
ヒスチジン残基におけるＣ−４部位，グアニン，イノシ
ン，シチジンもしくはその同族体における反応性炭素部
位（たとえばグアニンは位置Ｃ−８に反応性炭素原子を
有する））よりなる群から選択される。さらにA³は、ヒ
スチジン残基の１部としてのたとえば蛋白質中のイミダ
ゾイル基またはチロシン残基の１部としてのアリール基
または合成重合体の１部としてのハロゲンのような改変
しうる反応基を有することもできる。A³におけるこれら
分子もしくは分子部分の反応性炭素原子は、たとえばジ
アゾアリール機能のような電子親和性物質と共有反応し
て結合しうるものでなければならない（たとえば、ジア
ゾ結合反応）。

A³における改変しうる反応基は、さらにA³を改変して
或いはそこにこの種の基を導入して存在させることもで
きる。さらに、たとえばポリペプチドに対し共有的にま
たは非共有的に結合させうる酵素の補助因子に存在させ
ることもできる。

A³における改変しうる反応基の個数は、A²におけるこ
の種の基の存在もしくは不存在、或いはそれぞれポリペ
プチド，ポリヌクレオチドもしくは多糖類における或る
種の反応性アミノ酸，塩基もしくは糖類に依存する。ビ
オポリマーの場合、これはビオポリマーの実際の化学組
成，その分子量，並びにビオポリマーの三次元構造、し
たがって到達しうる反応基の相対的能力、および反応相
手に対する共有結合作用に依存する。たとえば、蛋白質
には、或る種の活性領域に存在する表面などに対し、よ
り接近することができれば、他のものよりも反応性の大
きい或る種の残基が存在することも知られている。ビオ
ポリマーを本発明にしたがって過剰の改変剤により改変
させる場合、上記の因子が改変の程度を決定する。した
がって、１個，数個或いはできれば全ての反応性残基、
塩基または糖成分は適当な反応相手と反応することがで
きる。

或いは、たとえば個々のアミノ酸または個々のヌクレ
オチドもしくは糖類のようなビオポリマーの個々の単位
は上記のように改変され、次いで最終的にビオポリマー
中へ組み込むことができるであろう。

いずれにせよ、所定のA²またはビオポリマーに反応基
が存在するかどうか、およびA²もしくはビオポリマーと
改変基との間の結合体の最終的化学量論を決定するため
にどの程度の残基が反応したかを推定するのは当業者の
日常の仕事である。放射能標識のような技術を使用し
て、改変の程度を推定し、かつ改変反応基の個数を実際
に計数することができる。大抵の場合、実際に改変され
た基の個数は、任意特定の化学物質における使用可能な
改変しうる基の個数よりも少ない。

本発明の修飾剤により構成される好適な検出可能な分
子は、式（VII）： A³〔−Ｘ−R¹−Ｓ−Det^b〕_ｍ（VII）〔式中、A³はA²またはポリヌクレオチド，ポリペプチド
もしくは多糖類からなるビオポリマーである〕を有するものである。

Ｘは一般にA³改変性反応基の１個と基R¹との間の共有結
合機能を備える。Ｘはたとえばアミドもしくはエステル
のような単一機能であっても、或いはA³における改変し
うる反応基とR¹基との間の架橋結合であってもよい。た
とえばＸがNH−COである場合、そのNH部分は一般にA¹ま
たはビオポリマーのアミン機能から生じ、Ｘは標準的ア
ミド基である。ＸがＮ＝Ｎ（アゾ結合）である場合、こ
の結合は一般に活性炭素を含有するA²もしくはビオポリ
マーの改変しうる基に結合される。

R¹は未置換のフェニルまたはたとえば塩素もしくは臭
素のようなハロゲンにより置換されたフェニルとするこ
とができる。R¹はさらに基Ｙにより置換されたフェニル
であってもよく、ここでＹはＳに対する直接共有結合ま
たはＳ−R²とすることができる。R²は二価のC₁−C₁₀の
分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキル，好ましくは低級
アルキル（C₁−C₆）、特に好ましくはメチル，エチル，
プロピル，イソプロピル,n−ブチル，イソブチルもしく
はペンチルとすることができる。

さらにR¹は二価のC₁−C₁₀の分枝鎖もしくは分枝鎖の
ない上記R²につき記載したようなアルキル，好ましくは
低級アルキル（C₁−C₆）、特に好ましくはC₂−C₄とする
ことができる。R¹はさらにたとえば低級アルキルにより
置換されたフェニルのようなC₁−C₁₀アラルキル，特に
ベンジルとすることもできる。

Det^bは検出しうる化学成分であって、ビオチンまたは
改変ビオチン分子からなり、或いは金属キレート化合物
または金属キレート化合物を生成しうる化合物であるDe
t^aからなっている。これら化合物のうち好適なものは、
たとえばEDTA,DTPAもしくはDCTAまたはその同族体のよ
うな分子である。特に好適なものは、式（VIII）：の化合物である。

この式はシクロヘキサンに基づく金属キレート化剤を
示し、これは位置４もしくは５を介して硫黄原子Ｓに結
合することができ、かつ１〜４個の金属もしくは非金属
陽イオン、一価の陽イオンまたはアルカリ土類金属を有
する。たとえば、酸化状態＋１を有する金属の場合、そ
れぞれ個々のシクロヘキサンに基づく分子は４個までの
金属陽イオンを有することができる（R³基の両者はCH₂C
OOMである）。しばしば、より高い酸化状態の場合、金
属の個数はシクロヘキサン骨格１個当り２個または１個
にまで減少する。シクロヘキサン官能価は種々の立体化
学を可能にし、かつ上記の式は任意特定の立体化学に分
子を限定する目的ではない。特に、両アミノ基は互いに
cisもしくはtransのいずれであってもよい。

シクロヘキサンは未置換（２個の窒素官能基と硫黄置
換基とを除く）であってもよく、或いは特に４位置にヒ
ドロキシまたは、たとえば低級アシル置換のようなアシ
ル化ヒドロキシ基で置換されていてもよい。

本発明の目的で、その他のシクロヘキサンに基づく同
族体、たとえばアルキル誘導体（たとえば低級アルキ
ル）または置換生成物（ここで誘導体または置換体は硫
黄に対するシクロヘキサン骨格の結合、個々のキレート
化成分のキレート化能力（親和性，構造など）または改
変A³の全体的生物学活性を妨げない）も上記に示したも
のと同等である。本発明の目的で同等な置換基はたとえ
ばヒドロキシ，アシル，ハロゲン，アミノなどである。

結合されたシクロヘキサン成分を有するA³部分は酸型
（Ｍ＝Ｈ）または非放射性の金属もしくは非金属型（た
とえばＭ＝Mg⁺²,Na⁺,K⁺,Li⁺,▲NH⁺ ₄▼など）または放射
性金属型とすることができる。

生体内または試験管内の診断法で検出しうる、或いは
生体内または試験管内で治療作用を行ないうる任意の金
属を使用することができる。非放射性金属および放射性
金属の両者をこの目的で使用することができる。たとえ
ば、化学反応を触媒しうる金属,NMRもしくはESRスペク
トルを行ないうる金属，または種々の種類もしくは強度
の照射線を放出しうる金属も使用することができる。特
にヒトもしくは動物体内における治療もしくは診断効果
を与えうる、或いは試験管内の診断分析を可能にする任
意の放射性金属を、本発明の実施に使用することができ
る。適するイオンは次のものを包含する：アンチモン−
124,アンチモン−125,砒素−74,バリウム−103,バリウ
ム−104,ベリリウム−7,ビスマス−206,ビスマス−207,
カドミウム−109,カドミウム−115m,カルシウム−45,セ
リウム−139,セリウム−141,セリウム−144,セシウム−
137,クロム−51,コバルト−56,コバルト−57,コバルト
−58,コバルト−60,エルビウム−169,ヨーロピウム−15
2,ガドリニウム−153,金−195,金−199,ハフニウム−17
5,ハフニウム−175＋181,インジウム−111,イリジウム
−192,鉄−55,鉄−59,クリプトン−85,鉛−210,マンガ
ン−54,水銀−197,水銀−203,モリブデン−99,ネオジミ
ウム−147,ネプチニウム−237,ニッケル−63,ミオブ−9
5,オスミウム−185＋191,パラジウム−103,白金−195m,
プラセオジニウム−143,プロメチウム−147,プロタクチ
ニウム−233,ラジウム−226,レニウム−186,ルビジウム
−86,ルテニウム−103,ルテニウム−106,スカンジウム
−44,スカンジウム−46,セレニウム−75,銀−110m,銀−
111,ナトリウム−22,ストロンチウム−85,ストロンチウ
ム−89,ストロンチウム−90,硫黄−35,タンタル−182,
テクネチウム−99m,テルル−125,テルル−132,ツルビウ
ム−160,タリウム−204,トリウム−228,トリウム−232,
タリウム−170,錫−113,チタン−44,タングステン−18
5,バナジウム−48,バナジウム−49,イッテルビウム−16
9,イットリウム−88,イットリウム−90,イットリウム−
91,亜鉛−65およびジルコン−95。

上記式（VII）の範囲内の好適な種類は次のものであ
る： C₁−C₁₀の分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキルと結
合したNH−CO; Ｎ＝Ｎ−アリール（ここでアリールは式（VII）で定
義したと同様である）と結合したチロシン，ヒスチジン
またはグアニジン、イノシンもしくはシチジンにおける
活性炭素； C₁−C₁₀の分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキル、或い
はアリール（ここでアリールは式（VII）に定義したと
同様である）と結合したNH−CO−CH₂−Ｓ。

本発明の修飾剤により構成される検出可能な分子の特
定例を下記第Ｉ表に示す： A¹もしくはA²低分子量体の特定例はジゴキシン，モル
フィン，コデイン，ヘロイン，ジテルペンアルカロイ
ド，エストロデン,DES,バルビツール，アンフェタミ
ン，カテコールアミン，クロルプロマジン，アゼピン，
ジアゼピン，カフェイン，テオフィリン，カナビノー
ル,THC,ペニシリン，エタムブゾール，クロロマイセチ
ン，ニトロフラントイン，メタドン，セロトニン，抗ヒ
スタミン，ポリハロゲン化ビフェニル，燐酸エステル，
チオ燐酸エステル，カルバミン酸エステル、並びにその
代謝物，誘導体および同族体である。

