JPH0892286A - ポリペプチド、その製造法およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】下記式で表されるポリペプチド及びこれをコー
ドするＤＮＡ。 〔式中、４５、５２、５６、７０、７５および７６位の
システイン残基は、４５位と７６位、５２位と７０位、
および５６位と７５位との少なくとも一つの組合せの残
基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよ
い。〕カブトガニ血球内小顆粒画分をグアニジンとキレ
ート剤とを含む緩衝液で抽出し、抽出液を逆相高速液体
クロマトグラフィーに付し、アセトニトリル濃度勾配溶
出することによって得ることができる。また、ペプチド
合成により得ることもできる。また、カブトガニ血球か
ら単離したpoly (A)⁺ RNA より作成したｃＤＮＡライブ
ラリーから前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離
し、これをベクターに組込み遺伝子工学的手法により前
記ポリペプチドを得ることができる。 【効果】 デフェンシン類似の構造を有し、抗菌剤、殺
菌剤、防腐剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細菌（グラム陽性菌、
グラム陰性菌）や真菌等に対する抗菌活性等の生理活性
を有するポリペプチドおよびその製造法ならびに該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡに関する。本発明のポリペ
プチドは、強い抗菌活性を有するので、この性質を用い
て、様々な種類の微生物に対して有効な抗菌剤、殺菌剤
又は防腐剤として有用である。

【０００２】

【従来の技術】カブトガニは、その体内に一種類の血球
細胞を有している。細胞内は、密度の異なる大、小、二
種類の顆粒で満たされており、大顆粒画分には体液凝固
因子および抗リポ多糖因子、小顆粒画分にはタキプレシ
ンなどの抗菌性物質が含まれている。本発明者らは、先
にカブトガニの血球細胞中の小顆粒画分の成分として６
種類の蛋白質（Ｓ１〜Ｓ６）を分離している（Shigenag
a, T. ら，J. Biochem.114, 307-316 (1993))。

【０００３】一方、ヒト、ウサギ、モルモット、ラット
などのほ乳類の好中球やマクロファージの細胞内顆粒か
らは、デフェンシン（defensin）と総称される抗菌活性
を有するペプチド群が単離されており、米国特許第 524
2902号明細書には全アミノ酸配列が開示されている。ま
た、デフェンシンは、グラム陰性菌、グラム陽性菌およ
び真菌に対して抗菌活性を有することに加えて、上皮細
胞および繊維芽細胞増殖を促進する効果を有することが
同明細書に開示されている。デフェンシンに共通した構
造上の特徴としては、システイン残基を６個有し、ジス
ルフィド結合を３個有し、アミノ酸残基数が約３０個の
塩基性ペプチドであることが挙げられる。カブトガニの
血球細胞からデフェンシンに類似したアミノ酸配列を有
するポリペプチドが単離されたという報告はない。ま
た、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に対応した塩
基配列も知られていなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は種々の
生理活性を有する新規なポリペプチド、その製造法、用
途および該ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する
ことにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、先に分離
していたカブトガニ血球細胞の小顆粒画分の成分のう
ち、Ｓ５ペプチドについて全アミノ酸配列を決定したと
ころ、カルボキシ末端（Ｃ末端）側に、従来知られてい
るデフェンシンに類似した構造を持つことを見いだし
た。さらに、このＳ５ペプチドの抗菌活性を鋭意検索し
たところ、グラム陽性菌、グラム陰性菌および真菌のい
ずれに対しても強い抗菌活性を示すことを見いだし、本
発明に至った。すなわち、本発明は、次の１）〜６）で
示されるポリペプチド及び７）で示されるその製造法を
提供するものである。

【０００６】１）少なくとも次の〔式１〕で示されるア
ミノ酸配列の一次構造を含むポリペプチド、 AA1 AA2 Cys AA2 AA2 AA2 AA1 AA2 AA4 Cys 5 10 Arg Ser AA1 Cys Phe Arg AA1 Glu AA4 AA2 15 20 AA3 AA2 AA4 AA4 Ser Ala AA2 Cys Gly Arg 25 30 Tyr AA4 Cys Cys Arg AA2 AA1 〔式１〕 35 〔式中、AA1 は塩基性アミノ酸残基、AA2 は中性アミノ
酸残基、AA3 は酸性アミノ酸残基、AA4 は芳香族アミノ
酸残基をそれぞれ示す。ここで３、１０、１４、２８、
３３および３４位のシステイン残基は、３位と３４位、
１０位と２８位および１４位と３３位との少なくとも一
つの組合せの残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）
していてもよい〕。

【０００７】２）AA1 はArg 、Lys およびHis からなる
群から選ばれた塩基性Ｌ−アミノ酸残基、AA2 はGly 、
Ala 、Leu 、Val 、Ile 、Met 、Pro 、Asn 、Thr 、Se
r およびGln からなる群から選ばれた中性Ｌ−アミノ酸
残基、AA3 はAsp およびGlu からなる群から選ばれた酸
性Ｌ−アミノ酸残基、AA4 はTrp 、Tyr およびPhe から
なる群から選ばれた芳香族Ｌ−アミノ酸残基である上記
１）記載のポリペプチド。

【０００８】３）少なくとも次の〔式２〕で示されるア
ミノ酸配列の一次構造を含むポリペプチド、 His Ser Cys Ala Gly Asn Arg Gly Trp Cys 5 10 Arg Ser Lys Cys Phe Arg His Glu Tyr Val 15 20 Asp Thr Tyr Tyr Ser Ala Val Cys Gly Arg 25 30 Tyr Phe Cys Cys Arg Ser Arg 〔式２〕 35 〔式中、３、１０、１４、２８、３３および３４位のシ
ステイン残基は、３位と３４位、１０位と２８位、およ
び１４位と３３位との少なくとも一つの組合せの残基間
でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよい。〕

【０００９】４）〔式２〕の一次構造をカルボキシル末
端に有し、アミノ末端に疎水性ポリペプチド領域を有す
る抗菌性ポリペプチド、

【００１０】５）次の〔式３〕で示されるアミノ酸配列
の一次構造をもつポリペプチド、 Asn Pro Leu Ile Pro Ala Ile Tyr Ile Gly 1 5 10 Ala Thr Val Gly Pro Ser Val Trp Ala Tyr 15 20 Leu Val Ala Leu Val Gly Ala Ala Ala Val 25 30 Thr Ala Ala Asn Ile Arg Arg Ala Ser Ser 35 40 Asp Asn His Ser Cys Ala Gly Asn Arg Gly 45 50 Trp Cys Arg Ser Lys Cys Phe Arg His Glu 55 60 Tyr Val Asp Thr Tyr Tyr Ser Ala Val Cys 65 70 Gly Arg Tyr Phe Cys Cys Arg Ser Arg 〔式３〕 75 〔式中、４５、５２、５６、７０、７５および７６位の
システイン残基は、４５位と７６位、５２位と７０位、
および５６位と７５位との少なくとも一つの組合せの残
基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよ
い。〕

【００１１】６）カブトガニ血球内小顆粒画分をグアニ
ジンとキレート剤を含む緩衝液を用いて抽出し、抽出液
を逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、アセトニト
リルの濃度勾配溶出により溶離させることによって得ら
れうる画分に含まれ、次の物性値を示す抗菌性ポリペプ
チド、 (i) SDS-PAGEにより還元条件下で単一のバンドを示
す。 (ii) SDS-PAGEにより求めた分子量が約8,200 である
(還元条件下) 。 (iii) アミノ酸79個より構成される。 (iv) グラム陰性菌、グラム陽性菌および真菌に対して
抗菌性を示す。および

【００１２】７）カブトガニ血球内小顆粒画分を蛋白質
変性剤とキレート剤を含む緩衝液を用いて抽出し、抽出
液を逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、疎水性有
機溶媒によって溶出させることを特徴とする上記１）〜
６）のいずれかに記載のポリペプチドを採取することを
特徴とするポリペプチドの製造法。

