JPH0886771A

JPH0886771A - 生菌数迅速測定方法及び装置

Info

Publication number: JPH0886771A
Application number: JP6222122A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Iwasaki; 裕岩崎; Takeshi Sato; 猛佐藤; Tatsu Oishi; 竜大石; Hirofumi Akano; 裕文赤野; Kichiya Kawamura; 吉也川村
Original assignee: Nakano Vinegar Co Ltd
Current assignee: Nakano Vinegar Co Ltd
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 1996-04-02

Abstract

(57)【要約】【目的】生菌数を迅速に測定する方法及び装置を提供
する。【構成】絶縁層薄膜１を有する半導体素子２の上に微
生物を含む電解質含有培養基３を密着配置し、電極４と
半導体素子２の間に定電圧電源５より一定電圧を印加
し、光源７からの光線を光走査装置８により二次元走査
しながら電流測定装置６で流れる電流を測定する。演算
装置９で測定電流値をｐＨに換算することによってｐＨ
の二次元分布を測定し、０．０２以上０．２以下のｐＨ
変化が生じたスポットをもとに生菌数を測定する。半導
体素子２は厚さが２００μｍ以下で、且つ表面の粗さが
２００ｎｍ以下の平滑な半導体を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生菌数を迅速に測定す
る方法及び装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】食品や医薬品、化粧品など微生物による
汚染が問題となる産業分野においては、製造工程や品質
管理及び食中毒の衛生検査など微生物の生菌数を測定し
て安全性を確認する微生物検査が一般に行われている。

【０００３】その方法としては、従来から、測定目的と
する微生物に応じた培地成分を含有する寒天平板培地に
食品などの被検体又はその希釈物の一定量を塗抹又は混
釈して、一定期間、恒温状態で培養して出現するコロニ
ーを主として目視で計測して生菌数とする、いわゆる微
生物培養による検査方法が広く行われてきた。

【０００４】しかし、この方法は、培養に数日を要する
ため、結果が判明するまでの待ち時間が発生するなど迅
速な対応ができないという問題があった。この問題を解
決する目的で、種々の微生物迅速測定法が提案されてお
り、例えば、検体中の微生物からアデノシン−３−リン
酸（ＡＴＰ）を抽出し、発光試薬により発光させその量
をルミノメータで測定し、これから微生物数を算出する
バイオルミネッセンス法（特開平２−１６３０９８号）
等が知られている。また、本発明者らは、これまでに、
空間分解能を有する光走査型半導体ｐＨセンサを用い
て、寒天平板上の生菌を検出することができることを見
出だしている（１９９３年９月２７日、秋期第５４回応
用物理学会学術講演会予稿集、１０６６頁２７ａ−ＺＡ
−４）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記バイオル
ミネッセンス法は検出限界が低く、例えば細菌では検出
に少なくとも１０³個程度の菌数が必要で、生菌数がそ
れ以下の場合にはそのままでは測定できないことや、複
数の種類の微生物が存在した場合、微生物によりＡＴＰ
の含有量が異なるため、正確な菌数が算出できないなど
実用上問題がある。

【０００６】また、前述の空間分解能を有する光走査型
半導体ｐＨセンサを用いる方法においては、ｐＨ変化の
分布を二次元的に測定するため、生菌の数を正確に測定
できるという点では有効であるものの、短時間で生菌を
検出するには感度と分解能が不十分であるという問題が
あった。

【０００７】そこでさらに、高感度、高分解能とするた
めには、ｐＨセンサの半導体基板を薄膜化することが有
効な手段であることを予測していた（１９９３年９月２
７日、秋期第５４回応用物理学会学術講演会予稿集、１
０８３頁２７ｐ−ＺＣ−４６）が、単に半導体基板を薄
膜化するだけでは信号強度とノイズの比率いわゆるＳ／
Ｎ比が低く高感度、迅速な生菌測定を実現することがで
きなかった。以上のような状況を鑑み、本発明は生菌数
を迅速に測定する方法及び装置を提供することを目的に
なされたものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】一般に半導体層／絶縁体
層／電解質層からなる構造において、半導体と電解質層
の間に電圧を印加し、半導体中に空乏層を形成した状態
で断続した光エネルギーを与えると、交流の光励起電流
が流れる。一方、絶縁体である例えば窒化シリコンと二
酸化シリコン膜表面のシラノール基（Ｓｉ−Ｏ−Ｈ）は
周囲のｐＨの状態により、Ｓｉ−Ｏ^-，Ｓｉ−Ｏ−Ｈ，
Ｓｉ−Ｏ−Ｈ₂ ⁺の各構造をとる。これらの構造の違いに
より絶縁体に接する半導体のバンドの曲がり方が異な
り、同じ光エネルギーを与えても光励起電流の流れ出す
電圧が異なり、逆にこの電圧（バイアス電圧）を一定に
した状態では、表面のとりうる構造の違いで電流値が異
なる。この電流値と半導体表面のｐＨには強い相関があ
り、例えば、後述する本発明による装置によればｐＨ１
当たり約５９ｍＶの電圧変化が観測される。従って、一
定のバイアス電圧を印加した状態で半導体表面に光を照
射し、その部分での光励起電流を測定することで局所領
域のｐＨを測定することができ、半導体上を光走査する
とｐＨ分布を二次元画像として測定できる。

