JPH0889255A - 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 - Google Patents
新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法Info
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- JPH0889255A JPH0889255A JP6235737A JP23573794A JPH0889255A JP H0889255 A JPH0889255 A JP H0889255A JP 6235737 A JP6235737 A JP 6235737A JP 23573794 A JP23573794 A JP 23573794A JP H0889255 A JPH0889255 A JP H0889255A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする
新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、クレ
アチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡ
に挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ、
及びクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子をベクタ
ーＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、クレアチ
ンアミジノハイドロラーゼ生産能を有するエッシェリシ
ア属に属する微生物を培地に培養し、培養物からクレア
チンアミジノハイドロラーゼを採取することを特徴とす
るクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法。 【効果】 培地中にクレアチンを添加することなく、ク
レアチンアミジノハイドロラーゼを効率よく生産でき
る。
新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子、クレ
アチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡ
に挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ、
及びクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子をベクタ
ーＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、クレアチ
ンアミジノハイドロラーゼ生産能を有するエッシェリシ
ア属に属する微生物を培地に培養し、培養物からクレア
チンアミジノハイドロラーゼを採取することを特徴とす
るクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法。 【効果】 培地中にクレアチンを添加することなく、ク
レアチンアミジノハイドロラーゼを効率よく生産でき
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、クレアチン量の測定に
有用な新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝
子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びクレアチンアミジノハ
イドロラーゼの製造法に関する。
有用な新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝
子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びクレアチンアミジノハ
イドロラーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】クレアチンアミジノハイドロラーゼは、
クレアチンを加水分解してザルコシン及び尿素を生成す
る触媒作用を有する酵素であり、ヒトの血清中又は尿中
のクレアチン量の測定に用いることができ、腎臓病をは
じめとする各種の疾患の診断薬として利用することがで
きる。しかしながら、従来のクレアチンアミジノハイド
ロラーゼは、pH安定性が4.5〜8.5と狭く、pH8.5を超え
る高pH領域において不安定であるため、該pH領域下での
精製が困難であり、又、Km値が大きいため、試料測定の
ために長時間を要するなどの欠点があった。
クレアチンを加水分解してザルコシン及び尿素を生成す
る触媒作用を有する酵素であり、ヒトの血清中又は尿中
のクレアチン量の測定に用いることができ、腎臓病をは
じめとする各種の疾患の診断薬として利用することがで
きる。しかしながら、従来のクレアチンアミジノハイド
ロラーゼは、pH安定性が4.5〜8.5と狭く、pH8.5を超え
る高pH領域において不安定であるため、該pH領域下での
精製が困難であり、又、Km値が大きいため、試料測定の
ために長時間を要するなどの欠点があった。
【０００３】そこで、本発明者等は、アルカリゲネス・
エスピー（Alcaligenes sp.）KS-85株(FREM BP-4487)を
クレアチンを含む培地に接種、培養すれば、高pH領域に
おいて安定で、かつKm値の小さい新規なクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼを得ることができること等の知見を
得、先に特許出願を行なった（特願平5-318675号出
願）。
エスピー（Alcaligenes sp.）KS-85株(FREM BP-4487)を
クレアチンを含む培地に接種、培養すれば、高pH領域に
おいて安定で、かつKm値の小さい新規なクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼを得ることができること等の知見を
得、先に特許出願を行なった（特願平5-318675号出
願）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子工学
的手法によりクレアチンアミジノハイドロラーゼを生産
することを目的として、その生産の元となるクレアチン
アミジノハイドロラーゼ遺伝子、更に、該遺伝子を含む
組み換え体ＤＮＡ及び該組み換え体ＤＮＡを用いるクレ
アチンアミジノハイドロラーゼの製造法を提供すること
である。
的手法によりクレアチンアミジノハイドロラーゼを生産
することを目的として、その生産の元となるクレアチン
アミジノハイドロラーゼ遺伝子、更に、該遺伝子を含む
組み換え体ＤＮＡ及び該組み換え体ＤＮＡを用いるクレ
アチンアミジノハイドロラーゼの製造法を提供すること
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的に鑑み更に検討
した結果、本発明者等は、アルカリゲネス由来のクレア
チンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を単離及び構造決定
することに成功し、また更に、クレアチンアミジノハイ
ドロラーゼをコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入
した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェ
リシア（Escherichia)属に属する菌株に含ませたクレア
チンアミジノハイドロラーゼ生産能を有する菌株を培地
に培養すると、培地中にクレアチンを添加することな
く、効率よくクレアチンアミジノハイドロラーゼが生産
されること等を見出し、本発明を完成した。
した結果、本発明者等は、アルカリゲネス由来のクレア
チンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を単離及び構造決定
することに成功し、また更に、クレアチンアミジノハイ
ドロラーゼをコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入
した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェ
リシア（Escherichia)属に属する菌株に含ませたクレア
チンアミジノハイドロラーゼ生産能を有する菌株を培地
に培養すると、培地中にクレアチンを添加することな
く、効率よくクレアチンアミジノハイドロラーゼが生産
されること等を見出し、本発明を完成した。
【０００６】即ち、本願の第１の発明は、配列番号２記
載のアミノ酸配列をコードする新規なクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ遺伝子であり、本願の第２の発明は、
クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子をベクターＤ
ＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮ
Ａであり、また本願の第３の発明は、クレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組
み換え体ＤＮＡを含み、クレアチンアミジノハイドロラ
ーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を
培地に培養し、培養物からクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼを採取することを特徴とするクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼの製造法である。
載のアミノ酸配列をコードする新規なクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ遺伝子であり、本願の第２の発明は、
クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子をベクターＤ
ＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮ
Ａであり、また本願の第３の発明は、クレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組
み換え体ＤＮＡを含み、クレアチンアミジノハイドロラ
ーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を
培地に培養し、培養物からクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼを採取することを特徴とするクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼの製造法である。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子は、例えば次
のようにして得ることができる。先ず、アルカリゲネス
・エスピー．KS-85 株を、例えばCurrent Protocols in
Molecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の
方法等により培養し、得られた菌株から染色体ＤＮＡを
抽出する。
クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子は、例えば次
のようにして得ることができる。先ず、アルカリゲネス
・エスピー．KS-85 株を、例えばCurrent Protocols in
Molecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の
方法等により培養し、得られた菌株から染色体ＤＮＡを
抽出する。
【０００８】上記アルカリゲネス・エスピー. KS-85 株
は、京都府内の土壌中より新たに検索して得た菌株で、
その菌学的性質は以下に示す通りである。菌学的性質の
同定のための実験法は、主として長谷川武治編著「微生
物の分類と同定」東京大学出版会（1975年）によって行
なった。また分類同定の基準としてバージーズ・マニュ
アル・オブ・デターミネィティブ・バクテリオロジー第
８版（1974年）を参考にした。
は、京都府内の土壌中より新たに検索して得た菌株で、
その菌学的性質は以下に示す通りである。菌学的性質の
同定のための実験法は、主として長谷川武治編著「微生
物の分類と同定」東京大学出版会（1975年）によって行
なった。また分類同定の基準としてバージーズ・マニュ
アル・オブ・デターミネィティブ・バクテリオロジー第
８版（1974年）を参考にした。
【０００９】〔アルカリゲネス・エスピー. KS-85 の菌
学的性質〕 (A) 形態的性質 顕微鏡的観察〔肉汁寒天培地(pH 9.0)上で、30℃、24〜
48時間培養〕 (1) 細胞の形及び大きさ：0.5〜1.0×0.5〜4.0ミクロン
の直状桿菌である。(2)運動性の有無：周毛を有し、運
動性を有する。 (3) 胞子の有無：無し。 (4) グラム染色性：陰性。 (5) 抗酸性：陰性。
学的性質〕 (A) 形態的性質 顕微鏡的観察〔肉汁寒天培地(pH 9.0)上で、30℃、24〜
48時間培養〕 (1) 細胞の形及び大きさ：0.5〜1.0×0.5〜4.0ミクロン
の直状桿菌である。(2)運動性の有無：周毛を有し、運
動性を有する。 (3) 胞子の有無：無し。 (4) グラム染色性：陰性。 (5) 抗酸性：陰性。
【００１０】(B) 各培地(pH 8.0)における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 30℃、５日間の培養で、直径２〜３mmの淡黄色の円形コ
ロニーを形成する。表面は円滑で脂肪様光沢があり、周
縁は透明である。（白っぽいが淡い黄色味も帯びてい
る。） (2) 肉汁寒天斜面培養 30℃、９日間の静置培養で拡布状の生育を示す。色はベ
ージュ色の菌体で、色素の産生は認められない。 (3) 肉汁液体培養 30℃、９日間の静置培養で、培地液面に膜状に生育し、
下部に沈殿を生成する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃、30日間の静置培養で、培地上部にのみ生育し、ゼ
ラチンを液化しない。 (5) リトマスミルク 30℃、９日間の静置培養で、リトマスミルクの凝固、液
化は認められないが、培地中でアルカリを産出し、培地
初発pHを上昇させる。
ロニーを形成する。表面は円滑で脂肪様光沢があり、周
縁は透明である。（白っぽいが淡い黄色味も帯びてい
る。） (2) 肉汁寒天斜面培養 30℃、９日間の静置培養で拡布状の生育を示す。色はベ
ージュ色の菌体で、色素の産生は認められない。 (3) 肉汁液体培養 30℃、９日間の静置培養で、培地液面に膜状に生育し、
下部に沈殿を生成する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃、30日間の静置培養で、培地上部にのみ生育し、ゼ
ラチンを液化しない。 (5) リトマスミルク 30℃、９日間の静置培養で、リトマスミルクの凝固、液
化は認められないが、培地中でアルカリを産出し、培地
初発pHを上昇させる。
【００１１】(C) 生理的性質 主に pH 6.5に調整した培地を用いて試験した。 (1) 硝酸塩の還元：還元しない。 (2) 脱窒反応：無し。（好気的条件下では亜硝酸塩を生
成） (3) MRテスト：陰性。 (4) VPテスト：陰性。 (5) インドールの生成：生成しない。 (6) 硫化水素の生成：生成しない。 (7) デンプンの加水分解：加水分解しない。 (8) クエン酸の利用：利用しない。 (9) 無機窒素源の利用：利用しない。（硝酸塩及びアン
モニウム塩） (10)色素の生成：生成しない。 (11)ウレアーゼ：陰性。 (12)オキシダーゼ：陽性。 (13)カタラーゼ：陽性。 (14)生育の範囲：温度；15〜45℃、pH；6.0〜9.0 (15)酸素に対する態度：好気性。 (16) O−Fテスト（Hugh-Leifson法）：酸化、発酵共に
無し。 (17)糖類からの酸及びガスの生成：無し。（下記の糖類
について検討した。） L-アラビノース、D-キシロース、D-グルコース、D-マン
ノース、D-フラクトース、D-ガラクトース、麦芽糖、シ
ョ糖、乳糖、トレハロース、D-ソルビット、D-マンニッ
ト、イノシット、グリセリン、デンプン
成） (3) MRテスト：陰性。 (4) VPテスト：陰性。 (5) インドールの生成：生成しない。 (6) 硫化水素の生成：生成しない。 (7) デンプンの加水分解：加水分解しない。 (8) クエン酸の利用：利用しない。 (9) 無機窒素源の利用：利用しない。（硝酸塩及びアン
モニウム塩） (10)色素の生成：生成しない。 (11)ウレアーゼ：陰性。 (12)オキシダーゼ：陽性。 (13)カタラーゼ：陽性。 (14)生育の範囲：温度；15〜45℃、pH；6.0〜9.0 (15)酸素に対する態度：好気性。 (16) O−Fテスト（Hugh-Leifson法）：酸化、発酵共に
無し。 (17)糖類からの酸及びガスの生成：無し。（下記の糖類
について検討した。） L-アラビノース、D-キシロース、D-グルコース、D-マン
ノース、D-フラクトース、D-ガラクトース、麦芽糖、シ
ョ糖、乳糖、トレハロース、D-ソルビット、D-マンニッ
ト、イノシット、グリセリン、デンプン
【００１２】上記した菌学的性質から、本菌株は、アル
カリゲネス属に属するものと判定された。従って本菌株
を、アルカリゲネス・エスピー．KS-85 と同定命名し
た。本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM BP-4487として寄託されている。
カリゲネス属に属するものと判定された。従って本菌株
を、アルカリゲネス・エスピー．KS-85 と同定命名し
た。本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM BP-4487として寄託されている。
【００１３】次いで、この染色体ＤＮＡを、例えばEcoR
Ｉにより部分分解し、染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。
このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば、通
常のアガロースゲル電気泳動法により、好ましくは２〜
５Kbの大きさのＤＮＡ断片混合物を得、これに必要によ
りアルカリフォスファターゼ処理等を行なった後、更に
必要により、例えばフェノール抽出等の精製手段により