本発明の他の好適な生成物は、式（IX）：〔式中、A⁴はA²または重合体であり、A²と重合体との両
者はアミノ，アリール，イミダゾールおよび活性炭素を
含む残基よりなる群から選択される少なくとも１個の改
変しうる反応基を有し、A²は約2000未満の分子量を有す
る化学実体であり、ｊは電子吸引基であり、Ｋは信号発
生特性を有するか、または固体マトリックスであり、ｎ
は１〜約２、好ましくは２の整数であり、かつｍは上記
の通りである〕を有するものである。

ｊは主として電子吸引基とすることができる。好まし
くは、ｊは塩素，弗素，臭素，スルホン基および沃素よ
りなる群から選択され、塩素が特に好適である。

Ｋは主として従来技術で使用された信号発生特性を有
するものを包含し、将来開発される全てのものを包含す
る。これは信号自体（たとえば放射能標識を発生しうる
成分、または後の反応操作に際し信号を発生する成分、
たとえば酵素結合した系とすることができる。限定はし
ないが、適する信号発生するものの例は、本出願人によ
り1982年６月23日付けで出願された米国特許出願第391,
440号明細書に開示されている。Ｋは従来公知の任意の
方法でベンゼン環に結合させることができる。さらにＫ
は、たとえばセルロースのような固体マトリックスであ
ってもよい。ジアゾニウム化合物を、シードに係る米国
特許第4,286,964号公報に開示された方法でセルロース
へ固定することができる。

式（IX）の好適化合物は次の通りである：式（IX）の化合物は驚く程安定であり、かつ強力な電
子親和性のものである。このような安定性および強力な
電子親和性は、式（IX）の化合物を、改変性反応基が極
めて不活性である、たとえばクアニンのＣ−８位置にお
ける反応性炭素のような場合に、A³に式（IX）の化合物
を結合させることができる。このような安定性および強
力な電子親和性は、ベンゼン環における電子吸引基に基
づくものと思われる。

本発明の修飾剤により構成される検出可能な分子の範
囲内にある他の化合物は、個々に改変されたモノヌクレ
オチド（リボ−およびデオキシリボ−）であって、式
（Ｘ）：〔式中、P_Zはまたはその金属もしくは非金属塩であり、 Q¹はＨまたはOHであり、 BAはたとえばグアニン，イノシンまたはシチジンのよ
うな改変しうるプリンもしくはピリミジン塩基である〕を有する。

これら化合物のうち好適なものは、BAが式（XI）：を有するものである。

下記の種々の中間体は、本発明の範囲内にある好適化
合物である。

方法好適なシクロヘキサンに基づく骨格に関与する反応は
DCTAまたはその同族体，置換誘導体につき行なうことが
でき、これら化合物は次の方法のいずれかにしたがって
製造される：方法I:ブロム−DCTAの製造方法Ｉは、3,4−ジニトロ−フェノール（Ｉ−１）か
ら3,4−ジアミノシクロヘキサン（Ｉ−２）への還元、
3,4−ジアミノシクロヘキサンから3,4−ジアミノブロム
シクロヘキサン（Ｉ−３）への臭素化、およびこの化合
物とハロゲン置換されたカルボキシルメチル化合物との
反応によるそのテトラカルボキシルメチル誘導体の生成
を示しており、これにより標記化合物（Ｉ−４）を与え
る。これら反応の詳細は、エンゲルハルト等に係る1982
年６月23日付け出願の米国特許出願第391,440号明細書
に見ることができる。

方法II:置換DCTAの製造（たとえば４−ヒドロキシ−５−ブロムDCTAを例とす
る）方法IIは、出発物質としての４−シクロヘキセン−1,
2−ジカルボン酸無水物（II−１）の使用を示してい
る。アルコールおよび次いでヒドラジンとの反応はジヒ
ドラジド（II−３）を生成し、これは硝酸塩と反応させ
かつ加熱するとジウレタン（II−５）まで再配列する。
ジウレタンを塩基で処理するとジアミン（II−６）が得
られ、これは次いでカルボキシアルキル化して1,2−ジ
アミノ−４−シクロヘキセンテトラ酢酸（II−７）を生
成することができる。たとえば、この化合物を次いでＮ
−ブロムスクシンイミド（NBS）で処理して４−ブロム
−５−ヒドロキシDCTA誘導体（II−８）を生成させるこ
とができる。これら反応の詳細は後記実施例に見ること
ができる。

方法III:ジアミノシクロヘキサン−N,N−（ジアルキル
ジ酢酸）誘導体の製造方法IIIは、1,4−シクロヘキサジエン（III−１）を
使用してジブロム誘導体（III−２）を生成させ、これ
を次いでＮ−アルキル置換したグリシンと反応させて標
記化合物（III−３）を生成させる過程を示している。

上記方法I,IIまたはIIIにおいて、勿論、他のハロゲ
ン或いはハロゲン類似物も使用しうることが理解され
る。何故なら、目的はシクロヘキサンをメルカプト基SH
により置換されうる遊離基でシクロヘキサンを置換する
ことにあるからである。この種の遊離基は塩素，臭素，
シアノ，トシル，メシルなどの基とすることができる。

これら方法に使用する中間体または出発物質（たとえ
ば、ジエステルシクロヘキセン（II−２）を、さらに置
換されたシクロヘキサン骨格の製造に使用することがで
き、これは有機化学の当業者により容易に了解されるで
あろう。たとえば、各種の改変基または置換基を、キレ
ート化基または置換しうる遊離基の基礎的化学特性に影
響を与えることなく、シクロヘキサン骨格中へ導入する
ことができる。

A³に対する置換もしくは未置換のシクロヘキサン骨格
の結合は酸素，窒素または好ましくはジオール含有化合
物の硫黄原子と、シクロヘキサンにおける置換しうる基
との間の基本的な核親和性置換反応を介して行なわれ
る。結合は３つの一般的経路のいずれかを取ることがで
きる。

第１に、A³−Ｘ−Ｒ−SH成分を核親和性置換により遊
離基含有のシクロヘキサンへ結合させることができる。

第２に、反応基を有するA³成分を予め製造されたX¹−
Ｒ−Ｓ−Det^b（ここでX¹はA³における改変しうる反応基
と反応してＸを生成しうる基である）へ結合させること
ができる。

第３に、第１の方法と第２の方法とを組み合せて使用
し、A³を先ず架橋基の１部と反応させ、次いでこれを予
め改変されたシクロヘキサンと反応させて最終結合体を
生成させることができる。

第２の方法（下記方法IV）において、ジアゾアリール
成分を含有するシクロヘキサン（（IV−２）、硫黄を介
してシクロヘキサンに結合）を製造し、かつこれを蛋白
質もしくはポリヌクレオチドと次のように反応させるこ
とができる。

方法IV: 第３の方法において、たとえば改変しうる反応基をハ
ロアシル基と反応させ、次いでこの改変したA³をたとえ
ば、チオールもしくはアミンのような核親和性基を有す
る改変シクロヘキサンと反応させることにより、予めA³
を改変することができる（方法Ｖ）。

方法V: 方法（Ｖ）におけるようなハロアシルA³の製造は、た
とえばミーンズおよびフィーネー，ホールデン−ディー
・インコーポレーション社（1971）により刊行物「蛋白
質の化学的改変」およびローレー等に係る米国特許第4,
220,722号公報に示されており、この両者を参考のため
ここに引用する。

上記方法（Ｖ）における「A³−NH」成分は、代案とし
て、遊離基を有するジアゾアリール基（たとえば3,4,5
−トリクロルベンゼンジアゾニウム塩）を有する化合物
によって改変させることもできる。この種の化合物は、
テトラフルオロ硼酸型として公知である（コルゼニオウ
スキー等、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミスト
リー、（1981）、第46巻、第2153−2159頁）。改変しう
る反応基A³に対するこの化合物の結合は、置換しうる塩
素原子をそこに結合することによりA³を改変する（この
種の方法は、工程を逆転することにより得られる上記方
法（IV）の変法である。一般に、ビオポリマーに対する
アリールジアゾニウム機能の結合は公知である〔シード
に係る米国特許第4,286,964号およびメールス等に係る
米国特許第4,043,998号参照〕。

本発明の修飾剤により構成される最終生成物を製造す
るのに有用な特にビオポリマーに対する他の可能なA³改
変は、アミノ基とジケテンとの反応によりA³を有するア
セトアセチルを生成させ、できれば次いで還元すること
を含む（ミーンズおよびフィーネー、上記、第80−81
頁）。アセトアセチルにおけるケトン基の使用は還元ア
ミノ化反応に有用であり、ここでシクロヘキサンキレー
ト化剤は各親和性アミンを有する。

アミンを含有するビオポリマーをアルカリ性溶液中で
イミドエステルと反応させて、イミドアミド（いわゆる
アミジン）を生成させることができる（ミーンズおよび
フィーネー、上記、第90−91頁）。この反応は、ややア
ルカリ性のpHにおいて水性溶媒中で室温にて生ずる。適
当に置換されたアミジンを製造することができ、これを
次いで改変シクロヘキサンキレート化剤と反応させるこ
とができる。

ハロゲン化スルホニルおよび置換ハロゲン化スルホニ
ル、たとえば塩化物および弗化物は、蛋白質のアミノ，
スルフヒドロ，イミダゾールおよびフエノール性ヒドロ
キシ基と反応することが知られている（ミーンズおよび
フィーネー、上記、第97頁）。脂肪族ヒドロキシ基との
反応はやや遅い。適当に置換されたハロゲン化スルホニ
ルを使用して、たとえば置換しうる塩素のような置換し
うる基をビオポリマー中へ導入することができる。