【０００９】以上の機能を備えた空間分解能を有するｐ
Ｈセンサとしては、電解質含有溶液と接する絶縁層及び
半導体層からなる半導体素子の半導体側から光を照射し
ながら二次元方向（Ｘ−Ｙ方向）に走査し、絶縁層と接
している溶液のｐＨ分布を測定できるものが望ましく、
たとえば、半導体層としてはシリコン半導体層、絶縁層
としては窒化シリコン層及び二酸化シリコン層、電解質
含有溶液としては塩化カリウム溶液又は塩化ナトリウム
溶液を使用することができる。

【００１０】一方、微生物はその代謝によって細胞外に
様々な物質を分泌することが知られている。その物質の
多くは、有機酸やアルカリ性の有機物等であり、周囲の
環境のｐＨを変化させる。従って、生菌であればその増
殖と代謝の過程で周囲のｐＨを変化させ、死菌では代謝
が行われず増殖もしないため周囲のｐＨに与える影響は
ほとんどない。よって、生菌の表面及び周囲のｐＨと微
生物の存在しない培地上のｐＨを測定し、その分布状態
を解析することで生菌数を測定することができる。

【００１１】さらに迅速に生菌を測定するためには、上
記のように生菌の産出する物質に対応するｐＨの変化量
を測定する方法において、検出するｐＨの変化量（以
下、ΔｐＨという）が検出可能な最も小さい値であるこ
とが望ましいが、この変化は微生物の種類によっても異
なり、また使用する培地によっても異なる。充分に迅速
で、かつ生菌を確実に検出して測定できる最も好適なｐ
Ｈの変化量ΔｐＨは０．０２以上、０．２以下以下、望
ましくは０．０５以上、０．１以下である。生菌による
ｐＨの変化量が０．２より大きくなるためには長時間を
要し、例えば大腸菌の場合には１０時間以上を要し、迅
速性に欠ける。また、ｐＨの変化量が０．０２以下で
は、生菌以外の例えば電解質含有培地の状態のばらつき
によってもｐＨの変化が起こり、正確な生菌数の測定が
できない。

【００１２】また、上記ｐＨ変化量を測定するに際し
て、空間分解能を有するｐＨセンサが光走査型半導体ｐ
Ｈセンサであり、半導体素子の厚さは２００μｍ以下、
望ましくは１００μｍ以下であり、かつ半導体素子表面
の粗さ、すなわち半導体素子の厚さの最も厚いところと
最も薄いところの差が２００ｎｍ以下、望ましくは１０
０ｎｍ以下の平滑な半導体素子を使用することが望まし
い。半導体素子の厚さが２００μｍ以上では、光を半導
体の裏面から照射したとき、光で励起された電子やホー
ルが半導体素子中で拡散し、絶縁層上でのｐＨを測定す
る範囲が広くなり、その結果生菌表面及び周囲のｐＨ分
布の変化を感度良くとらえることができず、例えば８時
間以内で細菌を検出することができない。

【００１３】また、半導体の表面が粗く、半導体層の厚
さが不均一な場合も光で励起された電子やホールの半導
体層中での減衰率が異なり、絶縁層上での信号強度がば
らつくために、結果としてノイズが大きくなり感度が著
しく低下する。半導体表面の粗さが２００ｎｍを超える
場合には、半導体に光励起電流を発生させるために使用
する光照射装置のエネルギーの強弱にかかわらず絶縁層
上で実際に検出できるΔｐＨが０．２より大きくなり迅
速な生菌検出ができない。半導体素子の厚さが１００μ
ｍの場合は表面の粗さは１００ｎｍ以下が望ましく、厚
さが５０μｍの場合は粗さが５０ｎｍ以下が好適であ
る。すなわち半導体素子の厚さと半導体素子表面の粗さ
の割合は概ね１０００：１以上であることが望ましい。

