JPH0889266A - Ｌ−γ−グルタミルアミド化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｌ−グルタミン等のＬ−γ−グルタミル基供
与体とアミノ酸、アミン等のアミノ基を有する化合物と
から、Ｌ−γ−グルタミルペプチド、Ｌ−γ−グルタミ
ルアルキルアミド等のＬ−γ−グルタミルアミド化合物
を生成する能力を有する微生物の菌体または菌体処理物
を、Ｌ−γ−グルタミル基供与体化合物とアミノ基を有
する化合物に作用せしめ、Ｌ−γ−グルタミルアミド化
合物を採取することを特徴とするＬ−γ−グルタミルア
ミド化合物の製造方法。 【効果】 本発明によれば、Ｌ−グルタミン等のＬ−γ
−グルタミル基供与体とアミノ酸、アミン等のアミノ基
を有する化合物とから、Ｌ−γ−グルタミルペプチド、
Ｌ−γ−グルタミルアルキルアミド等のＬ−γ−グルタ
ミルアミド化合物を安価かつ簡便に製造することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−γ−グルタミルア
ミド化合物の製造方法に関する。Ｌ−γ−グルタミル化
合物の一種であるＬ−γ−グルタミルエチルアミド（以
下テアニンという）は、玉露のうま味の主成分として知
られている。また、テアニンのエチル基の代わりに他の
置換基（メチル、プロピル、ブチル、ベンジル基等）を
導入したテアニン誘導体は神経成長因子（NGF）合成促
進活性を持つことが報告されている（1994年度日本農芸
化学会大会講演要旨集P537）。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−γ−グルタミルアミド化合物
の製造方法としては、シュードモナス属に属する微生物
の菌体を用いた方法（特開平5-68578）、バチルス属由
来のグルタミナーゼを用いた方法（特開平5-284983）、
大腸菌のγ−グルタミルトランスペプチダーゼを用いた
方法（Journal of Bacteriology,Vol.168,No.3）が知ら
れている。しかしながら、それ以外の微生物では知られ
ていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
かつ簡便にＬ−γ−グルタミルアミド化合物を製造する
方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、安価かつ
簡便なＬ−γ−グルタミルアミド化合物の製造方法を開
発するために鋭意検討を重ねた結果、アクロモバクター
属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属
またはキサントモナス属に属する微生物がＬ−グルタミ
ン等のL-γ-グルタミル基を有する化合物とアミノ酸、
アミン等のアミノ基を有する化合物とから、Ｌ−γ−グ
ルタミルペプチド、Ｌ−γ−グルタミルアルキルアミド
等のＬ−γ−グルタミルアミド化合物を生成することを
見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、下記一般式（１）で
表す、Ｌ−γ−グルタミン等のＬ−γ−グルタミル基供
与体と下記一般式（２）で表す、アミノ酸、アミン等の
アミノ基を有する化合物（Ｌ−γ−グルタミル基受容
体）とから、下記一般式（３）で表す、Ｌ−γ−グルタ
ミルペプチド、Ｌ−γ−グルタミルアルキルアミド等の
Ｌ−γ−グルタミルアミド化合物の製造方法を提供する
ものである。

【０００６】

【化４】

【０００７】

【化５】

【０００８】

【化６】 （式中、Ｒ¹は、水素原子または置換基を有していても
よいアルキル基、アルケニル基、アラルキル基もしくは
アリール基を示し、Ｒ²は、置換基を有していてもよい
アルキル基、アルケニル基、アラルキル基もしくはアリ
ール基を示し、Ｒ³は、水素原子または置換基を有して
いてもよいアルキル基、アルケニル基、アラルキル基も
しくはアリール基を示す。不斉炭素＊の立体配置は、Ｓ
である。）

【０００９】本発明に使用する微生物としては、Ｌ−グ
ルタミン等のＬ−γ−グルタミル基供与体とアミノ酸、
アミン等のアミノ基を有する化合物とから、Ｌ−γ−グ
ルタミルペプチド、Ｌ−γ−グルタミルアルキルアミド
等のＬ−γ−グルタミルアミド化合物を生成する能力を
有するアクロモバクター属、エンテロバクター属、クレ
ブシエラ属、セラチア属またはキサントモナス属に属す
る微生物であればいずれを用いてもよいが、具体的には
以下のものを例示することができる。 アクロモバクター・キシロシス（Achromobacter xerosi
s）IFO 12668 エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerog
enase）IFO 13534 クレブシエラ・ニュモニアエ（Klebsiella pneumonia
e）IFO 3319 セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）ATCC
14226 キサントモナス・マルトフィラ（Xanthomonas maltophi
lia）IFO 12692