【００１３】さらに、〔式３〕のポリペプチドを蛋白分
解酵素によって分解して得られるポリペプチドを提供す
るものである。そして〔式４〕で示されるアミノ酸配列
の一次構造をもつポリペプチド、および〔式５〕で示さ
れるアミノ酸配列の一次構造をもつポリペプチド、

【００１４】 Ala Ser Ser Asp Asn His Ser Cys Ala Gly 1 5 10 Asn Arg Gly Trp Cys Arg Ser Lys Cys Phe 15 20 Arg His Glu Tyr Val Asp Thr Tyr Tyr Ser 25 30 Ala Val Cys Gly Arg Tyr Phe Cys Cys Arg 35 40 Ser Arg 〔式４〕 〔式中、アミノ末端にＡｒｇが１個ペプチド結合してい
てもよく、また８、１５、１９、３３、３８および３９
位のシステイン残基は、８位と３９位、１５位と３３
位、および１９位と３８位との少なくとも一つの組合せ
の残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していても
よい。〕

【００１５】 Asn Pro Leu Ile Pro Ala Ile Tyr Ile Gly 1 5 10 Ala Thr Val Gly Pro Ser Val Trp Ala Tyr 15 20 Leu Val Ala Leu Val Gly Ala Ala Ala Val 25 30 Thr Ala Ala Asn Ile Arg 〔式５〕 35 〔式中、カルボキシル末端にArg がさらに１個ペプチド
結合していてもよい。〕を提供するものである。

【００１６】さらに本発明は、これらのポリペプチドま
たはその薬理的に許容される塩を有効成分とする抗菌剤
を提供することにある。

【００１７】さらに、〔式３〕で示されるポリペプチド
をコードする塩基配列を含む一本鎖のＤＮＡあるいは該
ＤＮＡと相補的なＤＮＡとからなる二本鎖のＤＮＡを提
供することにある。

【００１８】本発明の製造法において、原料のカブトガ
ニ血球内小顆粒画分とは、リムルス・ポリフェムス(Lim
ulus polyphemus）、タキプレウス・トリデンタツス
(Tachypleus tridentatus ）、タキプレウス・ギガス
（Tachypleus gigas)、カルシノスコルピウス・ロツン
ディカウダ(Carcinoscorpius rotundicauda）等のカブ
トガニの血液を採取し血球を分離後、さらにその血球細
胞内の小顆粒を分離したものである。

【００１９】具体的には、例えば分離したカブトガニ血
球に0.008Mトリス−塩酸緩衝液 (0.001Mプロプラノロー
ル、0.001Mフェニルメタンスルホニルフロライド（ＰＭ
ＳＦ）及び0.75M ショ糖含有，pH7.4)を加えて懸濁さ
せ、しばらく振とう後、遠心分離し、その上清にヘパリ
ン（終濃度40ＵＳＰ単位/ml)を加え、遠心分離し、上層
部を採取し、 1.5−2.4Mショ糖密度勾配液（0.008Mトリ
ス−塩酸緩衝液(pH7.4)、0.001MＰＭＳＦ及びヘパリン
（40ＵＳＰ単位／ml）含有）によって遠心分離 (112,00
0 ×ｇ、30分）し、下層を採取して小顆粒画分として使
用する。

【００２０】このようにして得られたカブトガニ血球内
小顆粒画分から 0.02Mトリス−塩酸緩衝液 (6Mグアニ
ジン及び0.002Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含
有、pH 8.0）などの適当な緩衝液を加えて超音波処理
し、37℃で１時間加温して抽出し、抽出物をTSK gel
Phenyl 5PW-RP(東ソー (株))を担体とする逆相ＨＰＬＣ
に付し、アセトニトリルの濃度勾配で溶出し、Ｓ５画分
を採取することによって本発明の抗菌性ポリペプチドを
得ることができる。の逆相ＨＰＬＣ工程によって得ら
れた溶出画分（Ｓ５）は、TSK gel ODS120T （東ソー
(株))を担体とする逆相ＨＰＬＣでさらに精製してもよ
い。なお、精製過程でのペプチド含量の測定は、波長21
4nm における紫外部吸収を測定することによって行うこ
とができる。

【００２１】また、本発明のポリペプチドは、それ自体
公知の方法、例えば液相合成法あるいは固相合成法（泉
屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇 道典、「ペプチド合
成の基礎と実験」1985、丸善（株））によって製造する
ことができる。例えば、〔式１〕のポリペプチドを、固
相合成法で製造する場合、アミノ酸配列の３７位がアル
ギニン残基のときは、Ｎ−保護アルギニンのカルボキシ
ル基を直接、或いは場合によりスペーサーを介して、ク
ロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹
脂に結合させて後、アミノ酸配列の３６位から１位まで
の各保護アミノ酸を固相合成法に従って順次結合し、次
いで不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱離させて、
直鎖状の〔式１〕のポリペプチドを得ることができる。
さらに、得られたポリペプチドの３位と３４位、１０位
と２８位，１４位と３３位の３対のシステインは、独立
してメルカプト基を介してジスルフイド結合（−Ｓ−Ｓ
−）を形成することができる。これらのジスルフイド結
合は、それ自体公知の方法、例えば、温和な空気酸化に
より形成することができる。

【００２２】本発明のポリペプチドを合成する場合に使
用される前記のクロロメチル基あるいはオキシメチル基
を有する不溶性樹脂及びスペーサー、場合によりＮ−保
護アミノ酸を該不溶性樹脂に結合したＮ−保護アミノ酸
樹脂等は、公知の方法で調製でき、各種のものが市販さ
れている。

【００２３】該不溶性樹脂としては、Ｃ末端のＮ−保護
アミノ酸のカルボキシル基と直接、或いは場合によりス
ペーサーを介して、結合可能であり、かつ、その後脱離
可能なものであれば如何なるものでもよい。かかる不溶
性樹脂としては、例えば、Ｂｏｃ（t-ブチルオキシカル
ボニル）ストラテジーの場合は、クロロメチル樹脂（ク
ロロメチル化スチレン- ジビニルベンゼン共重合体）、
オキシメチル樹脂あるいはスペーサーを導入した４−オ
キシメチル−Ｐａｍ（フェニルアセタミドメチル）−樹
脂が、Ｆmoc （９−フルオレニルメチルオキシカルボニ
ル）ストラテジーの場合は、オキシメチルフェノキシメ
チル樹脂（Ｗａｎｇ）樹脂及びこれらの誘導体等が好ま
しい。

【００２４】保護アミノ酸とは、官能基を公知の方法に
より保護基で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミ
ノ酸が市販されている。本発明のポリペプチドを合成す
る場合には、以下に示す保護基のいずれかを選択するの
が好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基は
Ｂｏｃ（t-ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ (９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル）である。アル
ギニン（Ａｒｇ）のグアニジノ基の保護基は、Ｔｏｓ
（トシル）、ＮＯ₂ （ニトロ）、Ｍｔｒ（４−メトキシ
−２, ３, ６−トリメチル ベンゼンスルホニル）又は
Ｐｍｃ（２, ２,５, ７, ８- ペンタメチルクロマン−
６−スルホニル）である。リジン（Ｌｙｓ）のε−アミ
ノ基の保護基は、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、Ｃ
l ・Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｏ
ｃ、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフエニ
ル）である。ヒスチジン（Ｈｉｓ）のイミダゾリル基の
保護基は、Ｔｏｓ、Ｚ、Ｐａｃ（フェナシル）、Ｂｏｍ
（ベンジルオキシメチル）、Ｄｎｐ（ジニトロフェニ
ル）又はＴｒｔ（トリチル）である。システイン（Ｃｙ
ｓ）のメルカプト基の保護基としてはＢｚｌ (ベンジ
ル）、ＭＢｚｌ (４−メトキシベンジル）、４−Ｍe Ｂ
ｚｌ（４−メチルベンジル）、Ａｃｍ（アセタミドメチ
ル）、Ｔｒｔ、Ｎｐｙｓ、t-Ｂｕ (t-ブチル）、t-Ｂｕ
Ｓ（t-ブチルチオ）が挙げられるが、ＭＢｚｌ、４−Ｍ
e Ｂｚｌ、Ｔｒｔ、Ａｃｍ、Ｎｐｙｓが好ましい。チロ
シン（Ｔｙｒ）の水酸基の保護基は、Ｂｚｌ、Ｃl2・Ｂ
ｚｌ（２, ６−ジクロロベンジル）、t-Ｂｕであるか、
あるいは保護しなくてもよい。トリプトファン（Ｔｒ
ｐ）のインドール基の保護基はＣＨＯ（フォルミル）で
あるか、あるいは無保護でもよい。メチオニン（Ｍｅ
ｔ）のチオメチル基の保護基は、メチルスルホキシドで
あるか、あるいは保護しなくてもよい。セリン（Ｓｅ
ｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）の水酸基の保護基は、
Ｂｚｌ又はｔ−Ｂｕである。アスパラギン酸（Ａｓｐ）
およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）のカルボキシル基の保護
基は、ＯＢｚｌ（ベンジルエステル）、ＯｔＢｕ（ｔ−
ブチルエステル）、ＯｃＨｅｘ（シクロヘキシルエステ
ル）、ＯＰａｃ（フェナシルエステル）等が挙げられ
る。アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌ
ｎ）のカルバミド基の保護基は、ＴｒｔまたはＸａｎ
（キサンチル）である。各保護基は、ペプチドの合成条
件に応じ適当なものをそれ自体公知の中から選択するこ
とが好ましい。