精製し、また更に、例えばエタノール沈殿等の方法によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にクレ
アチンアミジノハイドロラーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片が含まれる）を得る。
Ｉにより部分分解し、染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。
このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば、通
常のアガロースゲル電気泳動法により、好ましくは２〜
５Kbの大きさのＤＮＡ断片混合物を得、これに必要によ
りアルカリフォスファターゼ処理等を行なった後、更に
必要により、例えばフェノール抽出等の精製手段により
精製し、また更に、例えばエタノール沈殿等の方法によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にクレ
アチンアミジノハイドロラーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片が含まれる）を得る。
【００１４】一方、本発明において用いることのできる
ベクターＤＮＡとしては、例えば、バクテリオファージ
ベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等が挙げら
れるが、具体的にはpUC118（宝酒造社製）等が好まし
い。上記プラスミドベクターＤＮＡをEcoRＩ断片取り込
み可能な状態にするため、例えば、EcoRＩ（宝酒造社
製）を作用させて消化し、更に必要によりエタノール沈
殿処理等を行なうことにより、EcoRＩ断片取り込み可能
なプラスミドＤＮＡベクターを得る。
ベクターＤＮＡとしては、例えば、バクテリオファージ
ベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等が挙げら
れるが、具体的にはpUC118（宝酒造社製）等が好まし
い。上記プラスミドベクターＤＮＡをEcoRＩ断片取り込
み可能な状態にするため、例えば、EcoRＩ（宝酒造社
製）を作用させて消化し、更に必要によりエタノール沈
殿処理等を行なうことにより、EcoRＩ断片取り込み可能
なプラスミドＤＮＡベクターを得る。
【００１５】次いで、得られたアルカリゲネス由来のク
レアチンアミジノハイドロラーゼをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡ断片と、同じく上記のようにして得たEc
oRＩ断片取り込み可能なプラスミドベクターＤＮＡを混
合し、これに、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ーマンハイム社製）を作用させて組み換え体プラスミド
ＤＮＡを得る。
レアチンアミジノハイドロラーゼをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡ断片と、同じく上記のようにして得たEc
oRＩ断片取り込み可能なプラスミドベクターＤＮＡを混
合し、これに、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ーマンハイム社製）を作用させて組み換え体プラスミド
ＤＮＡを得る。
【００１６】このようにして得られた組み換え体ＤＮＡ
を用いて、例えば大腸菌K12、好ましくは大腸菌JM109
（東洋紡社製）、XL-Blue（フナコシ(株)製）等を形質
転換して、様々な遺伝子断片を保有する組み換え体ＤＮ
Ａのコロニーを得ることができる。得られたコロニーの
中より、クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を保有する組み換え体ＤＮＡを検索するに
は、例えば、実施例１の項目(3) に記載の方法に従って
得られた遺伝子断片の末端に対してジコギシゲニン（ベ
ーリンガーマンハイム社製）で標識したオリゴヌクレオ
チドをプローブとして、前記Current Protocols in Mol
ecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の方法
によりコロニーハイブリダイゼーションを行なうことが
できる。
を用いて、例えば大腸菌K12、好ましくは大腸菌JM109
（東洋紡社製）、XL-Blue（フナコシ(株)製）等を形質
転換して、様々な遺伝子断片を保有する組み換え体ＤＮ
Ａのコロニーを得ることができる。得られたコロニーの
中より、クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を保有する組み換え体ＤＮＡを検索するに
は、例えば、実施例１の項目(3) に記載の方法に従って
得られた遺伝子断片の末端に対してジコギシゲニン（ベ
ーリンガーマンハイム社製）で標識したオリゴヌクレオ
チドをプローブとして、前記Current Protocols in Mol
ecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の方法
によりコロニーハイブリダイゼーションを行なうことが
できる。
【００１７】得られた組み換え体ＤＮＡ（その中にクレ
アチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含有してい
る。）より、純化されたプラスミドＤＮＡを得るには、
例えば超遠心CsCl濃度勾配分離法等の方法を用いること
ができる。上記の純化されたプラスミドＤＮＡを用い
て、実施例１の項目(4) に示すような方法によって、ク
レアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子の全塩基配列の
解析を行ない、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によ
って翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を確定す
る。このアミノ酸配列は、配列番号２に示されるとおり
である。このようにして確定されたアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子が本発明のクレアチンアミジノハイドロラ
ーゼ遺伝子である。
アチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含有してい
る。）より、純化されたプラスミドＤＮＡを得るには、
例えば超遠心CsCl濃度勾配分離法等の方法を用いること
ができる。上記の純化されたプラスミドＤＮＡを用い
て、実施例１の項目(4) に示すような方法によって、ク
レアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子の全塩基配列の
解析を行ない、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によ
って翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を確定す
る。このアミノ酸配列は、配列番号２に示されるとおり
である。このようにして確定されたアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子が本発明のクレアチンアミジノハイドロラ
ーゼ遺伝子である。
【００１８】しかし、上記のようにして得られたクレア
チンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含む組み換え体Ｄ
ＮＡは、大腸菌で発現するためのプロモーターを有しな
いので、組み換え体ＤＮＡを保有する形質転換株はクレ
アチンアミジノハイドロラーゼを生産しない。そこで、
以下の操作によりクレアチンアミジノハイドロラーゼ生
産株を得る。
チンアミジノハイドロラーゼ遺伝子を含む組み換え体Ｄ
ＮＡは、大腸菌で発現するためのプロモーターを有しな
いので、組み換え体ＤＮＡを保有する形質転換株はクレ
アチンアミジノハイドロラーゼを生産しない。そこで、
以下の操作によりクレアチンアミジノハイドロラーゼ生
産株を得る。
【００１９】上記の操作で得られた塩基配列に基づき、
クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子のＮ末端、Ｃ
末端各10個のアミノ酸に対応する30個の塩基のオリゴヌ
クレオチド（Ｃ末端側は相補鎖である。）を合成して、
これをプライマーとし、更に上記で得られた純化した組
み換え体プラスミドを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反
応（以下PCR法と略す）を行ない、クレアチンアミジノ
ハイドロラーゼをコードする領域のみからなるＤＮＡを
得る。得られたＤＮＡを、大腸菌ラクトースオペロン等
に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム
結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（The Operon,P
227,Cold Spring Harbor Laboratory,1980年を参照）を
保有するベクターＤＮＡに挿入する。用いられるベクタ
ーＤＮＡはとしては、例えばプラスミドＤＮＡ、バクテ
