JPH0881378A - ヒト表皮角化細胞賦活剤 - Google Patents
ヒト表皮角化細胞賦活剤Info
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- JPH0881378A JPH0881378A JP7179598A JP17959895A JPH0881378A JP H0881378 A JPH0881378 A JP H0881378A JP 7179598 A JP7179598 A JP 7179598A JP 17959895 A JP17959895 A JP 17959895A JP H0881378 A JPH0881378 A JP H0881378A
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 アルギン酸オリゴ糖又はその塩を有効成分と
して含むヒト表皮角化細胞賦活剤。 【効果】 本発明により、ヒト表皮角化細胞の培養に要
する培養時間を短縮でき、しかも、安定した４回以上の
継代を可能にするヒト表皮角化細胞賦活剤が提供され
る。
して含むヒト表皮角化細胞賦活剤。 【効果】 本発明により、ヒト表皮角化細胞の培養に要
する培養時間を短縮でき、しかも、安定した４回以上の
継代を可能にするヒト表皮角化細胞賦活剤が提供され
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アルギン酸オリゴ糖又
はその塩を有効成分として含むヒト表皮角化細胞賦活剤
に関する。
はその塩を有効成分として含むヒト表皮角化細胞賦活剤
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト表皮角化細胞の無血清培地による培
養系が確立され、最近ではヒト表皮角化細胞の培養を目
的とした細胞培養キットが販売されており〔例えば、
（株）森永生科学研究所製、倉敷紡績（株）製、極東製
薬工業（株）製〕、皮膚関連の研究技術は大きく進歩し
ている。また、無血清培地を用いることにより、血清中
に含まれる不明な成分を考慮する必要がなく、基礎的な
研究を行いやすくなった。しかも、コストの削減、ロッ
ト差の解消、及び品質等の維持管理が容易となった。
養系が確立され、最近ではヒト表皮角化細胞の培養を目
的とした細胞培養キットが販売されており〔例えば、
（株）森永生科学研究所製、倉敷紡績（株）製、極東製
薬工業（株）製〕、皮膚関連の研究技術は大きく進歩し
ている。また、無血清培地を用いることにより、血清中
に含まれる不明な成分を考慮する必要がなく、基礎的な
研究を行いやすくなった。しかも、コストの削減、ロッ
ト差の解消、及び品質等の維持管理が容易となった。
【０００３】その結果、種々の分野で無血清培地を利用
した研究開発が進められており、特に、皮膚科領域で
は、創傷ややけど等の皮膚治療を目的とした臨床応用へ
と発展しようとしている。このような技術的進歩に伴
い、皮膚治療の分野では、培養によって得られた皮膚を
用いた治療が注目されている。即ち、重症やけど等を負
ったため自力では皮膚を再生できない患者等に対する治
療において、患者自身の皮膚断片を培養して表面積の大
きい皮膚をつくり、これを移植するというものである。
この治療の対象としては、例えば、体表70％以上に及ぶ
やけどや、広範囲のアザ、やけど後の痕跡等を負った患
者が挙げられる。外国では、体表98％に及ぶやけどを負
った患者に培養表皮の移植を行い、治療が成功した例も
ある。
した研究開発が進められており、特に、皮膚科領域で
は、創傷ややけど等の皮膚治療を目的とした臨床応用へ
と発展しようとしている。このような技術的進歩に伴
い、皮膚治療の分野では、培養によって得られた皮膚を
用いた治療が注目されている。即ち、重症やけど等を負
ったため自力では皮膚を再生できない患者等に対する治
療において、患者自身の皮膚断片を培養して表面積の大
きい皮膚をつくり、これを移植するというものである。
この治療の対象としては、例えば、体表70％以上に及ぶ
やけどや、広範囲のアザ、やけど後の痕跡等を負った患
者が挙げられる。外国では、体表98％に及ぶやけどを負
った患者に培養表皮の移植を行い、治療が成功した例も
ある。
【０００４】しかし、治療に用いる患者自身の皮膚の培
養期間が２〜３週間と長くかかること、又は培養を植え
継ぐ回数 (継代数) を４回以上行うことは困難であるこ
とが依然として解決すべき問題点として残されている。
養期間が２〜３週間と長くかかること、又は培養を植え
継ぐ回数 (継代数) を４回以上行うことは困難であるこ
とが依然として解決すべき問題点として残されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、皮膚の細胞
の培養に要する培養時間を短縮でき、しかも、培養細胞
の継代数を増加させることにより、目的とする皮膚の細
胞を確実に多く得ることが可能なヒト表皮角化細胞賦活
剤を提供することを目的とする。
の培養に要する培養時間を短縮でき、しかも、培養細胞
の継代数を増加させることにより、目的とする皮膚の細
胞を確実に多く得ることが可能なヒト表皮角化細胞賦活
剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、アルギン酸オリゴ糖
又はその塩を無血清培養系に添加した培地でヒト表皮角
化細胞を培養することにより、上記諸問題を解決し、さ
らに培養細胞システムの構築（ヒトの皮膚を保管・保存
し、いつでも利用可能な状態にできる皮膚バンクを確か
なものとすること）が期待されるほどの増殖活性が得ら
れることを見い出し、本発明を完成するに至った。
に基づいて鋭意研究を行った結果、アルギン酸オリゴ糖
又はその塩を無血清培養系に添加した培地でヒト表皮角
化細胞を培養することにより、上記諸問題を解決し、さ
らに培養細胞システムの構築（ヒトの皮膚を保管・保存
し、いつでも利用可能な状態にできる皮膚バンクを確か
なものとすること）が期待されるほどの増殖活性が得ら
れることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、アルギン酸オリゴ糖
又はその塩を有効成分として含むヒト表皮角化細胞賦活
剤である。ここで、アルギン酸オリゴ糖又はその塩とし
ては、アルギン酸又はその塩をアルテロモナス属に属す
る微生物の菌体又はその処理物で処理したものが挙げら
れる。また、アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、分子量
1,000 以下のものであるが、アルギン酸オリゴ糖又はそ
の塩における２糖〜５糖の割合は、80〜100重量％であ
る。
又はその塩を有効成分として含むヒト表皮角化細胞賦活
剤である。ここで、アルギン酸オリゴ糖又はその塩とし
ては、アルギン酸又はその塩をアルテロモナス属に属す
る微生物の菌体又はその処理物で処理したものが挙げら
れる。また、アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、分子量
1,000 以下のものであるが、アルギン酸オリゴ糖又はそ
