JPH04222600A - ナフトール誘導体ホスフェートによる核酸等の検定方法 - Google Patents
ナフトール誘導体ホスフェートによる核酸等の検定方法Info
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- JPH04222600A JPH04222600A JP2413201A JP41320190A JPH04222600A JP H04222600 A JPH04222600 A JP H04222600A JP 2413201 A JP2413201 A JP 2413201A JP 41320190 A JP41320190 A JP 41320190A JP H04222600 A JPH04222600 A JP H04222600A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，核酸配列等を蛍光によ
り効率良く検出することができる，核酸等の検定方法に
関する。
り効率良く検出することができる，核酸等の検定方法に
関する。
【０００２】
【従来技術】医学，生物学の分野においては，近年，核
酸断片検出法により，核酸配列を検定する方法が多用さ
れている。この検定方法においては，例えばＤＮＡ（又
はＲＮＡ）プローブを放射性同位元素を用いて標識し，
これと標的核酸とをハイブリダイズさせ，しかる後にオ
ートラジオグラフティーにより標的核酸の検出を行うと
いう手段が，現在広く行われている。
酸断片検出法により，核酸配列を検定する方法が多用さ
れている。この検定方法においては，例えばＤＮＡ（又
はＲＮＡ）プローブを放射性同位元素を用いて標識し，
これと標的核酸とをハイブリダイズさせ，しかる後にオ
ートラジオグラフティーにより標的核酸の検出を行うと
いう手段が，現在広く行われている。
【０００３】
【解決しようとする課題】しかしアイソトープ法には，
多くの欠点があり，この分野の技術の応用と発展にとっ
て著しい障害となっている。アイソトープ法の欠点は次
の通りである。 （ａ） 核酸ハイブリダイゼーションにおいて，近接
した遺伝子間（核酸配列間）の相対的位置関係を明らか
にするだけの空間的解像力がない。 （ｂ） アイソトープを用いた実験操作は，特別の設
備をそなえたアイソトープ実験室の中でしか行うことが
出来ない。このことは，特にハイブリダイゼーション法
の臨床検査への応用を妨げる原因となっている。 （ｃ） アイソトープを用いることは，たとえ実験室
の中であっても実験者にとって危険が伴い，また廃棄物
等による一般人への危険も常に存在する。 （ｄ） 検出のために非常な長時間（数週間〜数ヶ月
）を要する場合があり，迅速臨床診断への応用が難しい
。 （ｅ） 放射活性は，一定の半減期をもって減衰する
ため，アイソトープの購入予定日に合わせた実験計画を
立てねばならず，わずかな日程のずれにより，アイソト
ープや大規模な実験成果をむだにする危険がある。 （ｆ） 検出感度を高めるためにはプローブとする核
酸に，できるだけ高い放射性を付与する必要があるが，
放射性を高める程標識した核酸は放射崩壊し易くなると
いう矛盾がある。 （ｇ） アイソトープは，一般にきわめて高価であり
，１回の実験で数十万円分に相当するアイソトープを消
費することも珍しくない。この事が，ハイブリダイゼー
ション法の一般的普及を妨げている。 このような背景から放射性アイソトープに代わるＤＮＡ
，ＲＮＡ標識法がこれまでにもいくつか開発されている
。例えば，ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー社（ＢＲ
Ｌ社）より市販されているブルージン（Ｂｌｕ Ｇｅ
ｎｅ）キットがある。また，特開昭６０−２２６８８８
号公報に記載の「核酸標識物質及びその使用法」がある
。しかし，これらの技術は，上記の欠点の一部のみを解
消したものにとどまり，特に検出感度はアイソトープ法
にまさるものとは言えない。本発明は，かかる問題点に
鑑み，前記アイソトープ法の安全上等の欠点を解決し，
検出感度に優れた，核酸等の検定方法を提供しようとす
るものである。
多くの欠点があり，この分野の技術の応用と発展にとっ
て著しい障害となっている。アイソトープ法の欠点は次
の通りである。 （ａ） 核酸ハイブリダイゼーションにおいて，近接
した遺伝子間（核酸配列間）の相対的位置関係を明らか
にするだけの空間的解像力がない。 （ｂ） アイソトープを用いた実験操作は，特別の設
備をそなえたアイソトープ実験室の中でしか行うことが
出来ない。このことは，特にハイブリダイゼーション法
の臨床検査への応用を妨げる原因となっている。 （ｃ） アイソトープを用いることは，たとえ実験室
の中であっても実験者にとって危険が伴い，また廃棄物
等による一般人への危険も常に存在する。 （ｄ） 検出のために非常な長時間（数週間〜数ヶ月
）を要する場合があり，迅速臨床診断への応用が難しい
。 （ｅ） 放射活性は，一定の半減期をもって減衰する
ため，アイソトープの購入予定日に合わせた実験計画を
立てねばならず，わずかな日程のずれにより，アイソト
ープや大規模な実験成果をむだにする危険がある。 （ｆ） 検出感度を高めるためにはプローブとする核
酸に，できるだけ高い放射性を付与する必要があるが，
放射性を高める程標識した核酸は放射崩壊し易くなると