【００２５】保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例
えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、
ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）法［Ｔ
artar.Ａら；Ｊ．Ｏrg．Ｃhem.，44、5000（1979）］、
活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボ
ニルジイミダゾール法、ＤＣＣ- ＨＯＢt(１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール）法［Ｋeonig 、Ｗら；Ｃhem.Ｂ
er.,103 、788 、2024、2034（1970）］、ジフエニルホ
スホリルアジド法、ＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾリル−
Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキ
サフルオロリン化物塩）を用いるＢＯＰ−ＨＯＢｔ法
（Hudson, D., J. Org. Chem.,53, 617(1988))、ＨＢＴ
Ｕ（2-(1H)- ベンゾトリアゾ−ル-1- イル)-1,1,3,3-テ
トラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート）
−ＨＯＢｔ法（Knorr,R.ら, Tetrahedron Lett., 30, 1
927 (1989)）、ＴＢＴＵ（2-(1H)- ベンゾトリアゾール
-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム テトラフ
ルオロボレイト）−ＨＯＢｔ法（Knorr, R. ら, Tetrah
edron Lett., 30, 1927 (1989)）等に従って行なうこと
ができる。しかしこれらのうち、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−Ｈ
ＯＢt 法、ＢＯＰ−ＨＯＢｔ法、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ
法、対称酸無水物法が好ましい。

【００２６】これらの縮合反応は、通常、ジクロロメタ
ン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロ
リドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中
で行なわれる。α- アミノ基の保護基の脱離試薬として
は、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン、ＨＣl ／ジオ
キサン、ピペリジン／ＤＭＦ又はピペリジン／ＮＭＰ等
が用いられ、該保護基の種類により適宜選択する。ま
た、合成の各段階における縮合反応の進行の程度はＥ．
カイサーらの方法[Anal. Biochem., 34, 595(1970) ］
（ニンヒドリン反応法）によって検査される。以上のよ
うにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹
脂を得ることができる。

【００２７】保護ペプチド樹脂は、フッ化水素、ＴＦＭ
ＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）［Aademic Pres
s 発行、E. Gross編集、Ｙajima ，Ｈら; " The Peptid
es "５、65(1983)］、ＴＭＳＯＴf （トリメチルシリル
トリフラート）［ Fujii、Nら； J. Chem．Soc., Chem.
Commun., 274 (1987) ］、ＴＭＳＢr(トリメチルシリ
ルブロミド）[Fujii、N ら； Chem. Pharm. Bull.,35、
3880 (1987) ］、またはトリフルオロ酢酸などで処理す
ることにより、該樹脂および保護基を同時に脱離させる
ことができる。上記の脱離試薬は、該ストラテジー（Ｂ
oc又はＦmoc)、該樹脂、該保護基の種類により適宜選択
する。

【００２８】次いで、所望により、２- メルカプトエタ
ノール、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）などで還元する
ことによりシステインのメルカプト基が還元型となって
いることを確実ならしめた後、酸化処理することにより
ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合の環状ポリペプチドを
得ることができる。この際の酸化処理は、公知の方法を
用いることができ、通常、大気中の酸素やフエリシアン
酸塩（例えば、フエリシアン化カリウム）のような酸化
剤を用いる。かくして得られたポリペプチドは、該ポリ
ペプチド関連分野で知られた手段、例えば、抽出、再結
晶、各種クロマトグラフイー（ゲルろ過、イオン交換、
分配、吸着、逆相）、電気泳動、向流分配等により単離
精製することができるが、逆相高速液体クロマトグラフ
イーによる方法が最も効果的である。

【００２９】本明細書のポリペプチドのアミノ酸残基は
国際的に認められた三文字表示による記号で示す。すな
わち各記号は下記アミノ酸の残基を示す。 Ｈｉｓ； ヒスチジン Ｓｅｒ； セリン Ｃｙｓ； システイン Ａｌａ； アラニン Ｇｌｙ； グリシン Ａｓｎ； アスパラギン Ａｒｇ； アルギニン Ｔｒｐ； トリプトフアン Ｌｙｓ； リジン Ｐｈｅ； フェニルアラニン Ｇｌｕ； グルタミン酸 Ｔｙｒ； チロシン Ｖａｌ； バリン Ａｓｐ； アスパラギン酸 Ｔｈｒ； トレオニン Ｌｅｕ； ロイシン Ｉｌｅ； イソロイシン Ｍｅｔ； メチオニン Ｐｒｏ； プロリン Ｇｌｎ； グルタミン

【００３０】また、本発明のポリペプチドの誘導体とし
て、ジスルフィド結合せずに存在しているシステイン残
基またはジスルフィド結合を公知の方法（ジチオスレイ
トール等の還元剤で還元する方法等）で還元して得られ
たシステイン残基を公知の方法（ヨード酢酸等を使用す
る方法等）でカルボキシメチル化したポリペプチド誘導
体もグラム陰性菌およびグラム陽性菌に対し、強い抗菌
活性を示す。次に、本発明のポリペプチド断片は、本発
明の上記〔式３〕のポリペプチドをトリプシン、キモト
リプシン又はペプシン等の蛋白分解酵素を用いて、それ
自体公知の方法で分解して得ることができる。得られた
ポリペプチドは、ペプチド分野で公知の方法により単離
精製することができるが、逆相高速液体クロマトグラフ
ィーによる方法が最も効果的である。

【００３１】次いで、本発明によれば、以下の方法によ
って、〔式３〕（配列表、配列番号５）のアミノ酸配列
（Asn 〜 Arg；アミノ酸番号１〜７９）で示されるポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ（AAT 〜 CGC；塩基番号１
３５〜３７１）を得ることができる。さらに、〔式３〕
のポリペプチドと共通のアミノ酸配列部分をもつ、〔式
２〕、〔式４〕または〔式５〕のポリペプチドをコード
するＤＮＡも同様の方法で得ることができる。

【００３２】すなわち、カブトガニ血球より単離した p
oly(A)⁺ RNA より作製したcDNAライブラリーから〔式
３〕のアミノ酸配列で示されるポリペプチドの部分アミ
ノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドまたは
該ポリペプチドに対する抗体等を用いることにより該ポ
リペプチドをコードするcDNAを単離し、それらの塩基配
列をダイデオキシチェインターミネーション法(Proc.Na
tl.Acad.Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977) Sanger,
F. et al.) 等により確認することで、本発明のＤＮＡ
を得ることができる。また、このように決定された塩基
配列と上記部分アミノ酸配列を基に該ポリペプチドのア
ミノ酸配列を決定することもできる。なお、ポリペプチ
ドをコードする領域の塩基配列について、アミノ酸配列
が異ならないように同一アミノ酸に対応する他のコドン
となるように塩基を置換して得たＤＮＡも本発明の範疇
に含まれる。