個々の改変モノヌクレオチドは、上記方法のいずれか
をモノヌクレオチドに適用して製造することができる。

多糖類に対するDet^bの結合は、たとえば任意のcis−
ジオールを含有する多糖類を臭化シアノゲンと反応さ
せ、次いで得られた水溶性もしくは不溶性の活性多糖類
を適当に改変されたシクロヘキサンキレート化剤、その
先駆体もしくはビオチンを含む核親和性基と反応させて
行なうことができる。同じ方法を、たとえばジゴキシン
のような低分子量のcis−ジオールを含有する分子の製
造に適用することもできる。

ビオチンからなる検出しうる成分の結合は、一般に硫
黄含有の核親和性化合物の結合によるビオチン側鎖の改
変を必要とする。この種の改変の例を下記方法（VI）に
示す：方法VI: 方法（VI）は１−アミノ−２−メルカプトエタンの使
用を例示している。さらに、この方法は3,4,5−トリク
ロルベンゼンジアゾニウム塩の使用を例示しているが、
他の結合剤も使用することができる。たとえば、A³がビ
オポリマーである場合、これを適当なハロゲン化物で改
変させることができ、かつメルカプト誘導体（VI−５）
をこれと反応させて最終生成物を得ることができる。

一般に、シクロヘキサンキレート化剤またはその誘導
体との反応は、中和型の分子（COOHまたはCOONaもしく
はCOO−アルキル型）を用いて、或いは化学理論量のた
とえばマグネシウムのような他の金属の存在下で行なう
ことができる。非放射性の方法（NMR,ESRなど）により
検出しうるまたは影像化しうる金属または放射能標識し
た金属を含有する活性な検出しうるシクロヘキサン成分
の製造は、有機合成における最終工程の後に行なうこと
ができる。

特に興味あるものは、放射能標識した化合物の製造の
後に、この化合物を使用することである。放射能標識し
た診断用または治療用分子の製造方法は、一般に分子識
別しうる部分および放射性金属イオンとキレート化しう
るキレート化部分からなる治療用もしくは診断用薬剤
を、放射性金属イオンが結合され、かつ放射性金属イオ
ンに対するキレート化部分の結合親和性よりも小さい放
射性金属イオンに対する結合親和性を有するイオン交換
物質と接触させることであり、この場合接触させる前に
キレート化部分をキレート解除し、或いは放射性金属イ
オンの結合親和性よりも小さいキレート化部分に対する
結合親和性を有する第２の金属イオンでキレート化さ
せ、これにより放射能標識した治療用もしくは診断用薬
剤を接触および次いでイオン交換物質からの放射能標識
された治療用もしくは診断用薬剤の分離により生成させ
る。このように生成された放射能標識した物質を、次い
で直ちに試験管内または生体内の診断過程に使用する。
この種の方法は、ワイ・スタブリアノポラスにより本出
願と同時出願の「キレート化基を有する診断用および治
療用薬剤の放射能標識法」と題する米国特許出願明細書
に開示され、これを参考のため、ここに引用する。

本発明の他の面によれば、上記合成法に使用される種
々の中間体が提供される。したがって、本発明はさらに
式（XII）：〔式中、A³は上記の意味を有しかつアミンおよび活性炭
素を含む残基よりなる群から選択される少なくとも１個
の改変しうる反応基を含有し、 Z_bは塩素，臭素もしくは沃素であり、ｍは１乃至A³における改変反応基の全個数に至る範囲
の整数である〕の改変化合物を包含する。

この改変A³は、本発明の好適な最終検出可能化合物を
製造するのに有用である。

さらに本発明は、式（XIII）：の化合物またはその４−ヒドロキシもしくはアシルオキ
シ誘導体を包含し、上記式中Ｍは前記した通りであり、Ｓは二価の硫黄原子であり、 Q²はＨ、分枝鎖もしくは分枝鎖のないC₁−C₁₀アラル
キルもしくはアラルキルであって、OH,CH,NH₂,CONHNH₂
またはＣ−L_Vよりなる群から選択される基を有し、ここ
でL_Vは置換しうる遊離基であり、或いは、Q²はであり、ここでZ_Cは水素，塩素，臭素もしくは沃素であ
り、ＪはNH₂または▲Ｎ⁺ ₂▼CA^-であり、CA^-は対応陰イオ
ンである。

L_Vの例はN₃,Cl,Br,トシル基，メシル基などである。C
A^-の例はフルオロ硼酸基，テトラフルオロ硼酸基，トシ
ル基，過塩素酸基などである。

さらに他の中間体は、式（XIV）：〔式中、P_Z,BAおよびQ¹は上記の通りである〕の改変モノヌクレオチドである。

改変モノヌクレオチド（XIV）は、ポリヌクレオチド
中へ組み込まれ、次いで適当なSH基含有のシクロヘキサ
ンキレート化剤またはビオチンと反応させることができ
る。代案として、改変モノヌクレオチド（XIV）をシク
ロヘキサンキレート化剤またはビオチンと反応させ、得
られた生成物をポリヌクレオチド中へ組み込むことがで
きる。

さらに、他の中間体は、式（XV）：〔式中、j,nおよびＫは上記の意味を有し、かつCA^-は適
当な対応陰イオンである〕の化合物を包含する。

小分子量のキレート化剤を含有する化合物（Ｖ）： A¹・・・Det^a （Ｖ）の製造は、金属キレート化成分または金属キレート化し
うる成分を分子へ結合させる任意周知の方法で行なうこ
とができる。たとえば、EDTA,DTPAもしくはDCTAのよう
なキレート化剤をA¹のアミノもしくはヒドロキシ基に結
合させて、アミドもしくはエステルを生成させることが
できる。ジアゾアリールを含有するキレート化剤または
その能力を有するキレート化剤を、A¹における活性化芳
香族基に結合させることもできる。

用途本発明によるキレート化剤またはビオチン含有化合物
の使用および用途は限定されず、この種の着脱自在に標
識した化合物を従来技術で用いている全ゆる用途に拡張
することができる。たとえば、試料中で検出しかつ分析
することが望ましい任意の化合物を、本発明の技術によ
り改変させることができる。特に興味あるものは、たと
えばサンドイッチ免疫分析法のような免疫分析法に使用
するための抗体の改変である。さらに、興味あるものは
放射線免疫分析法のための薬剤または微生物隔膜に存在
することが知られた蛋白質の改変である。このように製
造された着脱自在に標識した蛋白質は、競合免疫分析法
にも使用することができる。標識したポリヌクレオチド
は、ハイブリッド化分析に使用することができる。

本発明による検出可能な化合物、特にビオポリマーの
他の用途は、特にモノクローナル抗体による影像化であ
る。これらは本発明の技術により改変することができ、
かつたとえば動物体のような生体物質における所定部位
に金属を導入することもできる。次いで、検出を放射線
技術により行なうことができる。このような部位に導入
された金属をエミッタとなるように選択して、局部的放
射線治療を行なうこともできる〔たとえば、エス・デナ
ルド等、「ヌクレア・メディスン・アンド・バイオロジ
ー」、第IV巻、ベルガモン・プレス社、パリ、フランス
（1982）第182−185頁〕。

特に興味あるものは、ウイルス性および細菌性のDNA
配列の検出および同定である。

本発明により製造されたポリヌクレオチド生成物を使
用して、遺伝子障害に関連するDNA遺伝子配列に対し補
完的なヌクレオチドを作成し、かつハイブリッド化の存
在を検出することにより、遺伝子障害を診断することが
できる。検出しうるポリヌクレオチドはさらに染色体の
核型分類に使用することもでき、これは染色体に位置す
る一連の所定遺伝子配列に対応する一連の改変ポリヌク
レオチドを使用し、次いでハイブリッド化を検出するこ
とからなっている。

他の用途は、細胞の表面におけるホルモン受容部位を
同定し、または位置決定する方法を含み、この方法は本
発明による検出可能なビオポリマーであるホルモン受容
体結合化合物を結合させ、次いで検出装置により結合を
検出することからなっている。

本発明による金属キレート化結合体の他の用途は、金
属イオンの不必要かつ危険な蓄積をキレート化部分が結
合された特定ビオポリマーにより特定される目標物から
除去することである。一般に、本発明によるキレート剤
標識した分子は、公知または将来見い出される他の検出
装置に使用することができる。これらの用途は、放射性
薬剤として使用するための非放射性重金属イオンによる
キレート化,NMRにより検出しうる金属イオンのキレート
化，触媒特性を有しかつ染色体化学反応を触媒しうる金
属によるキレート化などを包含する。

ビオチン結合した化合物は、これらをアビジンまたはス
トレプトアビジンと一緒に培養して検出することがで
き、この場合アビジンまたはストレプトアビジンは、た
とえば染色体化合物の生成を触媒しうる酵素（たとえば
アルカルホスファタービまたはペルオキシダーゼ）のよ
うな検出しうる標識へ共有結合される。これは標準的な
周知の酵素結合した免疫分析方式（ELISA）であり、198
2年６月23日付け出願のエンゲルハルト等による「改変
ヌクレオチド、その製造および使用方法並びにそれを含
有する組成物」と題する米国特許出願第392,440号明細
書に記載されており、これを参考のためここに引用す
る。

さらに、本発明は、キットの作成を容易に可能にす
る。このキットは、分室を有してそこにたとえば試験
管，小壜，フラスコ、壜，注射器などの一連の容器手段
を封入する支持体から構成することができる。この種の
一連の容器手段の１つは、本発明による検出可能な化合
物、または標準的内挿曲線を作成しうるような種々の濃
度で存在させた化合物を含有することができる。キレー
ト剤結合した化合物を非放射能標識金属型で設ければ、
他の容器手段が所望の放射性金属および適当なイオン交
換物質を含有して、放射性金属に対する「コールド」の
交換を与えることができる。たとえば、使用者は、キレ
ート化剤結合化合物を放射性金属で容易に標識すること
ができる。或いは、第２の容器手段または一連の容器手
段はアビジンまたはストレプトアビジンを含有すること
ができ、これら分子を酵素免疫分析系に使用するための
酵素に共有結合させることができる。

