JPH088874B2 - フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルを測定するためのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体並びに検査方法 - Google Patents
フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルを測定するためのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体並びに検査方法Info
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- JPH088874B2 JPH088874B2 JP2509255A JP50925590A JPH088874B2 JP H088874 B2 JPH088874 B2 JP H088874B2 JP 2509255 A JP2509255 A JP 2509255A JP 50925590 A JP50925590 A JP 50925590A JP H088874 B2 JPH088874 B2 JP H088874B2
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、フェニトロチオン（0,0−ジメチル０−
（３−メチル−４−ニトロフェニル）ホスホロチオエー
ト、CAS 122−14−５）及び近縁の有機リン系殺虫剤、
例えばクロルピリフォス（chlorpyrifos）−メチル、ク
ロルピリフォス−エチル及びピリミホス（pirimiphos）
−メチルと結合するポリクローナル抗体、並びに該殺虫
剤と結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞系の両方を製造する手段、特にこれらの抗体を
用いて水、食品及び農産物（特に穀物）の中に存在する
フェニトロチオン及びこれら有機リン系殺虫剤を検出す
る方法に関する。有機リン系殺虫剤は、虫の神経筋接合
部におけるコリンエステラーゼの阻害によって機能する
タイプに大分類される殺虫剤である。このような阻害は
麻痺、窒息を生起させ、ついには死に至らしめる。
（３−メチル−４−ニトロフェニル）ホスホロチオエー
ト、CAS 122−14−５）及び近縁の有機リン系殺虫剤、
例えばクロルピリフォス（chlorpyrifos）−メチル、ク
ロルピリフォス−エチル及びピリミホス（pirimiphos）
−メチルと結合するポリクローナル抗体、並びに該殺虫
剤と結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞系の両方を製造する手段、特にこれらの抗体を
用いて水、食品及び農産物（特に穀物）の中に存在する
フェニトロチオン及びこれら有機リン系殺虫剤を検出す
る方法に関する。有機リン系殺虫剤は、虫の神経筋接合
部におけるコリンエステラーゼの阻害によって機能する
タイプに大分類される殺虫剤である。このような阻害は
麻痺、窒息を生起させ、ついには死に至らしめる。
本明細書中の「近縁の有機リン酸エステル（closely
related organophosphates）」とは、0,0−ジメチル０
−（Ｘ）ホスホロチオエート又は0,0−ジエチル０−
（Ｘ）ホスホロチオエート［式中、Ｘは芳香族基もしく
は複素環基、又は置換芳香族基もしくは置換複素環基で
ある］タイプの化合物を意味する。その具体例として
は、３−メチル−４−ニトロフェニル、3,5,6−トリク
ロロ−２−ピリジル又は２−ジエチルアミノ−６−メチ
ルピリミジン−４−イルが挙げられる。
related organophosphates）」とは、0,0−ジメチル０
−（Ｘ）ホスホロチオエート又は0,0−ジエチル０−
（Ｘ）ホスホロチオエート［式中、Ｘは芳香族基もしく
は複素環基、又は置換芳香族基もしくは置換複素環基で
ある］タイプの化合物を意味する。その具体例として
は、３−メチル−４−ニトロフェニル、3,5,6−トリク
ロロ−２−ピリジル又は２−ジエチルアミノ−６−メチ
ルピリミジン−４−イルが挙げられる。
フェニトロチオンは、穀物、果物、野菜、綿、コーヒ
ー及び茶、森林の樹木並びに家庭での蚊退治に広く使用
されている広範スペクトル性の殺虫剤である。異常発生
したバッタの群には、広域にわたるフェニトロチオンの
噴霧が使用されてきた。フェニトロチオンは他の多くの
有利リン系殺虫剤に比べて哺乳動物に対する急性毒性が
低いが、これらの化合物にはその各々について、大部分
の食糧品中における残留値の上限が法的に決められてい
る。例えば、Codex Alimentarius Commission of the F
ood and Agriculture Organisation及び世界保険機構に
よって決められているもの、又はFederal Food,Drug an
d Cosmetic Actの支配下のUS Environmental Protectio
n Agencyにより決められているものがある。フェニトロ
チオン及び近縁の有機リン系殺虫剤を検出又は測定する
ための従来の方法は精確ではあるが、化合物を現場で分
析する場合、又は最少限の設備しかない小さな研究所で
一定時間内の処理数（スループット）の高い分析を行う
場合には適していない。気体−液体クロマトグラフィー
による分析（Sissons,D.J.,J.Chromatography47（197
0）328;Ambrus,A.,J.Assoc.Off.Anal.Chem.64（1981）7
33;Bottomley,D.及びBaker,P.G.Analyst 109（1984）8
5）及び高速液体クロマトグラフィー（Funch,F.H.Z.Leb
ensm.Unters.Forsch.173（1981）95）は、設備費が高
く、熟練したオペレータもしくはアナリストを必要と
し、試料のスループットが低く且つ試料の分析に比較的
長い時間がかかるという欠点を有する。大部分のクロマ
トグラフィー分析には妨害成分の除去（試料の「クリー
ンアップ（clean−up）」）が必要である。薄層クロマ
トグラフィー（Bhaskar,S.U.Talanta 29（1982）233;Pi
s′mennaya,M.V.Khim.Sel′sk Khoz,18（1980）54）は
高い設備費は必要としないが半定量的でしかなく、存在
する有機リン系殺虫剤を近縁の化合物から識別するのが
難しいことがある。コリンエステラーゼ阻害に基づく有
機リン酸エステルの酵素アッセイは短時間で比較的簡単
に実施できるが、個々の有機リン酸エステルに対して特
異的ではない。場合によっては、感度が不十分なことも
ある（Dayananda,S.及びKumar,N.V.N.,J.Food Sci.Tech
nol.22（1985）107;Goodson,L.H.及びGoodman,A.,Unite
d States Patent 4,328,858（1982））。誘導体化（der
ivatization）又は４−ニトロ−３−メチルフェノキシ
ドへのアルカリ加水分解の後にフェニトロチオンを分光
光度計で測定するための現場の検査（field−based tes
ts）（Kovac,I.及びSohler,E.,Fresenius′Z.Anal.Che
m.208（1965）201;Desmarchelier,J.M.,J.Environ.Sci.
Health,B16（1981）419）は、化合物に対して特異的で
ないか、感度に欠けるか、又は毒性もしくは腐食性化学
物質の使用を伴う抽出物クリーンアップを必要とし得
る。
ー及び茶、森林の樹木並びに家庭での蚊退治に広く使用
されている広範スペクトル性の殺虫剤である。異常発生
したバッタの群には、広域にわたるフェニトロチオンの
噴霧が使用されてきた。フェニトロチオンは他の多くの
有利リン系殺虫剤に比べて哺乳動物に対する急性毒性が
低いが、これらの化合物にはその各々について、大部分
の食糧品中における残留値の上限が法的に決められてい
る。例えば、Codex Alimentarius Commission of the F
ood and Agriculture Organisation及び世界保険機構に
よって決められているもの、又はFederal Food,Drug an
d Cosmetic Actの支配下のUS Environmental Protectio
n Agencyにより決められているものがある。フェニトロ
チオン及び近縁の有機リン系殺虫剤を検出又は測定する
ための従来の方法は精確ではあるが、化合物を現場で分
析する場合、又は最少限の設備しかない小さな研究所で
一定時間内の処理数（スループット）の高い分析を行う
場合には適していない。気体−液体クロマトグラフィー
による分析（Sissons,D.J.,J.Chromatography47（197
0）328;Ambrus,A.,J.Assoc.Off.Anal.Chem.64（1981）7
33;Bottomley,D.及びBaker,P.G.Analyst 109（1984）8
5）及び高速液体クロマトグラフィー（Funch,F.H.Z.Leb
ensm.Unters.Forsch.173（1981）95）は、設備費が高
く、熟練したオペレータもしくはアナリストを必要と
し、試料のスループットが低く且つ試料の分析に比較的
長い時間がかかるという欠点を有する。大部分のクロマ
トグラフィー分析には妨害成分の除去（試料の「クリー
ンアップ（clean−up）」）が必要である。薄層クロマ
トグラフィー（Bhaskar,S.U.Talanta 29（1982）233;Pi
s′mennaya,M.V.Khim.Sel′sk Khoz,18（1980）54）は
高い設備費は必要としないが半定量的でしかなく、存在
する有機リン系殺虫剤を近縁の化合物から識別するのが
難しいことがある。コリンエステラーゼ阻害に基づく有
機リン酸エステルの酵素アッセイは短時間で比較的簡単
に実施できるが、個々の有機リン酸エステルに対して特
異的ではない。場合によっては、感度が不十分なことも
ある（Dayananda,S.及びKumar,N.V.N.,J.Food Sci.Tech
nol.22（1985）107;Goodson,L.H.及びGoodman,A.,Unite
d States Patent 4,328,858（1982））。誘導体化（der
ivatization）又は４−ニトロ−３−メチルフェノキシ
ドへのアルカリ加水分解の後にフェニトロチオンを分光
光度計で測定するための現場の検査（field−based tes
ts）（Kovac,I.及びSohler,E.,Fresenius′Z.Anal.Che
m.208（1965）201;Desmarchelier,J.M.,J.Environ.Sci.
Health,B16（1981）419）は、化合物に対して特異的で
ないか、感度に欠けるか、又は毒性もしくは腐食性化学
物質の使用を伴う抽出物クリーンアップを必要とし得
る。
そのため、フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エ
ステルを測定するための簡単で、迅速で且つ信頼できる
手段が必要とされている。ポリクローナル抗体又はモノ
クローナル抗体のいずれかに基づく現在のイムノアッセ
イは、有機リン糸殺虫剤の従来の化学的アッセイ及び機
器によるアッセイの有用な代替手段である。フェニトロ
チオンのような小さい有機分子はそれ自体は免疫原性で
はないが、タンパク質のような適当なキャリヤーに化学
的に結合すると免疫原性になる得る。結合の部位及びキ
ャリヤータンパク質の種類は、当業者が十分には予測で
きないようなメカニズムで、産生される抗体の特異性及
び親和性に影響を及ぼし得る。例えば、長い架橋基（グ
ルタミン及びジアゾ安息香酸）と結合した還元パラチオ
ン（本発明で使用するハプテンと密接に関係する化合
物）を製造しても、パラチオンとの間に有用な反応を起
こす抗血清を産生する結合体は得られなかった（Vallej
o,R.D.,Bogus,E.R.及びMumma,R.O.,J.Agric.Food Chem.