【００３３】そして、本発明のＤＮＡを用いて、例え
ば、以下の方法により、本発明のポリペプチドを得るこ
とができる。上記の方法で得られた、本発明のポリペプ
チドをコードするＤＮＡを、超音波処理、制限酵素処理
または遺伝子工学の分野において知られたその他の方法
により切り出し、適当なベクターに組み込む。このベク
ターを適当な宿主生物または細胞に移入することによ
り、形質転換体を得ることができる。この形質転換体
を、該転換体に適した方法で飼育、培養することによ
り、多量のポリペプチドを安定して生産することができ
る。形質転換体の飼育、培養条件は、ポリペプチドを生
産する範囲で適宜選定可能であるが、用いた宿主の生育
に適した、遺伝子工学の分野で周知の条件を用いるとよ
い。そして、得られた飼育物または培養物から、遺伝子
工学およびタンパク質化学の分野において一般に知られ
ているタンパク質の単離、精製方法によって、目的とす
るポリペプチドを得ることができる。

【００３４】本発明のポリペプチドは、構成するアミノ
酸の特徴から塩基性を示す故に酸付加により塩を形成す
る。たとえば無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝
酸、硫酸など）または有機カルボン酸（酢酸、プロピオ
ン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒
石酸、サリチル酸など）、グルクロン酸、ガラクツロン
酸、グルコン酸、アスコルビン酸等の酸性糖、ヒアルロ
ン酸、コンドロイチン硫酸塩類、アルギン酸等の酸性多
糖、または有機スルホン酸（メタンスルホン酸、ｐ−ト
ルエンスルホン酸など）との塩を形成する。本発明のポ
リペプチドは、これらの医薬として許容しうる塩として
用いることができる。

【００３５】本発明のポリペプチドをうがい薬、消毒
薬、防腐剤および抗菌剤として用いる場合は、有効成分
として、本発明のポリペプチドまたはその塩と、薬剤の
投与方法および投与形態に応じて選択された薬学的に許
容されうる担体とからなる組成物として調製される。す
なわち、本発明のポリペプチドを有効成分とする、うが
い薬、消毒薬、防腐剤および抗菌剤は、生体外部微生物
感染部の治療又は消毒対象、あるいは生体内部微生物感
染疾患に応じて、非経口的（外用、注射、座薬として）
あるいは経口的に使用され、その使用方法に応じて適宜
な薬物担体により、粉末、顆粒、注射用もしくは内服用
液剤、錠剤、座剤、ベッサリー、軟膏、クリーム、エア
ゾールなどの製剤として調製することができる。

【００３６】本発明のポリペプチドを有効成分とする抗
菌剤を、注射剤として直接、生体に投与する場合には、
本発明のポリペプチドまたはその塩を生理食塩液に溶解
し点滴又は静注により連続的又は間欠的に投与すること
ができる。さらに、本発明のポリペプチドは、従来知ら
れているデフェンシンに類似したアミノ酸配列を含むの
で、創傷治癒効果も期待される。

【００３７】本発明のポリペプチドの投与量は、その症
状、性別、年令、投与方法によって異なるが、非経口的
に投与する場合はうがい薬および抗菌剤等として成人、
１人１日当りの 0.2〜20mgを上記投与方法によって数回
に分けて投与または使用する。また経口的に投与する場
合は、２〜200mg を数回に分けて投与するとよい。

【００３８】次に、本発明の具体例を実施例を挙げて説
明する。

【実施例１】 (1) カブトガニ血球内小顆粒画分の調製 タキプレウス・トリデンタツス (Tachypleus Tridenta
tus)の血リンパ液１００mlに0.002Mプロプラノロールを
含む３％食塩水100ml を加え、15分間、氷冷下に放置
後、４℃で遠心分離(150×ｇ、５分）して沈澱（血球細
胞）を採取した。その沈澱を0.008Mトリス−塩酸緩衝液
（0.001Mプロプラノロール、0.001MＰＭＳＦ及び0.75M
ショ糖含有、p H7.4）20mlに懸濁し、静かに混合後、４
℃で遠心分離(400×ｇ、15分）し、その上清に40USP 単
位／mlになるようにヘパリンを添加後、４℃で遠心分離
し(400×ｇ、10分）した。上層部の５ml（顆粒画分）を
1.5−2.4Mショ糖密度勾配液（0.008Mトリス−塩酸緩衝
液(pH7.4) 、ヘパリン（40ＵＳＰ単位／ml）及び 0.001
M ＰＭＳＦ含有）８mlの上に加え、４℃で遠心分離（11
2,000 ×ｇ、30分）した。２つの層に分離されるが、そ
のうちの下の層を採取し、小顆粒画分を得た。

【００３９】(2) 抗菌性ポリペプチドの調製 この小顆粒画分３mlにクロロホルム−メタノール（１：
４）混液１mlを加え、遠心分離し、沈澱を得た。その沈
澱に0.05M トリス−塩酸緩衝液（６M グアニジン及び0.
002M ＥＤＴＡ含有、pH8.0 ）を加え、超音波処理(10
W、10秒）し、37℃、１時間加温後、遠心分離した。上
清をあらかじめ0.1 ％(V/V) トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）で平衡化したTSK gel Phenyl 5PW-RP カラム（4.6
×75mm、東ソー (株) ）に添加し、アセトニトリル濃度
を16−48％(V/V) に連続的に上昇させる 0.1％ＴＦＡ溶
液により、0.5ml ／分の流速で吸着したポリペプチドを
溶出した。この際に溶出されるポリペプチドは214nm の
紫外部吸収でモニターした。その結果を図１に示す。図
１中のＳ５画分をあらかじめ 0.1％ＴＦＡで平衡化した
TSK gel ODS120T カラム(4.6×150mm 、東ソー (株))に
添加し、アセトニトリル濃度を０−80％(V/V) に連続的
に上昇させる直線的濃度勾配法により、0.5ml ／分の流
速で溶出し、精製Ｓ５画分（ポリペプチド）を得た。こ
のようにして得られたポリペプチドをSDS-PAGE（ドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
にかけたところ、還元条件下で図２に示すように単一の
パンドが得られ、その分子量は約 8,200であった。

【００４０】

【実施例２】 〔アミノ酸分析およびアミノ酸配列の決定〕実施例１に
よって得られた精製ポリペプチドを、あらかじめ 0.1％
(V/V) ＴＦＡで平衡化したTSKgel Phenyl5PW-RP (4.6×
75mm) に添加した。次いで充分にカラムを洗浄した後、
10分後に８％、15分後に16％、105 分後に48％、110 分
後に80％までアセトニトリル濃度を連続的に上昇させた
直線的濃度勾配法により、0.5ml ／分の流速で吸着した
ポリペプチドを溶出した。この際に溶出されるポリペプ
チドは 214nmの紫外部吸収でモニターし、ポリペプチド
含量の高い部分を採取した。このポリペプチドを6M塩酸
で24、48及び72時間加水分解し、あるいは4Mメタンスル
ホン酸で加水分解し、アミノ酸組成を測定した。その結
果を表１に示す。アミノ酸分析によるアミノ酸組成の測
定値は〔式３〕のアミノ酸配列から計算されるアミノ酸
組成の理論値とほぼ一致した。