いう矛盾がある。 （ｇ） アイソトープは，一般にきわめて高価であり
，１回の実験で数十万円分に相当するアイソトープを消
費することも珍しくない。この事が，ハイブリダイゼー
ション法の一般的普及を妨げている。 このような背景から放射性アイソトープに代わるＤＮＡ
，ＲＮＡ標識法がこれまでにもいくつか開発されている
。例えば，ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー社（ＢＲ
Ｌ社）より市販されているブルージン（Ｂｌｕ Ｇｅ
ｎｅ）キットがある。また，特開昭６０−２２６８８８
号公報に記載の「核酸標識物質及びその使用法」がある
。しかし，これらの技術は，上記の欠点の一部のみを解
消したものにとどまり，特に検出感度はアイソトープ法
にまさるものとは言えない。本発明は，かかる問題点に
鑑み，前記アイソトープ法の安全上等の欠点を解決し，
検出感度に優れた，核酸等の検定方法を提供しようとす
るものである。
【０００４】
【課題の解決手段】本発明は，核酸などの被検体にホス
ファターゼを結合させ，次いで該ホスファターゼにナフ
トール誘導体ホスフェートを反応させ，その後これらに
励起光を照射して，これにより発生する蛍光を検出する
ことを特徴とする核酸等の検定方法にある。上記ホスフ
ァターゼとしては，アルカリホスファターゼ，アシッド
ホスファターゼなどがある。また，本発明において対象
とする被検体の検出法としては，核酸（ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ）の検出，蛋白質の検出，抗体を用いた化学物質の免
疫学的検出技術などがある。上記ナフトール誘導体ホス
フェートとしては，一般式Ｐ−Ｎａｐ−Ｒ（ｎ） で表
されるホスファターゼ修飾蛍光物質がある。ここに，Ｎ
ａｐは，ナフタレン環部であり，Ｐは，上記ナフタレン
環に結合するホスフェート部であり，Ｒ（ｎ） は，上
記ナフタレン環に結合（３個；ｎ＝１，２，３）する置
換基部である。また，上記のＰ−Ｎａｐ−Ｒ（ｎ） は
，例えば下記の化学構造式１又は２により表される。
ファターゼを結合させ，次いで該ホスファターゼにナフ
トール誘導体ホスフェートを反応させ，その後これらに
励起光を照射して，これにより発生する蛍光を検出する
ことを特徴とする核酸等の検定方法にある。上記ホスフ
ァターゼとしては，アルカリホスファターゼ，アシッド
ホスファターゼなどがある。また，本発明において対象
とする被検体の検出法としては，核酸（ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ）の検出，蛋白質の検出，抗体を用いた化学物質の免
疫学的検出技術などがある。上記ナフトール誘導体ホス
フェートとしては，一般式Ｐ−Ｎａｐ−Ｒ（ｎ） で表
されるホスファターゼ修飾蛍光物質がある。ここに，Ｎ
ａｐは，ナフタレン環部であり，Ｐは，上記ナフタレン
環に結合するホスフェート部であり，Ｒ（ｎ） は，上
記ナフタレン環に結合（３個；ｎ＝１，２，３）する置
換基部である。また，上記のＰ−Ｎａｐ−Ｒ（ｎ） は
，例えば下記の化学構造式１又は２により表される。
【化１】
【化２】上記の式中Ｒ１ はアミド基，ビニル基，Ｃが
１〜３のアルキル基，エステル基であるか，もしくは下
記化学構造式３
１〜３のアルキル基，エステル基であるか，もしくは下
記化学構造式３
【化３】（Ｘはアルコキシ基，フェノキシ基である）で
表されるものである。また，Ｒ２ は，アリール基，縮
合芳香属基，チオアリール基，アルキル基，アルコキシ
基，フェノキシ基を表する。また，Ｒ３ ，Ｒ４ は，
同じか又は異なっていてよく，水素原子，ハロゲン原子
，アルキル基，アルコキシ基，フェノキシ基，アミノア
セチル基，シアノ基，エステル基を表す。また，上記の
Ｒ２ が下記化学構造式４のアリール基で表される場合
には，
表されるものである。また，Ｒ２ は，アリール基，縮
合芳香属基，チオアリール基，アルキル基，アルコキシ
基，フェノキシ基を表する。また，Ｒ３ ，Ｒ４ は，
同じか又は異なっていてよく，水素原子，ハロゲン原子
，アルキル基，アルコキシ基，フェノキシ基，アミノア
セチル基，シアノ基，エステル基を表す。また，上記の
Ｒ２ が下記化学構造式４のアリール基で表される場合
には，
【化４】上記式中Ｍ１ ，Ｍ２ ，Ｍ３ は，同
じか又は異なっていてよく，水素原子，ハロゲン原子，
Ｃが１〜３のアルキル基，アルコキシ基，フェニル基，
アミノフェニル基，ベンジル基，アミノアセチル基，シ
アノ基であるか，もしくは下記化学構造式５で表され，
じか又は異なっていてよく，水素原子，ハロゲン原子，
Ｃが１〜３のアルキル基，アルコキシ基，フェニル基，
アミノフェニル基，ベンジル基，アミノアセチル基，シ
アノ基であるか，もしくは下記化学構造式５で表され，
【化５】上記式中Ｍ４ は，水素原子，又はＣが１〜３
のアルキル基，アルコキシ基，シアノ基，アミノアセチ
ル基を表す。更に，前記Ｒ２ が縮合芳香族基である場
合には，Ｒ２ は下記の化学構造式６，７又は８で表さ
れる。
のアルキル基，アルコキシ基，シアノ基，アミノアセチ
ル基を表す。更に，前記Ｒ２ が縮合芳香族基である場
合には，Ｒ２ は下記の化学構造式６，７又は８で表さ
れる。
【化６】
【化７】
【化８】また，前記のＲ２ がチオアリール基である場