〔発明の実施例〕

以下、本発明を実施例につき説明するが、本発明はこ
れらのみに限定されない。

実施例１ 1,2−trans−ジアミノシクロヘキセンテトラ酢酸の合
成工程1: 無水４−シクロヘキセン−1,2−ジカルボン酸（154
g、1.01モル）を700mlの等級200の無水エタノールに溶
解させた。濃硫酸（40ml）を加え、反応混合物を３時間
還流させた。約350mlのエタノールを蒸留により除去し
た。さらに蒸留によりエタノール−水の共沸混合物の１
部として水を除去した。約350mlの等級200の無水エタノ
ールを加え、次いで反応物をさらに90分間還流させた。
次いで空気ポンプ（アスピレータでない）を備えた回転
式蒸発器を用いて、約400mlの溶剤を除去した。残留す
る反応混合物へ１のエーテルを加え、そして反応生成
物を溶解させた。この反応混合物を氷水混合物（１の
水と１の氷）に注ぎ入れ、次いで分液漏斗に入れた。
振とうしかつエーテルと水層とを分離させた後、水層を
除去して捨てた。エーテル相を100mlずつの５％重炭酸
ナトリウムの冷溶液で３回抽出して、H₂SO₄とモノエス
テルとを除去した（最終重炭酸抽出物のpHは新たな５％
重炭酸溶液と同じであった）。エーテル相を無水Na₂SO₄
で撹拌しながら90分間脱水した。Na₂SO₄を濾過により除
去した。エーテルを、回転蒸発器および空気ポンプで生
成物４−シクロヘキサン−1,2−ジカルボン酸エチルジ
エステルから除去した。殆どのエーテルが除去された後
に、徐々に水浴温度を90℃まで高めて、残余のエーテル
を定量的に除去した。収量160gの液体ジエステルが得ら
れた。

工程2: ４−シクロヘキセン−1,2−ジカルボン酸エチルジエ
ステル（160g,0.707モル）と250mlの市販級ヒドラジン
（54％ヒドラジン＝4.22モル）とを撹拌せずに還流装置
へ入れた。次いで、油浴をアルゴン雰囲気中で130℃ま
で加熱した（ジエステルとヒドラジンとが二相として残
留した）。無水（等級200），エタノール（100ml以下）
を急速撹拌しながら還流凝縮器の頂部から一相となるま
で加えた（乳濁相が消失した）。この反応混合物を、ア
ルゴン雰囲気中で撹拌しながら（固化を防止する）130
℃にて24時間還流させた。生成物４−シクロヘキセン−
1,2−ジヒドラジンが生成されるにつれて沈澱した。反
応混合物がまだ暖かいうちに、これを２のビーカーに
注ぎ入れて冷却させた。混合物が固化し、この粗生成物
をブフナ漏斗で濾過した。濾過に際し、ブフナ漏斗上に
ある固体をエタノールで洗浄した。粗製ヒドラジドを次
のように再結晶化させた：１の85％エタノール（水中）を撹拌しながら加熱し
た。粗製ヒドラジドの１部（40−50g）を加えた。ヒド
ラジドを溶解させながら、混合物を10分間煮沸した。こ
の溶液をデカンとして不溶性物質を除去し、溶液を徐々
に室温まで冷却させた。溶液が冷却されるにつれて、ヒ
ドラジドが沈澱した。これをブフナ漏斗により濾過し、
次いで少量のエタノールで洗浄した。

濾液の容量を無水エタノールで１に調整した。次い
で、濾液を撹拌しながら加熱し、さらに粗製ヒドラジド
の40〜50gを上記と同様に再結晶化させた。粗製ヒドラ
ジドの全部が再結晶化するまで上記手順を反復した。全
部で120gのヒドラジドが得られた。

工程3: ４−シクロヘキセン−1,2−ジヒドラジド（20g、0.10
1モル）を200mlの2N硫酸に溶解させた。エーテル（250m
l）を加え、そして反応フラスコを氷−塩の浴に入れ、
そして−２〜−３℃まで冷却した。５〜10分間かけて、
激しく撹拌しながら亜硝酸ナトリウム（13.9g、0.202モ
ル）を加えた。混合物の温度は５℃より高くせず、撹拌
を10分間続けた。この反応混合物を冷めたい分液漏斗
（この分液漏斗と１の三角フラスコとを冷凍機におい
て冷却した）に注ぎ入れ、相を分離させた。エーテル相
を冷やした三角フラスコに移した。水相を約100〜150ml
ずつの冷エーテルにより次のように２回抽出した。水相
を氷浴（塩を含まない）中でエーテルと共に10分間撹拌
し、次いで冷やした分液漏斗を用いて相分離させた。冷
エーテル抽出物を合し、次いで30mlずつの冷５％重炭酸
ナトリウム溶液で２回抽出した。エーテル相を60gの無
水硫酸ナトリウムで４℃にて30分間撹拌することにより
脱水した。硫酸ナトリウムをガラスウールを介して濾過
することにより除去した。生成物４−シクロヘキセン−
1,2−ジアジド（エーテル中）は、精製せず、或いは特
性化しなかった。次の反応を行なうため、アジドをエー
テルからベンゼンに次のように移した。アジドを含有す
るエーテル溶液の１部（全エーテル容量の1/3）を約150
mlの無水ベンゼンに加えた。エーテルを、回転式蒸発器
および空気ポンプを用いて急速に蒸発させた。水浴の温
度は、エーテル除去の際45℃以下に保った。エーテル中
のアジドの１部（それぞれ約1/3）を、アジドの全部が
ベンゼンへ移されるまで加えた。

工程4: 100mlの無水トルエン（100ml）とベンジルアルコール
（30ml、0.289モル）とをフラスコ中に入れ、70℃まで
加熱した。ベンゼン溶液（上記工程から得られたもの）
における４−シクロヘキセン−1,2−ジカルボキシルア
ジドの１部（10ml）を徐々に（約150mlのベンゼン溶液
に対する全時間は約30分間である）加えて、N₂を発生さ
せ、かつ温度が80℃を越えないようにした。上記工程か
らのベンゼン溶液の全部を加えた。

この時点で、さらに上記工程からのヒドラジド20gを
アジドに変化させた。しかしながら、上記工程は、次の
ように改変した。150mlでなく100mlのベンゼンをヒドラ
ジド出発物質20g当りに使用した。上記からの残余のト
ルエン−ベンジルアルコール混合物に20mlのベンジルア
ルコールを追加し、次いで100mlのベンゼン溶液を上記
と同様に10mlずつ反応させた。この工程をさらに他の20
gのヒドラジドにつき反復した。３つのバッチを合し、
そして10mlのベンジルアルコールを加えた（60gのヒド
ラジドにつき全部で0.772モル）。できるだけ多量のベ
ンゼンを蒸留により除去し、次いで残留する反応混合物
を120℃の浴温度にて１晩還流させた。この時間中に反
応混合物は赤褐色となった。トルエンを減圧ポンプ（0.
5mmHg）を備えた回転式蒸発器で除去した。酢酸（100〜
200mlの水中50％の氷酢酸）を反応フラスコに加え、そ
して混合物をガラス棒で撹拌した。所望のウレタン生成
物（４−シクロヘキセン−trans−1,2−ジベンジルウレ
タン）は不溶性であったが、赤褐色は液相中へ移行し
た。このウレタン生成物をブフナ漏斗で濾過し、水中の
冷50％氷酢酸で洗浄した。分析のため、ウレタンを水中
50％の氷酢酸から再結晶化させた。収量60gのウレタン
が得られた。

工程５上記工程からの４−シクロヘキセン−trans−1,2−ジ
ベンジルウレタン（60g）を300mlの7N水酸化ナトリウム
へ加え、１時間還流させた。極めて効率的な凝縮器を用
いて、約70mlの水を蒸留除去して、約10Nの最終水酸化
ナトリウム濃度にした。この水酸化ナトリウム濃度に
て、反応の際生成した炭酸ナトリウムが沈澱した。混合
物を冷却させ、次いで炭酸ナトリウムをブフナ漏斗での
濾過により除去した。炭酸ナトリウムを100〜150mlのｎ
−ブチルアルコールで洗浄した。得られた濾液は二相を
有し、この濾液を分液漏斗に入れ、かつ振とうして水層
を除去した。次いで、150mlの水および濃塩酸をpHが１
になるまで加えた。混合物を振とうし、かつ相を分離さ
せた。この時点で、殆んどの生成物trans−1,2−ジアミ
ノ−４−シクロヘキセンは水相中で二塩酸塩型であっ
た。濃塩酸（50ml）を有機相に加え、生成物アミン二塩
酸塩の大部分が沈澱した。固体をブフナ漏斗で濾過し、
次いで水酸化ナトリウムペレットを含むデシケータで乾
燥して、塩酸を除去した。殆んどの生成物を含有する水
相を減圧ポンプ（0.5mmHg）を備えた回転式蒸発器で蒸
発乾固させた。２つの生成物バッチを合し、これを精製
することなく次の工程に使用した。アミンへの変換は10
0％であると推定された。

工程6: 塩酸塩型のアミンtrans−1,2−ジアミノ−４−シクロ
ヘキセン（ウレタンからの定量的な変換と推定される,
0.158モル）および75gのクロル酢酸（0.79モル）（両者
とも固体）を、大型撹拌器と氷浴とを備えた三角フラス
コにおいて混合した。冷7N水酸化ナトリウム（約113m
l）を徐々に加えて、クロル酢酸を中和した。反応混合
物を冷却し続けるよう注意した（20℃以下）。次いで水
酸化ナトリウムを添加すると、アミンの懸濁物が得られ
た。この反応混合物をゆっくり撹拌し、かつ55℃の油浴
中で加熱した。pHを監視するため、pH計を用いながら7N
水酸化ナトリウムを加え、pHを９〜10の範囲に保った。
全てのアミンが溶解した後、油浴温度を90〜95℃まで１
時間で上昇させた。この間、pHを7N水酸化ナトリウムに
より９〜10の範囲に維持した。反応混合物を冷却し、次
いでpHを濃塩酸により、1.2に調整した。１のアセト
ンを室温にてゆっくり加え、そして大半の副生物、塩化
ナトリウムが沈澱した。この塩化ナトリウムをブフナ漏
斗での濾過により除去した。所望生成物、すなわちtran
s−1,2−ジアミノ−４−シクロヘキセンテトラ酢酸が濾
液中に残留し、これは淡赤褐色であった。アセトンを、
最終80℃の浴温度にて回転式蒸発器により除去した。水
溶液中に生成物が残留し、これを１晩冷却させた。僅か
に沈澱物が生じた。pHを1.2に再調整し（0.9であったも
の）、フラスコの壁部を引っ掻いて結晶化を誘発させ
た。磁気撹拌器により撹拌すると、さらに生成物の沈澱
を生じた。生成物、trans−1,2−ジアミノ−４−シクロ
ヘキセンテトラ酢酸（11g）が最初の生成物として結晶
化し、かつ6gの生成物がさらに１ケ月間で徐々に沈澱し
た。この沈澱物を濾過により集め、冷水で洗浄し、かつ
100℃にて減圧下に乾燥させた。全部で17gのモノ不飽和
DCTA生成物が得られた。