の塩における２糖〜５糖の割合は、80〜100重量％であ
る。
【０００８】さらに、本発明は、ヒト表皮角化細胞用無
血清培地に添加してヒト表皮角化細胞を増殖させるため
の、又は、やけど、創傷若しくはアザの治療のための、
前記記載のヒト表皮角化細胞賦活剤である。以下、本発
明を詳細に説明する。本発明の有効成分であるアルギン
酸オリゴ糖又はその塩は、アルギン酸又はその塩に、ア
ルテロモナス属に属する微生物が生産するアルギン酸又
はその塩の分解酵素、即ちアルギン酸リアーゼを作用さ
せて得ることができる。アルギン酸とは、Ｄ−マンヌロ
ン酸とＬ−グルロン酸を構成糖とする多糖類の一つであ
り、その塩としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、
アルギン酸カリウム、又はその混合物が挙げられる。ま
た、アルギン酸オリゴ糖の塩としては、例えば、アルギ
ン酸ナトリウムオリゴ糖、アルギン酸カリウムオリゴ
糖、又はその混合物が挙げられる。
血清培地に添加してヒト表皮角化細胞を増殖させるため
の、又は、やけど、創傷若しくはアザの治療のための、
前記記載のヒト表皮角化細胞賦活剤である。以下、本発
明を詳細に説明する。本発明の有効成分であるアルギン
酸オリゴ糖又はその塩は、アルギン酸又はその塩に、ア
ルテロモナス属に属する微生物が生産するアルギン酸又
はその塩の分解酵素、即ちアルギン酸リアーゼを作用さ
せて得ることができる。アルギン酸とは、Ｄ−マンヌロ
ン酸とＬ−グルロン酸を構成糖とする多糖類の一つであ
り、その塩としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、
アルギン酸カリウム、又はその混合物が挙げられる。ま
た、アルギン酸オリゴ糖の塩としては、例えば、アルギ
ン酸ナトリウムオリゴ糖、アルギン酸カリウムオリゴ
糖、又はその混合物が挙げられる。
【０００９】先ず、本発明の有効成分であるアルギン酸
オリゴ糖又はその塩を得るために用いられるアルギン酸
リアーゼを生産する微生物について説明する。かかる微
生物としては、アルテロモナス属に属する微生物が挙げ
られ、アルテロモナス エスピー No.1786を例示するこ
とができる。アルテロモナス エスピー No.1786は、魚
介類の腸及びその内容物よりアルギン酸ナトリウムを唯
一の炭素源としてスクリーニングを実施した結果、カブ
トガニの腸より分離されたものであり、その形態学的性
質及び生理学的性質は下記の表１に示す通りである。
オリゴ糖又はその塩を得るために用いられるアルギン酸
リアーゼを生産する微生物について説明する。かかる微
生物としては、アルテロモナス属に属する微生物が挙げ
られ、アルテロモナス エスピー No.1786を例示するこ
とができる。アルテロモナス エスピー No.1786は、魚
介類の腸及びその内容物よりアルギン酸ナトリウムを唯
一の炭素源としてスクリーニングを実施した結果、カブ
トガニの腸より分離されたものであり、その形態学的性
質及び生理学的性質は下記の表１に示す通りである。
【００１０】
【表１】
【００１１】上記表１に示す菌株の性質に基づいて清水
らの方法〔海洋微生物研究法、学会出版センター、 228
〜239 (1985)参照〕に従って同定を試みた結果、上記微
生物(本菌株) は、アルテロモナス属に属することが判
明した。尚、本菌株は、通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に、FERM P-11685として寄託されてい
る。
らの方法〔海洋微生物研究法、学会出版センター、 228
〜239 (1985)参照〕に従って同定を試みた結果、上記微
生物(本菌株) は、アルテロモナス属に属することが判
明した。尚、本菌株は、通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に、FERM P-11685として寄託されてい
る。
【００１２】上記表１に示す性質を有する菌株を培養
し、得られた培養物から通常の精製手法によってアルギ
ン酸リアーゼを分離精製する。培地としては、例えば、
アルギン酸ナトリウム（10ｇ）、人工海水〔塩化ナトリ
ウム 300mM、塩化カリウム10mM、硫酸マグネシウム（７
水和物）50mM、塩化カルシウム（２水塩）10mMを含
有〕、クエン酸鉄アンモニウム10g/100ml 脱塩水、リン
酸水素二カリウム（３水和物）7.5g/100ml 脱塩水、塩
化アンモニウム20g/100ml 脱塩水及び１Ｍ トリス−塩
酸緩衝液を含む培地組成が挙げられる。
し、得られた培養物から通常の精製手法によってアルギ
ン酸リアーゼを分離精製する。培地としては、例えば、
アルギン酸ナトリウム（10ｇ）、人工海水〔塩化ナトリ
ウム 300mM、塩化カリウム10mM、硫酸マグネシウム（７
水和物）50mM、塩化カルシウム（２水塩）10mMを含
有〕、クエン酸鉄アンモニウム10g/100ml 脱塩水、リン
酸水素二カリウム（３水和物）7.5g/100ml 脱塩水、塩
化アンモニウム20g/100ml 脱塩水及び１Ｍ トリス−塩
酸緩衝液を含む培地組成が挙げられる。
【００１３】培養は、例えば、凍結乾燥菌体アルテロモ
ナス・エスピー No.1786株を２回前培養 (20℃、１日)
後、本培養 (25℃、１日) を行う。このようにして上記
微生物を培養することによって、アルギン酸リアーゼが
蓄積された培養上清又は微生物を含む培養物が得られ
る。次に、該培養物を材料にして、蛋白質の分離、精製
に用いられる方法によりアルギン酸リアーゼを得ること
ができる。例えば、上記培養液から分画分子量500,000
限外濾過膜 (ロミコン社製) により菌体を取り除いて粗
アルギン酸リアーゼ溶液とするほか、更に、該粗アルギ
ン酸リアーゼ溶液について、塩析法、遠心分離法、各種
クロマトグラフィー、電気泳動等を適当に組み合わせて
精製を行ってもよい。各種クロマトグラフィーとして
は、疎水、ゲルろ過、イオン交換、逆相、アフィニティ
ークロマトグラフィー等が挙げられる。また、精製品の
純度及びその分子量の確認のため、ＳＤＳ（ラウリル硫
酸ナトリウム）ポリアクリルアミドゲル電気泳動等を用
いることもできる。
ナス・エスピー No.1786株を２回前培養 (20℃、１日)
後、本培養 (25℃、１日) を行う。このようにして上記
微生物を培養することによって、アルギン酸リアーゼが
蓄積された培養上清又は微生物を含む培養物が得られ
る。次に、該培養物を材料にして、蛋白質の分離、精製
に用いられる方法によりアルギン酸リアーゼを得ること
ができる。例えば、上記培養液から分画分子量500,000
限外濾過膜 (ロミコン社製) により菌体を取り除いて粗
アルギン酸リアーゼ溶液とするほか、更に、該粗アルギ
ン酸リアーゼ溶液について、塩析法、遠心分離法、各種
クロマトグラフィー、電気泳動等を適当に組み合わせて
精製を行ってもよい。各種クロマトグラフィーとして
は、疎水、ゲルろ過、イオン交換、逆相、アフィニティ
ークロマトグラフィー等が挙げられる。また、精製品の
純度及びその分子量の確認のため、ＳＤＳ（ラウリル硫
酸ナトリウム）ポリアクリルアミドゲル電気泳動等を用
いることもできる。