合には，Ｒ２ は下記の化学構造式９で示され，
合には，Ｒ２ は下記の化学構造式９で示され，
【化９
】上記式中Ｍ５ は，水素原子，又はＣが１又は２のア
ルキル基，アルコキシ基，シアノ基，アミノアセチル基
を表す。
】上記式中Ｍ５ は，水素原子，又はＣが１又は２のア
ルキル基，アルコキシ基，シアノ基，アミノアセチル基
を表す。
【０００５】
【作用及び効果】本発明の検定方法においては，前記ホ
スファターゼにナフトール誘導体ホスフェート（リン酸
体）を結合（反応）させ，次いで励起光を照射する。こ
れにより，ナフトール誘導体ホスフェートの脱リン酸体
が蛍光を発する。そこで，この蛍光を検出する。即ち，
ホスファターゼをナイロンメンブレンフィルター上の試
料（例えば，核酸）に結合させ，次いで該ホフファター
ゼに上記ナフトール誘導体ホスフェートを反応させる。 これにより，蛍光性を有すると共に，ナイロンメンブレ
ンフィルターへの沈着性を有するナフトール誘導体ホス
フェートの脱リン酸体を生ずる。そこで，励起光を照射
して，その蛍光及びパターン（スポットや電気泳動法に
よるバンド等）を検出する。そして，本発明においては
，上記ナフトール誘導体ホスフェートを用いることによ
り強力な蛍光が得られるため，上記検出の感度が向上し
，１０−１３ ｇという極微少量のＤＮＡについても検
出可能となる。また，本発明は，アイソトープを用いな
いため前記従来技術の問題点も解決できる。したがって
，本発明によれば，使用安全で，検出感度に優れた核酸
等の検定方法及びこの方法に用いる優れた検出感度のホ
スファターゼ修飾蛍光物質を提供することができる。
スファターゼにナフトール誘導体ホスフェート（リン酸
体）を結合（反応）させ，次いで励起光を照射する。こ
れにより，ナフトール誘導体ホスフェートの脱リン酸体
が蛍光を発する。そこで，この蛍光を検出する。即ち，
ホスファターゼをナイロンメンブレンフィルター上の試
料（例えば，核酸）に結合させ，次いで該ホフファター
ゼに上記ナフトール誘導体ホスフェートを反応させる。 これにより，蛍光性を有すると共に，ナイロンメンブレ
ンフィルターへの沈着性を有するナフトール誘導体ホス
フェートの脱リン酸体を生ずる。そこで，励起光を照射
して，その蛍光及びパターン（スポットや電気泳動法に
よるバンド等）を検出する。そして，本発明においては
，上記ナフトール誘導体ホスフェートを用いることによ
り強力な蛍光が得られるため，上記検出の感度が向上し
，１０−１３ ｇという極微少量のＤＮＡについても検
出可能となる。また，本発明は，アイソトープを用いな
いため前記従来技術の問題点も解決できる。したがって
，本発明によれば，使用安全で，検出感度に優れた核酸
等の検定方法及びこの方法に用いる優れた検出感度のホ
スファターゼ修飾蛍光物質を提供することができる。
【０００６】
【実施例】実施例１
ナフトール誘導体ホスフェートの核酸プローブとしての
有用性を確かめるために，ベーリンガー・マンハイム（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社のＤＮ
Ａ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎ ｋｉｔ，及びナフトール誘導体ホスフェートと
しての，２−アリル〔２′−（３，４−ジメチルフェニ
ル）〕３−ナフトールホスフェートを用い，ナイロンメ
ンブレンフィルター上でＤＮＡの検出を行った。即ち，
ディゴキシゲニン（Ｄｉｇ）によりＤＮＡを標識し，希
釈を行い，ナイロンメンブレンフィルターにスポットし
た。なお，この際すべてのスポットが非特異的ＤＮＡと
して５０ｎｇ（５０×１０−９ｇ）のニシン精子ＤＮＡ
を含むようにした。上記実験は，図１に示すごとく，Ｄ
ｉｇラベルＤＮＡ量０．０８〜２５ｐｇ（ピコグラム）
について行った。同図中０ｐｇはブランクテストである
。その結果を同図に示す。同図において，１は核酸試料
担体フィルター，１１は蛍光感光部分である。なお，図
中における「＋」は検出可能を，「±」は検出不明瞭を
，「−」は検出不能を示す。上記より知られるごとく，
０．４ｐｇという極く微少量でも充分に検出できた。次
に，別のテストとして，上記ＤＮＡ量を更に少量用い，
ＤｉｇラベルＤＮＡ量０．０１５６〜０．５ｐｇについ
て，上記と同様に行った。その結果を図１と同様にして
図２に示す。同図に示すごとく，０．２５ｐｇ（２５０
ｆｇ）では充分に検出できた。なお，０．１２５ｐｇで
は検出不充分であった。この後者の試験の際，アゾ色素
Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ ＢＢ（ポリサイエンス社，Ｐ
ＯＬＹＳＣＩＥＮＣＥ，ＩＮＣ．）を用いた従来の発色
検出法を試した。その結果，検出できたスポットは０．
５ｐｇ（０．５×１０−１２ ｇ）であった。上記のナ
フトール誘導体ホスフェートは，下記の方法により製造
した。即ち，３，４−ジメチルベンジルクロライド５ｇ
とトリフェニルホスフィンを１ｍｏｌ当量混ぜ，無溶媒
で室温で１０分間，次いで５０℃で２時間攪拌する。次
いで，無水キシレン７ｍｌを加え，オイル温度１３０℃
で１時間攪拌する。ここで結晶が出来たら反応を止め，
吸引濾過を行い結晶をエーテルで洗う。次いで，この結
晶を無水のアセトニトリルで再結晶を行い，下記化学構