30（1982）572）。
ステルを測定するための簡単で、迅速で且つ信頼できる
手段が必要とされている。ポリクローナル抗体又はモノ
クローナル抗体のいずれかに基づく現在のイムノアッセ
イは、有機リン糸殺虫剤の従来の化学的アッセイ及び機
器によるアッセイの有用な代替手段である。フェニトロ
チオンのような小さい有機分子はそれ自体は免疫原性で
はないが、タンパク質のような適当なキャリヤーに化学
的に結合すると免疫原性になる得る。結合の部位及びキ
ャリヤータンパク質の種類は、当業者が十分には予測で
きないようなメカニズムで、産生される抗体の特異性及
び親和性に影響を及ぼし得る。例えば、長い架橋基（グ
ルタミン及びジアゾ安息香酸）と結合した還元パラチオ
ン（本発明で使用するハプテンと密接に関係する化合
物）を製造しても、パラチオンとの間に有用な反応を起
こす抗血清を産生する結合体は得られなかった（Vallej
o,R.D.,Bogus,E.R.及びMumma,R.O.,J.Agric.Food Chem.
30（1982）572）。
最近になって、特異性の高い均質な抗体を製造するこ
とができるモノクローナル抗体製造技術が開発された。
この種の抗体は通常、動物をタンパク質で免疫し、その
動物から抗体産生細胞を採取し、これらの抗体産生細胞
を骨髄腫細胞株即ち腫瘍細胞株と融合させてハイブリド
ーマを形成し、これらのハイブリドーマを単離し且つモ
ノクローンとして培養することにより製造する。このモ
ノクローナルハイブリドーマはin vitroで培養するか、
又は宿主動物の体内で腫瘍として増殖させ得る。各抗体
産生細胞は１種類の抗体のみを産生するため、ハイブリ
ドーマの各モノクローナル培養物は均質な抗体を産生す
ることになる。これらの抗体はin vitroで増殖したハイ
ブリドーマ培養物の培養培地か又は腫瘍を有する宿主動
物の細胞、腹水もしくは血清から得られる。
とができるモノクローナル抗体製造技術が開発された。
この種の抗体は通常、動物をタンパク質で免疫し、その
動物から抗体産生細胞を採取し、これらの抗体産生細胞
を骨髄腫細胞株即ち腫瘍細胞株と融合させてハイブリド
ーマを形成し、これらのハイブリドーマを単離し且つモ
ノクローンとして培養することにより製造する。このモ
ノクローナルハイブリドーマはin vitroで培養するか、
又は宿主動物の体内で腫瘍として増殖させ得る。各抗体
産生細胞は１種類の抗体のみを産生するため、ハイブリ
ドーマの各モノクローナル培養物は均質な抗体を産生す
ることになる。これらの抗体はin vitroで増殖したハイ
ブリドーマ培養物の培養培地か又は腫瘍を有する宿主動
物の細胞、腹水もしくは血清から得られる。
骨髄腫細胞と抗体産生細胞との融合の結果得られるハ
イブリドーマクローンの総てが、所望の殺虫剤に対して
（又はその種類の分子に特徴的な殺虫剤上の官能基に対
して）特異的というわけではない。なぜなら、ハイブリ
ドーマの多くは、免疫された動物が産生した抗体と他の
外来物質と反応させるからである。問題の抗原に対する
抗体さえもクローン毎に異なる。これは、種々の細胞に
よって産生された抗体が同一分子の種々の抗原決定基と
反応し得るからである。従って、得られた抗体を各クロ
ーンから取り出して問題の殺虫剤（例えばフェニトロチ
オン、クロルピリフォス−メチル、クロルピリフォス−
エチル又はピリミホス−メチル）に対する反応性を検査
し、且つその抗体がその特定有機リン系殺虫剤を認識す
るかを調べることによってその特異性を検査しなければ
ならない。また、特異的イムノアッセイコンフィギュレ
ーション又はフォーマットで機能するのは抗体又は抗血
清の一部にすぎない。
イブリドーマクローンの総てが、所望の殺虫剤に対して
（又はその種類の分子に特徴的な殺虫剤上の官能基に対
して）特異的というわけではない。なぜなら、ハイブリ
ドーマの多くは、免疫された動物が産生した抗体と他の
外来物質と反応させるからである。問題の抗原に対する
抗体さえもクローン毎に異なる。これは、種々の細胞に
よって産生された抗体が同一分子の種々の抗原決定基と
反応し得るからである。従って、得られた抗体を各クロ
ーンから取り出して問題の殺虫剤（例えばフェニトロチ
オン、クロルピリフォス−メチル、クロルピリフォス−
エチル又はピリミホス−メチル）に対する反応性を検査
し、且つその抗体がその特定有機リン系殺虫剤を認識す
るかを調べることによってその特異性を検査しなければ
ならない。また、特異的イムノアッセイコンフィギュレ
ーション又はフォーマットで機能するのは抗体又は抗血
清の一部にすぎない。
本発明は極めて特殊で重要な用途を有する。第１に、
フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルは、数
ケ月間貯蔵するか又は輸出するための穀物及び他の産物
に、その後の加工又は消費に先立って、日常的に散布さ
れる。虫が蔓延すると産物が人間による消費又は販売に
は適さないものとなるため、有機リン系保護剤は均一に
且つ十分な量で分配することが重要である。
フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルは、数
ケ月間貯蔵するか又は輸出するための穀物及び他の産物
に、その後の加工又は消費に先立って、日常的に散布さ
れる。虫が蔓延すると産物が人間による消費又は販売に
は適さないものとなるため、有機リン系保護剤は均一に
且つ十分な量で分配することが重要である。
第２に、人間によって消費される穀物及び他の産物中
のフェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルの量
は、適切な法律によって定められた最大残留レベル（MR
L）を超えないようにすることが重要である。例えば、
フェニトロチオンのMRLはコムギの穀粒中で10ppm、漂白
小麦粉中で1ppm、白パン中で0.2ppmとされている。クロ
ルピリフォス−メチルのMRLはコムギの穀粒中で10ppm、
漂白小麦粉中で2ppm、白パン中で0.5ppmである。
のフェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルの量
は、適切な法律によって定められた最大残留レベル（MR
L）を超えないようにすることが重要である。例えば、
フェニトロチオンのMRLはコムギの穀粒中で10ppm、漂白
小麦粉中で1ppm、白パン中で0.2ppmとされている。クロ
ルピリフォス−メチルのMRLはコムギの穀粒中で10ppm、
漂白小麦粉中で2ppm、白パン中で0.5ppmである。
第３に、フェニトロチオンと近縁の有機リン酸エステ
ルとをクロマトグラフィー法によって特異的に検出する
ための信頼できる方法は既に存在しているが、これらの
方法は農場もしくは市場での検査、小規模なもしくは十
分な設備のない食品、穀物もしくは産物の研究所での使
用、又は水もしくは土の試料の環境汚染あるいは動物及
び魚試料の汚染をモニターするための現場での使用には
適していない。
ルとをクロマトグラフィー法によって特異的に検出する
ための信頼できる方法は既に存在しているが、これらの
方法は農場もしくは市場での検査、小規模なもしくは十
分な設備のない食品、穀物もしくは産物の研究所での使
用、又は水もしくは土の試料の環境汚染あるいは動物及
び魚試料の汚染をモニターするための現場での使用には
適していない。
従って、クロマトグラフィーの設備又は専門家を必要
とせずに簡単な抗体ベースの検査によってフェニトロチ
オン及び近縁の有機リン酸エステルを検出するのに本発
明を適用すれば、当業界特に食品及び環境分析分野に実
質的な改善がもたらされる。
とせずに簡単な抗体ベースの検査によってフェニトロチ
オン及び近縁の有機リン酸エステルを検出するのに本発
明を適用すれば、当業界特に食品及び環境分析分野に実
質的な改善がもたらされる。
先行技術は、殺虫剤を含む有機リン系コリンエステラ
ーゼ阻害剤を検出又は測定する免疫化学的方法の使用に
関する科学文献から明らかである。その具体例として
は、マラチオンに対するポリクローナル抗血清（Haas,
J.H.及びGuardia,E.J.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.129（19
68）546;Centeno,E.R.,Johnson,W.J.及びSehon,A.H.,In
t.Arch.Allergy 37（1970））、パラチオンに対するポ
リクローナル抗血清（Ercegovich,C.D.,Vallejo,R.P.,G
ettig,R.R.,Woods,L.,Bogus,E.R.及びMumma,R.O.,J.Agr
ic、Food Chem.29（1981）559;Ngeh−Ngwainbi,J.,Fole
y,P.H.,Kuan,S.S.及びGuilbault,G.J.Amer.Chem.Soc.10
8（1986）5444）及びパラオキソンに対するポリクロー
ナル抗血清（Hunter,K.W.及びLenz,D.E.,Life Sci.30
（1982）355;Lober,M.,Kranz,S.及びHerrmann,I.Acta.B
iol.Med.Ger.41（1982）487;Heldman,E.,Balan,A.,Horo
witz,O.,Ben−Zion,S.及びTorten,M.FEBS Lett.180（19
85）243）、並びにパラオキソンに対するモノクローナ
ル抗体（Brimfield,A.A.,Lenz,D.E.,Graham,C.及びHumt
er,K.W.J.Agric.Food Chem.33（1985）1237）及びソマ
ンに対するモノクローナル抗体（Hunter,K.W.,Lenz,D.