【００１４】このようにして得られたアルギン酸リアー
ゼの酵素的性質は次の通りである。 作用：アルギン酸又はその塩を基質として上記微生物
の生産するアルギン酸リアーゼを反応させた時、反応生
成物であるアルギン酸オリゴ糖又はその塩の二重結合に
由来する特異吸収波長である230nm における吸光度の増
加、及び生じるオリゴ糖による還元力の増加が確認され
た。
ゼの酵素的性質は次の通りである。 作用：アルギン酸又はその塩を基質として上記微生物
の生産するアルギン酸リアーゼを反応させた時、反応生
成物であるアルギン酸オリゴ糖又はその塩の二重結合に
由来する特異吸収波長である230nm における吸光度の増
加、及び生じるオリゴ糖による還元力の増加が確認され
た。
【００１５】至適ｐＨ：上記微生物の生産するアルギ
ン酸リアーゼは、ｐＨ7.０〜7.５の範囲で相対活性量が
高く、相対活性量が最大になるｐＨ7.０が至適ｐＨであ
る。 至適温度及び熱安定性：上記微生物の生産するアルギ
ン酸リアーゼは、45〜55℃の範囲で高くなる。 酵素活性：下記組成の反応液を用い、アルギン酸ナト
リウムとアルギン酸リアーゼを50℃にて10分間反応さ
せ、生成したオリゴ糖量をネルソン・ソモギー法により
測定することにより、アルギン酸リアーゼの酵素活性を
測定できる。この酵素活性は、１μmoleのマンニュロン
酸に相当するアルギン酸ナトリウムオリゴ糖を生成する
酵素量を１単位として示す。酵素活性測定には、アルギ
ン酸カリウムを用いても良い。 （反応液の組成) ・0.５％アルギン酸ナトリウム（和光純薬製) を含む0.05Ｍリン酸ナトリウム緩 衝液 (ｐＨ7.０) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.45ml ・酵素液・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.05ml 尚、本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩を製造する
ためには、上記本菌株を通常の変異手段を適用して得ら
れる変異株であってアルギン酸リアーゼ産生能を有する
菌株を培養して得られるアルギン酸リアーゼも使用する
ことができる。
ン酸リアーゼは、ｐＨ7.０〜7.５の範囲で相対活性量が
高く、相対活性量が最大になるｐＨ7.０が至適ｐＨであ
る。 至適温度及び熱安定性：上記微生物の生産するアルギ
ン酸リアーゼは、45〜55℃の範囲で高くなる。 酵素活性：下記組成の反応液を用い、アルギン酸ナト
リウムとアルギン酸リアーゼを50℃にて10分間反応さ
せ、生成したオリゴ糖量をネルソン・ソモギー法により
測定することにより、アルギン酸リアーゼの酵素活性を
測定できる。この酵素活性は、１μmoleのマンニュロン
酸に相当するアルギン酸ナトリウムオリゴ糖を生成する
酵素量を１単位として示す。酵素活性測定には、アルギ
ン酸カリウムを用いても良い。 （反応液の組成) ・0.５％アルギン酸ナトリウム（和光純薬製) を含む0.05Ｍリン酸ナトリウム緩 衝液 (ｐＨ7.０) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.45ml ・酵素液・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.05ml 尚、本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩を製造する
ためには、上記本菌株を通常の変異手段を適用して得ら
れる変異株であってアルギン酸リアーゼ産生能を有する
菌株を培養して得られるアルギン酸リアーゼも使用する
ことができる。
【００１６】原料のアルギン酸又はその塩は若干のカル
シウムを含有するため、それらを用いて製造したアルギ
ン酸オリゴ糖又はその塩にもカルシウムが含まれている
可能性がある。カルシウムは表皮角化細胞の角質化（分
化) を促す物質として知られ、カルシウムが存在すると
十分に増殖する前に角質化してしまうため、増殖段階の
培地からカルシウムを除く必要がある。そこで、本発明
のアルギン酸オリゴ糖又はその塩について、脱塩及び脱
カルシウム処理を行うのが好ましい。該処理には電気透
析装置 (旭化成工業（株) 製、商品名、マイクロアシラ
イザー) 等を用いることが好ましい。
シウムを含有するため、それらを用いて製造したアルギ
ン酸オリゴ糖又はその塩にもカルシウムが含まれている
可能性がある。カルシウムは表皮角化細胞の角質化（分
化) を促す物質として知られ、カルシウムが存在すると
十分に増殖する前に角質化してしまうため、増殖段階の
培地からカルシウムを除く必要がある。そこで、本発明
のアルギン酸オリゴ糖又はその塩について、脱塩及び脱
カルシウム処理を行うのが好ましい。該処理には電気透
析装置 (旭化成工業（株) 製、商品名、マイクロアシラ
イザー) 等を用いることが好ましい。
【００１７】次に、原料のアルギン酸又はその塩に、前
記アルギン酸リアーゼを反応させてアルギン酸オリゴ糖
又はその塩を得る。尚、この場合、アルギン酸又はその
塩とアルギン酸リアーゼとの反応温度は45〜55℃、反応
時のｐＨが7.０〜7.５の条件で行うのが好ましく、50
℃、ｐＨ7.０の条件で行うのが更に好ましい。
記アルギン酸リアーゼを反応させてアルギン酸オリゴ糖
又はその塩を得る。尚、この場合、アルギン酸又はその
塩とアルギン酸リアーゼとの反応温度は45〜55℃、反応
時のｐＨが7.０〜7.５の条件で行うのが好ましく、50
℃、ｐＨ7.０の条件で行うのが更に好ましい。
【００１８】本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩と
しては、２糖〜５糖を中心とした分子量1,000 以下のも
のが挙げられ、アルギン酸オリゴ糖又はその塩における
２糖〜５糖の割合は80〜100重量％である。以上のよう
にして得られるアルギン酸オリゴ糖又はその塩の活性成
分は、そのまま本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤として
用いることができ、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥等の
方法で乾燥しておくことができる。
しては、２糖〜５糖を中心とした分子量1,000 以下のも
のが挙げられ、アルギン酸オリゴ糖又はその塩における
２糖〜５糖の割合は80〜100重量％である。以上のよう
にして得られるアルギン酸オリゴ糖又はその塩の活性成
分は、そのまま本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤として
用いることができ、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥等の
方法で乾燥しておくことができる。
【００１９】本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤は、例え
ば、患者から得られた表皮細胞を培養して増殖させるこ
とを目的として用いることができる。また、市販されて