造式１０の３，４−ジメチルベンジルホスホニウム塩（
Ａ）を収率４０％で得た。
有用性を確かめるために，ベーリンガー・マンハイム（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社のＤＮ
Ａ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎ ｋｉｔ，及びナフトール誘導体ホスフェートと
しての，２−アリル〔２′−（３，４−ジメチルフェニ
ル）〕３−ナフトールホスフェートを用い，ナイロンメ
ンブレンフィルター上でＤＮＡの検出を行った。即ち，
ディゴキシゲニン（Ｄｉｇ）によりＤＮＡを標識し，希
釈を行い，ナイロンメンブレンフィルターにスポットし
た。なお，この際すべてのスポットが非特異的ＤＮＡと
して５０ｎｇ（５０×１０−９ｇ）のニシン精子ＤＮＡ
を含むようにした。上記実験は，図１に示すごとく，Ｄ
ｉｇラベルＤＮＡ量０．０８〜２５ｐｇ（ピコグラム）
について行った。同図中０ｐｇはブランクテストである
。その結果を同図に示す。同図において，１は核酸試料
担体フィルター，１１は蛍光感光部分である。なお，図
中における「＋」は検出可能を，「±」は検出不明瞭を
，「−」は検出不能を示す。上記より知られるごとく，
０．４ｐｇという極く微少量でも充分に検出できた。次
に，別のテストとして，上記ＤＮＡ量を更に少量用い，
ＤｉｇラベルＤＮＡ量０．０１５６〜０．５ｐｇについ
て，上記と同様に行った。その結果を図１と同様にして
図２に示す。同図に示すごとく，０．２５ｐｇ（２５０
ｆｇ）では充分に検出できた。なお，０．１２５ｐｇで
は検出不充分であった。この後者の試験の際，アゾ色素
Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ ＢＢ（ポリサイエンス社，Ｐ
ＯＬＹＳＣＩＥＮＣＥ，ＩＮＣ．）を用いた従来の発色
検出法を試した。その結果，検出できたスポットは０．
５ｐｇ（０．５×１０−１２ ｇ）であった。上記のナ
フトール誘導体ホスフェートは，下記の方法により製造
した。即ち，３，４−ジメチルベンジルクロライド５ｇ
とトリフェニルホスフィンを１ｍｏｌ当量混ぜ，無溶媒
で室温で１０分間，次いで５０℃で２時間攪拌する。次
いで，無水キシレン７ｍｌを加え，オイル温度１３０℃
で１時間攪拌する。ここで結晶が出来たら反応を止め，
吸引濾過を行い結晶をエーテルで洗う。次いで，この結
晶を無水のアセトニトリルで再結晶を行い，下記化学構
造式１０の３，４−ジメチルベンジルホスホニウム塩（
Ａ）を収率４０％で得た。
【化１０】
一方，１−ヒドロキシ−２−ナフトアルデヒド５ｇに無
水ピリジン９ｍｌを加え０℃で１０分間攪拌し，これに
精製した無水酢酸を２ｍｏｌ当量加え０℃，１時間，室
温で２時間攪拌する。反応後，反応物を水／エーテル：
クロロホルム＝４：１の溶媒中に入れ，抽出を行う。次
いで，有機層を１ＮのＨＣｌで，水層が弱酸性になるま
で洗う。次いで，水で洗い，中性確認後飽和食塩水で洗
い，硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒をエバポレータで除
き，１−アセチル−２−ナフトアルデヒドの粗結晶を得
る。次いで，この結晶を無水エタノールで再結晶精製し
，下記化学構造式１１の１−アセチル−２−ナフトアル
デヒド（Ｂ）を収率５０％で得た。
水ピリジン９ｍｌを加え０℃で１０分間攪拌し，これに
精製した無水酢酸を２ｍｏｌ当量加え０℃，１時間，室
温で２時間攪拌する。反応後，反応物を水／エーテル：
クロロホルム＝４：１の溶媒中に入れ，抽出を行う。次
いで，有機層を１ＮのＨＣｌで，水層が弱酸性になるま
で洗う。次いで，水で洗い，中性確認後飽和食塩水で洗
い，硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒をエバポレータで除
き，１−アセチル−２−ナフトアルデヒドの粗結晶を得
る。次いで，この結晶を無水エタノールで再結晶精製し
，下記化学構造式１１の１−アセチル−２−ナフトアル
デヒド（Ｂ）を収率５０％で得た。
【化１１】
次いで，前記ホスホニウム塩（Ａ）１．６４ｇに無水テ
トラヒドロフラン４ｍｌを加え０℃で１０分攪拌後，ナ
トリウムエチラートを１．１ｍｏｌ当量加え，室温で１
時間攪拌する。反応液は赤色を示している。次いで，上
記の１−アセチル−２−ナフトアルデヒド（Ｂ）の１ｍ
ｏｌ当量を無水テトラヒドロフラン４ｍｌに溶かしゆっ
くり加える。ここで反応液の赤色が消えたら，反応液に
飽和塩化アンモニウムで反応を止め，１０％塩酸を加え
ｐＨ＝４にする。次いで，エーテルで抽出し，飽和食塩
水で粗い，硫酸マグネシウムで乾燥後，エーテルをエバ
ポレータで除くと結晶を得る。この結晶をシリカゲルカ
ラムクロマトで精製し，下記化学構造式１２の１−アセ
チル−２−アリル−〔２′−（３，４−ジメチルフェニ
ル）〕ナフタレン（Ｃ）を収率２５％で得た。
トラヒドロフラン４ｍｌを加え０℃で１０分攪拌後，ナ
トリウムエチラートを１．１ｍｏｌ当量加え，室温で１
時間攪拌する。反応液は赤色を示している。次いで，上
記の１−アセチル−２−ナフトアルデヒド（Ｂ）の１ｍ
ｏｌ当量を無水テトラヒドロフラン４ｍｌに溶かしゆっ
くり加える。ここで反応液の赤色が消えたら，反応液に
飽和塩化アンモニウムで反応を止め，１０％塩酸を加え