【００１４】図１に、光走査型半導体ｐＨセンサを用い
た本発明による生菌数迅速測定装置の構成を示す。絶縁
性薄膜１で皮膜された半導体素子２上に、測定すべき微
生物を含む電解質含有培養基３が配置され、電解質含有
培養基３の表面あるいは内部には電極４が装着されてい
る。半導体素子２の絶縁性薄膜１で皮膜されていない側
には、光源７からの光線が光走査装置８によって二次元
方向（Ｘ−Ｙ方向）に走査されて照射される。電極４と
半導体素子２の間には定電圧電源５によって一定の電圧
が印加され、流れる電流が電流測定装置６によって測定
される。演算装置９は、測定された電流値と光走査信号
とをもとに、電流測定装置６で測定された電流値を二次
元のｐＨ分布として演算し、ディスプレイ１０に表示す
る。

【００１５】培養基３に含有させる電解質としては、塩
化カリウム溶液、塩化ナトリウム溶液などを用いること
ができる。電解質の量は、ｐＨの変化量が測定できる導
電性が得られる程度の量、例えば０．０１Ｍ〜０．５Ｍ
程度とすることができる。絶縁性薄膜で皮膜された半導
体素子としては、窒化シリコン層及び二酸化シリコン層
を有するシリコン半導体を使用することができる。半導
体素子上への二酸化シリコン層の形成方法は通常の方法
でよいが、例えばシリコン基板を酸素気流中で１０００
℃程度で焼成して形成することができる。窒化シリコン
層は二酸化シリコン層にさらに化学的気相堆積法により
形成することができる。半導体層の厚さは２００μｍ以
下、絶縁性薄膜の厚さは概ね１〜１００ｎｍ程度とする
ことができる。この半導体素子の絶縁性薄膜上に、微生
物を含む例えば厚さ１ｍｍ程度の電解質含有培養基を密
着させる。この場合、微生物を含む電解質含有培養基の
微生物が存在する面を絶縁層に接触させることが望まし
いが、電解質含有培養基の厚さが薄い場合にはこの限り
ではない。電極４は通常使用されるものであればいずれ
でも良いが、特に好適には白金電極が使用できる。光源
７は、半導体素子２に対して光励起電流を発生させるこ
とができるものならいずれでも良いが、半導体素子上で
２００μｍ程度以下のスポットに絞ることのできるレー
ザ光源等が好ましい。電流測定装置６は１０ｎＡ程度以
上の電流が測定できるものが好ましい。定電圧電源５
は、半導体素子２と微生物を含む電解質含有培養基３に
装着された電極４の間に一定電圧、例えば−１０Ｖ〜＋
１０Ｖ程度を印加できるものであれば良い。また、光走
査装置８は、固定した光線に対して半導体素子の方を移
動させる方式のものでもよいし、光線の偏向走査と半導
体素子の移動とを組み合わせて光走査を行うものであっ
てもよい。

【００１６】

【作用】空間分解能を有するｐＨセンサを使用し、生菌
の産生する物質に対応するｐＨの変化量を測定し、該ｐ
Ｈの変化量が０．０２以上、０．２以下の範囲で生菌数
を迅速に測定することができる。例えば、大腸菌であれ
ば、通常の培養方法では検出に２４〜４８時間かかる
が、本発明の方法によれば約８時間で検出が可能であ
る。また、酵母は８時間、乳酸菌は２４時間、カビは１
２時間程度でそれぞれ検出でき迅速測定が可能である。

【００１７】

【実施例】以下に、実施例を挙げて説明するが、本発明
はこれに限定されるものではない。

【００１８】（実施例１）〔大腸菌の測定〕図１に示した装置を用いて大腸菌（E. coli IFO 0330
1）の生菌数測定を行った。使用した半導体素子は厚さ
２００μｍ、表面の粗さ２００ｎｍのシリコン半導体
で、光源には出力５ｍＷ、波長８３０ｎｍの赤外線半導
体レーザーを使用した。光走査装置で半導体素子の２．
５６ｃｍ²の範囲を走査して測定した。また、半導体素
子には定電圧電源より０．５Ｖの定電圧を印加した。電
解質含有培養基としては、市販の大腸菌群検出用寒天培
地（栄研化学社製）に電解質として０．１Ｍとなるよう
塩化ナトリウムを添加したものを用い、２．５６ｃｍ²
あたり１０個程度の大腸菌が存在するように接種し、３
７℃に保った。測定した電流値は演算装置により二次元
のｐＨ分布として表されるが、そのｐＨ変化が周囲と比
較して円状に変化して分布している点の中心のｐＨと、
円の周囲のｐＨ、すなわち変化していない初期の電解質
含有培養基のｐＨとの差（ΔｐＨ）を測定した。