E.,Brimfield,A.A.及びNaylor,J.A.,FEBS Lett.149（19
82）147;Buenafe,A.C.及びRittenburg,M.B.Mol.Immuno
l.24,（1987）401）が挙げられる。しかしながら、これ
らの抗体と、フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エ
ステル、例えばクロルピリフォス−メチル、クロルピリ
フォス−エチル及びピリミホス−メチルとの交差反応は
通常は評価されなかったし、またこれらの抗体は他の有
機リン酸エステルに対する抗体として製造されたもので
あるためフェニトロチオン及び前述のような近縁の有機
リン酸エステルに対して特異的ではない。ジエチルチオ
ホスフェートエステルを含む有機リン酸エステル殺虫剤
を特異的に検出するイムノアッセイも開発されたが、こ
れらの方法ではフェニトロチンオン及びクロルピリフォ
ス−メチルは検出されなかった（Suedi,J.及びHeesche
n,W.Kiel.Milchwirtsch.Forschungsber 40（1988）17
9）。フェニトロチオンの活性代謝物質であるフェニト
ロキソンに対する抗体も記述されているが（Padki,M.M.
及びBhide,M.B.,Indian J.Med.Res.79（1984）137）、
これらの抗体は有機リン酸エステルの検出には使用され
たことがない。
ーゼ阻害剤を検出又は測定する免疫化学的方法の使用に
関する科学文献から明らかである。その具体例として
は、マラチオンに対するポリクローナル抗血清（Haas,
J.H.及びGuardia,E.J.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.129（19
68）546;Centeno,E.R.,Johnson,W.J.及びSehon,A.H.,In
t.Arch.Allergy 37（1970））、パラチオンに対するポ
リクローナル抗血清（Ercegovich,C.D.,Vallejo,R.P.,G
ettig,R.R.,Woods,L.,Bogus,E.R.及びMumma,R.O.,J.Agr
ic、Food Chem.29（1981）559;Ngeh−Ngwainbi,J.,Fole
y,P.H.,Kuan,S.S.及びGuilbault,G.J.Amer.Chem.Soc.10
8（1986）5444）及びパラオキソンに対するポリクロー
ナル抗血清（Hunter,K.W.及びLenz,D.E.,Life Sci.30
（1982）355;Lober,M.,Kranz,S.及びHerrmann,I.Acta.B
iol.Med.Ger.41（1982）487;Heldman,E.,Balan,A.,Horo
witz,O.,Ben−Zion,S.及びTorten,M.FEBS Lett.180（19
85）243）、並びにパラオキソンに対するモノクローナ
ル抗体（Brimfield,A.A.,Lenz,D.E.,Graham,C.及びHumt
er,K.W.J.Agric.Food Chem.33（1985）1237）及びソマ
ンに対するモノクローナル抗体（Hunter,K.W.,Lenz,D.
E.,Brimfield,A.A.及びNaylor,J.A.,FEBS Lett.149（19
82）147;Buenafe,A.C.及びRittenburg,M.B.Mol.Immuno
l.24,（1987）401）が挙げられる。しかしながら、これ
らの抗体と、フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エ
ステル、例えばクロルピリフォス−メチル、クロルピリ
フォス−エチル及びピリミホス−メチルとの交差反応は
通常は評価されなかったし、またこれらの抗体は他の有
機リン酸エステルに対する抗体として製造されたもので
あるためフェニトロチオン及び前述のような近縁の有機
リン酸エステルに対して特異的ではない。ジエチルチオ
ホスフェートエステルを含む有機リン酸エステル殺虫剤
を特異的に検出するイムノアッセイも開発されたが、こ
れらの方法ではフェニトロチンオン及びクロルピリフォ
ス−メチルは検出されなかった（Suedi,J.及びHeesche
n,W.Kiel.Milchwirtsch.Forschungsber 40（1988）17
9）。フェニトロチオンの活性代謝物質であるフェニト
ロキソンに対する抗体も記述されているが（Padki,M.M.
及びBhide,M.B.,Indian J.Med.Res.79（1984）137）、
これらの抗体は有機リン酸エステルの検出には使用され
たことがない。
そこで本発明は、第１の目的として、0,0−ジメチル
０−（３−メチル−４−ニトロフェニル）ホスホロチオ
エート、0,0−ジメチル０−（３−メチル−４−アミノ
フェニル）ホスホロチオエート、0,0−ジメチル０−
（３−メチル−４−（メチルチオ）フェニル）ホスホロ
チオエート、0,0−ジメチル０−（４−アミノスルホニ
ル）フェニルホスホロチオエート、0,0−ジメチル０−
（0,0,0′,0′−テトラメチル0,0−チオジ−ｐ−フェニ
レン−ビス（ホスホロチオエート））ホスホロチオエー
ト、0,0−ジメチル０−（3,5,6−トリクロロ−２−ピリ
ジル）ホスホロチエート、0,0−ジメチル０−（２−ジ
エチルアミノ−６−メチルピリミジン−４−イル）ホス
ホロチオエート及び0,0−ジエチル０−（２−ジエチル
アミノ−６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチ
オエートのうちの少なくとも１種類の化合物に結合する
ことができる抗体又はそのフラグメントを提供する。
０−（３−メチル−４−ニトロフェニル）ホスホロチオ
エート、0,0−ジメチル０−（３−メチル−４−アミノ
フェニル）ホスホロチオエート、0,0−ジメチル０−
（３−メチル−４−（メチルチオ）フェニル）ホスホロ
チオエート、0,0−ジメチル０−（４−アミノスルホニ
ル）フェニルホスホロチオエート、0,0−ジメチル０−
（0,0,0′,0′−テトラメチル0,0−チオジ−ｐ−フェニ
レン−ビス（ホスホロチオエート））ホスホロチオエー
ト、0,0−ジメチル０−（3,5,6−トリクロロ−２−ピリ
ジル）ホスホロチエート、0,0−ジメチル０−（２−ジ
エチルアミノ−６−メチルピリミジン−４−イル）ホス
ホロチオエート及び0,0−ジエチル０−（２−ジエチル
アミノ−６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチ
オエートのうちの少なくとも１種類の化合物に結合する
ことができる抗体又はそのフラグメントを提供する。
本発明の抗体及びそのフラグメントの一部は、（YO）
2PS−OXタイプの少なくとも１種類の別の化合物とも結
合することができる。前記式中、Ｘは芳香族基もしくは
複素環基、又は置換芳香族基若しくは置換複素環基であ
り、Ｙは低級アルキルである。
2PS−OXタイプの少なくとも１種類の別の化合物とも結
合することができる。前記式中、Ｘは芳香族基もしくは
複素環基、又は置換芳香族基若しくは置換複素環基であ
り、Ｙは低級アルキルである。
本発明の抗体又はそのフラグメントはポリクローナル
であってもよいが、より好ましくはモノクローナル抗体
及びそのフラグメントである。本発明は、このようなモ
ノクローナル抗体及びそのフラグメントを産生できるハ
イブリドーマ細胞系にも関する。
であってもよいが、より好ましくはモノクローナル抗体
及びそのフラグメントである。本発明は、このようなモ
ノクローナル抗体及びそのフラグメントを産生できるハ
イブリドーマ細胞系にも関する。
本発明は、適当なスペーサーアーム化合物である保護
された酸もしくはエステルによりリン原子を介して誘導
体化することによって、有機リン系殺虫剤を化学的に活
性化させる新規の包括的手段も提供する。基スペーサー
はβ−アラニンが好ましい。このスペーサー上の酸反応
基は、非塩基性条件で除去できる任意の反応基で保護し
得る。適当な保護基としては、トリチル（トリフェニル
メチル）、ｔ−ペンチル、ｔ−ヘキシル及びトリメチル
シリルエタノールが挙げられるが、特に好ましいのはｔ
−ブチルである。有機リン酸エステル結合誘導体はその
後、穏やかで簡単な加水分解により、キャリヤー高分子
に対して化学的反応性を示すようにし得る。
された酸もしくはエステルによりリン原子を介して誘導
体化することによって、有機リン系殺虫剤を化学的に活
性化させる新規の包括的手段も提供する。基スペーサー
はβ−アラニンが好ましい。このスペーサー上の酸反応
基は、非塩基性条件で除去できる任意の反応基で保護し
得る。適当な保護基としては、トリチル（トリフェニル
メチル）、ｔ−ペンチル、ｔ−ヘキシル及びトリメチル
シリルエタノールが挙げられるが、特に好ましいのはｔ
−ブチルである。有機リン酸エステル結合誘導体はその
後、穏やかで簡単な加水分解により、キャリヤー高分子
に対して化学的反応性を示すようにし得る。
そこで、本発明は第２の目的として、非塩基性条件で
脱保護できる保護されたスペーサーと結合した０−モノ
アルキル−０−（Ｘ）ホスホロチオエートの製造方法を
提供する。この方法は、塩化チオホスホリルのアルコキ
シ誘導体を保護された酸もしくはエステルスペーサーと
反応させ、次いで（YO）2PS−OXタイプの化合物のリン
酸エステル加水分解生成物と反応させることからなる。
脱保護できる保護されたスペーサーと結合した０−モノ
アルキル−０−（Ｘ）ホスホロチオエートの製造方法を
提供する。この方法は、塩化チオホスホリルのアルコキ
シ誘導体を保護された酸もしくはエステルスペーサーと
反応させ、次いで（YO）2PS−OXタイプの化合物のリン
酸エステル加水分解生成物と反応させることからなる。
本発明は更に別の目的として、特に産物又は食品中の
フェニトロチオン又は近縁の有機リン酸エステルを定量
する方法も提供する。この方法は、フェニトロチオン又
は近縁の殺虫剤を含んでいると思われる試料又は試料抽
出物を適当な支持体に塗布し、この支持体に、フェニト
ロチオンもしくは近縁の有機リン酸エステルに対して特
異的な適当に標識した抗体の溶液か、又は適当に標識し
たフェニトロチオンもしくはフェニトロチオン類似体も
しくは近縁の0,0−ジアルキル−１−ホスホロチオエー
ト（ハプテン）の溶液を塗布し、任意に洗浄した後で、
前記固相支持体に結合した適当に標識した抗体又はハプ
テンを適当なシグナル増幅ステップ又は他の検出方法に
かけることからなる。
フェニトロチオン又は近縁の有機リン酸エステルを定量
する方法も提供する。この方法は、フェニトロチオン又
は近縁の殺虫剤を含んでいると思われる試料又は試料抽