ｐＨ＝４にする。次いで，エーテルで抽出し，飽和食塩
水で粗い，硫酸マグネシウムで乾燥後，エーテルをエバ
ポレータで除くと結晶を得る。この結晶をシリカゲルカ
ラムクロマトで精製し，下記化学構造式１２の１−アセ
チル−２−アリル−〔２′−（３，４−ジメチルフェニ
ル）〕ナフタレン（Ｃ）を収率２５％で得た。
【化１２】
次いで，上記のアセチルアリルナフタレン（Ｃ）１５０
ｍｇにエタノール４ｍｌを加え，過剰の炭酸カリウムを
加え，室温で１時間攪拌する。ＴＬＣで原料の消失確認
後反応液を濾過し，溶媒を除き，次いで１ＮのＨＣｌを
５ｃｃ加え，クロロホルムで抽出し，飽和食塩水で洗い
，乾燥，濾過し，クロロホルムを除き結晶を得る。これ
を，シリカゲルクロマトで精製し，下記化学構造式１３
の２−アリル−〔２′−（３，４−ジメチルフェニル）
〕ナフトール（Ｄ）を収率９０％で得た。
ｍｇにエタノール４ｍｌを加え，過剰の炭酸カリウムを
加え，室温で１時間攪拌する。ＴＬＣで原料の消失確認
後反応液を濾過し，溶媒を除き，次いで１ＮのＨＣｌを
５ｃｃ加え，クロロホルムで抽出し，飽和食塩水で洗い
，乾燥，濾過し，クロロホルムを除き結晶を得る。これ
を，シリカゲルクロマトで精製し，下記化学構造式１３
の２−アリル−〔２′−（３，４−ジメチルフェニル）
〕ナフトール（Ｄ）を収率９０％で得た。
【化１３】
次いで，このナフトール誘導体（Ｄ）１ｇをピリジン８
ｍｌに溶かし，０℃で３０分攪拌後，同様に冷却したオ
キシ塩化リン（２．５ｅｑ）を加え０℃で４時間攪拌し
た。その後，氷を加え反応を止めた。この反応物を逆相
シリカゲルカラムクロマト精製，次いで順相シリカゲル
カラムクロマト精製により下記化学構造式１４で表され
る２−アリル−〔２′−（３，４−ジメチルフェニル）
〕３−ナフトールホスフェートを得た。
ｍｌに溶かし，０℃で３０分攪拌後，同様に冷却したオ
キシ塩化リン（２．５ｅｑ）を加え０℃で４時間攪拌し
た。その後，氷を加え反応を止めた。この反応物を逆相
シリカゲルカラムクロマト精製，次いで順相シリカゲル
カラムクロマト精製により下記化学構造式１４で表され
る２−アリル−〔２′−（３，４−ジメチルフェニル）
〕３−ナフトールホスフェートを得た。
【化１４】
そして，このものを上記のごとく検出テストに用いた。
【０００７】実施例２
文献Ｅｎｚｙｍｅ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙに
基づいて，２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸５ｇ（０．
０２７ｍｏｌ）と，２−アミノ−４−メチルベンゾチア
ゾール３．８ｇ（０．０２３ｍｏｌ）と，無水キシレン
４０ｍｌとを，ジムロート冷却器を付けた１００ｍｌナ
スフラスコに入れ，８０℃で１０分間攪拌する。次いで
，三塩化リン（０．０１ｍｏｌ）を加える。そして，こ
の混合物を２時間還流する。その後，反応液を熱いまま
デカンテーションして上清液を取る。次いで，４℃で冷
却し，でてきた沈澱物を濾過する。この沈澱物をキシレ
ン，次いで水で洗う。更に，この沈澱物を２％炭酸ナト
リウム水溶液で中和し，煮沸によってキシレンを完全に
除く。次いで，２％炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ＝９に
し，濾過し，冷却する。そして，沈澱物を水で洗う。こ
の沈澱物を３％ＨＣｌ水溶液に加え，加熱し，濾過し，
冷却する。更に，この沈澱物を熱水で洗い，乾燥する。 次いで，この沈澱物を再結晶して，下記化学構造式１５
で示される３−ヒドロキシ−２−ナフトアミド（４メチ
ルベンゾチアゾール）を得た。
基づいて，２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸５ｇ（０．
０２７ｍｏｌ）と，２−アミノ−４−メチルベンゾチア
ゾール３．８ｇ（０．０２３ｍｏｌ）と，無水キシレン
４０ｍｌとを，ジムロート冷却器を付けた１００ｍｌナ
スフラスコに入れ，８０℃で１０分間攪拌する。次いで
，三塩化リン（０．０１ｍｏｌ）を加える。そして，こ
の混合物を２時間還流する。その後，反応液を熱いまま
デカンテーションして上清液を取る。次いで，４℃で冷
却し，でてきた沈澱物を濾過する。この沈澱物をキシレ
ン，次いで水で洗う。更に，この沈澱物を２％炭酸ナト
リウム水溶液で中和し，煮沸によってキシレンを完全に
除く。次いで，２％炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ＝９に
し，濾過し，冷却する。そして，沈澱物を水で洗う。こ
の沈澱物を３％ＨＣｌ水溶液に加え，加熱し，濾過し，
冷却する。更に，この沈澱物を熱水で洗い，乾燥する。 次いで，この沈澱物を再結晶して，下記化学構造式１５
で示される３−ヒドロキシ−２−ナフトアミド（４メチ
ルベンゾチアゾール）を得た。
【化１５】
次いで，このナフトール誘導体１ｇをピリジン８ｍｌに
溶かし，０℃で３０分攪拌後，同様に冷却したオキシ塩
化リン（２．５ｅｑ）を加え０℃で４時間攪拌した。そ
の後，氷を加え反応を止めた。この反応物を逆相シリカ
ゲルカラムクロマト精製，次いで順相シリカゲルカラム
クロマト精製により，下記化学構造式１６で表される３
−ヒドロキシ−２−ナフトアミド（４−メチルベンゾチ