【００１９】走査して測定した範囲においてΔｐＨが
０．０２以上、０．２以下の範囲である点の数を生菌数
の数とした場合、表１に示すように実際に存在する大腸
菌の数とよく一致する結果が得られた。また、測定時間
は通常の培養方法では２４時間程度かかる大腸菌の検出
が上記ΔｐＨの範囲では８時間以内で検出でき、迅速測
定が可能であった。なお、実際の大腸菌の数は、寒天培
地に接種後、３７℃に保って２４時間後の数を用いた。
また、表中の百分率は測定に供した寒天平板に実際に存
在した大腸菌生菌数に対する本装置で測定された生菌数
の割合を各５回測定し、その結果を平均して、１の位を
四捨五入したものである。従って、例えば本装置の測定
結果が実際の生菌数と完全に一致した場合は１００％、
また半数しか測定されない場合は５０％である。

【００２０】

【表１】

【００２１】（実施例２）〔半導体素子の厚さ〕図１の装置で、半導体素子の厚さを種々変えて、実施例
１と同様の条件で大腸菌（E. coli IFO 03301）の検出
を行った。半導体素子の厚さの調整は、厚さ６００μｍ
の市販シリコンを研磨装置で削り調整した。なお、半導
体素子表面の粗さは触針式粗さ計（デクタック）で測定
し、２００ｎｍを越えない程度とした。継時的に測定を
行った結果を表２に示すが、半導体素子の厚さが２００
μｍ以下で大腸菌が８時間以内に検出でき、迅速測定が
可能であった。

【００２２】

【表２】

【００２３】（実施例３）〔半導体素子の表面粗さ〕図１の装置で、使用する半導体素子の表面の粗さを種々
変えて、実施例１と同様の条件で測定した。表面の粗さ
を変える方法は、１Ｎ程度の水酸化カリウム溶液にシリ
コン基板を浸漬し表面を溶解するいわゆるエッチングに
よる方法と、サンドペーパーで研磨する方法、及び機械
研磨で鏡面加工する方法を組み合わせて用いた。最終的
には半導体素子の厚さを２００μｍとし、測定した。表
３に大腸菌の検出に要する時間とその時のΔｐＨの値を
示したが、粗さが２００ｎｍ以下の場合には８時間以内
で大腸菌が検出できた。粗さが２００ｎｍを超える場合
には、検出可能なΔｐＨの下限値が大きく、大腸菌の産
生する物質によるｐＨ変化が大きくないと検出ができな
かった。

【００２４】

【表３】

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、生菌数を迅速に測定す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】光走査型半導体ｐＨセンサを用いた生菌数迅速
測定装置の概略図。

【符号の説明】

１…絶縁性薄膜、２…半導体素子、３…電解質含有培養
基、４…電極、５…定電圧電源、６…電流測定装置、７
…光源、８…光走査装置、９…演算装置、１０…ディス
プレイ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】空間分解能を有するｐＨセンサを使用
し、生菌の産生する物質に対応するｐＨの変化量を測定
して生菌数を検出する生菌数測定方法において、前記ｐ
Ｈの変化量が０．０２以上、０．２以下であることを特
徴とする生菌数の迅速測定方法。
【請求項２】絶縁性薄膜で皮膜された半導体素子、電
極、該電極と半導体素子の間に定電圧を印加する定電圧
電源、前記電極と半導体素子の間に流れる電流を測定す
る電流測定装置、光源、及び該光源からの光線を絶縁性
薄膜で皮膜されていない側の半導体素子表面上に走査す
る光走査装置を含む空間分解能を有する光走査型ｐＨセ
ンサと、前記光走査型ｐＨセンサの半導体素子の絶縁性
薄膜上に密着設置した電解質含有培養基を含み、前記電
解質含有培養基に前記電極を装着したことを特徴とする
生菌数迅速測定装置。
【請求項３】前記半導体素子は厚さが２００μｍ以下
で、且つ表面の粗さが２００ｎｍ以下の平滑な半導体で
あることを特徴とする請求項２記載の生菌数の迅速測定
方法。