【００１０】これらの微生物は、野生株または変異株の
いずれでもよいし、また、細胞融合もしくは遺伝子操作
等の遺伝学的手法により誘導される組換え株等も用いる
ことができる。

【００１１】このような微生物の菌体を得るには、当該
微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。そのよ
うな培地には格別の制限はなく、通常の炭素源、窒素
源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常
の培地でよい。

【００１２】炭素源としては、グルコ−ス等の炭水化
物、グリセロ−ル等のアルコ−ル類、アミノ酸、有機
酸、その他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が用
いられる。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、
リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイ
オン、その他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源
としては、ビタミン、アミノ酸等、及びこれらを含有す
る酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コ−ンスティ−プ
リカ−、カゼイン分解物、その他が適宜用いられる。

【００１３】培地には更にグルタミン酸を添加すること
により、Ｌ−γ−グルタミルアミド化合物を生成する活
性の高い菌体が得られる場合がある。

【００１４】培養条件にも格別の制限はなく、例えば、
好気的条件下にて、pH 5ないし8、温度25ないし40℃の
範囲内でpH及び温度を適当に制限しつつ12〜48時間程度
培養を行なえばよい。

【００１５】Ｌ−γ−グルタミル基供与体としては、例
えば、Ｌ−グルタミン、Ｌ−γ−グルタミル−ρ−ニト
ロアニリド、グルタチオン等を例示することができる
が、これに限定されない。また上記Ｌ−γ−グルタミル
基ドナーと反応させるアミノ基を有する化合物（Ｌ−γ
−グルタミル基受容体）としては、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｖ
ａｌ、γ−アミノ酪酸等の各種アミノ酸、エチルアミ
ン、ブチルアミン等のアルキルアミン、シクロヘキシル
アミン等のシクロアルキルアミン、ベンジルアミン等の
アラルキルアミン、グリシル−グリシン（Gly−Gly）等
のペプチドなどを用いることができる。

【００１６】テアニンを製造するには、Ｌ−γ−グルタ
ミル基供与体としては、Ｌ−グルタミンを使用すること
が好ましく、Ｌ−γ−グルタミル基受容体としては、エ
チルアミンを使用することが好ましい。

【００１７】上記微生物をＬ−γ−グルタミル基供与体
とＬ−γ−グルタミル基受容体に作用せしめる方法とし
ては、かくして得られる微生物培養物にＬ−γ−グルタ
ミル基供与体とＬ−γ−グルタミル基受容体を添加して
反応させる方法、微生物培養物から遠心分離等により菌
体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝
液に再懸濁したものにＬ−γ−グルタミル基供与体とＬ
−γ−グルタミル基受容体を添加して反応させる方法等
がある。また、微生物菌体の処理物として、菌体破砕
物、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体、あるいはポリア
クリルアミドゲル法、カラギーナン法、アルギン酸ゲル
法等の公知の方法で固定化した菌体も用いることもでき
る。更に、微生物菌体処理物としては菌体抽出物もしく
はこれより反応を触媒する酵素を単離して用いても良
い。

【００１８】菌体または菌体処理物の使用量は、所与の
反応の場合において目的とする効果を発揮する量（有効
量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な
予備実験により容易に求められるが、例えば洗浄湿潤菌
体の場合は反応液100ml当り1ないし40gである。

【００１９】Ｌ−γ−グルタミル基供与体とＬ−γ−グ
ルタミル基受容体との濃度は、1mMから10M、好ましくは
0.1Mないし2Mであるが、供与体に対して受容体を3ない
し5倍量用いる方が好ましい。また、必要ならば、例え
ば高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応の
間、これを追補することができる。

【００２０】反応温度は10ないし70℃、好ましくは20な
いし50℃であり、反応pHは5ないし12、好ましくは8ない
し11である。かくして10分ないし20時間程度反応を行な
うことにより、反応混合物中にＬ−γ−グルタミルアミ
ド化合物が生成蓄積する。

【００２１】このようにして生成蓄積したＬ−γ−グル
タミルアミド化合物は、合成吸着樹脂、イオン交換樹脂
を用いる方法等によって反応終了混合物より分離採取す
ることができる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に説明する。
なお、実施例におけるテアニン、並びにＬ−γ−グルタ
ミル−Gly−Glyの定量は高速液体クロマトグラフィー
（カラム：ダイセル化学社製クラウンパック(CR+)、溶
離液：ＨＣｌＯ₄水溶液（ＨＣｌＯ₄を蒸留水に溶解して
ｐH2.0としたもの）、流量：0.4ml/分、検出：UV200n
m）により行った。