アゾール）リン酸体を得た。
溶かし，０℃で３０分攪拌後，同様に冷却したオキシ塩
化リン（２．５ｅｑ）を加え０℃で４時間攪拌した。そ
の後，氷を加え反応を止めた。この反応物を逆相シリカ
ゲルカラムクロマト精製，次いで順相シリカゲルカラム
クロマト精製により，下記化学構造式１６で表される３
−ヒドロキシ−２−ナフトアミド（４−メチルベンゾチ
アゾール）リン酸体を得た。
【化１６】
【０００８】実施例３
２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸（２′−フェニルアニ
リド）１ｇ（２．９５×１０−３ｍｏｌ）を無水クロロ
ホルム１０ｍに溶かす。次いで五塩化リンを０．５ｍｏ
ｌ当量加え，４０℃で２時間攪拌する。次いで，エバポ
レータでクロロホルムを除く。残査の結晶を無水メタノ
ール１０ｍｌに溶かし，氷冷下でナトリウムメトキシド
を１０ｍｏｌ当量加える。０℃で一夜攪拌後，そのまま
カラムクロマト精製を行い，２−ヒドロキシ−（２′−
フェニルアニリド）−メチル−３−ナフトエートを１０
０ｍｇ得た。次いで，このヒドロキシ体を無水ピリジン
３ｍｌに溶かし，０℃で３０分間攪拌後，オキシ塩化リ
ンを２．５ｍｏｌ当量加え，０℃で４時間攪拌する。そ
の後，氷を加え反応を止める。次いで，逆相シリカゲル
カラムクロマト精製を行い，下記の化学構造式１７で示
される２−ヒドロキシ−（２′−フェニルアニリド）−
メチル−３−ナフトエートリン酸体を３０ｍｇ得た。
リド）１ｇ（２．９５×１０−３ｍｏｌ）を無水クロロ
ホルム１０ｍに溶かす。次いで五塩化リンを０．５ｍｏ
ｌ当量加え，４０℃で２時間攪拌する。次いで，エバポ
レータでクロロホルムを除く。残査の結晶を無水メタノ
ール１０ｍｌに溶かし，氷冷下でナトリウムメトキシド
を１０ｍｏｌ当量加える。０℃で一夜攪拌後，そのまま
カラムクロマト精製を行い，２−ヒドロキシ−（２′−
フェニルアニリド）−メチル−３−ナフトエートを１０
０ｍｇ得た。次いで，このヒドロキシ体を無水ピリジン
３ｍｌに溶かし，０℃で３０分間攪拌後，オキシ塩化リ
ンを２．５ｍｏｌ当量加え，０℃で４時間攪拌する。そ
の後，氷を加え反応を止める。次いで，逆相シリカゲル
カラムクロマト精製を行い，下記の化学構造式１７で示
される２−ヒドロキシ−（２′−フェニルアニリド）−
メチル−３−ナフトエートリン酸体を３０ｍｇ得た。
【化１７】
【０００９】実施例４
２−アミノ−３−ナフトール５ｇ（０．０３１４ｍｏｌ
）と２−フェニル安息香酸６．２ｇ（０．０３１４ｍｏ
ｌ）と無水キシレン４０ｍｌを，ジムロート冷却器を付
けた１００ｍｌナスフラスコに入れ，８０℃で１０分間
攪拌する。次いで，実施例２と同様にして，下記化学構
造式１８で示されるＮ−（２′−フェニル安息香酸）−
２−ヒドロキシ−３−ナフチルアミンリン酸体を得た。
）と２−フェニル安息香酸６．２ｇ（０．０３１４ｍｏ
ｌ）と無水キシレン４０ｍｌを，ジムロート冷却器を付
けた１００ｍｌナスフラスコに入れ，８０℃で１０分間
攪拌する。次いで，実施例２と同様にして，下記化学構
造式１８で示されるＮ−（２′−フェニル安息香酸）−
２−ヒドロキシ−３−ナフチルアミンリン酸体を得た。
【化１８】
【００１０】実施例５
１−アミノ−７−ナフトール５ｇ（０．０３１４ｍｏｌ
）と４−フェニル安息香酸６．２ｇｒ（０．０３１４ｍ
ｏｌ）と無水キシレン４０ｍｌを，ジムロート冷却器を
付けた１００ｍｌナスフラスコに入れ，８０℃で１０分
間攪拌する。次いで，実施例２と同様にして，下記の化
学構造式１９で示されるＮ−（４′−フェニル安息香酸
）−２−ヒドロキシ−８−ナフチルアミンリン酸体を得
た。
）と４−フェニル安息香酸６．２ｇｒ（０．０３１４ｍ
ｏｌ）と無水キシレン４０ｍｌを，ジムロート冷却器を
付けた１００ｍｌナスフラスコに入れ，８０℃で１０分
間攪拌する。次いで，実施例２と同様にして，下記の化
学構造式１９で示されるＮ−（４′−フェニル安息香酸
）−２−ヒドロキシ−８−ナフチルアミンリン酸体を得
た。
【化１９】
【００１１】実施例６
２−ヒドロキシ−６−ナフトエ酸２ｇ（０．０１１ｍｏ
ｌ）と２−フェニルアニリン１．８ｇ（０．０１１ｍｏ
ｌ）と無水キシレン３０ｍｌを，ジムロート冷却器を付
けた１００ｍｌナスフラスコに入れ，８０℃で１０分間
攪拌する。次いで，実施例２と同様にして，下記の化学
構造式２０で示される２−ヒドロキシ−６−ナフトエ酸
（２′−フェニルアニリド）リン酸体を得た。
ｌ）と２−フェニルアニリン１．８ｇ（０．０１１ｍｏ
ｌ）と無水キシレン３０ｍｌを，ジムロート冷却器を付
けた１００ｍｌナスフラスコに入れ，８０℃で１０分間
攪拌する。次いで，実施例２と同様にして，下記の化学
構造式２０で示される２−ヒドロキシ−６−ナフトエ酸
（２′−フェニルアニリド）リン酸体を得た。
【化２０】
上記実施例２〜６により得られた各種のナフトール誘導
体ホスフェートについて実施例１と同様の検出テストを
おこなった。該検出テストは，実施例１に示した核酸試
料担体フィルターへのスポットによる方法を用いた。ま
た，上記検出テストの結果を表２に示す。同表には実施
例１についても併示した。表２より知られるごとく，本
発明によれば極めて微量なＤＮＡについても感度良く検
出できることが分かる。
体ホスフェートについて実施例１と同様の検出テストを