出物を適当な支持体に塗布し、この支持体に、フェニト
ロチオンもしくは近縁の有機リン酸エステルに対して特
異的な適当に標識した抗体の溶液か、又は適当に標識し
たフェニトロチオンもしくはフェニトロチオン類似体も
しくは近縁の0,0−ジアルキル−１−ホスホロチオエー
ト（ハプテン）の溶液を塗布し、任意に洗浄した後で、
前記固相支持体に結合した適当に標識した抗体又はハプ
テンを適当なシグナル増幅ステップ又は他の検出方法に
かけることからなる。
適当なシクグナル増幅ステップは、適当な酵素を抗体
に結合し、次いで抗原と酵素で標識された抗体との複合
体に基質を加えるエンザイムイムノアッセイステップで
あってよい。あるいは、ラジオイムノアッセイ、蛍光イ
ムノアッセイ、化学ルミネセンス、凝集又は付着、電気
化学的もしくは光学的方法又はこれらを組合わせたもの
も、適当な検出ステップとして使用し得る。
に結合し、次いで抗原と酵素で標識された抗体との複合
体に基質を加えるエンザイムイムノアッセイステップで
あってよい。あるいは、ラジオイムノアッセイ、蛍光イ
ムノアッセイ、化学ルミネセンス、凝集又は付着、電気
化学的もしくは光学的方法又はこれらを組合わせたもの
も、適当な検出ステップとして使用し得る。
適当な固相支持体は種々の形態を有し得、その具体例
としては、管、ウェルプレート、マイクロプレート、細
長いスティック、薄いストリップ又はビーズが挙げられ
る。このような固相の表面を形成し得る材料としてはポ
リスチレンもしくは他の適当なプラスチック、ニトロセ
ルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド、ガ
ラス、シリカ又は他の適当な材料が挙げられる。これら
の材料は、フェニトロチオンもしくは他の0,0−ジアル
キル−０−ホスホロチオエートに特異的な、又はフェニ
トロチオンもしくは近縁の有機リン酸エステルで置換し
た適当なキャリヤー高分子に特異的なポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体で予めコーティングする。
としては、管、ウェルプレート、マイクロプレート、細
長いスティック、薄いストリップ又はビーズが挙げられ
る。このような固相の表面を形成し得る材料としてはポ
リスチレンもしくは他の適当なプラスチック、ニトロセ
ルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド、ガ
ラス、シリカ又は他の適当な材料が挙げられる。これら
の材料は、フェニトロチオンもしくは他の0,0−ジアル
キル−０−ホスホロチオエートに特異的な、又はフェニ
トロチオンもしくは近縁の有機リン酸エステルで置換し
た適当なキャリヤー高分子に特異的なポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体で予めコーティングする。
本発明のハイブリドーマ細胞系は、抗体産生細胞とマ
ウス種由来の骨髄腫細胞との融合によって製造するのが
好ましい。抗体産生細胞は脾臓細胞が好ましい。骨髄腫
細胞としては任意の適当な細胞系を使用し得るが、望ま
しくは、特性が十分に解明されている細胞系であって一
般的に使用されている細胞系を使用する。
ウス種由来の骨髄腫細胞との融合によって製造するのが
好ましい。抗体産生細胞は脾臓細胞が好ましい。骨髄腫
細胞としては任意の適当な細胞系を使用し得るが、望ま
しくは、特性が十分に解明されている細胞系であって一
般的に使用されている細胞系を使用する。
本発明の検査方法は、溶媒抽出による試料の「クリー
ンアップ」を必要とせず、相移動（phase transfer）も
しくは吸着クロマトグラフィー（殺虫剤のクロマトグラ
フィー分析の試料の調製に使用される一般的方法）が不
要である。この方法は、個々の試料を短時間（15分以
下）で分析するか又は数ダースの試料を同時に短時間で
分析するのに使用でき、高価な自動装置を必要とせず、
小さい研究所又は現場もしくは市場におけるこれらのア
ッセイの実施を可能にする。更に、本発明は生の穀物も
しくは産物、又は調理もしくは加工した食品に適してお
り、フェニトロチオン又は近縁の有機リン酸エステルを
単一ステップで抽出し得る。本発明の方法は簡単で、低
コストで、信頼性があり、フェニトロチオン又は近縁の
有機リン酸エステルを質的又は量的に測定することがで
きる。また、検査の感度は、抗体もしくは抗原の濃度、
ハプテン置換率又は溶媒対固体の抽出比を変えることに
よって容易に変え得る。
ンアップ」を必要とせず、相移動（phase transfer）も
しくは吸着クロマトグラフィー（殺虫剤のクロマトグラ
フィー分析の試料の調製に使用される一般的方法）が不
要である。この方法は、個々の試料を短時間（15分以
下）で分析するか又は数ダースの試料を同時に短時間で
分析するのに使用でき、高価な自動装置を必要とせず、
小さい研究所又は現場もしくは市場におけるこれらのア
ッセイの実施を可能にする。更に、本発明は生の穀物も
しくは産物、又は調理もしくは加工した食品に適してお
り、フェニトロチオン又は近縁の有機リン酸エステルを
単一ステップで抽出し得る。本発明の方法は簡単で、低
コストで、信頼性があり、フェニトロチオン又は近縁の
有機リン酸エステルを質的又は量的に測定することがで
きる。また、検査の感度は、抗体もしくは抗原の濃度、
ハプテン置換率又は溶媒対固体の抽出比を変えることに
よって容易に変え得る。
ここで、本発明の免疫原、ポリクロール抗血清、細胞
系及びモノクローナル抗体の製造と、食品及び穀物のよ
うな農産物中のフェニトロチオン及び近縁の有機リン酸
エステルを測定するためのこれら抗体の使用とに関する
実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
系及びモノクローナル抗体の製造と、食品及び穀物のよ
うな農産物中のフェニトロチオン及び近縁の有機リン酸
エステルを測定するためのこれら抗体の使用とに関する
実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
免疫原結合体の製造 0,0−ジメチル−０−（３−メチル−４−アミノフェ
ニル）ホスホロチオエート（Ｉ）を、希塩酸中、亜硝酸
ナトリウムで０℃で処理し且つニワトリ卵オボアルブミ
ンもしくはKLH（keyhole limpet heamocyanin）と反応
させることにより、ジアゾニウム塩に変換した。あるい
は、（Ｉ）を塩化メチルアジポイルで処理し、メチルエ
ステルを加水分解し、得られた酸をジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（DCC）を用いてＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルに変換し、次いでニワトリ卵オボアルブ
ミン又はニワトリ血清IgGと反応させた。免疫原を製造
するためのより一般的な方法では、塩化チオホスホリル
をメタノール／トリクロロメタン中で還流させ、次いで
生成物をアルカリ性条件下でβ−アラニンｔ−ブチルエ
ステルと反応させて二官能性物質（IIa）を得、これを
アセトニトリル中で３−メチル−４−ニトロフェノール
（Ａ）又は3,5,6−トリクロロ−２−ピリジノール
（Ｂ）もしくは２−ジエチルアミノ−４−ヒドロキシ−
６−メチルピリミジン（ｃ）と反応させて、（IIA）又
は類似の化合物（IIB）もしくは（IIC）を生成した。
ニル）ホスホロチオエート（Ｉ）を、希塩酸中、亜硝酸
ナトリウムで０℃で処理し且つニワトリ卵オボアルブミ
ンもしくはKLH（keyhole limpet heamocyanin）と反応
させることにより、ジアゾニウム塩に変換した。あるい
は、（Ｉ）を塩化メチルアジポイルで処理し、メチルエ
ステルを加水分解し、得られた酸をジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（DCC）を用いてＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルに変換し、次いでニワトリ卵オボアルブ
ミン又はニワトリ血清IgGと反応させた。免疫原を製造
するためのより一般的な方法では、塩化チオホスホリル
をメタノール／トリクロロメタン中で還流させ、次いで
生成物をアルカリ性条件下でβ−アラニンｔ−ブチルエ
ステルと反応させて二官能性物質（IIa）を得、これを
アセトニトリル中で３−メチル−４−ニトロフェノール
（Ａ）又は3,5,6−トリクロロ−２−ピリジノール
（Ｂ）もしくは２−ジエチルアミノ−４−ヒドロキシ−
６−メチルピリミジン（ｃ）と反応させて、（IIA）又
は類似の化合物（IIB）もしくは（IIC）を生成した。
塩化チオホスホリルをエタノール／トリクロロメタン
中で還流させ、次いで生成物を前述のようにβ−アラニ
ンｔ−ブチルエステルと反応させて（IIb）を得、これ
を例えば3,5,6−トリクロロ−２−ピリジノール（Ｂ）
と反応させることにより（IID）を生成してもよい。
中で還流させ、次いで生成物を前述のようにβ−アラニ
ンｔ−ブチルエステルと反応させて（IIb）を得、これ
を例えば3,5,6−トリクロロ−２−ピリジノール（Ｂ）
と反応させることにより（IID）を生成してもよい。
次いで、ｔ−ブチルエステル（IIA−Ｄ）を加水分解
し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）／塩化メ
チレン中Ｎ−ビドロキシスクシンイミドと反応させてII
IA−Ｄを生成する。これらの化合物（IIIA−Ｄ）を、ニ
ワトリIgG、ニワトリ卵オボアルブミン及びKLHのような
種々のキャリヤータンパク質と反応させて免疫原を得
た。結合度（ハプテン対キャリヤーのモル比）は各結合
体で２〜50であり、反応体のモル比又は反応条件を変え
ることによって変えることができた。
し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）／塩化メ
チレン中Ｎ−ビドロキシスクシンイミドと反応させてII
IA−Ｄを生成する。これらの化合物（IIIA−Ｄ）を、ニ
ワトリIgG、ニワトリ卵オボアルブミン及びKLHのような
種々のキャリヤータンパク質と反応させて免疫原を得
た。結合度（ハプテン対キャリヤーのモル比）は各結合
体で２〜50であり、反応体のモル比又は反応条件を変え
ることによって変えることができた。
有機リン酸エステル殺虫剤パロキソンに対する抗体を
製造するために、キャリヤータンパク質と結合するため
の有機リン酸エステルリンとβ−アラミン誘導体との反
応によって有機リン酸エステル系殺虫剤を誘導体化する
ことは、Heldman,E.Balan,A.Horowitz,D.Ben−Zion,S.