【００４１】

【表１】 ────────────────────────── アミノ酸 分析値a) 理論値 （残基数／分子） （残基数／分子） ────────────────────────── Asp 6.0 6 Thr 3.2 3 Ser 7.0 7 Glu 1.3 1 Pro 4.0 3 Gly 6.1 6 Ala 12.0 12 1/2Cys^b) 4.7 6 Val 6.7 7 Met 0 0 Ile 3.7 4 Leu 3.1 3 Tyr 5.7 6 Phe 1.9 2 Lys 1.9 1 His 1.8 2 Trp^c) 1.8 2 Arg 7.5 8 ────────────────────────── Total 79 ──────────────────────────^a) 5.7M塩酸で 110℃、24、48および72時間加水分解した
結果の平均値。なおSer,Thr については、０時間への外
挿値^b) ギ酸および過酸化水素を用い過ギ酸酸化した後、24時
間加水分解しシステイン酸として測定^c) 4Mメタンスルホン酸法により測定

【００４２】また、このようにして得られたポリペプチ
ドのアミノ酸配列を気相エドマン分解法（アプライド・
バイオシステムズ社、477A使用）によって決定したとこ
ろ次の〔式３〕に示されるとおりのアミノ酸配列（配列
表、配列番号１）が得られた。 Asn Pro Leu Ile Pro Ala Ile Tyr Ile Gly 1 5 10 Ala Thr Val Gly Pro Ser Val Trp Ala Tyr 15 20 Leu Val Ala Leu Val Gly Ala Ala Ala Val 25 30 Thr Ala Ala Asn Ile Arg Arg Ala Ser Ser 35 40 Asp Asn His Ser Cys Ala Gly Asn Arg Gly 45 50 Trp Cys Arg Ser Lys Cys Phe Arg His Glu 55 60 Tyr Val Asp Thr Tyr Tyr Ser Ala Val Cys 65 70 Gly Arg Tyr Phe Cys Cys Arg Ser Arg 〔式３〕

【００４３】

【実施例３】以下の実施例において、使用された装置お
よび試薬は、下記のとおりである。 中圧カラムクロマトグラフイー装置： 山善（株） 中
圧分取液体クロマトグラフ ＹＦＬＣ−6004−ＦＣ−６
Ｒ型 同装置のカラム： セッパック Ｃ18（ウオーターズ社
（米国））充填カラム ペプチドシンセサイザ： アプライド バイオシステム
ズ社（米国） 430Ａ型 アミノ酸分析計：（株）日立製作所 日立高速アミノ酸
分析計 Ｌ−8500型 Ｆmoc −アミノ酸：（株）ペプチド研究所 及び 渡辺
化学工業（株） 固相合成用樹脂：（株）ペプチド研究所 及び 渡辺化
学工業（株） 縮合剤：（株）ペプチド研究所、渡辺化学工業（株）及
び（株）アプライドバイオシステムズ ジャパン（株） 保護基脱離試薬：（株）ペプチド研究所 及び 渡辺化
学工業（株） セファデックス Ｇ−10担体：ファルマシア バイオテ
ク（株）

【００４４】次のポリペプチド〔式６〕の固相合成法に
よる調製

【化１】 上記式中、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、
Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｔ
ｙｒ、Ｖａｌ、ＡｓｐおよびＴｈｒは前記したアミノ酸
残基を示し、３位と３４位、１０位と２８位および１４
位と３３位Ｃｙｓ間の実線はジスルフイド結合を示す。

【００４５】Ｎα−Ｆｍｏｃ基を除去した保護基保護化
ペプチド−Ｗａｎｇ樹脂は、ペプチド自動合成機（ペプ
チドシンセサイザ：アプライド バイオシステムズ社
（米国））を用い、Ｆｍｏｃストラテジーによる固相合
成法により調製した。合成過程及びそのコントロールに
は、アプライド バイオシステムズ社（米国）の開発し
たＦａｓｔ Ｍｏｃプログラムを使用した。このＦａｓ
ｔ Ｍｏｃプログラムは、迅速で高効率の縮合反応が進
行するＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法を採用している。 １）出発原料（Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂）は、３７位保
護アルギニンをオキシメチルフェノキシメチル樹脂（Ｗ
ａｎｇ）樹脂に導入した市販のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍ
ｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（渡辺化学工業（株））を出発原料
とした。 ２）３６位セリンの導入； １）のＦｍｏｃ−Ａｒｇ
（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（1.25ｇ、0.25mmol； 0.2m
mol アルギニン／ｇ Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗ
ａｎｇ樹脂）及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ)(383mg 、
1.00mmol；４等量）を反応ベッセル及びＦｍｏｃアミノ
酸用カ−トリッジにそれぞれをとり、該ベッセル及び該
カ−トリッジを上記ペプチド自動合成機に装着し、Ｆａ
ｓｔ Ｍｏｃプログラムにより自動合成操作を開始し
た。そのプログラムによる１サイクルの合成反応は、表
２の操作条件のとおりである。

【００４６】

【表２】 １サイクル所要時間： 55 分 １サイクル廃液容量： 160 ml * ジイソプロピルエチルアミン

【００４７】３）３５位〜１位のアミノ酸の導入； 以
下同様にしてＣ端アミノ酸からの配列に従い順次Ｎα−
Ｆｍｏｃ化のＡｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｃ
ｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ａｒｇ
（Ｐｍｃ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｖａｌ、Ａｌ
ａ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｔｙｒ（ｔ
Ｂｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｖａ
ｌ、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｈｉｓ
（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ（Ｔｒ
ｔ）、Ｌys（Ｂoc）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｍ
ｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐ
ｍｃ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｃｙｓ
（Ｔｒｔ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）残基
をＷａｎｇ樹脂に導入してほぼ１００％の収率でＮα−
Ｆｍｏｃ基を除去した保護基保護化ペプチド- Ｗａｎｇ
樹脂（３．３１ｇ）を得た。

【００４８】４）脱保護基並びに脱樹脂操作と部分精製
によるペプチドの調製； 前記１）〜３）の操作を経て
調製したＮα−Ｆｍｏｃ基を除去した保護基保護化ペプ
チド樹脂は、次いで該樹脂100mg 当り１Ｍ- ＴＭＳＯＴ
ｆ−チオアニソール／ＴＦＡ系（ｍ−クレゾール（100e
q)、エタンジチオール（300eq)の存在するトリフルオロ
酢酸10ml）で25℃２時間反応させた。反応混合液から樹
脂を濾別し、トリフルオロ酢酸１mlにて２回洗浄し、濾
液、洗液を合せたものに氷冷乾燥エーテル100mlを加
え、生じた沈殿物を遠心し、残渣をデカンテーションに
より上清から分離した。得られた残渣を、冷エーテルで
洗浄後４Ｎ酢酸（ＡｃＯＨ）10mlに溶解し830mg 、80eq
のジチオスレイトールを加え、室温で一夜撹拌した。反
応液を遠心し、上清をＳephadex Ｇ-10 (3.7×50cm）、
４Ｎ ＡｃＯＨでゲル濾過し、素通り画分である主溶出
部分を集め、凍結乾燥して粉末状の部分精製未環化ポリ
ペプチド〔式２〕を得た。

【００４９】５）空気酸化によるポリペプチド〔式６〕
の調製： 上記、部分精製未環化ポリペプチドの水溶液
を濃アンモニア水にてpH7.5 に調整し、通気により空気
酸化を行い環化反応を行った。空気酸化終了後環化ペプ
チドをダイアイオンＨＰ−20樹脂10ｇに吸着せしめ、次
いで60％アセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ)(１Ｎ ＡｃＯＨ
中）を用いて脱着溶出し、該溶出液を室温下減圧濃縮し
てＣＨ₃ ＣＮを除去し、さらに凍結乾燥により粉末化し
た。該粉末を少量の水に溶解し、その溶液をＳｅｐＰａ
ｋ中圧カラム（24ｘ190mm)にかけ、アセトニトリル（Ｃ
Ｈ₃ＣＮ）のグラデイエント溶出(0.1％トリフルオロ酢
酸水溶液中）により部分精製し(280nmの吸光度でモニタ
ー）、純度40−50％の目的フラクションを得た。該フラ
クションを集め、減圧濃縮、さらに凍結乾燥し粉末を得
た。さらに、該粉末を少量の水に溶解し、その溶液をア
サヒパックＯＤＰ−90カラム（2.15ｘ30cm）（旭化成工
業（株））にかけ、ＣＨ₃ＣＮのグラディエント溶出に
よる高速液体クロマトグラフイー（東ソー（株）製 全
自動高速液体クロマトグラフ ＨＬＣ−8070型）で精製
し、単一ピークの目的ペプチド〔式６〕を13％の収率
（保護基保護化ペプチド樹脂から計算した値）で得た。