いる正常ヒト表皮角化細胞培養キットに本発明のヒト表
皮角化細胞賦活剤を添加して培養液を調製し、これを用
いて細胞の増殖を促進させることができる。この場合、
培地に含めるヒト表皮角化細胞賦活剤の有効量は、0.00
1 〜100 mg／ml、好ましくは0.01〜0.1 mg／mlである。
ば、患者から得られた表皮細胞を培養して増殖させるこ
とを目的として用いることができる。また、市販されて
いる正常ヒト表皮角化細胞培養キットに本発明のヒト表
皮角化細胞賦活剤を添加して培養液を調製し、これを用
いて細胞の増殖を促進させることができる。この場合、
培地に含めるヒト表皮角化細胞賦活剤の有効量は、0.00
1 〜100 mg／ml、好ましくは0.01〜0.1 mg／mlである。
【００２０】また、本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤を
医薬として適用する場合は、ヒト表皮角化細胞賦活作用
により、各種疾患又は症状を治療又は改善する目的であ
れば、特に対象を限定しない。例えば、やけど、創傷又
はアザ等に対する治療を特異目的として用いることがで
きる。また、投与する方法は非経口により行い、その投
与形態としては、クリーム剤、軟膏、パップ剤等が挙げ
られる。また、その投与量は動物か人間かによって、ま
た、年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に
変えることができる。この場合、本発明のヒト表皮角化
細胞賦活剤の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用
し得る担体との組成物として投与される有効量は、0.01
〜100mg/cm2 皮膚/日であり、１日１回から数回に分け
て２日以上投与される。
医薬として適用する場合は、ヒト表皮角化細胞賦活作用
により、各種疾患又は症状を治療又は改善する目的であ
れば、特に対象を限定しない。例えば、やけど、創傷又
はアザ等に対する治療を特異目的として用いることがで
きる。また、投与する方法は非経口により行い、その投
与形態としては、クリーム剤、軟膏、パップ剤等が挙げ
られる。また、その投与量は動物か人間かによって、ま
た、年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に
変えることができる。この場合、本発明のヒト表皮角化
細胞賦活剤の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用
し得る担体との組成物として投与される有効量は、0.01
〜100mg/cm2 皮膚/日であり、１日１回から数回に分け
て２日以上投与される。
【００２１】本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤を非経口
投与する場合、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の
添加剤を含有させることもできる。本発明において、ア
ルギン酸オリゴ糖又はその塩がヒト表皮角化細胞賦活剤
として有効であることを裏付ける薬理試験を以下に述べ
る。 〔ヒト表皮角化細胞増殖試験〕（株）森永生科学研究所
製の正常ヒト表皮角化細胞培養キットを用い、ヒト表皮
角化細胞の増殖に及ぼす本発明の増殖賦活剤としての効
果を調べるため、以下の試験を行った。
投与する場合、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の
添加剤を含有させることもできる。本発明において、ア
ルギン酸オリゴ糖又はその塩がヒト表皮角化細胞賦活剤
として有効であることを裏付ける薬理試験を以下に述べ
る。 〔ヒト表皮角化細胞増殖試験〕（株）森永生科学研究所
製の正常ヒト表皮角化細胞培養キットを用い、ヒト表皮
角化細胞の増殖に及ぼす本発明の増殖賦活剤としての効
果を調べるため、以下の試験を行った。
【００２２】〔試験例１〕凍結した正常ヒト表皮角化細
胞を融解後、表皮角化細胞用無血清培地で培養し、さら
に２回継代した。そして、３回目の継代時に上記の無血
清培地に濾過滅菌したアルギン酸カリウムオリゴ糖 (濃
度１mg/ml)を加え、経時的に細胞数を計測するととも
に、細胞の増殖の様子を形態学的に観察した。尚、アル
ギン酸カリウムオリゴ糖を加えなかったものを対照とし
て比較した。
胞を融解後、表皮角化細胞用無血清培地で培養し、さら
に２回継代した。そして、３回目の継代時に上記の無血
清培地に濾過滅菌したアルギン酸カリウムオリゴ糖 (濃
度１mg/ml)を加え、経時的に細胞数を計測するととも
に、細胞の増殖の様子を形態学的に観察した。尚、アル
ギン酸カリウムオリゴ糖を加えなかったものを対照とし
て比較した。
【００２３】その結果、図１に示す通り、アルギン酸カ
リウムオリゴ糖含有培養基（「○」）では、対照培養基
（「●」）と比較して、顕著な細胞増加が認められた。
一方、アルギン酸カリウムオリゴ糖の添加直後、６時間
後及び48時間後における細胞の増殖の様子をそれぞれ図
２、図３及び図４に写真として示した。対照培養基（写
真上段）に比較して、アルギン酸カリウムオリゴ糖含有
培養基（写真下段）の方が細胞数が多いのは写真からも
明らかである。以上より、アルギン酸カリウムオリゴ糖
を加えることによってヒト表皮角化細胞の増殖活性を高
めることができた。
リウムオリゴ糖含有培養基（「○」）では、対照培養基
（「●」）と比較して、顕著な細胞増加が認められた。
一方、アルギン酸カリウムオリゴ糖の添加直後、６時間
後及び48時間後における細胞の増殖の様子をそれぞれ図
２、図３及び図４に写真として示した。対照培養基（写
真上段）に比較して、アルギン酸カリウムオリゴ糖含有
培養基（写真下段）の方が細胞数が多いのは写真からも
明らかである。以上より、アルギン酸カリウムオリゴ糖
を加えることによってヒト表皮角化細胞の増殖活性を高
めることができた。
【００２４】〔試験例２〕凍結した正常ヒト表皮角化細
胞を融解後、表皮角化細胞用無血清培地に濾過滅菌した
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖を添加した培地（0.01、
0.10、1.00mg/ml)で培養し、セミ・コンフルエント（付
着細胞が培養器の面積の約80％を占める状態）に達した
ところで継代を行った。セミ・コンフルエントに達する
時間及び継代数を検討し、細胞の様子を形態学的に観察
した。尚、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖を加えなかっ
たものを対照として比較した。
胞を融解後、表皮角化細胞用無血清培地に濾過滅菌した
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖を添加した培地（0.01、
0.10、1.00mg/ml)で培養し、セミ・コンフルエント（付
着細胞が培養器の面積の約80％を占める状態）に達した
ところで継代を行った。セミ・コンフルエントに達する
時間及び継代数を検討し、細胞の様子を形態学的に観察