おこなった。該検出テストは，実施例１に示した核酸試
料担体フィルターへのスポットによる方法を用いた。ま
た，上記検出テストの結果を表２に示す。同表には実施
例１についても併示した。表２より知られるごとく，本
発明によれば極めて微量なＤＮＡについても感度良く検
出できることが分かる。
【表１】
【図１】実施例１におけるＤＮＡ検出テストの結果を示
す図。
す図。
【図２】実施例１における微小量のＤＮＡ検出テストの
結果を示す図。
結果を示す図。
１ 核酸試料担体フィルター，１１
蛍光検出部分，
蛍光検出部分，
Claims (6)
- 【請求項１】 核酸などの被検体にホスファターゼを
結合させ，次いで該ホスファターゼにナフトール誘導体
ホスフェートを反応させ，その後これらに励起光を照射
して，これにより発生する蛍光を検出することを特徴と
する核酸等の検定方法。 - 【請求項２】 請求項１の検定方法に用いるナフトー
ル誘導体ホスフェートは，一般式Ｐ−Ｎａｐ−Ｒ（ｎ）
で表され，Ｎａｐは，ナフタレン環部であり，Ｐは，
上記ナフタレン環に結合するホスフェート部であり，Ｒ
（ｎ）は，上記ナフタレン環に結合（３個；ｎ＝１，２
，３）する置換基部であるホスファターゼ修飾蛍光物質
。 - 【請求項３】 請求項２において，Ｐ−Ｎａｐ−Ｒ（
ｎ） は，下記の化学構造式１又は２により表されるも
ので，【化１】 【化２】 式中Ｒ１ はアミド基，ビニル基，Ｃが１〜３のアルキ
ル基，エステル基であるか，もしくは下記化学構造式３
，【化３】 （Ｘはアルコキシ基，フェノキシ基である）で表される
ものであり，Ｒ２ は，アリール基，縮合芳香族基，チ
オアリール基，アルキル基，アルコキシ基，フェノキシ
基を表し，Ｒ３ ，Ｒ４ は，同じか又は異なっていて
よく，水素原子，ハロゲン原子，アルキル基，アルコキ
シ基，フェノキシ基，アミノアセチル基，シアノ基，エ
ステル基で表される，ことを特徴とするホスファターゼ
修飾蛍光物質。 - 【請求項４】 請求項３において，Ｒ２ が下記化学
構造式４のアリール基で表される場合には，【化４】 上記式中Ｍ１ ，Ｍ２ ，Ｍ３ は，同じか又は異なっ
ていてよく，水素原子，ハロゲン原子，Ｃが１〜３のア
ルキル基，アルコキシ基，フェニル基，アミノフェニル
基，ベンジル基，アミノアセチル基，シアノ基であるか
，もしくは下記化学構造式５で表され， 【化５】 上記式中Ｍ４ は，水素原子又はＣが１〜３のアルキル
基，アルコキシ基，シアノ基，アミノアセチル基を表す
，ことを特徴とするホスファターゼ修飾蛍光物質。 - 【請求項５】 請求項３において，Ｒ２ が縮合芳香
族基である場合には，Ｒ２ は下記の化学構造式６，７
又は８で表されることを特徴とするホスファターゼ修飾
蛍光物質。 【化６】 【化７】 【化８】 - 【請求項６】 請求項３において，Ｒ２ がチオアリ
ール基である場合には，Ｒ２ は下記の化学構造式９で
示され， 【化９】 上記式中Ｍ５ は，水素原子，又はＣが１又は２のアル
キル基，アルコキシ基，シアノ基，アミノアセチル基を
表すことを特徴とするホスファターゼ修飾蛍光物質。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2413201A JPH04222600A (ja) | 1990-12-21 | 1990-12-21 | ナフトール誘導体ホスフェートによる核酸等の検定方法 |
| US07/806,189 US5484700A (en) | 1990-12-21 | 1991-12-13 | Method for assaying nucleic acids using naphthol derivative phosphate |
| DE4142076A DE4142076C2 (de) | 1990-12-21 | 1991-12-19 | Verfahren zum Analysieren von Nucleinsäuren unter Anwendung von Naphtholderivatphosphat |
| GB9127232A GB2250991B (en) | 1990-12-21 | 1991-12-23 | Naphthalene derivatives and their use in methods for assaying nucleic acids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2413201A JPH04222600A (ja) | 1990-12-21 | 1990-12-21 | ナフトール誘導体ホスフェートによる核酸等の検定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04222600A true JPH04222600A (ja) | 1992-08-12 |
Family
ID=18521887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2413201A Pending JPH04222600A (ja) | 1990-12-21 | 1990-12-21 | ナフトール誘導体ホスフェートによる核酸等の検定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5484700A (ja) |