実施例２４−ブロム−５−ヒドロキシDCTA Ｎ−ブロムスクシンイミド（NBS）を次の手順により
再結晶化させた。１の水を磁気撹拌器を備えたフラス
コ中に入れ、そして75℃まで加熱した。粗製NBS（乳鉢
と乳棒とを用いて微細な粉末まで磨砕したもの100g）を
撹拌しながら加え、次いで２分間撹拌した。溶液を、加
温したブフナ漏斗により迅速に濾過した（漏斗は暖くな
ければならず、さもないと沈澱物が濾過の際に生ず
る）。濾液を迅速に氷冷ビーカ中に注ぎ入れて、NBSを
沈澱させ、その分解を最小に保った。NBSを１晩凍結乾
燥して、微量の水を除去した。全部で80gが回収され
た。

trans−1,2−ジアミノ−４−シクロヘキセンテトラ酢
酸（1g、0.0028モル）の遊離酸を1.5mlの7N NaOHに溶
解させて、約5.2の最終pHにした。この溶液を10℃まで
冷却し、次いで磁気撹拌器と氷浴とを備えたガラス管に
おける0.5gのNBS（0.0028モル）に加えた。反応混合物
を温度計で撹拌し、温度を８−10℃に１時間保った。こ
の混合物を４℃にて１晩撹拌し、固体がもはや見えなく
なるまで反応を完結させた。ナトリウム塩としての生成
物４−ブロム−５−ヒドロキシ−DCTAを、10倍容量の乾
燥メタノールの添加により沈澱させた。ブフナ漏斗での
濾過により生成物を集め、少量のメタノールで洗浄し、
かつ迅速に空気乾燥させた。光に対する露出を最小にし
て、分解を防止した。生成物をアルミニウム箔で覆った
フラスコに入れ、そして高減圧度にて１晩凍結乾燥させ
た。全部で1gのナトリウム塩が得られた（Br−およびOH
−を有する炭素に関する立体化学はまだ充分に説明され
ていない。しかしながら、本発明の目的でこの立体化学
は重要でない）。

実施例３５−ヒドロキシ−DCTA−４−β−チオプロピオン酸ヒ
ドラジドこの反応を行なう前に、反応体β−メルカプトプロピ
オン酸ヒドラジドは次の手順にしたがって合成せねばな
らない。β−メルカプトプロピオン酸（53g、0.5モル、
液体）を0.6モルのNaOH（24g）、0.2モルのKI（33.2g）
および0.5モルの結晶I₂（126.9g）と混合した。ビスチ
オールが生成し、かつ一度に沈澱した。これをブフナ漏
斗で濾過し、水から再結晶化させ、かつ95℃で15分間乾
燥させて、48g（0.23モル、92％収率）のビスチオール
ジプロピオン酸を得た。

このビスチオールジプロピオン酸（48g、0.23モル）
を、10mlの濃硫酸（0.138モル）を含有する400mlの無水
エタノール中に溶解させ、そして混合物を２時間還流さ
せた。蒸留によりエタノール（200ml）を除去した。無
水エタノール（追加200ml）を混合物に加え、そして混
合物をさらに２時間還流させ、かつ200〜250mlのエタノ
ールを蒸留により除去した。エーテル（500ml）を生成
溶液に加え、次いで混合物を氷上へ注ぎ入れた。固体重
炭酸ナトリウム（30.7g、0.366モル）を撹拌しながら加
えて、溶液を中和した。分液漏斗にて相を分離させた。
水相を捨て、エーテル相を100mlの冷５％重炭酸ナトリ
ウムで１回洗浄し、次いで200mlの0.1モル塩化ナトリウ
ムで１回洗浄した。エーテル層を50gの無水Na₂SO₄で撹
拌しながら90分間脱水した。このNa₂SO₄を濾過により除
去した。エーテルを空気ポンプを備えた回転式蒸発器で
生成物〔（CH₃−CH₂−Ｏ−CO−CH₂−CH₂S）_２〕から除
去した。殆どのエーテルが除去された後、徐々に水浴温
度を90℃まで高めて残留エーテルを定量的に除去した。
粗生成物を次いで100mlの市販級のヒドラジン（54％ヒ
ドラジン＝1.7モル）および100mlの無水エタノールと混
合して、エチルエステルをヒドラジドに変化させた。こ
の混合物を撹拌しながらアルゴン雰囲気中で一晩還流さ
せて、酸化を防止した。溶液は黄褐色となった。エーテ
ルを回転式蒸発器により除去した。固体生成物を200ml
の無水エタノールと共にトリチル化し、次いでブフナ漏
斗上で濾過して集めた。黄色粉末の生成物を250mlのエ
タノールから再結晶化させて、20.3gのビスジチオール
ヒドラジド（NH₂−NH−CO−CH₂−CH₂S−）_２（0.17モ
ル、37％）を得た。この生成物を30倍モル過剰の硼水素
化ナトリウムにより次のように１段階で還元した。

ビスジチオヒドラジド（0.75ミリモル）を1.0mlの水
中に溶解させた。固体の硼水素化ナトリウム（2.25モ
ル、85mg）を加え、反応温度を時々冷却しながら25℃に
維持した。生成物チオールの生成を５分間隔で次のよう
に監視した。５μの試料を200μの冷水中に溶解さ
せ、残留する硼水素化物を50μのIN HClの添加によ
り分解し、チオールをクリーランド試薬により測定し
た。

反応が完結した後、混合物を冷却し、1N塩酸を滴加し
て過剰の硼水素化物を分解した。HCl（1N）を、ガスの
発生がもはや観察されなくなるまで加えた。反応混合物
を5NのNaOHによりpH7.8まで中和した。試験紙を用いてp
Hを監視した。この時点で、所望の最終生成物β−メル
カプトプロピオン酸ヒドラジドが得られた。これを次の
ように直ちに使用した。

４−ブロム−５−ヒドロキシ−DCTA（441mg、１ミリ
モル）および1mlの2M炭酸カリウムをβ−メルカプトプ
ロピオン酸ヒドラジドに加え、95℃にてアルゴン雰囲気
中で２時間反応させ、次いで反応混合物を冷却し、水で
希釈し、そしてダウェックス１のカラムに充填した。未
反応のヒドラジドはこのカラムに結合せず、ピクリルス
ルホン酸をカラムに通して監視した（赤色溶液の発
生）。このカラムを0.1Nの酢酸で洗浄し、次いで生成物
５−ヒドロキシ−DCTA−４−チオプロピオン酸ヒドラジ
ドを0.2Nの塩酸で溶出させた。ヒドラジド陽性フラクシ
ョン（ピクリルスルホン酸との反応により監視）を合
し、次いで5M NaOHで中和した。0.6ミリモルの収量が
得られた。

実施例４４−アミノエチルチオ−ｔ−ヒドロキシ−DCTA（５−
ヒドロキシ−DCTA−４−β−チオエチルアミン４−ブロム−５−ヒドロキシ−DCTA（882mg、2.0ミリ
モル）および340mgの２−アミノエタンチオールヒドロ
クロライド（3.0ミリモル）をアルゴン雰囲気下にて1.0
mlの2M炭酸カリウム中で合し、次いで90℃にて２時間加
熱した。クリーランド試薬〔5,5′−ジチオ−ビス−
（２−ニトロ安息香酸）〕を用いてチオールの消失を追
跡することにより反応を監視した。約90％のチオールが
消失した後、反応混合物を酸素を含まない水で約50倍希
釈し、次いで6mlのダウェックス−１カラムへ充填した
（酢酸型、0.8ミリ当量/ml樹脂）。未反応の２−アミノ
エタンチオール塩酸塩はカラムに結合しなかった。カラ
ムを0.1N酢酸で洗浄した。ニンヒドリンを用いてアミン
の存在につき洗浄液を監視した。生成物に対し塩として
結合したアミンをピークとして洗浄除去し、次いでアミ
ンの量は水平となった。この時点で、カラムを0.2M塩酸
（約pH1）で溶出させた。溶出の際、生成物４−アミノ
−エチルチオ−５−ヒドロキシ−DCTAの１部が沈澱した
が、pHが約１に達すると生成物は溶解し、したがって生
成物を全部溶出しないよう注意せねばならない。

ニンヒドリンを用いてアミンにつき溶出液を試験し
た。アミン陽性の全フラクションを合し、かつ凍結乾燥
させた。収量1.07gの生成物がアミン三塩酸塩として得
られた。