した。尚、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖を加えなかっ
たものを対照として比較した。
【００２５】表２にそれぞれの継代数におけるセミ・コ
ンフルエント達成時間を示した。
ンフルエント達成時間を示した。
【００２６】
【表２】
【００２７】アルギン酸ナトリウムオリゴ糖含有培養基
では、継代に適した状態であるセミ・コンフルエントに
なる時間が継代数４回以降徐々に長くなったものの、10
回の継代でも細胞の増殖が可能であった。これに対し
て、対照培養基では、６回目の継代で増殖は認められ
ず、継代できなかった。図５に継代数６回の細胞数の経
時的変化を示した。アルギン酸ナトリウムオリゴ糖含有
培養基では、0.01（「●」）、0.10（「▲」）、1.00
（「■」）mg/ml のいずれの濃度においても４日でセミ
・コンフルエントに達し、継代を行うことができたが、
対照培養基（「○」）では、７日間培養しても増殖は認
められず、継代できない状態になった。通常、継代数４
回以降は、細胞の増殖活性は衰え、正常な状態は期待で
きない上に、６回以上の継代はできないが、アルギン酸
ナトリウムオリゴ糖の添加により細胞の増殖活性が高め
られ、10回継代しても細胞が増殖可能であることが確認
できた。継代数６回の対照培養基の培養７日目の細胞の
形態学的様子を図６に、継代数６〜10回までのアルギン
酸ナトリウムオリゴ糖含有培養基のセミ・コンフルエン
トに達した細胞の形態学的様子をそれぞれ図７〜11に写
真として示した。写真から明らかな通り、対照培養基
（図６）では６回目の継代で増殖しなくなったのに対し
て、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖を添加した培養基
（図７〜11）では、継代数に関係なく正常な増殖を維持
することができることがわかった。
では、継代に適した状態であるセミ・コンフルエントに
なる時間が継代数４回以降徐々に長くなったものの、10
回の継代でも細胞の増殖が可能であった。これに対し
て、対照培養基では、６回目の継代で増殖は認められ
ず、継代できなかった。図５に継代数６回の細胞数の経
時的変化を示した。アルギン酸ナトリウムオリゴ糖含有
培養基では、0.01（「●」）、0.10（「▲」）、1.00
（「■」）mg/ml のいずれの濃度においても４日でセミ
・コンフルエントに達し、継代を行うことができたが、
対照培養基（「○」）では、７日間培養しても増殖は認
められず、継代できない状態になった。通常、継代数４
回以降は、細胞の増殖活性は衰え、正常な状態は期待で
きない上に、６回以上の継代はできないが、アルギン酸
ナトリウムオリゴ糖の添加により細胞の増殖活性が高め
られ、10回継代しても細胞が増殖可能であることが確認
できた。継代数６回の対照培養基の培養７日目の細胞の
形態学的様子を図６に、継代数６〜10回までのアルギン
酸ナトリウムオリゴ糖含有培養基のセミ・コンフルエン
トに達した細胞の形態学的様子をそれぞれ図７〜11に写
真として示した。写真から明らかな通り、対照培養基
（図６）では６回目の継代で増殖しなくなったのに対し
て、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖を添加した培養基
（図７〜11）では、継代数に関係なく正常な増殖を維持
することができることがわかった。
【００２８】以上より、本発明のヒト表皮角化細胞賦活
剤は、継代数の少ない細胞の増殖活性を高めて培養期間
を短縮できるだけでなく、４回以上の継代により増殖活
性が衰えた細胞の賦活化にも効果があり、継代数を増加
させることがわかった。
剤は、継代数の少ない細胞の増殖活性を高めて培養期間
を短縮できるだけでなく、４回以上の継代により増殖活
性が衰えた細胞の賦活化にも効果があり、継代数を増加
させることがわかった。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。但し、本発明は、これら実施例により限定さ
れるものではない。 〔実施例１〕 アルギン酸塩オリゴ糖の製造 (1) アルギン酸リアーゼの調製 (培地組成) ・アルギン酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10 g ・人工海水*1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1000 ml ・Fe stock*2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1 ml ・Pi stock*3・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2 ml ・NH4 stock*4・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 ml ・１Ｍ トリス−塩酸緩衝液 (ｐＨ7.8)・・・・・・・・・・・・・・ 50 ml ──────────────────────────────────── ＊１：人工海水：塩化ナトリウム 300mM、塩化カリウム10mM、硫酸マグネシウム (７水和物) 50mM、塩化カルシウム (２水塩) 10mM ＊２：Fe stock：クエン酸鉄アンモニウム 10g/100ml 脱塩水 ＊３：Pi stock：リン酸水素二カリウム (３水和物) 7.5g/100ml 脱塩水 ＊４：NH4 stock：塩化アンモニウム 20g/100ml 脱塩水 上記組成の培地を用い、凍結乾燥菌体アルテロモナス・
エスピー No.1786株を２回前培養 (20℃、１日) 後、本
培養 (25℃、１日) を行った。その結果、酵素活性が培
養液１ml当たり、0.90単位であるアルギン酸リアーゼ培
養液が生産された。
説明する。但し、本発明は、これら実施例により限定さ
れるものではない。 〔実施例１〕 アルギン酸塩オリゴ糖の製造 (1) アルギン酸リアーゼの調製 (培地組成) ・アルギン酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10 g ・人工海水*1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1000 ml ・Fe stock*2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1 ml ・Pi stock*3・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2 ml ・NH4 stock*4・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 ml ・１Ｍ トリス−塩酸緩衝液 (ｐＨ7.8)・・・・・・・・・・・・・・ 50 ml ──────────────────────────────────── ＊１：人工海水：塩化ナトリウム 300mM、塩化カリウム10mM、硫酸マグネシウム (７水和物) 50mM、塩化カルシウム (２水塩) 10mM ＊２：Fe stock：クエン酸鉄アンモニウム 10g/100ml 脱塩水 ＊３：Pi stock：リン酸水素二カリウム (３水和物) 7.5g/100ml 脱塩水 ＊４：NH4 stock：塩化アンモニウム 20g/100ml 脱塩水 上記組成の培地を用い、凍結乾燥菌体アルテロモナス・