リオファージＤＮＡ等が挙げられる。得られた組み換え
体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌K-12、好ましくは大腸
菌JM109（東洋紡社製）、XL-Blue（フナコシ(株)製）等
を形質転換又は形質導入して夫々の菌株を得る。
クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子のＮ末端、Ｃ
末端各10個のアミノ酸に対応する30個の塩基のオリゴヌ
クレオチド（Ｃ末端側は相補鎖である。）を合成して、
これをプライマーとし、更に上記で得られた純化した組
み換え体プラスミドを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反
応（以下PCR法と略す）を行ない、クレアチンアミジノ
ハイドロラーゼをコードする領域のみからなるＤＮＡを
得る。得られたＤＮＡを、大腸菌ラクトースオペロン等
に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム
結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（The Operon,P
227,Cold Spring Harbor Laboratory,1980年を参照）を
保有するベクターＤＮＡに挿入する。用いられるベクタ
ーＤＮＡはとしては、例えばプラスミドＤＮＡ、バクテ
リオファージＤＮＡ等が挙げられる。得られた組み換え
体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌K-12、好ましくは大腸
菌JM109（東洋紡社製）、XL-Blue（フナコシ(株)製）等
を形質転換又は形質導入して夫々の菌株を得る。
【００２０】形質転換はD.M.Morrisonの方法（Method i
n Enzymology,68,326-331,1979)に行なうことができ
る。また、形質導入はB.Hohnの方法（Method in Enzymo
logy,68,299-309，1979)により行なうことができる。
n Enzymology,68,326-331,1979)に行なうことができ
る。また、形質導入はB.Hohnの方法（Method in Enzymo
logy,68,299-309，1979)により行なうことができる。
【００２１】上記のようにして得られたクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する菌株を用いてクレアチンアミジノハイドロラーゼ
を生産するには、下記のようにして行なうことができ
る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培
養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養す
るのが好ましい。
ジノハイドロラーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する菌株を用いてクレアチンアミジノハイドロラーゼ
を生産するには、下記のようにして行なうことができ
る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培
養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養す
るのが好ましい。
【００２２】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンス
テイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等
の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム，リン酸
水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸
第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。
は、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンス
テイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等
の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム，リン酸
水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸
第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。
【００２３】なお、培地の初発pHは７〜９に調整するの
が適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で６〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりクレアチンアミジノハイドロラーゼを採取す
るには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
が適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で６〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりクレアチンアミジノハイドロラーゼを採取す
るには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
【００２４】培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からクレ
アチンアミジノハイドロラーゼを採取することが好まし
い。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、
超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の
破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如
き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、
トリトンＸ-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を
抽出する方法等により、菌体からクレアチンアミジノハ
イドロラーゼを採取するのが好ましい。
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からクレ
アチンアミジノハイドロラーゼを採取することが好まし
い。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、
超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の
破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如
き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、
トリトンＸ-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を
抽出する方法等により、菌体からクレアチンアミジノハ
イドロラーゼを採取するのが好ましい。
【００２５】このようにして得られた粗酵素液からクレ
アチンアミジノハイドロラーゼを単離するには、通常の
酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安
塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ
法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ
法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好まし
い。
アチンアミジノハイドロラーゼを単離するには、通常の
酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安
塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ
法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ
法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好まし
い。
【００２６】得られたクレアチンアミジノハイドロラー
ゼは、下記の酵素化学的性質及び理化学的性質を有す
る。 (1) 作用 １モルのクレアチンを加水分解し、１モルのザルコシン
と１モルの尿素を生成する。 (2) 基質特異性 クレアチンに基質特異性を有する。
ゼは、下記の酵素化学的性質及び理化学的性質を有す
る。 (1) 作用 １モルのクレアチンを加水分解し、１モルのザルコシン
と１モルの尿素を生成する。 (2) 基質特異性 クレアチンに基質特異性を有する。
【００２７】(3) 至適pH 緩衝液として、50 mM 酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH
4.0〜6.0）、50 mMリン酸緩衝液（pH 6.0〜7.5）及び5
0 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5〜9.0）を用い、各pHにお
ける本酵素の活性測定を行なった結果、図１に示す通り
であった。図１より、本酵素の至適pHは、7.0〜9.0と認
められた。 (4) 至適温度 後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行なっ
た結果、図２に示す通りであった。図２より、本酵素の
至適温度は、35〜45℃と認められた。
4.0〜6.0）、50 mMリン酸緩衝液（pH 6.0〜7.5）及び5
0 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5〜9.0）を用い、各pHにお
ける本酵素の活性測定を行なった結果、図１に示す通り
であった。図１より、本酵素の至適pHは、7.0〜9.0と認
められた。 (4) 至適温度 後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行なっ
た結果、図２に示す通りであった。図２より、本酵素の
至適温度は、35〜45℃と認められた。
【００２８】(5) pH安定性 緩衝液として、50 mM 酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（pH
4.0〜6.0）、50mMリン酸緩衝液（pH 6.0〜8.0）、50 m
M Tris-HCl緩衝液（pH 8.0〜9.0）、50 mM グリシン−N
aOH緩衝液（pH 9.0〜10.0）及び50mM CAPS緩衝液（pH1
0.0〜11.0)を用い、pH 4.0〜11.0において25℃で17時間
夫々処理した後、本酵素の残存活性を測定した結果、図
３に示す通りであった。図３より、安定pH域はpH 5.0〜
10.5であった。 (6) 熱安定性 50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）を用いて、各温度で30
分間処理した場合の熱安定性の結果は図４に示す通りで
あり、本酵素は、45℃程度迄安定であると認められた。
4.0〜6.0）、50mMリン酸緩衝液（pH 6.0〜8.0）、50 m
M Tris-HCl緩衝液（pH 8.0〜9.0）、50 mM グリシン−N
aOH緩衝液（pH 9.0〜10.0）及び50mM CAPS緩衝液（pH1
0.0〜11.0)を用い、pH 4.0〜11.0において25℃で17時間
夫々処理した後、本酵素の残存活性を測定した結果、図
３に示す通りであった。図３より、安定pH域はpH 5.0〜
10.5であった。 (6) 熱安定性 50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）を用いて、各温度で30
分間処理した場合の熱安定性の結果は図４に示す通りで
あり、本酵素は、45℃程度迄安定であると認められた。
【００２９】(7) 酵素活性測定法 本酵素の活性の測定は、下記条件下で行なった。なお、
１分間に１マイクロモルの尿素を生成する酵素活性を１
単位とする。 （試薬調製） １液；基質液） クレアチン6.63ｇを50mMリン酸緩衝液（pH7.7）500mlに
溶解する。 ２液；発色液） ρ−ジメチルアミノベンズアルデヒド10ｇを500mlの特
級エタノールに溶解し、レジン水575ml、濃塩酸75mlを
混合したものと混合する。
１分間に１マイクロモルの尿素を生成する酵素活性を１
単位とする。 （試薬調製） １液；基質液） クレアチン6.63ｇを50mMリン酸緩衝液（pH7.7）500mlに
溶解する。 ２液；発色液） ρ−ジメチルアミノベンズアルデヒド10ｇを500mlの特
級エタノールに溶解し、レジン水575ml、濃塩酸75mlを
混合したものと混合する。
【００３０】（測定手順） 1)１液 0.9 mlを37℃にて５分間プレインキュベーショ
ンする。 2)酵素液（１〜２U/ml程度に調整）0.1 mlを混合し、37
℃において10分間反応させる。 3)10分間の反応後、上記２液２mlを混合する。 4)２液と混合後、25℃にて20分間放置し、後に435 nmの
吸光度を測定する。（ODsample） 5)ブランク値の測定は、１液0.9 mlを37℃にて10分間イ
ンキュベーションした後、上記２液２mlを混合し、更に
酵素液0.1 mlを混合、25℃にて20分間放置し、その後43
5 nmの吸光度を測定することによって行なった。（ODbl
ank）
ンする。 2)酵素液（１〜２U/ml程度に調整）0.1 mlを混合し、37
℃において10分間反応させる。 3)10分間の反応後、上記２液２mlを混合する。 4)２液と混合後、25℃にて20分間放置し、後に435 nmの
吸光度を測定する。（ODsample） 5)ブランク値の測定は、１液0.9 mlを37℃にて10分間イ
ンキュベーションした後、上記２液２mlを混合し、更に
酵素液0.1 mlを混合、25℃にて20分間放置し、その後43
5 nmの吸光度を測定することによって行なった。（ODbl
ank）
【００３１】（活性の計算） Ｕ／ｍｌ＝△ＯＤ×18.06*×希釈倍率 （*尿素検量線より算出した係数）
【００３２】(8) 阻害剤 活性測定法における反応液に、夫々表１に示す金属塩を
添加して、その影響を調べた結果、表１に示す通りであ
り、AgNO3 、HgCl2 、CuSO4 等により本酵素は強く阻害
された。
添加して、その影響を調べた結果、表１に示す通りであ
り、AgNO3 、HgCl2 、CuSO4 等により本酵素は強く阻害
された。
【００３３】
【表１】 〔阻害試験結果〕 （基質中に添加） 阻害剤 終濃度（mM) 相対活性（％) なし 0 100 AgNO3 1 1 HgCl2 1 1.9 CuSO4 1 3.3
【００３４】 （酵素液中に添加） 阻害剤 終濃度（mM) 相対活性（％) なし 0 100 AgNO3 1 1 HgCl2 1 1.7 CuSO4 1 3.4
【００３５】(9) Km値 ラインウエーバー・バークのプロットから、Km値は 1.3
×10-2Ｍ（クレアチンに対して）であった。 (10)分子量 TSKgel G3000SWXLによるゲル濾過法で、 80,000±5000
であった。
×10-2Ｍ（クレアチンに対して）であった。 (10)分子量 TSKgel G3000SWXLによるゲル濾過法で、 80,000±5000
であった。
【００３６】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
【００３７】（実施例１） (1)アルカリゲネス・エスピー.KS-85染色体の調製 アルカリゲネス・エスピー.KS-85(FERM BP-4487)をTY培
地（１％バクトートリプトン、0.5 ％ペプトン、0.25％
NaCl）200mlに接種して、30℃で20時間振とう培養し培
養物を得た。この培養物を6000rpmで10分間遠心分離す
ることにより集菌して菌体を得た。この菌体を25mlのソ
ルビトール溶液(0.9M ソルビトール、0.1Mトリス塩酸 p
H8.0、0.1M EDTA)に懸濁した後、Current Protocols in
Molecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の
方法に従い、染色体ＤＮＡ500 μｇを得た。
地（１％バクトートリプトン、0.5 ％ペプトン、0.25％
NaCl）200mlに接種して、30℃で20時間振とう培養し培
養物を得た。この培養物を6000rpmで10分間遠心分離す
ることにより集菌して菌体を得た。この菌体を25mlのソ
ルビトール溶液(0.9M ソルビトール、0.1Mトリス塩酸 p
H8.0、0.1M EDTA)に懸濁した後、Current Protocols in
Molecular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の
方法に従い、染色体ＤＮＡ500 μｇを得た。
【００３８】(2) ＤＮＡライブラリーの作製 上記染色体ＤＮＡ100μｇを常法に従いEcoRＩ(宝酒造社
製）により部分分解した後、アガロースゲル電気泳動に
より２〜５kb画分の断片を10μｇを得た。プラスミドＤ
ＮＡベクター pUC118(宝酒造社より入手）１μｇのEcoR
Ｉ消化物と上記で得られた染色体ＤＮＡのEcoRＩ消化物
２μｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）１ユニットで連結し、得られたプラスミドをD.
M.Morrisonの方法（Method in Enzymology,68,326-331,
1979)に従って大腸菌JM109株を形質転換した結果、600
個のコロニーを得、アマシャム社のプロトコールに従っ
てナイロンメンブレンフィルターHybond-N+（アマシャ
ム社製）へブロッティングした。
製）により部分分解した後、アガロースゲル電気泳動に
より２〜５kb画分の断片を10μｇを得た。プラスミドＤ
ＮＡベクター pUC118(宝酒造社より入手）１μｇのEcoR
Ｉ消化物と上記で得られた染色体ＤＮＡのEcoRＩ消化物
２μｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）１ユニットで連結し、得られたプラスミドをD.