及びTorten,M.,FEBS Letters,180（1985）,243−247に
記述されている。しかしながら、これらの研究者は特定
の有機リン酸エステル系殺虫剤を１つだけ誘導体化した
にすぎず、また０−（４−ニトロフェニル）−０−メチ
ルホスホロクロリデート上での求核置換反応にβ−アラ
ニンのトリメチルシリルエステルを使用している。この
種の誘導体は湿気に不安定であり、また一般的な方法と
しては使用できないため各有機リン酸エステル毎に新た
な合成を必要としている。二官能性物質（II）を形成す
れば、より簡単でより有用な結合方法が得られる。なぜ
なら、この二官能性物質は、どの0,0−ジアルキル−０
−ホスホロチオエートにも使用し得、得られる誘導体は
高分子との結合反応の前に長期間貯蔵できるからであ
る。
製造するために、キャリヤータンパク質と結合するため
の有機リン酸エステルリンとβ−アラミン誘導体との反
応によって有機リン酸エステル系殺虫剤を誘導体化する
ことは、Heldman,E.Balan,A.Horowitz,D.Ben−Zion,S.
及びTorten,M.,FEBS Letters,180（1985）,243−247に
記述されている。しかしながら、これらの研究者は特定
の有機リン酸エステル系殺虫剤を１つだけ誘導体化した
にすぎず、また０−（４−ニトロフェニル）−０−メチ
ルホスホロクロリデート上での求核置換反応にβ−アラ
ニンのトリメチルシリルエステルを使用している。この
種の誘導体は湿気に不安定であり、また一般的な方法と
しては使用できないため各有機リン酸エステル毎に新た
な合成を必要としている。二官能性物質（II）を形成す
れば、より簡単でより有用な結合方法が得られる。なぜ
なら、この二官能性物質は、どの0,0−ジアルキル−０
−ホスホロチオエートにも使用し得、得られる誘導体は
高分子との結合反応の前に長期間貯蔵できるからであ
る。
当業者には明らからように、他の結合方法、二官能性
物質及びキャリヤータンパク質を用いても、フェニトロ
チオン及び近縁の有機リン酸エステルと反応する抗体を
産生する免疫原を形成し得る。
物質及びキャリヤータンパク質を用いても、フェニトロ
チオン及び近縁の有機リン酸エステルと反応する抗体を
産生する免疫原を形成し得る。
ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体の産生 個々のウサギ（ニュージーランドホワイト）を免疫原
結合体の１つで免疫した。最初に50％フロイント完全ア
ジュバント中（1000μｇの結合体（半分を皮下注射し、
半分を筋内注射した））で免疫し、その２週間及び４週
間後、並びにその後１ケ月の間隔で、フロイント不完全
アジュバント中ウサギ当たり500μｇの結合体で免疫し
た。プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーを
用いて血清から抗体を回収した。
結合体の１つで免疫した。最初に50％フロイント完全ア
ジュバント中（1000μｇの結合体（半分を皮下注射し、
半分を筋内注射した））で免疫し、その２週間及び４週
間後、並びにその後１ケ月の間隔で、フロイント不完全
アジュバント中ウサギ当たり500μｇの結合体で免疫し
た。プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーを
用いて血清から抗体を回収した。
モノクローナル抗体を製造すべく、マウス（Balb/c）
に免疫原結合体の１つを注射した。最初に50％フロイン
ト完全アジュバント中（400μｇの結合体）で免疫し、
２週間及び４週間後に、フロイント不完全アジュバント
中マウス当たり100μｇの結合体を注射した。投与量を
分割して、皮下注射と筋内注射に半分ずつ使用した。４
〜８週間後、マウスに腹腔内ブースター注射（900μ
ｇ）し、融合を行うべく４日後に脾臓を摘出した。ポリ
エチレングリコールを用いて、脾臓細胞を適当なマウス
骨髄腫細胞系と融合させた（Sp 2/0,Galfre,G.Howe,S.
C.,Milstein,D.,Butcher,G.W.及びHoward,J.C.,Nature
266（1977）550）。この融合のプロトコル及び培養技術
の詳細は、別の文献に記述されている（Shulman,M.,Wil
de,C.D.及びKohler,G.,Nature 276（1978）269）。融合
した細胞（ハイブリドーマ）を希釈によって分離し、限
界希釈によって抗体分泌クローンをサブクローン化し
た。或るサブクローンについては、ハイブリドーマをマ
ウス体内で腹水腫瘍として10日間増殖させた。
に免疫原結合体の１つを注射した。最初に50％フロイン
ト完全アジュバント中（400μｇの結合体）で免疫し、
２週間及び４週間後に、フロイント不完全アジュバント
中マウス当たり100μｇの結合体を注射した。投与量を
分割して、皮下注射と筋内注射に半分ずつ使用した。４
〜８週間後、マウスに腹腔内ブースター注射（900μ
ｇ）し、融合を行うべく４日後に脾臓を摘出した。ポリ
エチレングリコールを用いて、脾臓細胞を適当なマウス
骨髄腫細胞系と融合させた（Sp 2/0,Galfre,G.Howe,S.
C.,Milstein,D.,Butcher,G.W.及びHoward,J.C.,Nature
266（1977）550）。この融合のプロトコル及び培養技術
の詳細は、別の文献に記述されている（Shulman,M.,Wil
de,C.D.及びKohler,G.,Nature 276（1978）269）。融合
した細胞（ハイブリドーマ）を希釈によって分離し、限
界希釈によって抗体分泌クローンをサブクローン化し
た。或るサブクローンについては、ハイブリドーマをマ
ウス体内で腹水腫瘍として10日間増殖させた。
酵素で標識したフェニトロチオンの製造 還元フェニトロチオン（0,0−ジメチル−０−（３−
メチル−４−アミノフェニル）ホスホロチオエート）
（Ｉ）を、幾つかの手法で、Gershoni,J.M.,Bayer,F.B.
及びWilchek,M.,Anal.Biochem.146,pp59（1985）に従っ
て製造したマーカー酵素、ホースラディッシュペクオキ
シダーゼ又はそのヒドラジド誘導体に結合させた。応用
例の１つでは、塩化メチルアジポイル（Ｉ）の芳香族ア
ミノ基に結合し、次いで水性アルカリ性エタノール中で
メチルエステルを加水分解した。生成された酸を塩化メ
チレン及びDCC中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで処理
することによりスクリンイミドに誘導体化した。このス
クシンイミジルエステルを40モル過剰量でホースラディ
ッシュペルオキシダーゼと４℃で16時間反応させた。
メチル−４−アミノフェニル）ホスホロチオエート）
（Ｉ）を、幾つかの手法で、Gershoni,J.M.,Bayer,F.B.
及びWilchek,M.,Anal.Biochem.146,pp59（1985）に従っ
て製造したマーカー酵素、ホースラディッシュペクオキ
シダーゼ又はそのヒドラジド誘導体に結合させた。応用
例の１つでは、塩化メチルアジポイル（Ｉ）の芳香族ア
ミノ基に結合し、次いで水性アルカリ性エタノール中で
メチルエステルを加水分解した。生成された酸を塩化メ
チレン及びDCC中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで処理
することによりスクリンイミドに誘導体化した。このス
クシンイミジルエステルを40モル過剰量でホースラディ
ッシュペルオキシダーゼと４℃で16時間反応させた。
場合によっては、（Ｉ）をこの手順でウシ血清アルブ
ミンと結合させ、得られた結合体を、公知の方法（Naka
ne,P.K.及びKawoi,A.J.Histochem.Cytochem.22（1974）
1084）の改良方法によって、シッフ塩基の形成の後でホ
ースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた。
ミンと結合させ、得られた結合体を、公知の方法（Naka
ne,P.K.及びKawoi,A.J.Histochem.Cytochem.22（1974）
1084）の改良方法によって、シッフ塩基の形成の後でホ
ースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた。
更に、β−アラニンスペーサーアームによるホースラ
ディッシュペルオキシダーゼへの（Ｉ）の結合も行っ
た。この場内の手順は次の通りである。まず、（Ｉ）を
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でβ−アラニ
ンのｔ−ブトキシカルボニルアミドと反応させた。水性
トリフルオロ酢酸で脱保護し且つ酸性化メタノールで処
理した後、得られたアミン（II）を過ヨウ素酸塩処理し
たホースラディッシュペルオキシダーゼとpH9.5、20℃
で４時間反応させた。酵素上の未反応アルデヒド基をエ
タノールアミンでクエンチした。（β−アラニンｔ−ブ
チルエステルとの反応により）リン上で誘導体化した前
述の化合物（IIIA−Ｄ）もホースラディッシュペルオキ
シダーゼ又はそのヒドラジド誘導体と反応させた。当業
者には明らなように、他のマーカー酵素との類似の結合
体も可能である。
ディッシュペルオキシダーゼへの（Ｉ）の結合も行っ
た。この場内の手順は次の通りである。まず、（Ｉ）を
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でβ−アラニ
ンのｔ−ブトキシカルボニルアミドと反応させた。水性
トリフルオロ酢酸で脱保護し且つ酸性化メタノールで処
理した後、得られたアミン（II）を過ヨウ素酸塩処理し
たホースラディッシュペルオキシダーゼとpH9.5、20℃
で４時間反応させた。酵素上の未反応アルデヒド基をエ
タノールアミンでクエンチした。（β−アラニンｔ−ブ
チルエステルとの反応により）リン上で誘導体化した前
述の化合物（IIIA−Ｄ）もホースラディッシュペルオキ
シダーゼ又はそのヒドラジド誘導体と反応させた。当業
者には明らなように、他のマーカー酵素との類似の結合
体も可能である。
結果 アッセイフォーマット1.試料抽出物中に存在する殺虫