エスピー No.1786株を２回前培養 (20℃、１日) 後、本
培養 (25℃、１日) を行った。その結果、酵素活性が培
養液１ml当たり、0.90単位であるアルギン酸リアーゼ培
養液が生産された。
【００３０】上記培養液から分画分子量500,000 限外濾
過膜 (ロミコン社製) により菌体を取り除いて粗アルギ
ン酸リアーゼ溶液とした。 (2) アルギン酸カリウムオリゴ糖の製造 アルギン酸カリウム (10.0kg) を90Ｌの脱塩水に溶解
後、上記(1)で得られた粗アルギン酸リアーゼ溶液 (50,
000Ｕ) を加え、40℃で20時間攪拌しながら反応させ
た。反応液を除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸
カリウムオリゴ糖粉末を4.２kg得た。
過膜 (ロミコン社製) により菌体を取り除いて粗アルギ
ン酸リアーゼ溶液とした。 (2) アルギン酸カリウムオリゴ糖の製造 アルギン酸カリウム (10.0kg) を90Ｌの脱塩水に溶解
後、上記(1)で得られた粗アルギン酸リアーゼ溶液 (50,
000Ｕ) を加え、40℃で20時間攪拌しながら反応させ
た。反応液を除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸
カリウムオリゴ糖粉末を4.２kg得た。
【００３１】尚、同様にしてアルギン酸ナトリウム、又
はアルギン酸ナトリウムとアルギン酸カリウムとの混合
物を用いれば、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖、又はア
ルギン酸ナトリウムオリゴ糖とアルギン酸カリウムオリ
ゴ糖との混合物が得られる。 (3) カルシウムを含まないアルギン酸塩オリゴ糖の製造 上記(2)で製造したアルギン酸カリウムオリゴ糖 (40.0
ｇ) を電気透析装置 (旭化成工業 (株) 製、商品名、マ
イクロアシライザー) に供してカルシウムイオンを除去
し、精製アルギン酸カリウムオリゴ糖 (39.5ｇ) を得
た。そのオリゴ糖を精製前後で元素レベルで比較した。
その結果を表３に示す。その結果からカルシウムを除去
できたことが確認された。
はアルギン酸ナトリウムとアルギン酸カリウムとの混合
物を用いれば、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖、又はア
ルギン酸ナトリウムオリゴ糖とアルギン酸カリウムオリ
ゴ糖との混合物が得られる。 (3) カルシウムを含まないアルギン酸塩オリゴ糖の製造 上記(2)で製造したアルギン酸カリウムオリゴ糖 (40.0
ｇ) を電気透析装置 (旭化成工業 (株) 製、商品名、マ
イクロアシライザー) に供してカルシウムイオンを除去
し、精製アルギン酸カリウムオリゴ糖 (39.5ｇ) を得
た。そのオリゴ糖を精製前後で元素レベルで比較した。
その結果を表３に示す。その結果からカルシウムを除去
できたことが確認された。
【００３２】
【表３】
【００３３】尚、同様にしてカルシウムを含まないアル
ギン酸ナトリウムオリゴ糖も調製することができる。 〔実施例２〕 ヒト表皮角化細胞賦活剤を含む培養液の
調製 (1) 正常ヒト表皮角化細胞用培地(I) 森永生科学研究所製角化細胞用無血清基礎液体培地の基
礎液体培地250mlに、付属の牛脳下垂体抽出液2.0ml及び
上皮成長因子2.5μgを添加混合し、完全液体培地を調製
する。実施例１(3)で製造したアルギン酸ナトリウムオ
リゴ糖を濾過滅菌処理した後、完全液体培地へ濃度１mg
／培地mlとなるように添加し、本発明のヒト表皮角化細
胞賦活剤を含む培養液を得た。
ギン酸ナトリウムオリゴ糖も調製することができる。 〔実施例２〕 ヒト表皮角化細胞賦活剤を含む培養液の
調製 (1) 正常ヒト表皮角化細胞用培地(I) 森永生科学研究所製角化細胞用無血清基礎液体培地の基
礎液体培地250mlに、付属の牛脳下垂体抽出液2.0ml及び
上皮成長因子2.5μgを添加混合し、完全液体培地を調製
する。実施例１(3)で製造したアルギン酸ナトリウムオ
リゴ糖を濾過滅菌処理した後、完全液体培地へ濃度１mg
／培地mlとなるように添加し、本発明のヒト表皮角化細
胞賦活剤を含む培養液を得た。
【００３４】(2) 正常ヒト表皮角化細胞用培地(II) （株）森永生科学研究所製角化細胞用無血清基礎液体培
地の基礎液体培地250mlに、付属の牛脳下垂体抽出液2.0
ml及び上皮成長因子2.5 μgを添加混合し、完全液体培
地を調製する。実施例１(3)で製造したアルギン酸カリ
ウムオリゴ糖を濾過滅菌処理した後、完全液体培地へ濃
度１mg／培地mlとなるように添加し、本発明のヒト表皮
角化細胞賦活剤を含む培養液を得た。
地の基礎液体培地250mlに、付属の牛脳下垂体抽出液2.0
ml及び上皮成長因子2.5 μgを添加混合し、完全液体培
地を調製する。実施例１(3)で製造したアルギン酸カリ
ウムオリゴ糖を濾過滅菌処理した後、完全液体培地へ濃
度１mg／培地mlとなるように添加し、本発明のヒト表皮
角化細胞賦活剤を含む培養液を得た。
【００３５】〔参考例１〕本参考例は、本発明のアルギ
ン酸カリウムオリゴ糖の重合度の分析例を示すものであ
る。重合度の決定は、薄層クロマトグラフィー (ＴＬ
Ｃ) により行った。まず最初に、標準物質としてアルギ
ン酸ナトリウムを１Ｎトリルオロ酢酸で100℃、24時間
で加水分解して調製した。尚、標準物質としてアルギン
酸カリウムを用いても良い。
ン酸カリウムオリゴ糖の重合度の分析例を示すものであ
る。重合度の決定は、薄層クロマトグラフィー (ＴＬ
Ｃ) により行った。まず最初に、標準物質としてアルギ
ン酸ナトリウムを１Ｎトリルオロ酢酸で100℃、24時間
で加水分解して調製した。尚、標準物質としてアルギン
酸カリウムを用いても良い。
【００３６】ＴＬＣは、以下のような条件で行った。 薄層プレート：シリカゲル60ＨＰＴＬＣプレート (メル
ク社製) 展開溶媒：１−ブタノール／酢酸／水 (５／２／３） 発色試薬：ジフェニルアミン−アニリン−リン酸試薬 上記アルギン酸ナトリウム加水分解物 (標準物質) をＴ
ＬＣに供したところ、６つのスポットが得られた。６つ
のスポットのうち、一番移動度の大きいスポットは、Ｄ
−マンニュロン酸 (シグマ社製Ｄ−マンニュロン酸ラク
トンをアルカリ処理してラクトン環をはずしたもの、Ｒ
ｆ値0.38、ＤＰ＝１) と一致した。さらに、他のスポッ
トに関して、Bio-Gel P-2 (1.5×46cm、0.１Ｍ酢酸緩衝
液 (ｐＨ4.０) で溶出) でゲル濾過して、精製オリゴ糖
を得た。この精製オリゴ糖について、ウロン酸量 (オル
シノール鉄塩酸法、Brown;Arch. Biochem., 11, 269-27
8(1946)) と還元糖類 (ソモギーネルソン法、Somogyi；
J.Biol. Chem., 195, 19-23(1952) 、Nelson；J.Biol.