M.Morrisonの方法（Method in Enzymology,68,326-331,
1979)に従って大腸菌JM109株を形質転換した結果、600
個のコロニーを得、アマシャム社のプロトコールに従っ
てナイロンメンブレンフィルターHybond-N+（アマシャ
ム社製）へブロッティングした。
【００３９】(3)コロニーハイブリダイゼーションによ
るクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子の単離 フラボバクテリウム属由来のクレアチンアミジノハイド
ロラーゼ遺伝子を含むpKL501（特開昭62-205786号公報
記載）を、SplＩ及びSmaＩ両制限酵素にて部分分解し、
通常のアガロースゲル電気泳動法によりクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼ遺伝子部分(1.2kb)を切り出し、GEN
ECLEAN II（フナコシ(株)製）にて精製した。得られた
遺伝子断片の末端に対し、DIG-Labeling Kit (ベーリン
ガーマンハイム社製）を用いてジコギシゲニン標識を行
ない、コロニーハイブリダイゼーションのプローブとし
た。Current Protocols in Molecular Biology(WILEY I
ntersciense,1989) 記載の方法に従い、コロニーハイブ
リダイゼーションを行ない、ポジティブコロニー２株を
得た。
るクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子の単離 フラボバクテリウム属由来のクレアチンアミジノハイド
ロラーゼ遺伝子を含むpKL501（特開昭62-205786号公報
記載）を、SplＩ及びSmaＩ両制限酵素にて部分分解し、
通常のアガロースゲル電気泳動法によりクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼ遺伝子部分(1.2kb)を切り出し、GEN
ECLEAN II（フナコシ(株)製）にて精製した。得られた
遺伝子断片の末端に対し、DIG-Labeling Kit (ベーリン
ガーマンハイム社製）を用いてジコギシゲニン標識を行
ない、コロニーハイブリダイゼーションのプローブとし
た。Current Protocols in Molecular Biology(WILEY I
ntersciense,1989) 記載の方法に従い、コロニーハイブ
リダイゼーションを行ない、ポジティブコロニー２株を
得た。
【００４０】(4)クレアチンアミジノハイドロラーゼ遺
伝子の解析 単離したポジティブコロニー２株の内、１株よりクレア
チンアミジノハイドロラーゼ遺伝子が含まれるプラスミ
ドＤＮＡを超遠心法にて調製し、EcoRＩで切断したとこ
ろ、約2.5kbのアルカリゲネス属由来の染色体ＤＮＡ断
片が挿入されていることが判った。そこで、このプラス
ミドＤＮＡについてKilo-Seaqence用deletion kit（宝
酒造社製）及び370DNA Seaqencing System（アプライド
バイオシステム社製）を用いて塩基配列の決定を行なっ
た。決定した塩基配列を配列番号１に、また、該ＤＮＡ
配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列
番号２に夫々示した。クレアチンアミジノハイドロラー
ゼ遺伝子は、1215のコーディング領域をもち、404のア
ミノ酸をコードしていた。
伝子の解析 単離したポジティブコロニー２株の内、１株よりクレア
チンアミジノハイドロラーゼ遺伝子が含まれるプラスミ
ドＤＮＡを超遠心法にて調製し、EcoRＩで切断したとこ
ろ、約2.5kbのアルカリゲネス属由来の染色体ＤＮＡ断
片が挿入されていることが判った。そこで、このプラス
ミドＤＮＡについてKilo-Seaqence用deletion kit（宝
酒造社製）及び370DNA Seaqencing System（アプライド
バイオシステム社製）を用いて塩基配列の決定を行なっ
た。決定した塩基配列を配列番号１に、また、該ＤＮＡ
配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列
番号２に夫々示した。クレアチンアミジノハイドロラー
ゼ遺伝子は、1215のコーディング領域をもち、404のア
ミノ酸をコードしていた。
【００４１】(5)形質転換株大腸菌JM109（pUCE100)の作
製 先ず、特開平5-317055号公報に記載の方法により発現ベ
クターpUTE100を作製した。具体的には、プラスミドベ
クターpBR322ＤＮＡをEcoRＩ及びNruＩで切断消化後、D
NA Blunting Kit（宝酒造社製）で平滑末端とした後、
常法に従いアガロースゲル電気泳動を行い、GENECLEAN
II（フナコシ(株)製）により複製起点を含む約3.4 kbの
ＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片はＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより環状にした後、EcoRＩ切断を行ない、
直鎖にした。次いで、以下に示すような大腸菌ラクトー
スオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及
びリボソーム結合部位等の発現調節領域並びにHpaI切断
部位を含むＤＮＡ配列（The Operon,p.227,Cold Spring
Harbor Laboratory,1980 を参照）：
製 先ず、特開平5-317055号公報に記載の方法により発現ベ
クターpUTE100を作製した。具体的には、プラスミドベ
クターpBR322ＤＮＡをEcoRＩ及びNruＩで切断消化後、D
NA Blunting Kit（宝酒造社製）で平滑末端とした後、
常法に従いアガロースゲル電気泳動を行い、GENECLEAN
II（フナコシ(株)製）により複製起点を含む約3.4 kbの
ＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片はＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより環状にした後、EcoRＩ切断を行ない、
直鎖にした。次いで、以下に示すような大腸菌ラクトー
スオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及
びリボソーム結合部位等の発現調節領域並びにHpaI切断
部位を含むＤＮＡ配列（The Operon,p.227,Cold Spring
Harbor Laboratory,1980 を参照）：
【００４２】
【外１】
【００４３】をDNA Synthesizer Model 392 (Applied B
iosystems 社製）で合成し、上記で得られたEcoRＩ切断
と連結して発現ベクターpUTE100を作製した。次いで、
クレアチンアミジノハイドロラーゼのＮ末端及びＣ末端
アミノ酸配列に対応する夫々配列番号３及び配列番号４
の塩基配列のオリゴヌクレオチドをDNA Synthesizer Mo
del 392(アプライドバイオシステム社製）で合成してプ
ライマーとし、上記で得られた組み換え体プラスミドＤ
ＮＡのEcoRＩ消化物を鋳型にしてGeneamp DNA Amplific
ation Reagent Kit with AmpliTaq(宝酒造社製）を用い
たPCR法によりクレアチンアミジノハイドロラーゼコー
ディング領域のみを合成した後、上記発現プラスミドベ
クターpUTE100 ＤＮＡのHpaＩ部位に挿入し、組み換え
体プラスミドpUCE100 ＤＮＡを得た。
iosystems 社製）で合成し、上記で得られたEcoRＩ切断
と連結して発現ベクターpUTE100を作製した。次いで、
クレアチンアミジノハイドロラーゼのＮ末端及びＣ末端
アミノ酸配列に対応する夫々配列番号３及び配列番号４
の塩基配列のオリゴヌクレオチドをDNA Synthesizer Mo
del 392(アプライドバイオシステム社製）で合成してプ
ライマーとし、上記で得られた組み換え体プラスミドＤ
ＮＡのEcoRＩ消化物を鋳型にしてGeneamp DNA Amplific
ation Reagent Kit with AmpliTaq(宝酒造社製）を用い
たPCR法によりクレアチンアミジノハイドロラーゼコー
ディング領域のみを合成した後、上記発現プラスミドベ
クターpUTE100 ＤＮＡのHpaＩ部位に挿入し、組み換え
体プラスミドpUCE100 ＤＮＡを得た。
【００４４】D.M.Morrisonの方法（Method in Enzymolo
gy,68,326-331,1979)に従い、組み換え体プラスミドＤ
ＮＡpUCE100を用いて大腸菌JM109（東洋紡社製）を形質
転換し、形質転換株、大腸菌(E.coli) JM109 (pUCE100)
を得た。なお、該株は工業技術院生命工学工業技術研究
所にFERM BP-4803として寄託されている。得られた大腸
菌 JM109 (pUCE100)を、1mMイソプロピル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドを含むTY培地（１％バクトートリプトン、0.