剤と酵素標識フェニトロチオン類似体との間の固相結合
フェニトロチオン特異抗体に対する競合反応を用いるエ
ンザイムイムノアッセイ 固相をフェニトロチオン特異抗体でコーティングす
る。表Ｉに示した結果は、アジピックアシルクロリド−
６−エチルエステルを介してニワトリ血清IgGに結合し
たフェニトロチオンアミンに対するポリクローナルIgG
抗体を使用した時のものであるが（抗体P1）、前述のよ
うに、この免疫原に対して形成されたモノクローナル抗
体並びに他の免疫原に対して形成されたモノクローナル
及びポリクローナル抗体を使用しても同様の結果が得ら
れる。好ましくは、抗体をpH9.6の50mM炭酸ナトリウム
バッファ中10μg/mlでコーティングする。次いで、適当
なタンパク質又は洗剤、例えば、0.9％塩化ナトリウム
含有50mMリン酸ナトリウム（pH7.2）中10mg/mlのウシ血
清アルブミンで処理することにより、免疫反応体の非特
異的結合を最少限に抑える。分析すべき穀類、食品又は
他の試料、例えば土は、純メタノール又はエタノール中
に抽出するが、他の極性水混和性溶媒、例えばイソプロ
ハノール、アセトニトリル及びアセトンを使用してもよ
い。水とこれらの溶媒との混合物も使用し得る。水の分
析では、水の試料を直接使用し得る。穀類、食品又は他
の抽出物をタンパク質及び洗剤含有バッファ（例えばリ
ン酸塩緩衝塩水中の0.05％（v/v）のTween及び10mg/ml
のウシ血清アルブミン又は1mg/mlのTeleostean魚皮ゼラ
チン）で５倍に希釈し、これを固相に塗布し、酵素で標
識した還元フェニトロチオン（同様に希釈したもの）を
即座に加える。フェニトロチオン標準試料をメタノール
又はエタノール中で形成し、この標準試料の希釈物を同
時にアッセイする。
剤と酵素標識フェニトロチオン類似体との間の固相結合
フェニトロチオン特異抗体に対する競合反応を用いるエ
ンザイムイムノアッセイ 固相をフェニトロチオン特異抗体でコーティングす
る。表Ｉに示した結果は、アジピックアシルクロリド−
６−エチルエステルを介してニワトリ血清IgGに結合し
たフェニトロチオンアミンに対するポリクローナルIgG
抗体を使用した時のものであるが（抗体P1）、前述のよ
うに、この免疫原に対して形成されたモノクローナル抗
体並びに他の免疫原に対して形成されたモノクローナル
及びポリクローナル抗体を使用しても同様の結果が得ら
れる。好ましくは、抗体をpH9.6の50mM炭酸ナトリウム
バッファ中10μg/mlでコーティングする。次いで、適当
なタンパク質又は洗剤、例えば、0.9％塩化ナトリウム
含有50mMリン酸ナトリウム（pH7.2）中10mg/mlのウシ血
清アルブミンで処理することにより、免疫反応体の非特
異的結合を最少限に抑える。分析すべき穀類、食品又は
他の試料、例えば土は、純メタノール又はエタノール中
に抽出するが、他の極性水混和性溶媒、例えばイソプロ
ハノール、アセトニトリル及びアセトンを使用してもよ
い。水とこれらの溶媒との混合物も使用し得る。水の分
析では、水の試料を直接使用し得る。穀類、食品又は他
の抽出物をタンパク質及び洗剤含有バッファ（例えばリ
ン酸塩緩衝塩水中の0.05％（v/v）のTween及び10mg/ml
のウシ血清アルブミン又は1mg/mlのTeleostean魚皮ゼラ
チン）で５倍に希釈し、これを固相に塗布し、酵素で標
識した還元フェニトロチオン（同様に希釈したもの）を
即座に加える。フェニトロチオン標準試料をメタノール
又はエタノール中で形成し、この標準試料の希釈物を同
時にアッセイする。
ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した還元
フェニトロチオン（P1）、フェニトロチオン（P2）、ク
ロルピリフォス−メチル（P9）又はピリミホス−メチル
（P11）と30分間インキュベートし、更に発色性基質
（2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン
−６−スルホン酸）と10分間インキュベートして表１の
結果を得た。この方法を抗体P1について使用しても、殺
虫剤で処理しなかったコムギ穀粒、又はピリミホス−メ
チル、クロルピリフォス−メチル、アジンホス−メチル
（以上、有機リン酸エステル）もしくはビオレスメトリ
ン（ピレスロイド）を高濃度（7ppm）で含むコムギでは
フェニトロチオンは検出されなかった。しかしながら、
商業用穀類処理法で使用されている種々の量のフェニト
ロチオンを添加したコムギでは、フェニトロチオンが容
易に検出された。前述した他のフェニトロチオン−酵素
結合体を使用することもでき、アッセイの総所要時間を
３〜10分に短縮できる。発色性物質3,3′,5,5′−テト
ラメチルベンジジンを使用してもよい。
フェニトロチオン（P1）、フェニトロチオン（P2）、ク
ロルピリフォス−メチル（P9）又はピリミホス−メチル
（P11）と30分間インキュベートし、更に発色性基質
（2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン
−６−スルホン酸）と10分間インキュベートして表１の
結果を得た。この方法を抗体P1について使用しても、殺
虫剤で処理しなかったコムギ穀粒、又はピリミホス−メ
チル、クロルピリフォス−メチル、アジンホス−メチル
（以上、有機リン酸エステル）もしくはビオレスメトリ
ン（ピレスロイド）を高濃度（7ppm）で含むコムギでは
フェニトロチオンは検出されなかった。しかしながら、
商業用穀類処理法で使用されている種々の量のフェニト
ロチオンを添加したコムギでは、フェニトロチオンが容
易に検出された。前述した他のフェニトロチオン−酵素
結合体を使用することもでき、アッセイの総所要時間を
３〜10分に短縮できる。発色性物質3,3′,5,5′−テト
ラメチルベンジジンを使用してもよい。
この方法によるフェニトロチオンの分析は、固相上の
フェニトロチオン特異抗体への結合に関する、検査試料
中のフェニトロチオンと酵素表したフェニトロチオンと
の間の競合反応に基づくもとである。酵素標識したフェ
ニトロチオンの結合は、検査試料中のフェニトロチオン
濃度が増加するにつれて減少する。これは、酵素触媒作
用により生成する着色生成物の吸光度の減少によって示
される。未知の試料中のフェニトロチオン濃度は、試料
抽出物の添加によって生じた抗体結合の阻害の度合い
を、既知量のフェニトロチオンの添加の結果生じた阻害
の度合いと比較することによって測定し得る。他の強力
な殺虫剤の検出にも同様の原理が適用される。大部分の
食品、穀物、農産物及び水の抽出物の分析では、抽出物
のクリーンアップは不要であった。
フェニトロチオン特異抗体への結合に関する、検査試料
中のフェニトロチオンと酵素表したフェニトロチオンと
の間の競合反応に基づくもとである。酵素標識したフェ
ニトロチオンの結合は、検査試料中のフェニトロチオン
濃度が増加するにつれて減少する。これは、酵素触媒作
用により生成する着色生成物の吸光度の減少によって示
される。未知の試料中のフェニトロチオン濃度は、試料
抽出物の添加によって生じた抗体結合の阻害の度合い
を、既知量のフェニトロチオンの添加の結果生じた阻害
の度合いと比較することによって測定し得る。他の強力
な殺虫剤の検出にも同様の原理が適用される。大部分の
食品、穀物、農産物及び水の抽出物の分析では、抽出物
のクリーンアップは不要であった。
抗体の特異性及び穀物試料に関して得られた幾つかの
結果をそれぞれ表１及び表２に示した。フェニトロチオ
ンの分析では、添加量が少ない場合でも、所定の最大残
留レベルに近いかもしくはこれを超えた場合でも、十分
な感度が得られた。このアッセイは、長時間貯蔵した製
品又は加工後の製品中のフェニトロチオン又は近縁の有
機リン酸エステルの残留物を測定するためにも使用し得
る。この検査では、調理中に生成されるフェニトロチオ
ンの主要（殺虫剤としての活性はない）分解生成物であ
る４−ニトロ−３−メチルフェノールは検出されない
（Snelson,J.T.Grain Protectants,ACIAR（1987）p16
4）。このアッセイは例えば抗体P1を用いた場合には、
フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルに対し
て特異的である。４−置換フェニル部分を有するジメチ
ル−０−ホスホロチオエートエステルは活性がもっとも
高い。活性の極めて高い化合物はフェニル部分の３−位
置で置換されたものであった。ジエチル−０−ホスホロ
チオエートは有意な活性を示さなかった。他の一般的な
商業上重要な有機リン酸エステル、例えばジシクロルボ
ス、クロルピリフォス−エチル、ピリミホス−メチル、
アジンホス−メチル、ジメトエート及びマラチオンは極
めて僅かしか又は全く検出されなかった。カルバメート
殺虫剤（例えばカルバリール）、有機塩素系殺虫剤（例
えばジエルドリン）及び合成ピレスロイド（例えばビオ
レスメトリン）は検出されなかった。パラチオン−メチ
ルは僅かに検出された。従って、このアッセイは機能的
にフェニトロチオンに対して特異的である。このアッセ
イフォーマットは、前述のように製造したクロルピリフ
ォス−メチル又はピリミホス特異抗体にも使用でき、そ
の場合はそれぞれ抗体P9及びP11を使用して、クロルピ
リフォス−メチル並びにピリミホス−メチル及びピリミ
ホス−エチルに対して特異的なアッセイが得られる（表
１）。
結果をそれぞれ表１及び表２に示した。フェニトロチオ
ンの分析では、添加量が少ない場合でも、所定の最大残
留レベルに近いかもしくはこれを超えた場合でも、十分
な感度が得られた。このアッセイは、長時間貯蔵した製
品又は加工後の製品中のフェニトロチオン又は近縁の有
機リン酸エステルの残留物を測定するためにも使用し得
る。この検査では、調理中に生成されるフェニトロチオ
ンの主要（殺虫剤としての活性はない）分解生成物であ
る４−ニトロ−３−メチルフェノールは検出されない
（Snelson,J.T.Grain Protectants,ACIAR（1987）p16
4）。このアッセイは例えば抗体P1を用いた場合には、
フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルに対し