Chem., 153, 375-380(1944)) を測定し、ウロン酸量／
還元糖量により重合度 (ＤＰ) を算出したところ、それ
ぞれ２、３、４、５、６となった。
ク社製) 展開溶媒：１−ブタノール／酢酸／水 (５／２／３） 発色試薬：ジフェニルアミン−アニリン−リン酸試薬 上記アルギン酸ナトリウム加水分解物 (標準物質) をＴ
ＬＣに供したところ、６つのスポットが得られた。６つ
のスポットのうち、一番移動度の大きいスポットは、Ｄ
−マンニュロン酸 (シグマ社製Ｄ−マンニュロン酸ラク
トンをアルカリ処理してラクトン環をはずしたもの、Ｒ
ｆ値0.38、ＤＰ＝１) と一致した。さらに、他のスポッ
トに関して、Bio-Gel P-2 (1.5×46cm、0.１Ｍ酢酸緩衝
液 (ｐＨ4.０) で溶出) でゲル濾過して、精製オリゴ糖
を得た。この精製オリゴ糖について、ウロン酸量 (オル
シノール鉄塩酸法、Brown;Arch. Biochem., 11, 269-27
8(1946)) と還元糖類 (ソモギーネルソン法、Somogyi；
J.Biol. Chem., 195, 19-23(1952) 、Nelson；J.Biol.
Chem., 153, 375-380(1944)) を測定し、ウロン酸量／
還元糖量により重合度 (ＤＰ) を算出したところ、それ
ぞれ２、３、４、５、６となった。
【００３７】そして、これらの６種の精製オリゴ糖 (Ｄ
−マンニュロン酸を含む) を用いて、薄層クロマトグラ
フィーにおける相対移動度 (Ｒｆ／１−Ｒｆ) の対数値
と重合度 (ＤＰ) との関係を検討した結果、直線性の検
量線が得られた（図12）。図12中、「●」はアルギン酸
ナトリウム加水分解物（標準物質）、「○」はアルギン
酸オリゴ糖（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を示す。
−マンニュロン酸を含む) を用いて、薄層クロマトグラ
フィーにおける相対移動度 (Ｒｆ／１−Ｒｆ) の対数値
と重合度 (ＤＰ) との関係を検討した結果、直線性の検
量線が得られた（図12）。図12中、「●」はアルギン酸
ナトリウム加水分解物（標準物質）、「○」はアルギン
酸オリゴ糖（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を示す。
【００３８】次に、実施例１(2)の方法で調製したアル
ギン酸カリウムオリゴ糖を、DEAE GLASS（ナカナイテス
ク社製) を用いたNaClによる０から２Ｍグラジエント溶
出により高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供
し、フラクションコレクターで分画した (特開平４−２
６６８９６号公報参照) 。この溶出パターンを図13に示
す。230nm に吸収のある画分である１〜８（以下、それ
ぞれ「Ｐ−１」、「Ｐ−２」、・・・「Ｐ−８」とす
る）のうち、主な画分であるＰ−２、Ｐ−３、Ｐ−５、
Ｐ−８を回収し、それぞれの画分を Bio-Gel P-2（バイ
オラッド社製) を充填したカラムを用いて脱塩 (特開平
４−１６９１８８号公報参照) した後凍結乾燥し、ＴＬ
Ｃに供した。その結果、図14に示すような薄層クロマト
グラムが得られた。図14において、Ｏは原点を示す。Ｍ
はＤ−マンニュロン酸、Ｓはアルギン酸ナトリウムの酵
素分解オリゴ糖、２は、Ｐ−２画分、３はＰ−３画分、
５は、Ｐ−５画分、８は、Ｐ−８画分を示す。また、
ａ、ｂ、ｃ、ｄはＲｆ値を算出したスポットを示す。
ギン酸カリウムオリゴ糖を、DEAE GLASS（ナカナイテス
ク社製) を用いたNaClによる０から２Ｍグラジエント溶
出により高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供
し、フラクションコレクターで分画した (特開平４−２
６６８９６号公報参照) 。この溶出パターンを図13に示
す。230nm に吸収のある画分である１〜８（以下、それ
ぞれ「Ｐ−１」、「Ｐ−２」、・・・「Ｐ−８」とす
る）のうち、主な画分であるＰ−２、Ｐ−３、Ｐ−５、
Ｐ−８を回収し、それぞれの画分を Bio-Gel P-2（バイ
オラッド社製) を充填したカラムを用いて脱塩 (特開平
４−１６９１８８号公報参照) した後凍結乾燥し、ＴＬ
Ｃに供した。その結果、図14に示すような薄層クロマト
グラムが得られた。図14において、Ｏは原点を示す。Ｍ
はＤ−マンニュロン酸、Ｓはアルギン酸ナトリウムの酵
素分解オリゴ糖、２は、Ｐ−２画分、３はＰ−３画分、
５は、Ｐ−５画分、８は、Ｐ−８画分を示す。また、
ａ、ｂ、ｃ、ｄはＲｆ値を算出したスポットを示す。
【００３９】図14の薄層クロマトグラムからわかるよう
に、各サンプルとも１スポットにならなかった。そこ
で、主なスポットのＲｆ値を求め、図12に示した検量線
の上にプロットし、重合度を検討した。その結果、分画
したオリゴ糖 (Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−５、Ｐ−８) の重
合度は、主に２〜５であることが明らかになった。すな
わち、アルギン酸カリウムオリゴ糖は、重合度２〜５の
混合物であった。
に、各サンプルとも１スポットにならなかった。そこ
で、主なスポットのＲｆ値を求め、図12に示した検量線
の上にプロットし、重合度を検討した。その結果、分画
したオリゴ糖 (Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−５、Ｐ−８) の重
合度は、主に２〜５であることが明らかになった。すな
わち、アルギン酸カリウムオリゴ糖は、重合度２〜５の
混合物であった。
【００４０】本発明のアルギン酸カリウムオリゴ糖の構
造の例を図15に示した。(a) は重合度２、(b) は重合度
３、(c) は重合度４、(d) は重合度５のオリゴ糖をそれ
ぞれ示している。構成糖はＤ−マンニュロン酸及びＬ−
グルロン酸であるが、ホモ型、ヘテロ型どちらの場合も
あり、「-COOR」基のＲとしては、Ｈ、Ｎａ又はＫの各
場合がある。
造の例を図15に示した。(a) は重合度２、(b) は重合度
３、(c) は重合度４、(d) は重合度５のオリゴ糖をそれ
ぞれ示している。構成糖はＤ−マンニュロン酸及びＬ−
グルロン酸であるが、ホモ型、ヘテロ型どちらの場合も
あり、「-COOR」基のＲとしては、Ｈ、Ｎａ又はＫの各
場合がある。
【００４１】
【発明の効果】本発明により、ヒト表皮角化細胞の培養
系をより安定化させ、実用的に利用可能な４回以上の継
代を可能にするヒト表皮角化細胞賦活剤が提供される。
本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤は、継代数の少ない細
胞の増殖活性を高めて培養期間を短縮できるだけでな
く、継代を繰り返して増殖能力の著しく衰えた細胞の不
活化にも効果があり、10回以上継代しても増殖が可能に
なった。
系をより安定化させ、実用的に利用可能な４回以上の継
代を可能にするヒト表皮角化細胞賦活剤が提供される。
本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤は、継代数の少ない細
胞の増殖活性を高めて培養期間を短縮できるだけでな
く、継代を繰り返して増殖能力の著しく衰えた細胞の不
活化にも効果があり、10回以上継代しても増殖が可能に
なった。
【図１】ヒト表皮角化細胞増殖試験の結果を示す図であ
る。
る。
【図２】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写
真である。
真である。
【図３】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写