【００５０】６）ポリペプチドの分析；前記５）で精製
されたポリペプチドを、Ｌｉｕらの（Liu 、T. Y. ら、
J. Biol. Chem., 251 、1936（1976））方法に従い、0.
2 ％トリプタミン含有 ４Ｍメタンスルホン酸で 115℃
下24時間、酸加水分解し、そのアミノ酸組成を調べたと
ころ、前記、〔式６〕のアミノ酸配列による組成の計算
値とよく一致した。また、下記条件下での分析的逆相高
速液体クロマトグラフイー（（株）島津製作所 高速液
体クロマトグラフ ＬＣ−６ＡＤ型； ＴＳＫ ＯＤＳ
−１２０Ｔ（0.46ｘ15cm）カラム及び ＴＳＫ ＯＤＳ
−１２０Ｔガードカラム (0.32ｘ1.5cm)（東ソー
（株）））で22.8分に単一ピークとして溶出した。

【００５１】比較対照とした抗菌性ペプチドのタキプレ
シンＩ（Nakamura、H.ら、J. Biol.Chem.,263, 16709(1
988)) は24.1分に、抗ＨＩＶ活性ペプチドのＴ22（Naka
shima 、H.ら、Antimicrobial Agents and Chemotherap
y, 36, 1249(1992))は、17.2に溶出した。分析的逆相高
速液体クロマトグラフイーの条件は、溶離液として10％
ＣＨ₃ＣＮを含む 0.1％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ
液）、80％ＣＨ₃ＣＮを含む 0.1％トリフルオロ酢酸水
溶液（Ｂ液）の２液グラジエントで、１分後にＢ液０
％、29.4分後にＢ液42％にするグラジエントを用い、カ
ラム温度40℃、流速 0.8ml／分、検出波長220nm および
280nm 、サンプルインジェクト量20μl(ペプチド濃度
0.1mg/ml)である。

【００５２】

【実施例４】 （抗菌活性の測定）表３の各種微生物を、10mMリン酸緩
衝液，pH7.0(低張液) に懸濁した菌液(5,000−10,000 C
FU/ml) 900μl に、実施例１で得られたポリペプチド
（20μg/ml）の２倍系列希釈液 100μl を加え、37℃で
１時間インキュベートした後、100 μl を普通寒天培地
に接種した。37℃で12時間培養した後、コロニー数を肉
眼で計測した（参考文献 Infections and Immunity, 4
2, 10-14 (1983))。なお、ＣＦＵは、コロニー形成単位
のことである。結果を、表３に示す。表３から明らかな
ように本発明のポリペプチドは、グラム陰性菌、グラム
陽性菌及び真菌のいずれに対しても強い抗菌活性を示し
た。

【００５３】

【表３】

【００５４】

【実施例５】50mMトリス−塩酸緩衝液，pH８に、実施例
１で得られた精製ポリペプチド２mgとトリプシン（シグ
マ社）20μg を添加し、37℃で24時間インキュベートし
て分解し、ポリペプチド断片を得た。これを、あらかじ
め0.06％(V/V) トリフルオロ酢酸で平衡化したＹＭＣ−
Ｐａｃｋ ５Ｃ４（ＹＭＣ社）カラム(4.6×150mm)に負
荷し、アセトニトリル濃度を５分後に０％、55分後に80
％(V/V) まで連続的に上昇させた 0.052％トリフルオロ
酢酸溶液により、0.5ml ／分の流速で吸着したポリペプ
チド断片を溶出した。この際溶出されるポリペプチド断
片は210nm の紫外部吸収でモニターし、ペプチド含量の
高い部分であった溶出時間27分および47.6分の画分をお
のおの採取することで、２つのポリペプチド断片を得
た。以下、該断片をそれぞれポリペプチド断片Ｔ３、Ｔ
６と呼ぶことがある。このようにして得られた２つのポ
リペプチド断片をそれぞれ、5.7M塩酸、110℃で24時間
加水分解しアミノ酸組成を測定した。その結果を表４に
示す。アミノ酸分析から、ポリペプチド断片Ｔ３および
Ｔ６のアミノ酸組成の測定値は、〔式４〕および〔式
５〕（配列表、配列番号３および４）のアミノ酸組成か
ら計算されるアミノ酸の理論値とほぼ一致した。

【００５５】

【表４】 ────────────────────────────── ポリペプチド断片Ｔ３ ポリペプチド断片Ｔ６ アミノ酸 分析値 理論値 分析値 理論値 （残基数／分子） （残基数／分子） ────────────────────────────── Asp 4.0 (4) 1.9 (2) Thr 1.1 (1) 2.3 (2) Ser 5.0 (6) 1.2 (1) Glu 1.2 (1) Pro 2.8 (3) Gly 3.4 (3) 3.3 (3) Ala 3.4 (3) 9.5 (9) 1/2Cys N.D (6) N.D (0) Val 2.1 (2) 5.2 (5) Met Ile 3.8 (4) Leu 3.0 (3) Tyr 4.0 (4) 2.1 (2) Phe 1.5 (2) Lys 1.0 (1) His 2.0 (2) Trp N.D (1) N.D (1) Arg 6.7 (6) 1.6 (2) ────────────────────────────── Total (42) (37) ──────────────────────────────

【００５６】

【実施例６】 （抗菌活性）10mMリン酸緩衝液，pH7.0 に懸濁した、 E
scherichia coli (10000 CFU/ml)450 μl に、実施例
５で得られたポリペプチド断片Ｔ3(〔式４〕のポリペプ
チド）、ポリペプチド断片Ｔ6(〔式５〕のポリペプチ
ド）、実施例１で得られたポリペプチド（いずれも40μ
g/ml）および対照として10mMリン酸緩衝液，pH7.0 を各
々50μl 加え、37℃で１時間インキュベートした後、10
0 μl を普通寒天培地に接種した。37℃で12時間培養し
た後、コロニー数を肉眼で計測した。この結果、Escher
ichia coliの生育を、対照に比べ、ポリペプチド断片
Ｔ3(〔式４〕のポリペプチド）は約90％、ポリペプチド
断片Ｔ6(〔式５〕のポリペプチド）は約20％、および実
施例１のポリペプチドは約95％以上阻害した。また、10
mMリン酸緩衝液，pH 7.0に懸濁した、Staphylococcus
aureus (5000CFU/ml)450μl に、実施例５で得られたポ
リペプチド断片Ｔ３（〔式４〕のポリペプチド）、ポリ
ペプチド断片Ｔ6(〔式５〕のポリペプチド）、実施例１
で得られたポリペプチド（いずれも40μg/ml）および対
照として10mMリン酸緩衝液，pH7.0を各々50μｌを加
え、37℃で１時間インキュベートした後、100 μl を普
通寒培地に接種した。37℃で12時間培養した後、コロニ
ー数を肉眼で計測した。この結果、Staphylococcus au
reusの生育を、対照に比べ、ポリペプチド断片Ｔ３
（〔式４〕のポリペプチド）は約３０％、ポリペプチド
断片Ｔ6(〔式５〕のポリペプチド）は約70％、および実
施例１のポリペプチドはほぼ完全に阻害した。これらの
結果から明らかなように、本発明の上記のポリペプチド
断片は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌に、強い抗菌
活性を示すが、特に、ポリペプチド断片Ｔ３（〔式４〕
のポリペプチド）はグラム陰性菌である Escherichia
coliに対して、またポリペプチド断片Ｔ６（〔式５〕の
ポリペプチド）はグラム陽性菌である、Staphylococcus
aureusに対して、強い抗菌活性を示した。