て特異的である。４−置換フェニル部分を有するジメチ
ル−０−ホスホロチオエートエステルは活性がもっとも
高い。活性の極めて高い化合物はフェニル部分の３−位
置で置換されたものであった。ジエチル−０−ホスホロ
チオエートは有意な活性を示さなかった。他の一般的な
商業上重要な有機リン酸エステル、例えばジシクロルボ
ス、クロルピリフォス−エチル、ピリミホス−メチル、
アジンホス−メチル、ジメトエート及びマラチオンは極
めて僅かしか又は全く検出されなかった。カルバメート
殺虫剤（例えばカルバリール）、有機塩素系殺虫剤（例
えばジエルドリン）及び合成ピレスロイド（例えばビオ
レスメトリン）は検出されなかった。パラチオン−メチ
ルは僅かに検出された。従って、このアッセイは機能的
にフェニトロチオンに対して特異的である。このアッセ
イフォーマットは、前述のように製造したクロルピリフ
ォス−メチル又はピリミホス特異抗体にも使用でき、そ
の場合はそれぞれ抗体P9及びP11を使用して、クロルピ
リフォス−メチル並びにピリミホス−メチル及びピリミ
ホス−エチルに対して特異的なアッセイが得られる（表
１）。
アッセイフォーマット2.フェニトロチオン又は近縁の有
機リン酸エステルに特異的な抗体に対する、試料抽出物
中の殺虫剤と固相結合フェニトロチオン又は近縁殺虫剤
との間の競合反応を用いるエンザイムイムノアッセイ 固相を殺虫剤−高分子結合体でコーティングする。表
１の結果は、免疫原結合体P3及びF2（オボアルブミンに
結合したIIA）、P3b（オボアルブミンに結合したII
B）、F4（ニワトリ血清IgGに結合したIIA）を使用した
時のものである。前記した他の結合体を使用しても同様
の結果が得られる。適当なタンパク質又は洗剤での処理
による結合体の非特異的結合の最小限に抑えるための予
処理の後で、分析すべきフェニトロチオン含有試料を加
える。穀物、食品又は他の試料は、メタノール、エタノ
ールもしくは他の前述のごとき極性水混和性溶媒中に抽
出するか、又はジシクロロメタンもしくはアセトンのよ
うな揮発性有機溶媒で抽出し、溶媒を蒸発させ、残留物
をより少量のメタノール中に再溶解させるようにし得
る。抽出又は再溶解した残留物をタンパク質及び洗剤含
有バッファ中に希釈し、固相に塗布し、フェニトロチオ
ン及び近縁の有機リン酸エステルに特異的な抗体を即座
に加える。フェニトロチオン標準溶液をメタノール中で
調製し、この標準溶液を希釈物を同時にアッセイした。
この種の抗体は、直接的共有結合か又は抗体の結合を検
出するのに使用される適当な増幅ステップで酵素標準し
得る。この方法によるフェニトロチオンの分析は、溶液
中のフェニトロチオン特異抗体への結合に関する検査試
料中のフェニトロチオンと固相結合フェニトロチオンと
の間の競合反応に基づくものである。検査試料中のフェ
ニトロチオン又は近縁の有機リン酸エステルの濃度が増
加すると抗体の結合が低下する。これは、この実施例で
は、酵素触媒作用により生成した着色生成物の吸光度の
減少によって示される。フェニトロチオン又は近縁の有
機リン酸エステルの濃度はアッセイフォーマット１と同
様に測定し得る。抽出物のクリーンアップは不要であっ
た。
機リン酸エステルに特異的な抗体に対する、試料抽出物
中の殺虫剤と固相結合フェニトロチオン又は近縁殺虫剤
との間の競合反応を用いるエンザイムイムノアッセイ 固相を殺虫剤−高分子結合体でコーティングする。表
１の結果は、免疫原結合体P3及びF2（オボアルブミンに
結合したIIA）、P3b（オボアルブミンに結合したII
B）、F4（ニワトリ血清IgGに結合したIIA）を使用した
時のものである。前記した他の結合体を使用しても同様
の結果が得られる。適当なタンパク質又は洗剤での処理
による結合体の非特異的結合の最小限に抑えるための予
処理の後で、分析すべきフェニトロチオン含有試料を加
える。穀物、食品又は他の試料は、メタノール、エタノ
ールもしくは他の前述のごとき極性水混和性溶媒中に抽
出するか、又はジシクロロメタンもしくはアセトンのよ
うな揮発性有機溶媒で抽出し、溶媒を蒸発させ、残留物
をより少量のメタノール中に再溶解させるようにし得
る。抽出又は再溶解した残留物をタンパク質及び洗剤含
有バッファ中に希釈し、固相に塗布し、フェニトロチオ
ン及び近縁の有機リン酸エステルに特異的な抗体を即座
に加える。フェニトロチオン標準溶液をメタノール中で
調製し、この標準溶液を希釈物を同時にアッセイした。
この種の抗体は、直接的共有結合か又は抗体の結合を検
出するのに使用される適当な増幅ステップで酵素標準し
得る。この方法によるフェニトロチオンの分析は、溶液
中のフェニトロチオン特異抗体への結合に関する検査試
料中のフェニトロチオンと固相結合フェニトロチオンと
の間の競合反応に基づくものである。検査試料中のフェ
ニトロチオン又は近縁の有機リン酸エステルの濃度が増
加すると抗体の結合が低下する。これは、この実施例で
は、酵素触媒作用により生成した着色生成物の吸光度の
減少によって示される。フェニトロチオン又は近縁の有
機リン酸エステルの濃度はアッセイフォーマット１と同
様に測定し得る。抽出物のクリーンアップは不要であっ
た。
この実施例では、抗体とのインキュペーションを30分
行うと共に（2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチ
アゾリン−６−スルホン酸））基質とのインキュベーシ
ョンを20分行った。前述のような他のフェニトロチオン
−高分子結合体、ポリクローナル抗体及びモノクローナ
ル抗体を使用することもでき、アッセイの総所要時間を
５〜10分に短縮させるか又は多数（数百）の試料のバッ
チ分析の場合は18時間までの増加で済ませることができ
る。後者の場合は、フェニトロチオン又は近縁の有機リ
ン酸エステルに対する感度も増加する。
行うと共に（2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチ
アゾリン−６−スルホン酸））基質とのインキュベーシ
ョンを20分行った。前述のような他のフェニトロチオン
−高分子結合体、ポリクローナル抗体及びモノクローナ
ル抗体を使用することもでき、アッセイの総所要時間を
５〜10分に短縮させるか又は多数（数百）の試料のバッ
チ分析の場合は18時間までの増加で済ませることができ
る。後者の場合は、フェニトロチオン又は近縁の有機リ
ン酸エステルに対する感度も増加する。
結果を表１に示す。
感度は、揮発性有機溶媒を用いて試料を抽出し、溶媒
を蒸発させ、残留物を少量の水混和性有機溶媒中に再溶
解させるようにすると更に増加し得る。
を蒸発させ、残留物を少量の水混和性有機溶媒中に再溶
解させるようにすると更に増加し得る。
これらのアッセイの特異性はアッセイフォーマット１
を用いた時に得られるものとは異なり得る。抗体P3を用
いるアッセイは、フェニトロチオンは検出するがアミノ
−フェニトロチオン（還元フェニトロチオン）は検出し
ない。メチル−パラチオン、パラチオン及びジカプトン
の検出度はフェニトロチオンより低い。例えば、４−ニ
トロフェニル基又は４−メチルフェニル基を有する或る
種のジメチル−０−ホスホロチオエートは検出できる
が、４位で置換されたより大きい基を有する化合物は検
出できない。パラオキソン及びジクロルボスのような近
縁の（オキソ）−リン酸エステルは検出されない。フェ
ニル以外の置換基を有するジメチル−０−ホスホロチオ
エート殺虫剤は検出されない。ピリミホス−メチル及び
アジンホス−メチルは検出されない。他の殺虫剤、例え
ばカルバメート殺虫剤（カルバリール）、有機塩素系殺
虫剤（ジエルドリン）及びピレスロイド（ビオレスメト
リン）は表１に示した抗体では検出されなかった。
を用いた時に得られるものとは異なり得る。抗体P3を用
いるアッセイは、フェニトロチオンは検出するがアミノ
−フェニトロチオン（還元フェニトロチオン）は検出し
ない。メチル−パラチオン、パラチオン及びジカプトン
の検出度はフェニトロチオンより低い。例えば、４−ニ
トロフェニル基又は４−メチルフェニル基を有する或る
種のジメチル−０−ホスホロチオエートは検出できる
が、４位で置換されたより大きい基を有する化合物は検
出できない。パラオキソン及びジクロルボスのような近
縁の（オキソ）−リン酸エステルは検出されない。フェ
ニル以外の置換基を有するジメチル−０−ホスホロチオ
エート殺虫剤は検出されない。ピリミホス−メチル及び
アジンホス−メチルは検出されない。他の殺虫剤、例え
ばカルバメート殺虫剤（カルバリール）、有機塩素系殺
虫剤（ジエルドリン）及びピレスロイド（ビオレスメト
リン）は表１に示した抗体では検出されなかった。
このように、これらのアッセイはフェニトロチオン及
び近縁の有機リン酸系殺虫剤を検出する。このアッセイ
フォーマットでは、固相上の近縁0,0−ジアルキルホス
ホロチオエート結体（IIB、IC、IID）、及び溶液中のク
ロルピリフォス−メチル、クロルピリフォス−エチル又
はピリミホス−メチルに対して特異的な抗体も使用で
き、その場合はクロルピリフォス−メチルアッセイ（抗
体F7）、クロルピリフォス−エチルアッセイ又はピリミ
ホス−メチルアッセイが提供される。
び近縁の有機リン酸系殺虫剤を検出する。このアッセイ
フォーマットでは、固相上の近縁0,0−ジアルキルホス
ホロチオエート結体（IIB、IC、IID）、及び溶液中のク
ロルピリフォス−メチル、クロルピリフォス−エチル又
はピリミホス−メチルに対して特異的な抗体も使用で
き、その場合はクロルピリフォス−メチルアッセイ（抗
体F7）、クロルピリフォス−エチルアッセイ又はピリミ
ホス−メチルアッセイが提供される。
本発明の方法は、前記有機リン系殺虫剤、特にフェニ
トロチオン及び近縁の有機リン酸エステル、例えばクロ
ルピリフォス−メチル、クロルピリフォス−エチル及び
ピリミホス−メチルを検出するためのキットに直接適用
し得る。特に、フェニトロチオン又は近縁の有機リン酸
エステルに対して特異的な抗体でコーティングしたフェ
ニトロチオン特異抗体被覆マイクロウェルプレート、ス
トリップ又は他の適当な固体支持体と、所定量のフェニ
トロチオン又は近縁のジアルキル−０−ホスホロチオエ
ートを含む１種類以上の標準溶液又は調製物と、フェニ
トロチオン又は近縁のジアルキル−０−ホスホロチオエ