実施例５改変ヌクレオチド−−−dUTPアリルアミンの合成（ａ）水銀化のdUTPの製造デオキシリボウリジン三燐酸（dUTP、554mg）を100ml
の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に溶解させ、酢
酸水銀（1.59g、5.0ミリモル）を加えた。この溶液を50
℃で４時間加熱し、ついで氷冷した。塩化リチウム（39
2mg、9.0ミリモル）を加え、溶液を同量の酢酸エチルで
６回抽出して、過剰のHgCl₂を除去した。抽出過程の効
率を、有機層における水銀イオン濃度を4,4−ビス（ジ
メチルアミノ）−チオベンゾフェノンを用いて測定する
ことにより監視した〔エー・エヌ・クリストファー、ア
ナリスト、第94巻、第392頁（1969）〕。ヌクレオチド
形成の程度を分光光度法により測定し、次いでデール等
により記載されたように水溶液の１部を沃度化させ〔ア
ール・エム・ケー・デール・ディー・シー・ワード、デ
ィー・シー・リビングトンおよびイー・マーチン、ヌク
レイック・アシッド・リサーチ、第２巻、第915頁（197
5）〕、これは通常90〜100％の範囲であった。酢酸エチ
ル抽出の際しばしば濁りを生じた水層におけるヌクレオ
チド生成物を３倍容量の氷冷エタノールの添加により沈
澱させ、遠心分離により集めた。沈澱物を冷無水エタノ
ールで２回、エチルエーテルで１回ずつ洗浄し、次いで
風乾した。このように製造された水銀化ヌクレオチド
を、さらに生成することなくアリルアミン−ヌクレオチ
ドの合成に使用した。

（ｂ） dUTPアリルアミン水銀化ヌクレオチド（工程ａからのもの）を0.1M酢酸
ナトリウム緩衝液（pH5.0）に溶解し、そして20ミリモ
ルの濃度（267nmにて100OD/ml）に調整した。酢酸水溶
液中の酢酸アリルアミンの新たな2.0M溶液は、1.5mlの
アリルアミン（13.3ミリモル）を8.5mlの氷冷4M酢酸へ
徐々に加えて作成した。3ml（6.0ミリモル）の中和され
たアリルアミン保存物を25ml（0.5ミリモル）のヌクレ
オチド溶液へ加えた。4mlの水中に溶解させたヌクレオ
チド１当量のK₂PdCl₄（163mg、0.5ミリモル）を次いで
加えて、反応を開始させた。パラジウム塩（アルファー
ベントン社）を添加すると、溶液は徐々に金属（Hgおよ
びPd）の付着物が反応容器の壁部に生ずることにより黒
色となった。室温に18〜24時間静置した後、反応混合物
を0.45mmの膜フイルタ（ナルゲン）に通して殆どの残留
金属沈澱物を除去した。黄色濾液を５倍希釈し、そして
100mlのDEAE−セファデックスTM Ａ−25（ファルマシ
ア社）カラムへ加えた。１カラム容量の0.1M酢酸ナトリ
ウム緩衝液（pH5.0）で洗浄した後、生成物を１の直
線勾配（0.1〜0.6M）の酢酸ナトリウム（pH約８〜９）
または重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）（pH7.
5）のいずれかで溶出させた。所望の生成物は主たるUV
−吸収部分に存在し、これを0.30〜0.35Mの塩で溶出さ
せた。スペクトル分析は、このピークが数種の生成物を
含有することを示した。最終的精製は、0.5MのNH₄H₂PO₄
緩衝液（pH3.3）（分析的分離）または0.5Mの酢酸トリ
エチルアンモニウム（pH4.3）（製造的分離）のいずれ
かを溶出剤として用いてパルチシル−ODS2のカラムによ
り逆相−HPLCクロマトグラフィーで行った。５−（３−
アミノプロペン−１−イル）ウリジンの５′−三燐酸塩
（ウリジンに対するアリルアミン付加物）が最後にHPLC
カラムから溶出され、これらはまだ未確認の不純物とし
て３種から分離された。

実施例６５−ヒドロキシ−DCTA−４−β−チオプロピオン酸ヒ
ドラジドで標識したdUTPアリルアミン５−ヒドロキシ−DCTA−４−β−チオプロピオン酸ヒ
ドラジド（12ミリモル、４倍過剰）を0.3mlの水に溶解
させた。HCl（50、1N）を加え、反応混合物を０℃ま
で冷却した。冷0.05MのNaNO₂（0.3ml）を反応混合物に
加え、これを０℃で10分間反応させた。この時点で、DC
TAヒドラジドはアジド（−N₃）まで変化した。炭酸カリ
ウム（25μ、2M）を加え、反応混合物を中和し、そし
て10μの10M硫酸マグネシウムを加えて中和した。pH
を15μの2M炭酸カリウムで約８に調整し、次いで500
μ dUTPアリルアミン（0.6モル NaCl中３ミリモ
ル）および100μの冷５％重炭酸ナトリウムを０℃で
加えた。この混合物を０℃にて１晩（約12時間）反応さ
せた。生成物を未反応出発物質から次のように分離し
た。反応混合物を1N塩酸によりpH7まで中和し、次いで
予め0.01M燐酸カリウム（一塩基性および二塩基性の燐
酸カリウム等モル、約pH6.8）で平衡化させた1mlのヒド
ロキシアパタイトカラムへ充填した。0.3mlのフラクシ
ョンを集めた。カラムを同じ緩衝液（4ml）で、A₂₆₀も
しくはA₂₅₅における吸収帯がもはや溶出されなくなるま
で洗浄した。

生成物であるDCTA−標識されたdUTPと未反応のdUTPア
リルアミンとを0.3Mの燐酸カリウム緩衝液（一塩基性お
よび二塩基性の燐酸カリウムの等モル液）で溶出した。
290nmにおける吸収を有する全てのフラクションを全部
で0.9ml集めた。全A₂₉₀＝17.8OD:E dUTP AA290＝8nm
^-1、収率2.3μモル＝77％。

この生成物を次の手順により異なる緩衝液に移した。
生成物（0.9ml）を冷水により20倍希釈し、次いで0.5ml
のDE−52セルロースカラム（塩素型）に充填した。全A
₂₉₀が吸収された。このカラムを0.5ml（１床容量）の0.
05M NaClで洗浄した。生成物を1.0mlの容量の0.6M Na
Clで溶出させた。回収されたA₂₉₀＝17.8OD、回収率100
％であった。

dUTPアリルアミンの代りにdTTPを用いた比較反応を平
衡して行ない、同様に処理した。それぞれ10μを20μ
のグリシンと0.05Mの酢酸アンモニウムとで放射性ニ
ッケルの存在下に希釈し、かつ15分間結合させた。各バ
ッチをダウェックス50（NH₄ ⁺型）カラムに充填した。dU
TPアリルアミンとの反応生成物のみを放射性ニッケルで
標識した。少なくとも84％の生成物がDCTA同族体であっ
た。

キレート化剤標識したdUTPアリルアミン生成物の構造
は次の通りであった：実施例７５−ヒドロキシ−DCTAで標識した蛋白質（免疫グロブ
リンＧ）１当量のDCTA−ヒドラジド（水中）を10倍過剰の1N塩
酸で処理し、０℃まで冷却した。１当量の予備冷却され
たピペットにおける冷0.05M NaNO₂溶液を０℃の反応混
合物へ加えた。混合物を０℃にて10〜15分間反応させ
た。反応混合物を冷５％重炭酸ナトリウムで中和した
（pH約8.5まで）。これは高い塩モル濃度を与えた。免
疫グロブリンＧ蛋白質を加え、０℃にて１晩培養した。
過剰の活性化DCTAをＧ−50カラムに保持し、蛋白質を空
隙容積に通過させた。

実施例８ DCTA−SH １ミリモルのDCTA−臭化物を、0.2mlの1,2−ジチオエ
チレンと0.5mlのトリエチルアミンとを含有する5mlの50
％DMFに加えた。混合物をアルゴン雰囲気中で60〜70℃
にて２時間培養した。反応後、混合物を酸素を含まない
H₂Oで50mlまで希釈し、pHを氷酢酸により4.0〜4.5に調
整し、過剰のHS−CH₂−CH₂−SHを15mlのベンゼンにより
撹拌して（振とうでない）３回抽出した。次いで、水相
をダウェックスAG−１カラム（床容量9ml）へ充填し
た。このカラムを50μの0.1M酢酸溶液で流過物がチオ
ールを含まなくなるまで洗浄した。次いで、DCTA−SHを
0.25M HClで溶出させた。チオール含有のフラクション
を合し、減圧下に40℃にて蒸発乾固させ、遊離酸（300m
g）を−20℃にてアルゴン雰囲気中で貯蔵した。

実施例９ 3,4,5−トリクロルアニリンによるDNAの活性化 100mgの3,4,5−トリクロルアニリンを2.5mlの50％DMS
Oにおける0.5M HClに溶解させ、氷上で激しく撹拌しな
がら冷却し、当モル量のNaNO₂を冷1M溶液からできるだ
け迅速に加え、次いで10分間撹拌を続けた。300mlの水
における1mgの3HもしくはfdDNAを300μの2Mカコジル
酸緩衝液（pH6.6）および600μのDMSOと混合した（DM
SOの添加により溶液のpHは8.3まで上昇した）。20μ
の新たに調製したジアゾニウム溶液をこれに加え、そし
て混合物を室温で２時間培養した。培養の際に生じた僅
かな沈澱を遠心分離により除去した。この溶液を、次い
で酢酸アンモニウムにより0.4Mとなし、DNAをエタノー
ルで沈澱させた。

実施例10 トリクロルアニリンで活性化したDNAとチオールとの
反応。DCTA−SHとの反応の例。

3,4,5−トリクロルアニリンで活性化したfdDNA（実施
例９）を、同量の0.1MのK₂HPO₄と共に0.1Mの水酸化ナト
リウム中に溶解させた。この溶液を等容量の0.1M DCTA
−SH（実施例８）で処理し、アルゴン雰囲気中で65℃に
て２時間培養した。沈澱したジスルフィドを遠心分離に
より除去し、DNAをＧ−50クロマトグラフィーにより精
製し、−20℃にて貯蔵した。放射性Niを用いて誘導体DN
Aの量を推定することにより、グアニンの60％が標識さ
れたことが確認された。