【００５７】

【実施例７】 〔ポリペプチドをコードするＤＮＡの採取〕 １．オリゴヌクレオチドの合成 実施例２で決定したアミノ酸配列中のHis-Glu-Tyr-Val-
Asp-Thr （配列表、配列番号１、アミノ酸番号５９〜６
４）をアンチセンスに逆翻訳し、さらに５′末端側に制
限酵素（ＥｃｏＲＩ）認識配列とＤＮＡの保護のための
２塩基を付けた２５個の塩基からなるオリゴヌクレオチ
ドの混合物をＤＮＡシンセサイザー３８０Ａ（アプライ
ド バイオシステムズ ジャパン（株））を用いて合成
した。 ここに示すオリゴヌクレオチドは、His-Glu-Tyr-Val-As
p-Thr から逆翻訳した塩基配列に相補的な配列の全ての
可能性を包括している（但し、Thr に対するコドンに相
補的な塩基配列（ 3'-TG(T/G/C/A)-5'）の５’末端のヌ
クレオチド(T/G/C/A) は除かれている）。

【００５８】２．ポリペプチドをコードするmRNAを含む
poly(A)⁺RNA の調製 本発明のポリペプチドはカブトガニ血球より精製される
ことから、 poly(A)⁺RNA はカブトガニ血球より単離し
た。 （１）全ＲＮＡの調製 カブトガニ血球11.8ｇよりAGPC法 (実験医学Vol.9, p19
37〜1940を参照) を用いて、全RNA 約11mgを分離した。 （２） poly(A)⁺ RNA の調製 分離した全RNA のうち約2mg の全RNA よりOligotex-dT
30 Superキット（日本ロシュ（株））を用いて poly(A)
⁺ RNA を単離した。さらに、一度単離したpoly(A)⁺ RNA
は、より純度を高めるために、同様の操作をもう一度
繰り返した。このように２度のOligotex-dT 30 Superキ
ットの操作により、2 mgの全RNA から34.5μｇの高純度
の poly(A)⁺ RNA を得た。

【００５９】３．カブトガニ血球ｃＤＮＡのライブラリ
ーの作製 （１）ｃＤＮＡの合成 前記２で得た poly(A)⁺ RNA からGIBCO BRL 社の SUPER
SCRIPT^TMチョイスシステム（商品名）を利用し、ｃＤＮ
Ａを合成した。 （２）ｃＤＮＡライブラリーの作製 （１）で合成したｃＤＮＡからGIBCO BRL 社のλＺＩＰ
ＬＯＸ，ＥｃｏＲＩアーム（商品名）とラムダパッケー
ジングシステム（商品名）を用いて、カブトガニ血球由
来λＺＩＰＬＯＸ ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００６０】４．ポリペプチドのｃＤＮＡクローニング Seki N.(J.Biol.Chem.269,1370-1374(1994))らが調製し
たλgt10 cDNAライブラリーより調製したファージＤＮ
Ａを鋳型とし、プライマーとして二種のオリゴヌクレオ
チド、すなわち前記１で合成したオリゴヌクレオチドと
ファージベクターλgt10のＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列
周辺と同じ配列(3'-ATGGGACCTTCTTTATGAGTAT-5')の合成
オリゴヌクレオチドを用いて、PCR 法(Saiki,R.K. et a
l., Science, 239,487-491,(1988))を行い、〔式３〕の
ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡフラグメントを
増幅した。このＤＮＡフラグメントは Ready-to-Go^TM D
NAラベリングキット（ファルマシア バイオテク
（株））を用いて[ α−³²Ｐ]dCTP で標識した。次いで
この標識化ＤＮＡフラグメントをプローブとして、前記
３.(２）で作製したλＺＩＰＬＯＸ ｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングし、最長の581bp のインサートｃ
ＤＮＡを含むポジティブクローンを得、このインサート
ｃＤＮＡの塩基配列を解析した。

【００６１】５．ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ塩
基配列の決定 前記４．で得られたポジティブクローンを、λＺＩＰＬ
ＯＸ，ＥｃｏＲＩアームの添付文書に従い、添付された
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（ＺＩＰ）に感染させ該ポリ
ペプチドをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを得
た。このインサートのｃＤＮＡの全塩基配列を決定する
ため、ｃＤＮＡ断片上の制限酵素認識部位ならびにキロ
−シークエンスデレーションキット（宝酒造（株））を
用いたデレーションによるサブクローニングを行った。
上記方法により作製したクローンのｃＤＮＡの塩基配列
をDNA シークエンサー373A（アプライド バイオシステ
ムズジャパン（株）(ABI社) ）を用いて決定した。この
際、シークエンシングプライマーとしては、ポジティブ
クローンから得たインサートｃＤＮＡを含むプラスミド
が、Ｍ１３系プラスミドであることからABI 社のユニバ
ーサルプライマーおよびＭ１３リバースプライマーの塩
基配列を模した合成オリゴヌクレオチド（5'-TGTAAAACG
ACGGCCAGT-3'、5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'）ならびに
〔式３〕のポリペプチドのアミノ酸配列中のArg-Ala-Se
r-Ser-Asp-Asn の配列を逆翻訳した合成オリゴヌクレオ
チド（5'-CGAGCCTCTTCTGATAAC-3'）を用いた。このよう
に決定した該ポリペプチドのｃＤＮＡの塩基配列、なら
びにそれより明らかにされたアミノ酸配列を配列番号５
の配列表に示した。このアミノ酸配列中に、実施例２で
決定したアミノ酸配列（配列番号：１）が全て含まれて
おり、今回塩基配列を決定したインサートｃＤＮＡは該
ポリペプチドを確かにコードしていた。

【００６２】

【実施例８】 （製剤例） （１）外傷薬 １ｇクリーム 実施例１のポリプペプチド １０ｍｇ モノステアリン酸ソルビタン ７ｍｇ モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン ７ｍｇ パルミチン酸イソプロピル ３７ｍｇ ワセリン ３７ｍｇ 流動パラフィン ３７ｍｇ セタノール ５０ｍｇ グリセリン ７０ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ に精製水を加えて１ｇのクリームとした。 上記成分を均一に混合し、硬カプセルに充填してカプセ
ル剤を得た。

【００６３】

【配列表】

配列番号 ：１ 配列の長さ：７９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：両形態 起 源 ：カブトガニ血球

【００６４】配列番号 ：２ 配列の長さ：３７ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：両形態

【００６５】配列番号 ：３ 配列の長さ：４２ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：両形態

【００６６】配列番号 ：４ 配列の長さ：３６ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状

【００６７】配列番号 ：５ 配列の長さ：５８１ 配列の型 ：核酸 トポロジー：直鎖状 配列 10 20 30 40 GATTGGTATCAACAAACACAATGAAAGGAAACATCGGTATTGCTG MetLysGlyAsnIleGlyIleAlaVal -35 -30 50 60 70 80 90 TGTTCTACATGTTGTTACTTCTACTTCCAACAGACAGTATTGGGA PheTyrMetLeuLeuLeuLeuLeuProThrAspSerIleGlyLys -25 -20 -15 100 110 120 130 AGAAGATGGAAGAAGAGCAAGAGAAACTTTTCAGACAAAAACGAA LysMetGluGluGluGlnGluLysLeuPheArgGlnLysArgAsn -10 -5 ー1 1 140 150 160 170 180 ATCCTCTCATTCCAGCAATTTACATTGGAGCAACTGTTGGGCCTT ProLeuIleProAlaIleTyrIleGlyAlaThrValGlyProSer 5 10 15 190 200 210 220 CAGTTTGGGCTTATCTGGTCGCTTTAGTTGGTGCCGCTGCCGTTA ValTrpAlaTyrLeuValAlaLeuValGlyAlaAlaAlaValThr 20 25 30 230 240 250 260 270 CTGCTGCAAATATAAGACGAGCCTCTTCTGATAACCATTCCTGTG AlaAlaAsnIleArgArgAlaSerSerAspAsnHisSerCysAla 35 40 45 280 290 300 310 CTGGCAACAGAGGTTGGTGTAGGTCAAAGTGTTTCCGTCACGAAT GlyAsnArgGlyTrpCysArgSerLysCysPheArgHisGluTyr 50 55 60 320 330 340 350 360 ATGTGGACACTTACTACAGTGCTGTATGTGGAAGATACTTTTGCT ValAspThrTyrTyrSerAlaValCysGlyArgTyrPheCysCys 65 70 75 370 380 390 400 GCAGATCACGCTAACAGATGGCACTCTGACAAAGTATCTGAATTT ArgSerArg 410 420 430 440 450 GAGGTGTAACCAAGAAAACTAAAGCCATATTAAGTAAACAGTTCT 460 470 480 490 AAACATTTCAAGGTATTTAGAGTAATTTAGTAATGTCTAGATAGT 500 510 520 530 540 ATTATGTCTTCTTACCAATATATATATTCGTAGTGTATGAGTATG 550 560 570 580 TTTTACGTTATCTGACAGTCAATAAATATGTTTCTATCAAT