5 ％バクトーイースト・エクストラクト、0.5％NaCl、p
H7.0）にて16時間振とう培養した後、前述した酵素活性
測定法によりクレアチンアミジノハイドロラーゼ活性を
測定し、尿素の検量線に基づき活性の算出を行なったと
ころ、1.1U/mlであった。
gy,68,326-331,1979)に従い、組み換え体プラスミドＤ
ＮＡpUCE100を用いて大腸菌JM109（東洋紡社製）を形質
転換し、形質転換株、大腸菌(E.coli) JM109 (pUCE100)
を得た。なお、該株は工業技術院生命工学工業技術研究
所にFERM BP-4803として寄託されている。得られた大腸
菌 JM109 (pUCE100)を、1mMイソプロピル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドを含むTY培地（１％バクトートリプトン、0.
5 ％バクトーイースト・エクストラクト、0.5％NaCl、p
H7.0）にて16時間振とう培養した後、前述した酵素活性
測定法によりクレアチンアミジノハイドロラーゼ活性を
測定し、尿素の検量線に基づき活性の算出を行なったと
ころ、1.1U/mlであった。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、培地中にクレアチンを
添加することなく、クレアチンアミジノハイドロラーゼ
を効率よく生産することができる。
添加することなく、クレアチンアミジノハイドロラーゼ
を効率よく生産することができる。
【００４６】
配列番号 １ 配列の長さ：1215 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes s
p.）KS-85 株名：FREM BP-4487 配列： 54 ATG ACT GAC GAC ATG TTG CAC GTG ATG AAA TGG CAC AAC GGC GAA AAA GAT TAT 108 TCG CCG TTT TCG GAT GCC GAG ATG ACC CGC CGC CAA AAC GAC GTT CGC GGC TGG 162 ATG GCC AAG AAC AAT GTC GAT GCG GCG CTG TTC ACC TCT TAT CAC TGC ATC AAC 216 TAC TAT TCC GGC TGG CTG TAC TGC TAT TTC GGA CGC AAG TAC GGC ATG GTC ATC 270 GAC CAC AAC AAC GCC ACG CCG ATT TCG GCC GGC ATC GAC GGC GGC CAG CCC TGG 324 CGC CGC AGC TTC GGC GAC AAC ATT ACC TAC ACC GAC TGG CGC CGC GAC ATT TTC 378 TAT CGC GCC GTG GCG CAG CTG ACC ACG GGC GCC AAG CGC ATC GGC ATC GAG TTC 432 GAC CAC GTC AAT CTC GAC TTC CGC CGC CAG CTC GAG GAA AAC CTA CCG GGC GTC 486 GAG TTC GTC GAC ATC AGC CAG CCC TCG ATG TGG ATG CGC ACC ATC AAG TCG CTC 540 GAA GAG CAG AAG CTG ATC CGC GAA GGC GCC CGC GTG TGT GAC GTC GGC GGC GCG 594 GCC TGC GCG GCT GCC ATC AAG GCC GGC GTG CCC GAG CAT GAC ATG GCG ATC GCC 648 ACC ACC AAT GCG ATG ATC CGC GAG ATC GCC AAA TCG TTC CCC TTC GTG GAG CTG 702 ATG GAC ACC TGG ACC TGG TTC CAG TCG GGC ATC AAC ACC GAC GGC GCG CAC AAT 756 CCG GTC ACC AAC CGC ATC GTG CAA TCC GGC GAC ATC CTT TCG CTC AAC ACC TTC 810 CCG ATG ATC TTC GGC TAC TAC AAC CCG CTG GAG CGC ACG CTG TTC TGC GAC CAT 864 GTC GAT GAC GCC AGC CTC GAC ATC TGG GAG AAG AAC GTG GCC GTG CAT CGC CGC 918 GGG CTC GAG CTG ATC AAG CCG GGC GCG CGC TGC AAG GAC ATC GCC ATC GAG CTC 972 AAC GAG ATG TAC CGC GAG TGG GAC CTG CTG AAG TAC CGC TCC TTC GGC TAT GGC 1026 CAC TCC TTC GGC GTG CTG TGC CAC TAC TAC GGT CGC GAG GCG GGC GTG GAG CTG 1080 CGC GAG GAC ATC GAC ACC GAG CTG AAG CCC GGC ATG GTG GTC TCC ATG GAG CCG 1134 ATG GTG ATG CTG CCG GAG GGC ATG CCC GGT GCC GGC GGC TAT CCC GAG CAC GAC 1188 ATC CTG ATC GTC GGG GAG GAC GGT GCC GAG AAC ATC ACC GGC TTC CCG TTC GGT 1215 CCG GAA CAC AAC ATC ATC CGC AAC TGA
p.）KS-85 株名：FREM BP-4487 配列： 54 ATG ACT GAC GAC ATG TTG CAC GTG ATG AAA TGG CAC AAC GGC GAA AAA GAT TAT 108 TCG CCG TTT TCG GAT GCC GAG ATG ACC CGC CGC CAA AAC GAC GTT CGC GGC TGG 162 ATG GCC AAG AAC AAT GTC GAT GCG GCG CTG TTC ACC TCT TAT CAC TGC ATC AAC 216 TAC TAT TCC GGC TGG CTG TAC TGC TAT TTC GGA CGC AAG TAC GGC ATG GTC ATC 270 GAC CAC AAC AAC GCC ACG CCG ATT TCG GCC GGC ATC GAC GGC GGC CAG CCC TGG 324 CGC CGC AGC TTC GGC GAC AAC ATT ACC TAC ACC GAC TGG CGC CGC GAC ATT TTC 378 TAT CGC GCC GTG GCG CAG CTG ACC ACG GGC GCC AAG CGC ATC GGC ATC GAG TTC 432 GAC CAC GTC AAT CTC GAC TTC CGC CGC CAG CTC GAG GAA AAC CTA CCG GGC GTC 486 GAG TTC GTC GAC ATC AGC CAG CCC TCG ATG TGG ATG CGC ACC ATC AAG TCG CTC 540 GAA GAG CAG AAG CTG ATC CGC GAA GGC GCC CGC GTG TGT GAC GTC GGC GGC GCG 594 GCC TGC GCG GCT GCC ATC AAG GCC GGC GTG CCC GAG CAT GAC ATG GCG ATC GCC 648 ACC ACC AAT GCG ATG ATC CGC GAG ATC GCC AAA TCG TTC CCC TTC GTG GAG CTG 702 ATG GAC ACC TGG ACC TGG TTC CAG TCG GGC ATC AAC ACC GAC GGC GCG CAC AAT 756 CCG GTC ACC AAC CGC ATC GTG CAA TCC GGC GAC ATC CTT TCG CTC AAC ACC TTC 810 CCG ATG ATC TTC GGC TAC TAC AAC CCG CTG GAG CGC ACG CTG TTC TGC GAC CAT 864 GTC GAT GAC GCC AGC CTC GAC ATC TGG GAG AAG AAC GTG GCC GTG CAT CGC CGC 918 GGG CTC GAG CTG ATC AAG CCG GGC GCG CGC TGC AAG GAC ATC GCC ATC GAG CTC 972 AAC GAG ATG TAC CGC GAG TGG GAC CTG CTG AAG TAC CGC TCC TTC GGC TAT GGC 1026 CAC TCC TTC GGC GTG CTG TGC CAC TAC TAC GGT CGC GAG GCG GGC GTG GAG CTG 1080 CGC GAG GAC ATC GAC ACC GAG CTG AAG CCC GGC ATG GTG GTC TCC ATG GAG CCG 1134 ATG GTG ATG CTG CCG GAG GGC ATG CCC GGT GCC GGC GGC TAT CCC GAG CAC GAC 1188 ATC CTG ATC GTC GGG GAG GAC GGT GCC GAG AAC ATC ACC GGC TTC CCG TTC GGT 1215 CCG GAA CAC AAC ATC ATC CGC AAC TGA