真である。
真である。
【図４】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写
真である。
真である。
【図５】継代を６回繰り返したヒト表皮角化細胞の増殖
試験の結果を示す図である。
試験の結果を示す図である。
【図６】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写
真である。
真である。
【図７】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写
真である。
真である。
【図８】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写
真である。
真である。
【図９】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写
真である。
真である。
【図10】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写
真である。
真である。
【図11】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写
真である。
真である。
【図12】アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の重合度と相対
移動度の対数値との関係を示す図である。
移動度の対数値との関係を示す図である。
【図13】アルギン酸カリウムオリゴ糖のＨＰＬＣの結果
を示す図である。
を示す図である。
【図14】アルギン酸カリウムオリゴ糖の薄層クロマトグ
ラムを示す図である。
ラムを示す図である。
【図15】アルギン酸塩オリゴ糖の構造の例を示す模式図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 3/06 Ｃ１２Ｎ 5/06 9/88 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ 7432−4Ｂ // Ａ６１Ｌ 27/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 山本 英司 茨城県つくば市和台16−２ マルハ株式会 社中央研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 アルギン酸オリゴ糖又はその塩を有効成
分として含むヒト表皮角化細胞賦活剤。 - 【請求項２】 アルギン酸オリゴ糖又はその塩が、アル
ギン酸又はその塩をアルテロモナス属に属する微生物の
菌体又はその処理物で処理したものである、請求項１記
載のヒト表皮角化細胞賦活剤。 - 【請求項３】 アルギン酸オリゴ糖又はその塩が、分子
量1,000以下のものである、請求項１記載のヒト表皮角
化細胞賦活剤。 - 【請求項４】 アルギン酸オリゴ糖又はその塩における
２糖〜５糖の割合が80〜100重量％である、請求項３記
載のヒト表皮角化細胞賦活剤。 - 【請求項５】 ヒト表皮角化細胞用無血清培地に添加し
てヒト表皮角化細胞を増殖させるための、請求項１乃至
４のいずれか１項に記載のヒト表皮角化細胞賦活剤。 - 【請求項６】 やけど、創傷又はアザの治療のための、
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のヒト表皮角化細
胞賦活剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17959895A JP3825069B2 (ja) | 1994-07-14 | 1995-06-23 | ヒト表皮角化細胞賦活剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18526694 | 1994-07-14 | ||
| JP6-185266 | 1994-07-14 | ||
| JP17959895A JP3825069B2 (ja) | 1994-07-14 | 1995-06-23 | ヒト表皮角化細胞賦活剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0881378A true JPH0881378A (ja) | 1996-03-26 |
| JP3825069B2 JP3825069B2 (ja) | 2006-09-20 |
Family
ID=26499398
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| JP17959895A Expired - Fee Related JP3825069B2 (ja) | 1994-07-14 | 1995-06-23 | ヒト表皮角化細胞賦活剤 |
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| JP (1) | JP3825069B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001040315A1 (en) * | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Dalian Yaweite Biology Engineering Co., Ltd. | The alginate having low molecular weight, methods of manufacturing it and its use |
| JP2007204449A (ja) * | 2006-02-03 | 2007-08-16 | Pias Arise Kk | マトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤、並びにその産生抑制剤を配合した炎症後色素沈着の予防・改善剤、化粧料 |
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| JP2016111957A (ja) * | 2014-12-12 | 2016-06-23 | 伊那食品工業株式会社 | 多糖類水溶液の製造方法、それによって得られた多糖類水溶液及び多糖類水溶液を含む食品 |
-
1995
- 1995-06-23 JP JP17959895A patent/JP3825069B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001040315A1 (en) * | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Dalian Yaweite Biology Engineering Co., Ltd. | The alginate having low molecular weight, methods of manufacturing it and its use |
| JP2007204449A (ja) * | 2006-02-03 | 2007-08-16 | Pias Arise Kk | マトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤、並びにその産生抑制剤を配合した炎症後色素沈着の予防・改善剤、化粧料 |
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| JP3825069B2 (ja) | 2006-09-20 |
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