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１によるTSK gel Phenyl 5PW-RP カラム
から本発明のポリペプチドをアセトニトリル濃度勾配法
により溶出する図を示す。

【図２】実施例１より得られる本発明のポリペプチドの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）を示す。左側は本発明
のポリペプチド、右側はマーカーを示す。マーカーはLM
W Kit １（ファルマシアバイオシステムズ (株) ）を使
用した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＢ ＡＤＺ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも次の〔式１〕で示されるアミ
   ノ酸配列の一次構造を含むポリペプチド。 AA1 AA2 Cys AA2 AA2 AA2 AA1 AA2 AA4 Cys 5 10 Arg Ser AA1 Cys Phe Arg AA1 Glu AA4 AA2 15 20 AA3 AA2 AA4 AA4 Ser Ala AA2 Cys Gly Arg 25 30 Tyr AA4 Cys Cys Arg AA2 AA1 〔式１〕 35 〔式中、AA1 は塩基性アミノ酸残基、AA2 は中性アミノ
   酸残基、AA3 は酸性アミノ酸残基、AA4 は芳香族アミノ
   酸残基をそれぞれ示す。３、１０、１４、２８、３３お
   よび３４位のシステイン残基は、３位と３４位、１０位
   と２８位、および１４位と３３位との少なくとも一つの
   組合せの残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）して
   いてもよい。〕
2. 【請求項２】 〔式１〕においてAA1 はArg 、Lys およ
   びHis からなる群から選ばれた塩基性Ｌ−アミノ酸残
   基、AA2 はGly 、Ala 、Leu 、Val 、 Ile、Met 、Pro
   、Asn 、Thr 、Ser およびGln からなる群から選ばれ
   た中性Ｌ−アミノ酸残基、AA3 はAsp およびGlu からな
   る群から選ばれた酸性Ｌ−アミノ酸残基、AA4 はTrp 、
   Tyr およびPhe からなる群から選ばれた芳香族Ｌ−アミ
   ノ酸残基である請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 少なくとも次の〔式２〕で示されるアミ
   ノ酸配列の一次構造を含むポリペプチド。 His Ser Cys Ala Gly Asn Arg Gly Trp Cys 5 10 Arg Ser Lys Cys Phe Arg His Glu Tyr Val 15 20 Asp Thr Tyr Tyr Ser Ala Val Cys Gly Arg 25 30 Tyr Phe Cys Cys Arg Ser Arg 〔式２〕 35 〔式中、３、１０、１４、２８、３３および３４位のシ
   ステイン残基は、３位と３４位、１０位と２８位、およ
   び１４位と３３位との少なくとも一つの組合せの残基間
   でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよい。〕
4. 【請求項４】 〔式２〕の一次構造をカルボキシル末端
   に有し、アミノ末端に疎水性ポリペプチド領域を有する
   抗菌性ポリペプチド。
5. 【請求項５】 次の〔式３〕で示されるアミノ酸配列の
   一次構造をもつポリペプチド。 Asn Pro Leu Ile Pro Ala Ile Tyr Ile Gly 1 5 10 Ala Thr Val Gly Pro Ser Val Trp Ala Tyr 15 20 Leu Val Ala Leu Val Gly Ala Ala Ala Val 25 30 Thr Ala Ala Asn Ile Arg Arg Ala Ser Ser 35 40 Asp Asn His Ser Cys Ala Gly Asn Arg Gly 45 50 Trp Cys Arg Ser Lys Cys Phe Arg His Glu 55 60 Tyr Val Asp Thr Tyr Tyr Ser Ala Val Cys 65 70 Gly Arg Tyr Phe Cys Cys Arg Ser Arg 〔式３〕 75 〔式中、４５、５２、５６、７０、７５および７６位の
   システイン残基は、４５位と７６位、５２位と７０位、
   および５６位と７５位との少なくとも一つの組合せの残
   基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよ
   い。〕
6. 【請求項６】 カブトガニ血球内小顆粒画分をグアニジ
   ンとキレート剤を含む緩衝液を用いて抽出し、抽出液を
   逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、アセトニトリ
   ルの濃度勾配溶出により溶離させることによって得られ
   うる画分に含まれ、次の物性値を示す抗菌性ポリペプチ
   ド。 (i) SDS-PAGEにより還元条件下で単一のバンドを示
   す。 (ii) SDS-PAGEにより求めた分子量が約8,200 である
   (還元条件下) 。 (iii) アミノ酸79個より構成される。 (iv) グラム陰性菌、グラム陽性菌および真菌に対して
   抗菌性を示す。
7. 【請求項７】 カブトガニ血球内小顆粒画分を蛋白質変
   性剤とキレート剤を含む緩衝液を用いて抽出し、抽出液
   を逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、疎水性有機
   溶媒によって溶出させることを特徴とする請求項１〜６
   のいずれかに記載のポリペプチドを採取することを特徴
   とするポリペプチドの製造法。
8. 【請求項８】 〔式３〕のポリペプチドを蛋白分解酵素
   によって分解して得られるポリペプチド。
9. 【請求項９】 次の〔式４〕で示されるアミノ酸配列の
   一次構造をもつポリペプチド。 Ala Ser Ser Asp Asn His Ser Cys Ala Gly 1 5 10 Asn Arg Gly Trp Cys Arg Ser Lys Cys Phe 15 20 Arg His Glu Tyr Val Asp Thr Tyr Tyr Ser 25 30 Ala Val Cys Gly Arg Tyr Phe Cys Cys Arg 35 40 Ser Arg 〔式４〕 〔式中、アミノ末端にArg が１個ペプチド結合していて
   もよく、また８、１５、１９、３３、３８および３９位
   のシステイン残基は、８位と３９位、１５位と３３位、
   および１９位と３８位との少なくとも一つの組合せの残
   基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよ
   い。〕
10. 【請求項１０】 次の〔式５〕で示されるアミノ酸配列
    の一次構造をもつポリペプチド。 Asn Pro Leu Ile Pro Ala Ile Tyr Ile Gly 1 5 10 Ala Thr Val Gly Pro Ser Val Trp Ala Tyr 15 20 Leu Val Ala Leu Val Gly Ala Ala Ala Val 25 30 Thr Ala Ala Asn Ile Arg 〔式５〕 35 〔式中、カルボキシル末端にArg がさらに１個ペプチド
    結合していてもよい。〕
11. 【請求項１１】 請求項１〜６および請求項８〜１０の
    いずれかに記載されるポリペプチドまたはその薬理的に
    許容される塩を有効成分とする抗菌剤。
12. 【請求項１２】 〔式３〕で示されるポリペプチドをコ
    ードする塩基配列を含む一本鎖のＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 配列表配列番号５の塩基番号１３５〜
    ３７１で示される配列をもつ請求項１２記載のＤＮＡ。
14. 【請求項１４】 請求項１２または請求項１３のＤＮＡ
    と、このＤＮＡと相補的なＤＮＡとからなる二本鎖のＤ
    ＮＡ。