【００２３】実施例１ 酵母エキス 1.0%、ポリペプトン 1.0%、グルコース 1.0
%、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄0.5%、ＫＨ₂ＰＯ₄ 0.1%、Ｋ₂ＨＰＯ
₄ 0.3%、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.05%、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ 0.001%、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ 0.001%、Ｌ−グルタミ
ン酸ナトリウム 0.5%から成る培地(pH 7.0)を500ml容フ
ラスコに50ml入れ、120℃で15分間加熱殺菌した。これ
に予めブイヨン寒天培地で30℃にて24時間培養して得た
表１に示す微生物の菌体を一白金耳量接種し、30℃にて
20時間振とう培養した。この培養液より菌体を遠心分離
し、培養液と同量の生理食塩水にて二回洗浄し、再び遠
心分離して菌体を集め、0.05Mホウ酸緩衝液(pH 10)に懸
濁し10mlとした。菌体懸濁液2mlをＬ−グルタミン0.5M
およびエチルアミン1.17Mを含む0.05Mホウ酸緩衝液(pH
10)3mlに添加し、全量を5mlとした後、30℃にて20時間
反応を行った。結果を表１に示した。

【００２４】

【表１】

【００２５】実施例２ 実施例１と同様にして得られた菌体を超音波処理によっ
て破砕し、遠心分離を行い、無細胞抽出液を得た。この
無細胞抽出液（タンパク含量2.0mg/ml）0.5mlを5mMの各
種Ｌ−γ−グルタミル基供与体（Ｌ−γ−グルタミル−
ρ−ニトロアニリド、Ｌ−グルタミン、グルタチオン）
と100mMのGly−Glyを含む50mMホウ酸緩衝液(pH 10) 0.5
mlに添加し、30℃にて反応を開始した。4時間後、1.5N
酢酸1mlを反応液に添加することにより反応を停止し、
生成したＬ−γ−グルタミル−Gly−Glyを定量した。そ
の結果を表2に示した。

【００２６】

【表２】

【００２７】実施例３ 実施例２と同様に表３、表４に示す微生物の無細胞抽出
液を調製した。この無細胞抽出液0.5mlを5mM Ｌ−γ−
グルタミル−ρ−ニトロアニリド、100mMの各種アミノ
酸あるいはアミンを含む50mMホウ酸緩衝液(pH 10) 0.5m
lに添加し、30℃にて反応を開始した。30分後、1.5N酢
酸1mlを反応液に添加することにより反応を停止し、反
応停止後、反応液を遠心分離し、その上清の410nmにお
ける吸光度を測定することにより、γ−グルタミル基転
移活性を測定した。Gly−Glyを受容体とした時のγ−グ
ルタミル基転移活性を100とし、各種受容体を用いた時
の相対活性を表３、表４に示した。

【００２８】

【表３】

【００２９】

【表４】

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−グルタミン等のＬ
−γ−グルタミル基を有する化合物とアミノ酸、アミン
等のアミノ基を有する化合物とから、Ｌ−γ−グルタミ
ルペプチド、Ｌ−γ−グルタミルアルキルアミド等のＬ
−γ−グルタミルアミド化合物を安価かつ簡便に製造す
ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:43） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:64）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記一般式（１）で表されるＬ−γ−グル
   タミル基供与体と下記一般式（２）で表されるアミノ基
   を有する化合物とから、下記一般式（３）で表されるＬ
   −γ−グルタミルアミド化合物を生成する能力を有し、
   アクロモバクター属、エンテロバクター属、クレブシエ
   ラ属、セラチア属またはキサントモナス属に属する微生
   物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体または該
   微生物菌体の処理物をＬ−γ−グルタミル基供与体とア
   ミノ基を有する化合物に作用せしめ、Ｌ−γ−グルタミ
   ルアミド化合物を採取することを特徴とするＬ−γ−グ
   ルタミルアミド化合物の製造方法。 【化１】 【化２】 【化３】 （式中、Ｒ¹は、水素原子または置換基を有していても
   よいアルキル基、アルケニル基、アラルキル基もしくは
   アリール基を示し、Ｒ²は、置換基を有していてもよい
   アルキル基、アルケニル基、アラルキル基もしくはアリ
   ール基を示し、Ｒ³は、水素原子または置換基を有して
   いてもよいアルキル基、アルケニル基、アラルキル基も
   しくはアリール基を示す。不斉炭素＊の立体配置は、Ｓ
   である。）
2. 【請求項２】Ｌ−γ−グルタミル基供与体がＬ−グルタ
   ミンであり、アミノ基を有する化合物がエチルアミンで
   あることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。