| JP (1) | JPH04222600A (ja) |
| DE (1) | DE4142076C2 (ja) |
| GB (1) | GB2250991B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5296061A (en) * | 1991-06-12 | 1994-03-22 | Toray Industries, Inc. | Process for producing a tubular nonwoven fabric and tubular nonwoven fabric produced by the same |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06197798A (ja) * | 1992-08-28 | 1994-07-19 | Aisin Seiki Co Ltd | 蛍光基質によるｄｎａ塩基配列決定法 |
| GB0318110D0 (en) * | 2003-08-01 | 2003-09-03 | Isaeo Ltd | Methods and kits for detecting an enzyme capable of modifying a nucleic acid |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB939675A (en) * | 1958-10-24 | 1963-10-16 | Gevaert Photo Prod Nv | New dyes and the production thereof |
| NL137849C (ja) * | 1961-12-30 | |||
| EP0124124A3 (en) * | 1983-05-02 | 1987-08-26 | Enzo Biochem, Inc. | Method and materials useful for the analysis and detection of genetic material |
| US4707440A (en) * | 1984-01-30 | 1987-11-17 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleic acid hybridization assay and detectable molecules useful in such assay |
| US4582789A (en) * | 1984-03-21 | 1986-04-15 | Cetus Corporation | Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives |
| EP0401813A3 (en) * | 1989-06-08 | 1991-10-16 | Advanced Instruments, Inc. | Method and device for the assay of alkaline phosphatase in dairy products |
| GB2239948B (en) * | 1989-12-28 | 1994-01-12 | Aisin Seiki | Fluorescence assay using phosphatase and a naphthol phosphate derivative |
-
1990
- 1990-12-21 JP JP2413201A patent/JPH04222600A/ja active Pending
-
1991
- 1991-12-13 US US07/806,189 patent/US5484700A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-19 DE DE4142076A patent/DE4142076C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-23 GB GB9127232A patent/GB2250991B/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5296061A (en) * | 1991-06-12 | 1994-03-22 | Toray Industries, Inc. | Process for producing a tubular nonwoven fabric and tubular nonwoven fabric produced by the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5484700A (en) | 1996-01-16 |
| DE4142076A1 (de) | 1992-07-09 |
| GB2250991B (en) | 1994-08-10 |
| DE4142076C2 (de) | 1996-03-28 |
| GB2250991A (en) | 1992-06-24 |
| GB9127232D0 (en) | 1992-02-19 |
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