実施例11 ビオチン−SH ３ミリモルのビオチン−NHSエステルを25mlの無水DMF
に溶解させ、かつ0.5M重炭酸ナトリウム溶液12mlにおけ
るシステアミン塩酸塩の1M溶液と混合し、そして混合物
を室温にて１晩培養した。培養の間、重質沈澱物が生じ
た。液体を減圧下で45℃にて除去し、残留物を50mlの無
水エタノールに懸濁させ、1gのNaBH₄を加え、かつ懸濁
物を75℃にて１時間撹拌した。エタノールを除去し、冷
1M塩酸を加えて、pHを4.5となし、そして水を35℃にて
減圧下に除去した（これらの操作は全てアルゴン雰囲気
下で行なって、チオールの酸化を防止した）。固体残留
物を粉末化し、4mlの冷0.01M脱気酢酸と共にトリチル化
した。この手順を２回反復し、残留物を凍結乾燥させ
た。TLCクロマトグラフィーは、主たるビオチンスポッ
トがチオールを含有し、２つの小さいスポットがチオー
ル陰性であることを示した。全ての反応において、使用
したビオチンの量はチオール含有量に基づいている。ビ
オチン−SHを実施例10と同様にトリクロルアニリン−活
性化DNAとの反応に使用することができる。

実施例12 DCTA−SHによる3,4,5−トリクロルアニリンのDNAの標
識水0.2mlにおける活性化DNA（実施例９）の0.5mgを90
％DMFにおける0.5Mの酢酸トリエチルアンモニウム2.0ml
と混合した。トリエチルアンモニウム型のDCTA−SH（実
施例８）50mgを加えた。この混合物を暗所中で50℃にて
４時間撹拌した。DMFを減圧下で45℃にて除去し、DNAを
Ｇ−50での濾過により脱塩した。標識の程度を、次いで
放射性Ni−63を用いて測定した。平均して5.3個の塩基
が計算により標識された。

実施例13 ４−アミノチオフェニルDCTAおよび３−アミノチオフ
ェニルDCTA ４−アミノ:13−１３−アミノ:13−２ 882mgの４−ブロム−５−ヒドロキシ−DCTA（2.0μモ
ル）および376mgの４−アミノチオフェノールまたは320
μの３−アミノチオフェノールを2mlの炭酸カリウム
溶液（１モル）に溶解させ、混合物をアルゴン雰囲気中
で90℃にて２時間撹拌した。混合物を50μの酸素を含
有しないH₂Oで希釈し、10mlのダウェックスカラムに充
填した。このカラムを0.1M酢酸で流過物がチオールを含
有しなくなるまで洗浄し、生成物を0.2N HClで溶出し
た。チオールを含有する全フラクションを合し、そして
HClをKOHで中和した。この溶液を−40℃で貯蔵した。チ
オール含有量により測定した収率はそれぞれ92.7％（13
−１）および86.3％（13−２）であった。

実施例14 ４−アミノチオフェニルDCTAによるBSAの標識４−アミノチオフェニルDCTA（実施例13−１）で標識
する場合、貯蔵４−アミノ溶液は0.1Mとした。100μ
の４−アミノチオフェニルDCTA溶液＋25μの0.1M塩酸
＋100μの0.1M NaNO₂を混合し、そして０℃にて30分
間培養した。50μの1M K₂HPO₄を加えて、pHを6.7と
なし、その50μの1mlの0.1M NaBO₃中のBSA（7.0mg/m
l）と混合した。この混合物を４℃にて１時間培養し
た。ジアゾニウム塩は極めて不安定であった。４℃にて
１時間後、β−ナフトールとの結合は観察されず、標識
の割合は1.7であった。

３−アミノチオフェニルDCTAは使用しなかったが、そ
の高い安定性のため、より良好な試薬である。

ここに使用したBSAは予め95℃にてpH3.5で15分間加熱
することにより、ヌクレアーゼを失活させた。

実施例15 DCTAヒドラジドによるBSAの標識 200μのヒドラジド溶液（6.7μモル）および50μ
の1M HClを０℃に冷却した。７μの1M NaNO₂を加
え、０℃にて15分間培養した。30μの氷冷2M Na₃CO₃
を溶液に加えてpHを約8.5〜9.0にした。0.1M NaBO₃に
おけるBSAの溶液（7.0mg/ml）の1mlへ125μのアジド
溶液を加え、そして混合物を４℃にて１晩培養した。過
剰のアジドをG50カラムによる濾過で除去した。BSA濾液
を0.5mg/mlまで希釈し、その100μをNiで標識した。
全カウントは86,728（6.91モル）であった。BSAの分子
量が68000と仮定すれば、0.5mgは7.3μモルである（100
mlにおける0.72μモルは9.4分子のDCTA/BSA1分子に相当
する）。

実施例16 放射性コバルトを含有するDNA試料を用いたλDNAハイ
ブリッド化 A.末端ポリ（アリルアミン）dUTPを有するDNAの作成 200μ（0.01緩衝液、トリス−HCl、pH7.4、0.001M
EDTA）における3.2OD/260の200μｇのλDNAを80μ
のDNA分解酵素（１μg/μBSAで5000分の１に希釈、0.
005M MgCl₂）と混合した。この混合物を37℃で５分間
培養し、50μの0.1MEDTAと混合し、65℃にて15分間加
熱することにより酵素を失活させた。培養混合物を0.2M
KClで平衡化した0.5mlのDEAEカラムに充填し、このカ
ラムを5mlの0.2M KClで洗浄した。DNAを0.5M KOHで溶
出させ、260nmの吸収フラクションを合し、そして酢酸
で中和した。

この培養混合物は3.0ml中に0.2Mのコカジル酸緩衝液
（pH7.3）と、0.1Mの酢酸カリウムと、１ミリモルのdUT
Pと、0.3ミリモルのアリル−アミノdUTPと、１ミリモル
のCaCl₂と、１ミリモルのβ−メルカプトエタノール
と、消化されたDNAと、400単位の末端トランスフェラー
ゼとを含有した。培養を37℃にて１晩行なった。51.8％
のヌクレオチド三燐酸がDNA断片に末端組み込みされ
た。この混合物を0.5mlのDEAEカラムに充填し、10mlの
0.2M KClで洗浄し、生成物を1.5MのLiClで溶出させた
（9.3OD/260;3.2ODの出力＝6.1OD/260＝244μｇ重合
体）。

B.アリルアミノ基の放射能標識 1mlのヒドラジド−DCTA（実施例３）（16.4ミリモル）
および200mlの1M HClを０℃で冷却した。50mlの冷0.35
M NaNO₂を撹拌下に加え、そして混合物を０℃で15分間
培養した。100mlの冷2M K₂CO₃を加えて酸を中和し、次
いで200mlの0.5M硼酸緩衝液（pH9.2）を加えた。この混
合物へ「冷」DNA溶液（1ml）を加え、０℃にて１晩培養
した。次いで、混合物を0.5mlのDEAEカラム（0.2M KCl
で平衡化）に充填した。このカラムを10mlの0.2M KCl
で洗浄し、生成物を1.5M LiClで溶出させた。OD/260の
半分をこの塩により溶出させた。残部を0.2M酢酸におけ
る1.5M LiClで溶出させた。次いで、放射性CoCl₂を少
しづつ加えた。

フラクションI:8,800,000cpm/μｇフラクションII:92,600,000cpm/μｇ次いで、フラクションＩを次のようにDNAとハイブリ
ッド化させた。

C.ハイブリッド化Ｃ・１サウザンゲル DNAをHind IIIで制限し、クロマトグラフにかけ、か
つサウザンブロット技術により適当なフイルタへ移し
た。比較として、制限M13ファージを使用した。コバル
ト標識したDNA（実験16.B、２μｇ）およびキャリヤDNA
（1mg）を5mlのハイブリッド化溶液に溶解させた。比較
試料および試験試料をこの溶液と共に42℃で１晩培養
し、次いで緩衝液において0.1％SDSにより55℃で３回洗
浄し、風乾し、そして標準トルエン溶液において計数し
た。

結果（１）M13比較:7475cpm （2a）λ試験:25.724cpm （2b）λ試験:29.412cpm これらの結果は、背景としてのカウントは高いもので
あったが、コバルト標識した試料を用いるハイブリッド
化は約3.5〜４倍高いカウントを与えることを示した。

Ｃ・２スポットハイブリッド化上記Ｃ・１につき記載したような１晩の条件下でスポ
ットハイブリッド化を行なった。Co−標識したDNA試料
を用いて、125pgのλDNAを検出することができた。

実施例17 放射性ニッケルで標識した抗HCG抗体の作成 250μ容量の0.1M硼酸緩衝液における0.4OD/280の抗
ヒト絨毛ゴナドトロピン抗体と0.22μモルのヒドラジド
DCTA（実施例３）とを０℃にて１晩培養した。過剰のDC
TAヒドラジドをG50での濾過により除去した。

濾液： OD/280＝0.376 OD/280＝0.216 誘導された抗体を含有する部分（100μ）を10μモ
ルの比活性629,262cpm/μモルを有する10μモルのNiと
混合した。蛋白質に結合されたカウント:297,350cpm/0.
472μモル（1mgの抗体および150,000の分子量につき1.4
OD/280と仮定する）。100mlは26.4μｇ＝0.175μモルの
抗体に等しい0.0376OD/280を含有した。0.175μモルの
抗体は0.472μモルのNiを含有した。したがって、１モ
ルの抗体は0.472/0.176＝2.60モルのニッケルを含有し
た。

実施例18 不活性溶剤に可溶性である遊離アルコール基を有する
物質のDCTA標識に対する好適方法ダウェックス１−X2^Rは第４級アミノ基を含有する。
これらの基はDCTA−ヒドラジドのカルボキシル基を極め
て強力に結合して、下記の塩（Ｉ）を生成する：塩（Ｉ）は0.03Mの塩酸中で安定であり、高HCl濃度
（0.1M）にて置換される。これは、0.03Mの塩酸中でNaN
O₂と反応して、アジド（II）を生成する：ベンゼン中で塩（II）を加熱することにより、アジド
が再配列してイソシアネート（III）を生成した：式（III）のイソシアネート基は次いでアルコールと8
0〜130℃で反応して、ウレタン（IV）を生成した：これらのウレタンは生理学的pHにて安定な物質であ
り、濃厚な酸または濃厚なアルカリで加水分解してアミ
ンを生成する。ダウェックスに対するDCTAの固定は、そ
のOH基が他の分子のイソシアネート基と反応するのを相
当な程度で防止し、DCTAアジドが不溶性であるベンゼン
もしくはトルエンまたはその他の不活性溶剤中で操作す
ることを可能にする。