【００４７】配列番号 ２ 配列の長さ：404 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： 5 10 15 Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu 20 25 30 Lys Asp Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln 35 40 45 Asn Asp Val Arg Gly Trp Met Ala Lys Asn Asn Val Asp Ala Ala 50 55 60 Leu Phe Thr Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu 65 70 75 Tyr Cys Tyr Phe Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp His Asn 80 85 90 Asn Ala Thr Pro Ile Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp 95 100 105 Arg Arg Ser Phe Gly Asp Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg 110 115 120 Asp Asn Phe Tyr Arg Ala Val Ala Gln Leu Thr Thr Gly Ala Lys 125 130 135 Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His Val Asn Leu Asp Phe Arg Arg 140 145 150 Gln Leu Glu Glu Asn Leu Pro Gly Val Glu Phe Val Asp Ile Ser 155 160 165 Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Ile Lys Ser Leu Glu Glu Gln 170 175 180 Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Val Cys Asp Val Gly Gly Ala 185 190 195 Ala Cys Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gly Val Pro Glu His Asp Met 200 205 210 Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Ile Arg Glu Ile Ala Lys Ser 215 220 225 Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln Ser 230 235 240 Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile 245 250 255 Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile 260 265 270 Phe Gly Tyr Tyr Asn Pro Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His 275 280 285 Val Asp Asp Ala Ser Leu Asp Ile Trp Glu Lys Asn Val Ala Val 290 295 300 His Arg Arg Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys 305 310 315 Asp Ile Ala Ile Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu 320 325 330 Leu Lys Tyr Arg Ser Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu 335 340 345 Cys His Tyr Tyr Gly Arg Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp 350 355 360 Ile Asp Thr Glu Leu Lys Pro Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro 365 370 375 Met Val Met Leu Pro Glu Gly Met Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Pro 380 385 390 Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu Asp Gly Ala Glu Asn Ile 395 400 405 Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn Ile Ile Arg Asn *
【００４８】配列番号 ３ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： ATG ACT GAC GAC ATG TTG CAC GTG ATG AAA
【００４９】配列番号 ４ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： TCA GTT GCG GAT GAT GTT GTG TTC CGG ACC
【図１】本発明の方法によって得られたクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼの至適pHを示す図である。
ジノハイドロラーゼの至適pHを示す図である。
【図２】本発明の方法によって得られたクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼの至適温度を示す図である。
ジノハイドロラーゼの至適温度を示す図である。
【図３】本発明の方法によって得られたクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼのpH安定性を示す図である。
ジノハイドロラーゼのpH安定性を示す図である。
【図４】本発明の方法によって得られたクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼの熱安定性を示す図である。
ジノハイドロラーゼの熱安定性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 小山 泰二 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内
Claims (3)
- 【請求項１】 配列番号２記載のアミノ酸配列をコード
する新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１記載のクレアチンアミジノハイ
ドロラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特
徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項２記載の組み換え体ＤＮＡを含
み、クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を有する
エッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養
物からクレアチンアミジノハイドロラーゼを採取するこ
とを特徴とするクレアチンアミジノハイドロラーゼの製
造法。
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