ートの酵素結合誘導体と、酵素基質と、洗浄溶液と、発
色停止溶液と、非特異的結合阻止試薬とを含むパケット
からなる、フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エス
テルを検出するためのキットを提供し得る。
トロチオン及び近縁の有機リン酸エステル、例えばクロ
ルピリフォス−メチル、クロルピリフォス−エチル及び
ピリミホス−メチルを検出するためのキットに直接適用
し得る。特に、フェニトロチオン又は近縁の有機リン酸
エステルに対して特異的な抗体でコーティングしたフェ
ニトロチオン特異抗体被覆マイクロウェルプレート、ス
トリップ又は他の適当な固体支持体と、所定量のフェニ
トロチオン又は近縁のジアルキル−０−ホスホロチオエ
ートを含む１種類以上の標準溶液又は調製物と、フェニ
トロチオン又は近縁のジアルキル−０−ホスホロチオエ
ートの酵素結合誘導体と、酵素基質と、洗浄溶液と、発
色停止溶液と、非特異的結合阻止試薬とを含むパケット
からなる、フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エス
テルを検出するためのキットを提供し得る。
あるいはフェニトロチオン又は近縁の0,0−ジアルキ
ル−０−ホスホロチオエート誘導体結合高分子でコーテ
ィングしたマイクロウェルプレート、ストリップ又は他
の適当な固体支持体と、所定量のフェニトロチオン又は
近縁の0,0−ジアルキル−０−ホスホロチオエートを含
む１種類以上の標準溶液又は調製物と、フェニトロチオ
ン又は近縁の物質に対する抗体と、洗浄溶液と、発色停
止溶液と、非特異的結合阻止試薬とを含むパケットから
なる、フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステル
を検出するためのキットを提供し得る。
ル−０−ホスホロチオエート誘導体結合高分子でコーテ
ィングしたマイクロウェルプレート、ストリップ又は他
の適当な固体支持体と、所定量のフェニトロチオン又は
近縁の0,0−ジアルキル−０−ホスホロチオエートを含
む１種類以上の標準溶液又は調製物と、フェニトロチオ
ン又は近縁の物質に対する抗体と、洗浄溶液と、発色停
止溶液と、非特異的結合阻止試薬とを含むパケットから
なる、フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステル
を検出するためのキットを提供し得る。
あるいは、凝集、付着、蛍光、視覚的イムノアッセ
イ、ラジオイムノアッセイ又は化学ルミネンスの原理に
依存するように構成された、フェニトロチオン又は近縁
の有機リン酸エステルを検出するためのキットも提供し
得る。
イ、ラジオイムノアッセイ又は化学ルミネンスの原理に
依存するように構成された、フェニトロチオン又は近縁
の有機リン酸エステルを検出するためのキットも提供し
得る。
当業者には明らかなように、以上説明してきた本発明
はその範囲内で様々に変形し得る。
はその範囲内で様々に変形し得る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 33/577 Ｂ // Ａ０１Ｎ 57/14 Ｃ 57/16 １０２ Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヒル，アマンダ・スザンヌ オーストラリア国、ニユー・サウス・ウエ ールズ・2077、ホーンズビイ・ヘイツ、サ ンセツト・アベニユー・18 (72)発明者 マツカダム，デビツド・ピーター オーストラリア国、オーストラリアン・キ ヤピタル・テリトリー・2611、ダフイ、バ ーレンドン・ストリート・39
Claims (13)
- 【請求項１】0,0−ジメチル−０−（3,5,6−トリクロロ
−２−ピリジル）ホスホロチオエート、0,0−ジエチル
−０−（3,5,6−トリクロロ−２−ピリジル）ホスホロ
チオエート、0,0−ジメチル−０−（２−ジエチルアミ
ノ−６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチオエ
ート及び0,0−ジエチル−０−（２−ジエチルアミノ−
６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチオエート
から成る群から選択されるホスホロチオエートに高い特
異性をもって結合可能な抗体又はその断片を製造するた
めの方法であって、 ヒト以外の動物を、 （ａ） 塩化チオホスホリルのメトキシ又はエトキシ誘
導体と、スペーサーアーム化合物である保護された酸又
はエステルと反応させ、 （ｂ） ステップ（ａ）の生成物を、3,5,6−トリクロ
ロ−２−ピリジノール又は２−ジエチルアミノ−４−ヒ
ドロキシ−６−メチルピリミジンと反応させて、保護ス
ペーサーが結合されたホスホロチオエートを形成し、 （ｃ） 前記保護スペーサー結合ホスホロチオエートを
脱保護し、得られた脱保護スペーサーが結合されたホス
ホロチオエートを、免疫原性高分子物質に結合して免疫
原結合体を形成する ステップによって調製される免疫原結合体で免疫感作
し、 前記ホスホロチオエートに高い特異性をもって結合可能
な抗体を回収し、 必要により、前記抗体を断片化してその抗原結合性断片
を回収する ステップを包含することを特徴とする前記方法。 - 【請求項２】請求項１記載の方法によって製造される抗
体又はその断片。 - 【請求項３】前記抗体がモノクローナル抗体である請求
項２記載の抗体。 - 【請求項４】前記抗体がポリクローナル抗体である請求
項２記載の抗体。 - 【請求項５】0,0−ジメチル−０−（3,5,6−トリクロロ
−２−ピリジル）ホスホロチオエート、0,0−ジエチル
−０−（3,5,6,−トリクロロ−２−ピリジル）ホスホロ
チオエート、0,0−ジメチル−０−（２−ジエチルアミ
ノ−６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチオエ
ート及び0,0−ジエチル−０−（２−ジエチルアミノ−
６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチオエート
から成る群から選択され、且つ、 （ａ） 塩化チオホスホリルのメトキシ又はエトキシ誘
導体を、スペーサーアーム化合物である保護された酸又
はエステルと反応させ、 （ｂ） ステップ（ａ）の生成物を、3,5,6−トリクロ
ロ−２−ピリジノール又は２−ジエチルアミノ−４−ヒ
ドロキシ−６−メチルピリミジンと反応させて、保護ス
ペーサーが結合されたホスホロチオエートを形成する ステップによって製造されることを特徴とする保護スペ
ーサー結合ホスホロチオエート。 - 【請求項６】0,0−ジメチル−０−（3,5,6−トリクロロ
−２−ピリジル）ホスホロチオエート、0,0−ジエチル
−０−（3,5,6,−トリクロロ−２−ピリジル）ホスホロ
チオエート、0,0−ジメチル−０−（２−ジエチルアミ
ノ−６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチオエ
ート及び0,0−ジエチル−０−（２−ジエチルアミノ−
６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチオエート
から成る群から選択されるホスホロチオエートに、その
ホスホロチオエート基上のエステル又は酸スペーサーの
カルボン酸基を介して高分子物質が結合されていること
を特徴とする免疫原結合体。 - 【請求項７】農産物、穀物、食品又は環境試料中の、0,
0−ジメチル−０−（3,5,6−トリクロロ−２−ピリジ
ル）ホスホロチオエート、0,0−ジエチル−０−（3,5,
6,−トリクロロ−２−ピリジル）ホスホロチオエート、
0,0−ジメチル−０−（２−ジエチルアミノ−６−メチ
ルピリミジン−４−イル）ホスホロチオエート及び0,0
−ジエチル−０−（２−ジエチルアミノ−６−メチルピ
リミジン−４−イル）ホスホロチオエートから成る群か
ら選択されるホスホロチオエートを定量又は検出するた
めの方法であって、 （ａ） 前記ホスホロチオエートのホスホロチオエート
基上のエステル又は酸スペーサーのカルボン酸基を介し
て標識が結合されている該ホスホロチオエートの標識化
結合体の既知量の存在下で、高い特異性をもって該ホス
ホロチオエートに結合可能である抗体又はその断片と、
前記試料とを接触させ、 （ｂ） 前記標識化ホスホロチオエートと前記抗体又は
その断片との結合を、試料中のホスホロチオエート量に
反比例する量として測定する ステップを包含することを特徴とする前記方法。 - 【請求項８】前記抗体又はその断片が支持体に結合され
ている請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】前記標識が酵素である請求項７に記載の方
法。 - 【請求項１０】0,0−ジメチル−０−（3,5,6−トリクロ
ロ−２−ピリジル）ホスホロチオエート、0,0−ジエチ
ル−０−（3,5,6,−トリクロロ−２−ピリジル）ホスホ
ロチオエート、0,0−ジメチル−０−（２−ジエチルア
ミノ−６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチオ
エート及び0,0−ジエチル−０−（２−ジエチルアミノ
−６−メチルピリミジン−４−イル）ホスホロチオエー
トから成る群から選択されるホスホロチオエートを定量
又は検出するためのキッドであって、 （ａ） 高い特異性をもって前記ホスホロチオエートに
結合可能な抗体又はその断片、及び （ｂ） 標識が前記ホスホロチオエートのホスホロチオ
エート基上のエステル又は酸スペーサーのカルボン酸基
を介して結合されている、既知量の該ホスホロチオエー
トの標識化結合体 を含むことを特徴とする前記キット。 - 【請求項１１】前記標識が酵素である請求項10に記載の
キット。 - 【請求項１２】前記抗体又はその断片が固体支持体に結
合されている請求項10に記載のキット。 - 【請求項１３】既知量の前記ホスホロチオエートを含有
する標準溶液又は調製物をさらに含む請求項10に記載の
キット。
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