ウレタン（IV）の生成後、これを50％エタノールにお
ける冷LiClによりダウェックスから溶出させた。冷却時
かつ中性pHにおいて、エステル変換は生じなかった。

実施例19 セラミドの標識セラミドは２個の遊離アルコール基を有するジクリセ
ライドである。

実施例18からのDCTA−ヒドラジド（Ｉ）の10ミリモル
を、50mlのH₂OにおけるダウェックスAG−１−X2の懸濁
物へ撹拌下に徐々に加えた。撹拌を15分間続け、樹脂を
ブフナ漏斗で500mlの冷水により洗浄した。次いで、こ
の樹脂を100mlの冷0.03M HClに懸濁させ、懸濁物を氷
浴中に入れた。10ミリモルの固体NaNO₂を30分間かけて
撹拌下に加え、温度を５℃以下に保った。最後のNaNO₂
を添加した後、懸濁物を同温度で15分間撹拌した。次い
で、樹脂を冷ブフナ漏斗で濾過し、100mlの冷（−20
℃）エタノールで洗浄した。最後に、100mlの冷（−20
℃）エタノールに懸濁させ、氷−塩の浴において−20℃
で30分間撹拌した。エタノールを吸引除去し、そして残
留する微量のエタノールを高減圧で除去した。乾燥樹脂
を無水条件下で分け取り、封入アンプル中に−70℃で貯
蔵したが、少なくとも８ケ月にわたり活性は喪失しなか
った。

セラミドを標識するため、0.5gのアジド樹脂を15mlの
無水ベンゼンに懸濁させ、600μモルのセラミドを加
え、そして懸濁物を75℃にて30分間加熱した。次いで、
ベンゼンを減圧下で除去し、15mlの無水トルエンを加
え、そして懸濁物を120℃で無水条件下に１晩撹拌し
た。

樹脂を濾過し、エタノールで洗浄して微量のトルエン
を除去し、そして未反応セラミドを次いで３倍床容量の
水中における50％エタノールで除去した。生成物を50％
エタノール/H₂Oにおける0.6M LiClで溶出させた。DCTA
活性を有するフラクションを合し、そしてセラミド含有
量を沃度測定法により測定した。63.8％の収量であるこ
とが判明した。

実施例20 A.cis−ジオール基による物質の一般的DCTA標識ジオールをK₂CO₃溶液において臭化シアノゲンで活性
化させ、過剰の臭化シアノゲンをトリエタノールアミン
で失活させ、そして活性化ジオールをDCTAアミンと反応
させた。物質が水中に可溶性でなければ、ジギトキシン
の場合と同様に、活性化をジグリム／水中で行なった。

B.ジギトキシンの標識 65.4μモルのH³−ジギトキシン（1000cpm/mg）を40ml
のジグリムに溶解させ、４℃まで冷却した。同容量の0.
1M冷K₂CO₃を加え、そして300mgのアセトニトリル2mlに
おける臭化シアノゲンを撹拌および冷却下で１度に加え
た。この混合物を４℃で15分間保ち、過剰の臭化シアノ
ゲンを5mlの2Mトリエタノールアミン塩酸塩（pH1.2）に
よりpH8.5〜9.0として失活させた。2mlのH₂Oに溶解した
200μモルのDCTAアミンを加え、そして混合物を４℃に
て１晩培養し、次いでダウェックスAG−１−X2カラムに
充填した。このカラムを流過物中にカウントが検出され
なくなるまで50％エタノールで洗浄し、結合体を50％エ
タノールにおける0.6M LiClで溶出させた。全ての放射
性フラクションを合した。結合したジギトキシンを示す
放射能の回収率は57.6％であった。

実施例21 DCTAによる燐酸４−アミノ−１−ナフトールの標識 DCTAにより燐酸４−アミノ−１−ナフトールを標識す
るために開発した方法は、第一級アミノ基を有する全て
の物質に適用される。

20mlの0.2M HClに溶解させた500μモルの５−ヒドロ
キシ−DCTA−４−β−チオプロピオン酸ヒドラジドの溶
液を０℃まで冷却し、そして500μモルの固体NaNO₂を20
分間かけて加え、温度を５℃以下に保った。最後のNaNO
₂を添加してから15分後、pHを冷Na₂CO₃により8.5とな
し、かつ5mlの1M NaHCO₃に溶解した450μモルの燐酸４
−アミノ−１−ナフトールを加えた。この混合物を４℃
にて１晩培養し、100mlのH₂Oで希釈し、そして酢酸型の
ダウェックス１−X2カラムに充填した。

このカラムを３倍床容量の0.1M酢酸で洗浄し、生成物
をH₂Oにおける0.6M LiClで溶出させた。DCTA含有フラ
クションを合し、生成物を３倍床容量のエタノールに
て、−20℃で１晩沈澱させた。

収率：生成物86.4％この生成物はアルカリホスファターゼの基質となる。
生成フエノールをジアゾニウム塩と結合させることによ
り、放射性金属で標識されうる沈澱が生じた。これは、
アルカリホスファターゼに対する極めて感度のよい分析
を可能にする。

以上、本発明を実施例につき充分説明したが、本発明
はこれらのみに限定されず、本発明の範囲内において同
等な広範囲の構造、方法および用途が可能であることが
当業者には了解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｃ 251/02 271/06 309/63 311/01 311/15 323/30 323/43 323/48 Ｃ０７Ｆ 9/09 Ｕ 9155−4ＨＣ０７Ｈ 19/067 19/073 19/167 19/173 Ｃ０７Ｋ 1/13 8318−4Ｈ 14/765 16/00 16/26 Ｃ０８Ｂ 37/02 7433−4ＣＣ０８Ｆ 8/00 ＭＦＶＣ０８Ｇ 85/00 ＮＶＡＧ０１Ｎ 33/58 ＡＺ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式： A³〔−Ｘ−R¹−Ｅ−Det^b〕_ｍの化学構造を有する検出可能な分子を構成する修飾剤で
あって、 A³は修飾を受ける分子であって、アミノ、ヒドロキシ、
cis1,2−diOH、ハロゲン化物、アリール、イミダゾイ
ル、カルボニル、カルボキシル、チオールまたは活性炭
素を含む残基よりなる群から選択される少なくとも１個
の改変しうる反応基を有し、Ｘは −Ｎ＝Ｎ−、−NHSO₂−、−OSO₂−、−NH−Ｎ＝Ｎ−、 −CH₂−NH−、 −NH−CH₂−、および−Ｓ−CH₂− よりなる群から選択され、 R¹は−OHにより置換でき、かつおよびC₁−C₁₀の分枝したもしくは分枝していないアル
キルもしくはアラルキルよりなる群から選択され、ＹはＥへの直接結合であるか、あるいは−Ｅ−R²−であ
り、ここでR²はC₁−C₁₀の分枝したもしくは分枝してい
ないアルキルであり、 Zaは塩素、臭素、または沃素であり、ＥはＯ、NH、硫黄原子または改変しうる反応基であり、 Det^bはビオチンおよび置換もしくは未置換の金属キレー
ト化剤よりなる群から選択される、検出されうる化合物
から成り、前記金属キレート化剤は、式：を有するか、またはこの４−ヒドロキシ誘導体もしくは
アシルオキシ誘導体であって、R³がC₁−C₄のアルキルで
あるかまたはCH₂COOMであり、各Ｍは個別に金属陽イオ
ン、被放射性金属陽イオンおよび非金属陽イオンから選
択され、ｍは１乃至A³上の改変しうる反応基の全個数の整数であ
ることを特徴とする、検出可能な分子を構成する修飾
剤。
【請求項２】R¹がであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の検
出可能な分子を構成する修飾剤。
【請求項３】R²が−CH₂−CH₂−であることを特徴とする
特許請求の範囲第２項記載の検出可能な分子を構成する
修飾剤。
【請求項４】Ｘが−Ｎ＝Ｎ−であり、そしてR¹がから選択されることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の検出可能な分子を構成する修飾剤。
【請求項５】R¹がであることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の検
出可能な分子を構成する修飾剤。
【請求項６】R¹がであることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の検
出可能な分子を構成する修飾剤。
【請求項７】Det^bがビオチンから成ることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の検出可能な分子を構成する
修飾剤。
【請求項８】Ｘが −NHSO₂−、−NH−Ｎ＝Ｎ−、よりなる群から選択されることを特徴とする特許請求の
範囲第７項記載の検出可能な分子を構成する修飾剤。
【請求項９】Ｘがおよびよりなる群から選択されることを特徴とする特許請求の
範囲第８項記載の検出可能な分子を構成する修飾剤。
【請求項１０】Ｘがよりなる群から選択され、かつR¹がC₁−C₆のアルキルで
あることを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の検出
可能な分子を構成する修飾剤。
【請求項１１】R¹が−CH₂−CH₂−であることを特徴とす
る特許請求の範囲第８項または第10項記載の検出可能な
分子を構成する修飾剤。
【請求項１２】R¹がC₁−C₁₀のアルキル基であることを
特徴とする特許請求の範囲第８項記載の検出可能な分子
を構成する修飾剤。
【請求項１３】Det^bが金属キレート化剤であって、式：を有するか、またはこの４−ヒドロキシ誘導体もしくは
アシルオキシ誘導体であり、R³がC₁−C₄のアルキルであ
るかまたはCH₂COOMであり、各Ｍは個別に金属陽イオ
ン、被放射性金属陽イオンおよび非金属陽イオンから選
択されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
検出可能な分子を構成する修飾剤。
【請求項１４】R¹がであるか、またはC₁−C₁₀のアルキル基であることを特
徴とする特許請求の範囲第13項記載の検出可能な分子を
構成する修飾剤。
【請求項１５】R²が−CH₂−CH₂−であることを特徴とす
る特許請求の範囲第14項記載の検出可能な分子を構成す
る修飾剤。